JP2015171338A - Nucleic acid real-time detection method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、核酸の検出方法に関する。本発明は、各種感染症や遺伝病等の診断等に有用である。 The present invention relates to a method for detecting a nucleic acid. The present invention is useful for diagnosis of various infectious diseases and genetic diseases.
従来より、PCRに代表される核酸増幅法は、被検試料中の被検核酸の増幅に広く用いられている。PCRは、変性工程、アニーリング工程及び伸長工程から成るサイクルを、各工程ごとに大きく異なる温度で行う必要があるため、迅速な温度変更及び綿密な温度管理が必要で、そのための装置が必要になる。近年、ファージphi29由来のPhi29DNAポリメラーゼを用いて一定温度で核酸増幅を行うRCA(rolling circle amplification)法が開発され、既に実用化されている（非特許文献１）。Phi29DNAポリメラーゼは、３７℃程度の温度下において高いDNAポリメラーゼ活性と鎖置換活性（鋳型DNA上でDNA伸長を行いながら二本鎖DNAに到達すると、先にある二本鎖DNAを一本鎖にし、さらにDNA伸長を行うことにより、二本鎖のうち、鋳型核酸ではない方の鎖を置換する）を有するため、３７℃程度の定温下において、増幅サイクルを繰り返すことができるという優れた利点を有する。さらに、近年、RCAの改良法として、制限酵素の存在下でRCAを行うことにより、プライマーを自動生成するプライマー生成RCA(primer generating rolling circle amplification, PG-RCA)も開発された（非特許文献２）。 Conventionally, a nucleic acid amplification method represented by PCR has been widely used for amplification of a test nucleic acid in a test sample. PCR requires a cycle consisting of a denaturation step, an annealing step, and an extension step at different temperatures for each step. Therefore, rapid temperature changes and close temperature control are required, and equipment for that is required. . In recent years, an RCA (rolling circle amplification) method for performing nucleic acid amplification at a constant temperature using Phi29 DNA polymerase derived from phage phi29 has been developed and already put into practical use (Non-patent Document 1). Phi29 DNA polymerase has high DNA polymerase activity and strand displacement activity at a temperature of about 37 ° C. (When double-stranded DNA is reached while performing DNA extension on the template DNA, the double-stranded DNA is converted into a single strand, Furthermore, by performing DNA extension, it has an excellent advantage that the amplification cycle can be repeated at a constant temperature of about 37 ° C. . Furthermore, in recent years, primer generating rolling circle amplification (PG-RCA), which automatically generates primers by performing RCA in the presence of a restriction enzyme, has been developed as an improved method of RCA (Non-patent Document 2). ).
核酸増幅法を利用して被検試料中に含まれる被検核酸の定量を行う方法も既に実用化されている。代表的な方法として、一端にレポーター蛍光色素、他端にクエンチャー蛍光色素を結合したプローブの存在下でPCRを行い、核酸増幅反応液の蛍光強度をリアルタイムで測定し、蛍光強度が急激に立ち上がるまでのサイクル数に基づいて被検核酸である鋳型核酸を定量する方法（リアルタイム検出PCR、RTD-PCR)や、二本鎖核酸に特異的に結合するインターカレーター蛍光色素の存在下でPCRを行う方法等が知られている。また、酸化還元反応性のインターカレーターの存在下でPG-RCAを行い、増幅反応溶液を流れる電流をボルタンメトリーによりリアルタイムで測定し、増幅サイクル数とピーク電流密度との関係から鋳型核酸を定量する方法も公知である（非特許文献２）。 A method of quantifying a test nucleic acid contained in a test sample using a nucleic acid amplification method has already been put into practical use. As a typical method, PCR is performed in the presence of a probe having a reporter fluorescent dye at one end and a quencher fluorescent dye at the other end, and the fluorescence intensity of the nucleic acid amplification reaction solution is measured in real time, and the fluorescence intensity rises rapidly. PCR is performed in the presence of intercalator fluorescent dyes that specifically bind to double-stranded nucleic acids, or a method for quantifying the template nucleic acid that is the test nucleic acid based on the number of cycles until (real-time detection PCR, RTD-PCR) Methods are known. In addition, PG-RCA is performed in the presence of a redox-reactive intercalator, the current flowing through the amplification reaction solution is measured in real time by voltammetry, and the template nucleic acid is quantified from the relationship between the number of amplification cycles and the peak current density. Is also known (Non-Patent Document 2).
