JP2015506366A - 免疫応答を調節する組成物及び方法 - Google Patents

Abstract

樹状細胞においてＭＨＣ Ｉエンドリソソーム交差提示を刺激するステップを含む、ＭＨＣ Ｉ媒介性免疫応答を刺激する組成物及び方法。ＭＨＣ Ｉエンドリソソーム交差提示の刺激は、樹状細胞におけるＣＤ７４の過剰発現及び／又は抗原のＭＨＣ Ｉエンドリソソーム交差提示経路への標的化を含む。抗原又はその断片と、ＣＤ７４エンドリソソーム標的化配列とを含む融合タンパク質も提供する。

Description

本発明は、免疫調節の分野、特にＭＨＣ Ｉ媒介性免疫応答を調節する組成物及び方法に関する。

一次免疫応答の間、樹状細胞は、適応免疫応答を開始する、主要な抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。樹状細胞は、死細胞及び抗原タンパク質を含有する細胞残屑を取込み、これらの外来抗原をＭＨＣ Ｉに提示するためにプロセシングする。このプロセシングは、ＭＨＣ Ｉ交差提示と称される。このプロセシングは、ウイルス、腫瘍、自己抗原及び同種移植片に対するＣＤ８^＋Ｔ細胞媒介性応答に必須である。

ＣＤ７４は、樹状細胞内で働き、哺乳動物の一次免疫応答を制御する、細胞機構の重要な要素である。樹状細胞は、外部の脅威を感知し、次に応答することを可能にする、特殊な経路を保有している。現在までに、主要組織適合クラスＩ（Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔａｂｉｌｉｔｙ Ｃｌａｓｓ Ｉ）（ＭＨＣ Ｉ）を、免疫系による病原体の基本的な提示及び認識をもたらす、外来の侵略者を見出し、「衝突」可能にする回路とつなぎ合わせることは誰もできなかった。

本発明の目的は、免疫応答を調節する組成物及び方法を提供することである。本発明の一態様に従って、樹状細胞においてＭＨＣ Ｉエンドリソソーム交差提示を刺激するステップを含む、ＭＨＣ Ｉ媒介性免疫応答を刺激する方法を提供する。ＭＨＣ Ｉエンドリソソーム交差提示を刺激するステップは、ＣＤ７４を樹状細胞において過剰発現させるステップ及び／又は抗原をＭＨＣ Ｉエンドリソソーム交差提示経路に標的化させるステップを含み得る。

本発明の別の態様に従って、抗原又はその断片と、ＣＤ７４のエンドリソソーム標的化配列とを含む融合タンパク質を提供する。核酸分子、ベクター及び融合タンパク質を発現する細胞も提供する。

本発明の別の態様に従って、ＣＤ７４依存性ＭＨＣ Ｉ交差提示経路のためのコンパートメントを提供する。このコンパートメントは、エンドリソソームであってよい。

本発明の別の態様に従って、一次免疫応答を刺激するための、カテプシン切断ペプチド及び前記ペプチドのコンカテマーを提供する。

Ｃｄ７４^−／−マウスが、弱い抗ウイルス一次免疫応答を生じる図である。 図１ａは、低力価のＶＳＶ（組織培養細胞単層又はマウスの５０％が感染する２×１０^５の用量）に感染６日後に単離し、その後５日間、ＶＳＶＮＰ（５２〜５９）を用いて刺激したＣｄ７４^＋／＋、Ｃｄ７４^−／−及びＴａｐ１^−／−マウスの脾臓におけるＶＳＶＮＰ（５２〜５９）特異的（Ｈ−２Ｋ^ｂ−ＶＳＶＮＰ）ＣＤ８^＋Ｔ細胞の発生を示す図である。象限の数値はそれぞれの場所の細胞百分率を示す。 図１ｂは、ａ（ｎ＝３マウス／遺伝子型）において得られた細胞中のＨ−２Ｋ^ｂ−ＶＳＶＮＰ（５２〜５９）特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の頻度を示す図である。 図１ｃは、ａにおけるようなＶＳＶ感染及びｉｎ ｖｉｔｒｏ追加免疫後に発生したＣＴＬの標準的^５１Ｃｒ放出アッセイを示す図である。^＊Ｐ＜０．０５（スチューデントｔ検定）。データは、少なくとも３回の個別の実験の代表である（平均±ｓ．ｄ．）。 Ｃｄ７４^−／−マウスの一次免疫応答誘発の欠損が、それらの抗原提示細胞に存在し、ＣＤ４^＋Ｔ細胞とは独立していることを示す図である。 図２ａは、ＶＳＶ（５０％の組織培養細胞単層又はマウスが感染する１×１０^５の用量）を注射され、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＶＳＶＮＰ（５２〜５９）を追加免疫されたキメラ（ｎ＝３）から得られた脾臓におけるＶＳＶＮＰ（５２〜５９）特異的ＣＤ８^＋細胞の発生を示す図である。 図２ｂは、ａにおけるようなｉｎ ｖｉｔｒｏの追加免疫後に発生したＣＴＬの細胞障害性アッセイを示す図である。表示がある場合は、標的細胞にＶＳＶＮＰ（５２〜５９）をパルスしてあり、又は非特異的殺傷の対照として未標識のままである。 図２ｃは、ａにおけるようなＶＳＶ感染及びｉｎ ｖｉｔｒｏの追加免疫に続く、抗ＣＤ４（＋Ａｂ）の静脈内注射により、ＣＤ４^＋細胞が枯渇したＣｄ７４^＋／＋→Ｃｄ７４^−／−及びＣｄ７４^−／−→Ｃｄ７４^＋／＋キメラ（ｎ＝３）の脾臓における、Ｈ−２Ｋ^ｂ−ＶＳＶＮＰ（５２〜５９）に特異的なＣＤ８^＋Ｔ細胞の発生を示す図である。 図２ｄは、ｃにおけるようなｉｎ ｖｉｔｒｏ追加免疫後に発生したＣＴＬの、ｂにおけるような細胞障害性アッセイを示す図である。^＊Ｐ＜０．０５（スチューデントｔ検定）。データは、３実験（ａ）、少なくとも３実験（ｂ）、２実験（ｃ）又は３実験（ｄ；平均及びｓ．ｄ．）の代表である。 Ｃｄ７４^−／−ＤＣが、細胞関連抗原をｉｎ ｖｉｖｏで交差提示して、抗原特異性ＣＤ８^＋Ｔ細胞をプライミングできないことを示す図である。 図３ａは、プロトコルを示す図である：ＯＶＡタンパク質又はＯＶＡ（２５７〜２６４）をパルスされたＣｄ７４^−／−又はＣｄ７４^＋／＋ＢＭＤＣを、精製ＣＦＳＥ標識ＣＤ８^＋ＯＴ−Ｉ Ｔ細胞と共にＢＡＬＢ／ｃバックグラウンドのＲａｇ１^−／−マウスに注射し（左）、３日後、Ｈ−２Ｋ^ｂ ＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖をアッセイした（枠で囲った領域、右）。 図３ｂは、ａにおけるレシピエントマウス（ｎ＝３）の脾臓由来のＯＴ−Ｉ Ｔ細胞の増殖（黒）及び非増殖（灰色）を示す図である。括弧付きの線の上の数字は、ＣＦＳＥ⁻（分裂）細胞のパーセントを示す。データは２実験の代表である。 交差提示及びクロスプライミングがＣｄ７４^−／−ＤＣにおいて欠損していることを示す図である。 図４ａは、ＯＶＡと一緒に３７℃（濃い灰色で影を付けた曲線）又は４℃（明るい灰色の線）においてインキュベーション後に、ＢＭＤＣによるＯＶＡ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８の取込みを、フローサイトメトリーにより評価した図である。 図４ｂは、可溶性ＯＶＡと一緒に（＋ＯＶＡ）、又は可溶性ＯＶＡなしでインキュベーションした（−ＯＶＡ）脾臓ＤＣにおけるＨ−２Ｋ^ｂ−ＯＶＡ（２５７〜２６４）複合体の形成（上）及び総Ｈ−２Ｋ^ｂ（影を付けた曲線）、それより下位のバックグラウンド（灰色の線、下）を、フローサイトメトリーにより測定した図である。 図４ｃは、培地単独（−ＯＶＡ）、ＯＶＡ単独（＋ＯＶＡ）又はＯＶＡ及びインターフェロン−γ（ＯＶＡ＋ＩＦＮ−γ）と一緒にインキュベートしたＢＭＤＣにおける、フローサイトメトリーにより評価したＣＤ８０及びＣＤ４０の発現を示す図である。 図４ｄは、さまざまな濃度の可用性ＯＶＡ（水平軸）と一緒に、細胞シグナル伝達分子であるＧＭ−ＣＳＦ単独（上）又はＧＭ−ＣＳＦ＋ＴＮＦ（中央）又はインターフェロン−γ（下）の存在下でインキュベートした脾臓由来ＤＣによるＢ３ＺＴ細胞の活性化を、化学発光アッセイにより測定した示す図である。 図４ｅは、ＯＶＡと一緒に、ＴＮＦを伴い（下）又は伴わずに（上）インキュベートし、その後、Ｈ−２Ｋ^ｂ−ＯＶＡ（２５７〜２６４）に対する抗体（赤）及び抗ＬＡＭＰ−１（緑）を用いて同時染色し、光学的に統合した画像として提示した、成熟した脾臓由来ＤＣのＩＣＭを示す図である。スケールバー、５μｍ。 図４ｆは、ＴＮＦの存在下のＨ−２Ｋ^ｂ−ＯＶＡ（２５７〜２６４）とＬＡＭＰ−１^＋後期エンドソームとの共局在化定量分析（上）並びにＴＮＦ処理を行った、及び行わなかったＣｄ７４^＋／＋、Ｃｄ７４^−／−及びＴａｐ１^−／−ＤＣ（＞２０／系統）の、標準化された総画素数に対する個別画素数として提示した蛍光発光（下）を示す図である。^＊Ｐ＜０．０５（スチューデントｔ検定）。データは、２実験（ａ〜ｆ）（エラーバー（ｆ）、ｓ．ｄ．）の代表である又は同様の結果を有する３回の個別の実験の１実験代表（ｄ；三連の試料の平均±ｓ．ｄ．）からである。 クロロキンを用いた処理による、ＤＣにおけるＭＨＣクラスＩのＣＤ７４媒介性輸送の阻害を示す図である。 図５ａは、未処理のまま（−ＣＱ）又はクロロキンを用いて処理した（＋ＣＱ）ＢＭＤＣ、並びに培地単独（青）又は可溶性ＯＶＡ（赤、上）又はＯＶＡペプチド（赤、下）と一緒にインキュベートしたＢＭＤＣにおけるＨ−２Ｋ^ｂ−ＯＶＡ（２５７〜２６４）複合体の形成を、フローサイトメトリーにより測定した図である。 図５ｂは、未処理のまま又はクロロキンを用いて処理されたＢＭＤＣにおける総Ｈ−２Ｋ^ｂ（緑）を示す図である（青、バックグラウンド）。 図５ｃは、ａのように処理されたＢＭＤＣにおける表面Ｈ−２Ｋ^ｂ−ＯＶＡ（２５７〜２６４）複合体を、標準化された平均蛍光強度（ＭＦＩ）として提示した図であり、１００％は、未処理ＢＭＤＣにおいて見出されたＨ−２Ｋ^ｂ−ＯＶＡ（２５７〜２６４）複合体の量である。 図５ｄは、未処理のまま又はクロロキンを用いて処理され、その後、抗Ｈ−２Ｋ^ｂ（赤）及び抗ＣＤ７４（緑）を用いて同時染色した成熟ＢＭＤＣのＩＣＭを、光学的に統合した画像として提示した図である。スケールバー、５μｍ。 図５ｅは、ｄにおけるＨ−２Ｋ^ｂとＣＤ７４との共局在化の定量化を、総画素数に対する標準化された画素数として提示した図である。 図５ｆは、完全長（＋ＦＬ）ＣＤ７４又はエンドリソソーム輸送モチーフを欠いた（＋ Δ２−１７）切断型ＣＤ７４を用いて再構成されたＣｄ７４^−／−ＢＭＤＣにより誘導され、可溶性ＯＶＡタンパク質又はＯＶＡ（２５７〜２６４）と一緒にインキュベートされたＣＦＳＥ−標識ＯＴ−Ｉ細胞の増殖を示す図である。枠で囲まれた領域の数値は、１００％に設定されたＣｄ７４^＋／＋対照（一番左）に対するＯＴ−Ｉ細胞（ＣＤ８^＋ＣＦＳＥ⁻）の増殖パーセントを示す。データは、２実験の代表である（エラーバー（ｃ，ｅ）、ｓ．ｄ．）。 ＣＤ７４が、ＤＣにおいて、ＥＲからエンドリソソームへのＭＨＣクラスＩの輸送を調節することを示す図である。 図６ａは、抗Ｈ−２Ｋ^ｂ（緑）＋抗ＣＤ７４（赤、上）又は抗ＬＡＭＰ−１（赤、下）を用いて染色された成熟脾臓ＤＣのＩＣＭを示す図である。スケールバー、５μｍ。 図６ｂは、ＬＡＭＰ−１^＋コンパートメント（５０ＤＣ／マウス系統）におけるＭＨＣクラスＩの定量化を、個別画素数／総画素数として提示した図である。 図６ｃは、抗Ｉ−Ａ−Ｉ−Ｅ（Ｉ−Ａ^ｂ；左レーン）、抗ＣＤ７４（中央レーン）又は抗Ｈ−２Ｋ^ｂ（右レーン）を用いた、［^３５Ｓ］メチオニン標識Ｃｄ７４^＋／＋、Ｃｄ７４^−／−、Ｔａｐ１^−／−及びβ_２−ミクログロブリン−欠損（Ｂ２ｍ^−／−）ＢＭＤＣの免疫沈降（ＩＰ）を示す図である。矢印は、４１−ｋＤａ（上）及び３１−ｋＤａ（下）のＣＤ７４のバンドを示す。 図６ｄは、抗Ｉ−Ａ^ｂ、抗Ｈ−２Ｋ^ｂ（立体配座依存性）、Ｈ−２Ｋ^ｂ細胞質ドメインに対する抗体（ｅ−ＶＩＩＩ；立体配座独立性）又はトランスフェリン受容体（ＴＦＲ）に対する抗体を用いた、Ｃｄ７４^＋／＋ＤＣの溶解物由来タンパク質の免疫沈降、続く抗ＣＤ７４を用いた免疫ブロット分析を示す図である。一番右（ＷＣＬ）は、全細胞溶解物（対照）の免疫ブロット分析である。 図６ｅは、抗ＣＤ７４を用いたＤＣの溶解物由来タンパク質の免疫沈降、続く未消化（−）又はＥｎｄｏ Ｈ（＋）による消化並びに抗ＭＨＣクラスＩを用いた免疫ブロット分析を示す図である。 図６ｆは、抗ＭＨＣクラスＩを用いた、未処理のまま、又はクロロキン若しくはＥｎｄｏ Ｈを用いて処理された細胞の溶解物由来タンパク質の免疫沈降、続く、抗ＣＤ７４を用いた免疫ブロット分析を示す図である。バンド強度を、Ｏｄｙｓｓｅｙソフトウェアを使用して定量化した。レーンの下の数値は、ＣＱ未処理試料に対して標準化されたバンド強度を示す。 図６ｇは、抗Ｈ−２Ｋ^ｂで標識されたＤＣ中のＭＨＣクラスＩの内部移行をフローサイトメトリーにより継時的に評価し、４℃においてインキュベートした対照ＤＣと比較した、３７℃においてインキュベートしたＤＣの平均蛍光強度を増加パーセントとして提示した図である。^＊Ｐ＜０．０５（スチューデントｔ検定）。データは、２実験（ａ）、２実験（ｂ；平均±ｓ．ｄ．）、５実験（ｃ）、３実験（ｄ）、３実験（ｅ）、２実験（ｅ）又は２実験（ｆ；エラーバー、ｓ．ｄ．）の代表である。 キメラマウスの末梢分析（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ）を示す図である。 ＣＤ７４^−／−マウスが、細胞関連抗原をｉｎ ｖｉｖｏで交差提示し、有効な一次免疫応答を発生することができないことを示す図である。 ＣＤ７４^−／−ＤＣが脾臓に局在化することを示す図である。

