JP2015514403A - Sample preparation for flow cytometry - Google Patents
Sample preparation for flow cytometry Download PDFInfo
- Publication number
- JP2015514403A JP2015514403A JP2015504727A JP2015504727A JP2015514403A JP 2015514403 A JP2015514403 A JP 2015514403A JP 2015504727 A JP2015504727 A JP 2015504727A JP 2015504727 A JP2015504727 A JP 2015504727A JP 2015514403 A JP2015514403 A JP 2015514403A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sample
- background signal
- nucleic acid
- molecule
- acid stain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 title claims abstract description 42
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 12
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 115
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 115
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 115
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 99
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 83
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims abstract description 38
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims abstract description 38
- 239000013618 particulate matter Substances 0.000 claims abstract description 29
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 214
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 27
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 22
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 20
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 16
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 10
- 150000001555 benzenes Chemical class 0.000 claims description 8
- LISFMEBWQUVKPJ-UHFFFAOYSA-N quinolin-2-ol Chemical group C1=CC=C2NC(=O)C=CC2=C1 LISFMEBWQUVKPJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 claims description 7
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 7
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 6
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 6
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N Sulfurous acid Chemical group OS(O)=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 4
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 claims description 4
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 4
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 claims description 4
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 3
- 230000035699 permeability Effects 0.000 claims description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract description 24
- 238000010186 staining Methods 0.000 abstract description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 42
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 30
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 239000001974 tryptic soy broth Substances 0.000 description 29
- 108010050327 trypticase-soy broth Proteins 0.000 description 29
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 22
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 21
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 16
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 13
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 13
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 12
- 239000000980 acid dye Substances 0.000 description 10
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 9
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- 239000011236 particulate material Substances 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 6
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 6
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 6
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 6
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 4
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 4
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 3
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 3
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002373 5 membered heterocyclic group Chemical group 0.000 description 2
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 2
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- UFWIBTONFRDIAS-UHFFFAOYSA-N naphthalene-acid Natural products C1=CC=CC2=CC=CC=C21 UFWIBTONFRDIAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001624 naphthyl group Chemical group 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 2
- CHADEQDQBURGHL-UHFFFAOYSA-N (6'-acetyloxy-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-3'-yl) acetate Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(OC(C)=O)C=C1OC1=CC(OC(=O)C)=CC=C21 CHADEQDQBURGHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000223936 Cryptosporidium parvum Species 0.000 description 1
- 241000179197 Cyclospora Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000736262 Microbiota Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000011090 industrial biotechnology method and process Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000004814 polyurethane Substances 0.000 description 1
- 229920002635 polyurethane Polymers 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 238000012372 quality testing Methods 0.000 description 1
- 238000009790 rate-determining step (RDS) Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
- C12Q1/06—Quantitative determination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
Abstract
本明細書に記載されるのは、試料中の少なくとも１種の微生物（たとえば、細菌）を同定および分析し、試料をフローサイトメトリーにより分析する際に得られるバックグラウンドシグナル強度を低減するための方法および試薬である。試料は、バックグラウンドシグナル低減分子と、または消光剤と共有結合により連結された核酸染色剤と、試料を組み合わせることにより調製される。試料中の粒子状物質の一部は場合により、核酸染色剤で染色する前に、樹脂により除去することもできる。Described herein is for identifying and analyzing at least one microorganism (eg, bacterium) in a sample and reducing the background signal intensity obtained when the sample is analyzed by flow cytometry. Methods and reagents. The sample is prepared by combining the sample with a background signal reducing molecule or a nucleic acid stain covalently linked to a quencher. Part of the particulate matter in the sample can optionally be removed with a resin before staining with a nucleic acid stain.
Description
特定の試料中の生菌（ｖｉａｂｌｅ ｏｒｇａｎｉｓｍ）を同定し、その総数を決定することは、極めて重要である。特に重要なのは、食物中および環境中の病原菌を、素早く、効率的に、かつ正確に監視および同定することによって、食物および水の供給の安全性をモニタリングし保証することである。 It is extremely important to identify viable organisms in a particular sample and determine their total number. Of particular importance is monitoring and ensuring the safety of food and water supply by monitoring and identifying pathogens in food and the environment quickly, efficiently and accurately.
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年４月５日に出願した米国特許仮出願第６１／６２０，８２３号明細書の出願日の利益を主張し、本出願と共同所有される２０１３年３月１３日に出願した米国特許仮出願第６１／７７９，７６６号明細書に関連するものであり、これらの開示は、ここで参照により本明細書に組み込まれる。
CROSS REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS This application claims the benefit of the filing date of US Provisional Application No. 61 / 620,823, filed April 5, 2012, and is co-owned with this application. The disclosure of which is related to US Provisional Application No. 61 / 779,766, filed on Jan. 13, the disclosure of which is hereby incorporated herein by reference.
これを達成するそのような方法の１つは、総生菌（ＴＶＯ）アッセイである。ＴＶＯアッセイは、応用微生物学分野において、品質管理用途として今日広く使用されている。ＴＶＯアッセイは、たとえば、食肉などの消費者向け食品中の細菌の数および種類をモニタリングするために使用される。ＴＶＯ法は、飲料水中の細菌集団をモニタリングするために使用することもできる。食物および水に対するモニタリングは、当然ながら、食物および水の供給が、消費するのに安全であることを保証するために決定的に重要である。 One such method of accomplishing this is the total viable bacteria (TVO) assay. TVO assays are widely used today for quality control applications in the field of applied microbiology. TVO assays are used, for example, to monitor the number and type of bacteria in consumer foods such as meat. The TVO method can also be used to monitor bacterial populations in drinking water. Monitoring for food and water is of course critical to ensure that the food and water supply is safe to consume.
ＴＶＯアッセイのステップは、一般的に、１）試験試料を採取することと；２）好適な容器に入れた寒天培地（ゼラチン質の栄養物質）上で試料を培養または平板培養することとを包含する。微生物（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｏｒｇａｎｉｓｍ）を増殖させ、寒天培地上に形成するコロニーの数に基づき、コロニー形成単位（ＣＦＵ）を計算する。ＣＦＵは、コロニー増殖のための時間を与えた後でようやく計算することができる。試料は典型的に希釈され、ＣＦＵを計算する際には、この希釈係数（すなわち、試料と総体積との体積比）を考慮に入れる。 The steps of a TVO assay generally include 1) taking a test sample; and 2) culturing or plating the sample on an agar medium (gelatinous nutrient) in a suitable container. To do. Microorganisms are grown and colony forming units (CFU) are calculated based on the number of colonies that form on the agar medium. The CFU can only be calculated after giving time for colony growth. Samples are typically diluted and this dilution factor (ie volume ratio of sample to total volume) is taken into account when calculating the CFU.
標的微生物の単離を助け、どのような種類の微生物が存在するかをより正確かつ確実に決定するために、異なる種類の選択培地を含有する多様な寒天培地プレート上で試料を培養することもできる。選択剤（たとえば、抗生物質、抗真菌剤など）は、ある特定の非標的微生物（たとえば、対象でない細菌）を排除する。これにより、多くの異なる種類の微生物からのコロニーが形成された場合に、偽の結果が生じ得るおそれが回避される。 Samples can also be cultured on a variety of agar plates containing different types of selective media to help isolate target microorganisms and more accurately and reliably determine what types of microorganisms are present. it can. Selective agents (eg, antibiotics, antifungal agents, etc.) exclude certain non-target microorganisms (eg, non-target bacteria). This avoids the possibility of false results when colonies from many different types of microorganisms are formed.
選択剤は、他の微生物に対し、ある特定の種類の微生物の増殖を助長することもできる。ＴＶＯアッセイは、異なる微生物種、たとえば、異なる細菌種の検出を可能にするが、食物および環境の微生物学者は、多くの場合、計数と同定のどちらかを、両方という選択肢はなしに選択しなければならない。選択剤を加えて特定の菌群の増殖を助長することはできるが、ＴＶＯアッセイは、多くの場合、正常な健康な細胞が栄養豊富な培地（すなわち、選択なしの）において繁殖する能力に基づく。それゆえ、ＴＶＯは、試験される試料中の微生物の総数または１つの群の微生物を測定するキャパシティを有する。しかしながら、特定の微生物を区別する能力の不足のために、ＴＶＯは、微生物集団全体に対して比較的非特異的である可能性がある。 Selective agents can also promote the growth of certain types of microorganisms relative to other microorganisms. TVO assays allow for the detection of different microbial species, for example, different bacterial species, but food and environmental microbiologists often have to choose between counting and identifying without both options. Don't be. Although selective agents can be added to promote the growth of specific fungal groups, TVO assays are often based on the ability of normal healthy cells to grow in nutrient-rich media (ie, no selection). . Therefore, TVO has the capacity to measure the total number of microorganisms or one group of microorganisms in the sample being tested. However, due to the lack of ability to distinguish specific microorganisms, TVO may be relatively non-specific to the entire microbial population.
特定の微生物、とりわけ病原体を同定する多数の他の方法が利用可能である。そのような方法は、臨床状況において広く使用されている。微生物を検出するための方法は、多くの場合、標的微生物の数を増加させるためおよび損傷を受けた微生物を回復させるために、微生物培養物の富化に依存する。選択的および鑑別的な平板培養を用いる場合、研究者は、標的菌をバックグラウンド微生物叢から識別することが可能である。しかしながら、結果は、ほぼ常に非計数的である。換言すれば、特定の細菌集団の存在または不在のみを決定することができ、数量を決定することはできない。 Many other methods for identifying specific microorganisms, particularly pathogens, are available. Such methods are widely used in clinical situations. Methods for detecting microorganisms often rely on enrichment of microbial cultures to increase the number of target microorganisms and to recover damaged microorganisms. When using selective and differential plating, researchers can distinguish target bacteria from the background microbiota. However, the results are almost always non-counting. In other words, only the presence or absence of a particular bacterial population can be determined, and the quantity cannot be determined.
試料富化と選択的平板培養の結果の両方を利用することは、時間のかかるアッセイであり、これは多くの場合、予備的結果ですら得られるまでに数日を要する。そのような富化および選択的平板培養は、試料中の微生物の数および種類を決定するための常套手段であるが、それは典型的に、寒天培地上で増殖したコロニーをカウントした後最終結果を得るのに数日を要し得る。結果を得るのに要する時間量は、常套のＴＶＯアッセイを使用することの最も顕著な欠点である。 Utilizing both sample enrichment and selective plating results is a time consuming assay, which often takes several days to obtain even preliminary results. Such enrichment and selective plating are routine means for determining the number and type of microorganisms in a sample, but it typically yields final results after counting colonies grown on agar. It can take several days to get. The amount of time required to obtain results is the most significant disadvantage of using a conventional TVO assay.
選択的および鑑別的な平板培養ステップを排除することにより検出時間の短縮を試みる、異なる方法が開発されている。そのような方法としては、ＤＮＡハイブリダイゼーション、凝集反応、および酵素免疫測定法が挙げられる。これらの代替的技法により、検出のための時間が短縮されたが、これらの方法では、可能な極限検出（ｕｌｔｉｍａｔｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）が標的病原体１０３〜１０４ＣＦＵに限られるため、培養物富化ステップは、依然として必要である。それゆえ、ＴＶＯアッセイには、陽性と推定される結果に対する確認が、依然として必要である。 Different methods have been developed that attempt to reduce detection time by eliminating selective and differential plating steps. Such methods include DNA hybridization, agglutination, and enzyme immunoassay. Although these alternative techniques have reduced the time for detection, these methods limit the possible ultimate detection to the target pathogen 10 3 to 10 4 CFU, so that the culture enrichment step Is still needed. Therefore, confirmation for the presumed positive result is still necessary for the TVO assay.
さらに、生物試料、とりわけ食物試料を分析して複数の微生物の存在または不在について検出するために利用可能な普遍的方法または単一の技法は存在しない。これにより、微生物に対するアッセイの前に、生物試料から微生物を分離し、その後濃縮するための試料調製ステップは、食物由来病原体を包含する病原体を検出するための分子法における律速ステップとなる。 Furthermore, there is no universal method or single technique available for analyzing biological samples, particularly food samples, to detect the presence or absence of multiple microorganisms. Thus, the sample preparation step for separating the microorganism from the biological sample prior to assaying for the microorganism and then concentrating it becomes a rate-limiting step in molecular methods for detecting pathogens including food-derived pathogens.
微生物を分離するための特定の試料調製技法に関して、遠心分離に続いて洗浄および濾過ステップを利用する技法は、加工中に微生物の顕著な損失または微生物への傷害を生じるために有利ではない。さらに、全手順は、自動化に適さない。 With respect to certain sample preparation techniques for separating microorganisms, techniques that utilize washing and filtration steps following centrifugation are not advantageous because they cause significant loss or damage to the microorganisms during processing. Furthermore, the whole procedure is not suitable for automation.
