JP2015151367A - ３−デアザプリンヌクレオシド誘導体、３−デアザプリンヌクレオチド誘導体及びポリヌクレオチド誘導体 - Google Patents
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Abstract
【課題】従来とは異なる新しいコンセプトで生体内の微細環境をモニタリングすることを可能にするプローブの提供。
【解決手段】下記式（Ｉ）又は（ＩＩ）：
【化２７】
［式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、１−ナフチル基又は２−ナフチル基などの縮合環であり、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又は水酸基である。］で示される３−デアザプリンヌクレオシド誘導体を用いる。
【選択図】図１
【解決手段】下記式（Ｉ）又は（ＩＩ）：
【化２７】
［式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、１−ナフチル基又は２−ナフチル基などの縮合環であり、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又は水酸基である。］で示される３−デアザプリンヌクレオシド誘導体を用いる。
【選択図】図１
Description
本発明は、３−デアザプリンヌクレオシドのＣ３位に、三重結合を介して、置換基を持たない特定の芳香族化合物である蛍光分子が導入されてなる３−デアザプリンヌクレオシド誘導体に関する。また本発明は、該３−デアザプリンヌクレオシド誘導体を含むデアザプリンヌクレオチド誘導体、さらには少なくとも１つのヌクレオチドが該デアザプリンヌクレオチド誘導体で置換されてなるポリヌクレオチド誘導体に関する。
周囲の極性環境の違いによって蛍光発光波長を変化させる化合物については、これまでに多く報告されている。同様のヌクレオシドについてもいくつかの報告例がある。
本願発明者らも、次式で示されるプリン塩基のＣ８位に二重結合又は三重結合を介して蛍光分子を導入してなる化合物が周囲の極性環境の違いによって蛍光発光波長を大きく変化させることを報告した（特許文献１：特開２０１１−３７７９６号公報）。
また、次式で示されるプリン塩基のＣ７位に二重結合又は三重結合を介して蛍光分子を導入してなる化合物が周囲の極性環境の違いによって蛍光発光波長を大きく変化させることを報告した（特許文献２：特開２０１３−１５９５７４号公報）。
周囲の極性環境の違いによって蛍光発光波長を変化させる化合物は、対象物質の極性環境の変化を色の違いによって検出できるため、遺伝子検出用のプローブ、タンパク質又は細胞内の局所的な極性環境の調査用プローブなどとしての利用が期待される。例えば、ＤＮＡ中の識別したい塩基の対面に蛍光ヌクレオシドを導入したプローブＤＮＡを作製し、対面塩基とのマッチ−ミスマッチの違いによる周辺極性環境の変化を利用することで、目的とする塩基の種類を色の違いで識別することができるため、このような化合物は遺伝子検出用のプローブとして有用である。
しかし、一般的に、プリン塩基のＣ８位に置換基を導入すると、置換基とＤＮＡの糖−リン酸バックボーンとが衝突し、その上、ヌクレオシドの糖と塩基とが通常のａｎｔｉ配座からｓｙｎ配座へと反転しやすくなってしまうため、Ｃ８位に置換基を導入したヌクレオシドを用いた場合にはＤＮＡの二重らせん構造が不安定化することが知られている。ＤＮＡの二重らせん構造が不安定化すると、その影響によっても周囲の極性環境が変化してしまうため、蛍光ヌクレオシドと対面塩基とのマッチ−ミスマッチの違いによる周辺極性環境の変化を正確に検出できない場合がある。
また、プリン塩基のＣ７位に置換基を導入した化合物は、ＤＮＡの二重らせん構造を不安定化しない点では優れているが、一般的にマッチすると考えられるチミン塩基の他に、シトシン塩基とも水素結合を形成する場合があり、塩基識別能の点で改良の余地がある。また、この化合物を用いた場合、ＤＮＡのメジャーグルーブに蛍光色素を導入することになるが、この位置に導入された蛍光色素は上下のＧＣ塩基対により強く蛍光消光されてしまい、利用できるＤＮＡ配列に制限があった。
本願発明者らも、次式で示されるプリン塩基のＣ８位に二重結合又は三重結合を介して蛍光分子を導入してなる化合物が周囲の極性環境の違いによって蛍光発光波長を大きく変化させることを報告した（特許文献１：特開２０１１−３７７９６号公報）。
また、次式で示されるプリン塩基のＣ７位に二重結合又は三重結合を介して蛍光分子を導入してなる化合物が周囲の極性環境の違いによって蛍光発光波長を大きく変化させることを報告した（特許文献２：特開２０１３−１５９５７４号公報）。
周囲の極性環境の違いによって蛍光発光波長を変化させる化合物は、対象物質の極性環境の変化を色の違いによって検出できるため、遺伝子検出用のプローブ、タンパク質又は細胞内の局所的な極性環境の調査用プローブなどとしての利用が期待される。例えば、ＤＮＡ中の識別したい塩基の対面に蛍光ヌクレオシドを導入したプローブＤＮＡを作製し、対面塩基とのマッチ−ミスマッチの違いによる周辺極性環境の変化を利用することで、目的とする塩基の種類を色の違いで識別することができるため、このような化合物は遺伝子検出用のプローブとして有用である。
しかし、一般的に、プリン塩基のＣ８位に置換基を導入すると、置換基とＤＮＡの糖−リン酸バックボーンとが衝突し、その上、ヌクレオシドの糖と塩基とが通常のａｎｔｉ配座からｓｙｎ配座へと反転しやすくなってしまうため、Ｃ８位に置換基を導入したヌクレオシドを用いた場合にはＤＮＡの二重らせん構造が不安定化することが知られている。ＤＮＡの二重らせん構造が不安定化すると、その影響によっても周囲の極性環境が変化してしまうため、蛍光ヌクレオシドと対面塩基とのマッチ−ミスマッチの違いによる周辺極性環境の変化を正確に検出できない場合がある。
また、プリン塩基のＣ７位に置換基を導入した化合物は、ＤＮＡの二重らせん構造を不安定化しない点では優れているが、一般的にマッチすると考えられるチミン塩基の他に、シトシン塩基とも水素結合を形成する場合があり、塩基識別能の点で改良の余地がある。また、この化合物を用いた場合、ＤＮＡのメジャーグルーブに蛍光色素を導入することになるが、この位置に導入された蛍光色素は上下のＧＣ塩基対により強く蛍光消光されてしまい、利用できるＤＮＡ配列に制限があった。
このような状況の下、従来の分子の良い光学特性を維持しつつ、ＤＮＡに導入した場合にもＤＮＡの二重らせん構造を不安定化せず、塩基識別能に優れた新規な蛍光核酸及びそれを利用したプローブの開発が求められている。
また、極性環境の違いをモニタリングするだけでは、生体分子内での波長の変化が十分ではないため、従来とは異なる新しいコンセプトで生体内の微細環境をモニタリングすることを可能にする新しいアイディアが求められている。
また、極性環境の違いをモニタリングするだけでは、生体分子内での波長の変化が十分ではないため、従来とは異なる新しいコンセプトで生体内の微細環境をモニタリングすることを可能にする新しいアイディアが求められている。
本願発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討した結果、３−デアザプリンヌクレオシドのＣ３位に、三重結合を介して、置換基を持たない特定の芳香族化合物である蛍光分子が導入されてなる３−デアザプリンヌクレオシド誘導体が、周辺の粘度環境に応じて分子構造を変化させ、分子のねじれに応じた発光波長を示すことができ、従来とは異なる新しいコンセプトで生体内の微細環境をモニタリングできることが判った。生体内には様々な局所的な粘度の違いが存在するが、本発明の３−デアザプリンヌクレオシド誘導体を用いることで、蛍光発光色の違いにより粘度環境が判るようになるため、それらの検出試薬として利用することができる。
さらに、ＤＮＡ中の識別したい塩基の対面にこの３−デアザプリンヌクレオシド誘導体を導入したプローブＤＮＡを用いることにより、ＤＮＡの二重らせん構造を不安定化することなく、塩基識別能が格段に向上することも判った。例えば、本発明の３−デアザプリンヌクレオシド誘導体を含むプローブＤＮＡは、対面塩基がマッチのＴの時のみ塩基対を形成することが確認できた。また、これに伴い、対面塩基がフルマッチのＴの時のみ、従来見られないほどの大きな発光波長シフトが観察され、チミン識別プローブとして十分に利用できることが判った。
また、本発明の３−デアザプリンヌクレオシド誘導体は、３−デアザプリンヌクレオシドのＣ３位に蛍光分子が結合していることで、ＤＮＡのマイナーグルーブに蛍光色素を導入することが可能であり、上下のＧＣ塩基対による蛍光消光が見られないため、利用できるＤＮＡ配列に制限がなく、ＤＮＡプローブとして応用の幅が広がることを見出し、本発明を完成させるに至った。
さらに、ＤＮＡ中の識別したい塩基の対面にこの３−デアザプリンヌクレオシド誘導体を導入したプローブＤＮＡを用いることにより、ＤＮＡの二重らせん構造を不安定化することなく、塩基識別能が格段に向上することも判った。例えば、本発明の３−デアザプリンヌクレオシド誘導体を含むプローブＤＮＡは、対面塩基がマッチのＴの時のみ塩基対を形成することが確認できた。また、これに伴い、対面塩基がフルマッチのＴの時のみ、従来見られないほどの大きな発光波長シフトが観察され、チミン識別プローブとして十分に利用できることが判った。
また、本発明の３−デアザプリンヌクレオシド誘導体は、３−デアザプリンヌクレオシドのＣ３位に蛍光分子が結合していることで、ＤＮＡのマイナーグルーブに蛍光色素を導入することが可能であり、上下のＧＣ塩基対による蛍光消光が見られないため、利用できるＤＮＡ配列に制限がなく、ＤＮＡプローブとして応用の幅が広がることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、以下に示した３−デアザプリンヌクレオシド誘導体、３−デアザプリンヌクレオチド誘導体及び少なくとも１つのヌクレオチドが３−デアザプリンヌクレオシド誘導体であるポリヌクレオチド誘導体ならびに該３−デアザプリンヌクレオシド誘導体またはポリヌクレオチド誘導体を含むプローブに関するものである。
［１］下記式（Ｉ）又は（ＩＩ）：
［式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、下記式：
で示される縮合環であり、
Ｒａ及びＲｂは、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又は水酸基である。］
で示される３−デアザプリンヌクレオシド誘導体。
［２］前記Ｒａ及びＲｂが、水素原子である、［１］に記載の３−デアザプリンヌクレオシド誘導体。
［３］前記Ｒ１及びＲ２が、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、下記式：
で示される縮合環である、［１］又は［２］に記載の３−デアザプリンヌクレオシド誘導体。
［４］生体内の粘度環境の変化をモニタリングするためのものである、［１］〜［３］のいずれか一項に記載のデアザプリンヌクレオシド誘導体を含むプローブ。
［５］下記式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）：
［式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、下記式：
で示される縮合環であり、
Ｒａ及びＲｂは、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又は水酸基であり、
ｓ及びｔは、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、１、２又は３である。］
で示される３−デアザプリンヌクレオチド誘導体。