本発明は、ＭＨＣ Ｉ受容体を、免疫細胞内で侵入病原体を含有するコンパートメントに連結する、ＣＤ７４によるガイド役の発見に基づく。この洗練された回路は、免疫細胞が体内の病原体の存在を認識し、シグナル伝達を可能にし、特殊化Ｔ免疫ファイター細胞に警告を与え、この細胞は分裂すること、及び感染細胞を攻撃することによって応答し、それによって病原体を破壊する。特に、本発明は、ＣＤ７４が、外来性ペプチドを負荷するために、樹状細胞の小胞体からエンドリソソームコンパートメントへのＭＨＣ Ｉの輸送を媒介し、したがって、ＣＤ７４が、ＭＨＣ Ｉ媒介性ＣＴＬ応答をプライミングするためのエンドリソソームの樹状細胞交差提示において重要な機能を有するという発見に基づく。したがって、本発明は、ＭＨＣ Ｉ媒介性免疫応答を調節する方法を提供する。

ある実施形態において、ＣＤ７４依存性ＭＨＣ Ｉエンドリソソーム樹状細胞交差提示を調節する化合物及び方法を提供する。ある実施形態において、免疫応答、例えばＭＨＣ Ｉ媒介性ＣＴＬ応答を、ＣＤ７４依存性ＭＨＣ Ｉ樹状細胞交差提示を強化することによって刺激する方法を提供する。ＣＤ７４依存性ＭＨＣ Ｉ交差提示経路は、例えば、樹状細胞におけるＣＤ７４の発現を増加させることによって強化可能である。したがって、ある実施形態において、ＣＤ７４の発現を強化する化合物及び方法を提供する。

発現ベクターは、細胞において本発明のＣＤ７４タンパク質を発現させるために使用可能である。発現ベクターの構築に使用できる適切な発現ベクターは、当業者には明らかであると思われる。このようなベクターが、個体に直接投与可能であることもまた、当業者には明らかであろう。又は、個体由来の細胞が、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を用いて、ｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子操作可能であり、遺伝子操作された細胞は、その後、個体に提供される。このような方法は当分野において周知である。

さらに、ネズミＣＤ７４のアミノ酸配列は当分野において知られており（例えば、ＮＣＢＩ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ受託番号Ｐ０４４４１．３を参照されたい）、以下に記載する。
１ ｍｄｄｑｒｄｌｉｓｎ ｈｅｑｌｐｉｌｇｎｒ ｐｒｅｐｅｒｃｓｒｇ ａｌｙｔｇｖｓｖｌｖ ａｌｌｌａｇｑａｔｔ ａｙｆｌｙｑｑｑｇｒ
６１ ｌｄｋｌｔｉｔｓｑｎ ｌｑｌｅｓｌｒｍｋｌ ｐｋｓａｋｐｖｓｑｍ ｒｍａｔｐｌｌｍｒｐ ｍｓｍｄｎｍｌｌｇｐ ｖｋｎｖｔｋｙｇｎｍ
１２１ ｔｑｄｈｖｍｈｌｌｔ ｒｓｇｐｌｅｙｐｑｌ ｋｇｔｆｐｅｎｌｋｈ ｌｋｎｓｍｄｇｖｎｗ ｋｉｆｅｓｗｍｋｑｗ ｌｌｆｅｍｓｋｎｓｌ
１８１ ｅｅｋｋｐｔｅａｐｐ ｋｖｌｔｋｃｑｅｅｖ ｓｈｉｐａｖｙｐｇａ ｆｒｐｋｃｄｅｎｇｎ ｙｌｐｌｑｃｈｇｓｔ ｇｙｃｗｃｖｆｐｎｇ
２４１ ｔｅｖｐｈｔｋｓｒｇ ｒｈｎｃｓｅｐｌｄｍ ｅｄｌｓｓｇｌｇｖｔ ｒｑｅｌｇｑｖｔｌ
ヒトＣＤ７４のさまざまなアイソフォームのアミノ酸配列もまた、当分野において知られている（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＨ１８７２６．１；ＡＡＨ２４２７２．１；ＥＡＷ６１７２９．１；ＥＡＷ６１７３０．１及びＥＡＷ６１７３１．１を参照されたい）。

したがって、本発明のある実施形態において、ＣＤ７４を発現するポリヌクレオチド及び発現ベクター並びにこのようなポリヌクレオチド及び発現ベクターを利用して、ＣＤ７４又はこれらの活性断片の発現させる方法を提供する。ある実施形態において、本発明のポリヌクレオチド及び発現ベクターは、限定するものではないが、樹状細胞を含む細胞を、ｉｎ ｖｉｖｏで遺伝的に操作するために使用される。ある他の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド及び発現ベクターは、限定するものではないが、樹状細胞を含む細胞を、ｅｘ ｖｉｖｏで遺伝的に操作するために使用され、これらの遺伝子操作された細胞を、その後、個体に投与できる。したがって、ある実施形態において、ＣＤ７４を過剰発現するように遺伝子操作された樹状細胞を提供する。ポリヌクレオチド、発現ベクター及び細胞は、医薬組成物として、医薬として許容される希釈剤及び担体と共に投与することができる。

上記のように、エンドリソソームが、樹状細胞における交差提示のための主要なコンパートメントであることを示唆する証拠が存在する。本発明のある実施形態において、樹状細胞のエンドリソソームを提供する。ある実施形態において、樹状細胞のエンドリソソームコンパートメントにおいて発生する、ＭＨＣ Ｉに提示するためのペプチドを提供する。これらのペプチドは、樹状細胞のエンドリソソームを特異的に標的としている、抗原及びこれらの断片からプロセシングされたペプチドであってよい。

抗原及びこれらの断片の樹状細胞のエンドリソソームコンパートメントへの標的化は、ＭＨＣ Ｉの抗原プライミングを強化することができる。したがって、本発明のある実施形態において、樹状細胞のエンドリソソームに対する、抗原及びこれらの断片を含む分子を標的とする化合物及び方法を提供する。例えば、ＣＤ７４のエンドソームの標的化シグナルは、抗原又はこれらの断片を、樹状細胞中のＭＨＣ Ｉ抗原プロセシング経路に届けるために使用することができる。本発明のある実施形態において、対象となる抗原又はこれらの断片を含む融合タンパク質及びＣＤ７４エンドソーム標的化シグナルを提供する。ある実施形態において、標的化シグナルは、ＮＣＢＩ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ受託番号Ｐ０４４４１ （配列：ｄｄｑｒｄｌｉｓｎ ｈｅｑｌｐｉｌ）に記載の配列のアミノ酸２から１７を含む。

本発明の融合タンパク質を発現する、ポリヌクレオチド、発現ベクター及び細胞（樹状細胞を含む）もまた提供する。上記のように、適切な発現ベクターは、当業者には明らかであると思われる。融合タンパク質を発現するポリヌクレオチド及び発現ベクターは、限定するものではないが樹状細胞を含む細胞を、ｉｎ ｖｉｖｏで遺伝子操作するために使用でき、又は限定するものではないが樹状細胞を含む細胞を、ｅｘ ｖｉｖｏで遺伝的に操作するために使用でき、その後、これらの遺伝子操作された細胞を、患者に投与することができる。融合タンパク質、ポリヌクレオチド、発現ベクター及び細胞は、医薬組成物として、医薬として許容される希釈剤又は担体と共に投与することができる。

ＭＨＣ Ｉ交差提示の強化は、免疫応答の強化をもたらし得る。特に、ＣＤ７４依存性ＭＨＣ Ｉエンドリソソーム樹状細胞交差提示の強化は、ＭＨＣ Ｉ媒介性ＣＴＬ応答の刺激をもたらし得る。したがって、本発明のある実施形態において、ＭＨＣ Ｉ媒介性ＣＴＬ応答を、ＭＨＣ Ｉ エンドリソソーム交差提示を強化するステップによって刺激する方法を提供する。上記のように、ＭＨＣ Ｉ交差提示の強化は、ＣＤ７４の過剰発現及び／又は抗原又はこれらの断片の、樹状細胞中のＭＨＣ Ｉ抗原プロセシング経路への標的化を介するものであってよい。これらの方法は、他の免疫刺激方法、例えば、限定するものではないがサイトカインを含む免疫刺激性化合物の投与と組み合わせて、免疫応答をさらに刺激することができる。本発明の化合物及び方法への使用に適切な他の免疫刺激方法及び化合物は、当業者には明らかであると思われる。

当業者は、ＣＴＬ応答の刺激が、多数の疾患及び／又は病態の予防及び／又は治療に有用であり得ることを、容易に認識すると思われる。例えば、ＣＴＬ応答の刺激は、限定するものではないが、細菌、プラスモディウム属（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）及びウイルスを含む細胞内病原体により引き起こされる疾患の予防及び／又は治療、及び／又は癌の治療に有用であり得る。したがって、本発明のある実施形態において、ＭＨＣ Ｉ交差提示経路を刺激するステップによる、細胞内病原体により引き起こされる疾患の予防及び／又は治療の方法を提供する。他の実施形態において、ＭＨＣ Ｉ交差提示経路を刺激するステップによる、癌を治療する方法を提供する。

ある実施形態において、限定するものではないがＨＩＶ感染症を含むウイルス感染症の予防及び／又は治療の方法を提供する。ある実施形態において、細菌感染症、例えば、限定するものではないが、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）感染症を含むマイコバクテリア感染症の予防及び／又は治療の方法を提供する。ある実施形態において、限定するものではないが、マラリアの予防及び／又は治療を含む、プラスモディウム属感染症の予防及び／又は治療の方法を提供する。

