JP2015513893A - Production of capric acid in mixed nutrition mode by Botulococcus - Google Patents
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Abstract
本発明は、ボツリオコッカス属に属する微細藻類の新規な株のカプリン酸を混合栄養条件で有機炭素含有基質の存在下にて豊富にする方法に関する。これらの株から得られるバイオマスとカプリン酸の収率は、光の照射がフラッシュの形態で変化するとき、または不連続であるとき、さらに大きくなる。【選択図】なしThe present invention relates to a method for enriching capric acid, a novel strain of microalgae belonging to the genus Botriococcus, in the presence of an organic carbon-containing substrate under mixed nutrient conditions. The yields of biomass and capric acid obtained from these strains are even greater when the light irradiation changes in flash form or is discontinuous. [Selection figure] None
Description
本発明は、ボツリオコッカス属、特にボツリオコッカス・ブラウニー種とボツリオコッカス・スデティクス種の微細藻類を混合栄養モードで培養する方法に関する。この方法により、このようにして培養した微細藻類のカプリン酸（デカン酸、またはＣ１０：０、またはＣ１０としても知られる）を、カプリン酸がほぼ存在しない古典的な独立栄養条件の場合と比べて豊富にすることができる。不連続な照明および／または変化する光の存在下で、この方法により、バイオマスの収率を非常に大きくすることができる。またこの方法により、混合栄養モードの性質を持っていてカプリン酸の収率が大きいボツリオコッカス・ブラウニーとボツリオコッカス・スデティクスの株を選択することができる。 The present invention relates to a method for culturing microalgae of the genus Botriococcus, in particular, Botriococcus brownie and Botriococcus sudeticis in a mixed nutrition mode. In this way, this way caprate microalgae cultured: a (decanoic acid or C10, 0 or also known as C 10,), compared with the case of the classical autotrophic conditions capric near absence Can be abundant. In the presence of discontinuous illumination and / or changing light, this method can greatly increase the yield of biomass. Also, by this method, it is possible to select Botriococcus brownies and Botriococcus sudetics strains that have mixed nutrition mode properties and have a large capric acid yield.
微細藻類は、独立栄養性の光合成微生物、すなわち光合成によって自律的に増殖する傾向を有する光合成微生物である。 Microalgae are autotrophic photosynthetic microorganisms, that is, photosynthetic microorganisms that have a tendency to grow autonomously by photosynthesis.
微細藻類は、海水環境や、淡水または塩水のほか、さまざまな地上環境でも増殖する。 Microalgae grow in seawater environments, fresh water or salt water, as well as in various terrestrial environments.
淡水または海洋で見つかる微細藻類の大半の種は、一般に、独立栄養性である、すなわち光合成によってしか増殖することができない。それらの種にとって、環境中に炭素含有基質または有機材料が存在することは有利ではなく、増殖を向上させることはない。しかし科と起源が非常に多彩な微細藻類のいくつかの種は、厳密には独立栄養性ではないことがわかっている。例えばそのうちの従属栄養性と呼ばれるいくつかは、光がまったくない状態で、発酵によって、すなわち有機材料を利用して増殖することができる。 Most species of microalgae found in freshwater or the ocean are generally autotrophic, ie can only grow by photosynthesis. For those species, the presence of a carbon-containing substrate or organic material in the environment is not advantageous and does not improve growth. However, some species of microalgae with very diverse families and origins have been found not to be strictly autotrophic. For example, some of them, called heterotrophic, can be grown by fermentation, ie utilizing organic materials, in the absence of any light.
増殖する上で光合成が不可欠な微細藻類の他の種は、光合成と、環境中に存在する有機材料の両方を利用することができる。混合栄養性と呼ばれるこれらの中間種は、光と有機材料の両方が存在する状態で培養することができる。 Other species of microalgae where photosynthesis is essential for their growth can utilize both photosynthesis and organic materials present in the environment. These intermediate species, called mixed nutrients, can be cultured in the presence of both light and organic materials.
“混合栄養性”と呼ばれる藻類のこの特徴は代謝と結び付いていて、その代謝によってこの藻類が光合成と発酵を同時に実行することが可能になっているように思われる。これら２種類の代謝は、藻類の増殖に対するプラスの全体的効果と共存している［Ｙａｎｇ， Ｃ．他（２０００年）；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｊｏｕｒｎａｌ、第６巻：８７〜１０２ページ］。 This feature of algae called “mixed nutrition” is linked to metabolism, which appears to allow the algae to simultaneously carry out photosynthesis and fermentation. These two types of metabolism coexist with a positive overall effect on algal growth [Yang, C. et al. Et al. (2000); Biochemical Engineering Journal, Vol. 6: 87-102].
現在、微細藻類は多くの工業的プロジェクトの対象となっている。なぜならいくつかの種は、大量の脂質、特に炭化水素と脂肪酸を蓄積または分泌することができるからである。このような脂肪酸（その中には多不飽和脂肪酸と飽和脂肪酸が含まれる）には多くの工業的応用がある。 Currently, microalgae are the subject of many industrial projects. This is because some species can accumulate or secrete large amounts of lipids, especially hydrocarbons and fatty acids. Such fatty acids (which include polyunsaturated fatty acids and saturated fatty acids) have many industrial applications.
カプリン酸（デカン酸、またはＣ１０：０、またはＣ１０としても知られる）は、化学式Ｃ１０Ｈ２０Ｏを持つ飽和脂肪酸であり、二重結合をまったく持っていない。 Capric acid (decanoic acid or C10,: also known as 0 or C 10,) is a saturated fatty acid having a chemical formula C 10 H 20 O, I do not have any double bond.
カプリン酸は、複数の工業分野で使用されており、例えばインク用溶媒や脱脂剤として、また化粧用組成物や石鹸の中の軟化剤として用いられている。カプリン酸は、香水、潤滑剤、プラスチック、染料の製造にも用いられている。カプリン酸のグリセロールのエステルは、食品と栄養製品に使用されている。 Capric acid is used in a plurality of industrial fields, for example, as an ink solvent and a degreasing agent, and as a softening agent in cosmetic compositions and soaps. Capric acid is also used in the manufacture of perfumes, lubricants, plastics and dyes. Glycerol esters of capric acid are used in food and nutritional products.
現在のところ、カプリン酸は、主として植物による産生経路（特にヤシ油とパーム核油）によって、または化学経路によって製造されている。カプリン酸は、ヤシ油の中の全脂肪酸の６〜１０％を占め、パーム核油の中の全脂肪酸の３〜１４％を占める。カプリン酸の収率はこのように低いため、植物によるこの産生経路はコストがかかる。 At present, capric acid is mainly produced by plant production pathways (especially palm oil and palm kernel oil) or by chemical pathways. Capric acid accounts for 6-10% of the total fatty acids in coconut oil and 3-14% of the total fatty acids in palm kernel oil. Because of the low yield of capric acid, this production pathway by plants is costly.
カプリン酸を製造する別の経路は化学合成である。カプリン酸（デカン酸、またはＣ１０：０、またはＣ１０としても知られる）は、通常は、アセトン溶媒を使用し、酸性条件下で酸化剤として三酸化クロム（ＣｒＯ３）を用いてデカノールを酸化することによって調製される。この製造経路はコストがかかり、しかも三酸化クロムは健康と環境に大きな影響を与える。 Another route to produce capric acid is chemical synthesis. Capric acid (decanoic acid or C10,: 0, also known as or C 10,) is typically using acetone solvent, oxidation of decanol with chromium trioxide (CrO 3) as an oxidizing agent under acidic conditions To be prepared. This manufacturing route is costly, and chromium trioxide has a significant impact on health and the environment.
そこで将来において市場での増大する要求に応じるため、この脂肪酸の新たな製造源を探す必要がある。 In order to meet the increasing demands in the market in the future, it is necessary to find a new source of this fatty acid.
そこで出願人は、通常ではない光条件下での多数の実験と、さまざまな基質の添加により、混合栄養モードで培養できるボツリオコッカス属の微細藻類の株を単離することで、カプリン酸の産生を可能にした。 Therefore, the applicant has isolated capric acid by isolating a strain of botulococcus microalgae that can be cultivated in mixed nutrient mode by numerous experiments under unusual light conditions and addition of various substrates. Production was made possible.
出願人が知る限り、微細藻類によるカプリン酸の産生はこれまで知られていない。微細藻類によるカプリン酸の産生は、上記の理由により、化学経路による製造および植物経路による産生と比べて有利な代替法である。 As far as the applicant is aware, the production of capric acid by microalgae has not been known so far. Production of capric acid by microalgae is an advantageous alternative compared to production by chemical route and production by plant route for the reasons described above.