微生物の試料からの分離を実現するため、特定の微生物に対する親和剤が用いられている。しかしながら、微生物を複合マトリックスから単離するために使用される親和剤もまた、採用が複雑である。その理由は、１）その他の試料構成要素から選択的にすべての菌と結合する普遍的な親和剤が不足していること；２）普遍的な親和性試薬に対する異なる菌の結合親和性にばらつきがあること；および３）結合された菌を溶離して溶液中に戻すのが困難であることである。 In order to achieve separation of microorganisms from samples, affinity agents for specific microorganisms are used. However, affinity agents used to isolate microorganisms from complex matrices are also complex to adopt. The reasons are: 1) lack of universal affinity agents that selectively bind to all bacteria from other sample components; 2) variation in binding affinity of different bacteria for universal affinity reagents. And 3) it is difficult to elute the bound bacteria back into solution.
食物および水中の病原体を同定するための他の技法も知られている。たとえば、フローサイトメトリーは、微生物を計数および同定するための迅速な技法として報告されている。フローサイトメトリーは、真核細胞集団を分離および分析するために元来使用される方法であるが、微生物の評価および検出においても用いられている。詳細には、たとえば核酸色素で蛍光染色した微生物に、光線中を通過させる。対象の微生物に特有のパターンが、光の吸収（ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ）と散乱の両方の組合せにより取得される（非特許文献１；非特許文献２）。 Other techniques for identifying pathogens in food and water are also known. For example, flow cytometry has been reported as a rapid technique for counting and identifying microorganisms. Flow cytometry is a method originally used to separate and analyze eukaryotic cell populations, but is also used in the evaluation and detection of microorganisms. Specifically, for example, a microorganism stained with a nucleic acid dye is allowed to pass through the light beam. A pattern specific to the target microorganism is obtained by a combination of both absorption and scattering of light (Non-Patent Document 1; Non-Patent Document 2).
フローサイトメトリーの主な利点は、実施が高速かつ容易であることである。フローサイトメトリーは、異なる種類の試料および方法に対して適合可能であり、それにより、自動化にも適するロバストなアプリケーションとなる。工業バイオテクノロジー、食物および医薬品の品質管理、飲料水および廃水システムの日常的モニタリング、ならびに土壌および自然の水生生息地における微生物生態学的研究において、多数のフローサイトメトリーアプリケーションが出現していることは驚くべきことではない。フローサイトメトリー結果は、標準的なプレートカウント法の結果と、良好な相関を示す。 The main advantage of flow cytometry is that it is fast and easy to perform. Flow cytometry can be adapted for different types of samples and methods, thereby making it a robust application that is also suitable for automation. Numerous flow cytometry applications are emerging in industrial biotechnology, food and pharmaceutical quality control, routine monitoring of drinking water and wastewater systems, and microbial ecological studies in soil and natural aquatic habitats Not surprising. The flow cytometry results show a good correlation with the standard plate count results.
しかしながら、フローサイトメトリーは、検出のために標的微生物の色素標識が必要であること、設備のコストが高いこと、および人材の特殊な訓練が必要であることなど、他の制限を有する。検出に対するさらなる制限が、非特異的蛍光の干渉、最適ではない検出限界、方法を固体または粒子状の食物試料に適用することの困難さ、特殊な染色を使用しなければ生存細胞と死細胞の区別ができないこと、および試料加工中にも起こり得る細胞の生存性の破壊により課される（非特許文献３）。この技法の広範かつ日常的な使用により、これらの欠点は緩和され始めている。 However, flow cytometry has other limitations such as the need for dye labeling of the target microorganism for detection, high equipment costs, and the need for specialized training of personnel. Further limitations on detection include non-specific fluorescence interference, suboptimal detection limits, difficulty in applying the method to solid or particulate food samples, and viable and dead cells without special staining. It is imposed by the indistinguishability and destruction of cell viability that can occur during sample processing (Non-patent Document 3). With the extensive and routine use of this technique, these shortcomings are beginning to be alleviated.
とりわけ「複合マトリックス」と称されるものに由来する生物または環境試料の分析に関連して、フローサイトメトリーには、他の実務的な問題が残されている。複合マトリックスは、生物または環境試料中の微生物の検出に干渉する粒子状物質を包含する物質からなり得る。試料中の微生物を検出するために使用される核酸色素は、試料マトリックス中のそのような粒子状物質と非特異的に結合し、高いバックグラウンド蛍光シグナルを生じ得る。この高いバックグラウンドにより、試料中の低濃度の微生物の同定および分析が困難となる。 Other practical problems remain in flow cytometry, particularly in connection with the analysis of biological or environmental samples derived from what are termed “complex matrices”. The composite matrix may consist of materials including particulate matter that interferes with the detection of microorganisms in biological or environmental samples. Nucleic acid dyes used to detect microorganisms in a sample can bind non-specifically with such particulate matter in the sample matrix, resulting in a high background fluorescence signal. This high background makes it difficult to identify and analyze low concentrations of microorganisms in the sample.
その全内容がここで参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｕｔｔｒｙらの特許文献１に記載されるように、膜透過性の死細胞により生成される蛍光バックグラウンドおよび蛍光シグナルは、標的特異的な蛍光色素および蛍光消光剤を対象の試料中に混合することにより、低減することができる。しかしながら、標的特異的な蛍光色素に対する非特異的親和性を有する細胞外粒子を含有する一部の試料マトリックスにおいては、蛍光バックグラウンドを、蛍光消光剤により効果的に消光することができない。加えて、標的特異的な蛍光色素に対する非特異的親和性を有する細胞外粒子を大量に含有する試料においては、標的特異的な色素の大部分が粒子と非特異的に結合し、結果として、標的菌を標識するために溶液中で利用可能な色素分子が不十分となる。 As described in Buttry et al., U.S. Patent No. 6,057,097, the entire contents of which are hereby incorporated herein by reference, the fluorescence background and signal generated by membrane permeable dead cells is target specific. It can be reduced by mixing a fluorescent dye and a fluorescence quencher into the sample of interest. However, in some sample matrices containing extracellular particles with non-specific affinity for target-specific fluorescent dyes, the fluorescence background cannot be effectively quenched by the fluorescence quencher. In addition, in samples containing large amounts of extracellular particles with non-specific affinity for target-specific fluorescent dyes, most of the target-specific dye binds non-specifically to the particles, resulting in: Insufficient dye molecules are available in solution to label the target bacteria.
よって、フローサイトメトリーを使用して試料中の微生物の存在または不在を検出するための現行の方法の欠点に対処する方法が求められている。 Thus, there is a need for a method that addresses the shortcomings of current methods for detecting the presence or absence of microorganisms in a sample using flow cytometry.
本発明は、試料中の少なくとも１種の微生物の存在または不在を同定する方法に関する。本明細書に記載されるように、少なくとも１種の微生物の存在または不在について試験すべき試料が最初に採取され、次いで実施すべきアッセイのために調製される。生きている菌と死滅した菌の両方に対して浸透性の蛍光核酸染色剤を使用して、浮遊している細胞をフローサイトメトリー研究のために標識する。しかしながら、そのようなフローサイトメトリー研究の検出感度は、標的細胞が、核酸色素と非特異的に結合する試料マトリックスからの粒子状物質とともに浮遊液中に存在する間に、悪影響を受ける可能性がある。溶液中のそれらの干渉粒子からの蛍光シグナルを遮蔽および／または除去し、その後検出感度を高めるためのいくつかの手法が、本明細書に記載される。 The present invention relates to a method for identifying the presence or absence of at least one microorganism in a sample. As described herein, a sample to be tested for the presence or absence of at least one microorganism is first taken and then prepared for the assay to be performed. Floating cells are labeled for flow cytometry studies using fluorescent nucleic acid stains that are permeable to both live and dead bacteria. However, the detection sensitivity of such flow cytometry studies can be adversely affected while target cells are present in suspension with particulate matter from the sample matrix that binds non-specifically to the nucleic acid dye. is there. Several techniques are described herein for shielding and / or removing fluorescent signals from those interfering particles in solution and then increasing detection sensitivity.
一実施形態では、試料を分析して生存微生物の量を決定する方法は、試料を採取するステップと、前記試料中の生存微生物の存在または不在を検出するためのアッセイのために前記試料を調製するステップとを包含する。一実施形態では、アッセイは、ＴＶＯアッセイである。試料調製の一環として、過剰量のバックグラウンドシグナルを低減する分子（以下、バックグラウンドシグナル低減分子）を試料に加える。バックグラウンドシグナル低減分子は、試料中の生存細胞に浸透しないが、生存細胞に浸透する核酸染色剤（これもまた、試料に加えられる）と同様の、調製された試料における非生存細胞（たとえば、死細胞、細胞残屑）および試料中の他の非細胞性物質に対する結合特性を有する。次いで、調製された試料を、総生菌についてアッセイする。 In one embodiment, a method for analyzing a sample to determine the amount of viable microorganisms comprises preparing the sample for the step of taking a sample and an assay for detecting the presence or absence of viable microorganisms in the sample. Including the steps of: In one embodiment, the assay is a TVO assay. As part of sample preparation, an excessive amount of a molecule that reduces background signal (hereinafter, background signal reducing molecule) is added to the sample. Background signal-reducing molecules do not penetrate viable cells in the sample, but non-viable cells (eg, for example) in prepared samples similar to nucleic acid stains that also penetrate viable cells (which are also added to the sample). Has binding properties to dead cells, cell debris) and other non-cellular substances in the sample. The prepared sample is then assayed for total viable bacteria.
本明細書で企図されるバックグラウンドシグナル低減分子の例は、ヘミシアニンまたは閉鎖シアニンである。そのような分子は、少なくとも１個の窒素原子を含有する５員複素環を有する基本的なシアニン構造を包含する。基本的なシアニン構造は、構造（Ｉ）： Examples of background signal reducing molecules contemplated herein are hemicyanine or closed cyanine. Such molecules include a basic cyanine structure having a 5-membered heterocycle containing at least one nitrogen atom. The basic cyanine structure is structure (I):
Ｙ−（ＣＨ＝ＣＨ）ｎ−ＣＨ＝Ｚ Y— (CH═CH) n —CH═Z
構造（Ｉ）、またはその塩 Structure (I) or a salt thereof
（式中、Ｙは、 (Where Y is
であり； Is;
ｎは、０または最大約５の整数であり；一部の実施形態では、ｎは、０または最大約３の整数であり； n is 0 or an integer of up to about 5; in some embodiments, n is 0 or an integer of up to about 3;
Ｘは、炭素または硫黄のいずれかであり； X is either carbon or sulfur;
Ｒ１は、場合により、水素、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基、サルファイト部分、またはアルキルアミドである）
として示される。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、バックグラウンドシグナル低減分子の生存標的微生物中への細胞浸透性を低下させるために選択される。
R 1 is optionally hydrogen, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a sulfite moiety, or an alkylamide)
As shown. In certain embodiments, R 1 is selected to reduce cell penetration of background signal reducing molecules into living target microorganisms.
Ｚは、Ｙと同じかまたは異なるかのいずれかである。同じにせよ異なるにせよ、Ｚはまた、Ｙの５員複素環も包含する。ＺがＹと異なる場合、差異は、５員複素環の置換基に存する。 Z is either the same as or different from Y. Whether the same or different, Z also includes a 5-membered heterocycle of Y. If Z is different from Y, the difference lies in the substituent of the 5-membered heterocyclic ring.
場合により、Ｙ部分は、それに縮合したベンゼンまたはベンゼン誘導体を有する。ベンゼンまたはベンゼン誘導体は、置換されていても置換されていなくてもよい。本明細書で使用されるベンゼン誘導体は、ナフタレンなどの多環芳香族部分を包含する。他の実施形態では、５員環構造は、キノロン置換基を有する。キノロン置換基もまた、置換されていても置換されていなくてもよい。 Optionally, the Y moiety has benzene or a benzene derivative condensed to it. Benzene or a benzene derivative may be substituted or unsubstituted. As used herein, benzene derivatives include polycyclic aromatic moieties such as naphthalene. In other embodiments, the 5-membered ring structure has a quinolone substituent. A quinolone substituent may also be substituted or unsubstituted.