［６］前記Ｒａ及びＲｂが、水素原子である、［５］に記載の３−デアザプリンヌクレオチド誘導体。
［７］前記Ｒ１及びＲ２は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、下記式：
で示される縮合環である、［５］又は［６］に記載の３−デアザプリンヌクレオチド誘導体。
［８］ポリヌクレオチドにおいて少なくとも１つのヌクレオチドが［５］〜［７］のいずれか一項に記載のデアザプリンヌクレオチド誘導体で置換されてなるポリヌクレオチド誘導体。
［９］［８］に記載のポリヌクレオチド誘導体を含むプローブ。
［１０］生体内の粘度環境をモニタリングするためのものである、［９］に記載のプローブ。
［１］下記式（Ｉ）又は（ＩＩ）：
［式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、下記式：
で示される縮合環であり、
Ｒａ及びＲｂは、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又は水酸基である。］
で示される３−デアザプリンヌクレオシド誘導体。
［２］前記Ｒａ及びＲｂが、水素原子である、［１］に記載の３−デアザプリンヌクレオシド誘導体。
［３］前記Ｒ１及びＲ２が、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、下記式：
で示される縮合環である、［１］又は［２］に記載の３−デアザプリンヌクレオシド誘導体。
［４］生体内の粘度環境の変化をモニタリングするためのものである、［１］〜［３］のいずれか一項に記載のデアザプリンヌクレオシド誘導体を含むプローブ。
［５］下記式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）：
［式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、下記式：
で示される縮合環であり、
Ｒａ及びＲｂは、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又は水酸基であり、
ｓ及びｔは、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、１、２又は３である。］
で示される３−デアザプリンヌクレオチド誘導体。
［６］前記Ｒａ及びＲｂが、水素原子である、［５］に記載の３−デアザプリンヌクレオチド誘導体。
［７］前記Ｒ１及びＲ２は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、下記式：
で示される縮合環である、［５］又は［６］に記載の３−デアザプリンヌクレオチド誘導体。
［８］ポリヌクレオチドにおいて少なくとも１つのヌクレオチドが［５］〜［７］のいずれか一項に記載のデアザプリンヌクレオチド誘導体で置換されてなるポリヌクレオチド誘導体。
［９］［８］に記載のポリヌクレオチド誘導体を含むプローブ。
［１０］生体内の粘度環境をモニタリングするためのものである、［９］に記載のプローブ。
本発明によれば、３−デアザプリン塩基のＣ３位に三重結合を介して蛍光分子を導入してなる３−デアザプリンヌクレオシド誘導体、該デアザプリンヌクレオシド誘導体にリン酸がエステル結合してなるデアザプリンヌクレオチド誘導体、さらには少なくとも１つのヌクレオチドが、該デアザプリンヌクレオチド誘導体で置換されてなるポリヌクレオチド誘導体が得られる。
本発明の好ましい態様によれば、本発明の３−デアザプリンヌクレオシド誘導体は、周囲の粘度環境に応じて分子構造を変化させ、分子のねじれに応じた発光波長を示すことができる。この性質を利用して、本発明の３−デアザプリンヌクレオシド誘導体を、例えば生体内の粘度環境の変化をモニタリングするためのプローブとして用いることができる。
また、本発明の３−デアザプリンヌクレオシド誘導体を導入してなるポリヌクレオチド誘導体は、周囲の粘度環境の変化を蛍光発光色の違いによって検出することができるので、ヌクレオシド誘導体又はオリゴヌクレオチド鎖の局在する粘度環境の検出ができるようになる。生体内には様々な局所的な粘度の違いが存在するが、本発明の好ましい態様によれば、蛍光発光色の違いにより粘度環境が判るようになるので、それらの検出試薬として利用可能である。
さらに、本発明の３−デアザプリンヌクレオシド誘導体を導入してなるポリヌクレオチド誘導体を用いることで、高粘度の状況と同様な分子の回転を抑制する環境をモニタリングすることもできる。この性質を利用することで、生体内の様々な局所的な環境をモニタリングすることができる。
本発明の好ましい態様によれば、本発明の３−デアザプリンヌクレオシド誘導体は、周囲の粘度環境に応じて分子構造を変化させ、分子のねじれに応じた発光波長を示すことができる。この性質を利用して、本発明の３−デアザプリンヌクレオシド誘導体を、例えば生体内の粘度環境の変化をモニタリングするためのプローブとして用いることができる。
また、本発明の３−デアザプリンヌクレオシド誘導体を導入してなるポリヌクレオチド誘導体は、周囲の粘度環境の変化を蛍光発光色の違いによって検出することができるので、ヌクレオシド誘導体又はオリゴヌクレオチド鎖の局在する粘度環境の検出ができるようになる。生体内には様々な局所的な粘度の違いが存在するが、本発明の好ましい態様によれば、蛍光発光色の違いにより粘度環境が判るようになるので、それらの検出試薬として利用可能である。
さらに、本発明の３−デアザプリンヌクレオシド誘導体を導入してなるポリヌクレオチド誘導体を用いることで、高粘度の状況と同様な分子の回転を抑制する環境をモニタリングすることもできる。この性質を利用することで、生体内の様々な局所的な環境をモニタリングすることができる。
以下、本発明の３−デアザプリンヌクレオシド誘導体、３−デアザプリンヌクレオチド誘導体、ポリヌクレオチド誘導体及びプローブ等について詳細に説明する。
本発明の３−デアザプリンヌクレオシド誘導体は、下記式（Ｉ）又は（ＩＩ）で示される化合物である。
［式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、下記式：
で示される縮合環であり、
Ｒａ及びＲｂは、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又は水酸基である。］
［式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、下記式：
で示される縮合環であり、
Ｒａ及びＲｂは、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又は水酸基である。］
本発明の３−デアザプリンヌクレオシド誘導体は、３−デアザプリン骨格のＣ３位に炭素−炭素三重結合を介して蛍光分子を導入するように設計されている。本発明の３−デアザプリンヌクレオシド誘導体は、周辺の粘度環境に応じて分子構造を変化させ、分子のねじれに応じた発光波長を示すことができる。本発明の好ましい態様では、この性質を利用して、本発明の３−デアザプリンヌクレオシド誘導体を例えば生体内の粘度環境の変化をモニタリングするためのプローブとして用いることができる。
本発明の３−デアザプリンヌクレオシド誘導体において、３−デアザプリン塩基と結合する五炭糖は、２−デオキシリボースでもリボースでもよく、式中、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又は水酸基である。本発明の３−デアザプリンヌクレオシド誘導体をヌクレオチドに導入してＤＮＡ型のプローブとして用いるときは、Ｒａ及びＲｂは水素原子が好ましく、ＲＮＡ型のプローブとして用いるときは、Ｒａ及びＲｂはそれぞれ水酸基が好ましい。
式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、下記式：
で示される縮合環である。なお、式中、＊は、三重結合への結合位置を示している。これらの中でも、ＤＮＡのマイナーグルーブに蛍光色素を導入する際に収まりがよいことから、ナフチル基、キノリル基及びイソキノリル基からなる群から選ばれる縮合環であることが好ましく、下記式で示される１−ナフチル基又は２−ナフチル基が特に好ましい。
で示される縮合環である。なお、式中、＊は、三重結合への結合位置を示している。これらの中でも、ＤＮＡのマイナーグルーブに蛍光色素を導入する際に収まりがよいことから、ナフチル基、キノリル基及びイソキノリル基からなる群から選ばれる縮合環であることが好ましく、下記式で示される１−ナフチル基又は２−ナフチル基が特に好ましい。
上記のとおり、本発明の３−デアザプリンヌクレオシド誘導体は、３−デアザプリン骨格のＣ３位に三重結合を介して置換基を持たない特定の縮合環を含む蛍光分子を導入し、核酸塩基部位と縮合環部位とがπ共役系を形成できるように設計されている。例えば、低粘度の環境下では、核酸塩基部位と縮合環部位とのπ共役系が繋がり、縮合環部位のみによる発光と比べて長波長側に極大をもつブロードな発光が見られる。これは、分子内電荷移動状態（Intra-molecular Charge Transfer State: ICT）による発光が生じているためであると考えられる。
他方、高粘度の環境下では、分子構造にねじれが発生し、縮合環部位のみによる発光が見られ、短波長側に極大をもつ先の尖った発光が見られる。これは、高粘度のために分子の回転が抑制されてπ共役系が分断され、結果として波長の低い縮合環部位のみによる
局所励起状態（Locally Excited State: LE）による発光が見られるためであると考えられる。
このように本発明の３−デアザプリンヌクレオシド誘導体は、周囲の粘度環境によって二つの蛍光帯を示すいわゆる二重蛍光という特徴的な性質を有しており、周囲の粘度環境の変化を蛍光発光色の違いによって識別することが可能である。また、本発明の３−デアザプリンヌクレオシド誘導体は、高粘度の環境と同様な分子の回転を抑制する環境の変化を識別することも可能である。
他方、高粘度の環境下では、分子構造にねじれが発生し、縮合環部位のみによる発光が見られ、短波長側に極大をもつ先の尖った発光が見られる。これは、高粘度のために分子の回転が抑制されてπ共役系が分断され、結果として波長の低い縮合環部位のみによる
局所励起状態（Locally Excited State: LE）による発光が見られるためであると考えられる。
このように本発明の３−デアザプリンヌクレオシド誘導体は、周囲の粘度環境によって二つの蛍光帯を示すいわゆる二重蛍光という特徴的な性質を有しており、周囲の粘度環境の変化を蛍光発光色の違いによって識別することが可能である。また、本発明の３−デアザプリンヌクレオシド誘導体は、高粘度の環境と同様な分子の回転を抑制する環境の変化を識別することも可能である。
本発明の３−デアザプリンヌクレオシド誘導体は、３−デアザアデノシン又は３−デアザグアノシンなどのＣ３位に蛍光分子を導入することにより簡便に製造することができる。例えば、３−ヨード−３−デアザプリンヌクレオシド誘導体又は３−ブロモ−３−デアザプリンヌクレオシド誘導体を合成し、これに所望の縮合環を導入することによって簡便に製造することができる。
本発明の式（Ｉ）で示されるデアザプリンヌクレオシド誘導体は、例えば、下記のスキームに従って製造することができる。
［式中、ＸはＩ又はＢｒであり、Ｒ１は、式（Ｉ）中のＲ１と同義である。］
［式中、ＸはＩ又はＢｒであり、Ｒ１は、式（Ｉ）中のＲ１と同義である。］
まず、化合物Ａ、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）、ヨウ化銅及び化合物ａを溶媒に溶かし、これにトリエチルアミンを加えて、４０〜６０℃の範囲内で１〜４時間撹拌する。その後、反応溶媒を留去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーなどを用いて精製して目的の化合物Ｉを得ることができる。