現在のところ、藻類の分類は、主に、形態的基準と、細胞に含まれる光合成色素の性質とに相変わらず基づいている。そのため、藻類は種と形態が非常に多彩であるにもかかわらず、この分類では、藻類の種が、独立栄養性、従属栄養性、混合栄養性のどれであるかがほとんどわからない［Ｄｕｂｉｎｓｋｙ他（２０１０年）；Ｈｉｄｒｏｂｉｏｌｏｇｉａ、第６３９巻：１５３〜１７１ページ］。 At present, the classification of algae is mainly based on the morphological criteria and the nature of the photosynthetic pigments contained in the cells. Therefore, despite the variety of species and forms of algae, this classification hardly reveals whether algae species are autotrophic, heterotrophic, or mixed-nutrient [Dubinsky et al. ( 2010); Hidobiologia, 639: 153-171].
真核性藻類の分類には１４の門が含まれる。脂肪酸を産生するこれらの門を構成するさまざまな綱の種の間で、微細藻類に含まれる脂質の含量、特に炭化水素と多不飽和脂肪酸と飽和脂肪酸の含量が大きく異なっている。さらに、特に脂質のプロファイル中の脂質の相対的な比率は、種と培養条件によって異なる。 The classification of eukaryotic algae includes 14 gates. The content of lipids in microalgae, especially the content of hydrocarbons, polyunsaturated fatty acids and saturated fatty acids, varies greatly between the various class species that make up these gates that produce fatty acids. Furthermore, the relative proportions of lipids, particularly in the lipid profile, vary with species and culture conditions.
微細藻類による脂肪酸の産生を工業的スケールで実現するには、複数の因子を考慮する必要がある。例えば培養は、株、温度、光の条件、発酵装置のサイズに応じ、独立栄養条件、混合栄養条件、従属栄養条件のいずれかで実施することができる。培養は、例えば１リットルの容器の中で、実験室で、光バイオリアクターの中で、１００，０００リットルの容器の中で実施することや、開放された（数ヘクタールの）池の中で実施することもできる。しかし理想的な培養条件を開発するには、エネルギーのコストやそれ以外の資源（例えば労力、培養状態の監視の容易さ）を考慮する必要がある。 Several factors need to be considered in order to achieve fatty acid production by microalgae on an industrial scale. For example, the culture can be performed under any of autotrophic conditions, mixed nutrient conditions, and heterotrophic conditions depending on the strain, temperature, light conditions, and the size of the fermentation apparatus. Cultivation can be carried out, for example, in a 1 liter vessel, in a laboratory, in a photobioreactor, in a 100,000 liter vessel or in an open (several hectare) pond. You can also However, in order to develop ideal culture conditions, it is necessary to consider energy costs and other resources (for example, labor, ease of monitoring culture conditions).
いずれにせよ、微細藻類は、産生する脂肪酸の収率増大にとって最適な条件で培養することが望ましい。したがってできるだけ大きな収率が得られることが好ましい（例えば５０ｇ／ｌ超の乾燥材料と、乾燥材料に対して６０％超の脂肪酸）。 In any case, it is desirable to culture the microalgae under the optimum conditions for increasing the yield of the fatty acid produced. It is therefore preferable to obtain as large a yield as possible (for example, more than 50 g / l dry material and more than 60% fatty acid relative to the dry material).
工業的なより効率的かつより収益性のよい産生のためには、カプリン酸の収率をより大きくできることが望ましかろう。 For industrial more efficient and more profitable production, it would be desirable to be able to increase the yield of capric acid.
さらに、ボツリオコッカス属の微細藻類（緑色植物門、緑藻綱、クロロコックム目、ボツリオコックス科）［ＩＴＩＳ、生命のカタログ、２０１０年］のいくつかの株は、無視できない量の炭化水素、特にｎ−アルカジエン、トリエン、メチル化スクワレン、トリテルペノイド、テトラテルペノイド、リコパジエンを産生することができる。これらの株はさらに、ボトリオコッセンという名前にまとめられる、長い炭素鎖を有する特別な炭化水素を産生する。これらの炭化水素は、主に、化学式ＣｎＨ２ｎ−１０で表わされる非分岐のトリテルペンイソプレノイドからなる。これらの炭化水素は、クラッキングと精製によってケロセンまたは軽油に変換することができる。３種類のボツリオコッカス・ブラウニーが記録されていて、それらは、産生される特徴的な炭化水素に基づいて識別される。種類Ａは、奇数ｎ−アルカジエンＣ２５〜Ｃ３１とトリエンを産生する。種類Ｂは、イソプレノイドを起源としていてボトリオコッセンとして知られるトリテルペノイド炭化水素（Ｃ１１Ｈ２ｎ−１０、ｎ＝３０〜３７）を産生する。種類Ｌは、リコパジエンを産生する。これは、１つのテトラテルペンＣ４０である。 In addition, some strains of the botulococcus microalgae (green plant phylum, green algae, Chlorococcidae, Botriococcidae) [ITIS, catalog of life, 2010] have non-negligible amounts of hydrocarbons, especially n-alkadienes, trienes, methylated squalene, triterpenoids, tetraterpenoids, lycopadiene can be produced. These strains also produce special hydrocarbons with long carbon chains that are grouped under the name Botryococcene. These hydrocarbons, mainly consisting of unbranched triterpene isoprenoid represented by the chemical formula C n H 2n-10. These hydrocarbons can be converted to kerosene or light oil by cracking and refining. Three types of Botriococcus brownies have been recorded and are identified based on the characteristic hydrocarbons produced. Type A produces odd n- alkadiene C 25 -C 31 and triene. Type B is a triterpenoid hydrocarbon (C 11 H 2n-10 , n = 30-37) that originates from isoprenoids and is known as botryococcene. Type L produces lycopadiene. This is one tetraterpenes C 40.
ボツリオコッカス・ブラウニーは、産生される炭化水素の品質と、独立栄養モードでの培養が容易であることを理由として、これまで最もよく研究されてきた種である。色が濃いことで知られるこの緑藻は、一般に、５００〜１，５００マイクロモル／ｍ２秒という大輝度条件下で培養される。 Botriococcus brownies are the species that has been best studied so far due to the quality of the hydrocarbons produced and the ease of culturing in the autotrophic mode. This green algae, known for its dark color, is generally cultured under high-brightness conditions of 500-1500 micromol / m 2 seconds.
ボツリオコッカス・ブラウニーｖａｒ．ショウワは、その乾燥重量の３０％までボトリオコッセンを蓄積することで知られている。ボトリオコッセンの脂肪鎖は、３０〜３７個の炭素原子を含んでいる［プラントの特許、アメリカ合衆国特許第６，１６９号］。この株のゲノムのシークエンシングが現在行なわれている。 Botriococcus brownie var. Showa is known to accumulate botryococcene to 30% of its dry weight. Botryococcene's fatty chain contains 30-37 carbon atoms [Plant Patent, US Pat. No. 6,169]. Sequencing of the genome of this strain is currently underway.
この株の突然変異種であるボツリオコッカス・ブラウニーｖａｒ．ニンセイは、細胞外マトリックスにボトリオコッセンを分泌できることが記載されている［アメリカ合衆国特許出願公開第２００６／０２６５８００号］。この分泌は、ボツリオコッカスのコロニーを液体培地に浮かばせる効果を有する。そうなることで、ボトリオコッセンを含む藻類を培地の表面でうまく回収することが可能になる。 A mutant of this strain, Botriococcus brownie var. Ninsei has been described as being capable of secreting botryococcene into the extracellular matrix [US Patent Application Publication No. 2006/0265800]. This secretion has the effect of allowing the botulococcus colonies to float in the liquid medium. As a result, algae containing botryococcene can be successfully recovered on the surface of the medium.
田野井と河地によって単離されたボツリオコッカス・ブラウニーＢ７０株［ＴａｎｏｉとＫａｗａｃｈｉ（２０１１年）、「炭素供給源がボツリオコッカス・ブラウニーの増殖と形態に及ぼす効果」、Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｐｈｙｃｏｌ．、第２３巻：２５〜３３ページ］は、独立栄養条件、従属栄養条件、混合栄養条件のもとで増殖することができる。暗条件または明条件でグルコースを存在させると、油を含有する細胞と粒子は、グルコースの不在下で得られるよりもサイズがはるかに大きくなった。 Botriococcus brownie B70 strain isolated by Tanoi and Kawachi [Tanoi and Kawachi (2011), “Effects of carbon source on growth and morphology of Botriococcus brownie”, J. Org. Appl. Physol. 23: 25-33] can grow under autotrophic, heterotrophic and mixed nutrient conditions. In the presence of glucose in the dark or light conditions, the oil-containing cells and particles were much larger in size than would be obtained in the absence of glucose.