別の実施形態では、試料を分析して生存微生物の量を決定する方法は、試料を採取するステップと、ＴＶＯアッセイのために前記試料を調製するステップとを包含する。生存細胞に浸透しない、蛍光消光剤と共有結合により連結された核酸染色剤が試料に加えられる。生存細胞に浸透し、蛍光消光剤と共有結合により連結されていない核酸染色剤もまた試料に加えられる。生存細胞に浸透しない核酸染色剤は、スペクトル重複により核酸色素の蛍光シグナルを消光することができる。 In another embodiment, a method for analyzing a sample to determine the amount of viable microorganisms comprises taking a sample and preparing the sample for a TVO assay. A nucleic acid stain that is covalently linked to a fluorescence quencher that does not penetrate viable cells is added to the sample. A nucleic acid stain that penetrates viable cells and is not covalently linked to a fluorescence quencher is also added to the sample. Nucleic acid stains that do not penetrate viable cells can quench the fluorescence signal of the nucleic acid dye due to spectral overlap.
さらに別の実施形態では、ＴＶＯアッセイのための試料の調製は、樹脂を使用して粒子状物質の少なくとも一部分を複合マトリックスから除去することを包含する。一実施形態では、樹脂により粒子状物質の少なくとも一部分を複合マトリックスから除去することは、試料を採取することと、前記試料を樹脂と組み合わせることとを包含する。樹脂はその後、試料からの粒子状物質の少なくとも一部を保持しつつ、試料から除去される。試料に、生存細胞に浸透する核酸染色剤を加える。次いで、調製された試料を、総生菌の存在および量についてアッセイする。一実施形態では、樹脂による粒子状物質の除去は、過剰量のバックグラウンドシグナル低減分子を加える前に、または蛍光消光剤と共有結合により連結された核酸染色剤を加える前に用いることができる。 In yet another embodiment, the preparation of a sample for a TVO assay includes using a resin to remove at least a portion of the particulate material from the composite matrix. In one embodiment, removing at least a portion of the particulate material from the composite matrix with the resin includes taking a sample and combining the sample with the resin. The resin is then removed from the sample while retaining at least a portion of the particulate matter from the sample. To the sample, add a nucleic acid stain that penetrates viable cells. The prepared sample is then assayed for the presence and amount of total viable bacteria. In one embodiment, removal of particulate matter by the resin can be used before adding an excess amount of background signal reducing molecule or before adding a nucleic acid stain covalently linked to a fluorescence quencher.
本発明のさらなる実施形態は、試料中の少なくとも１種の微生物を検出するための市販キットであって、バックグラウンドシグナル低減分子または消光剤と共有結合により連結された核酸の少なくとも１種と；核酸染色剤と；場合により、樹脂とを含むキットを包含する。市販セットは、試料と組み合わされ、試料中の生存微生物の存在または不在を決定するアッセイに供される。 A further embodiment of the invention is a commercial kit for detecting at least one microorganism in a sample, comprising at least one nucleic acid covalently linked to a background signal reducing molecule or quencher; Includes a kit comprising a staining agent; and optionally a resin. The commercial set is combined with the sample and subjected to an assay to determine the presence or absence of viable microorganisms in the sample.
本明細書に記載されるのは、試料分析にフローサイトメトリーを採用することにより、ＴＶＯアッセイなどの公知のアッセイに改良を加えるための方法である。食品、化粧品、および土壌試料から採取された試料は、「複合マトリックス」中の粒子状物質により引き起こされる干渉のために、フローサイトメトリーを使用して正確に分析することが困難な場合がある。本明細書で使用される複合マトリックスとは、顕著な量のアッセイと無関係の材料を有する試料である。本明細書で企図されるアッセイの場合、これらの無関係の材料とは、死細胞、細胞の残屑、および生存微生物以外の他の試料構成要素である。本明細書に記載される方法は、低レベルの病原体または散在する夾雑物の検出に必要とされるように試料調製を改良するのに役立ち、それにより、アッセイの前に試料培養物を富化する必要性を低減またはさらには排除できる可能性がある。 Described herein are methods for improving known assays such as the TVO assay by employing flow cytometry for sample analysis. Samples taken from food, cosmetics, and soil samples may be difficult to accurately analyze using flow cytometry due to interference caused by particulate matter in the “composite matrix”. As used herein, a composite matrix is a sample that has a significant amount of material unrelated to the assay. For the assays contemplated herein, these extraneous materials are dead cells, cellular debris, and other sample components other than viable microorganisms. The methods described herein help improve sample preparation as required for detection of low levels of pathogens or scattered contaminants, thereby enriching the sample culture prior to the assay. The need to do so may be reduced or even eliminated.
詳細には、本明細書に記載される方法および分子は、標的微生物を含有する疑いがある試料を、標的微生物の存在または不在を検出するための試験またはアッセイに供する前に、試料品質を改良する。本明細書に記載される方法を使用することの利点としては、複数の微生物株の検出を容易にすること；マトリックスに関連するアッセイ阻害因子（ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｓｓａｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を除去すること；干渉するマトリックス微粒子を除去すること；検出シグナル強さまたは検出シグナルを読み取る能力を向上させること、ならびに必要な試料サイズを低減して、よりサービングサイズの典型となる食物試料サイズおよび／または小さい培地体積の使用を可能にすることが挙げられるが、これらに制限されない。 Specifically, the methods and molecules described herein improve sample quality before subjecting a sample suspected of containing a target microorganism to a test or assay to detect the presence or absence of the target microorganism. To do. Advantages of using the methods described herein include facilitating detection of multiple microbial strains; removing matrix-associated assay inhibitors; interfering Removing matrix particulates; improving detection signal strength or ability to read detection signals, and reducing the required sample size to use a food sample size and / or smaller media volume typical of a larger serving size But is not limited thereto.
試料調製のための本明細書に記載される方法および試薬は、低レベルの病原体または散在する夾雑物の検出を容易にする。方法および試薬は、試料アッセイの前に、検出に利用可能な微生物の量を増加させるためまたは微生物増殖を加速させるために、試料培養物を富化する必要性を低減またはさらには排除する。 The methods and reagents described herein for sample preparation facilitate the detection of low levels of pathogens or scattered contaminants. The methods and reagents reduce or even eliminate the need to enrich the sample culture to increase the amount of microorganisms available for detection or to accelerate microbial growth prior to sample assay.
本明細書に記載される方法および分子は、標的微生物／病原体／細菌に対するアッセイに干渉し得るマトリックスに関連する阻害因子を試料から除去することにより、試料中の標的微生物／病原体／細菌を濃縮する（存在する場合）。本明細書に記載される方法および分子はまた、標的微生物／病原体／細菌の存在または不在の指標となる、試料から得られるシグナル対ノイズ比も向上させる。記載される方法は、普遍的（たとえば、複数の種類のマトリックスおよび標的微生物／病原体／細菌に適用可能）であるために有利である。記載される方法は、簡単、迅速、かつ安価である。さらに、本明細書に記載される方法は、試料に加えられる検出色素の標的微生物／病原体／細菌と残留マトリックス成分または死滅した標的細胞の両方との交差反応性のために、誤った陽性または陰性の結果が生じ得る可能性を低減する。
過剰のバックグラウンドシグナル低減分子
The methods and molecules described herein enrich target microorganisms / pathogens / bacteria in a sample by removing from the sample inhibitors associated with the matrix that can interfere with the assay against the target microorganism / pathogen / bacteria. (If there). The methods and molecules described herein also improve the signal-to-noise ratio obtained from the sample, which is an indication of the presence or absence of the target microorganism / pathogen / bacteria. The described method is advantageous because it is universal (eg applicable to multiple types of matrices and target microorganisms / pathogens / bacteria). The method described is simple, quick and inexpensive. In addition, the methods described herein may result in false positives or negatives due to cross-reactivity of detection dyes added to the sample with both target microorganisms / pathogens / bacteria and residual matrix components or dead target cells. Reduce the likelihood that this result can occur.
Excess background signal reducing molecules
一実施形態では、生存微生物の量（ＴＶＯ）について試料を分析する方法は、ｉ）試料を採取するステップ；ｉｉ）過剰量のバックグラウンドシグナル低減分子を加えることにより；および生存細胞に浸透する核酸染色剤を加えることにより、試料を調製するステップを包含する。バックグラウンドシグナル低減分子は、生存細胞に浸透しないが、調製された試料に対して、核酸染色剤と同様の結合特性を有する。次いで、調製された試料を分析する。 In one embodiment, the method of analyzing a sample for the amount of viable microorganisms (TVO) comprises: i) taking a sample; ii) adding an excess amount of background signal reducing molecule; and nucleic acid penetrating into viable cells It includes the step of preparing the sample by adding a stain. Background signal reducing molecules do not penetrate viable cells but have similar binding properties to prepared samples as nucleic acid stains. The prepared sample is then analyzed.
本明細書に記載される方法は、試料を採取することを企図する。試料は、たとえば、環境試料、食物試料、化粧品試料、または生物試料であり得る。これらの種類の試料は、多くの場合、たとえば土壌残屑細胞外マトリックスなどの様々な粒子状物質を含有する複合マトリックスの形態である。 The methods described herein contemplate taking a sample. The sample can be, for example, an environmental sample, a food sample, a cosmetic sample, or a biological sample. These types of samples are often in the form of composite matrices containing various particulate materials such as soil debris extracellular matrix.
分析すべき試料は、当業者に周知の、分析すべき特定の種類の試料のための公知の技法を使用して調製される。したがって、試料調製技法は、本明細書には詳細に記載しない。典型的な一実施形態では、食肉試料を調製するためのプロセスは、最初に食肉を緩衝液とブレンドすることを包含する。食肉を適正な緩衝液とブレンドして食肉エキスを得るための標準的なプロトコルの使用は、本明細書に記載される方法における使用に好適であると企図される。ブレンドは、食肉試料を適切な体積のリン酸緩衝希釈水に加え、ストマッカー袋（＜５０μＭフィルター−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｂａｇ ｓｙｓｔｅｍ：１１１６２５または相当品）に移し、ストマッカー（たとえば、Ｔｅｋｍａｒ（Ｓｅｗａｒｄ）Ｓｔｏｍａｃｈｅｒ Ｌａｂ Ｂｌｅｎｄｅｒ４００または相当品）でブレンドするなど、多様な技法を使用して達成される。そのようなプロトコルは、当業者に周知であり、本明細書には詳細に記載しない。そのようなプロトコルの例は、非特許文献４に記載され、これは、参照により本明細書に組み込まれる。 The sample to be analyzed is prepared using known techniques for the particular type of sample to be analyzed, well known to those skilled in the art. Accordingly, sample preparation techniques are not described in detail herein. In an exemplary embodiment, the process for preparing a meat sample includes first blending the meat with a buffer. The use of standard protocols for blending meat with a suitable buffer to obtain a meat extract is contemplated to be suitable for use in the methods described herein. For blends, add meat sample to appropriate volume of phosphate buffered dilution water, transfer to stomacher bag (<50 μM filter-Interscience Bag system: 111625 or equivalent) and stomacher (eg, Tekmar (Seward) Stomacher Lab Blender 400 or equivalent). This is accomplished using a variety of techniques, such as blending. Such protocols are well known to those skilled in the art and are not described in detail herein. An example of such a protocol is described in Non-Patent Document 4, which is incorporated herein by reference.
試料を調製した後、生存細胞に浸透しないが核酸染色剤と同様の結合特性を有する過剰量のバックグラウンドシグナル低減分子を、調製された試料に加える。バックグラウンドシグナル低減分子は、生存細胞に対して浸透性でないことから、細胞浸透性の核酸色素のみが、生存細胞を標識し、細胞からの蛍光シグナルを生成することができる。色素と非特異的に結合する干渉粒子は、核酸染色剤と本明細書に記載される分子の両方と結合される。バックグラウンドシグナル低減分子は、細胞外粒子および死細胞などのマトリックス中の粒子状物質との核酸染色剤の結合について競合し、結果として、試料をフローサイトメトリーにより分析した際の核酸染色剤の非特異的結合により引き起こされる蛍光シグナルを低減することができる。 After the sample is prepared, an excess amount of background signal reducing molecule that does not penetrate viable cells but has similar binding properties as the nucleic acid stain is added to the prepared sample. Since background signal reducing molecules are not permeable to viable cells, only cell permeable nucleic acid dyes can label viable cells and generate fluorescent signals from the cells. Interfering particles that bind non-specifically to the dye are bound to both the nucleic acid stain and the molecules described herein. Background signal reducing molecules compete for binding of the nucleic acid stain to particulate matter in the matrix, such as extracellular and dead cells, and as a result, the non-deletion of the nucleic acid stain when the sample is analyzed by flow cytometry. The fluorescence signal caused by specific binding can be reduced.