ＭＨＣ Ｉ抗原のプライミングを強化する化合物及び方法は、ワクチンの免疫原性及び有効性の改善に有用であり得る。したがって、本発明の化合物はアジュバント及び／又はワクチンとして使用可能である。例えば、ＣＤ７４を発現するポリヌクレオチド、発現ベクター及び／又は樹状細胞は、免疫応答を刺激するために使用可能である。加えて、ＭＨＣ Ｉ交差提示経路を標的とする融合タンパク質（並びに融合タンパク質を発現するポリヌクレオチド及び／又は発現ベクター）は、ワクチンに使用可能である。したがって、ある実施形態において、ＭＨＣ Ｉ交差提示経路を標的とするワクチンを提供する。

ある実施形態において、ワクチンにおいて一次免疫応答を刺激するための、カテプシン切断ペプチド及びこれらのペプチドのコンカテマーを提供する。ある実施形態において、カテプシンはＣａｔｈｅｐｓｉｎ Ｓである。

ある実施形態において、ワクチンの性能を改善する化合物及び方法を提供する。ある実施形態において、癌ワクチンの性能を改善する化合物及び方法を提供する。ある実施形態において、限定するものではないが、ＨＩＶを含むウイルスに対するワクチンの性能を改善する化合物及び方法を提供する。ある実施形態において、細菌、例えば、限定するものではないが、結核菌を含むマイコバクテリア属に対するワクチンの性能を改善する化合物及び方法を提供する。ある実施形態において、限定するものではないが、熱帯夏マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）を含むプラスモディウム属に対するワクチンの性能を改善する化合物及び方法を提供する。

ＣＤ７４の役割に対する理解はさらに、将来的に個別化された医療選択肢に影響を与え得る、個体間の免疫応答の差を説明し始めることができる。したがって、ある実施形態において、個体のＣＤ７４依存性ＭＨＣ Ｉ交差提示経路に基づく、個別化されたワクチンの取り組みを開発する方法を提供する。

ＭＨＣ Ｉ交差提示の阻害は、免疫応答の阻害をもたらし得る。例えば、ＣＤ７４の発現の欠損は、ＭＨＣ Ｉ交差提示の低下をもたらすことができ、順にＭＨＣ Ｉ媒介性ＣＴＬ応答を含むＭＨＣ Ｉ媒介性免疫応答を低下させることができる。したがって、本発明のある実施形態において、ＭＨＣ Ｉ交差提示を阻害し、それによって、樹状細胞におけるＣＤ７４の発現及び／又は活性を阻害するステップによる、ＭＨＣ Ｉ媒介性免疫応答を阻害する方法を提供する。このような方法は、自己免疫疾患の治療及び／又は移植片拒絶反応の予防／阻害に有用であり得る。ＣＤ７４の発現及び／又は活性を阻害する化合物としては、例えば、アンチセンス化合物及び／又は中和抗体が挙げられる。

ＭＨＣＩ シグナル伝達は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の先天的炎症反応をもたらし得ることが示唆されている。特に、構成的に発現された膜ＭＨＣ Ｉが、ＴＬＲ誘発性先天的炎症反応を減弱させることが見出された（Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１３：５５１−５５９）。したがって、本発明のある実施形態において、ＭＨＣＩ シグナル伝達を緩和することにより、先天的免疫応答を緩和する方法を提供する。

免疫応答に対する本発明の化合物の効果は、ｉｎ ｖｉｖｏで動物モデルにおいて試験することができる。例えば、免疫応答は、抗原提示細胞及びＴ細胞を、ＲＡＧ−／−免疫欠損マウスにおいて再構成することにより、ｉｎ ｖｉｖｏで評価可能である。したがって、本発明のある実施形態において、マウスを樹状細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞により再構成するステップ、及びマウスにおいて免疫応答を分析するステップを含む、ＲＡＧ−／−免疫欠損マウスにおいて免疫モジュレーター及び／又はアジュバントをスクリーニングする方法を提供する。免疫モジュレーターの候補は、再構成後、マウスに直接投与可能である、並びに／或いはＲＡＧ−／−マウス内に注射する前に、樹状細胞及び／又はＴ細胞に直接投与可能である。

ＣＤ７４欠損のマウス及び／又は樹状細胞はまた、ＭＨＣ Ｉ交差提示経路を標的とするワクチンの開発に使用可能である。例えば、このようなマウス及び細胞は、ＭＨＣ Ｉにより交差提示されるペプチドの同定に有用であり得、したがって、一次免疫応答の刺激に有用であり得る。本明細書に記載の本発明をさらに理解するために、以下に実施例を記載する。これらの実施例が、本発明の例示的な実施形態の記載を意図するものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではないことが理解されるだろう。

ＣＤ７４依存性ＭＨＣクラスＩエンドリソソーム交差提示経路。
免疫応答は、外来性抗原を交差提示する樹状細胞（ＤＣ）により開始され、プライミングされる。シャペロンＣＤ７４（インバリアント鎖）は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩとの関連で、ＤＣのプライミングを排他的に促進すると考えられる。しかし、本明細書において、ＤＣ中のＣＤ７４依存性ＭＨＣクラスＩ交差提示経路が、ウイルスタンパク質抗原及び細胞関連抗原に対する、ＭＨＣクラスＩ拘束性の、細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答の発生において主要な役割を有しことを実証する。ＣＤ７４は、ＤＣの小胞体においてＭＨＣクラスＩと会合し、外来性ペプチドを負荷するために、エンドリソソームコンパートメントへＭＨＣクラスＩの輸送を媒介する。ＣＤ７４が、ＭＨＣクラスＩ媒介性ＣＴＬ応答をプライミングするためのエンドリソソームＤＣ交差提示において、今まで発見されていなかった生理学的機能を有することが結論付けられる。

一次免疫応答の間に、樹状細胞（ＤＣ）は、主に交差提示及びＴ細胞のクロスプライミングを介して適応免疫応答を開始する、主要な抗原提示細胞である。これは、細胞外抗原の取込み、細胞関連抗原断片の消化及び主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ分子両方に関するタンパク質分解ペプチド産物の提示を伴う^１。ＭＨＣクラスＩに関して、どのようにこの過程が起こるかを説明可能な２つの中心的経路：ｉｎ ｖｉｔｒｏで機能することが説得力を持って示されるサイトゾル経路^２〜５及び特定の抗原に対してｉｎ ｖｉｖｏで主要な役割を有することが示される液胞経路がこれまで記載されている^６〜８。交差提示の「ｐｈａｇｏ−ＥＲ」（小胞体媒介性食作用）モデルは、交差提示の優勢な経路と考えられた^９。その後のデータによって、その結論が議論された^１０。この論争に寄与した１つの要因は、多くの場合、排他的ではなく、動的な細胞小器官の生合成及び分配の間に単に濃縮される細胞内タンパク質を、特定の細胞小器官に限定的なマーカーとして指定した、データの過剰解釈であると思われる。さらに、外来性抗原の異なる形態の研究から、及び長期ＤＣ細胞系の研究と新たに単離されたＤＣとの研究を対比することにおいて、対照的な結論が推論できる。

液胞経路において、ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｓは、ペプチド受容性ＭＨＣクラスＩ分子に負荷される抗原ペプチドを発生するプロテアーゼとして同定されている^１１。さらに、細胞内膜の融合の間のドナーとアクセプターとの係留及びドッキングを調節する膜及びサイトゾルのＳＮＡＲＥタンパク質もまた、交差提示事象において基本的な役割を有すると思われる^１２。しかし、クロスプライミングコンパートメントにおけるＭＨＣクラスＩの供給源、その輸送の機序及びペプチド負荷の部位は、依然として活発な研究領域である^８，１３。

リサイクリングＭＨＣクラスＩのエンドソーム内への自発的な内部移行が実証されている^{１４，１５}。公表された結果は、ＭＨＣクラスＩの、細胞膜からエンドリソソーム負荷コンパートメントへのリサイクリングが、ＭＨＣクラスＩの細胞質尾部において見出されるチロシン内部移行シグナルの認識によって容易にされるモデルを裏付ける^８，１３。したがって、細胞膜からリサイクルされるＭＨＣクラスＩ分子は、交差提示への参加を定められた、外来性抗原を負荷するためのＭＨＣクラスＩの一供給源である^８，１３。同様に、ＭＨＣクラスＩの、小胞体（ＥＲ）からエンドサイトーシスコンパートメントへの運搬もまた提唱されている。これは、ファゴソームとＥＲとの融合を伴う機序により起こり得る^９。代替の、補足的な仮説候補は、ＥＲにおいてＭＨＣクラスＩＩと関連があり、それによってペプチドの早期結合を防止し、ＣＤ７４細胞質尾部に存在する局在化シグナルにより、エンドサイトーシス経路への輸送を媒介すること^１，１６が公知であるシャペロンＣＤ７４（インバリアント鎖）が、ＭＨＣクラスＩと結合し、一部のＭＨＣクラスＩを液胞エンドサイトーシスコンパートメントへ送達し、交差提示において機能できることである^{１７，１８}。この機序は、ペプチド受容性ＭＨＣクラスＩを、外来性抗原及びＭＨＣクラスＩＩ分子と同じコンパートメント（又は類似のコンパートメント）であるＭＩＩＣコンパートメントに同時に配置し^１９、抗原ペプチドのＭＨＣクラスＩ分子への負荷及び結合を容易にする。ＣＤ７４がＭＨＣクラスＩの外来性提示のサイトゾルルートに関与するとは考えにくいので、この経路は、ＭＨＣクラスＩの液胞経路への運搬と連結していると思われる^{２０、２１}。

ＭＨＣクラスＩとＣＤ７４との相互作用及びそれらの同じコンパートメント中の同時局在化が、ヒト細胞系において実証されている^{１７〜１９}。長年の例に基づき、ＭＨＣクラスＩ−ＣＤ７４相互作用が、おそらく、ＭＨＣクラスＩのエンドソームへの運搬の運命を生理学的条件下で調節しない^２２ことが結論付けられたが、他の対照的な研究は、ＣＤ７４を発現するようにトランスフェクトされた細胞が、多様な対立遺伝子によりコードされたＭＨＣクラスＩを、より多く表面に発現することを実証しており、このことは、ＭＨＣクラスＩ−ＣＤ７４相互作用が機能的重要性を有し得ることを示唆している^２３。ＭＨＣクラスＩとＣＤ７４とのｉｎ ｖｉｖｏの相互作用の免疫学的妥当性を以下において調査し、外来性抗原の交差提示におけるＣＤ７４の明確で重要な役割及びその後のＤＣによるクロスプライミングを記載する。

結果
ＣＤ７４は、一次抗ウイルス応答を必要とする。
ＤＣは、直接感染させることができ、したがって、ＭＨＣクラスＩによる古典的提示を使用し、ナイーブなＣＤ８^＋Ｔ細胞を活性化できる。しかし、低力価でウイルスに感染する際、ＤＣの直接感染は考えにくく、ＤＣの交差提示は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答の発生に関与する優勢な経路である^８，２４。一次抗ウイルス免疫応答を発生させる交差提示におけるＣＤ７４の役割に対処するために、野生型（Ｃｄ７４^＋／＋）マウス及びＣＤ７４欠損（Ｃｄ７４^−／−）マウスを、低用量の水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）に感染させた。本発明者らは、同様に、運搬体ＴＡＰが欠損したマウス（Τａｐ１^−／−マウス）を感染させ、このマウスは、ＭＨＣクラスＩの構築及び細胞内運搬が損なわれ、したがって、陰性対照として、不適切な胸腺選択が原因でＣＤ８^＋Ｔ細胞を欠いている^２５（図１及び図７ａ）。この感染において、ＶＳＶに対するＣＤ８^＋Ｔ細胞の一次応答及びメモリー応答が、ＣＤ４^＋Ｔ細胞の不在下で発生し得る^{２６，２７}。このようにして、交差提示におけるＣＤ７４の役割を、ＣＤ４^＋Ｔ細胞応答におけるその役割とは関係なく評価可能である。ＶＳＶ感染後にＭＨＣクラスＩに提示される免疫優勢エピトープであるＶＳＶ核タンパク質のアミノ酸５２〜５９（ＶＳＶＮＰ（５２〜５９））（Ｈ−２Ｋ^ｂ）に対する応答において発生するＣＤ８^＋Ｔ細胞の頻度を評価した。Ｃｄ７４^−／−マウスは、抗原特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞を発生する能力がＣｄ７４^＋／＋マウスより有意に低い（５．０％対１９．０％；図１ａ、ｂ）。これによって、細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の殺傷能力が低い免疫応答がもたらされた（図１ｃ）。