化合物ａは、化合物Ａに対して等モルないしやや過剰に用いることが好ましく、その使用量は、化合物Ａに対して１．２〜２．０（モル倍量）が好ましい。
テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）及びヨウ化銅は、触媒量で用いればよく、化合物Ａに対して０．０１〜０．１（モル倍量）が好ましい。
トリエチルアミンは、化合物Ａに対して５〜１０（モル倍量）の範囲で用いることが好ましい。
溶媒は、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテルなどのエーテル系溶媒、塩化メチレン、ｏ−ジクロロベンゼンなどのハロゲン化炭化水素、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などのアミド、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族化合物などを用いることができる。
化合物ａは、化合物Ａに対して等モルないしやや過剰に用いることが好ましく、その使用量は、化合物Ａに対して１．２〜２．０（モル倍量）が好ましい。
テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）及びヨウ化銅は、触媒量で用いればよく、化合物Ａに対して０．０１〜０．１（モル倍量）が好ましい。
トリエチルアミンは、化合物Ａに対して５〜１０（モル倍量）の範囲で用いることが好ましい。
溶媒は、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテルなどのエーテル系溶媒、塩化メチレン、ｏ−ジクロロベンゼンなどのハロゲン化炭化水素、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などのアミド、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族化合物などを用いることができる。
なお、化合物Ａは、例えば、Journal of the American Chemical Society 125 (2003) 9970-9982及びChemBioChem 9 (2008) 464-470に記載の方法に準拠して合成することができる。化合物Ａの合成例を実施例１に示す。
本発明の式（ＩＩ）で示されるデアザプリンヌクレオシド誘導体は、例えば、下記のスキームに従って製造することができる。
［式中、ＸはＩ又はＢｒであり、Ｒ２は、式（ＩＩ）中のＲ２と同義である。］
［式中、ＸはＩ又はＢｒであり、Ｒ２は、式（ＩＩ）中のＲ２と同義である。］
まず、化合物Ｂ、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）、ヨウ化銅及び化合物ｂを溶媒に溶かし、これにトリエチルアミンを加えて、４０〜６０℃の範囲内で１〜４時間撹拌する。その後、反応溶媒を留去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーなどを用いて精製して目的の化合物ＩＩを得ることができる。
化合物ｂは、化合物Ｂに対して等モルないしやや過剰に用いることが好ましく、その使用量は、化合物Ｂに対して１．２〜２．０（モル倍量）が好ましい。
テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）及びヨウ化銅は、触媒量で用いればよく、化合物Ｂに対して０．０１〜０．１（モル倍量）が好ましい。
トリエチルアミンは、化合物Ｂに対して５〜１０（モル倍量）の範囲で用いることが好ましい。
溶媒は、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテルなどのエーテル系溶媒、塩化メチレン、ｏ−ジクロロベンゼンなどのハロゲン化炭化水素、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などのアミド、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族化合物などを用いることができる。
化合物ｂは、化合物Ｂに対して等モルないしやや過剰に用いることが好ましく、その使用量は、化合物Ｂに対して１．２〜２．０（モル倍量）が好ましい。
テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）及びヨウ化銅は、触媒量で用いればよく、化合物Ｂに対して０．０１〜０．１（モル倍量）が好ましい。
トリエチルアミンは、化合物Ｂに対して５〜１０（モル倍量）の範囲で用いることが好ましい。
溶媒は、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテルなどのエーテル系溶媒、塩化メチレン、ｏ−ジクロロベンゼンなどのハロゲン化炭化水素、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などのアミド、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族化合物などを用いることができる。
なお、化合物Ｂは、例えば、Tetrahedron 49 (1993) 557-570、Chemical and Pharmaceutical Bulletin 44 (1996) 288-295及びThe Journal of Organic Chemistry 64 (1999) 7158-7172に記載の方法に従って合成することができる。
本発明の好ましい態様によれば、本発明の３−デアザプリンヌクレオシド誘導体を用いることで局所的な粘度環境の変化を蛍光発光色の違いによって検出することができる。例えば、本発明の３−デアザプリンヌクレオシド誘導体を用いることにより、生体内等の局所的な粘度環境の変化をモニタリングすることができる。
また、本発明の３−デアザプリンヌクレオシド誘導体をタンパク質又は核酸などの生体高分子と相互作用させ、それに伴う立体障害により高粘度と同様な蛍光色素部位の分子回転を抑制する環境を作り出すことにより、タンパク質又はオリゴヌクレオチド鎖の相互作用を利用したＳＮＰｓタイピング（疾患または薬物代謝等に関係する遺伝子に存在するＳＮＰｓ（single nucleotide polymorphism）の塩基情報の解析）等に利用することもできる。
また、本発明の３−デアザプリンヌクレオシド誘導体をタンパク質又は核酸などの生体高分子と相互作用させ、それに伴う立体障害により高粘度と同様な蛍光色素部位の分子回転を抑制する環境を作り出すことにより、タンパク質又はオリゴヌクレオチド鎖の相互作用を利用したＳＮＰｓタイピング（疾患または薬物代謝等に関係する遺伝子に存在するＳＮＰｓ（single nucleotide polymorphism）の塩基情報の解析）等に利用することもできる。
次に、本発明の３−デアザプリンヌクレオチド誘導体について述べる。
本発明の３−デアザプリンヌクレオチド誘導体は、上述した本発明の３−デアザプリンヌクレオシド誘導体にリン酸がエステル結合した化合物であり、
下記式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）：
［式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、下記式：
で示される縮合環であり、
Ｒａ及びＲｂは、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又は水酸基であり、
ｓ及びｔは、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、１、２又は３である。］
で示される。
本発明の３−デアザプリンヌクレオチド誘導体は、上述した本発明の３−デアザプリンヌクレオシド誘導体にリン酸がエステル結合した化合物であり、
下記式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）：
［式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、下記式：
で示される縮合環であり、
Ｒａ及びＲｂは、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又は水酸基であり、
ｓ及びｔは、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、１、２又は３である。］
で示される。
式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）におけるＲ１、Ｒ２、Ｒａ及びＲｂは、式（Ｉ）又は（ＩＩ）におけるＲ１、Ｒ２、Ｒａ及びＲｂと同義であり、好ましい例も同じである。
ｓ及びｔはそれぞれ１、２又は３であるが、１又は３が好ましく、ポリヌクレオチド誘導体に容易に導入できることから３が特に好ましい。
ｓ及びｔはそれぞれ１、２又は３であるが、１又は３が好ましく、ポリヌクレオチド誘導体に容易に導入できることから３が特に好ましい。
本発明の３−デアザプリンヌクレオチド誘導体（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）の一リン酸体（ｓ，ｔ＝１）は、通常、本発明の３−デアザプリンヌクレオシド誘導体（Ｉ）又は（ＩＩ）をトリメチルホスファイトなどの溶媒に溶解し、０℃でオキシ塩化リンを加えて反応させた後に水を加えることで簡単に合成することができる。また、三リン酸体（ｓ，ｔ＝３）は、水を加える前にトリブチルアンモニウムピロリン酸（二リン酸）を加えるステップを加えることを除いて一リン酸体と同様にして合成することができる。
また、本発明の３−デアザプリンヌクレオチド誘導体（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）の三リン酸体は、ＰＣＲ法を用いてＤＮＡに容易に導入することができ、ポリヌクレオチドにおいて少なくとも１つのヌクレオチドが本発明のヌクレオチド誘導体で置換された本発明のポリヌクレオチド誘導体を得ることができる。あるいは、実施例３に示したように、本発明の３−デアザプリンヌクレオシド誘導体にＮ，Ｎ−ジ−ｎ−ブチルホルムアミドジメチルアセタールを反応させ、その後、触媒量の４，４’−ジメトキシトリチルクロリドを加えて反応させて得られる化合物を、トリエチルアミンの存在下、更に２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミジトと反応させて、得られたアミジト体を直接ＤＮＡ自動合成機にかけることで、本発明のポリヌクレオチド誘導体を得ることができる。
本発明のポリヌクレオチド誘導体は、ポリヌクレオチドにおいて少なくとも一つのヌクレオチドが、本発明の３−デアザプリンヌクレオチド誘導体で置換されてなるものである。
本発明において、ポリヌクレオチド誘導体はオリゴヌクレオチド誘導体であってもよい。本発明の３−デアザプリンオリゴヌクレオチド誘導体の塩基数は特に制限されなく、例えば２から１０００が好ましく、２から２００がより好ましく、２から１００が特に好ましい。
本発明において、ポリヌクレオチド誘導体はオリゴヌクレオチド誘導体であってもよい。本発明の３−デアザプリンオリゴヌクレオチド誘導体の塩基数は特に制限されなく、例えば２から１０００が好ましく、２から２００がより好ましく、２から１００が特に好ましい。
本発明の３−デアザプリンヌクレオシド誘導体を用いることで局所的な粘度環境の違いを蛍光発光色の変化によって検出することができる。この性質を利用して、本発明の３−デアザプリンヌクレオシド誘導体を、例えば、生体内等の局所的な粘度環境の変化をモニタリングするためのプローブとして用いることができる。
本発明のポリヌクレオチド誘導体は、ＲＮＡｉなどの細胞内における局在環境の粘度に関する情報をモニタリングすることができる。さらにこの手法を発展させることもできる。例えば、本発明のポリヌクレオチド誘導体をタンパク質又は核酸などの生体高分子と相互作用させ、それに伴う立体障害により高粘度と同様の蛍光色素部位の分子回転を抑制する環境を作り出すことにより、タンパク質又はオリゴヌクレオチド鎖の相互作用を利用したＳＮＰｓタイピング（疾患または薬物代謝等に関係する遺伝子に存在するＳＮＰｓ（single nucleotide polymorphism）の塩基情報の解析）等に利用することも可能である。
また、本発明の３−デアザプリンヌクレオシド誘導体は、３−デアザプリン骨格のＣ３位に蛍光分子を導入したことにより、ＤＮＡ中の幅の狭い溝であるマイナーグルーブに蛍光色素部位を導入することができる。また、本発明の３−デアザプリンヌクレオシド誘導体は、優れた光学特性を維持しつつ、ＤＮＡ二重らせん構造も不安定化しない。これらの性質を利用して、高粘度の場合と同様の色素部位の分子回転を抑制する環境を作り出してＤＮＡのマッチ・ミスマッチの違いをモニタリングすることもできる。
例えば、本発明のポリヌクレオチド誘導体を含むプローブを標的ＤＮＡとハイブリダイズさせフルマッチしたときの粘度環境の変化による蛍光発光色の違いで標的ＤＮＡの対面塩基を識別する塩基識別型蛍光核酸塩基（遺伝子検出用プローブ）として用いることができる。あるいは、タンパク質又は細胞内の局所的な粘度環境の調査用プローブとして用いることができる。
本発明の好ましい態様によれば、本発明のポリヌクレオチド誘導体を含むプローブは、周辺のＧＣ塩基対による蛍光消光が見られないため利用できるＤＮＡ配列に制限がなく、蛍光ＤＮＡプローブとして幅広く利用できるものと考えられる。
本発明のポリヌクレオチド誘導体は、ＲＮＡｉなどの細胞内における局在環境の粘度に関する情報をモニタリングすることができる。さらにこの手法を発展させることもできる。例えば、本発明のポリヌクレオチド誘導体をタンパク質又は核酸などの生体高分子と相互作用させ、それに伴う立体障害により高粘度と同様の蛍光色素部位の分子回転を抑制する環境を作り出すことにより、タンパク質又はオリゴヌクレオチド鎖の相互作用を利用したＳＮＰｓタイピング（疾患または薬物代謝等に関係する遺伝子に存在するＳＮＰｓ（single nucleotide polymorphism）の塩基情報の解析）等に利用することも可能である。
また、本発明の３−デアザプリンヌクレオシド誘導体は、３−デアザプリン骨格のＣ３位に蛍光分子を導入したことにより、ＤＮＡ中の幅の狭い溝であるマイナーグルーブに蛍光色素部位を導入することができる。また、本発明の３−デアザプリンヌクレオシド誘導体は、優れた光学特性を維持しつつ、ＤＮＡ二重らせん構造も不安定化しない。これらの性質を利用して、高粘度の場合と同様の色素部位の分子回転を抑制する環境を作り出してＤＮＡのマッチ・ミスマッチの違いをモニタリングすることもできる。
例えば、本発明のポリヌクレオチド誘導体を含むプローブを標的ＤＮＡとハイブリダイズさせフルマッチしたときの粘度環境の変化による蛍光発光色の違いで標的ＤＮＡの対面塩基を識別する塩基識別型蛍光核酸塩基（遺伝子検出用プローブ）として用いることができる。あるいは、タンパク質又は細胞内の局所的な粘度環境の調査用プローブとして用いることができる。
本発明の好ましい態様によれば、本発明のポリヌクレオチド誘導体を含むプローブは、周辺のＧＣ塩基対による蛍光消光が見られないため利用できるＤＮＡ配列に制限がなく、蛍光ＤＮＡプローブとして幅広く利用できるものと考えられる。
以下、本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明は、下記の実施例に制限されるものではない。
下記スキーム１に従って３−ヨード−デアザ−２’−デオキシアデノシン誘導体を合成した。
化合物１の合成
化合物１は公知の化合物であり、Journal of the American Chemical Society 125 (2003) 9970-9982及びChemBioChem 9 (2008) 464-470に従って合成することができる。
化合物１は公知の化合物であり、Journal of the American Chemical Society 125 (2003) 9970-9982及びChemBioChem 9 (2008) 464-470に従って合成することができる。
化合物２の合成
化合物１（100 mg, 0.18 mmol）をＤＭＦ（5 ml）に溶解させ、これにＮ−ヨードスクシンイミド（60.7 mg, 0.27 mmol）を加えて、室温で一晩中反応させた。反応後、溶媒を留去し、得られた残渣に酢酸エチルを加え、炭酸水素ナトリウムで２回、飽和食塩水で１回それぞれ分液操作を行い、有機層を硫酸ナトリウム（無水）で乾燥させた。硫酸ナトリウムをろ過後、溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムに吸着させ、メタノールークロロホルムの混合溶液で溶出し、化合物２（96.7 mg, 79 %）を得た。
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 1.06-1.19 (complex, 42H), 2.33 (m, 1H), 2.63 (ddd, J = 2.6, 5.4, 12.7 Hz, 1H), 3.96 (m, 2H), 4.15 (m, 1H), 4.72 (m, 1H), 5.17 (br, 2H), 7.21 (dd, J = 5.4, 7.8 Hz, 1H), 8.08 (s, 1H), 8.29 (s, 1H)
化合物１（100 mg, 0.18 mmol）をＤＭＦ（5 ml）に溶解させ、これにＮ−ヨードスクシンイミド（60.7 mg, 0.27 mmol）を加えて、室温で一晩中反応させた。反応後、溶媒を留去し、得られた残渣に酢酸エチルを加え、炭酸水素ナトリウムで２回、飽和食塩水で１回それぞれ分液操作を行い、有機層を硫酸ナトリウム（無水）で乾燥させた。硫酸ナトリウムをろ過後、溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムに吸着させ、メタノールークロロホルムの混合溶液で溶出し、化合物２（96.7 mg, 79 %）を得た。
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 1.06-1.19 (complex, 42H), 2.33 (m, 1H), 2.63 (ddd, J = 2.6, 5.4, 12.7 Hz, 1H), 3.96 (m, 2H), 4.15 (m, 1H), 4.72 (m, 1H), 5.17 (br, 2H), 7.21 (dd, J = 5.4, 7.8 Hz, 1H), 8.08 (s, 1H), 8.29 (s, 1H)
化合物３の合成
化合物２（52.5mg, 0.08 mmol）をＴＨＦ（2 ml）に溶解させ、テトラブチルアンモニウムフルオリド（1M, 0.20 ml, 0.20 mmol）を加えて、室温で３０分反応させた。反応後、反応液に酢酸(11 μl, 0.20 mmol)を加えて中和した。溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムに吸着させ、メタノールークロロホルムの混合溶液で溶出し、化合物３（23.5 mg, 82 %）を得た。
1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 2.39 (ddd, J = 3.9, 6.1, 13.2 Hz, 1H), 2.53 (m, 1H, overlapped with DMSO), 3.58 (m, 2H), 3.88 (m, 1H), 4.36 (m, 1H), 5.03 (t, J = 5.3 Hz, 1H), 5.35 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 6.42 (br, 2H), 7.00 (m, 1H), 7.89 (s, 1H), 8.50 (s, 1H)
化合物２（52.5mg, 0.08 mmol）をＴＨＦ（2 ml）に溶解させ、テトラブチルアンモニウムフルオリド（1M, 0.20 ml, 0.20 mmol）を加えて、室温で３０分反応させた。反応後、反応液に酢酸(11 μl, 0.20 mmol)を加えて中和した。溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムに吸着させ、メタノールークロロホルムの混合溶液で溶出し、化合物３（23.5 mg, 82 %）を得た。
1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 2.39 (ddd, J = 3.9, 6.1, 13.2 Hz, 1H), 2.53 (m, 1H, overlapped with DMSO), 3.58 (m, 2H), 3.88 (m, 1H), 4.36 (m, 1H), 5.03 (t, J = 5.3 Hz, 1H), 5.35 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 6.42 (br, 2H), 7.00 (m, 1H), 7.89 (s, 1H), 8.50 (s, 1H)
続いて、下記スキーム２に従って３−デアザプリンヌクレオシド誘導体を合成した。
化合物４の合成
化合物３（65.8 mg, 0.17 mmol）、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（0）（5.8 mg, 0.005 mmol）、ヨウ化銅（1.7 mg, 0.009 mmol）および１−エチニルナフタレン（32.0 mg, 0.21 mmol）をＤＭＦ（5 ml）に溶解させた。これにさらにトリエチルアミン（0.2 ml）を加えて、５０℃の油浴中で１時間反応させた。反応後、溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムに吸着させ、メタノールークロロホルムの混合溶液で溶出し、化合物４（60.4 mg, 86 %）を得た。
1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 2.46 (ddd, J = 3.6, 6.0, 13.3 Hz, 1H), 2.64 (m, 1H), 3.60 (m, 2H), 3.97 (m, 1H), 4.43 (m, 1H), 5.05 (m, 1H), 5.40 (d, J = 3.7 Hz, 1H), 7.02 (br, 2H), 7.17 (m, 1H), 7.53-8.02 (complex, 6H), 8.19 (s, 1H), 8.43 (m, 1H), 8.60 (s, 1H)
化合物３（65.8 mg, 0.17 mmol）、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（0）（5.8 mg, 0.005 mmol）、ヨウ化銅（1.7 mg, 0.009 mmol）および１−エチニルナフタレン（32.0 mg, 0.21 mmol）をＤＭＦ（5 ml）に溶解させた。これにさらにトリエチルアミン（0.2 ml）を加えて、５０℃の油浴中で１時間反応させた。反応後、溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムに吸着させ、メタノールークロロホルムの混合溶液で溶出し、化合物４（60.4 mg, 86 %）を得た。
1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 2.46 (ddd, J = 3.6, 6.0, 13.3 Hz, 1H), 2.64 (m, 1H), 3.60 (m, 2H), 3.97 (m, 1H), 4.43 (m, 1H), 5.05 (m, 1H), 5.40 (d, J = 3.7 Hz, 1H), 7.02 (br, 2H), 7.17 (m, 1H), 7.53-8.02 (complex, 6H), 8.19 (s, 1H), 8.43 (m, 1H), 8.60 (s, 1H)
化合物５の合成
化合物３（35.0 mg, 0.09 mmol）、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（0）（3.2 mg, 0.003 mmol）、ヨウ化銅（0.9 mg, 0.005 mmol）および４−エチニル−１−ナフトニトリル（19.8 mg, 0.11 mmol）をＤＭＦ（5 ml）に溶解させた。これにさらにトリエチルアミン（0.2 ml）を加えて、５０℃の油浴中で１時間反応させた。反応後、溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムに吸着させ、メタノールークロロホルムの混合溶液で溶出し、化合物５（37.0 mg, 93 %）を得た。
1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 2.47 (ddd, J = 3.1, 5.9, 13.2 Hz, 1H), 2.68 (m, 1H), 3.57-3.61 (m, 2H), 4.00 (m, 1H), 4.44 (m, 1H), 5.03 (m, 1H), 5.45 (d, J = 3.4 Hz, 1H), 7.11 (m, 1H), 7.20 (br, 2H), 7.86-7.92 (complex, 2H), 8.01 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 8.16-8.19 (complex, 2H), 8.27 (s, 1H), 8.59 (s, 1H), 8.60 (m, 1H)
化合物３（35.0 mg, 0.09 mmol）、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（0）（3.2 mg, 0.003 mmol）、ヨウ化銅（0.9 mg, 0.005 mmol）および４−エチニル−１−ナフトニトリル（19.8 mg, 0.11 mmol）をＤＭＦ（5 ml）に溶解させた。これにさらにトリエチルアミン（0.2 ml）を加えて、５０℃の油浴中で１時間反応させた。反応後、溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムに吸着させ、メタノールークロロホルムの混合溶液で溶出し、化合物５（37.0 mg, 93 %）を得た。
1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 2.47 (ddd, J = 3.1, 5.9, 13.2 Hz, 1H), 2.68 (m, 1H), 3.57-3.61 (m, 2H), 4.00 (m, 1H), 4.44 (m, 1H), 5.03 (m, 1H), 5.45 (d, J = 3.4 Hz, 1H), 7.11 (m, 1H), 7.20 (br, 2H), 7.86-7.92 (complex, 2H), 8.01 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 8.16-8.19 (complex, 2H), 8.27 (s, 1H), 8.59 (s, 1H), 8.60 (m, 1H)
得られた化合物４及び５についてそれぞれ下記の手順に従い、光学特性を測定した。
[１]ＵＶスペクトルの測定
得られた化合物を、それぞれ、１０μＭの濃度で各種溶媒（メタノール（MeOH）、エタノール（EtOH）、２−プロパノール（2-PrOH）、ジオキサン（dioxane）、アセトニトリル（MeCN）、テトラヒドロフラン（THF）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（DMF）、酢酸エチル（AcOEt）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、グリセリン（glycerine）、エチレングリコール（ethylene glycol）に溶解し、紫外可視分光光度計ＵＶ−２５５０（株式会社島津製作所）を用いてＵＶスペクトルを測定した。
[１]ＵＶスペクトルの測定
得られた化合物を、それぞれ、１０μＭの濃度で各種溶媒（メタノール（MeOH）、エタノール（EtOH）、２−プロパノール（2-PrOH）、ジオキサン（dioxane）、アセトニトリル（MeCN）、テトラヒドロフラン（THF）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（DMF）、酢酸エチル（AcOEt）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、グリセリン（glycerine）、エチレングリコール（ethylene glycol）に溶解し、紫外可視分光光度計ＵＶ−２５５０（株式会社島津製作所）を用いてＵＶスペクトルを測定した。
［２］蛍光スペクトルの測定
得られた各化合物を、それぞれ、１０μＭの濃度で各種溶媒（メタノール（MeOH）、エタノール（EtOH）、２−プロパノール（2-PrOH）、ジオキサン（dioxane）、アセトニトリル（MeCN）、テトラヒドロフラン（THF）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（DMF）、酢酸エチル（AcOEt）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、グリセリン（glycerine）、エチレングリコール（ethylene glycol））に溶解し、蛍光光度計ＲＦ−５３００ＰＣ（株式会社島津製作所）を用いて蛍光スペクトルを測定した。
得られた各化合物を、それぞれ、１０μＭの濃度で各種溶媒（メタノール（MeOH）、エタノール（EtOH）、２−プロパノール（2-PrOH）、ジオキサン（dioxane）、アセトニトリル（MeCN）、テトラヒドロフラン（THF）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（DMF）、酢酸エチル（AcOEt）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、グリセリン（glycerine）、エチレングリコール（ethylene glycol））に溶解し、蛍光光度計ＲＦ−５３００ＰＣ（株式会社島津製作所）を用いて蛍光スペクトルを測定した。
［３］励起スペクトルの測定
得られた各化合物を、それぞれ、１０μＭの濃度で各種溶媒（メタノール（MeOH）、エタノール（EtOH）、２−プロパノール（2-PrOH）、ジオキサン（dioxane）、アセトニトリル（MeCN）、テトラヒドロフラン（THF）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（DMF）、酢酸エチル（AcOEt）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、グリセリン（glycerine）、エチレングリコール（ethylene glycol）に溶解し、蛍光光度計ＲＦ−５３００ＰＣ（株式会社島津製作所）を用いて励起スペクトルを測定した。
化合物４についての測定結果を図１に、化合物５についての測定結果を図２に示す。
得られた各化合物を、それぞれ、１０μＭの濃度で各種溶媒（メタノール（MeOH）、エタノール（EtOH）、２−プロパノール（2-PrOH）、ジオキサン（dioxane）、アセトニトリル（MeCN）、テトラヒドロフラン（THF）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（DMF）、酢酸エチル（AcOEt）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、グリセリン（glycerine）、エチレングリコール（ethylene glycol）に溶解し、蛍光光度計ＲＦ−５３００ＰＣ（株式会社島津製作所）を用いて励起スペクトルを測定した。
化合物４についての測定結果を図１に、化合物５についての測定結果を図２に示す。
なお、各溶媒中における化合物４の光学特性を表１にまとめた。
図１及び表１に示すように、グリセロール（グリセリン）（η＝1412）のような高粘度の溶媒中では、化合物４は、上記の結果（蛍光スペクトル）に見られるような振動構造を伴った強い発光が短波長側に観察されている。これはナフタレン由来のＬＥ蛍光であると考えられる。溶媒の粘度が高いためナフタレン部位と３−デアザアデニン塩基との間での分子の回転が抑制され、ねじれた基底状態が維持されるためナフタレン由来のＬＥ蛍光が観察されている。
一方、アセトニトリル（η＝0.34）や1, 4-ジオキサン（η＝1.44）のような低粘度の溶媒中においては核酸塩基部位（アグリコン部位）由来のＩＣＴ蛍光が観察されている。これは溶媒の粘度が低いため、ナフタレン部位と３−デアザアデニン塩基との間で結合軸に沿った回転が生じ、核酸塩基部位（アグリコン部位）が平面になったためと考えられる。その結果π共役系が拡張され、上記の結果（蛍光スペクトル）に見られるような振動構造を伴わないブロードなＩＣＴ蛍光が長波長側で観察されている。
このように、本発明の化合物４は、溶媒の粘度により分子の平面性を変化させ、それによりＩＣＴ／ＬＥ蛍光の２つの異なる発光特性を示す二重蛍光性分子であることがわかる。
一方、アセトニトリル（η＝0.34）や1, 4-ジオキサン（η＝1.44）のような低粘度の溶媒中においては核酸塩基部位（アグリコン部位）由来のＩＣＴ蛍光が観察されている。これは溶媒の粘度が低いため、ナフタレン部位と３−デアザアデニン塩基との間で結合軸に沿った回転が生じ、核酸塩基部位（アグリコン部位）が平面になったためと考えられる。その結果π共役系が拡張され、上記の結果（蛍光スペクトル）に見られるような振動構造を伴わないブロードなＩＣＴ蛍光が長波長側で観察されている。
このように、本発明の化合物４は、溶媒の粘度により分子の平面性を変化させ、それによりＩＣＴ／ＬＥ蛍光の２つの異なる発光特性を示す二重蛍光性分子であることがわかる。
下記スキーム３に従って実施例１で得られた本発明の３−デアザプリンヌクレオシド誘導体（化合物４）をＤＮＡ鎖に導入した。
化合物４ａの合成
化合物４（52.1 mg, 0.13 mmol）をＤＭＦ（3 ml）に溶解させ、これにＮ，Ｎ−ジ−ｎ−ブチルホルムアミドジメチルアセタール（0.10 ml, 0.42 mmol）を加えて、５０℃の油浴中で１時間反応させた。反応後、溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムに吸着させ、メタノールークロロホルムの混合溶液で溶出し、化合物４ａ（46.4 mg, 66 %）を得た。
1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 0.94 (m, 6H), 1.33 (m, 4H), 1.61 (m, 4H), 2.46 (ddd, J = 3.5, 6.0, 13.2 Hz, 1H), 2.66 (m, 1H), 3.42 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 3.53-3.66 (complex, 4H), 3.96 (m, 1H), 4.43 (m, 1H), 5.04 (m, 1H), 5.39 (d, J = 3.5 Hz, 1H), 7.21 (m, 1H), 7.54-8.02 (complex, 6H), 8.36 (s, 1H), 8.45 (m, 1H), 8.60 (s, 1H), 8.78 (s, 1H)
化合物４（52.1 mg, 0.13 mmol）をＤＭＦ（3 ml）に溶解させ、これにＮ，Ｎ−ジ−ｎ−ブチルホルムアミドジメチルアセタール（0.10 ml, 0.42 mmol）を加えて、５０℃の油浴中で１時間反応させた。反応後、溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムに吸着させ、メタノールークロロホルムの混合溶液で溶出し、化合物４ａ（46.4 mg, 66 %）を得た。
1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 0.94 (m, 6H), 1.33 (m, 4H), 1.61 (m, 4H), 2.46 (ddd, J = 3.5, 6.0, 13.2 Hz, 1H), 2.66 (m, 1H), 3.42 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 3.53-3.66 (complex, 4H), 3.96 (m, 1H), 4.43 (m, 1H), 5.04 (m, 1H), 5.39 (d, J = 3.5 Hz, 1H), 7.21 (m, 1H), 7.54-8.02 (complex, 6H), 8.36 (s, 1H), 8.45 (m, 1H), 8.60 (s, 1H), 8.78 (s, 1H)
化合物４ｂの合成
化合物４ａ（38.7 mg, 0.07 mmol）を無水ピリジン（3 ml）に溶解させ、これに４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（37.3 mg, 0.11 mmol）を加えて、室温で２時間反応させた。反応後、溶媒を留去し、得られた残渣に酢酸エチルを加え、炭酸水素ナトリウムで２回、飽和食塩水で１回それぞれ分液操作を行い、有機層を硫酸ナトリウム（無水）で乾燥させた。硫酸ナトリウムをろ過後、溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムに吸着させ、エタノールークロロホルムの混合溶液で溶出し、化合物４ｂ（51.1 mg, 85 %）を得た。
1H-NMR (acetone-d6, 400 MHz) δ 0.97 (m, 6H), 1.41 (m, 4H), 1.70 (m, 4H), 2.72 (ddd, J = 5.0, 6.1, 13.4 Hz, 1H), 2.86 (m, 1H), 3.35 (m, 2H), 3.47 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.68 (m, 2H), 3.75 (s, 6H), 4.27 (m, 1H), 4.72 (m, 1H), 4.77 (m, 1H), 6.78-6.84 (complex, 4H), 7.16-7.72 (complex, 13H), 7.93-8.03 (complex, 3H), 8.33 (s, 1H), 8.42 (s, 1H), 8.63 (m, 1H), 8.86 (s, 1H)
化合物４ａ（38.7 mg, 0.07 mmol）を無水ピリジン（3 ml）に溶解させ、これに４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（37.3 mg, 0.11 mmol）を加えて、室温で２時間反応させた。反応後、溶媒を留去し、得られた残渣に酢酸エチルを加え、炭酸水素ナトリウムで２回、飽和食塩水で１回それぞれ分液操作を行い、有機層を硫酸ナトリウム（無水）で乾燥させた。硫酸ナトリウムをろ過後、溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムに吸着させ、エタノールークロロホルムの混合溶液で溶出し、化合物４ｂ（51.1 mg, 85 %）を得た。
1H-NMR (acetone-d6, 400 MHz) δ 0.97 (m, 6H), 1.41 (m, 4H), 1.70 (m, 4H), 2.72 (ddd, J = 5.0, 6.1, 13.4 Hz, 1H), 2.86 (m, 1H), 3.35 (m, 2H), 3.47 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.68 (m, 2H), 3.75 (s, 6H), 4.27 (m, 1H), 4.72 (m, 1H), 4.77 (m, 1H), 6.78-6.84 (complex, 4H), 7.16-7.72 (complex, 13H), 7.93-8.03 (complex, 3H), 8.33 (s, 1H), 8.42 (s, 1H), 8.63 (m, 1H), 8.86 (s, 1H)
化合物４ｃの合成
化合物４ｂ（50.0 mg, 0.06 mmol）をアセトニトリル（1 ml）に溶解させ、これにトリエチルアミン（0.5 ml）と２−シアノジイソプロピルクロロホスホロアミジト（0.08 ml）を加えて、室温で３０分反応させた。反応後、反応溶液に酢酸エチルを加え、炭酸水素ナトリウムで２回、飽和食塩水で１回それぞれ分液操作を行い、有機層を硫酸ナトリウム（無水）で乾燥させた。硫酸ナトリウムをろ過後、溶媒を留去し、粗生成物である化合物４ｃを得た。
化合物４ｂ（50.0 mg, 0.06 mmol）をアセトニトリル（1 ml）に溶解させ、これにトリエチルアミン（0.5 ml）と２−シアノジイソプロピルクロロホスホロアミジト（0.08 ml）を加えて、室温で３０分反応させた。反応後、反応溶液に酢酸エチルを加え、炭酸水素ナトリウムで２回、飽和食塩水で１回それぞれ分液操作を行い、有機層を硫酸ナトリウム（無水）で乾燥させた。硫酸ナトリウムをろ過後、溶媒を留去し、粗生成物である化合物４ｃを得た。
ＤＮＡ合成
得られた化合物４ｃをアセトニトリル６００μｌに溶解し、ＤＮＡ自動合成機（製造元：アプライドバイオシステムズ社、型番：３４００ ＤＮＡシンセサイザー）を用いてＤＮＡ鎖へ導入し、オリゴヌクレオチドＤＮＡ（ＯＤＮ１及びＯＤＮ２）をそれぞれ得た。
得られた化合物４ｃをアセトニトリル６００μｌに溶解し、ＤＮＡ自動合成機（製造元：アプライドバイオシステムズ社、型番：３４００ ＤＮＡシンセサイザー）を用いてＤＮＡ鎖へ導入し、オリゴヌクレオチドＤＮＡ（ＯＤＮ１及びＯＤＮ２）をそれぞれ得た。
実施例３で得られたオリゴヌクレオチドＤＮＡ（ＯＤＮ１及びＯＤＮ２）について、それぞれ、下記の手順に従い、ＵＶスペクトル及び蛍光スペクトルを測定した。また、ＤＮＡ又はＲＮＡ高次構造の熱安定性を評価した。
[１]ＵＶ吸収スペクトルの測定
得られたオリゴヌクレオチドＤＮＡを、0.1Ｍの濃度でＮａＣｌを含む50ｍＭリン酸バッファーに2.5μＭの濃度になるように溶解した。これに相補的な配列を有するターゲットＤＮＡ又はターゲットＲＮＡを2.5μＭの濃度になるように各種加え、紫外可視分光光度計ＵＶ−２５５０（株式会社島津製作所）にてＵＶ吸収スペクトルを測定した。
[１]ＵＶ吸収スペクトルの測定
得られたオリゴヌクレオチドＤＮＡを、0.1Ｍの濃度でＮａＣｌを含む50ｍＭリン酸バッファーに2.5μＭの濃度になるように溶解した。これに相補的な配列を有するターゲットＤＮＡ又はターゲットＲＮＡを2.5μＭの濃度になるように各種加え、紫外可視分光光度計ＵＶ−２５５０（株式会社島津製作所）にてＵＶ吸収スペクトルを測定した。
［２］蛍光スペクトルの測定
実施例３で得られたオリゴヌクレオチドＤＮＡを、0.1Ｍの濃度でNaClを含む50ｍＭリン酸バッファーに2.5μＭの濃度になるように溶解した。これに相補的な配列を有するターゲットＤＮＡ又はターゲットＲＮＡを2.5μＭの濃度になるように各種加え、蛍光光度計ＲＦ−５３００ＰＣ（株式会社島津製作所）にて蛍光スペクトルを測定した。
実施例３で得られたオリゴヌクレオチドＤＮＡを、0.1Ｍの濃度でNaClを含む50ｍＭリン酸バッファーに2.5μＭの濃度になるように溶解した。これに相補的な配列を有するターゲットＤＮＡ又はターゲットＲＮＡを2.5μＭの濃度になるように各種加え、蛍光光度計ＲＦ−５３００ＰＣ（株式会社島津製作所）にて蛍光スペクトルを測定した。
［３］ＤＮＡ高次構造の熱安定性の評価
Ｔｍ値（融解温度：melting temperature）は、特定の条件下における固有のＤＮＡ高次構造の熱安定性の指標である。実施例３で得られた本発明の化合物４をＤＮＡ鎖に導入してなるオリゴヌクレオチドＤＮＡ（ＯＤＮ１及びＯＤＮ２）にそれぞれ各種相補鎖（Ｎ＝Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔ，bulge，Ａｂ）を加えたときのＴｍ値及びその変化量ΔＴｍを次の手順に従って測定し、ＤＮＡ二重らせん構造の熱安定性を評価した。
濃度２．５μＭに調製したＤＮＡ溶液を８連マイクロセルに移し、紫外可視分光光度計（製造元：島津製作所、型番：ＵＶ−２５５０）を用いて４〜９０℃の範囲で測定を行い、中線法を用いてＴｍ値を算出した。また、天然オリゴヌクレオチドＤＮＡのＴｍ値をもとに、変化量ΔＴｍを算出した。
Ｔｍ値（融解温度：melting temperature）は、特定の条件下における固有のＤＮＡ高次構造の熱安定性の指標である。実施例３で得られた本発明の化合物４をＤＮＡ鎖に導入してなるオリゴヌクレオチドＤＮＡ（ＯＤＮ１及びＯＤＮ２）にそれぞれ各種相補鎖（Ｎ＝Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔ，bulge，Ａｂ）を加えたときのＴｍ値及びその変化量ΔＴｍを次の手順に従って測定し、ＤＮＡ二重らせん構造の熱安定性を評価した。
濃度２．５μＭに調製したＤＮＡ溶液を８連マイクロセルに移し、紫外可視分光光度計（製造元：島津製作所、型番：ＵＶ−２５５０）を用いて４〜９０℃の範囲で測定を行い、中線法を用いてＴｍ値を算出した。また、天然オリゴヌクレオチドＤＮＡのＴｍ値をもとに、変化量ΔＴｍを算出した。
［４］ＲＮＡ高次構造の熱安定性の評価
実施例３で得られた本発明の化合物４をＤＮＡ鎖に導入してなるオリゴヌクレオチドＤＮＡ（ＯＤＮ１）にＲＮＡ（Ｎ＝Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｕ）を加えたときのＴｍ値及びその変化量ΔＴｍを次の手順に従って測定し、ＤＮＡ/ＲＮＡ混成二重らせん構造の熱安定性を評価した。
濃度２．５μＭに調製したＲＮＡ溶液を８連マイクロセルに移し、紫外可視分光光度計（製造元：島津製作所、型番：ＵＶ−２５５０）を用いて４〜９０℃の範囲で測定を行い、中線法を用いてＴｍ値を算出した。また、天然オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ/ＲＮＡ）のＴｍ値をもとに、変化量ΔＴｍを算出した。
実施例３で得られた本発明の化合物４をＤＮＡ鎖に導入してなるオリゴヌクレオチドＤＮＡ（ＯＤＮ１）にＲＮＡ（Ｎ＝Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｕ）を加えたときのＴｍ値及びその変化量ΔＴｍを次の手順に従って測定し、ＤＮＡ/ＲＮＡ混成二重らせん構造の熱安定性を評価した。
濃度２．５μＭに調製したＲＮＡ溶液を８連マイクロセルに移し、紫外可視分光光度計（製造元：島津製作所、型番：ＵＶ−２５５０）を用いて４〜９０℃の範囲で測定を行い、中線法を用いてＴｍ値を算出した。また、天然オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ/ＲＮＡ）のＴｍ値をもとに、変化量ΔＴｍを算出した。
ＯＤＮ１とＤＮＡ相補鎖をハイブリダイズした後のＵＶスペクトル、蛍光スペクトル及びＴｍ値についての測定結果を図３に示す。ＯＤＮ１とＲＮＡをハイブリダイズした後のＵＶスペクトル、蛍光スペクトル及びＴｍ値についての測定結果を図４に示す。また、ＯＤＮ２とＤＮＡ相補鎖をハイブリダイズした後のＵＶスペクトル、蛍光スペクトル及びＴｍ値についての測定結果を図５に示す。
図３及び５に示すように、ＤＮＡ二重鎖の融解温度（Ｔｍ値）測定の結果から本発明の化合物４を含むＤＮＡは安定な二重鎖を形成することがわかる。特に二重鎖において化合物４の対面塩基がマッチとなるチミン塩基の場合には、他のミスマッチの塩基の場合と比べて高い熱安定性（高いＴｍ値）を示した。このことから、化合物４はチミン塩基とのみ安定な塩基対を形成することが示唆された。
また、本発明の化合物４を含むＤＮＡ二重鎖の蛍光スペクトルの測定結果から、化合物４の対面塩基がマッチのチミン塩基の時には振動構造を伴わないブロードな発光が長波長側で観察されることがわかる。これは、対面塩基がマッチのチミン塩基のときに、ナフタレン部位がＤＮＡ二重鎖の幅の狭いマイナーグルーブ側に突き出されて固定化され、塩基部位と平面になるために起こると考えられる。平面になることでπ共役系が拡張されたため、振動構造を伴わないブロードなＩＣＴ蛍光が長波長側で観察されたと考えられる。分子モデリング実験からも、化合物４の対面塩基がマッチのチミン塩基の場合にナフタレン部位がＤＮＡ二重鎖の幅の狭いマイナーグルーブ固定化され、核酸塩基部位全体が平面構造になることを確認している。図６に分子モデリング実験の結果を示す。なお、分子モデリング実験に関しては、ＯＤＮ１／ＤＮＡ３（Ｎ＝Ｔ）の二重鎖の配列を用い、MacroModel ver.9.0 (シュレディンガー社)によりAMBER*力場下で最適化計算を行った。
これに対して、対面塩基がミスマッチ塩基（すなわち、グアニン塩基及びシトシン塩基）のときには振動構造を伴う強い発光が短波長側に観察されている。これは、基底状態のねじれた構造が維持されているためであり、ナフタレン部位由来のＬＥ蛍光が観察されていると考えられる。このように対面塩基のマッチ−ミスマッチの違いに伴って生じる立体障害により、高粘度の溶媒中の場合と同様な分子の回転抑制が生じ、蛍光発光波長の大きな変化が観察された。本発明の化合物４が有するユニークな二重蛍光特性を用いることで、蛍光波長変化で対面塩基の識別を行う新しいプローブの開発が可能であると考えられる。
また、相補鎖としてＲＮＡを加えた際にも同様の結果が観察されている。対面塩基がマッチのウラシル塩基の時のみ長波長側でＩＣＴ蛍光が観察され、波長変化で対面塩基の識別が可能であった。
図３及び５に示すように、ＤＮＡ二重鎖の融解温度（Ｔｍ値）測定の結果から本発明の化合物４を含むＤＮＡは安定な二重鎖を形成することがわかる。特に二重鎖において化合物４の対面塩基がマッチとなるチミン塩基の場合には、他のミスマッチの塩基の場合と比べて高い熱安定性（高いＴｍ値）を示した。このことから、化合物４はチミン塩基とのみ安定な塩基対を形成することが示唆された。
また、本発明の化合物４を含むＤＮＡ二重鎖の蛍光スペクトルの測定結果から、化合物４の対面塩基がマッチのチミン塩基の時には振動構造を伴わないブロードな発光が長波長側で観察されることがわかる。これは、対面塩基がマッチのチミン塩基のときに、ナフタレン部位がＤＮＡ二重鎖の幅の狭いマイナーグルーブ側に突き出されて固定化され、塩基部位と平面になるために起こると考えられる。平面になることでπ共役系が拡張されたため、振動構造を伴わないブロードなＩＣＴ蛍光が長波長側で観察されたと考えられる。分子モデリング実験からも、化合物４の対面塩基がマッチのチミン塩基の場合にナフタレン部位がＤＮＡ二重鎖の幅の狭いマイナーグルーブ固定化され、核酸塩基部位全体が平面構造になることを確認している。図６に分子モデリング実験の結果を示す。なお、分子モデリング実験に関しては、ＯＤＮ１／ＤＮＡ３（Ｎ＝Ｔ）の二重鎖の配列を用い、MacroModel ver.9.0 (シュレディンガー社)によりAMBER*力場下で最適化計算を行った。
これに対して、対面塩基がミスマッチ塩基（すなわち、グアニン塩基及びシトシン塩基）のときには振動構造を伴う強い発光が短波長側に観察されている。これは、基底状態のねじれた構造が維持されているためであり、ナフタレン部位由来のＬＥ蛍光が観察されていると考えられる。このように対面塩基のマッチ−ミスマッチの違いに伴って生じる立体障害により、高粘度の溶媒中の場合と同様な分子の回転抑制が生じ、蛍光発光波長の大きな変化が観察された。本発明の化合物４が有するユニークな二重蛍光特性を用いることで、蛍光波長変化で対面塩基の識別を行う新しいプローブの開発が可能であると考えられる。
また、相補鎖としてＲＮＡを加えた際にも同様の結果が観察されている。対面塩基がマッチのウラシル塩基の時のみ長波長側でＩＣＴ蛍光が観察され、波長変化で対面塩基の識別が可能であった。
なお、ＯＤＮ１を用いたときの光学特性及び融解温度を表２にまとめた。
また、ＯＤＮ２を用いたときの光学特性及び融解温度を表３にまとめた。
また、ＯＤＮ２を用いたときの光学特性及び融解温度を表３にまとめた。
［比較例１］
下記スキーム４に従って実施例１で得られた比較化合物である３−デアザプリンヌクレオシド誘導体（化合物５）をＤＮＡ鎖に導入した。
下記スキーム４に従って実施例１で得られた比較化合物である３−デアザプリンヌクレオシド誘導体（化合物５）をＤＮＡ鎖に導入した。
化合物５ａの合成
化合物５（30.2 mg, 0.07 mmol）をＤＭＦ（3 ml）に溶解させ、これにＮ，Ｎ−ジ−ｎ−ブチルホルムアミドジメチルアセタール（0.05 ml, 0.21 mmol）を加えて、５０℃の油浴中で１時間反応させた。反応後、溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムに吸着させ、メタノールークロロホルムの混合溶液で溶出し、化合物５ａ（18.0 mg, 45 %）を得た。
1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 0.94 (m, 6H), 1.33 (m, 4H), 1.62 (m, 4H), 2.47 (ddd, J = 3.4, 5.9, 13.2 Hz, 1H), 2.69 (m, 1H), 3.43 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 3.54-3.63 (complex, 4H), 3.99 (m, 1H), 4.44 (m, 1H), 5.04 (m, 1H), 5.44 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 7.15 (m, 1H), 7.89-7.93 (complex, 2H), 8.01 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 8.18-8.20 (complex, 2H), 8.44 (s, 1H), 8.60 (s, 1H), 8.62 (m, 1H), 8.80 (s, 1H)
化合物５（30.2 mg, 0.07 mmol）をＤＭＦ（3 ml）に溶解させ、これにＮ，Ｎ−ジ−ｎ−ブチルホルムアミドジメチルアセタール（0.05 ml, 0.21 mmol）を加えて、５０℃の油浴中で１時間反応させた。反応後、溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムに吸着させ、メタノールークロロホルムの混合溶液で溶出し、化合物５ａ（18.0 mg, 45 %）を得た。
1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 0.94 (m, 6H), 1.33 (m, 4H), 1.62 (m, 4H), 2.47 (ddd, J = 3.4, 5.9, 13.2 Hz, 1H), 2.69 (m, 1H), 3.43 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 3.54-3.63 (complex, 4H), 3.99 (m, 1H), 4.44 (m, 1H), 5.04 (m, 1H), 5.44 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 7.15 (m, 1H), 7.89-7.93 (complex, 2H), 8.01 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 8.18-8.20 (complex, 2H), 8.44 (s, 1H), 8.60 (s, 1H), 8.62 (m, 1H), 8.80 (s, 1H)
化合物５ｂの合成
化合物５ａ（18.0 mg, 0.03 mmol）を無水ピリジン（3 ml）に溶解させ、これに４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（12.9 mg, 0.04 mmol）を加えて、室温で２時間反応させた。反応後、溶媒を留去し、得られた残渣に酢酸エチルを加え、炭酸水素ナトリウムで２回、飽和食塩水で１回それぞれ分液操作を行い、有機層を硫酸ナトリウム（無水）で乾燥させた。硫酸ナトリウムをろ過後、溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムに吸着させ、エタノールークロロホルムの混合溶液で溶出し、化合物５ｂ（20.1 mg, 72 %）を得た。
1H-NMR (acetone-d6, 400 MHz) δ 0.98 (m, 6H), 1.41 (m, 4H), 1.71 (m, 4H), 2.75 (ddd, J = 4.8, 6.0, 13.4 Hz, 1H), 2.91 (m, 1H), 3.34 (m, 2H), 3.49 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.70 (m, 2H), 3.74 (s, 3H), 3.75 (s, 3H), 4.29 (m, 1H), 4.74 (m, 1H), 4.82 (m, 1H), 6.77-6.82 (complex, 4H), 7.21-7.43 (complex, 10H), 7.89 (complex, 2H), 8.09 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 8.13 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 8.25 (m, 1H), 8.34 (s, 1H), 8.48 (s, 1H), 8.79 (m, 1H), 8.89 (s, 1H)
化合物５ａ（18.0 mg, 0.03 mmol）を無水ピリジン（3 ml）に溶解させ、これに４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（12.9 mg, 0.04 mmol）を加えて、室温で２時間反応させた。反応後、溶媒を留去し、得られた残渣に酢酸エチルを加え、炭酸水素ナトリウムで２回、飽和食塩水で１回それぞれ分液操作を行い、有機層を硫酸ナトリウム（無水）で乾燥させた。硫酸ナトリウムをろ過後、溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムに吸着させ、エタノールークロロホルムの混合溶液で溶出し、化合物５ｂ（20.1 mg, 72 %）を得た。
1H-NMR (acetone-d6, 400 MHz) δ 0.98 (m, 6H), 1.41 (m, 4H), 1.71 (m, 4H), 2.75 (ddd, J = 4.8, 6.0, 13.4 Hz, 1H), 2.91 (m, 1H), 3.34 (m, 2H), 3.49 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.70 (m, 2H), 3.74 (s, 3H), 3.75 (s, 3H), 4.29 (m, 1H), 4.74 (m, 1H), 4.82 (m, 1H), 6.77-6.82 (complex, 4H), 7.21-7.43 (complex, 10H), 7.89 (complex, 2H), 8.09 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 8.13 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 8.25 (m, 1H), 8.34 (s, 1H), 8.48 (s, 1H), 8.79 (m, 1H), 8.89 (s, 1H)
化合物５ｃの合成
化合物５ｂ（20.0 mg, 0.02 mmol）をアセトニトリル（1 ml）に溶解させ、これにトリエチルアミン（0.2 ml）と２−シアノジイソプロピルクロロホスホロアミジト（0.05 ml）を加えて、室温で３０分反応させた。反応後、反応溶液に酢酸エチルを加え、炭酸水素ナトリウムで２回、飽和食塩水で１回それぞれ分液操作を行い、有機層を硫酸ナトリウム（無水）で乾燥させた。硫酸ナトリウムをろ過後、溶媒を留去し、粗生成物である化合物５ｃを得た。
化合物５ｂ（20.0 mg, 0.02 mmol）をアセトニトリル（1 ml）に溶解させ、これにトリエチルアミン（0.2 ml）と２−シアノジイソプロピルクロロホスホロアミジト（0.05 ml）を加えて、室温で３０分反応させた。反応後、反応溶液に酢酸エチルを加え、炭酸水素ナトリウムで２回、飽和食塩水で１回それぞれ分液操作を行い、有機層を硫酸ナトリウム（無水）で乾燥させた。硫酸ナトリウムをろ過後、溶媒を留去し、粗生成物である化合物５ｃを得た。
得られた化合物５ｃをアセトニトリル６００μｌに溶解し、ＤＮＡ自動合成機（製造元：アプライドバイオシステムズ社、型番：３４００ ＤＮＡシンセサイザー）を用いてＤＮＡ鎖へ導入し、オリゴヌクレオチドＤＮＡ（ＯＤＮ３及びＯＤＮ４）をそれぞれ得た。
オリゴヌクレオチドＤＮＡ（ＯＤＮ３及びＯＤＮ４）について、それぞれ、実施例４と同様の手順で、蛍光スペクトルを測定した。
ＯＤＮ３とＤＮＡ相補鎖をハイブリダイズした後の蛍光スペクトルについての測定結果を図７に示す。また、ＯＤＮ４とＤＮＡ相補鎖をハイブリダイズした後の蛍光スペクトルについての測定結果を図８に示す。これらの結果に示されるとおり、化合物５を含むＤＮＡプローブ（ＯＤＮ３及びＯＤＮ４）は、対面塩基の識別能を持たないことがわかる。
化合物５はフェニル基が電子吸引性のシアノ基を有するため、電子ドナー性の３−デアザアデニン塩基との間で分子内においてドナー・アクセプターの関係となる。したがって、従来のドナー・アクセプター型ＤＮＡプローブのコンセプトによると化合物５を含むＤＮＡプローブ（ＯＤＮ３及びＯＤＮ４）は、化合物４を含むＤＮＡプローブ（ＯＤＮ１及びＯＤＮ２）より優れたチミン識別プローブになると考えられる。しかしながら、上記の蛍光スペクトルに見られるように、化合物５を含むＤＮＡプローブ（ＯＤＮ３及びＯＤＮ４）ではチミン塩基識別能は全く見られなかった。このことからも本発明の化合物４を含むプローブが従来のプローブと全く異なるコンセプトに基づいて作用していることがわかる。
化合物５はフェニル基が電子吸引性のシアノ基を有するため、電子ドナー性の３−デアザアデニン塩基との間で分子内においてドナー・アクセプターの関係となる。したがって、従来のドナー・アクセプター型ＤＮＡプローブのコンセプトによると化合物５を含むＤＮＡプローブ（ＯＤＮ３及びＯＤＮ４）は、化合物４を含むＤＮＡプローブ（ＯＤＮ１及びＯＤＮ２）より優れたチミン識別プローブになると考えられる。しかしながら、上記の蛍光スペクトルに見られるように、化合物５を含むＤＮＡプローブ（ＯＤＮ３及びＯＤＮ４）ではチミン塩基識別能は全く見られなかった。このことからも本発明の化合物４を含むプローブが従来のプローブと全く異なるコンセプトに基づいて作用していることがわかる。
以上の結果に示されるとおり、本発明の３−デアザプリンヌクレオシド誘導体は、周囲の局所的な粘度環境の違いに応じて蛍光発光波長を変化させる二重蛍光性分子であり、従来とは異なるコンセプトで生体内の微細環境をモニタリングすることを可能にする。また、本発明の３−デアザプリンヌクレオシド誘導体を含むオリゴヌクレオチドは、対面塩基のマッチ−ミスマッチの違いに伴って生じる立体障害により高粘度の溶媒中の場合と同様な分子の回転抑制が生じる環境下で蛍光発光波長を大きく変化させることができるため、本発明のポリヌクレオチド誘導体は、生体内における様々な粘度環境などの微細環境の変化を蛍光発光波長の違いによって識別することができる。
なお、本測定に用いたオリゴヌクレオチドＤＮＡ、相補鎖ＤＮＡ及びＲＮＡの塩基配列を下表に示す。
本発明の３−デアザプリンヌクレオシド誘導体は、生体内の局所的な粘度環境の変化をモニタリングするためのプローブなどとして用いることができる。また、本発明の３−デアザプリンヌクレオシド誘導体をタンパク質又は核酸などの生体高分子と相互作用させ、それに伴う立体障害により高粘度と同様の蛍光色素部位の分子回転を抑制する環境を作り出すことにより、タンパク質又はオリゴヌクレオチド鎖の相互作用を利用したＳＮＰｓタイピング等に利用することも可能である。
また、本発明のポリヌクレオチド誘導体を含むプローブは、標的ＤＮＡとハイブリダイズさせフルマッチしたときの粘度環境の変化による蛍光発光色の違いで標的ＤＮＡの対面塩基を識別する塩基識別型蛍光核酸塩基（遺伝子検出用プローブ）として、あるいは、タンパク質又は細胞内の局所的な粘度環境の調査用プローブとして用いることができる。
また、本発明のポリヌクレオチド誘導体を含むプローブは、標的ＤＮＡとハイブリダイズさせフルマッチしたときの粘度環境の変化による蛍光発光色の違いで標的ＤＮＡの対面塩基を識別する塩基識別型蛍光核酸塩基（遺伝子検出用プローブ）として、あるいは、タンパク質又は細胞内の局所的な粘度環境の調査用プローブとして用いることができる。
配列番号１：合成ＤＮＡ
配列番号２：合成ＤＮＡ
配列番号３：合成ＤＮＡ
配列番号４：合成ＤＮＡ
配列番号５：合成ＤＮＡ
配列番号６：合成ＤＮＡ
配列番号７：合成ＲＮＡ
配列番号２：合成ＤＮＡ
配列番号３：合成ＤＮＡ
配列番号４：合成ＤＮＡ
配列番号５：合成ＤＮＡ
配列番号６：合成ＤＮＡ
配列番号７：合成ＲＮＡ
Claims (10)
- 下記式（Ｉ）又は（ＩＩ）：
［式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、下記式：
で示される縮合環であり、
Ｒａ及びＲｂは、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又は水酸基である。］
で示される３−デアザプリンヌクレオシド誘導体。 - 前記Ｒａ及びＲｂが、水素原子である、請求項１に記載の３−デアザプリンヌクレオシド誘導体。
- 前記Ｒ１及びＲ２が、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、下記式：
で示される縮合環である、請求項１又は２に記載の３−デアザプリンヌクレオシド誘導体。 - 生体内の粘度環境の変化をモニタリングするためのものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のデアザプリンヌクレオシド誘導体を含むプローブ。
- 下記式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）：
［式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、下記式：
で示される縮合環であり、
Ｒａ及びＲｂは、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、水素原子又は水酸基であり、
ｓ及びｔは、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、１、２又は３である。］
で示される３−デアザプリンヌクレオチド誘導体。 - 前記Ｒａ及びＲｂが、水素原子である、請求項５に記載の３−デアザプリンヌクレオチド誘導体。
- 前記Ｒ１及びＲ２は、それぞれ互いに独立し、同一又は異なって、下記式：
で示される縮合環である、請求項５又は６に記載の３−デアザプリンヌクレオチド誘導体。 - ポリヌクレオチドにおいて少なくとも１つのヌクレオチドが請求項５〜７のいずれか一項に記載のデアザプリンヌクレオチド誘導体で置換されてなるポリヌクレオチド誘導体。
- 請求項８に記載のポリヌクレオチド誘導体を含むプローブ。
- 生体内の粘度環境をモニタリングするためのものである、請求項９に記載のプローブ。
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|---|---|---|---|---|
| JP2007031389A (ja) * | 2005-07-28 | 2007-02-08 | Univ Nihon | ヌクレオチド誘導体及びその利用 |
| JP2011037796A (ja) * | 2009-08-17 | 2011-02-24 | Nihon Univ | Ｃ８位置換プリン塩基誘導体及びそれを利用した蛍光プローブ |
| JP2013159574A (ja) * | 2012-02-03 | 2013-08-19 | Nihon Univ | デアザプリンヌクレオシド誘導体、デアザプリンヌクレオチド誘導体及びポリヌクレオチド誘導体 |
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| CHO, H. Y. ET AL., MOLECULES, vol. 17, JPN6017028808, 2012, pages 12061 - 12071, ISSN: 0003611194 * |
| SAITO, Y. ET AL., CHEMICAL COMMUNICATIONS, vol. 49, JPN7017002512, 2013, pages 5684 - 5686, ISSN: 0003611193 * |
| SUZUKI, A. ET AL., BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY LETTERS, vol. 23, JPN6017028805, 2013, pages 886 - 892, ISSN: 0003611192 * |
| SUZUKI, A. ET AL., TETRAHEDRON LETTERS, vol. 54, JPN6017028803, 2013, pages 2348 - 2352, ISSN: 0003611191 * |
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|---|---|---|---|---|
| JP2016138078A (ja) * | 2015-01-29 | 2016-08-04 | 学校法人日本大学 | ８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオシド誘導体、８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオチド誘導体及びポリヌクレオチド誘導体ならびにプローブ |
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