バックグラウンドシグナル低減分子の量は、その量が、複合マトリックス試料中の実質的にすべての粒子状物質の結合に関して核酸染色剤と好都合に競合するように、核酸染色剤を上回っている限り制限されない。過剰量のバックグラウンドシグナル低減分子は、核酸染色剤と好都合に競合し、試料中の粒子状物質と結合することができるため、核酸染色剤の粒子状物質との非特異的結合が低減され、非特異的蛍光強度を低下させる。したがって、本明細書に記載される「過剰濃度」は定性的であり、試料に加えられる核酸色素の量と比べたものである。当業者は、核酸色素の、特定の用途のための非標的粒子との望ましくない非特異的結合を軽減、低減、または排除するために加えるべきバックグラウンドシグナル低減分子の量を、容易に決定することができる。 The amount of background signal reducing molecule is not limited as long as the amount exceeds the nucleic acid stain so that it advantageously competes with the nucleic acid stain for binding of substantially all particulate matter in the composite matrix sample. . An excess amount of background signal reducing molecule can compete favorably with the nucleic acid stain and bind to particulate matter in the sample, thus reducing non-specific binding of the nucleic acid stain to the particulate matter, Reduce non-specific fluorescence intensity. Thus, the “excess concentration” described herein is qualitative and is compared to the amount of nucleic acid dye added to the sample. One skilled in the art readily determines the amount of background signal reducing molecule that should be added to reduce, reduce, or eliminate undesired non-specific binding of nucleic acid dyes to non-target particles for a particular application. be able to.
一実施形態では、バックグラウンドシグナル低減分子の濃度は、試料と組み合わせたとき、約０．１μＭから約５０μＭである。別の実施形態では、バックグラウンドシグナル低減分子の濃度は、試料と組み合わせたとき、約０．１μＭから約１０μＭである。さらに別の実施形態では、バックグラウンドシグナル低減分子の濃度は、試料と組み合わせたとき、約０．５μＭから約５μＭである。 In one embodiment, the concentration of background signal reducing molecule is from about 0.1 μM to about 50 μM when combined with the sample. In another embodiment, the concentration of background signal reducing molecule is about 0.1 μM to about 10 μM when combined with the sample. In yet another embodiment, the concentration of background signal reducing molecule is from about 0.5 μM to about 5 μM when combined with the sample.
一実施形態では、生存細胞に浸透しないが核酸染色剤と同様の結合特性を有する過剰量のバックグラウンドシグナル低減分子は、細胞浸透性の核酸染色剤と逐次的にまたは同時に、分析すべき試料に加えられる。別の実施形態では、バックグラウンドシグナル低減分子は、核酸染色剤を加える前に加えられる。 In one embodiment, an excess amount of background signal reducing molecule that does not penetrate living cells but has similar binding properties as the nucleic acid stain is applied to the sample to be analyzed, either sequentially or simultaneously with the cell-permeable nucleic acid stain. Added. In another embodiment, the background signal reducing molecule is added prior to adding the nucleic acid stain.
バックグラウンドシグナル低減分子を試料に加えた後、混合物をインキュベートしてもよい。一実施形態では、混合物は、約２分から約１時間インキュベートされる。別の実施形態では、混合物は、約２分から約３０分間インキュベートされる。さらに別の実施形態では、混合物は、約２分から約５分間インキュベートされる。 After adding the background signal reducing molecule to the sample, the mixture may be incubated. In one embodiment, the mixture is incubated for about 2 minutes to about 1 hour. In another embodiment, the mixture is incubated for about 2 minutes to about 30 minutes. In yet another embodiment, the mixture is incubated for about 2 minutes to about 5 minutes.
バックグラウンドシグナル低減分子の構造は、分子が、複合マトリックス試料中の粒子状物質と結合でき、フローサイトメトリーにより分析した際のバックグラウンド蛍光シグナルを低減でき、生存微生物細胞に著しく浸透しないものである限り制限されない。たとえば、Ａｃｉｄ Ｂｌａｃｋ４８およびトリパンブルーなどの荷電分子を分子に加えることを包含する、細胞浸透性を低減するためのバックグラウンドシグナル低減分子の化学構造に対する改変は、当業者に公知であり、本明細書には詳細に記載しない。 The structure of the background signal reducing molecule is such that the molecule can bind to particulate matter in the complex matrix sample, reduce the background fluorescent signal when analyzed by flow cytometry, and not significantly penetrate viable microbial cells. Not limited. Modifications to the chemical structure of background signal reducing molecules to reduce cell permeability, including adding charged molecules such as Acid Black 48 and Trypan Blue to the molecule, are known to those skilled in the art and are described herein. Is not described in detail.
一実施形態では、バックグラウンドシグナル低減分子に、消光剤が付着されている。消光剤が付着されたバックグラウンドシグナル低減分子は、試料中の粒子状物質の結合部位に付着する。消光剤は、試料中の粒子状物質と非特異的に結合する、十分にそれに近接した、あらゆる核酸色素の蛍光シグナルを消光する。消光剤がそれに付着されたバックグラウンドシグナル低減分子の存在はさらに、二重に：ｉ）試料中の非標的物質上の結合部位をふさぐことにより；およびｉｉ）試料中の非標的物質と結合するあらゆる標的色素からのシグナルを消光することにより、バックグラウンドシグナルを低減する。消光剤の選択は、微生物細胞を検出および分析するために使用される核酸色素の種類に依存し、たとえば、トリパンブルーおよびクリスタルバイオレットを包含し得る。蛍光消光剤は、当業者に周知であり、それゆえ本明細書には詳細に記載しない。 In one embodiment, a quencher is attached to the background signal reducing molecule. The background signal reducing molecule to which the quencher is attached is attached to the binding site of the particulate matter in the sample. The quencher quenches the fluorescence signal of any nucleic acid dye that is in close proximity to it, which binds non-specifically to particulate matter in the sample. The presence of a background signal reducing molecule with a quencher attached to it further doubles: i) by blocking the binding site on the non-target substance in the sample; and ii) binds to the non-target substance in the sample By quenching the signal from any target dye, the background signal is reduced. The choice of quencher depends on the type of nucleic acid dye used to detect and analyze microbial cells and can include, for example, trypan blue and crystal violet. Fluorescence quenchers are well known to those skilled in the art and are therefore not described in detail herein.
本明細書で企図されるバックグラウンドシグナル低減分子の例は、ヘミシアニンまたは閉鎖シアニンである。そのような分子は、少なくとも１個の窒素原子を含有する５員複素環を有する基本的なシアニン構造を包含する。基本的なシアニン構造は、構造（Ｉ）： Examples of background signal reducing molecules contemplated herein are hemicyanine or closed cyanine. Such molecules include a basic cyanine structure having a 5-membered heterocycle containing at least one nitrogen atom. The basic cyanine structure is structure (I):
Ｙ−（ＣＨ＝ＣＨ）ｎ−ＣＨ＝Ｚ Y— (CH═CH) n —CH═Z
構造（Ｉ）、またはその塩 Structure (I) or a salt thereof
（式中、Ｙは、 (Where Y is
であり； Is;
ｎは、０または最大約５の整数であり；一部の実施形態では、ｎは、０または最大約３の整数であり； n is 0 or an integer of up to about 5; in some embodiments, n is 0 or an integer of up to about 3;
Ｘは、炭素または硫黄のいずれかであり； X is either carbon or sulfur;
Ｒ１は、場合により、水素、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基、サルファイト部分、またはアルキルアミドである。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、バックグラウンドシグナル低減分子の生存標的微生物中への細胞浸透性を低下させるために選択される。 R 1 is optionally hydrogen, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a sulfite moiety, or an alkylamide. In certain embodiments, R 1 is selected to reduce cell penetration of background signal reducing molecules into living target microorganisms.
Ｚは、Ｙと同じかまたは異なるかのいずれかである。同じにせよ異なるにせよ、Ｚはまた、Ｙの５員複素環も包含する。ＺがＹと異なる場合、差異は、５員複素環の置換基に存する。 Z is either the same as or different from Y. Whether the same or different, Z also includes a 5-membered heterocycle of Y. If Z is different from Y, the difference lies in the substituent of the 5-membered heterocyclic ring.
場合により、Ｙ部分は、それに縮合したベンゼンまたはベンゼン誘導体を有する。ベンゼンまたはベンゼン誘導体は、置換されていても置換されていなくてもよい。本明細書で使用されるベンゼン誘導体は、ナフタレンなどの多環芳香族部分を包含する。他の実施形態では、５員環構造は、キノロン置換基を有する。キノロン置換基もまた、置換されていても置換されていなくてもよい。 Optionally, the Y moiety has benzene or a benzene derivative condensed to it. Benzene or a benzene derivative may be substituted or unsubstituted. As used herein, benzene derivatives include polycyclic aromatic moieties such as naphthalene. In other embodiments, the 5-membered ring structure has a quinolone substituent. A quinolone substituent may also be substituted or unsubstituted.
一実施形態では、バックグラウンドシグナル低減分子は、ｎが、最大３であり、Ｘが、硫黄であり、Ｒ１が、アルキルアミドであり、Ｙが、それに縮合したベンゼン部分またはベンゼン部分誘導体を有する、構造（Ｉ）の化合物を包含する。 In one embodiment, the background signal reducing molecule has n up to 3, X is sulfur, R 1 is an alkylamide, and Y has a benzene moiety or benzene moiety derivative fused thereto. , Including compounds of structure (I).
一実施形態では、バックグラウンドシグナル低減分子は、以下： In one embodiment, the background signal reducing molecule is:
（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）から市販、カタログ番号３８１３０６）； (Commercially available from Sigma-Aldrich®, catalog number 381306);
（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）から市販、カタログ番号Ｓ９９２００３）； (Commercially available from Sigma-Aldrich®, catalog number S992003);
（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）から市販、カタログ番号Ｓ９８１８２６）； (Commercially available from Sigma-Aldrich®, catalog number S981826);
（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）から市販、カタログ番号Ｓ１７１３６０）； (Commercially available from Sigma-Aldrich®, catalog number S171360);
（式中、ＱＧは、蛍光シグナル消光基を表す）
の少なくとも１種を包含する。
(In the formula, QG represents a fluorescence signal quenching group)
Including at least one of the following.
試料中の微生物の存在について検出するために、核酸染色剤を試料に加える。そのような染色剤、たとえばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＳＹＴＯ（登録商標）１３は、当業者に周知である。染色剤を選択する際、当業者は、以下の要素：ｉ）対象の標的微生物（たとえば、グラム陽性またはグラム陰性）、ｉｉ）試料中の微生物の存在または不在を決定するために採用される下流のアッセイ；およびｉｉｉ）選択した染色剤と試料構成要素のための他の染色剤とのコントラストを考慮する。当業者は、本明細書に記載される方法のための色素染色剤を選択する際の他の考慮事項を認識している。核酸染色剤は、バックグラウンドシグナル低減分子とのインキュベーションと同時にまたはその後に加えることができる。 In order to detect for the presence of microorganisms in the sample, a nucleic acid stain is added to the sample. Such stains, such as SYTO® 13 from Invitrogen, are well known to those skilled in the art. In selecting a staining agent, one of ordinary skill in the art will employ the following factors: i) the target microorganism of interest (eg, gram positive or gram negative), ii) downstream employed to determine the presence or absence of the microorganism in the sample And iii) consider the contrast between the selected stain and other stains for the sample components. Those skilled in the art are aware of other considerations in selecting dye stains for the methods described herein. The nucleic acid stain can be added simultaneously with or after incubation with the background signal reducing molecule.
核酸染色剤で染色した後、試料を次いで、フローサイトメトリーを使用して、標的微生物の存在または不在について分析する。フローサイトメトリーの使用は、当業者に周知であり、本明細書には記載しない。フローサイトメトリー分析の説明は、非特許文献５に記載され、これは、参照により本明細書に組み込まれる。全プロセスを自動化することもできる。記載される方法は、フローサイトメトリーのための試料調製プロトコルを、試料中の標的物質（たとえば、生存微生物）についてのシグナル／バックグラウンド比を改良する物質を加えることを包含するように適合させる。 After staining with a nucleic acid stain, the sample is then analyzed for the presence or absence of the target microorganism using flow cytometry. The use of flow cytometry is well known to those skilled in the art and is not described herein. A description of flow cytometry analysis is described in Non-Patent Document 5, which is incorporated herein by reference. The entire process can also be automated. The described method adapts the sample preparation protocol for flow cytometry to include adding a substance that improves the signal / background ratio for the target substance (eg, viable microorganism) in the sample.