公知の核酸のリアルタイム検出方法では、蛍光強度の測定やボルタンメトリーによる測定が必要である。本発明の目的は、公知のリアルタイム検出方法よりも簡便な方法により核酸のリアルタイム検出が可能となる、新規な方法を提供することである。 A known nucleic acid real-time detection method requires measurement of fluorescence intensity or voltammetry. An object of the present invention is to provide a novel method that enables real-time detection of nucleic acids by a simpler method than known real-time detection methods.
本願発明者らは、鋭意研究の結果、イオン性のインターカレーターの存在下で核酸増幅法を行い、このイオン性インターカレーターに感応性を持つイオン選択性電極を用いて核酸増幅反応溶液の電位をリアルタイムに測定することにより、ポテンシオメトリーにより簡便に鋳型核酸をリアルタイム検出できることに想到し、これを実験的に確認して本願発明に到達した。 As a result of intensive research, the inventors of the present invention performed a nucleic acid amplification method in the presence of an ionic intercalator, and the potential of the nucleic acid amplification reaction solution was adjusted using an ion-selective electrode sensitive to the ionic intercalator. It was conceived that the template nucleic acid could be easily detected in real time by potentiometry by measuring in real time, and this was experimentally confirmed to arrive at the present invention.
すなわち、本発明は、二本鎖核酸にインターカレートするイオン性インターカレーターの存在下において、鋳型核酸を増幅させると共に、該イオン性インターカレーターに感応性を持つイオン選択性電極を用いて核酸増幅反応溶液の電位をリアルタイムに測定することを含む、二本鎖増幅核酸の検出方法を提供する。 That is, the present invention amplifies a template nucleic acid in the presence of an ionic intercalator that intercalates with a double-stranded nucleic acid and amplifies the nucleic acid using an ion-selective electrode sensitive to the ionic intercalator. Provided is a method for detecting a double-stranded amplified nucleic acid, which comprises measuring the potential of a reaction solution in real time.
本願発明により、簡便な方法で、鋳型核酸をリアルタイム検出することが可能な、新規な核酸のリアルタイム検出方法が提供された。 The present invention provides a novel nucleic acid real-time detection method capable of detecting a template nucleic acid in real time by a simple method.
上記の通り、本発明の方法では、二本鎖核酸にインターカレートするイオン性インターカレーターを用いる。本発明で用いるインターカレーターは、二本鎖核酸にインターカレートすることができ、イオン性であり、それと選択的に感応するイオン性電極を構築可能なものであれば特に限定されない。このようなイオン性インターカレーターは、アンモニウムイオンやホスホニウムイオンのような陽イオンが好ましい。ここで、アンモニウムイオンは、第２級〜第４級アンモニウムイオンであり、多くの場合、第４級アンモニウムイオンである。同様に、ホスホニウムイオンは、第２級〜第４級ホスホニウムイオンであり、多くの場合、第４級ホスホニウムイオンである。第４級アンモニウムイオンを含む（水中で電離してイオンが遊離される）インターカレーターの好ましい例として、エチジウムブロマイド等のエチジウム塩、SYBR Green I等のSYBR Greenシリーズ、SYBR Gold、Pico Green、オキサゾールイエロー、チアゾールオレンジ等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。第４級ホスホニウムイオンを含むインターカレーターの好ましい例としては、テトラフェニルホスホニウムイオン、シンナミルトリフェニルホスホニウムイオン及びブチルトリフェニルホスホニウムイオン等の塩（対の陰イオンは、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン等のハロゲンイオン）等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。 As described above, in the method of the present invention, an ionic intercalator that intercalates with a double-stranded nucleic acid is used. The intercalator used in the present invention is not particularly limited as long as it can intercalate with a double-stranded nucleic acid, is ionic, and can construct an ionic electrode that selectively reacts with it. Such an ionic intercalator is preferably a cation such as an ammonium ion or a phosphonium ion. Here, the ammonium ion is a secondary to quaternary ammonium ion, and is often a quaternary ammonium ion. Similarly, the phosphonium ion is a secondary to quaternary phosphonium ion, and is often a quaternary phosphonium ion. Preferred examples of intercalators containing quaternary ammonium ions (iones are released by ionization in water) include ethidium salts such as ethidium bromide, SYBR Green series such as SYBR Green I, SYBR Gold, Pico Green, and oxazole yellow , Thiazole orange and the like, but are not limited thereto. Preferred examples of intercalators containing quaternary phosphonium ions include salts such as tetraphenylphosphonium ion, cinnamyltriphenylphosphonium ion and butyltriphenylphosphonium ion (the pair of anions are chloride ion, bromide ion, iodine Halide ions such as chloride ions), etc., but are not limited thereto.