しかし現在のところ、カプリン酸を産生するボツリオコッカスの株は知られていない。そこで出願人は、ボツリオコッカスの株のうちでカプリン酸を産生する能力を有する株を探した。 At present, however, no strain of Botriococcus that produces capric acid is known. Accordingly, the applicant searched for a strain having the ability to produce capric acid among the Botriococcus strains.
その結果、出願人は、通常ではない光条件下での多数の実験と、さまざまな基質の添加により、ボツリオコッカス・ブラウニー種とボツリオコッカス・スデティクス種という微細藻類の株を混合栄養モードで培養するとカプリン酸の産生が可能になることを確認するに至った。より具体的には、不連続に変化する照明、特にフラッシュの形態の照明の存在下でこの微細藻類を混合栄養モードで培養するとカプリン酸の収率が向上する。 As a result, applicants have been able to mix microalgae strains of Botriococcus brownie and Botriococcus sudetics in mixed nutrient mode through numerous experiments under unusual light conditions and the addition of various substrates. It has been confirmed that the cultivation of capric acid becomes possible when cultured. More specifically, culturing the microalgae in mixed nutrient mode in the presence of discontinuously changing illumination, particularly in the form of flash, increases the yield of capric acid.
関係する株は、それぞれ、ＦＣＣ ８２８（ＣＣＡＰ ８０７／６）とＦＣＣ ８４１（ＣＣＡＰ ８０７／４）である。ＦＣＣ ８２８株はボツリオコッカス・ブラウニー種に属し、ＦＣＣ ８４１はボツリオコッカス・スデティクス種に属する。これらの株は、ブダペスト条約の規定に従って２０１０年１０月２０日にＣＣＡＰ（藻類と原生生物の培養コレクション、スコットランド海洋科学協会、ダンスタッフネージ海洋研究所、オーバン、アルギル ＰＡ３７１ＱＡ、スコットランド、イギリス国）に寄託された。
The strains involved are FCC 828 (CCAP 807/6) and FCC 841 (CCAP 807/4), respectively. The
培養と選択の方法は、より具体的には、微細藻類を有機炭素含有基質とともに混合栄養条件下で培養するというものであった。光は、連続的に照射すること、すなわち古典的な混合栄養モードで照射することができる。培養は、特定の周波数を持っていて光の強度がある範囲で変化する、変化する照明および／または不連続な照明、特にフラッシュの形態の照明の存在下で実施することもできる。 More specifically, the culture and selection method was to culture microalgae with organic carbon-containing substrate under mixed nutrient conditions. The light can be irradiated continuously, i.e. in a classic mixed nutrition mode. Incubation can also be carried out in the presence of varying illumination and / or discontinuous illumination, in particular in the form of a flash, having a specific frequency and varying the light intensity over a certain range.
微細藻類にとってストレスとなると一般に考えられる明相と暗相（または光の強度がより小さい相）の頻繁な交代により、驚くべきことに、ボツリオコッカス・ブラウニーとボツリオコッカス・スデティクスの株で、バイオマスと脂質とカプリン酸の産生、その中でも特にカプリン酸の産生を増大させることができた。本発明による株を実現することで、光の照射を少なくしてカプリン酸を発酵装置の中で工業的に産生させる展望が開け、したがってこの酸を取得するさまざまなモードと比べてエネルギーを節約することができるはずである。 Surprisingly, due to the frequent alternation of light and dark phases (or phases with lower light intensity) that are generally considered stressful for microalgae, in the Botriococcus brownie and Botriococcus strains strains, Production of biomass, lipids and capric acid, especially capric acid, could be increased. Realizing the strain according to the present invention opens up the prospect of industrial production of capric acid in the fermenter with less light irradiation, thus saving energy compared to different modes of obtaining this acid Should be able to.
本発明のさまざまな側面と利点を以下に詳細に記載する。 Various aspects and advantages of the invention are described in detail below.
本発明によれば、混合栄養モードで培養した微細藻類によるカプリン酸の収率は、全脂肪酸の３０〜８０％である。バイオマスの収率、したがってカプリン酸の収率は、特にフラッシュの形態の変化する不連続な照明の存在下での方法を利用すると向上する。このような培養条件では、微細藻類によるカプリン酸の収率は、全脂肪酸の５５％を超える可能性がある。 According to the present invention, the yield of capric acid by microalgae cultured in the mixed nutrition mode is 30-80% of the total fatty acids. The yield of biomass, and hence the yield of capric acid, is improved especially when utilizing the method in the presence of discontinuous lighting with varying flash morphology. Under such culture conditions, the yield of capric acid by microalgae can exceed 55% of total fatty acids.
したがって本発明は、ボツリオコッカス属、特にボツリオコッカス・ブラウニー種とボツリオコッカス・スデティクス種の微細藻類を混合栄養モードで培養してカプリン酸を産生させる方法を目的とする。培養は、“古典的な” 混合栄養モードで実施すること、すなわち自然光を照射して（屋外での培養）、または連続的かつ一定の光を照射して実施することができる。 Accordingly, the present invention is directed to a method of producing capric acid by culturing microalgae of the genus Botriococcus, in particular, Botriococcus brownie and Botriococcus sudeticis in a mixed nutrient mode. Cultivation can be carried out in the “classical” mixed-nutrition mode, ie with natural light (outdoor cultivation) or with continuous and constant light.
本発明の一実施態様によれば、培養は、連続した照明、または不連続な照明および／または時間変化する照明の条件で実施される。照明は強度が変化し、その振幅は一般に５マイクロモル／ｍ２秒〜１０００マイクロモル／ｍ２秒だが、３０〜４００マイクロモル／ｍ２秒であることが好ましい。この変化は、一般に１時間につき２〜３６００回にできるが、１時間につき２〜２００回であることが好ましい。これらの培養条件により、規定量の光を照射することができる。光のこの照射は、不連続な照明の段階および／または変化する照明の段階を含むことができ、強度の変化は、振幅が同じでも異なっていてもよい。照射は、特にフラッシュの形態で行なうことができる。 According to one embodiment of the invention, the culturing is performed under conditions of continuous illumination, or discontinuous illumination and / or time-varying illumination. Illumination varies in intensity, and its amplitude is generally from 5 micromole / m 2 seconds to 1000 micromole / m 2 seconds, but preferably from 30 to 400 micromole / m 2 seconds. This change can generally be 2-3600 times per hour, but is preferably 2-200 times per hour. Depending on these culture conditions, a prescribed amount of light can be irradiated. This illumination of light can include discrete illumination steps and / or varying illumination steps, and the intensity changes can be the same or different in amplitude. Irradiation can take place in particular in the form of a flash.
この方法は、培養で得られるバイオマスの収率が増大するという利点を有する。この方法は、このようにして培養した微細藻類のカプリン酸が豊富になるという利点も有する。この方法は、混合栄養性でカプリン酸の収率が高いボツリオコッカス属の株、特にボツリオコッカス・ブラウニー種とボツリオコッカス・スデティクス種の株を選択するのにも利用できる。 This method has the advantage that the yield of biomass obtained in culture is increased. This method also has the advantage that the microalgae cultured in this way are rich in capric acid. This method can also be used to select strains of the genus Botriococcus with mixed nutritional and high yields of capric acid, in particular, strains of Botriococcus brownie and Botriococcus sudetics.
この微細藻類の混合栄養モードでの培養は、照明条件がどのようであれ、５ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは５０ｍＭ〜８００ｍＭ、より好ましくは７０ｍＭ〜６００ｍＭ、より一層好ましくは１００ｍＭ〜５００ｍＭの有機炭素含有基質の存在下でなされることが好ましい。細胞が高濃度の脂質を蓄積できるよう、基質は培養中を通じて連続的に添加される。培養中に追加の基質を培地に添加して一定の濃度を維持する。この有機炭素含有基質は、グルコース、および／またはセルロースの誘導体、および／または乳酸塩、および／またはデンプン、および／またはラクトース、および／または蔗糖、および／または酢酸塩、および／またはグリセロールを純粋な形態または混合物の形態で含んでいることが好ましい。好ましい基質は酢酸ナトリウムである。 The cultivation of the microalgae in the mixed nutrient mode is performed with an organic carbon-containing substrate of 5 mM to 1 M, preferably 50 mM to 800 mM, more preferably 70 mM to 600 mM, and even more preferably 100 mM to 500 mM, regardless of the lighting conditions. It is preferably done in the presence. The substrate is added continuously throughout the culture so that the cells can accumulate high concentrations of lipids. During the incubation, additional substrate is added to the medium to maintain a constant concentration. This organic carbon-containing substrate is pure from glucose and / or cellulose derivatives and / or lactate and / or starch and / or lactose and / or sucrose and / or acetate and / or glycerol. It is preferable to contain in the form of a form or a mixture. A preferred substrate is sodium acetate.