本明細書に記載される方法および分子は、核酸染色剤が複合マトリックスを含有する試料中の粒子状物質と非特異的に結合する際に得られるバックグラウンドシグナル強度を低減する。バックグラウンドシグナル強度の低減は、本明細書に記載される分子および樹脂を加えなかった同一の試料についてバックグラウンドシグナル強度がどのようになるかと比較される。一実施形態では、バックグラウンドシグナル強度は、少なくとも約９０％低減される。別の実施形態では、バックグラウンドシグナル強度は、少なくとも約７０％低減される。さらに別の実施形態では、バックグラウンドシグナル強度は、少なくとも約５０％低減される。
核酸色素と共有結合により連結された消光剤
The methods and molecules described herein reduce the background signal intensity obtained when a nucleic acid stain binds non-specifically to particulate matter in a sample containing a composite matrix. The reduction in background signal intensity is compared to what the background signal intensity will be for the same sample without the molecules and resins described herein. In one embodiment, the background signal intensity is reduced by at least about 90%. In another embodiment, the background signal intensity is reduced by at least about 70%. In yet another embodiment, the background signal intensity is reduced by at least about 50%.
Quenchers covalently linked to nucleic acid dyes
一実施形態では、試料を分析して生存微生物の量を決定する方法は、ｉ）試料を採取するステップと；ｉｉ）試料を調製するステップと；ｉｉｉ）蛍光消光剤と共有結合により連結された核酸染色剤を加えるステップと；ｉｖ）消光剤を含有せず、生存細胞に浸透する核酸染色剤を加えるステップと；ｖ）調製された試料を分析するステップとを包含する。 In one embodiment, a method for analyzing a sample to determine the amount of viable microorganisms comprises i) collecting a sample; ii) preparing a sample; iii) covalently linked to a fluorescence quencher. Adding a nucleic acid stain; iv) adding a nucleic acid stain that does not contain a quencher and penetrates viable cells; and v) analyzing the prepared sample.
この実施形態では、核酸染色剤の一部が、染色剤を生存細胞に浸透させずスペクトル重複により核酸染色剤の蛍光シグナルを消光することができる蛍光消光剤と共有結合により連結されている。消光剤を含む核酸染色剤は、生存細胞に対して浸透性でないことから、細胞浸透性の消光剤を含まない核酸染色剤のみが、生存細胞を標識することができる。核酸染色剤と非特異的に結合できる、死細胞または他の干渉粒子などの粒子状物質は、消光剤を含む核酸染色剤と消光剤を含まない核酸染色剤の両方を取り込む。染色剤−消光剤分子は、消光剤がそれに結合されていない色素と、粒子状物質上の結合部位について競合する。染色剤−消光剤分子の粒子状物質との結合は、そうでなければ粒子状物質により取り込まれた核酸染色剤により放出されるであろう蛍光シグナルの強度を低減する。 In this embodiment, a portion of the nucleic acid stain is covalently linked to a fluorescence quencher that can quench the fluorescence signal of the nucleic acid stain by spectral overlap without penetrating the viable cells. Since nucleic acid stains containing quenchers are not permeable to viable cells, only nucleic acid stains that do not contain cell-permeable quenchers can label viable cells. Particulate matter, such as dead cells or other interfering particles, that can bind non-specifically with the nucleic acid stain incorporates both the nucleic acid stain with and without the quencher. Stain-quencher molecules compete for binding sites on particulate matter with dyes to which no quencher is bound. The binding of the stain-quencher molecule to the particulate matter reduces the intensity of the fluorescent signal that would otherwise be released by the nucleic acid stain incorporated by the particulate matter.
一実施形態では、過剰量の消光剤を含む核酸染色剤は、細胞浸透性の消光剤を含まない核酸染色剤と逐次的にまたは同時に、分析すべき試料に加えられる。別の実施形態では、消光剤を含む核酸染色剤は、消光剤を含まない核酸染色剤を加える前に加えられる。この実施形態では、消光剤を含まない核酸染色剤は、消光剤を含む核酸染色剤と、粒子状物質上の結合部位について競合しない。
樹脂による粒子状物質の除去
In one embodiment, a nucleic acid stain containing an excess amount of quencher is added to the sample to be analyzed, either sequentially or simultaneously with a nucleic acid stain that does not contain a cell-permeable quencher. In another embodiment, the nucleic acid stain containing the quencher is added prior to adding the nucleic acid stain without the quencher. In this embodiment, the nucleic acid stain that does not contain a quencher does not compete for binding sites on the particulate matter with the nucleic acid stain that contains the quencher.
Removal of particulate matter by resin
一実施形態では、生物試料の調製は、分析の前に樹脂を使用して粒子状物質の少なくとも一部を複合マトリックスから除去することを包含する。粒子状物質の少なくとも一部を除去するための方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、本出願と共同所有される、２０１３年３月１３日に出願した米国特許出願第６１／７７９，７６６号明細書に記載される。手短に言えば、米国特許出願第６１／７７９，７６６号明細書に記載される方法および試薬は、標的微生物を含有する疑いがある試料を、標的微生物の存在または不在または数量を検出するための試験またはアッセイに供する前に、試料中の微生物を、一般に複合マトリックスを保有すると記載される他の試料構成要素（たとえば、牛挽肉、卵、牛乳、土壌、化粧品など）から分離し、試料品質を向上させる。本発明の別の実施形態では、樹脂を使用して、複合マトリックスの下流の試料アッセイ分析との干渉を調節または低減する。 In one embodiment, the preparation of the biological sample includes removing at least a portion of the particulate material from the composite matrix using a resin prior to analysis. A method for removing at least a portion of particulate matter is described in U.S. Patent Application 61/61, filed March 13, 2013, which is incorporated herein by reference in its entirety and co-owned with this application. 779,766. Briefly, the methods and reagents described in US Patent Application No. 61 / 779,766 are used to detect a sample suspected of containing a target microorganism to detect the presence or absence or quantity of the target microorganism. Prior to being subjected to testing or assay, the microorganisms in the sample are separated from other sample components that are generally described as possessing a composite matrix (eg, ground beef, egg, milk, soil, cosmetics, etc.) Improve. In another embodiment of the invention, the resin is used to modulate or reduce interference with sample assay analysis downstream of the composite matrix.
様々な樹脂が当技術分野で公知であり、特定の樹脂の選択は、分析すべき生物または環境試料の性質に依存する。樹脂は、アッセイを実施する前に、濾過などの技法により除去することができるが、用いられる特定の技法は、大いに設計選択の事項であり、樹脂および試料調製の種類に依存する。当業者は、これらのまたは他の要素に基づき、好適な分離技法を選択する。一実施形態では、非官能性樹脂、たとえば、Ｒｏｈｍ ＆ Ｈａａｓ製のＸＡＤ樹脂、特に、スチレンおよびジビニルベンゼンの非官能性共重合体であるＸＡＤ−４樹脂が、記載される方法の実施において使用され得る。 Various resins are known in the art, and the selection of a particular resin depends on the nature of the biological or environmental sample to be analyzed. Although the resin can be removed by techniques such as filtration prior to performing the assay, the particular technique used is largely a matter of design choice and depends on the type of resin and sample preparation. Those skilled in the art will select a suitable separation technique based on these or other factors. In one embodiment, non-functional resins, such as XAD resins from Rohm & Haas, in particular XAD-4 resins, which are non-functional copolymers of styrene and divinylbenzene, are used in the performance of the described method. obtain.
一実施形態では、試料を、樹脂処理および樹脂の除去の後、フローサイトメーターを使用して分析する。核酸染色剤または他の蛍光色素などの適切な染色剤を、樹脂の除去後かつフローサイトメトリーの前に、試料と組み合わせる。色素は、フローサイトメーターにおけるアッセイ標的の検出を容易にする。消光などの向上技法を用いて、アッセイの完全性をさらに改良することもできる。 In one embodiment, the sample is analyzed using a flow cytometer after resin treatment and resin removal. A suitable stain, such as a nucleic acid stain or other fluorescent dye, is combined with the sample after removal of the resin and prior to flow cytometry. The dye facilitates detection of the assay target in a flow cytometer. Enhancement techniques such as quenching can be used to further improve the integrity of the assay.
樹脂による粒子状物質の除去は、核酸染色剤で染色するための試料の調製において単独で用いることもでき、または本明細書に記載される様々な方法および分子と組み合わせて使用してもよい。たとえば、樹脂による粒子状物質の除去は、本明細書に記載される過剰量のバックグラウンドシグナル低減分子を加える前に、または同様に本明細書に記載される消光剤と共有結合により連結された核酸染色剤を加える前に完了することができる。 Removal of particulate matter by the resin can be used alone in the preparation of a sample for staining with a nucleic acid stain or can be used in combination with various methods and molecules described herein. For example, removal of particulate matter by the resin was covalently linked to the quencher described herein, or similarly, prior to adding an excess amount of background signal reducing molecule described herein. This can be done before adding the nucleic acid stain.
一実施形態では、樹脂により粒子状物質の少なくとも一部分を複合マトリックスから除去することは、ｉ）試料を採取することと；ｉｉ）試料を樹脂と組み合わせることと；ｉｉｉ）粒子状物質の少なくとも一部が接着した樹脂を試料から除去することと；ｉｖ）過剰量のバックグラウンドシグナル低減分子を加えることと；ｖ）生存細胞に浸透する核酸染色剤を加えることと、ｖｉ）生物試料を分析することとを包含する。 In one embodiment, removing at least a portion of the particulate material from the composite matrix with the resin comprises: i) taking a sample; ii) combining the sample with the resin; iii) at least a portion of the particulate material. Removing from the sample; iv) adding an excess amount of background signal reducing molecule; v) adding a nucleic acid stain that penetrates viable cells; and vi) analyzing the biological sample. Including.
別の実施形態では、樹脂により粒子状物質の少なくとも一部分を複合マトリックスから除去することは、ｉ）試料を採取することと；ｉｉ）試料を樹脂と組み合わせることと；ｉｉｉ）粒子状物質の少なくとも一部が接着した樹脂を試料から除去することと；ｉｖ）消光剤と共有結合により連結された核酸染色剤を加えることと；ｖ）生存細胞に浸透する核酸染色剤を加えることと；ｖｉ）試料中の生存微生物の存在、不在、または数量について、調製された試料をアッセイすることとを包含する。
キット
In another embodiment, removing at least a portion of the particulate material from the composite matrix with the resin includes: i) taking a sample; ii) combining the sample with the resin; and iii) at least one of the particulate materials. Removing the resin to which the part has adhered; iv) adding a nucleic acid stain covalently linked to a quencher; v) adding a nucleic acid stain that penetrates viable cells; vi) the sample Assaying the prepared sample for the presence, absence or quantity of viable microorganisms therein.
kit
本発明のさらなる実施形態は、試料中の少なくとも１種の微生物を検出するための市販キットであって、バックグラウンドシグナル低減分子または消光剤と共有結合により連結された核酸の少なくとも１種と；核酸染色剤と；場合により、樹脂とを含むキットを包含する。 A further embodiment of the invention is a commercial kit for detecting at least one microorganism in a sample, comprising at least one nucleic acid covalently linked to a background signal reducing molecule or quencher; Includes a kit comprising a staining agent; and optionally a resin.
以下の実施例は、本発明のある特定の実施形態をさらに例示するために提供される。したがって、実施例は、使用される材料、組成物、および条件に関して制限するものではない。通常遭遇し、当業者に明らかである多様な条件およびパラメーターの他の好適な改変および適合は、本明細書に記載される発明の趣旨および範囲内にある。 The following examples are provided to further illustrate certain specific embodiments of the invention. Thus, the examples are not limiting with respect to the materials, compositions, and conditions used. Other suitable modifications and adaptations of the various conditions and parameters normally encountered and apparent to those skilled in the art are within the spirit and scope of the invention described herein.