骨髄キメラを構築し、ＶＳＶ感染モデルにおいてクロスプライミングにおけるヘルパーＴ細胞に関する役割の可能性をさらに排除した^{２６，２７}。さらに、キメラを使用して、免疫応答の発生の欠損が、造血細胞由来ＤＣの、抗原を交差提示し、Ｔ細胞をプライミングする能力に依存するかどうかを確認した。Ｃｄ７４^＋／＋骨髄（Ｃｄ７４^＋／＋→Ｃｄ７４^＋／＋）又はＣｄ７４^−／−骨髄（Ｃｄ７４^−／−→Ｃｄ７４^＋／＋）を有するこのＣｄ７４^＋／＋マウス及び再構成されたＣｄ７４^−／−マウスを、Ｃｄ７４^＋／＋骨髄（Ｃｄ７４^＋／＋→Ｃｄ７４^−／−）又はＣｄ７４^−／−骨髄（Ｃｄ７４^−／−→Ｃｄ７４^−／−）により再構成した。正常な量のＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＣＤ４^＋Ｔ細胞が、Ｃｄ７４^＋／＋→Ｃｄ７４^＋／＋及びＣｄ７４^−／−→Ｃｄ７４^＋／＋マウスの末梢において見出された。しかし、少数のＣＤ４^＋Ｔ細胞及びいくらか多いＣＤ８^＋Ｔ細胞が、Ｃｄ７４^−／−→Ｃｄ７４^−／−及びＣｄ７４^＋／＋→Ｃｄ７４^−／−マウスにおいて見出された（図７ｂ、ｃ）。これは、Ｃｄ７４^−／−胸腺上皮においてＭＨＣクラスＩＩがあまり豊富でないため、レシピエントＣｄ７４^−／−マウスにおいて正の選択が損なわれたことを示していた。

抗ウイルス応答を検査するために、キメラマウスを、低力価のＶＳＶに感染させ、ＶＳＶＮＰ（５２〜５９）特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の発生を、四量体分析及びＣＴＬキリングアッセイ（ｋｉｌｌｉｎｇ ａｓｓａｙ）により評価した（図２）。ＣＤ４^＋Ｔ細胞数が少ないＣｄ７４^＋／＋→Ｃｄ７４^−／−マウスは、ＶＳＶＮＰ（５２〜５９）特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞を、野生型Ｃｄ７４^＋／＋→Ｃｄ７４^＋／＋キメラと同様に産生でき（１．１％対１．２％；図２ａ）、同様の殺傷能力を有する免疫応答をもたらした（１６．８％対１．９％；図２ｂ）。しかし、Ｃｄ７４^−／−→Ｃｄ７４^＋／＋マウスは、正常なＣＤ４^＋Ｔ細胞を有するにもかかわらず、ＶＳＶＮＰ（５２〜５９）特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の発生が大いに損なわれ（０．２％；図２ａ）、より低いＣＴＬの殺傷応答をもたらした（１８．０％対４．５％；図２ｂ）。このことは、ＶＳＶ特異的ＣＴＬ応答の発生が、ＣＤ４^＋Ｔ細胞の数とは独立していたことを示唆した。明白にＣＤ７４を発現する骨髄由来抗原提示細胞が要求され、Ｃｄ７４^−／−マウスに、Ｃｄ７４^＋／＋マウスの抗ウイルス免疫応答と同様の、強固な抗ウイルス免疫応答を生じさせた。

ＣＤ４^＋細胞の枯渇は、抗ＶＳＶ応答に影響を与えない。
次に、Ｃｄ７４^−／−マウスにおける正の選択の機能障害からもたらされる、Ｃｄ７４^＋／＋→Ｃｄ７４^−／−キメラ中の残存ＣＤ４^＋Ｔ細胞が、それらの抗ウイルス免疫応答の効率に寄与する可能性を除外した。感染の過程の間、Ｃｄ７４^＋／＋→Ｃｄ７４^−／−キメラを、ＣＤ４に対するＧＫ１．５抗体（抗ＣＤ４）をそれらに注射することによって、ＣＤ４^＋細胞を枯渇させた。ＣＤ４^＋細胞は、バックグラウンドに対してほぼ完全に検出不可能であるが、ＣＤ４^＋細胞が枯渇したＣｄ７４^＋／＋→Ｃｄ７４^−／−キメラは、ＶＳＶＮＰ（５２〜５９）に特異的なＣＤ８^＋Ｔ細胞を、Ｃｄ７４^−／−→Ｃｄ７４^＋／＋キメラより有意に多く産生し（１３．５％対４．１％；図２ｃ）、より溶解作用の高い免疫応答をもたらした（１４．０％対４．９％；図２ｄ）。これらのデータをまとめると、Ｃｄ７４^＋／＋→Ｃｄ７４^−／−キメラが、Ｃｄ７４^−／−→Ｃｄ７４^＋／＋キメラよりも、より強力な抗ＶＳＶ応答を備えていたことが確認された。これは、ＣＤ４^＋Ｔ細胞とは独立しているが、その代わりに、抗ウイルスＣＤ８^＋Ｔ細胞応答を完全にプライミングできる野生型ＤＣによるＣｄ７４^−／−マウスの再構成が原因であった。

細胞関連抗原のクロスプライミングは、ＣＤ７４依存性である。
細胞関連抗原に対する一次免疫応答におけるＣＤ７４の役割を調査するために、致死的な放射能を浴びたオボアルブミン（ＯＶＡ）をパルスされたＤＣ又は細胞関連抗原の供給源としてＯＶＡをパルスされた宿主と不一致のＭＨＣクラスＩを有するＤＣを、ＣＴＬを活性化するために、Ｃｄ７４^＋／＋マウス、ＣＤ４^＋細胞を枯渇させたＣｄ７４^＋／＋マウス及びＣｄ７４^−／−マウス並びに再構成されたマウスキメラに使用した。細胞関連ＯＶＡを初回免疫された野生型免疫系を有するマウスは、ＯＴ−Ｉトランスジェニックマウス由来のＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を誘導できたか（図８）、又はＯＶＡアミノ酸２５７〜２６４（ＯＶＡ（２５７〜２６４））をパルスされた標的細胞の殺傷において効率の良い内在性ＣＴＬを活性化できた（データ示さず）。しかし、細胞関連ＯＶＡの同じ初回免疫により、ＣＤ７４を欠損した造血系を有するマウスは、ＯＴ−Ｉ ＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖をあまり刺激できず、内在性ＣＴＬを産生が少なく、これが殺傷能力の低下に寄与した（図８及びデータ示さず）。

ＣＤ７４依存性クロスプライミングは、ＣＤ４^＋Ｔ細胞とは独立している。
ＤＣクロスプライミングの欠陥に焦点を合わせ、ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞の要求を含む外来因子の寄与を除外するために、Ｃｄ７４^−／−及びＣｄ７４^＋／＋ＤＣを、ＯＶＡタンパク質又はＯＶＡ（２５７〜２６４）ペプチドと一緒にインキュベートし、それらの細胞を、サイトゾル染料のＣＦＳＥで標識された、精製ＯＴ−Ｉ ＣＤ８^＋Ｔ細胞と併せて、ＢＡＬＢ／ｃバックグラウンドのＴ細胞欠損組換え活性化遺伝子１欠損（Ｒａｇ１^−／−）マウスに注射した。ＯＴ−Ｉ Ｔ細胞をクロスプライミングする、ＤＣの能力を評価した（図３ａ）。Ｃｄ７４^−／−ＤＣは、ＯＶＡタンパク質と一緒にインキュベートした場合、ＯＴ−Ｉの増殖の誘導はＣｄ７４^＋／＋ＤＣよりかなり少なかった（１８％対４８％；図３ｂ）。しかし、ＤＣに、直接提示の陽性対照としてＯＶＡ（２５７〜２６４）ペプチドをパルスした場合、Ｃｄ７４^−／−ＤＣは、ＣＤ８^＋ ＯＴ−Ｉ Ｔ細胞の活性化において、Ｃｄ７４^＋／＋ＤＣと同等の能力があった（５９．５％対６０．０％；図３ｂ）。

脾臓への注射部位からの、ＤＣの運動性及びホーミングにおけるＣＤ７４の交絡的役割の可能性に対処するために^２８、静脈内注射後のＣＦＳＥ標識ＤＣの局在化^２９を評価した（図３ｂ及び図９）。Ｒａｇ１^−／−マウスに静脈内注射されたＣｄ７４^＋／＋及びＣｄ７４^−／−ＤＣは、同等に脾臓に局在化した。したがって、Ｔ細胞増殖を誘導するＣｄ７４^−／−ＤＣの能力の低さは、ＤＣの遊走の差が原因ではないが、抗原をプロセシング及び提示する能力の低さが原因であった。ＣＤ７４が、ＭＨＣクラスＩによる細胞関連抗原の交差提示及びｉｎ ｖｉｖｏのＣＤ８^＋Ｔ細胞のプライミングにおいて重要な役割を有し、ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞又はＤＣのＣＤ７４媒介性運動性とは関係が無いことが結論付けられた。

ＣＤ７４欠損ＤＣは、クロスプライミング能力が損なわれた。
Ｈ−２Ｋ^ｂ拘束性オボアルブミンエピトープＯＶＡ（２５７〜２６４）をｉｎ ｖｉｔｒｏで交差提示する、さまざまなマウス系統の脾臓由来ＤＣの能力を評価した。ＤＣを、可溶性ＯＶＡと一緒に、サイトカインを伴い、又は伴わずにインキュベートし、細胞をＨ−２Ｋ^ｂ−ＯＶＡ（２５７〜２６４）複合体に特異的な抗体で染色するか、又は細胞を、Ｈ−２Ｋ^ｂと会合したＯＶＡ（２５７〜２６４）を認識後活性化されるＴ細胞ハイブリドーマであるＢ３Ｚと一緒に培養するかのいずれかに供した^３０。Ｃｄ７４^＋／＋及びＣｄ７４^−／−ＤＣは、ＯＶＡの内部移行に対して同様の能力を有し、同様のＭＨＣクラスＩの総表面発現を有した（図４ａ、ｂ）。しかし、ＯＶＡと一緒にインキュベーション後、Ｃｄ７４^−／−ＤＣは、Ｃｄ７４^＋／＋ＤＣより非常に少ないＨ−２Ｋ^ｂ−ＯＶＡ（２５７〜２６４）複合体を有した（図４ｂ）。ＤＣのクロスプライミング能力が、共刺激の上方制御及びＭＨＣ分子を誘導し、エンドサイトーシスを減少させる炎症性メディエーターにより、増大されることが示されている^{３１，３２}。これは、Ｔ細胞のプライミングに関するより高い能力をもたらすが、可溶性抗原を捕捉し、提示する、ＤＣの能力が縮小される。共刺激を伴う、ｉｎ ｖｉｖｏ条件に似た状況におけるＴ細胞の活性化を評価するために、ＯＶＡをパルスされたＤＣを、Ｂ３Ｚ Ｔ細胞と一緒に、サイトカインを伴い、又は伴わずにインキュベートした。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）及びインターフェロン−γの存在下で、Ｃｄ７４^＋／＋及びＣｄ７４^−／−ＤＣは、共刺激分子であるＣＤ８０、ＣＤ８６及びＣＤ４０を上方制御する同等の能力を有したが（図４ｃ及びデータ示さず）、Ｃｄ７４^−／−ＤＣは、Ｂ３Ｚ Ｔ細胞を、Ｃｄ７４^＋／＋ＤＣほど活性化できなかった（図４ｄ）。予想通り、細胞を、Ｔａｐ１^−／−マウス由来の、ＯＶＡをパルスされたＤＣと一緒に、サイトカインの存在下でインキュベートした後、Ｔ細胞の活性化は検出されなかった。これらのデータは、ＣＤ７４がＴ細胞クロスプライミングにおいて役割を有し、共刺激分子の発現に影響を与えないという結論を裏付けた。

ＣＤ７４は、エンドリソソームのＭＨＣクラスＩ負荷を媒介する。
分子レベルにおいて、交差提示及びプライミング欠損の機序をより理解するために、比較免疫蛍光共焦点顕微鏡法（ＩＣＭ）を使用して、ＴＮＦを伴う、又は伴わないＣｄ７４^＋／＋及びＣｄ７４^−／−ＤＣにおけるＯＶＡ（２５７〜２６４）負荷ＭＨＣクラスＩの細胞内局在化、輸送及び分布を評価した。細胞を、ＯＶＡタンパク質と一緒にインキュベートし、Ｈ−２Ｋ^ｂ−ＯＶＡ（２５７〜２６４）に対する抗体及び後期エンドソームマーカーのＬＡＭＰ−１に対する抗体を用いて、細胞を細胞内染色した。ＬＡＭＰ−１の共局在化は、ＴＮＦを培養液に加えなかった場合、Ｈ−２Ｋ^ｂ−ＯＶＡ（２５７〜２６４）複合体が染色された、多くのＣｄ７４^＋／＋脾臓ＤＣにおいて検出可能であった（図４ｅ、ｆ）。Ｃｄ７４^−／−及びＴａｐ１^−／−ＤＣ中の一部のＨ−２Ｋ^ｂ−ＯＶＡ（２５７〜２６４）複合体を同定したが、後期エンドソームの共局在化は最小であった（図４ｅ、ｆ）。Ｔａｐ１^−／−ＤＣ中の負荷されたＭＨＣクラスＩの不在は、先に仮定された機序である、交差提示におけるＴＡＰの役割と一致した^{２４，３３}。ＴＮＦを用いた処理後、Ｃｄ７４^＋／＋ＤＣは、Ｈ−２Ｋ^ｂ−ＯＶＡ（２５７〜２６４）複合体とＬＡＭＰ−１との有意に多い共局在化を有したが（図４ｅ、ｆ）、ＥＲマーカーのＧＲＰ７８又はゴルジマーカーのギアンチン（ｇｉａｎｔｉｎ）とは有意に多い共局在化を有さなかった（データ示さず）。対照的に、Ｃｄ７４^−／−ＤＣ中の後期エンドソームコンパートメントにおいてＨ−２Ｋ^ｂ−ＯＶＡ（２５７〜２６４）複合体はほとんど観察されず、これは、後期エンドソームにおいてＨ−２Ｋ^ｂ−ＯＶＡ（２５７〜２６４）複合体の形成が少ないことを示していた（図４ｆ）。ＩＣＭデータの比較により、ＴＮＦの存在下で、Ｃｄ７４^−／−由来のＤＣが、後期エンドソームにおいて、Ｃｄ７４^＋／＋ＤＣより有意に少ないＯＶＡ（２５７〜２６４）負荷Ｈ−２Ｋ^ｂを有したことが示された（６２％対３２％；図４ｆ）。これらのデータは、ＤＣにおいて、外来性抗原の交差提示を要求する、ＣＤ７４依存性ＭＨＣクラスＩ抗原プロセシング経路が存在することを示唆した。

ＣＤ７４は、ＭＨＣクラスＩをＥＲからエンドリソソームへ指向させる。
ＣＤ７４の欠損が、後期エンドソームコンパートメントにおいてＨ−２Ｋ^ｂ−ＯＶＡ（２５７〜２６４）複合体を減少させたという発見は、ＣＤ７４が、ＭＨＣクラスＩをＥＲからエンドリソソーム経路に標的化させることを示唆した。そこで、ＣＤ７４はおそらく分解され、ＭＨＣクラスＩに外来性抗原ペプチドが負荷される。このことをより詳細に検査するために、エンドソームの酸性化を、クロロキンを介してブロックし、ＣＤ７４媒介性ＭＨＣクラスＩ交差提示経路を評価した。クロロキンを用いて処理された骨髄由来ＤＣ（ＢＭＤＣ）が、未処理の対照の表面発現と同等のＭＨＣクラスＩの表面発現を有し、ＯＶＡ（２５７〜２６４）ペプチドをパルスした場合、Ｈ−２Ｋ^ｂ−ＯＶＡ（２５７〜２６４）をディスプレイしたが、可溶性ＯＶＡと一緒にインキュベートした場合、クロロキン処理ＤＣは、未処理ＤＣよりはるかに少ない表面Ｈ−２Ｋ^ｂ−ＯＶＡ（２５７〜２６４）を有したことが見出された（図５ａ〜ｃ）。ＩＣＭ分析により、ＢＭＤＣが、クロロキンを用いた処理後、Ｈ−２Ｋ^ｂとＣＤ７４とのより多くの共局在化を有したことが示された（図５ｄ、ｅ）。このことは、クロロキンを用いた処理が、おそらくＭＨＣクラスＩＩ経路に関して報告された様式と同様の様式で、エンドリソソームにおいてＭＨＣクラスＩとＣＤ７４との解離がブロックされ^３４、リサイクリングＭＨＣクラスＩの分解が阻害されたことにより、より多くのエンドリソソームＭＨＣクラスＩ分子がもたらされたことを示していた。最終結果は、ＭＨＣクラスＩへの外来性抗原の負荷の減少及びその後の表面Ｈ−２Ｋ^ｂ−ＯＶＡ（２５７〜２６４）の減少であった。ＣＤ７４が、ＭＨＣクラスＩをエンドリソソームコンパートメントに指向させるという発見を確認し、ＣＤ７４がＭＨＣクラスＩ輸送を媒介することを明確に実証するために、ＣＤ７４欠損ＢＭＤＣに、完全長ＣＤ７４又はサイトゾル輸送ドメインを欠いたＣＤ７４に関する発現ベクターをトランスフェクトし、ＯＶＡタンパク質又はプロセシングの必要性を回避した陽性対照であるＯＶＡ（２５７〜２６４）ペプチドを提示する、それらの能力を評価した。Ｃｄ７４^−／−ＤＣは、クロスプライミング能力が損なわれ、ＯＴ−Ｉ Ｔ細胞の増殖の誘導がＣｄ７４^＋／＋ＤＣよりもはるかに少なかった（図５ｆ）。予想通り、クロスプライミング能力は、完全長ＣＤ７４を用いて再構成されたＣｄ７４^−／−ＤＣにおいて復元され、ＤＣは、ＯＴ−Ｉ Ｔ細胞増殖を、野生型ＤＣと同様の能力で誘導できた。しかし、本発明者らが、エンドソーム輸送モチーフを欠いたＣＤ７４をＣｄ７４^−／−ＤＣに再導入した場合、クロスプライミング能力は損なわれたままであり（図５ｆ）、これは、ＣＤ７４の不在下で、エンドリソソームに指向されるＭＨＣクラスＩが少なく、ＯＴ−Ｉ Ｔ細胞のクロスプライミングが少なかったことを実証している。これらのデータをまとめると、ＣＤ７４が、外来性抗原の効率的な提示が起こるクロスプライミングコンパートメントへの、ＭＨＣクラスＩの輸送に影響を与えたことを示していた。

ＣＤ７４とＭＨＣクラスＩ分子とは、ＤＣにおいて複合体を形成する。
ＭＨＣクラスＩのクロスプライミングコンパートメントへの標的化のための必要条件として、ＤＣにおけるＣＤ７４とＭＨＣクラスＩとの相互作用を、分子レベルで調査した。Ｃｄ７４^＋／＋及びＣｄ７４^−／−マウスの脾臓由来のＤＣを、ＩＣＭによる分析のために単離した。ＤＣを、抗Ｈ−２Ｋ^ｂ及び抗ＣＤ７４で染色し、見出されたＨ−２Ｋ^ｂ分子は、細胞表面及び細胞質に分布し、その場所でＨ−２Ｋ^ｂ分子は主に小胞様コンパートメントに局在化していた。ＣＤ７４分子は、Ｃｄ７４^＋／＋ＤＣ中のこれらの細胞内コンパートメントで相当に共局在化していた（図６ａ）。しかし、本発明者らは、Ｔａｐ１^−／−ＤＣにおいてＨ−２Ｋ^ｂとＣＤ７４との共局在化が少ないことを観察し、おそらく、Ｈ−２Ｋ^ｂの全体の利用能が高速されたことが原因であると思われる（図６ａ）。

これらの分子が共局在化するコンパートメントを同定するために、脾臓ＤＣを、抗Ｈ−２Ｋ^ｂ及び抗ＬＡＭＰ−１（後期エンドソームを検出するために）を用いて染色した。相当な割合の後期エンドソームが、Ｃｄ７４^＋／＋ＤＣにおいてＨ−２Ｋ^ｂを含有し（図６ａ）、これにより、相当量のＭＨＣクラスＩ分子がエンドサイトーシスコンパートメントに存在することが確認された^８，２１。対照的にごくわずかなＨ−２Ｋ^ｂが、Ｃｄ７４^−／−ＤＣにおいて、後期エンドソームと共局在化していた（図６ａ）。この結果は、ＩＣＭ画像の定量化により確認され、このことは、Ｃｄ７４^−／−ＤＣにおいて、Ｃｄ７４^＋／＋ＤＣよりも極めて少ないＭＨＣクラスＩ分子がエンドリソソームコンパートメントを標的としていたことが示していた（７３％対４７％；図６ｂ）。共局在化は、Ｔａｐ１^−／−ＤＣにおいてもさらに低いことが明らかであり、おそらく、Ｈ−２Ｋ^ｂ分子のエンドリソソームへの標的化がＴＡＰの不在下で損なわれたことが原因であると思われる。これらのデータは、かなりのＭＨＣクラスＩ分子がＣＤ７４と相互作用して、おそらくＥＲからＤＣのエンドリソソームコンパートメントへのそれらの運搬を容易にしていたことを示唆した。

ＤＣにおけるＭＨＣクラスＩとＣＤ７４との間の直接分子相互作用の実証は、これが、ＤＣにおける抗原提示の未だ述べられていない経路であるという議論をさらに強固にした。このことを実証するために、ＢＭＤＣを、さまざまなノックアウトマウス及び野生型マウスから得て、この細胞を、^３５Ｓを用いて標識し、その後、ＭＨＣクラスＩ（Ｈ−２Ｋ^ｂ）、ＭＨＣクラスＩＩ（ｌ−Ａ^ｂ）又はＣＤ７４に結合した複合体を免疫共沈降させ、これらの複合体中のタンパク質を、それらの見かけの分子量に基づき同定した。ＭＨＣクラスＩＩに対する抗体は、Ｃｄ７４^＋／＋ＤＣ中のＣＤ７４の４１−キロダルトン（４１−ｋＤａ）及び３１−ｋＤａのアイソフォームを大量に免疫沈降させた（図６ｃ）。抗Ｈ−２Ｋ^ｂもまた、それらの同じＣＤ７４アイソフォームを沈降させ（図６ｃ）、このことは、常に、ＣＤ７４が、ＤＣ中のＭＨＣクラスＩ分子の全プールの一部に結合していることを示唆した。分子サイズ４１及び３１ｋＤａで検出された２種の顕著なタンパク質は、ＭＨＣクラスＩ負荷又は運搬複合体の成分であったと思われる。それらのサイズは、ＭＨＣクラスＩＩ負荷においてシャペロンとして作用するＨ−２ＤＭ又はＨ−２ＤＯのサイズと一致するが、それらの同一性は、最終的には未だ決定されていない。ＣＤ７４の４１及び３１−ｋＤａ型は、Ｃｄ７４^−／−ＤＣには存在せず（図６ｃ）、このことは、ＣＤ７４の４１及び３１−ｋＤａ型が実際に、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ分子と一緒に免疫沈降されたことが示されているＣＤ７４の報告されたアイソフォームであったことを示していた^{１７〜１９、２３}。さらに、４１及び３１−ｋＤａのＣＤ７４アイソフォームは、Ｔａｐ１^−／−ＤＣ中のＨ−２Ｋ^ｂと一緒に免疫沈降され（図６ｃ）、このことは、ＣＤ７４とＭＨＣクラスＩとの結合が、ＴＡＰのペプチド−運搬体機能に依存していなかったことを示唆した。最終的に、ＣＤ７４のアイソフォームは、β_２−ミクログロブリン欠損ＤＣ由来のＭＨＣクラスＩと一緒に免疫沈降され（図６ｃ）、このことは、ＣＤ７４が、フォールディングされたβ_２−ミクログロブリン会合ＭＨＣクラスＩ複合体及びβ_２−ミクログロブリン非含有ＭＨＣクラスＩ複合体と結合可能であることを示唆した。

その後免疫ブロット分析を使用して、ＭＨＣクラスＩ分子に結合したＣＤ７４アイソフォームの同一性を確認した。タンパク質を、抗ｌ−Ａ^ｂ、抗Ｈ−２Ｋ^ｂ及びエクソン８によりコードされるＭＨＣクラスＩ分子の領域に対する抗体並びに無関係なトランスフェリン受容体に対する抗体を用いて免疫沈降させ、その後、抗ＣＤ７４を用いて免疫ブロット分析を行った（図６ｄ）。予想通り、ＣＤ７４は、ＭＨＣクラスＩＩ（ｌ−Ａ^ｂ）と会合したが、無関係なタンパク質のトランスフェリン受容体とは会合しなかった（図６ｄ）。ＣＤ７４は、ＭＨＣクラスＩと会合することが決定的に同定され（図６ｄ）、このことにより、この相互作用が検出可能であり、この免疫沈降手順において使用された条件下で安定であったことが確認された。

ＭＨＣクラスＩ−ＣＤ７４複合体は、プレ−ゴルジ（ｐｒｅ−Ｇｏｌｇｉ）コンパートメントにおいて形成する。
次に、ＭＨＣクラスＩとＣＤ７４との間の相互作用の動態及び起源を明確に実証するために、生化学的手段を使用して、この相互作用が起こる細胞内コンパートメントをさらに推定する。分泌経路中のタンパク質は、ゴルジコンパートメントを介してＥＲから輸送し、ゴルジコンパートメントで、それらはマンノシダーゼＩＩにより切断されるので、それらはエンドグリコシダーゼ（Ｅｎｄｏ Ｈ）に対する耐性を獲得する^３５。Ｅｎｄｏ Ｈに対する感受性が、タンパク質が、ＥＲ又はＥＲとシス−ゴルジとの間の「移行領域」に局在することの表れとして作用することは広く受け入れられている。Ｃｄ７４^＋／＋ＢＭＤＣ由来のＣＤ７４結合ＭＨＣクラスＩは、抗ＣＤ７４又は抗ＭＨＣクラスＩを用いて免疫沈降され、免疫沈殿物をＥｎｄｏ Ｈで処理し、その後、抗ＭＨＣクラスＩ又は抗ＣＤ７４を用いた免疫ブロット分析を行い、ＭＨＣクラスＩ−ＣＤ７４複合体のＥｎｄｏ Ｈに対する感受性を可視化した。本発明者らは、ＭＨＣクラスＩ会合ＣＤ７４が、Ｅｎｄｏ Ｈに対して感受性であったことを見出した（図６ｅ、ｆ）。さらに、クロロキンを用いた処理後、バンド強度がより高いことによって実証されるように、Ｅｎｄｏ Ｈ耐性ＣＤ７４とＭＨＣクラスＩとの会合がわずかに多かった（図６ｆ）。全体として、これらのデータは、ＣＤ７４とＭＨＣクラスＩとの相互作用がＥＲを起源とし、ＥＲにおいてＣＤ７４が、ＭＨＣクラスＩ分子の「未熟」部分と結合し、ここからエンドリソソームコンパートメントへの輸送が開始され、交差提示、Ｔ細胞プライミング及び一次免疫応答が媒介されることを示唆した^８、１３。

ＣＤ７４は、ＭＨＣクラスＩの内部移行に影響を与えない。
最終的に、ＣＤ７４と結合したＭＨＣクラスＩの供給源を決定するために、本発明者らは、細胞膜からのＭＨＣクラスＩのＣＤ７４媒介性輸送の役割を調査した。ＣＤ７４が、表面受容体のリサイクリングにおいて機能するかどうかを決定するために、Ｃｄ７４^＋／＋及びＣｄ７４^−／−ＤＣにおけるＭＨＣクラスＩの内部移行をモニターした。ＢＭＤＣを、抗Ｈ−２Ｋ^ｂを用いて染色し、フローサイトメトリーを使用して、内部移行を継時的にモニターした。Ｃｄ７４^＋／＋及びＣｄ７４^−／−ＤＣは、ＭＨＣクラスＩ内部移行の非常に類似した動態を有した（図６ｇ）。このことは、ＣＤ７４がＭＨＣクラスＩと細胞表面において相互作用せず、交差提示のために細胞内コンパートメントへの内部移行を起こしたことを示した。ＭＨＣクラスＩ分子の細胞質ドメイン中のチロシンに基づくモチーフが、細胞膜からエンドリソソームのクロスプライミングコンパートメントへの、リサイクリングＭＨＣクラスＩ分子の内部移行にとって非常に重要であることを実証する公表された研究を称賛し^８，１３、したがって、ＣＤ７４依存性ＭＨＣクラスＩ輸送の唯一且つ独特な経路を実証した。

考察
ＭＨＣクラスＩＩ分子による外来性ペプチドの提示対ＭＨＣクラスＩ分子によるサイトゾルペプチドのディスプレイの二分法が見直されている^{６，８，３６，３７}。ＭＨＣクラスＩ交差提示は、この分割のぼやけを実証するだけでなく、特定の細胞型、例えばＤＣにとって、この現象が、ｉｎ ｖｉｖｏの一次免疫応答の発生において主要な役割を果たすことを示す^８。さらに、ＭＨＣクラスＩＩ分子における内在性ペプチドの提示は、ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ経路がおそらく交差して、それらが同じ抗原負荷コンパートメントを共有可能なことを実証している^３８。ＣＤ７４が、ＭＨＣクラスＩＩによる提示において主要なシャペロンとして古典的に認識されるが、ＣＤ７４及びＭＨＣクラスＩもまた相互作用することが示されている^{１７，１８，３９，４０}。しかし、ＣＤ７４の、ＭＨＣクラスＩ媒介性免疫応に対するｉｎ ｖｉｖｏの生理学的寄与は調査されておらず、ＭＨＣクラスＩ−ＣＤ７４相互作用の同定は、生理学的好奇心としてかなり軽視されている。ここで、ＣＤ７４が、ＤＣにおいて、ＭＨＣクラスＩ交差提示経路に大きく寄与したことが実証されている。これらの研究は、ウイルス抗原及び細胞関連抗原に対する応答の発生における、ＣＤ７４依存性クロスプライミングに関する主要な役割を同定している。

ＤＣ交差提示を介して発生されたＣＤ４^＋Ｔ細胞独立性ＣＴＬ応答を評価するために、低用量のＶＳＶに感染したモデルを使用した。低ウイルス用量は、大部分のＤＣが推定上感染を免れ、他の感染細胞が抗原ペプチドドナーとして作用する生理学的状況を模倣し、この状況は、直接又は内在性の提示対交差提示の描写を可能にする。ＣＤ７４を欠いたマウスが、特に、クロスプライミングが、ＤＣによる直接プライミングよりおそらく優勢である低ウイルス用量に対して、ＭＨＣクラスＩ拘束性ＣＴＬ応答を発生するそれらの能力を相当に損なうという観察は、ＭＨＣクラスＩ交差提示が、抗ウイルスＣＤ８^＋Ｔ細胞媒介性免疫が、生理学的条件下でｉｎ ｖｉｖｏで発生される主要機序であるという結論を裏付けた^８、４１。本発明者らは、他の研究者らの研究もまた確認し、ＶＳＶなどのウイルスに対する、ＣＴＬの応答が、ＣＤ４^＋Ｔ細胞独立性であり^{２６，２７}、したがって、ＭＨＣクラスＩＩ−ＣＤ７４複合体の機能とは独立していることを実証した。

骨髄キメラの作製は、野生型宿主バックグラウンドのＣｄ７４^−／−骨髄細胞由来ＤＣの活性の研究を可能にする。それらの研究は、ＣＤ７４のプライミングの欠陥がＤＣの起源の欠陥であり、この欠損がＤＣ交差提示のレベルであったことを示したという結論を導いた。さらに、ＣＤ７４の不在が、５０％を超えて低い抗ＶＳＶ ＣＴＬをもたらしたので、ＣＤ７４依存性クロスプライミングは、重要なＭＨＣクラスＩ抗原提示経路として同定された。さらに、マウスキメラにより得られた発見は、ＣＤ７４の欠損が、ＣＤ４^＋Ｔ細胞が少ないこととは独立して、ＶＳＶに対する一次免疫応答の発生を損なうという観察を裏付けた^{２６，４２}。このことは、ある場合において、ＣＤ４^＋Ｔ細胞が、二次ＣＴＬ集団拡大にとって必要であるが、一次集団の拡大には必要でないことを実証する、他の公表されたデータと一致する^４３。Ｔ細胞抗原受容体の刺激と一緒に、Ｂ７分子によるＣＤ８^＋ＣＴＬの同時刺激は、ヘルパーＴ細胞なしにＣＤ８^＋ＣＴＬを誘発するために十分であり得る^２６。又は、ＣＤ８^＋ＣＴＬ前駆体の２種の異なる系統が存在し、それによって、ＣＤ４^＋Ｔ細胞独立性集団が、さまざまなウイルスに対する優勢な応答を提供し、ＣＴＬ機能を、ＣＤ４^＋Ｔ細胞の不在下で喪失させないことが完全に可能である^４２。

エンドソーム標的化シグナルを欠いたＣＤ７４の形態の発現が、ＤＣ交差提示及びＴ細胞のプライミングを補足できなかったことが見出された。しかし、機能性エンドソーム標的化シグナルを含有する野生型ＣＤ７４分子による再構成がクロスプライミングを復元し、このことは、ＭＨＣクラスＩが、ＥＲからエンドリソソームへＣＤ７４により運搬される機序の提唱を裏付けた。さらに、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を完全に欠いたＲａｇ１^−／−マウス中のＣｄ７４^−／−ＤＣによるＣＤ８^＋Ｔ細胞の不十分な活性化は、ＤＣクロスプライミング機能の欠損は、ＣＤ７４の不在が原因であったことを明確に実証した。本発明者らの研究において、ＣＤ７４は、ＤＣのホーミング及び運動性においてｉｎ ｖｉｖｏで役割を有するとは思われなかったが、ＤＣによるＣＤ８^＋Ｔ細胞のＣＤ７４依存性ＭＨＣクラスＩクロスプライミングの生理学的に重要な経路を媒介していると思われた。

本発明者らの研究はまた、生理学的条件下でＤＣにおけるＭＨＣクラスＩ分子とＣＤ７４との間の会合の証拠を提供している。それらは、エンドリソソームにおけるＭＨＣクラスＩ−ＣＤ７４複合体の解離後、ＭＨＣクラスＩの重鎖及びβ_２−ミクログロブリンと抗原ペプチドとの再構築が、その後、エンドリソソームコンパートメントにおいて起こることをさらに示唆した^４４。これに関連して、ＭＨＣクラスＩ−ＣＤ７４複合体が、依然として後期エンドソームとして同定された液胞様コンパートメントにおいて構築されることを直接実証した。さらに、ＣＤ７４が、エンドリソソームにおけるＭＨＣクラスＩの存在に影響を与えることが確立され、これにより、ＭＨＣクラスＩ−ＣＤ７４の相互作用が、ＭＨＣクラスＩ分子のサブクラスをエンドリソソーム経路に標的化させるという公表された観察が確認された^１７。

先に記載されたＭＨＣクラスＩ細胞質尾部中のチロシン内部移行シグナルは^{８，１３，４５}、リサイクリングＭＨＣクラスＩをクロスプライミングコンパートメントに標的化させる。この機序とは対照的に、ＤＣにおけるＣＤ７４の不在が、ＭＨＣクラスＩの内部移行に影響を与えるとは思われなかったので、ＣＤ７４とＭＨＣクラスＩ分子との間の安定な相互作用が細胞膜において起こり、リサイクリングＭＨＣクラスＩを指向させるとは考えにくい。本発明者らの結果は、細胞質ドメイン中のチロシン内部移行シグナルにより指向される、ＭＨＣクラスＩの細胞膜からのリサイクリング、及びＭＨＣクラスＩのＥＲから、ＣＤ７４シャペロンとの結合を介した輸送の両方が、エンドリソソーム経路におけるペプチド受容性ＭＨＣクラスＩのプールに寄与するモデルを裏付ける。したがって、ＭＨＣクラスＩＩ分子により使用される様式と類似の様式で、ＭＨＣクラスＩ−ＣＤ７４複合体はＥＲで形成され、クロスプライミングコンパートメントへ移行するペプチド結合をマスクする立体構造の中に保持され得る。実際に２つの独立した研究が、コアのＭＨＣクラスＩＩに会合したＣＤ７４ペプチドＣＬＩＰ（ＭＲＭＡＴＰＬＬＭ）（ＭＨＣクラスＩＩ結合溝に結合したＣＤ７４の一部）に由来する小型のペプチドを含むＣＤ７４ペプチドが、ＭＨＣクラスＩ分子から溶離可能であることを示している^{４６，４７}。したがって、このようなペプチは、ＣＬＩＰのＭＨＣクラスＩ等価物の強力な候補である。このＣＬＩＰ由来ペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩの状況と類似の早期ペプチド結合を防止できる^{４６，４８}。このモデルにおいて、ＣＤ７４の消化及び除去後、ＭＨＣクラスＩは、高親和性のｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｓ由来外来性ペプチドを負荷でき^１１、細胞表面に進行でき、そこで活性化されるように、ＣＤ８^＋Ｔ細胞前駆体を効率的にプライミングできる。

要約すると、本明細書の本発明者らの結果及び他の公表されたデータ^８，４９は、ＤＣにおける交差提示の基本コンパートメントとしてのエンドリソソームの重要性を強調し、本明細書の本発明者らの調査は、ＭＨＣクラスＩ分子の細胞内経路指定及びＤＣのクロスプライミング機能に関する、ＭＨＣクラスＩ−ＣＤ７４相互作用の構造的及び機能的関連性を正式に確立した。本発明者らの観察は、免疫応答のプライミングのための未知の経路を定義し、今後の研究は、この過程を完全に解明するべきである。本発明者らの結果は、かなり臨床的に関連があり、ＤＣのエンドリソソームを標的とするワクチン候補が、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩの両方の抗原のプライミングを強化し、それによって、ワクチンの免疫原性及び有効性を改善することを示唆している。

方法
マウス。Ｃｄ７４^＋／＋（Ｈ−２Ｋ^ｂ）マウスはＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒから入手した。β_２−ミクログロブリン欠損Ｂ２ｍ^−／−、Ｔａｐ１^−／−、ＯＴ−Ｉ（Ｈ−２Ｋ^ｂ）及びＲａｇ１^−／−（Ｈ−２Ｋ^ｄ）マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。Ｃｄ７４^−／−（Ｈ−２Ｋ^ｂ）マウスは、Ｄ．Ｍａｔｈｉｓから贈呈された。キメラマウスに関しては、ドナー骨髄を、抗Ｔｈｙ−１（ＭＲＣ ＯＸ−７；Ａｂｃａｍ）を用いて成熟Ｔ細胞を枯渇させ、亜致死的に放射線照射されたレシピエント（１，２００ｒａｄ）に注射した（１×１０^７細胞）。末梢Ｔ細胞のサブセットを、抗ＣＤ８（５３−６．７；ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ）及び抗ＣＤ４（ＧＫ１．５、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色後、フローサイトメトリーにより分析した。ＣＤ４^＋細胞の枯渇に関して、免疫化前及びＴ細胞評価の４８時間前に、マウスに１００μｇの抗ＣＤ４（ＧＫ１．５）を注射した^５０。すべての研究は、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ大学の動物管理委員会（Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）及びカナダ動物管理協会（ｔｈｅ Ｃａｎａｄｉａｎ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｎ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ）により設定されたガイドラインに従った。

ウイルス感染。ＶＳＶを腹腔内注射した（５０％の組織培養細胞単層が感染する１×１０^５から２×１０^５の用量である）。注射６日後において、脾臓細胞を、抗ＣＤ８（５３−６．７）及びＨ−２Ｋ^ｂ−ＶＳＶＮＰ（５２〜５９）又はＨ−２Ｋ^ｂ−ＯＶＡ（２５７〜２６４）ｉＴＡｇ四量体（ｉｍｍｕｎｏｍｉｃｓ−ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ）を用いて染色し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）及びＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析した。脾臓細胞を、１μΜのＯＶＡ（２５７〜２６４）（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）又はＶＳＶＮＰ（５２〜５９）（ＲＧＹＶＹＱＧＬ）と一緒にさらに５日間培養し、その後、上記のように四量体染色した。細胞障害性アッセイを、記載のように実施した^８。

取込みアッセイ。ＢＭＤＣを、記載のように発生させた^８。細胞を、３０分間、４℃又は３７℃において、ＯＶＡ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８（３０μｇ／ｍｌ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と一緒にインキュベートした。ＯＶＡの取込みを、フローサイトメトリーにより分析した。

交差提示アッセイ。ＢＭＤＣを記載のように発生させるか^８、又は脾臓ＤＣを、ＣＤｌｌｃ^＋磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて単離した。ＤＣを、１５時間、ＯＶＡ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）と一緒に、指示がある場合は１００μΜのクロロキンと共にインキュベートした。ＤＣを、Ｆｃ Ｂｌｏｃｋ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を用いて染色し、その後、抗Ｈ−２Ｋ^ｂ（ＡＦ．６−８８．５）、抗ＣＤ８０（１６−１０Ａ１）、抗ＣＤ８６（ＧＬ１）、抗ＣＤ４０（３／２３）（すべてＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手）又は抗Ｈ−２Ｋ^ｂ−ＯＶＡ（２５７〜２６４）（２５．Ｄ１．１６；Ｊ．Ｙｅｗｄｅｌｌから贈呈された）を用いて染色し、フローサイトメトリーにより分析した。クロスプライミングアッセイに関しては、ＤＣを、ＯＶＡ、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子；１５ｎｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）及びＴＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）又はインターフェロン−γ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と一緒にインキュベートした。Ｂ３Ｚ Ｔ細胞（Ｎ．Ｓｈａｓｔｒｉから贈呈された）の活性化を、記載のように評価した^８。

ｉｎ ｖｉｖｏ研究に関して、Ｃｄ７４^＋／＋及びＣｄ７４^−／−ＢＭＤＣを、２時間、ＯＶＡ又はＯＶＡ（２５７〜２６４）（各１０ｍｇ／ｍｌ）と一緒にインキュベートし、Ｒａｇ１^−／−ＢＡＬＢ／ｃマウスに静脈内注射した（１×１０^７細胞）。２４時間後、ＯＴ−Ｉ Ｔ細胞を、２．５μΜのＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインジアセタートスクシンイミジルエステル；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて標識し、マウスに静脈内注射した（５×１０^６細胞）。脾臓におけるＯＴ−Ｉ Ｔ細胞の増殖を、フローサイトメトリーにより、ＣＦＳＥ希釈の３日後に評価した。脾臓への局在化を確認するために、ＣＦＳＥ標識ＤＣを、Ｒａｇ１^−／−ＢＡＬＢ／ｃマウスに静脈内注射した。２時間後、脾臓におけるＣＦＳＥ^＋細胞の存在を、フローサイトメトリーを用いて評価した。

共焦点顕微鏡法。脾臓由来ＤＣを単離し、固定し、記載のように透過性にした^８。交差提示の分析のために、ＤＣを、１０時間、ＯＶＡ（５ｍｇ／ｍｌ）と一緒に、ＴＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を伴い、又伴わずにインキュベートした。必要に応じて、ＤＣを、５０μΜのクロロキンで７２時間処理し、その後プロセシングした^３４。細胞を、抗Ｈ−２Ｋ^ｂ（ＡＦ．６−８８．５）、抗ＣＤ７４（Ｉｎ−１；Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ）、抗ＬＡＭＰ−１（Ｎ１９；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）又は抗Ｈ−２Ｋ^ｂ−ＯＶＡ（２５７〜２６４）（２５．Ｄ１．１６）を用いて染色した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８−若しくはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８−標識ウサギ抗マウス（Ａ−１１０２９、Ａ−１１０３１；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８−若しくはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８−標識ウサギ抗ヤギ（Ａ−１１０７８、Ａ−１１０７９；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８−標識ヤギ抗マウス（Ａ−１１００１；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を、二次抗体として使用した。画像を、Ｎｉｋｏｎ−Ｃ１、ＴＥ２０００−Ｕ ＩＣＭ及びＥＺ−Ｃ１ソフトウェアを用いて得た。データを、ＩｍａｇｅＪ．１、Ｏｐｅｎ／ａｂ及びＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを用いて分析した。個々の色の蛍光強度を、総蛍光強度の百分率として表した。

増殖アッセイ。Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウス（Ｈ−２Ｋ^ｋ）由来のＢＭＤＣを、１５時間、ＯＶＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）と一緒にインキュベートし、マウスに腹腔内注射した（５×１０^６細胞）。ＯＴ−Ｉ Ｔ細胞を標識し、上記のように静脈内注射した。ＯＴ−Ｉ Ｔ細胞の増殖を、３日後に、フローサイトメトリーによりＣＦＳＥ希釈液として評価した。

トランスフェクション。未熟なＢＭＤＣに、完全長マウスＣＤ７４（ｐ３１ アイソフォーム）又はアミノ酸２〜１７を欠いたＣＤ７４を含有するｐＢａｂｅベクター（Ｉ．Ｓｈａｃｈａｒから贈呈された）を、Ａｍａｘａ Ｍｏｕｓｅ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキットの使用を介してトランスフェクトした。エレクトロポレーションの１日後、ＤＣを、８時間、ＯＶＡ（２０ｍｇ／ｍｌ）又はＯＶＡ（２５７〜２６４）（１μΜ）と一緒にインキュベートし、その後、３日間、ＣＦＳＥ標識ＯＴ−Ｉ ＣＤ８^＋Ｔ細胞と一緒にインキュベートした。ＣＦＳＥ希釈液を、フローサイトメトリーにより評価した。

免疫沈降法。ＢＭＤＣを、１時間、メチオニン−及びシステイン非含有培地においてインキュベートし、その後、３０分間、［^３５Ｓ］メチオニン（３００μＣｉ／ｍｌ）をパルスし、その後、プロテアーゼ阻害剤の「カクテル」（Ｒｏｃｈｅ）及びＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド；４０μｇ／ｍｌ）を含有するバッファー（１２０ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＭｇＣｌ_２及び２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７．６）中０．５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０で溶解した。指示があれば、ＤＣを、１００μΜのクロロキンと一緒に一晩インキュベートし、その後溶解した。細胞溶解物を、正常ウサギ血清及びｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）と一緒に一晩インキュベートすることにより、予備清澄化した。すべてのＭＨＣクラスＩを認識する、エクソン８によりコードされる配列に対する抗体（Ｄ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｂ．Ｂａｒｂｅｒから入手）である、完全にフォールディングしたＭＨＣクラスＩを認識する抗Ｈ−２Ｋ^ｂ（ＡＦ６．８８．５；ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、抗Ｉ−Ａ−Ｉ−Ｅ（Ｍ５／１１４．１５．２；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、抗ＣＤ７４（Ｉｎ−１；Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ）及びトランスフェリン受容体に対する抗体（Ｈ６８．４；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、免疫沈降法に使用した。試料を、１０〜１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ゲルを固定し、Ａｍｐｌｉｆｙ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて強化し、乾燥させ、Ｋｏｄａｋ ＸＭＲオートラジオグラフィーフィルムに感光させた。又は、試料を、ニトロセルロース膜に転写し、抗ＣＤ７４（Ｉｎ−１；Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ）又は抗ＭＨＣクラスＩ（ＫＨ９５；ＳａｎｔａＣｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いた免疫ブロットにより分析した。試料を、エンドグリコシダーゼＨ_ｆで製造業者のプロトコル（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）に従って消化した。全細胞溶解物を、陽性対照として免疫ブロットにより分析した。マウス免疫グロブリンＧに対するロバ抗体（９２６−３２２１２；Ｌｉ−Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びマウスラット免疫グロブリンＧに対するヤギ抗体（Ａ２１０９６；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、二次抗体として使用した。ブロットを、Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇを用いて可視化した。

ＭＨＣクラスＩの内部移行。ＢＭＤＣを、Ｆｃ Ｂｌｏｃｋ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて染色し、その後、３０分間、０℃において、ビオチン化抗Ｈ−２Ｋ^ｂ（ＡＦ６−８８．５；ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて標識した。試料を、３７℃又は０℃においてインキュベートした。適切な時間に、ＤＣを、２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のパラホルムアルデヒドで固定し、ストレプトアビジン−フィコエリトリンを用いて標識し、その後、フローサイトメトリーにより検査した。データを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析し、内部移行されたＭＨＣクラスＩの量を計算した。

統計的分析。スチューデントｔ検定を使用して、集団間の差を比較した。Ｐ値が０．０５未満であった場合、差は、統計的に有意であったと考えられる（両側）。

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９． Ｇａｇｎｏｎ，Ｅ．ｅｔ ａｌ． Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ ｉｓ ａ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｅｎｔｒｙ ｉｎｔｏ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ． Ｃｅｌｌ １１０，１１９−１３１（２００２）．
１０． Ｔｏｕｒｅｔ，Ｎ．ｅｔ ａｌ． Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎｄ ｄｙｎａｍｉｃ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＥＲ ｔｏ ｐｈａｇｏｓｏｍｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ． Ｃｅｌｌ １２３，１５７−１７０（２００５）．
１１． Ｓｈｅｎ，Ｌ．，Ｓｉｇａｌ，Ｌ．Ｊ．，Ｂｏｅｓ，Ｍ． ＆ Ｒｏｃｋ，Ｋ．Ｌ． Ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅ ｏｆ ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｓ ｉｎ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ＴＡＰ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｃｒｏｓｓｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２１，１５５−１６５（２００４）．
１２． Ｃｅｂｒｉａｎ，Ｉ．ｅｔ ａｌ． Ｓｅｃ２２ｂ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｐｈａｇｏｓｏｍａｌ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎｔｉｇｅｎ ｃｒｏｓｓｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｙ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ． Ｃｅｌｌ １４７，１３５５−１３６８（２０１１）．
１３． Ｂａｓｈａ，Ｇ． ｅｔ ａｌ． ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ａｎｄ ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ｃｏｉｎｃｉｄｅｓ ｗｉｔｈ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ａｎｔｉｇｅｎ ｌｏａｄｉｎｇ ｉｎ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ． ＰＬｏＳ ＯＮＥ ３，ｅ３２４７（２００８）．
１４． Ｃｈｉｕ，Ｉ．，Ｄａｖｉｓ，Ｄ．Ｍ． ＆ Ｓｔｒｏｍｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｌ．Ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ｏｆ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｅｄ ＭＨＣ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６，１３９４４−１３９４９（１９９９）．
１５． Ｒｅｉｄ，Ｐ．Ａ． ＆ Ｗａｔｔｓ，Ｃ． Ｃｙｃｌｉｎｇ ｏｆ ｃｅｌｌ−ｓｕｒｆａｃｅ ＭＨＣ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｐｒｉｍａｑｕｉｎｅ− ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ． Ｎａｔｕｒｅ ３４６，６５５−６５７（１９９０）．
１６． Ｂａｋｋｅ，Ｏ． ＆ Ｄｏｂｂｅｒｓｔｅｉｎ，Ｂ． ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｉｎｖａｒｉａｎｔ ｃｈａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｓ ａ ｓｏｒｔｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ ｆｏｒ ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ． Ｃｅｌｌ ６３，７０７−７１６（１９９０）．
１７． Ｓｕｇｉｔａ，Ｍ． ＆ Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｍ．Ｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｖａｒｉａｎｔ ｃｈａｉｎ ｗｉｔｈ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｌａｓｓ Ｉ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｄｉｒｅｃｔｓ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ｔｏ ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ． Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，１４４３−１４４８（１９９５）．
１８． Ｖｉｇｎａ，Ｊ．Ｌ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｋ．Ｄ． ＆ Ｌｕｔｚ，Ｃ．Ｔ． Ｉｎｖａｒｉａｎｔ ｃｈａｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ：ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｆｏｒ ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ／β２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｓ，ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，ａｎｄ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ＭＨＣ ｐｅｐｔｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｇｒｏｏｖｅ． Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７，４５０３−４５１０（１９９６）．
１９． Ｋｌｅｉｊｍｅｅｒ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ． Ａｎｔｉｇｅｎ ｌｏａｄｉｎｇ ｏｆ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ ｔｒａｃｔ． Ｔｒａｆｆｉｃ ２，１２４−１３７（２００１）．
２０． Ｚｗｉｃｋｅｙ，Ｈ．Ｌ． ＆ Ｐｏｔｔｅｒ，Ｔ．Ａ． Ａｎｔｉｇｅｎ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｆｒｏｍ ｎｏｎｃｙｔｏｓｏｌｉｃ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｉｓ ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｃｌａｓｓｉｃａｌ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ． Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２，６３４１−６３５０（１９９９）．
２１． ＭａｃＡｒｙ，Ｐ．Ａ．ｅｔ ａｌ． Ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｆｒｏｍ ｌａｔｅ ｅｎｄｏｓｏｍｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ３４−ｄｅｒｉｖｅｄ ｈｕｍａｎ Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ ｃｅｌｌｓ． Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８，３９８２−３９８７（２００１）．
２２． Ｔｏｕｒｎｅ，Ｓ．ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｉｉ ＴＡＰ１ ｄｏｕｂｌｅ−ｍｕｔａｎｔ ｍｉｃｅ． Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３，１４６４−１４６９（１９９６）．
２３． Ｒｅｂｅｒ，Ａ．Ｊ．，Ｔｕｒｎｑｕｉｓｔ，Ｈ．Ｒ．，Ｔｈｏｍａｓ，Ｈ．Ｊ．，Ｌｕｔｚ，Ｃ．Ｔ． ＆ Ｓｏｌｈｅｉｍ，Ｊ．Ｃ． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｉｎｖａｒｉａｎｔ ｃｈａｉｎ ｃａｎ ｃａｕｓｅ ａｎ ａｌｌｅｌｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ５４，７４−８１（２００２）．
２４． Ｖｉｔａｌｉｓ，Ｔ．Ｚ．ｅｔ ａｌ． Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＴＡＰ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｍａｃｈｉｎｅｒｙ ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｄｊｕｖａｎｔ． ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．１，ｅ３６（２００５）．
２５． ｖａｎ Ｋａｅｒ，Ｌ．，Ａｓｈｔｏｎ−Ｒｉｃｋａｒｄｔ，Ｐ．Ｇ．，Ｐｌｏｅｇｈ，Ｈ．Ｌ． ＆ Ｔｏｎｅｇａｗａ，Ｓ． ＴＡＰ１ ｍｕｔａｎｔ ｍｉｃｅ ａｒｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ， ｓｕｒｆａｃｅ ｃｌａｓｓ Ｉ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， ａｎｄ ＣＤ４⁻８^＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｃｅｌｌ ７１，１２０５−１２１４（１９９２）．
２６． ＭｃＡｄａｍ，Ａ．Ｊ．，Ｆａｒｋａｓｈ，Ｅ．Ａ．，Ｇｅｗｕｒｚ，Ｂ．Ｅ．＆ Ｓｈａｒｐｅ，Ａ．Ｈ． Ｂ７ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｓ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｌａｓｓ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ ａｎｄ ＣＤ８＋ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｈｏｓｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ． Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４，２０３−２０８（２０００）．
２７． Ｍａｒｚｏ，Ａ．Ｌ．ｅｔ ａｌ． Ｆｕｌｌｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍｅｍｏｒｙ ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ＣＤ４ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３，９６９−９７５（２００４）．
２８． Ｆａｕｒｅ−Ａｎｄｒｅ，Ｇ．ｅｔ ａｌ． Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｂｙ ＣＤ７４， ｔｈｅ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｉｎｖａｒｉａｎｔ ｃｈａｉｎ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２２，１７０５−１７１０（２００８）．
２９． Ｂｅｎｖｅｎｕｔｉ，Ｆ．ｅｔ ａｌ． Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｒａｃ１ ａｎｄ Ｒａｃ２ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｍａｔｕｒｅ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ Ｔ ｃｅｌｌ ｐｒｉｍｉｎｇ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５，１１５０−１１５３（２００４）．
３０． Ｓｈａｓｔｒｉ，Ｎ． ＆ Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｆ． Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｏｖａｌｂｕｍｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅ／Ｋｂ ｃｏｍｐｌｅｘ ｔｏ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０，２７２４−２７３６（１９９３）．
３１． Ｓａｌｌｕｓｔｏ，Ｆ．，Ｃｅｌｌａ，Ｍ．，Ｄａｎｉｅｌｉ，Ｃ． ＆ Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ，Ａ． Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｕｓｅ ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｍａｎｎｏｓｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｏ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｌａｓｓ ＩＩ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ： ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ． Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２，３８９−４００（１９９５）．
３２． Ｂｒｏｓｓａｒｔ，Ｐ． ＆ Ｂｅｖａｎ，Ｍ．Ｊ． Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｏｎ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｌａｓｓ Ｉ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｂｙ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ： ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ． Ｂｌｏｏｄ ９０，１５９４−１５９９（１９９７）．
３３． Ｍｅｒｚｏｕｇｕｉ，Ｎ．，Ｋｒａｔｚｅｒ，Ｒ．，Ｓａｖｅａｎｕ，Ｌ． ＆ ｖａｎ Ｅｎｄｅｒｔ，Ｐ． Ａ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ， ＴＡＰ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐａｔｈｗａｙ ｆｏｒ ｃｒｏｓｓ−ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ． ＥＭ８Ｏ Ｒｅｐ．１２，１２５７−６４ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｅｍｂｏｒ．２０１１．２０３（２０１１）．
３４． Ｌｏｓｓ，Ｇ．Ｅ．Ｊｒ． ＆ Ｓａｎｔ，Ａ．Ｊ． Ｉｎｖａｒｉａｎｔ ｃｈａｉｎ ｒｅｔａｉｎｓ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ ｐａｔｈｗａｙ． Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０，３１８７−３１９７（１９９３）．
３５． Ｋｏｒｎｆｅｌｄ，Ｒ． ＆ Ｋｏｒｎｆｅｌｄ，Ｓ． Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ａｓｐａｒａｇｉｎｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ． Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５４，６３１−６６４ １０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ．ｂｉ．５４．０７０１８５．００３２１５（１９８５）．
３６． Ｒｏｃｋ，Ｋ．Ｌ．，Ｇａｍｂｌｅ，Ｓ． ＆ Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，Ｌ． Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ａｎｔｉｇｅｎ ｗｉｔｈ ｃｌａｓｓ Ｉ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９，９１８−９２１（１９９０）．
３７． ｖａｎ Ｌｉｔｈ，Ｍ．，ｖａｎ Ｈａｍ，Ｍ． ＆ Ｎｅｅｆｊｅｓ，Ｊ． Ｓｔａｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ／ＨＬＡ−ＤＯ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ａｔ ｔｈｅ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ． Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３，１１４５−１１５１（２００３）．
３８． Ｎｕｃｈｔｅｒｎ，Ｊ．Ｇ．，Ｂｉｄｄｉｓｏｎ，Ｗ．Ｅ． ＆ Ｋｌａｕｓｎｅｒ，Ｒ．Ｄ． Ｃｌａｓｓ ＩＩ ＭＨＣ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｃａｎ ｕｓｅ ｔｈｅ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ． Ｎａｔｕｒｅ ３４３，７４−７６ １０．１０３８／３４３０７４ａ０ （１９９０）．
３９． Ｃｅｒｕｎｄｏｌｏ，Ｖ．，Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｔ．，Ｅｌｖｉｎ，Ｊ．，Ｂａｓｔｉｎ，Ｊ． ＆ Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，Ａ． Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｎｖａｒｉａｎｔ ｃｈａｉｎ ｗｉｔｈ Ｈ−２ Ｄｂ ｃｌａｓｓ Ｉ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ． Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２，２２４３−２２４８（１９９２）．
４０． Ｐｏｗｉｓ，Ｓ．Ｊ． ＣＬＩＰ−ｒｅｇｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｖａｒｉａｎｔ ｃｈａｉｎ ｗｉｔｈ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ． ＦＥ８Ｓ Ｌｅｔｔ ５８０，３１１２−３１１６（２００６）．
４１． Ｓｉｇａｌ，Ｌ．Ｊ． ＆ Ｒｏｃｋ，Ｋ．Ｌ． Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｕｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ （ＴＡＰ）−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ −ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐａｔｈｗａｙｓ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ． Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２，１１４３−１１５０（２０００）．
４２． Ｂｕｌｌｅｒ，Ｒ．Ｍ．，Ｈｏｌｍｅｓ，Ｋ．Ｌ．，Ｈｕｇｉｎ，Ａ．，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ｔ．Ｎ． ＆ Ｍｏｒｓｅ，Ｈ．Ｃ．，ＩＩＩ． Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎ ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ＣＤ４ ｈｅｌｐｅｒ ｃｅｌｌｓ． Ｎａｔｕｒｅ３２８，７７−７９ １０．１０３８／３２８０７７ａ０ （１９８７）．
４３． Ｊａｎｓｓｅｎ，Ｅ．Ｍ．ｅｔ ａｌ． ＣＤ４^＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｍｏｒｙ ｉｎ ＣＤ８^＋Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ． Ｎａｔｕｒｅ ４２１，８５２−８５６（２００３）．
４４． Ｍａｃｈｏｌｄ，Ｒ．Ｐ． ＆ Ｐｌｏｅｇｈ，Ｈ．Ｌ． Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ａｎｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌａｓｓ Ｉ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ （ＭＨＣ） ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｐｒｏｂｅｄ ｗｉｔｈ ｆｒｅｅ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４，２２５１−２２５９（１９９６）．
４５． Ｒｅｉｎｉｃｋｅ，Ａ．Ｔ．，Ｏｍｉｌｕｓｉｋ，Ｋ．Ｄ．，Ｂａｓｈａ，Ｇ． ＆ Ｊｅｆｆｅｒｉｅｓ，Ｗ．Ａ． Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｃｒｏｓｓ−ｐｒｉｍｉｎｇ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ． ＰＬｏＳ ＯＮＥ ４， ｅ７２１０ １０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０００７２１０ （２００９）．
４６． Ｌｕｃｋｅｙ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ ａｌ． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｌａｓｓ Ｉ ＭＨＣ ａｌｌｅｌｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ． Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７，１２１２−１２２１（２００１）．
４７． Ｋｒｕｇｅｒ，Ｔ．ｅｔ ａｌ． Ｌｅｓｓｏｎｓ ｔｏ ｂｅ ｌｅａｒｎｅｄ ｆｒｏｍ ｐｒｉｍａｒｙ ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ： ｎｏｖｅｌ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ ａｎｄ ＨＬＡ ｌｉｇａｎｄｓ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５４，８２６−８３６（２００５）．
４８． Ｂｕｓｃｈ，Ｒ．，Ｃｌｏｕｔｉｅｒ，Ｉ．，Ｓｅｋａｌｙ，Ｒ．Ｐ． ＆ Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ，Ｇ．Ｊ． Ｉｎｖａｒｉａｎｔ ｃｈａｉｎ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｃｌａｓｓ ＩＩ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｆｒｏｍ ｂｉｎｄｉｎｇ ｉｎｔａｃｔ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ． ＥＭＢＯ Ｊ． １５，４１８−４２８（１９９６）．
４９． Ｓａｖｉｎａ，Ａ．ｅｔ ａｌ． ＮＯＸ２ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｐｈａｇｏｓｏｍａｌ ｐＨ ｔｏ ｒｅｇｕｌａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｄｕｒｉｎｇ ｃｒｏｓｓｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｙ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ． Ｃｅｌｌ １２６，２０５−２１８（２００６）．
５０． Ｒａｓｈｉｄ，Ａ．，Ａｕｃｈｉｎｃｌｏｓｓ，Ｈ．Ｊｒ． ＆ Ｓｈａｒｏｎ，Ｊ． Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ＧＫ１．５ ａｎｄ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｒａｔ／ｍｏｕｓｅ ＧＫ１．５ ａｎｔｉ−ＣＤ４ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｐｒｏｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｋｉｎ ａｌｌｏｇｒａｆｔ ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｎｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｌｌｏａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ． Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，１３８２−１３８８（１９９２）．

Claims (7)

1. 樹状細胞においてＭＨＣ Ｉエンドリソソーム交差提示を刺激するステップを含む、ＭＨＣ Ｉ媒介性免疫応答を刺激する方法。
2. 前記ＭＨＣ Ｉエンドリソソーム交差提示を刺激するステップが、樹状細胞においてＣＤ７４を過剰発現させるステップを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記ＭＨＣ Ｉエンドリソソーム交差提示を刺激するステップが、抗原を、前記ＭＨＣ Ｉエンドリソソーム交差提示経路に標的化させるステップを含む、請求項１に記載の方法。
4. 抗原又はその断片と、ＣＤ７４エンドリソソーム標的化配列とを含む融合タンパク質。
5. ＣＤ７４依存性ＭＨＣ Ｉ交差提示経路のためのコンパートメント。
6. エンドリソソームである、請求項５に記載のコンパートメント。
7. 一次免疫応答を刺激するための、カテプシン切断ペプチド及び前記ペプチドのコンカテマー。