培地に含まれる有機炭素含有基質は、複合分子または基質混合物で構成することができる。例えばトウモロコシ、コムギ、ジャガイモに由来するデンプンの生体内変化による産物、特にデンプンのサイズが小さな分子からなる加水分解産物は、例えば、本発明に従って微細藻類を混合栄養モードで培養するのに適した炭素含有基質である。 The organic carbon-containing substrate contained in the medium can be composed of a complex molecule or a substrate mixture. Products produced by biotransformation of starches derived from, for example, corn, wheat and potato, especially hydrolysates composed of molecules with small starch sizes, are suitable for cultivating microalgae in mixed nutrient mode according to the present invention, for example. Contains substrate.
この方法は、より具体的には、ボツリオコッカス属の微細藻類（門：緑色植物、目：クロロコックム、科：ボツリオコックス）［生命のＩＴＩＳカタログ、２０１０年］の株のうちで、混合栄養性であって、有機炭素含有基質を添加した３ＮＢＢＭ＋Ｖ培地（ＣＣＡＰ − 藻類と原生生物の培養物コレクション）の中で特に１０μＥを超える光を照射して培養できる株を選択するためのものである。有機炭素含有基質は、酢酸塩を５ｍＭ以上の濃度で含んでいることが好ましい。 More specifically, this method is a mixed nutrient among strains of the microalga of the genus Botriococcus (Gate: green plant, eyes: Chlorococcum, family: Botriocox) [ITIS catalog of life, 2010]. This is for selecting a strain that can be cultured by irradiation with light exceeding 10 μE, particularly in 3NBBM + V medium (CCAP-algae and protist culture collection) supplemented with an organic carbon-containing substrate. The organic carbon-containing substrate preferably contains acetate at a concentration of 5 mM or more.
ボツリオコッカスのこれらの株、より具体的にはボツリオコッカス・ブラウニーとボツリオコッカス・スデティクスは、本発明の選択・培養法に従って単離し、選択することができる。 These strains of Botriococcus, more specifically Botriococcus brownie and Botriococcus sudetics, can be isolated and selected according to the selection and culture method of the present invention.
本発明によるボツリオコッカス・ブラウニーの株のうちで代表的な１つの株はＦＣＣ ８２８株であり、出願人によって単離され、２０１０年１０月２０日にＣＣＡＰにＣＣＡＰ ８０７／６の番号で寄託された。本発明によるボツリオコッカス・ブラウニーの株のうちで代表的な別の株はＦＣＣ ８４１株であり、出願人によって単離され、２０１０年１０月２０日にＣＣＡＰにＣＣＡＰ ８０７／４の番号で寄託された。
One representative strain of Botriococcus brownie according to the present invention is the
このような株は、混合栄養モードで培養するとき、大量のカプリン酸を産生することができる。本発明によれば、これらの株のバイオマスの収率は、光の照射が変化するとき、または不連続であるときにさらに大きくなる。 Such strains can produce large amounts of capric acid when cultured in mixed nutrition mode. According to the present invention, the biomass yields of these strains are even greater when the light irradiation changes or is discontinuous.
現在進行中の分類分析によれば、ＣＣＡＰ ８０７／６とＣＣＡＰ ８０７／４は、ボツリオコッカス・ブラウニー種の種類Ａとボツリオコッカス・スデティクス種にそれぞれ属する。本発明は、混合栄養モードで増殖できてカプリン酸の産生が可能なあらゆるボツリオコッカス・ブラウニー種とボツリオコッカス・スデティクス種（例えばこの明細書に記載した種）に関する。本発明は、混合栄養モードで増殖できてカプリン酸の産生が可能なボツリオコッカス属の微細藻類のあらゆる種（例えばこの明細書に記載した種）にも関する。 According to the ongoing classification analysis, CCAP 807/6 and CCAP 807/4 belong to the Botriococcus brownie species A and Botriococcus sudetics species, respectively. The present invention relates to any Botriococcus brownie species and Botriococcus sudetics species (eg, the species described herein) that are capable of growing in a mixed nutrient mode and capable of producing capric acid. The present invention also relates to any species of Botriococcus microalgae that can be grown in a mixed nutrient mode and produce capric acid (eg, the species described herein).
本出願の中で同定されたボツリオコッカスの株を本発明に従って混合栄養条件で培養することにより、古典的な混合栄養条件で、大量のバイオマスと、カプリン酸が非常に豊富な脂質とを産生させることができる（図１参照）。カプリン酸は、微細藻類に含まれる全脂質の３０％超、４５％超、６０％超、７５％超に達する可能性がある。 By culturing Botriococcus strains identified in the present application under mixed nutrient conditions according to the present invention, large amounts of biomass and lipids very rich in capric acid are produced under classic mixed nutrient conditions (See FIG. 1). Capric acid can reach over 30%, over 45%, over 60%, over 75% of the total lipids contained in microalgae.
図１は、混合栄養モード（有機炭素含有基質として５ｍＭの酢酸ナトリウムを含む）または独立栄養モードで培養されたＦＣＣ ８２８株とＦＣＣ ８４１株の脂質のプロファイルを示している。独立栄養モードで培養されたＦＣＣ ８２８株（図１のＡ）はカプリン酸を産生しない。独立栄養モードでの培養によって得られる脂肪酸の大半は、Ｃ１８：１ｎ９、Ｃ１８：３ｎ３、Ｃ１６：０、Ｃ１８：２ｎ６ｔ、Ｃ２０：５ｎ３からなる（多い順番に記載）。図面では、脂肪酸を特定するのに生理学での用語を用いてある。例えばＣ１８：１ｎ９（オレイン酸）は、１８個の炭素原子からなる炭素鎖と、末端のメチル基から数えて９番目の炭素の位置に１つの二重結合を有する脂肪酸である。
FIG. 1 shows the lipid profiles of
予想外なことに、混合栄養モードのＦＣＣ ８２８株の培養物から得られた脂肪酸のプロファイルは劇的に変化した。今やカプリン酸が得られた脂肪酸の大半を占め、Ｃ１８：１ｎ９、Ｃ１８：３ｎ３、Ｃ１６：０、Ｃ１８：２ｎ６ｔ、Ｃ２０：５ｎ３の割合は少ない。
Unexpectedly, the fatty acid profile obtained from cultures of the mixed
独立栄養モードで培養されたＦＣＣ ８４１株（図１のＢ）もカプリン酸を産生しない。独立栄養モードでの培養によって得られる脂肪酸の大半は、Ｃ１６：０、Ｃ１８：１ｎ９、Ｃ１８：３ｎ３、Ｃ１８：２ｎ６ｔ（多い順番に記載）と、少量のＣ２０鎖とＣ２２鎖の酸である。 The FCC 841 strain cultured in autotrophic mode (FIG. 1B) also does not produce capric acid. Most of the fatty acids obtained by culturing in the autotrophic mode are C16: 0, C18: 1n9, C18: 3n3, C18: 2n6t (listed in descending order) and small amounts of C20 and C22 chain acids.
混合栄養モードのＦＣＣ ８２８株で観察されたのと同様、ＦＣＣ ８４１株によって産生された脂肪酸のプロファイルは、カプリン酸が非常に豊富なプロファイルへと劇的に変化する。得られる脂肪酸で圧倒的に多いのがカプリン酸であり、Ｃ１８：１ｎ９、Ｃ１８：３ｎ３、Ｃ１６：０、Ｃ１８：２ｎ６ｔ、Ｃ２０：５ｎ３の割合は少ない。
Similar to that observed in the mixed
これら２つの株では、得られた全脂肪酸の７０％超をカプリン酸が占める。 In these two strains, capric acid accounts for over 70% of the total fatty acids obtained.
混合栄養条件で培養したＦＣＣ ８２８株とＦＣＣ ８４１株では、得られた脂質のプロファイルの劇的な変化が観察されるだけでなく、得られたバイオマスの大きな増加も確認される。この増加は、１０〜２０％、より一般には２０〜５０％であり、独立栄養モードで培養した同じ株での増加よりも大きい。
In
本発明の一実施態様によれば、培養は、混合栄養条件にて、特にフラッシュの形態の変化する照明および／または不連続な照明の存在下でなされる。このような条件下では、ＦＣＣ ８２８株とＦＣＣ ８４１株で得られるバイオマスは１０〜２０％、より一般には２０〜５０％であり、古典的な混合栄養モードで培養した同じ株よりも多い。古典的混合栄養モードとは、同じ培地を用いるが、自然光の照射（屋外での培養）での培養条件、または連続的かつ一定の光の照射での培養条件を意味する。
According to one embodiment of the invention, the culturing is carried out in mixed nutrient conditions, in particular in the presence of changing illumination in the form of a flash and / or discontinuous illumination. Under such conditions, the biomass obtained with the
そこで本発明は、ボツリオコッカス属、特にボツリオコッカス・ブラウニー種とボツリオコッカス・スデティクス種の微細藻類を混合栄養モードで培養してカプリン酸を産生させる方法を目的とする。本発明は、時間とともに変化する照明および／または不連続な照明（例えばフラッシュの形態の照明）の存在下でのこのような方法も目的とする。 Therefore, the present invention is directed to a method for producing capric acid by culturing microalgae of the genus Botriococcus, in particular, Botriococcus brownie species and Botriococcus sudeticus species, in a mixed nutrient mode. The present invention is also directed to such a method in the presence of time-varying illumination and / or discontinuous illumination (eg, illumination in the form of a flash).
そこで本発明は、混合栄養性であってカプリン酸の収率が大きいボツリオコッカス属、特にボツリオコッカス・ブラウニー種とボツリオコッカス・スデティクス種の微細藻類を、特に時間とともに変化する照明および／または不連続な照明の存在下で選択する方法を目的とする。 Accordingly, the present invention is directed to the microalgae of the genus Botriococcus, particularly Botriococcus brownie and Botriococcus sudetics, which are mixed nutrients and have a high yield of capric acid, in particular, illumination and / Or the method of selecting in the presence of discontinuous illumination.
特に混合栄養モードで培養するときに培養物に変化する照明および／または不連続な照明を照射すると、藻類の増殖に好ましい影響があり、特に脂質の産生に関して藻類の生産性を増大させうることがわかった。発明者は、理論に囚われることなく、不連続な光および／または変化する光を微細藻類に照射すると、増殖と脂質合成にとって有利な“ストレス”を生じさせることができると考えている。この現象は、自然界において微細藻類は環境の制約に対抗するため予備の脂質を蓄積する傾向を有するという事実によって一部が説明できよう。 Irradiating changing and / or discontinuous lighting on the culture, especially when cultivated in mixed nutrition mode, has a positive effect on algae growth and can increase algae productivity, especially with respect to lipid production. all right. Without being bound by theory, the inventor believes that irradiating microalgae with discontinuous and / or changing light can create “stress” that is advantageous for growth and lipid synthesis. This phenomenon may be explained in part by the fact that microalgae in nature tend to accumulate reserve lipids to counter environmental constraints.
不連続な照明とは、複数の暗い期間によって区切られた照明を意味する。暗い期間は、１／４の時間、好ましくは半分以上の時間存在することができ、その間に藻類が培養される。 Discontinuous illumination refers to illumination delimited by multiple dark periods. The dark period can exist for 1/4 time, preferably more than half time during which the algae are cultured.
本発明の好ましい一実施態様によれば、照明は不連続であり、フラッシュの形態であることがより好ましい。フラッシュは、本発明の意味では、短時間の照明、すなわち３０分未満の照明である。フラッシュの持続時間は１５分未満が可能であり、５分未満が好ましく、１分未満がさらに好ましい。本発明のいくつかの実施態様によれば、フラッシュの持続時間は、１秒未満にすることができる。フラッシュの持続時間は、例えば１／１０秒、２／１０秒、３／１０秒、４／１０秒、５／１０秒、６／１０秒、７／１０秒、８／１０秒、９／１０秒のいずれかが可能である。光の照射またはフラッシュは、一般に１５秒よりも長い期間にわたる。フラッシュの持続時間は一般に５秒間〜１０分間だが、１０秒間〜２分間が好ましく、２０秒間〜１分間がより好ましい。 According to a preferred embodiment of the invention, the illumination is more discontinuous and more preferably in the form of a flash. A flash is in the sense of the present invention a short-time illumination, ie an illumination of less than 30 minutes. The duration of the flash can be less than 15 minutes, preferably less than 5 minutes, more preferably less than 1 minute. According to some embodiments of the present invention, the duration of the flash can be less than 1 second. The duration of the flash is, for example, 1/10 second, 2/10 second, 3/10 second, 4/10 second, 5/10 second, 6/10 second, 7/10 second, 8/10 second, 9/10 Any of seconds is possible. The irradiation or flashing of light typically lasts for a period longer than 15 seconds. The duration of the flash is generally from 5 seconds to 10 minutes, but is preferably from 10 seconds to 2 minutes, more preferably from 20 seconds to 1 minute.
一般に、フラッシュの数は１時間につき約２〜３６００回である。この数は、例えば１時間につき１００〜３６００回にすることができる。この数は、１時間につき１２０〜３０００回、または４００〜２５００回、さらには６００〜２０００回、または８００〜１５００回にすることもできる。この数は、１時間につき２〜２００回にすることもできるが、１０〜１５０回が好ましく、１５〜１００回がより好ましく、２０〜５０回がさらに好ましい。フラッシュは、定期的な時間間隔で発生させること、または不定期な時間間隔で発生させることができる。定期的な時間間隔での発生の場合、１時間あたりのフラッシュの数は、時間間隔（Ｔ）を持つ頻度（Ｆ）に対応し、Ｆ＝１／Ｔになると考えられる。この時間間隔は１秒〜３０分、または１秒〜３６秒、または１．２秒〜３０秒、または１．４４秒〜９秒、または１．８秒〜６秒、または２．４秒〜４．５秒にすることができる。この時間間隔は１８秒〜３０分にすることもできるが、２４秒〜６分が好ましく、３６秒〜４分がより好ましく、７２秒〜３分がさらに好ましい。１時間あたりのフラッシュの数は、フラッシュの強度と持続時間の関数として選択される（下記参照）。一般に、フラッシュの形態で照射する光の強度は５〜１０００マイクロモル／ｍ２秒だが、５〜５００マイクロモル／ｍ２秒または５０〜４００マイクロモル／ｍ２秒が好ましく、１５０〜３００マイクロモル／ｍ２秒がより好ましい。定義により、１マイクロモル／ｍ２秒は、文献でしばしば用いられる単位である１μＥ／ｍ２秒に対応する（アインシュタイン）。 In general, the number of flashes is about 2-3600 per hour. This number can be, for example, 100-3600 times per hour. This number can be 120-3000 times per hour, or 400-2500 times, even 600-2000 times, or 800-1500 times. This number can be 2 to 200 times per hour, preferably 10 to 150 times, more preferably 15 to 100 times, and still more preferably 20 to 50 times. The flush can occur at regular time intervals or at irregular time intervals. In the case of occurrence at regular time intervals, the number of flashes per hour is considered to correspond to the frequency (F) with the time interval (T), and F = 1 / T. This time interval is 1 second to 30 minutes, or 1 second to 36 seconds, or 1.2 seconds to 30 seconds, or 1.44 seconds to 9 seconds, or 1.8 seconds to 6 seconds, or 2.4 seconds to It can be 4.5 seconds. The time interval can be 18 seconds to 30 minutes, preferably 24 seconds to 6 minutes, more preferably 36 seconds to 4 minutes, and even more preferably 72 seconds to 3 minutes. The number of flashes per hour is selected as a function of flash intensity and duration (see below). In general, the intensity of light for irradiating flash mode but 5-1000 micromoles / m 2 sec, preferably 5 to 500 micromoles / m 2 sec or 50 to 400 micromoles / m 2 sec, 150 to 300 micromolar / M 2 seconds is more preferable. By definition, 1 micromole / m 2 sec corresponds to 1MyuE / m 2 sec is often unit used in the literature (Einstein).
本発明の特別な一実施態様によれば、光の強度は５０〜２００マイクロモル／ｍ２秒であり、フラッシュの時間間隔は、フラッシュの持続時間が１秒間〜１分間だと１０秒〜６０分である。 According to one particular embodiment of the invention, the light intensity is 50-200 micromole / m 2 seconds and the flash time interval is 10 seconds to 60 for flash durations of 1 second to 1 minute. Minutes.
本発明の別の一実施態様によれば、照明は変化させることができる。これは、照射が暗相によって中断されることはないが、光の強度が時間とともに変化することを意味する。光の強度のこの変化は規則的であり、周期的または循環式にすることができる。本発明によれば、連続した照明の段階と不連続な照明の段階を組み合わせた光照射にすることもできる。 According to another embodiment of the invention, the illumination can be varied. This means that the irradiation is not interrupted by the dark phase, but the intensity of the light changes with time. This change in light intensity is regular and can be periodic or cyclic. According to the present invention, it is also possible to provide light irradiation that combines a continuous illumination stage and a discontinuous illumination stage.
本発明によれば、どのような照明条件であれ、培養している藻類に対する光の強度（１秒あたり、１平方メートルあたりのフォトンのマイクロモル数（マイクロモル／ｍ２秒）を単位として表示）が、１時間のうちに少なくとも１回は変化する。光の強度のこの変化の振幅は、一般に、５〜１０００、または５０〜８００、または１００〜６００マイクロモル／ｍ２秒である。光の強度は、５〜４００マイクロモル／ｍ２秒で変化させることもできる。光の強度変化の振幅は７０〜３００マイクロモル／ｍ２秒が好ましく、１００〜２００マイクロモル／ｍ２秒がより好ましい。 According to the present invention, the intensity of light to the cultured algae under any lighting conditions (expressed in units of micromoles of photons per square meter per second (micromoles / m 2 seconds)) However, it changes at least once per hour. The amplitude of this change in light intensity is generally 5 to 1000, or 50 to 800, or 100 to 600 micromol / m 2 seconds. The intensity of light can also be varied from 5 to 400 micromol / m 2 seconds. The amplitude of the light intensity change is preferably 70 to 300 μmol / m 2 sec, and more preferably 100 to 200 μmol / m 2 sec.
光のこの強度は、変化する照明という条件では、１時間に数回、順番に、例えば５０と１００マイクロモル／ｍ２秒に、または５と４００マイクロモル／ｍ２秒に、または５０と８００マイクロモル／ｍ２秒にすることができる。光のこの強度は、順番に５０と２００マイクロモル／ｍ２秒にできることが好ましい。あるいは不連続な照明という条件では、光のこの強度は、１時間に数回、順番に、例えば０と５０マイクロモル／ｍ２秒に、または０と１００マイクロモル／ｍ２秒にすることができるが、順番に０と２００マイクロモル／ｍ２秒にできることがさらに好ましい。光のこの強度は、１時間に数回、順番に、例えば０と３００マイクロモル／ｍ２秒に、または０と６００マイクロモル／ｍ２秒に、または０と８００マイクロモル／ｍ２秒に、または０と１０００マイクロモル／ｍ２秒にすることもできる。
This intensity of light is changed several times an hour, in turn, for example at 50 and 100 micromole / m 2 s, or at 5 and 400 micromole / m 2 s, or 50 and 800, under the conditions of changing illumination. It can be micromole / m 2 seconds. This intensity of light is preferably able to be 50 and 200 micromol / m 2 seconds in order. Or in the condition of discontinuous illumination, this intensity of light can be several times an hour, in turn,
本発明の一実施態様によれば、どのような照射条件であれ、培養している藻類に対する光の強度は、細胞密度の関数として変化する。細胞がより密になるほど、光を強くすることができる。細胞密度は１ｍｌあたりの細胞の数であり、当業者に知られている技術に従って測定される。 According to one embodiment of the present invention, under any irradiation conditions, the light intensity for the cultured algae varies as a function of cell density. The denser the cells, the stronger the light. Cell density is the number of cells per ml and is measured according to techniques known to those skilled in the art.
培養の初期段階において細胞密度が約１０５〜５×１０５細胞／ｍｌであるとき、光の強度を５〜１５マイクロモル／ｍ２秒、好ましくは５〜１０マイクロモル／ｍ２秒にすることができる。培養物が１０６〜１０７細胞／ｍｌに到達すると、光の強度を例えば１５〜２００マイクロモル／ｍ２秒まで大きくできるが、２０〜５０マイクロモル／ｍ２秒まで大きくすることが好ましい。培養物が最終段階で１０７〜１０８細胞／ｍｌの密度に到達すると、光の強度を例えば５０〜４００マイクロモル／ｍ２秒まで大きくできるが、５０〜１５０マイクロモル／ｍ２秒まで大きくすることが好ましい。 When the cell density is about 10 5 to 5 × 10 5 cells / ml in the initial stage of culture, the light intensity is set to 5 to 15 μmol / m 2 sec, preferably 5 to 10 μmol / m 2 sec. be able to. When the culture reaches 10 6 to 10 7 cells / ml, the light intensity can be increased to, for example, 15 to 200 μmol / m 2 seconds, but it is preferable to increase the intensity to 20 to 50 μmol / m 2 seconds. When the culture reaches a density of 10 7 to 10 8 cells / ml at the final stage, the light intensity can be increased to, for example, 50 to 400 micromole / m 2 seconds, but it can be increased to 50 to 150 micromole / m 2 seconds. It is preferable to do.
本発明のいくつかの実施態様によれば、フラッシュの持続時間が例えば１分未満または１秒未満であるとき、光の強度は上記の値よりも大きくすることができる。培養の初期段階において細胞の密度が１０５〜５×１０５細胞／ｍｌであるとき、光の強度を５〜２００マイクロモル／ｍ２秒、好ましくは５〜１００マイクロモル／ｍ２秒にすることができる。培養物が１０６〜１０７細胞／ｍｌに到達すると、光の強度を例えば３０〜５００マイクロモル／ｍ２秒まで大きくできるが、５０〜４００マイクロモル／ｍ２秒まで大きくすることが好ましい。培養物が最終段階で１０７〜１０８細胞／ｍｌの密度に到達すると、光の強度を例えば１００〜１０００マイクロモル／ｍ２秒まで大きくできるが、２００〜５００マイクロモル／ｍ２秒まで大きくすることが好ましい。 According to some embodiments of the invention, the light intensity can be greater than the above values when the duration of the flash is, for example, less than 1 minute or less than 1 second. When the density of the cells is 10 5 to 5 × 10 5 cells / ml in the initial stage of the culture, the light intensity is set to 5 to 200 μmol / m 2 seconds, preferably 5 to 100 μmol / m 2 seconds. be able to. When the culture reaches 10 6 to 10 7 cells / ml, the intensity of light can be increased to, for example, 30 to 500 μmol / m 2 seconds, but it is preferable to increase it to 50 to 400 μmol / m 2 seconds. When the culture reaches a density of 10 7 to 10 8 cells / ml at the final stage, the light intensity can be increased to, for example, 100 to 1000 micromole / m 2 seconds, but increased to 200 to 500 micromole / m 2 seconds. It is preferable to do.
本発明の一実施態様によれば、１時間に培養物に照射する光の量は所定の値に留まる。この量は、約２，０００〜６００，０００、好ましくは２，０００〜３００，０００マイクロモル／ｍ２である。この量は、１時間あたり約４，０００〜２００，０００マイクロモル／ｍ２にすることができる。 According to one embodiment of the present invention, the amount of light irradiated to the culture per hour remains at a predetermined value. This amount is about 2,000 to 600,000, preferably 2,000 to 300,000 micromol / m 2 . This amount can be about 4,000 to 200,000 micromol / m 2 per hour.
本発明の一実施態様によれば、培養物にフラッシュを１時間に３０回照射する。各フラッシュは持続時間が３０秒間であり、強度は１０マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が９，０００マイクロモル／ｍ２であることを意味する。本発明の別の一実施態様によれば、培養物にフラッシュを１時間に２０回照射する。各フラッシュは持続時間が３０秒間であり、強度は２０マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が１２，０００マイクロモル／ｍ２であることを意味する。本発明の別の一実施態様によれば、培養物にフラッシュを１時間に４５回照射する。各フラッシュは持続時間が１５秒間であり、強度は５マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が３，３７５マイクロモル／ｍ２であることを意味する。本発明の別の一実施態様によれば、培養物にフラッシュを１時間に１２０回照射する。各フラッシュは持続時間が１０秒間であり、強度は２００マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が２４０，０００マイクロモル／ｍ２であることを意味する。
According to one embodiment of the invention, the culture is irradiated with
光の強度に関して上に説明したように、本発明の一実施態様によれば、培養物に照射する光の量は、細胞密度の関数として変化させることができる。培養の初期段階において細胞密度が約１０５〜５×１０５細胞／ｍｌであるとき、１時間あたりの光の全照射量は、一般に約１５００〜８０００マイクロモル／ｍ２だが、１５００〜６０００マイクロモル／ｍ２であることが好ましく、２０００〜５０００マイクロモル／ｍ２であることがさらに好ましい。培養物が１０６〜１０７細胞／ｍｌに到達すると、１時間あたりの光の全照射量を６０００〜６７，０００マイクロモル／ｍ２まで増大させることができるが、例えば６０００〜５０，０００マイクロモル／ｍ２まで増大させることが好ましく、１２，０００〜４５，０００マイクロモル／ｍ２まで増大させることがさらに好ましい。培養物が最終段階で１０７〜１０８細胞／ｍｌの密度に到達すると、１時間あたりの光の全照射量を例えば４５，０００〜３００，０００マイクロモル／ｍ２まで増大させることができるが、例えば４５，０００〜２００，０００マイクロモル／ｍ２まで増大させることが好ましく５０，０００〜１５０，０００マイクロモル／ｍ２まで増大させることがさらに好ましい。 As explained above with respect to light intensity, according to one embodiment of the present invention, the amount of light applied to the culture can be varied as a function of cell density. When the cell density is about 10 5 to 5 × 10 5 cells / ml in the initial stage of the culture, the total irradiation amount of light per hour is generally about 1500 to 8000 μmol / m 2, but 1500 to 6000 μm. is preferably mol / m 2, more preferably from 2,000 to 5,000 micromoles / m 2. When the culture reaches 10 6 to 10 7 cells / ml, the total dose of light per hour can be increased to 6000-67,000 micromol / m 2 , for example, 6000-50,000 micron. preferably increased to mol / m 2, more preferably increased to 12,000～45,000 micromoles / m 2. When the culture reaches a density of 10 7 to 10 8 cells / ml at the final stage, the total dose of light per hour can be increased to, for example, 45,000 to 300,000 micromol / m 2. , still more preferably it is increased preferably until 50,000 to 150,000 micromoles / m 2 to increase for example up 45,000～200,000 micromoles / m 2.
本発明の一実施態様によれば、培養の初期段階において（細胞密度が約１０５〜５×１０５細胞／ｍｌ）、培養物にフラッシュを１時間に３０回照射する。各フラッシュは持続時間が３０秒間であり、強度は５〜１０マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が２２５０マイクロモル／ｍ２〜４５００マイクロモル／ｍ２であることを意味する。次に、中間段階（細胞密度が１０６〜１０７細胞／ｍｌ）において、培養物にフラッシュを１時間に３０回照射する。各フラッシュは持続時間が３０秒間であり、強度は１５〜５０マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が１３，５００〜４５，０００マイクロモル／ｍ２であることを意味する。次に培養物の最終段階（細胞密度が１０７〜１０８細胞／ｍｌ）において、培養物にフラッシュを１時間に３０回照射する。各フラッシュは持続時間が３０秒間であり、強度は５０〜１５０マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が４５，０００〜１３５，０００マイクロモル／ｍ２であることを意味する。
According to one embodiment of the invention, at an early stage of culture (cell density of about 10 5 to 5 × 10 5 cells / ml), the culture is irradiated with
本発明の一実施態様によれば、例えばフラッシュの持続時間が１分間未満または１秒間未満のとき、培養の初期段階において（細胞密度が約１０５〜５×１０５細胞／ｍｌ）、培養物にフラッシュを１時間に３０回照射する。各フラッシュは持続時間が１０秒間であり、強度は５０〜１００マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が１５，０００マイクロモル／ｍ２〜３０，０００マイクロモル／ｍ２であることを意味する。次に、中間段階（細胞密度が１０６〜１０７細胞／ｍｌ）において、培養物にフラッシュを１時間に５０回照射する。各フラッシュは持続時間が１０秒間であり、強度は２００〜３００マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が１００，０００〜１５０，０００マイクロモル／ｍ２であることを意味する。次に培養物の最終段階（細胞密度が１０７〜１０８細胞／ｍｌ）において、培養物にフラッシュを１時間に１２０回照射する。各フラッシュは持続時間が１０秒間であり、強度は３５０〜４５０マイクロモル／ｍ２秒である。これは、１時間あたりの光の全照射量が４２０，０００〜５４０，０００マイクロモル／ｍ２であることを意味する。
According to one embodiment of the invention, for example when the duration of the flush is less than 1 minute or less than 1 second, at an early stage of culture (cell density is about 10 5 to 5 × 10 5 cells / ml), the culture The flash is irradiated 30 times per hour. Each flash has a duration of 10 seconds and an intensity of 50-100 micromole / m 2 seconds. This means that the total dose of light per hour is 15,000 micromol / m 2 to 30,000 micromol / m 2 . Next, at an intermediate stage (
培養物への光の照射は、発酵装置の外壁の周囲に配置した複数のランプによって実現できる。クロックが、これらのランプを決められた照射時間だけ稼働させる。発酵装置は、日光があたらない容器の中に位置している。その容器の周囲温度は制御できることが好ましい。 Irradiation of light to the culture can be realized by a plurality of lamps arranged around the outer wall of the fermentation apparatus. A clock activates these lamps for a set exposure time. The fermenter is located in a container that is not exposed to sunlight. The ambient temperature of the container is preferably controllable.
出願人が確認できたように、このようにして選択した株が混合栄養モードで不連続な光および／または変化する光の存在下においてうまく増殖できるという事実があるため、上記の株はカプリン酸をより多く産生することができる。 As the applicant has confirmed, there is the fact that the strains selected in this way can grow well in the presence of discontinuous and / or changing light in mixed nutrient mode, so Can be produced more.
したがって本発明の培養方法により、出願人が単離してＣＣＡＰにＣＣＡＰ ８０７／６とＣＣＡＰ ８０７／４という番号で寄託した株と同様、混合栄養性であってカプリン酸の収率が高いボツリオコッカス属の特にボツリオコッカス・ブラウニー種とボツリオコッカス・スデティクス種の株を選択することができる。この培養方法は、
ａ）強度が変化し、その変化の振幅は５〜１０００マイクロモル／ｍ２秒、好ましくは５〜４００マイクロモル／ｍ２秒であり、その変化は１時間に２〜３６００回、好ましくは５〜４００回である、不連続な照明および／または時間変化する照明という条件下でボツリオコッカス属の１種類または複数種類の株を混合栄養モードで培養するステップと、
ｂ）培地の中で有機炭素含有基質の存在下にてこの培養を複数世代にわたって継続するステップと、必要に応じて
ｃ）このようにして培養した微細藻類を回収するステップ
を含むことを特徴とする。
Therefore, by the culture method of the present invention, like the strains isolated by the applicant and deposited with CCAP under the numbers CCAP 807/6 and CCAP 807/4, Botriococcus having a mixed nutrition and high capric acid yield is obtained. In particular, strains of the genus Botriococcus brownie and Botriococcus sudetics can be selected. This culture method is
a) The intensity is changed, and the amplitude of the change is 5 to 1000 μmol / m 2 sec, preferably 5 to 400 μmol / m 2 sec, and the change is 2 to 3600 times per hour, preferably 5 Culturing one or more strains of the genus Botriococcus in a mixed nutrient mode under conditions of discontinuous illumination and / or time-varying illumination of ~ 400 times;
b) continuing the culturing for a plurality of generations in the presence of an organic carbon-containing substrate in the medium; and c) collecting the microalgae thus cultured, if necessary. To do.
回収ステップとは、より具体的には、上記の継代の間に細胞の数が最も増加した株の単離を意味する。 The recovery step means more specifically the isolation of the strain with the greatest increase in the number of cells during the passage.
株を選択するため、ボツリオコッカス属の特にボツリオコッカス・ブラウニー種とボツリオコッカス・スデティクス種のさまざまな株を同一の容器内の複数のマイクロプレート上で並列に培養し、そのさまざまな培養物の条件と変化をしっかりとモニタすることができる。したがってさまざまな株が、不連続な照明および／または変化する照明に対してと、場合によっては培地に添加した１種類または複数種類の炭素含有基質に対してどのように応答するかが容易にわかる。不連続な照明および／または変化する照明と炭素含有基質の添加に対して好ましい応答をする株が、品質（脂質プロファイル中にカプリン酸がより豊富に存在する）と量（脂質が、カプリン酸をより多い割合で含む）の面で脂質の産生に関して一般に最高の収率を提供する。 To select strains, various strains of the genus Botriococcus, in particular Botriococcus brownie and Botriococcus sudetics, are cultivated in parallel on multiple microplates in the same vessel and the various cultures It is possible to monitor the conditions and changes of objects firmly. It is therefore easy to see how different strains respond to discontinuous and / or changing illumination and possibly to one or more carbon-containing substrates added to the medium. . Strains that respond favorably to discontinuous and / or changing illumination and the addition of carbon-containing substrates are quality (capillic acid is more abundant in the lipid profile) and quantity (lipid is capric acid In general, it provides the highest yields for lipid production in terms of (including in greater proportions).
微細藻類は、発酵装置の中で不均一な集団から選択することができる。その集団から、本発明の選択法により、特定の範囲の光強度と特定の周波数を持つ不連続な光および／または変化する光を混合栄養という培養条件と組み合わせて有利な変異体を選択する。この場合、培養は、培養物の中で微細藻類を多くの世代にわたって維持しながら実施し、次いで培養が終わったとき、培地の中で過半を占めるようになった成分を単離する。 Microalgae can be selected from a heterogeneous population in the fermentation apparatus. From the population, the selection method of the present invention selects advantageous mutants by combining discontinuous light having a specific range of light intensity and specific frequency and / or changing light with a culture condition of mixed nutrition. In this case, culturing is carried out while maintaining microalgae for many generations in the culture, and then the components that have become predominant in the medium are isolated when the culturing is complete.
本発明の培養方法により、脂質も産生させることができる。 Lipids can also be produced by the culture method of the present invention.
その場合、本発明の方法は、
ｄ）微細藻類から脂質を回収するステップと、必要に応じて
ｅ）回収した脂質からカプリン酸を抽出するステップ
をさらに含んでいる。
In that case, the method of the present invention comprises:
d) further comprising a step of recovering lipids from the microalgae and, if necessary, e) a step of extracting capric acid from the recovered lipids.
本発明の培養方法は、本発明の混合栄養条件において増殖できてカプリン酸の産生が可能なボツリオコッカス属のあらゆる種にも適用できる。 The culture method of the present invention can be applied to any species of the genus Botriococcus that can grow under the mixed nutrient conditions of the present invention and can produce capric acid.
本発明の培養方法により、培養で得られるバイオマスの産生を最適化することができる。この方法により、このようにして培養された微細藻類の脂肪酸（特にカプリン酸）を豊富にすることもできる。 By the culture method of the present invention, the production of biomass obtained by culture can be optimized. By this method, fatty acids (particularly capric acid) of the microalgae cultured in this way can be enriched.
したがって本発明は、上記の方法に従って培養または選択することが好ましい混合栄養性のボツリオコッカス属の微細藻類の培養を通じてバイオマスの産生と脂質（特に脂肪酸）の産生を最適化し、次いでこのようにして培養した微細藻類を回収してそこから脂質（特にカプリン酸）を抽出することも目的とする。ボツリオコッカス・ブラウニー種とボツリオコッカス・スデティクス種の株が特に関係する。 Accordingly, the present invention optimizes biomass production and lipid (especially fatty acid) production through the cultivation of mixed-nutrient Botriococcus microalgae, preferably cultured or selected according to the method described above, and in this way Another object is to collect the cultured microalgae and extract lipids (especially capric acid) therefrom. Botriococcus brownies and Botriococcus strains are particularly relevant.
脂質（その中にカプリン酸が含まれる）を選択的に抽出する方法は当業者に知られており、例えば［Ｂｌｉｇｈ， Ｅ．Ｇ．とＤｙｅｒ， Ｗ．Ｊ．（１９５９年）、「全脂質を抽出して精製する迅速な方法」、Ｃａｎ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．、第３７巻：９１１〜９１７ページ］に記載されている。 Methods for selectively extracting lipids (with capric acid contained therein) are known to those skilled in the art, for example [Blight, E., et al. G. And Dyer, W.M. J. et al. (1959), “Rapid methods for extracting and purifying total lipids”, Can. J. et al. Biochem. Physiol. 37: 911-917].
本発明は、上記の本発明の方法に従って得ることのできるボツリオコッカス・ブラウニー種とボツリオコッカス・スデティクス種の微細藻類にも関する。これら微細藻類はカプリン酸が豊富である。このような微細藻類の全脂質には、一般に、その微細藻類に含まれる全脂質の３０％超、または４５％超、または６０％超、または７５％超のカプリン酸が含まれている。 The present invention also relates to microalgae of Botriococcus brownie species and Botriococcus sudetics species obtainable according to the above-described method of the present invention. These microalgae are rich in capric acid. The total lipids of such microalgae generally contain more than 30%, or more than 45%, or more than 60%, or more than 75% capric acid of the total lipid contained in the microalgae.
古典的な混合栄養モードと独立栄養モードでのボツリオコッカス・ブラウニー株とボツリオコッカス・スデティクス株の培養 Cultivation of Botriococcus brownie and Botriococcus strains in classic mixed and autotrophic modes
情報ステーションによって監視する専用の自動制御装置を備えた有効体積が２リットルの発酵装置（バイオリアクター）の中でボツリオコッカス・ブラウニーを培養した。このシステムは、塩基（１Ｎの水酸化ナトリウム溶液）および／または酸（１Ｎの硫酸溶液）を添加してｐＨを調節する。培養温度は２２℃に維持する。ラッシュトンの配置（下方にポンピングする３枚刃のインペラ）に従ってシャフトに取り付けた３つの撹拌用ロータを利用して撹拌する。撹拌速度と換気量は、最小＝１００ｒｐｍ、最大＝２５０ｒｐｍ、Ｑ最小＝０．５ｖｖｍ、Ｑ最大＝２ｖｖｍにそれぞれ調節する。バイオリアクターには、透明な容器を取り囲む外部照射システムが取り付けられている。 Botulococcus brownies were cultured in a fermentation apparatus (bioreactor) with an effective volume of 2 liters equipped with a dedicated automatic controller monitored by an information station. The system adjusts the pH by adding base (1N sodium hydroxide solution) and / or acid (1N sulfuric acid solution). The culture temperature is maintained at 22 ° C. Stir using three agitator rotors attached to the shaft according to Rushton's arrangement (3-blade impeller pumping down). The stirring speed and the ventilation rate are adjusted to minimum = 100 rpm, maximum = 250 rpm, Q minimum = 0.5 vvm, and Q maximum = 2 vvm, respectively. The bioreactor is fitted with an external irradiation system surrounding a transparent container.
恒温容器（２２℃）内の撹拌台（１４０ｒｐｍ）の上で８０〜１００μＥの光を照射しながら事前培養物を反応装置に接種する。事前培養とバイオリアクター内での培養は、３ＮＢＢＭ＋Ｖ培地（ＣＣＡＰ − 藻類と原生生物の培養物コレクション）の中で実施する。 The preculture is inoculated into the reactor while irradiating light of 80 to 100 μE on a stirring table (140 rpm) in a thermostatic container (22 ° C.). Pre-culture and culture in the bioreactor are performed in 3NBBM + V medium (CCAP-algae and protist culture collection).
混合栄養条件の場合には、酢酸ナトリウム（１００〜１５０ｍＭ）の形態の有機炭素を培地に添加した。 For mixed nutrient conditions, organic carbon in the form of sodium acetate (100-150 mM) was added to the medium.
培養物のモニタ Culture monitor
乾燥質量を測定して全バイオマスの濃度をモニタする（ＧＦＣフィルタ（Ｗｈａｔｍａｎ社）で濾過し、次いで真空乾燥機の中で６５℃、−０．８バールにて少なくとも２４時間にわたって乾燥させた後、計量する）。 After measuring dry mass and monitoring the concentration of total biomass (filtered with GFC filter (Whatman) and then dried in a vacuum dryer at 65 ° C. and −0.8 bar for at least 24 hours, Weigh).
全脂質を定量するため、７×１０８細胞／ｍｌを抽出した。脂質の抽出法は当業者に知られており、例えばＢｌｉｇｈ， Ｅ．Ｇ．とＤｙｅｒ， Ｗ．Ｊ．（１９５９年）に記載されている。 For quantification of total lipids, 7 × 10 8 cells / ml were extracted. Lipid extraction methods are known to those skilled in the art, for example see Bligh, E .; G. And Dyer, W.M. J. et al. (1959).
脂肪酸の分析 Fatty acid analysis
当業者に知られている方法に従って脂質をエステル交換反応させた後、気相クロマトグラフィによって脂肪酸を分析する。 Fatty acids are analyzed by gas phase chromatography after transesterification of the lipids according to methods known to those skilled in the art.
結果を図１に示す。 The results are shown in FIG.
Claims (15)
ｃ）このようにして培養した微細藻類を回収するステップと、必要に応じて
ｄ）前記微細藻類から脂質を回収するステップと、必要に応じて
ｅ）回収した前記脂質からカプリン酸を抽出するステップ
をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。 b) continuing the culture for a plurality of generations in the presence of an organic carbon-containing substrate in the medium; as required; c) recovering the microalgae cultured in this way; and if necessary 13. The method according to claim 1, further comprising: d) recovering lipid from the microalgae, and e) extracting capric acid from the recovered lipid as necessary. The method described.
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