上述のように、試料中の微生物の存在について検出および分析するために使用される核酸染色剤は、複合マトリックスを含有する試料中の粒子状物質と非特異的に結合し、高いバックグラウンドシグナル強度を引き起こし得る。以下の実施例１〜９は、本明細書に記載される様々なバックグラウンドシグナル低減分子の、フローサイトメトリーにより分析した際の複合マトリックスにおけるバックグラウンドシグナル強度の低減に対する有効性を実証するように設計される。実施例１〜９のそれぞれにおいて、様々な種類の粒子状物質を含有する複合マトリックス（たとえば、トリプチケースソイブロス、プロセス水、スワブ試料）を使用し、それにバックグラウンドシグナル低減分子を加える。比較のため、試料マトリックスのみを用いて、バックグラウンドシグナル低減分子を加えず、対照試料を調製する。次いで、核酸染色剤を、それぞれの試料に加える。次いで、試料をフローサイトメトリーにより分析して、バックグラウンドシグナル低減分子が、核酸染色剤の試料マトリックス中の粒子状物質との非特異的結合により引き起こされるバックグラウンドシグナル強度を低減するかどうかを決定する。フローサイトメトリーは、粒子または細胞と結合された蛍光シグナルのみを検出するように設計されるため、溶液中に残存するバックグラウンドシグナル低減分子および核酸染色剤からのいかなる残留蛍光シグナルも検出されない。 As mentioned above, the nucleic acid stain used to detect and analyze for the presence of microorganisms in the sample binds non-specifically to particulate matter in the sample containing the composite matrix and has a high background signal intensity. Can cause. Examples 1-9 below demonstrate the effectiveness of various background signal reducing molecules described herein for reducing background signal intensity in a composite matrix when analyzed by flow cytometry. Designed. In each of Examples 1-9, a composite matrix (eg, trypticase soy broth, process water, swab sample) containing various types of particulate matter is used and background signal reducing molecules are added thereto. For comparison, a control sample is prepared using only the sample matrix and no background signal reducing molecules. A nucleic acid stain is then added to each sample. The sample is then analyzed by flow cytometry to determine whether the background signal reducing molecule reduces the background signal intensity caused by non-specific binding of the nucleic acid stain to the particulate matter in the sample matrix. To do. Since flow cytometry is designed to detect only the fluorescent signal associated with the particles or cells, it does not detect any residual fluorescent signal from background signal reducing molecules and nucleic acid stains remaining in solution.
実施例１０では、実施例１〜９について上記した同じ一般的手順を用いるが、試料マトリックス中に、細菌をスパイクした。この実施例は、バックグラウンドシグナル低減分子が、バックグラウンドシグナル強度を低減するだけでなく、試料中の生存微生物の検出への干渉もしないことを実証するように設計された。実施例１〜１０について、下に詳述する。 Example 10 uses the same general procedure described above for Examples 1-9, but spikes bacteria into the sample matrix. This example was designed to demonstrate that background signal reducing molecules not only reduce background signal intensity, but also do not interfere with the detection of viable microorganisms in the sample. Examples 1 to 10 are described in detail below.
［実施例１］
式（ＩＩ）の分子をトリプチケースソイブロス（ＴＳＢ）に加え、最終濃度を５μＭとした。混合物を、３０分間インキュベートし、その後核酸染色剤Ｓｙｔｏ（登録商標）６２を０．２μＭの最終濃度で加えた。混合物を、フローサイトメトリーにより分析した。対照として、ＴＳＢおよび核酸染色剤のみを含有し、式（ＩＩ）の分子を含有しない試料についても試験した。結果は、図１Ａ〜１Ｃにまとめられ、バックグラウンドシグナルが、ＴＳＢのみの試料における６５９１カウントから、式（ＩＩ）の分子と混合された試料における５８カウントまで低減されることを実証する。これは、バックグラウンドシグナル（つまり、試料微粒子と結合された色素からのシグナル）が、およそ９９％低減されることを実証する。
[Example 1]
The molecule of formula (II) was added to trypticase soy broth (TSB) to a final concentration of 5 μM. The mixture was incubated for 30 minutes, after which the nucleic acid stain Syto® 62 was added at a final concentration of 0.2 μM. The mixture was analyzed by flow cytometry. As a control, samples containing only TSB and nucleic acid stain and not containing the molecule of formula (II) were also tested. The results are summarized in FIGS. 1A-1C and demonstrate that the background signal is reduced from 6591 counts in the TSB-only sample to 58 counts in the sample mixed with the molecule of formula (II). This demonstrates that the background signal (ie, the signal from the dye bound to the sample microparticles) is reduced by approximately 99%.
［実施例２］
式（ＩＩ）の分子をＴＳＢに加え、ＴＳＢ中の最終濃度を５μＭとした。混合物を、５分間インキュベートし、その後核酸染色剤Ｓｙｔｏ（登録商標）６２を０．２μＭの最終濃度で加えたか、またはプレインキュベーションなしで核酸染色剤と同時に加えた。混合物を、フローサイトメトリーにより分析した。対照として、ＴＳＢおよび核酸染色剤のみを含有し、式（ＩＩ）の分子を含有しない試料についても試験した。結果は、図２Ａ〜２Ｃにまとめられ、バックグラウンドシグナルが、ＴＳＢと核酸染色剤のみにおける６４３６カウントから、式（ＩＩ）の分子および染色剤と同時に混合されたＴＳＢにおける３０６２カウントまで低減されることを実証する。これは、およそ５１％のバックグラウンドシグナルの低減を実証する。しかしながら、核酸染色剤を加える前に、式（ＩＩ）の分子をＴＳＢと混合およびインキュベートした場合、バックグラウンドシグナルは、４８６カウントまで低減され、ほぼ９２％のバックグラウンドシグナルの低減である。
[Example 2]
The molecule of formula (II) was added to TSB to a final concentration in TSB of 5 μM. The mixture was incubated for 5 minutes, after which the nucleic acid stain Syto® 62 was added at a final concentration of 0.2 μM or simultaneously with the nucleic acid stain without preincubation. The mixture was analyzed by flow cytometry. As a control, samples containing only TSB and nucleic acid stain and not containing the molecule of formula (II) were also tested. The results are summarized in FIGS. 2A-2C, where the background signal is reduced from 6436 counts in TSB and nucleic acid stain alone to 3062 counts in TSB mixed simultaneously with the molecule and stain of formula (II). To demonstrate. This demonstrates an approximately 51% reduction in background signal. However, if the molecule of formula (II) is mixed and incubated with TSB before adding the nucleic acid stain, the background signal is reduced to 486 counts, a reduction of background signal of approximately 92%.
［実施例３］
式（ＩＩ）の分子をＴＳＢに加え、最終濃度を０．５μＭ、１．６７μＭ、または５μＭのいずれかとした。混合物を、６０分間インキュベートし、その後核酸染色剤Ｓｙｔｏ（登録商標）６２を０．２μＭの最終濃度で加えた。混合物を、フローサイトメトリーにより分析した。対照として、ＴＳＢおよび核酸染色剤のみを含有し、式（ＩＩ）の分子を含有しない試料についても試験した。結果は、図３にまとめられ、バックグラウンドシグナルの低減が、バックグラウンドシグナル低減分子の濃度に依存することを実証する。加えて、バックグラウンドシグナルは、最低濃度のバックグラウンドシグナル低減分子により少なくとも８２％低減される。
[Example 3]
Molecules of formula (II) were added to TSB to give a final concentration of either 0.5 μM, 1.67 μM, or 5 μM. The mixture was incubated for 60 minutes, after which the nucleic acid stain Syto® 62 was added at a final concentration of 0.2 μM. The mixture was analyzed by flow cytometry. As a control, samples containing only TSB and nucleic acid stain and not containing the molecule of formula (II) were also tested. The results are summarized in FIG. 3 and demonstrate that the background signal reduction is dependent on the concentration of the background signal reducing molecule. In addition, the background signal is reduced by at least 82% with the lowest concentration of background signal reducing molecule.
［実施例４］
式（ＩＩ）の分子をＴＳＢに加え、最終濃度を５μＭとした。混合物を、２分または５分間インキュベートし、その後核酸染色剤Ｓｙｔｏ（登録商標）６２を０．２μＭの最終濃度で加えた。混合物を、フローサイトメトリーにより分析した。対照として、ＴＳＢおよび核酸染色剤のみを含有し、式（ＩＩ）の分子を含有しない試料についても試験した。結果は、図４にまとめられ、バックグラウンドシグナルの低減が、バックグラウンドシグナル低減分子とのインキュベーションの時間に依存することを実証する。加えて、バックグラウンドシグナルは、２分のインキュベーション時間により少なくとも７５％低減される。
[Example 4]
The molecule of formula (II) was added to TSB to a final concentration of 5 μM. The mixture was incubated for 2 or 5 minutes, after which the nucleic acid stain Syto® 62 was added at a final concentration of 0.2 μM. The mixture was analyzed by flow cytometry. As a control, samples containing only TSB and nucleic acid stain and not containing the molecule of formula (II) were also tested. The results are summarized in FIG. 4 and demonstrate that the reduction of background signal depends on the time of incubation with the background signal reducing molecule. In addition, the background signal is reduced by at least 75% with an incubation time of 2 minutes.
［実施例５］
式（Ｉ）、（ＩＩＩ）、および（ＩＶ）の分子をＴＳＢに加え、分子の最終濃度を５μＭとした。混合物を、３０分間インキュベートし、その後核酸染色剤Ｓｙｔｏ（登録商標）６２を０．２μＭの最終濃度で加えた。混合物を、フローサイトメトリーにより分析した。対照として、ＴＳＢおよび核酸染色剤のみを含有し、バックグラウンドシグナル低減分子を含有しない試料についても試験した。結果は、図５Ａ〜５Ｅにまとめられる。バックグラウンドシグナル低減分子はそれぞれ、フローサイトメトリー分析におけるバックグラウンドシグナルを、少なくとも５５％のパーセントから最大９４％までも低減する。
[Example 5]
Molecules of formula (I), (III), and (IV) were added to TSB to give a final concentration of molecules of 5 μM. The mixture was incubated for 30 minutes, after which the nucleic acid stain Syto® 62 was added at a final concentration of 0.2 μM. The mixture was analyzed by flow cytometry. As a control, a sample containing only TSB and nucleic acid stain and no background signal reducing molecule was also tested. The results are summarized in FIGS. Each background signal reducing molecule reduces the background signal in flow cytometry analysis by at least 55% to as much as 94%.
［実施例６］
式（Ｉ）の分子をＴＳＢに加え、分子の最終濃度を５μＭとした。混合物を、２分または５分間インキュベートし、その後核酸染色剤Ｓｙｔｏ（登録商標）６２を０．２μＭの最終濃度で加えたか、またはプレインキュベーションなしで核酸染色剤と同時に加えた。混合物を、フローサイトメトリーにより分析した。対照として、ＴＳＢおよび核酸染色剤のみを含有し、式（Ｉ）の分子を含有しない試料についても試験した。結果は、図６Ａ〜６Ｄにまとめられ、バックグラウンドシグナルが、バックグラウンドシグナル低減分子を含有するすべての試料において低減されることを実証する。バックグラウンドシグナル低減分子が核酸染色剤と同時に混合された試料については、バックグラウンドシグナルは、およそ３４％低減された。核酸染色剤を加える前に、試料をバックグラウンドシグナル低減分子とプレインキュベートした場合、バックグラウンドシグナルの低減量は増加した。バックグラウンドシグナルは、５分および２分でインキュベートした試料について、それぞれおよそ８９％および９３％低減された。
[Example 6]
The molecule of formula (I) was added to TSB so that the final concentration of the molecule was 5 μM. The mixture was incubated for 2 or 5 minutes, after which the nucleic acid stain Syto® 62 was added at a final concentration of 0.2 μM or was added simultaneously with the nucleic acid stain without preincubation. The mixture was analyzed by flow cytometry. As a control, samples containing only TSB and nucleic acid stain and not containing the molecule of formula (I) were also tested. The results are summarized in Figures 6A-6D and demonstrate that background signal is reduced in all samples containing background signal reducing molecules. For samples where background signal reducing molecules were mixed simultaneously with the nucleic acid stain, the background signal was reduced by approximately 34%. If the sample was preincubated with a background signal reducing molecule prior to adding the nucleic acid stain, the amount of background signal reduction increased. Background signal was reduced by approximately 89% and 93% for samples incubated at 5 minutes and 2 minutes, respectively.
［実施例７］
式（Ｉ）および（ＩＩ）の分子をプロセス水に加え、分子の最終濃度を５μＭとした。混合物を、３０分間インキュベートし、その後核酸染色剤Ｓｙｔｏ（登録商標）６２を０．２μＭの最終濃度で加えた。次いで、混合物を、フローサイトメトリーにより分析した。対照として、プロセス水および核酸染色剤のみを含有し、式（Ｉ）および（ＩＩ）の分子を含有しない試料についても試験した。結果は、図７Ａ〜７Ｄにまとめられ、フローサイトメトリーによる分析の前に、プロセス水を含む試料を本明細書に記載されるバックグラウンドシグナル低減分子とインキュベートした場合、バックグラウンドシグナルがゼロ近くまで低減されることを実証する。
[Example 7]
Molecules of formula (I) and (II) were added to the process water to give a final molecular concentration of 5 μM. The mixture was incubated for 30 minutes, after which the nucleic acid stain Syto® 62 was added at a final concentration of 0.2 μM. The mixture was then analyzed by flow cytometry. As a control, samples containing only process water and nucleic acid stain and not containing molecules of formula (I) and (II) were also tested. The results are summarized in FIGS. 7A-7D, and when the sample containing process water was incubated with the background signal reducing molecule described herein prior to analysis by flow cytometry, the background signal decreased to near zero. Demonstrate that it is reduced.