イオン選択性電極自体は周知であり、用いるイオン性インターカレーターと選択的に感応するものであれば特に限定されないが、イオン感応膜を持つものが好ましい。イオン感応膜は、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、シリコーンゴム等のポリマーから成る膜中に、目的イオンと選択的に錯体を形成するイオノフォアや必要に応じて可塑剤を配合したものが広く用いられている。イオン選択性電極のイオン感応膜に配合するイオノフォアとしては、イオン性インターカレーターがエチジウム塩のような、上記した陽イオン性インターカレーターの場合には、脂溶性のホウ酸塩（テトラフェニルホウ酸塩、テトラキス(4-クロロフェニル）ホウ酸塩、テトラキス[3,5-ビス(トリフルオロメチル)フェニル]ホウ酸塩、テトラキス[3,5-ビス(2-メトキシヘキサフルオロ-2-プロピル)フェニル] ホウ酸塩等）が挙げられるがこれらに限定されるものではない。 The ion-selective electrode itself is well known and is not particularly limited as long as it selectively reacts with the ionic intercalator to be used, but one having an ion-sensitive membrane is preferable. Ion-sensitive membranes are widely used in which a polymer made of polyvinyl chloride, polyvinyl acetate, silicone rubber, or other polymer is mixed with an ionophore that selectively forms a complex with the target ion and, if necessary, a plasticizer. ing. As an ionophore compounded in the ion-sensitive membrane of the ion-selective electrode, when the ionic intercalator is the above-described cationic intercalator such as ethidium salt, a fat-soluble borate (tetraphenylborate) , Tetrakis (4-chlorophenyl) borate, tetrakis [3,5-bis (trifluoromethyl) phenyl] borate, tetrakis [3,5-bis (2-methoxyhexafluoro-2-propyl) phenyl] boron Acid salts), but are not limited thereto.
本発明の方法では、上記イオン感応性電極を用いて核酸増幅反応溶液の電位をリアルタイムに測定しながら、上記インターカレーターの存在下で核酸増幅を行う。ここで、「イオン感応性電極を用いて核酸増幅反応溶液の電位をリアルタイムに測定」することは、上記したイオン感応性電極と、参照電極とを核酸増幅反応溶液中に浸漬し、これらの電極の間の電位差を電位差計で連続的に測定することにより実施することができる。 In the method of the present invention, nucleic acid amplification is performed in the presence of the intercalator while measuring the potential of the nucleic acid amplification reaction solution in real time using the ion-sensitive electrode. Here, “measurement of the potential of the nucleic acid amplification reaction solution in real time using the ion sensitive electrode” means that the above-described ion sensitive electrode and the reference electrode are immersed in the nucleic acid amplification reaction solution, Can be carried out by continuously measuring the potential difference between the two with a potentiometer.
本発明の方法において行う核酸増幅法は、二本鎖核酸が増幅される方法であれば、いずれの方法であってもよく、核酸は、上記イオン性インターカレーターがインターカレートできるならばDNAでもRNAでもよい。反応溶液中のインターカレーターの濃度は、高すぎても低すぎても鋳型核酸の定量が困難となるが、適切な濃度は、インターカレーターと二本鎖核酸との親和性や、増幅条件等に応じて適宜選択可能であり、ルーチンな実験により容易に選択することができる。例えばエチジウム塩をインターカレーターとして用いる場合、増幅反応開始時の反応溶液中のエチジウム塩の濃度は、通常、10-6M〜10-3M程度である。 The nucleic acid amplification method performed in the method of the present invention may be any method as long as a double-stranded nucleic acid is amplified. The nucleic acid may be DNA if the ionic intercalator can intercalate. RNA may be used. If the concentration of the intercalator in the reaction solution is too high or too low, it will be difficult to quantify the template nucleic acid, but the appropriate concentration depends on the affinity between the intercalator and the double-stranded nucleic acid, amplification conditions, etc. Accordingly, it can be selected as appropriate, and can be easily selected by a routine experiment. For example, when ethidium salt is used as an intercalator, the concentration of ethidium salt in the reaction solution at the start of the amplification reaction is usually about 10 −6 M to 10 −3 M.
二本鎖核酸が増幅される核酸増幅法自体は、例えば、PCR法、RCA法、PG-RCA法等、種々の方法が周知であり、これらのいずれをも採用することができる。これらの核酸増幅法のうち、PCRのように反応温度を変化させる必要がない、上記したRCA法（非特許文献１）や、制限酵素の存在下でRCAを行うPG-RCA法（非特許文献２）が好ましい。これらの核酸増幅法を行うためのキットや装置も市販されているので、それらを用いて容易に実施することができる。なお、PCRの場合、検出すべき核酸（ターゲット核酸）は、通常、鋳型核酸である。RCAやPG-RCAの場合は、鋳型核酸は環状DNAであるが、環状DNAの一部領域に、ターゲットDNA（RCAやPG-RCAではプライマーとして機能）と相補的な塩基配列を持つ、所定濃度の環状DNAを鋳型核酸として用いることにより、ターゲットDNAを検出することができる。あるいは、DNAリガーゼを用いる周知の方法によりターゲットDNAを環状化する（環状化DNAの一部として被検核酸が組み込まれる）ことも可能であり、この場合には、環状化されたターゲットDNAが検出される。なお、RCAやPG-RCAにおける、プライマーとして機能するターゲットDNAのサイズは、通常、１０〜５０塩基、好ましくは１４〜３０塩基、さらに好ましくは１８〜３０塩基程度である。 As the nucleic acid amplification method for amplifying double-stranded nucleic acid itself, various methods such as PCR method, RCA method, PG-RCA method and the like are well known, and any of these can be adopted. Among these nucleic acid amplification methods, there is no need to change the reaction temperature as in PCR, and the RCA method described above (Non-patent Document 1) or the PG-RCA method that performs RCA in the presence of a restriction enzyme (Non-patent Document) 2) is preferred. Kits and devices for performing these nucleic acid amplification methods are also commercially available, and can be easily implemented using them. In the case of PCR, the nucleic acid to be detected (target nucleic acid) is usually a template nucleic acid. In the case of RCA or PG-RCA, the template nucleic acid is circular DNA, but a partial concentration of the circular DNA has a base sequence complementary to the target DNA (functioning as a primer in RCA or PG-RCA). The target DNA can be detected by using the circular DNA as a template nucleic acid. Alternatively, the target DNA can be circularized by a well-known method using DNA ligase (the test nucleic acid is incorporated as part of the circularized DNA). In this case, the circularized target DNA is detected. Is done. In addition, the size of the target DNA functioning as a primer in RCA or PG-RCA is usually about 10 to 50 bases, preferably about 14 to 30 bases, and more preferably about 18 to 30 bases.
核酸の増幅が起きて二本鎖核酸が増幅すると、増幅反応溶液中に存在するイオン性インターカレーターは選択的に二本鎖核酸とインターカレートするので、反応溶液中の遊離のイオン性インターカレーター濃度が減少する。このため、上記イオン選択性電極を用いて測定される反応溶液の電位が変化する。一方、反応溶液中にターゲット核酸（鋳型核酸又はプライマー）が存在しない場合には、二本鎖核酸が増幅しないので、反応溶液の電位は変化しない。増幅核酸の濃度は、初期のターゲット核酸の濃度に依存するので、上記電位をリアルタイムに測定することにより、ターゲット核酸の初期濃度に依存した電位の変化が観察される。種々の既知量のターゲット核酸を含む標準試料についての測定結果に基づき検量線を作成しておけば、未知の試料中のターゲット核酸を定量することができる。なお、ターゲット核酸の定量は、必然的にターゲット核酸の検出を伴うので、本発明における「検出」は、定量をも包含するものである。 When nucleic acid amplification occurs and double-stranded nucleic acid is amplified, the ionic intercalator present in the amplification reaction solution selectively intercalates with the double-stranded nucleic acid, so that the free ionic intercalator in the reaction solution Concentration decreases. For this reason, the electric potential of the reaction solution measured using the ion selective electrode changes. On the other hand, when no target nucleic acid (template nucleic acid or primer) is present in the reaction solution, the double-stranded nucleic acid is not amplified, and the potential of the reaction solution does not change. Since the concentration of the amplified nucleic acid depends on the initial concentration of the target nucleic acid, a change in the potential depending on the initial concentration of the target nucleic acid is observed by measuring the potential in real time. If a calibration curve is prepared based on the measurement results of standard samples containing various known amounts of target nucleic acids, the target nucleic acids in unknown samples can be quantified. In addition, since quantification of the target nucleic acid inevitably involves detection of the target nucleic acid, “detection” in the present invention includes quantification.
本発明の方法により二本鎖増幅核酸を検出することにより、ターゲットDNA（PCRの場合には鋳型核酸、RCAやPG-RCAの場合はプライマーとして機能するターゲットDNA又はターゲットDNAを環状化した鋳型核酸）を検出することができる。 By detecting double-stranded amplified nucleic acid by the method of the present invention, target DNA (template nucleic acid in the case of PCR, target DNA functioning as a primer in the case of RCA or PG-RCA, or template nucleic acid obtained by circularizing target DNA) ) Can be detected.
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
１． 小型イオン選択性電極(ISE)の作製
内径1.0 mm、外径1.5 mmのシリコンチューブを用意した。それを約3 cmに切った。さらに、チューブの先端に膜溶液をつけ、乾燥させた。膜は、厚みをもたせるために2度漬けした。膜溶液は、テトラキス(4-クロロフェニル）ホウ酸カリウム（商品名KTpClPB、Fluka社製）、シラノール末端ポリメチルシロキサン（商品名Siloprene K1000、Sigma Aldrich社製）、及びSiloprene K1000（商品名）用架橋剤（商品名Siloprene crosslinking agent K-11 Sigma Aldrich社製）を各14 mg、302.4 mg、33.6 mg量りとり、これらを10 mlのガラススクリュー管中で無水THF（1 ml）に完全に均一に溶解したものであった。膜を乾燥させた後、チューブ内に内部溶液として飽和KClを注射針により入れた。さらに、シリコンキャップの中央にシリンジで穴を開け、塩化銀化した銀線を差し込んだ。銀線をチューブに入れ、上端をボンドで閉じた。密封性を高めるために、シリコンキャップ周辺をパラフィルム（商品名）で巻いた。最後にISEを、エチジウムブロマイド(10−5 M)を含むPG-RCAバッファー(10 mM Tris-HCl buffer（pH 7.0），10 mM NaCl，10 mM MgCl2）に半日以上浸し、コンディショニングを行った。PG-RCAバッファーに最終濃度10-3M〜10-7Mのエチジウムブロマイドを添加した標準溶液を作製し、参照電極を用いて各標準溶液の電位を測定することにより、作製したISEがエチジウムブロマイド感応性電極として機能することを確認した。
1. Fabrication of small ion selective electrode (ISE) A silicon tube having an inner diameter of 1.0 mm and an outer diameter of 1.5 mm was prepared. It was cut to about 3 cm. Further, a membrane solution was applied to the tip of the tube and dried. The film was soaked twice to give it a thickness. The membrane solution was tetrakis (4-chlorophenyl) potassium borate (trade name KTpClPB, manufactured by Fluka), silanol-terminated polymethylsiloxane (trade name: Siloprene K1000, manufactured by Sigma Aldrich), and a cross-linking agent for Siloprene K1000 (trade name). (Product name: Siloprene crosslinking agent K-11 manufactured by Sigma Aldrich) was weighed 14 mg, 302.4 mg, and 33.6 mg each, and these were completely and uniformly dissolved in anhydrous THF (1 ml) in a 10 ml glass screw tube. It was a thing. After the membrane was dried, saturated KCl as an internal solution was put into the tube with an injection needle. Furthermore, a hole was made with a syringe in the center of the silicon cap, and a silver chloride silver wire was inserted. A silver wire was placed in the tube and the upper end was closed with a bond. In order to improve the sealing performance, the periphery of the silicon cap was wrapped with parafilm (trade name). Finally, ISE was immersed in a PG-RCA buffer (10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0), 10 mM NaCl, 10 mM MgCl 2 ) containing ethidium bromide (10 −5 M) for more than half a day for conditioning. Prepare a standard solution in which ethidium bromide with a final concentration of 10 -3 M to 10 -7 M is added to PG-RCA buffer, and measure the potential of each standard solution using a reference electrode. It was confirmed that it functions as a sensitive electrode.
２． PG-RCAにおけるリアルタイム電位測定
用いた環状化DNA（７３塩基、ニッポンジーン社製）及びターゲットDNA（１４塩基、ジーンデザイン社製）の塩基配列は次のとおりである。
環状化DNA 5'-phos- GTG GTT GTC TTC TCC TCA GCT CTA TCG GAT TTG TAT CTC TCC TCA GCC TAT CGG ATT TGT ATC TCT AAG CAG T-3'（配列番号１）
ターゲットDNA (5'-CAA CCA CAC TGC TT-3'（配列番号２）
2. Real-time potential measurement in PG-RCA The base sequences of the circularized DNA (73 bases, manufactured by Nippon Gene) and the target DNA (14 bases, manufactured by Gene Design) were as follows.
Circularized DNA 5'-phos- GTG GTT GTC TTC TCC TCA GCT CTA TCG GAT TTG TAT CTC TCC TCA GCC TAT CGG ATT TGT ATC TCT AAG CAG T-3 '(SEQ ID NO: 1)
Target DNA (5'-CAA CCA CAC TGC TT-3 '(SEQ ID NO: 2)
ターゲットDNAを、10pM、100pM又は1nMの最終濃度で含むPG-RCA反応溶液を調製した。対照として、ターゲットDNAを含まない溶液も調製した。なお、用いた試薬や酵素は全て市販品である。各反応溶液の組成を下記表１〜表４に示す。 A PG-RCA reaction solution containing the target DNA at a final concentration of 10 pM, 100 pM or 1 nM was prepared. As a control, a solution containing no target DNA was also prepared. All reagents and enzymes used are commercially available products. The composition of each reaction solution is shown in Tables 1 to 4 below.
上記したISE電極と、参照電極を反応溶液に浸漬し、各電極を電位差計に接続して、増幅反応中、反応開始時から反応開始後150分までリアルタイムに反応溶液の電位（各電極間の電位差）を測定した。結果を図１に示す。ターゲットDNAの初期濃度に依存して、測定された電位が異なっていることがわかる。ターゲットDNAを含む場合の測定値から対照の測定値を引いた差分の経時変化を図２に示す。図２に示す通り、ターゲットDNAの初期濃度が大きいほど、測定された電位差が小さくなっており、本発明の方法によりターゲットDNAの定量が可能であることがわかった。 Immerse the above ISE electrode and reference electrode in the reaction solution and connect each electrode to a potentiometer. During the amplification reaction, the reaction solution potential (between each electrode) is measured in real time from the start of the reaction to 150 minutes after the start of the reaction. (Potential difference) was measured. The results are shown in FIG. It can be seen that the measured potential varies depending on the initial concentration of the target DNA. FIG. 2 shows the change over time in the difference obtained by subtracting the control measurement value from the measurement value when the target DNA is included. As shown in FIG. 2, the larger the initial concentration of the target DNA, the smaller the measured potential difference. It was found that the target DNA can be quantified by the method of the present invention.
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57198858A (en) * | 1981-06-01 | 1982-12-06 | Hitachi Ltd | Cation selective electrode |
| JP2011523556A (en) * | 2008-06-05 | 2011-08-18 | ユニベルシテ パリ ディドロ−パリ ７ | Electrochemical identification method and apparatus for target nucleotide sequence |
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57198858A (en) * | 1981-06-01 | 1982-12-06 | Hitachi Ltd | Cation selective electrode |
| JP2011523556A (en) * | 2008-06-05 | 2011-08-18 | ユニベルシテ パリ ディドロ−パリ ７ | Electrochemical identification method and apparatus for target nucleotide sequence |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| BLANTON ET AL., BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, vol. 102, no. 1, JPN6018007151, 16 September 1981 (1981-09-16), pages 219 - 225 * |
| CHEMICAL REVIEWS, vol. 112, no. 6, JPN6018007156, June 2012 (2012-06-01), pages 3427 - 3481 * |
| LEE ET AL., ELECTROANALYSIS, vol. 25, no. 5, JPN6018007153, 4 March 2013 (2013-03-04), pages 1310 - 1315 * |
| 矢野敏之、西勝英, 日本薬理学雑誌, vol. 102, no. 4, JPN6018007158, 1993, JP, pages 271 - 277 * |
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