［実施例８］
様々なスワブ試料からのバックグラウンドシグナルを低減するために、本明細書に記載されるバックグラウンドシグナル低減分子を使用した。ポリウレタンまたはフォーム製のスワブを、５μＭの最終濃度の式（Ｉ）の分子の溶液中で、３０分間インキュベートした。次いで、０．２μＭの最終濃度の核酸染色剤Ｓｙｔｏ（登録商標）６２を混合物に加えた。混合物を、フローサイトメトリーにより分析した。対照として、スワブおよび核酸染色剤のみを含有し、式（Ｉ）の分子を含有しない試料についても試験した。３つの領域を分析し、領域１、領域２、および領域３は、それぞれカビ、細菌、および酵母が典型的に集合する領域を表す。結果は、図８Ａ〜８Ｆにまとめられ、バックグラウンドシグナルが、両方の種類のスワブの各領域において、有意に低減されることを実証する。
[Example 8]
To reduce the background signal from the various swab samples, the background signal reducing molecules described herein were used. A swab made of polyurethane or foam was incubated for 30 minutes in a solution of the molecule of formula (I) at a final concentration of 5 μM. A final concentration of 0.2 μM nucleic acid stain Syto® 62 was then added to the mixture. The mixture was analyzed by flow cytometry. As a control, samples containing only swabs and nucleic acid stains and not containing molecules of formula (I) were also tested. Three regions were analyzed, region 1, region 2, and region 3 representing regions where mold, bacteria, and yeast typically assemble, respectively. The results are summarized in FIGS. 8A-8F and demonstrate that background signal is significantly reduced in each region of both types of swabs.
［実施例９］
生菌を含まない精製水試料を、フローサイトメトリー分析のためのＢＤ ＦＡＣＳＭｉｃｒｏＣｏｕｎｔにおいて使用した。標準的なＢＤ ＭｉｃｒｏＣｏｕｎｔ ＴＶＯ試薬（バッファー試薬、細胞浸透性の核酸にインターカレートする蛍光色素（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｙｅ）であるバイオマス染色剤（Ｂｉｏｍａｓｓ Ｓｔａｉｎ）、ＢＲＡＧ３）を試料に加え、その後機器により分析した。図９Ａに示されるように、強度プロットにおける丸で囲んだゲート領域内の事象を計算して、生菌の濃度（カウント／ｍｌ）を報告する。
[Example 9]
A purified water sample without viable bacteria was used in a BD FACSM MicroCount for flow cytometric analysis. Standard BD MicroCount TVO reagent (buffer reagent, biomass dye (Biomass Stain), BRAG3), a fluorescent dye that intercalates into cell-permeable nucleic acids, is added to the sample, and then instrumentally analyzed. As shown in FIG. 9A, events within the circled gate region in the intensity plot are calculated and the concentration of viable bacteria (count / ml) is reported.
機器において標準的な水質試験法を使用して、図９Ａに見られるように、ゲート内で２９０カウント／ｍｌが、この水試料中の総生菌濃度として報告された。しかしながら、水試料をプレーティングし、インキュベーター中で１０日間インキュベートした後のＲ２Ａ寒天培地プレート上では、細菌コロニーは見られなかった。ゲート内の粒子は、バイオマス染色剤と非特異的に結合し蛍光を発するバックグラウンド粒子を表す。 Using the standard water quality test method in the instrument, 290 counts / ml were reported as the total viable concentration in this water sample, as seen in FIG. 9A. However, no bacterial colonies were seen on the R2A agar plate after plating the water sample and incubating in the incubator for 10 days. The particles in the gate represent background particles that bind non-specifically to the biomass stain and fluoresce.
５μＭのプロピジウムヨージド（ＰＩ）を、同じロットの水試料に加え、その後ＭｉｃｒｏＣｏｕｎｔバイオマス染色剤を加えた。同じ機器の設定を使用して、水試料を分析した。図９Ｂに見られるように、ゲート内で１５２の総カウントが、試料中の総生菌濃度として報告された。この事例では、ＰＩもまた核酸にインターカレートする分子であることから、過剰量のＰＩは、バイオマス染色剤の結合を阻止し、バックグラウンドカウントを低減することができる。ＰＩは蛍光色素であるが、分子の蛍光特徴は、この研究には必要でない。ＰＩは、ＦＡＣＳＭｉｃｒｏＣｏｕｎｔシステムにおける赤色レーザーで励起することができないので、ＰＩの蛍光特徴もまた、ＭｉｃｒｏＣｏｕｎｔバイオマス染色剤には干渉しない。 5 μM propidium iodide (PI) was added to the same lot of water sample followed by the MicroCount biomass stain. Water samples were analyzed using the same instrument settings. As seen in FIG. 9B, a total count of 152 within the gate was reported as the total viable concentration in the sample. In this case, since PI is also a molecule that intercalates into nucleic acids, an excess amount of PI can block the binding of biomass stain and reduce background count. Although PI is a fluorescent dye, the fluorescent characteristics of the molecule are not necessary for this study. Since PI cannot be excited with a red laser in the FACSM MicroCount system, the fluorescence characteristics of PI also do not interfere with the MicroCount biomass stain.
［実施例１０］
およそ１５，０００ｃｆｕ／ｍｌの大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ；Ｅ． ｃｏｌｉ）を、水試料中にスパイクし、スパイクした試料を、標準的な水質試験法を使用して、ＦＡＣＳＭｉｃｒｏＣｏｕｎｔにより分析した。ゲート内で３２８３の総カウントが、総生菌濃度として報告された。結果は、図１０Ａに示される。
[Example 10]
Approximately 15,000 cfu / ml of Escherichia coli (E. coli) was spiked into a water sample and the spiked sample was analyzed by FACSA MicroCount using standard water quality test methods. A total count of 3283 within the gate was reported as the total viable concentration. The result is shown in FIG. 10A.
およそ１５，０００ｃｆｕ／ｍｌの大腸菌を水試料中にスパイクし、５μＭのＰＩを試料に加え、その後バイオマス染色剤を加えた。ゲート内で３０６７の総カウントが、総生菌濃度として報告され、結果は、ＰＩを加えていない試料からの結果と同等であった。結果は、図１０Ｂに示される。バイオマス染色剤は細胞浸透性の色素であるのに対し、ＰＩは生きている大腸菌細胞に対して浸透性でないことから、ＰＩを加えても、バイオマス染色剤による生存細菌細胞の染色には干渉しない。 Approximately 15,000 cfu / ml of E. coli was spiked into the water sample and 5 μM PI was added to the sample followed by the biomass stain. A total count of 3067 within the gate was reported as the total viable concentration, and the results were comparable to those from the sample without added PI. The result is shown in FIG. 10B. Biomass stain is a cell-permeable dye, whereas PI is not permeable to living E. coli cells, so adding PI does not interfere with staining of viable bacterial cells with biomass stain .
本発明を特定の実施形態を参照して説明してきたが、これらの実施形態は、本発明の原理および用途を例示するものにすぎないことを理解すべきである。それゆえ、添付の特許請求の範囲により規定される本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、例示的実施形態に対して多数の改変がなされ得ること、および他の構成が考案され得ることを理解すべきである。 Although the invention has been described with reference to particular embodiments, it is to be understood that these embodiments are merely illustrative of the principles and applications of the present invention. Therefore, it will be appreciated that numerous modifications may be made to the exemplary embodiments and other arrangements may be devised without departing from the spirit and scope of the invention as defined by the appended claims. Should be understood.
Claims (32)
少なくとも１種の標的微生物の存在または不在について試験すべき試料を採取するステップと；
前記試料を調製するステップと；
過剰量のバックグラウンドシグナル低減分子を含む、バックグラウンドシグナルを低減する物質を加えるステップと；
前記微生物の標的生存細胞に浸透しおよびそれを標識する核酸染色剤を加えるステップと；および、
前記調製された試料を分析するステップと、
を含み、
前記バックグラウンドシグナル低減分子は、前記核酸染色剤と同様にして同様の効率で非標的粒子と結合することを特徴とする方法。 A method for analyzing a sample for the amount of viable microorganisms comprising:
Taking a sample to be tested for the presence or absence of at least one target microorganism;
Preparing the sample;
Adding a substance that reduces background signal, including an excess amount of a background signal reducing molecule;
Adding a nucleic acid stain that penetrates and labels the target living cells of the microorganism; and
Analyzing the prepared sample;
Including
The background signal reducing molecule binds to non-target particles with the same efficiency as the nucleic acid stain.
（式中、
Ｙは、
ｎは、０または最大約５の整数であり；
Ｘは、炭素または硫黄のいずれかであり；
Ｒ１は、場合により、水素、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基、サルファイト部分、またはアルキルアミドであり、前記バックグラウンドシグナル低減分子の前記生存標的微生物中への細胞浸透性を低下させるために選択でき；
Ｚは、Ｙと同じかまたは異なるかのいずれかである）
からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。 The background signal reducing molecule is a molecule having the structure Y— (CH═CH) n —CH═Z or a salt thereof (wherein
Y is
n is 0 or an integer of up to about 5;
X is either carbon or sulfur;
R 1 is optionally hydrogen, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a sulfite moiety, or an alkylamide, which reduces cell permeability of the background signal reducing molecule into the living target microorganism. Can choose to make;
Z is either the same as or different from Y)
The method of claim 1, wherein the method is selected from the group consisting of:
前記ベンゼン部分、ベンゼン部分誘導体、およびキノロンは、置換されていても置換されていなくてもよい
ことを特徴とする請求項１１に記載の方法。 Y is selected from the group consisting of a benzene moiety fused thereto; a benzene moiety derivative fused thereto; and a quinolone substituent;
12. The method of claim 11, wherein the benzene moiety, benzene moiety derivative, and quinolone may be substituted or unsubstituted.
少なくとも１種の標的微生物の存在または不在について試験すべき試料を採取するステップと；
前記試料を調製するステップと；
蛍光消光剤と共有結合により連結された核酸染色剤を加えるステップと；
生存細胞に浸透する、消光剤を含まない核酸染色剤を加えるステップと；および、
前記調製された試料を分析するステップと
を含み、
消光剤と共有結合により連結された前記核酸染色剤は、消光剤を含まない前記核酸染色剤と同様にして同様の効率で非標的粒子と結合し、消光剤と共有結合により連結された前記核酸染色剤は、前記微生物の標的生存細胞に実質的に浸透せず、前記蛍光消光剤は、スペクトル重複により、消光剤を含まない前記核酸染色剤の蛍光シグナルを消光し；および、
消光剤を含まない前記核酸染色剤は、前記微生物の標的生存細胞に浸透しおよびそれを標識する、
ことを特徴とする方法。 A method for analyzing a sample to determine the amount of viable microorganisms comprising:
Taking a sample to be tested for the presence or absence of at least one target microorganism;
Preparing the sample;
Adding a nucleic acid stain covalently linked to a fluorescence quencher;
Adding a quencher-free nucleic acid stain that penetrates viable cells; and
Analyzing the prepared sample,
The nucleic acid stain covalently linked to the quencher binds to the non-target particles with the same efficiency as the nucleic acid stain without the quencher, and the nucleic acid is covalently linked to the quencher. The stain does not substantially penetrate the target living cells of the microorganism, and the fluorescence quencher quenches the fluorescence signal of the nucleic acid stain without the quencher due to spectral overlap; and
The nucleic acid stain without quencher penetrates and labels the target living cells of the microorganism,
A method characterized by that.
少なくとも１種の標的微生物の存在または不在について試験すべき試料を採取するステップと；
前記試料を調製するステップと；
前記試料を、前記試料中の非標的粒子と結合するように選択される樹脂と組み合わせるステップと；
前記樹脂を前記試料から除去するステップであり、前記樹脂は、それとともに前記非標的粒子を保持するステップと；
前記樹脂を前記試料から除去した後に、前記試料を核酸染色剤と組み合わせるステップと；および、
前記調製された試料を分析するステップと、
を含むことを特徴とする方法。 A method for analyzing a sample for the presence or absence of at least one target microorganism comprising:
Taking a sample to be tested for the presence or absence of at least one target microorganism;
Preparing the sample;
Combining the sample with a resin selected to bind to non-target particles in the sample;
Removing the resin from the sample, the resin holding the non-target particles with it;
Combining the sample with a nucleic acid stain after removing the resin from the sample; and
Analyzing the prepared sample;
A method comprising the steps of:
前記バックグラウンドシグナル低減分子は、消光剤を含まない前記核酸染色剤と同様にして同様の効率で前記試料中の非標的粒子と結合し、
消光剤と共有結合により連結された前記核酸染色剤は、前記微生物の標的生存細胞に実質的に浸透せず、前記蛍光消光剤は、スペクトル重複により、消光剤を含まない前記核酸染色剤の蛍光シグナルを消光し、消光剤と共有結合により連結された前記核酸染色剤は、消光剤を含まない前記核酸染色剤と同様にして同様の効率で非標的粒子と結合し；
消光剤を含まない前記核酸染色剤は、前記微生物の標的生存細胞に浸透しおよびそれを標識し、および、
前記樹脂は、前記試料中の非標的粒子と結合するように選択される、
ことを特徴とするキット。 A kit for detecting at least one microorganism in a sample, comprising at least one nucleic acid stain covalently linked to a background signal reducing molecule or a quencher; and a nucleic acid stain without a quencher And optionally including a resin,
The background signal reducing molecule binds to non-target particles in the sample with the same efficiency as the nucleic acid stain without the quencher,
The nucleic acid stain covalently linked to the quencher does not substantially penetrate the target living cells of the microorganism, and the fluorescence quencher does not contain the quencher due to spectral overlap. The nucleic acid stain that quenches the signal and is covalently linked to the quencher binds to the non-target particles with similar efficiency as the nucleic acid stain without the quencher;
The nucleic acid stain without a quencher penetrates and labels the target living cells of the microorganism, and
The resin is selected to bind to non-target particles in the sample;
Kit characterized by that.
前記分子は、前記試料中の生存微生物の存在または不在を検出するために前記試料に加えられる核酸染色剤が前記非標的粒子と結合するのと同様にして同様の効率で前記非標的粒子と結合することを特徴とする物質。 A substance that reduces background signal for reducing background signal intensity in a flow cytometry assay, comprising a molecule that binds to a non-target particle in a sample containing a complex matrix and at least one microorganism,
The molecule binds to the non-target particle with similar efficiency as a nucleic acid stain added to the sample to detect the presence or absence of viable microorganisms in the sample binds to the non-target particle. A substance characterized by
Ｙは、
ｎは、０または最大約５の整数であり；
Ｘは、炭素または硫黄のいずれかであり；
Ｒ１は、場合により、水素、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基、サルファイト部分、またはアルキルアミドであり、前記バックグラウンドシグナル低減分子の前記生存標的微生物中への細胞浸透性を低下させるために選択でき；
Ｚは、Ｙと同じかまたは異なるかのいずれかである、
ことを特徴とする分子またはその塩。 28. The molecule of claim 27 or a salt thereof, wherein the background signal reducing molecule has the structure Y- (CH = CH) n -CH = Z, wherein
Y is
n is 0 or an integer of up to about 5;
X is either carbon or sulfur;
R 1 is optionally hydrogen, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a sulfite moiety, or an alkylamide, which reduces cell permeability of the background signal reducing molecule into the living target microorganism. Can choose to make;
Z is either the same as or different from Y,
Or a salt thereof.
前記ベンゼン部分、ベンゼン部分誘導体、およびキノロンは、置換されていても置換されていなくてもよい、
ことを特徴とする請求項２８に記載の分子。 Y is selected from the group consisting of a benzene moiety fused thereto; a benzene moiety derivative fused thereto; and a quinolone substituent;
The benzene moiety, benzene moiety derivative, and quinolone may be substituted or unsubstituted,
29. A molecule according to claim 28.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201261620823P | 2012-04-05 | 2012-04-05 | |
| US61/620,823 | 2012-04-05 | ||
| PCT/US2013/035291 WO2013152203A1 (en) | 2012-04-05 | 2013-04-04 | Sample preparation for flow cytometry |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2015514403A true JP2015514403A (en) | 2015-05-21 |
| JP6401146B2 JP6401146B2 (en) | 2018-10-03 |
Family
ID=49301050
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2015504727A Active JP6401146B2 (en) | 2012-04-05 | 2013-04-04 | Sample preparation for flow cytometry |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP2834367A4 (en) |
| JP (1) | JP6401146B2 (en) |
| CN (1) | CN104379760B (en) |
| AU (1) | AU2013243378B2 (en) |
| CA (1) | CA2869472C (en) |
| IN (1) | IN2014DN08957A (en) |
| WO (1) | WO2013152203A1 (en) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11001881B2 (en) | 2006-08-24 | 2021-05-11 | California Institute Of Technology | Methods for detecting analytes |
| US11525156B2 (en) | 2006-07-28 | 2022-12-13 | California Institute Of Technology | Multiplex Q-PCR arrays |
| WO2008014485A2 (en) | 2006-07-28 | 2008-01-31 | California Institute Of Technology | Multiplex q-pcr arrays |
| US11560588B2 (en) | 2006-08-24 | 2023-01-24 | California Institute Of Technology | Multiplex Q-PCR arrays |
| US9645057B2 (en) | 2012-04-05 | 2017-05-09 | Becton, Dickiinson and Company | Method for improving analysis of microorganisms in complex matrices |
| ES2715687T3 (en) * | 2013-03-13 | 2019-06-05 | Becton Dickinson Co | A method to improve the analysis of microorganisms in complex matrices |
| CN104677809B (en) * | 2013-11-29 | 2018-01-02 | 中国人民解放军第二军医大学 | Cryptococcus viability detection kit and detection method |
| US9708647B2 (en) | 2015-03-23 | 2017-07-18 | Insilixa, Inc. | Multiplexed analysis of nucleic acid hybridization thermodynamics using integrated arrays |
| US9499861B1 (en) | 2015-09-10 | 2016-11-22 | Insilixa, Inc. | Methods and systems for multiplex quantitative nucleic acid amplification |
| WO2017155858A1 (en) | 2016-03-07 | 2017-09-14 | Insilixa, Inc. | Nucleic acid sequence identification using solid-phase cyclic single base extension |
| CN107643238A (en) * | 2017-09-19 | 2018-01-30 | 中山大学附属第医院 | A kind of method for quantitatively detecting blood circulation particle concentration |
| EP3830547B1 (en) * | 2018-08-01 | 2023-11-29 | Sartorius BioAnalytical Instruments, Inc. | Methods, kits and stain compositions for flow cytometry evaluation of unassociated virus-size particles using multiple fluorogenic dyes |
| JP2022525322A (en) | 2019-03-14 | 2022-05-12 | インシリクサ， インコーポレイテッド | Methods and systems for time-gate fluorescence-based detection |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH10512670A (en) * | 1995-01-16 | 1998-12-02 | ソイニ，エルッキ | Biospecific multi-parameter assays |
| US7205100B2 (en) * | 2002-10-10 | 2007-04-17 | Advanced Analytical Technologies, Inc. | Methods for reducing background fluorescence |
| WO2011124927A1 (en) * | 2010-04-09 | 2011-10-13 | Biostatus Limited | Method of analysing a cell or other biological material containing a nucleic acid |
| JP2012507288A (en) * | 2008-11-03 | 2012-03-29 | ゼネラル・エレクトリック・カンパニイ | Method and system for measuring microbial content in aqueous media |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030013849A1 (en) * | 1999-10-29 | 2003-01-16 | Ward William W. | Renilla reniformis green fluorescent protein |
| RU2172512C1 (en) * | 2000-02-01 | 2001-08-20 | Закрытое акционерное общество Научно-производственное объединение "ФоМос" | Colored spectrum-zone silver halide photographic material |
| US6323337B1 (en) * | 2000-05-12 | 2001-11-27 | Molecular Probes, Inc. | Quenching oligonucleotides |
| CA2725716C (en) * | 2000-11-17 | 2015-02-10 | Biomoda, Inc. | Method of making 5, 10, 15, 20-tetrakis(carboxyphenyl) porphine solutions and compositions thereof |
| US20130095496A1 (en) * | 2010-06-21 | 2013-04-18 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Soluble Quencher to reduce Background in qPCR assays |
-
2013
- 2013-04-04 AU AU2013243378A patent/AU2013243378B2/en active Active
- 2013-04-04 JP JP2015504727A patent/JP6401146B2/en active Active
- 2013-04-04 CA CA2869472A patent/CA2869472C/en active Active
- 2013-04-04 CN CN201380029083.0A patent/CN104379760B/en active Active
- 2013-04-04 EP EP13773119.6A patent/EP2834367A4/en not_active Withdrawn
- 2013-04-04 WO PCT/US2013/035291 patent/WO2013152203A1/en active Application Filing
- 2013-04-04 IN IN8957DEN2014 patent/IN2014DN08957A/en unknown
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH10512670A (en) * | 1995-01-16 | 1998-12-02 | ソイニ，エルッキ | Biospecific multi-parameter assays |
| US7205100B2 (en) * | 2002-10-10 | 2007-04-17 | Advanced Analytical Technologies, Inc. | Methods for reducing background fluorescence |
| JP2012507288A (en) * | 2008-11-03 | 2012-03-29 | ゼネラル・エレクトリック・カンパニイ | Method and system for measuring microbial content in aqueous media |
| WO2011124927A1 (en) * | 2010-04-09 | 2011-10-13 | Biostatus Limited | Method of analysing a cell or other biological material containing a nucleic acid |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| "CYQUANT DIRECT CELL PROLIFERATION ASSAY KIT", INTERNET CITATION [ONLINE], JPN5015010488, 20 July 2009 (2009-07-20), ISSN: 0003854455 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2013243378B2 (en) | 2019-04-11 |
| CA2869472C (en) | 2017-07-11 |
| EP2834367A1 (en) | 2015-02-11 |
| IN2014DN08957A (en) | 2015-05-22 |
| CA2869472A1 (en) | 2013-10-10 |
| JP6401146B2 (en) | 2018-10-03 |
| WO2013152203A1 (en) | 2013-10-10 |
| CN104379760A (en) | 2015-02-25 |
| AU2013243378A1 (en) | 2014-10-30 |
| EP2834367A4 (en) | 2016-03-23 |
| CN104379760B (en) | 2018-03-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6401146B2 (en) | Sample preparation for flow cytometry | |
| US9933341B2 (en) | Sample preparation for flow cytometry | |
| Ishii et al. | Single-cell analysis and isolation for microbiology and biotechnology: methods and applications | |
| Khan et al. | Specific and rapid enumeration of viable but nonculturable and viable-culturable gram-negative bacteria by using flow cytometry | |
| Wang et al. | Past, present and future applications of flow cytometry in aquatic microbiology | |
| Jasson et al. | Alternative microbial methods: An overview and selection criteria | |
| López-Campos et al. | Detection, identification, and analysis of foodborne pathogens | |
| Forster et al. | Simultaneous fluorescent gram staining and activity assessment of activated sludge bacteria | |
| Rüger et al. | A flow cytometric method for viability assessment of Staphylococcus aureus and Burkholderia cepacia in mixed culture | |
| Duedu et al. | Two-colour fluorescence fluorimetric analysis for direct quantification of bacteria and its application in monitoring bacterial growth in cellulose degradation systems | |
| Wu et al. | Trace detection of specific viable bacteria using tetracysteine-tagged bacteriophages | |
| US20200299748A1 (en) | Method for determining the concentration of intact microorganisms in a sample | |
| Deng et al. | Improving the accuracy of flow cytometric quantification of microbial populations in sediments: importance of cell staining procedures | |
| Tidwell et al. | Flow cytometry as a tool for oilfield biocide efficacy testing and monitoring | |
| CA2427106C (en) | Method and apparatus for prokaryotic and eukaryotic cell quantitation | |
| Lawson-Ferreira et al. | Flow-cytometric method for viability analysis of mycoplasma gallisepticum and other cell-culture-contaminant Mollicutes | |
| Senjarini et al. | Application of fluorescence markers for the diagnosis of bacterial abundance and viability in aquatic ecosystem | |
| JP6353518B2 (en) | Method for improving the analysis of microorganisms in composite matrices | |
| Khan et al. | Rapid identification of bacterial viability, culturable and non-culturable stages by using flow cytometry | |
| Porter | Flow cytometry and environmental microbiology | |
| Slominski et al. | Quantitation of Microorganisms | |
| Waturangi | Check for updates Chapter 9 | |
| Smaruj et al. | FLOW CYTOMETRIC ANALYSIS OF MICROORGANISMS | |
| Hřebíček | Applications of flow cytometry in the study of microbial subpopulations. | |
| Ruyssen et al. | Flow cytometry as a rapid tool for microbiological analysis in the food industry: potentials and restrictions |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20160331 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170124 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20170424 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170721 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20171212 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180307 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20180807 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20180906 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6401146 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |