JP2015146803A - Method for inducing differentiation of melanocyte - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、メラノサイトの分化誘導を促進する方法、および前記方法によって分化誘導されたメラノサイト細胞群を含む細胞製剤に関する。 The present invention relates to a method for promoting differentiation induction of melanocytes, and a cell preparation containing a group of melanocyte cells induced to differentiate by the method.
皮膚、毛根の色を決定する最も重要な因子はメラニンと呼ばれる色素性物質である。メラニンは、皮膚では表皮基底層と毛根に存在するメラノサイトといわれる色素産生細胞により産生される。このメラニンの産生が異常に抑制されたり、メラノサイトが消失したりすると、尋常性白斑や、遺伝性対側性色素異常症、および白皮症といった遺伝性色素異常症が発症する。 The most important factor that determines the color of skin and hair roots is a pigmented substance called melanin. Melanin is produced in the skin by pigment-producing cells called melanocytes that are present in the basal epidermis and hair roots. When the production of melanin is abnormally suppressed or melanocytes disappear, hereditary pigmentation disorders such as common vitiligo, hereditary contralateral pigmentation disorders, and albinism develop.
例えば尋常性白斑症は我が国において１００〜２００万人が罹患していると推計される進行性の色素脱失症である。現在、本疾患の治療は、ステロイド療法や光化学療法により行われており、ある程度の成果が得られているが、予後不良であることが多く、難治性疾患とされている。 For example, vitiligo vulgaris is a progressive depigmentation estimated to affect 1 to 2 million people in Japan. At present, treatment of this disease is performed by steroid therapy and photochemotherapy, and some results have been obtained, but the prognosis is often poor, and it is regarded as an intractable disease.
一方で近年、未分化な細胞（幹細胞）の分化を誘導することで、損傷した組織の補填を図る再生医療（細胞医療）の研究が進められている。例えば、Ｙａｍａｎａｋａらによって樹立された人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）（特許文献１、非特許文献１および２）を利用した再生医療は、受精卵を破壊しないため倫理的問題が少ないばかりか、患者由来の細胞から樹立することができることから、自己細胞を供給源とすることで拒絶反応の問題も回避することができる。 On the other hand, in recent years, research on regenerative medicine (cell medicine) that promotes the repair of damaged tissues by inducing differentiation of undifferentiated cells (stem cells) has been advanced. For example, regenerative medicine using induced pluripotent stem cells (iPS cells) established by Yamanaka et al. (Patent Document 1, Non-Patent Documents 1 and 2) has few ethical problems because it does not destroy fertilized eggs, Since it can be established from patient-derived cells, the problem of rejection can be avoided by using autologous cells as a source.
現在までに、ヒト人工多能性幹細胞からメラノサイトの分化を誘導するいくつかの方法が報告されている。これらの方法は、一般的に、ヒト多能性幹細胞を、表皮誘導を刺激する成分とケラチノサイト分化を刺激する成分とを含む培養培地で培養することを含んでいる。 To date, several methods for inducing melanocyte differentiation from human induced pluripotent stem cells have been reported. These methods generally involve culturing human pluripotent stem cells in a culture medium comprising a component that stimulates epidermal induction and a component that stimulates keratinocyte differentiation.
例えば特許文献２は、表皮誘導を刺激する成分としてＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ５、Ｓｍａｄ７およびＧＦＤ−６から選択される成分を用い、ケラチノサイト分化を刺激する成分としてアスコルビン酸とレチノイン酸の組み合わせを使用する方法を開示している。 For example, Patent Document 2 uses an ingredient selected from BMP-2, BMP-4, BMP-7, Smad1, Smad5, Smad7 and GFD-6 as an ingredient that stimulates epidermal induction, and ascorbine as an ingredient that stimulates keratinocyte differentiation. Disclosed is a method using a combination of acids and retinoic acid.
非特許文献３は、表皮誘導を刺激する成分としてＷｎｔ３ａ、ＦＧＦ−２およびＳＣＦの組み合わせを用い、ケラチノサイト分化を刺激する成分としてＥｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−３およびアスコルビン酸の組み合わせを使用する方法を開示している。 Non-Patent Document 3 discloses a method of using a combination of Wnt3a, FGF-2 and SCF as a component for stimulating epidermis induction, and using a combination of Endothelin-3 and ascorbic acid as a component for stimulating keratinocyte differentiation.
非特許文献４は、表皮誘導を刺激する成分としてＥＧＦおよびＢＭＰ−４の組み合わせを使用し、ケラチノサイト分化を刺激する成分としてアスコルビン酸を使用する方法を開示している。 Non-Patent Document 4 discloses a method of using a combination of EGF and BMP-4 as a component for stimulating epidermis induction and using ascorbic acid as a component for stimulating keratinocyte differentiation.
またマウス細胞における研究では、色素細胞の分化に幹細胞因子（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒ；ＳＣＦ）および骨形成タンパク質（Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＢＭＰ）−４が使用されたこと（非特許文献５）、表皮誘導後のケラチノサイトへの分化にレチノイン酸、活性型ビタミンＤ３が使用されたことが報告されている（非特許文献６および７）。 In studies on mouse cells, stem cell factor (SCF) and bone morphogenetic protein (BMP) -4 were used for differentiation of pigment cells (Non-patent Document 5). It has been reported that retinoic acid and active vitamin D3 were used for differentiation into keratinocytes (Non-patent Documents 6 and 7).
これまでに報告されているヒトメラノサイトの分化誘導方法は、いずれもメラノサイトの分化までに長期（例えば少なくとも４０日以上）の培養が必要であった。さらに、これらの方法で分化誘導されるヒトメラノサイトの細胞集団は、メラノサイトの分化効率は高くなく、また、ヒト正常メラノサイトとの相同性が低いという問題があった。したがって、ヒトへの臨床用途に適したメラノサイトを効率的に分化誘導する方法に関するニーズが依然として存在する。 All of the methods for inducing differentiation of human melanocytes reported so far required long-term culture (for example, at least 40 days or more) until melanocyte differentiation. Furthermore, the cell population of human melanocytes induced to differentiate by these methods has a problem that the differentiation efficiency of melanocytes is not high and the homology with human normal melanocytes is low. Accordingly, there remains a need for methods for efficiently inducing differentiation of melanocytes suitable for human clinical use.
本発明は、ヒト多能性幹細胞からヒトメラノサイト細胞群を効率的に分化誘導する方法を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a method for efficiently inducing differentiation of human melanocyte cells from human pluripotent stem cells.
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねたところ、ヒト多能性幹細胞を、表皮分化を刺激する成分とケラチノサイトへの最終分化を刺激する成分の存在下で分化誘導培養する際に、これまで使用実績のない活性型ビタミンＤ３を培養系に添加することにより、従来の方に比較して、はるかに短期間でメラノサイト細胞群を取得できることを見出し、本発明を完成させるに至った。 The present inventor has conducted extensive studies to solve the above-mentioned problems. As a result, human pluripotent stem cells are cultured to induce differentiation in the presence of a component that stimulates epidermal differentiation and a component that stimulates terminal differentiation into keratinocytes. In order to complete the present invention, it has been found that by adding active vitamin D3, which has not been used so far, to the culture system, a melanocyte cell group can be obtained in a much shorter period of time compared to the conventional one. It came.
したがって、本発明は、一実施態様において、メラノサイトの分化誘導を促進する方法であって、ヒト多能性幹細胞を、表皮誘導を刺激する成分およびケラチノサイトへの最終分化を刺激する成分の存在下で培養することを含んでおり、培養系に活性型ビタミンＤ３を含有させることを特徴とする方法に関する。 Accordingly, the present invention, in one embodiment, is a method of promoting differentiation induction of melanocytes in the presence of a component that stimulates epidermal induction and a component that stimulates terminal differentiation into keratinocytes. The present invention relates to a method comprising culturing and containing an active vitamin D3 in a culture system.
本発明の一実施態様において、表皮誘導を刺激する成分は、ＳＣＦ、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ５、Ｓｍａｄ７、ＧＦＤ−６、ＥＧＦ、Ｗｎｔ３ａ、およびＦＧＦ−２よりなる群から選択される少なくとも１種であることができる。一態様において、表皮誘導を刺激する成分は、ＳＣＦおよびＢＭＰ−４の組み合わせであることが好ましい。 In one embodiment of the invention, the ingredient that stimulates epidermal induction consists of SCF, BMP-2, BMP-4, BMP-7, Smad1, Smad5, Smad7, GFD-6, EGF, Wnt3a, and FGF-2. It can be at least one selected from the group. In one embodiment, the component that stimulates epidermal induction is preferably a combination of SCF and BMP-4.
本発明の一実施態様において、ケラチノサイトへの最終分化を刺激する成分は、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−３、アスコルビン酸、およびレチノイン酸よりなる群から選択される少なくとも１種であることができる。一態様において、ケラチノサイトへの最終分化を刺激する成分は、アスコルビン酸およびレチノイン酸の組み合わせであることが好ましい。 In one embodiment of the present invention, the component that stimulates terminal differentiation into keratinocytes can be at least one selected from the group consisting of Endothelin-3, ascorbic acid, and retinoic acid. In one embodiment, the component that stimulates terminal differentiation into keratinocytes is preferably a combination of ascorbic acid and retinoic acid.
本発明の一実施態様において、前記ヒト多能性幹細胞は、ヒト人工多能性幹細胞であることができる。好ましくは、ヒト人工多能性幹細胞は、ヒト血液Ｔ細胞から誘導されたものである。 In one embodiment of the present invention, the human pluripotent stem cell can be a human induced pluripotent stem cell. Preferably, the human induced pluripotent stem cells are those derived from human blood T cells.
本発明はまた、メラノサイトの欠乏に起因する疾患を治療するための細胞製剤であって、本発明の方法により得られたメラノサイト細胞群を含む細胞製剤に関する。一実施形態において、メラノサイトの欠乏に起因する疾患は、尋常性白斑症、遺伝性対側性色素異常症および白皮症よりなる群から選択されるいずれかの疾患であることができる。 The present invention also relates to a cell preparation for treating a disease caused by melanocyte deficiency, which comprises a melanocyte cell group obtained by the method of the present invention. In one embodiment, the disease resulting from melanocyte deficiency can be any disease selected from the group consisting of vitiligo vulgaris, hereditary contralateral dyslipidemia and albinism.
本発明によれば、ヒト多能性幹細胞から、メラノサイトを効率的に誘導する方法が提供される。
本発明によれば、さらに、ヒト多能性幹細胞から、臨床用途に適したメラノサイト細胞群を効率的に取得する方法が提供される。
According to the present invention, a method for efficiently inducing melanocytes from human pluripotent stem cells is provided.
The present invention further provides a method for efficiently obtaining a melanocyte cell group suitable for clinical use from human pluripotent stem cells.
本発明は、ヒトメラノサイトの分化誘導を促進する方法（以下、単に「本発明の方法」とも称する）に関する。具体的に、本発明は、表皮誘導を刺激する成分およびケラチノサイトへの最終分化を刺激する成分の存在下でメラノサイトの分化誘導培養を行う際に、培養系に活性型ビタミンＤ３を含有させることを特徴とする、ヒトメラノサイトの分化誘導を促進する方法に関する。本発明はまた、本発明の方法によって分化誘導されたメラノサイト細胞群の臨床応用に関する。 The present invention relates to a method for promoting differentiation induction of human melanocytes (hereinafter, also simply referred to as “method of the present invention”). Specifically, in the present invention, when the differentiation induction culture of melanocytes is performed in the presence of a component that stimulates epidermal induction and a component that stimulates terminal differentiation into keratinocytes, the culture system contains active vitamin D3. The present invention relates to a method for promoting differentiation induction of human melanocytes. The present invention also relates to a clinical application of a group of melanocyte cells induced to differentiate by the method of the present invention.
１．多能性幹細胞
本発明で使用可能な多能性幹細胞は、胎盤を除くすべての細胞に分化する能力を有する分化多能性を有し、かつ、増殖能をも有する幹細胞である。そのような幹細胞の具体例には、以下のものに限定されないが、胚性幹（ＥＳ）細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（ｎｔＥＳ；核移植ＥＳ）細胞、精子幹細胞（「ＧＳ細胞」）、胚性生殖細胞（「ＥＧ細胞」）、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞などが含まれる。
1. Pluripotent stem cell The pluripotent stem cell that can be used in the present invention is a stem cell that has a differentiation pluripotency that has the ability to differentiate into all cells except the placenta and also has a proliferation ability. Specific examples of such stem cells include, but are not limited to, embryonic stem (ES) cells, cloned embryo-derived embryonic stem (ntES; nuclear transfer ES) cells, sperm stem cells ( “GS cells”), embryonic germ cells (“EG cells”), induced pluripotent stem (iPS) cells and the like.
ＥＳ細胞、ｎｔＥＳ細胞、ＧＳ細胞、ＥＧ細胞およびｉＰＳ細胞は、当該技術分野で公知のいずれかの方法により樹立された細胞を使用することができ、特に制限されない。 ES cells, ntES cells, GS cells, EG cells, and iPS cells can be cells established by any method known in the art, and are not particularly limited.
ＥＳ細胞は、マウスやヒトおよびサルなどの霊長類由来の細胞で樹立されたことが報告されており（Ｍ．Ｊ．Ｅｖａｎｓ ａｎｄ Ｍ．Ｈ．Ｋａｕｆｍａｎ（１９８１），Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１５４−１５６；Ｊ．Ａ． Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５−１１４７；Ｊ．Ａ． Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：７８４４−７８４８；Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，５５：２５４−２５９； Ｊ．Ａ． Ｔｈｏｍｓｏｎ ａｎｄ Ｖ．Ｓ． Ｍａｒｓｈａｌｌ （１９９８），Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ．， ３８：１３３−１６５）、例えばＨ．Ｓｕｅｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３４５：９２６−９３２；Ｍ．Ｕｅｎｏ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：９５５４−９５５９；Ｈ．Ｓｕｅｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．，２２２：２７３−２７９；Ｈ．Ｋａｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：１５８０−１５８５などに記載される方法に従って樹立および維持されたＥＳ細胞を本発明に使用することができる。 ES cells have been reported to be established in cells derived from primates such as mice, humans and monkeys (MJ Evans and MH Kaufman (1981), Nature 292: 154-156; J Thomson et al. (1999), Science 282: 1145-1147; JA Thomson et al. (1995), Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 92: 7844-7848; Thomson et al. (1996), Biol.Reprod., 55: 254-259 ;, JA Thomson and V.S. Marshall (1998), Curr. Top. Dev. Biol., 38: 133-165), For example, H.C. Suemori et al. (2006), Biochem. Biophys. Res. Commun. 345: 926-932; Ueno et al. (2006), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103: 9554-9559; Suemori et al. (2001), Dev. Dyn. 222: 273-279; Kawasaki et al. (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99: 1580-1585, etc., can be used in the present invention for ES cells established and maintained.
ＧＳ胞は、精巣由来の多能性幹細胞であり、ＥＳ細胞と同様に、種々の系列の細胞に分化誘導可能である。ＧＳ細胞は、例えば竹林正則ら（２００８），実験医学，２６巻，５号（増刊），４１〜４６頁に記載される方法に従って樹立および維持することができる。 GS vesicles are testis-derived pluripotent stem cells that can be induced to differentiate into various lineage cells, similar to ES cells. GS cells can be established and maintained according to the method described in, for example, Masanori Takebayashi et al. (2008), Experimental Medicine, Vol. 26, No. 5 (extra number), pages 41-46.
ＥＧ細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される多能性をもつ細胞であり、ＬＩＦ、ｂＦＧＦ、幹細胞因子（ＳＣＦ）などの物質の存在下で始原生殖細胞を培養することによって樹立することができる（Ｙ．Ｍａｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２），Ｃｅｌｌ，７０：８４１−８４７；Ｊ．Ｌ．Ｒｅｓｎｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９２），Ｎａｔｕｒｅ，３５９：５５０−５５１）。 EG cells are pluripotent cells established from embryonic primordial germ cells, and are established by culturing primordial germ cells in the presence of substances such as LIF, bFGF, and stem cell factor (SCF). (Y. Matsui et al. (1992), Cell, 70: 841-847; JL Resnick et al. (1992), Nature, 359: 550-551).
人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞は、特定の再プログラミング因子を、ＤＮＡまたはタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製することができる、分化多能性と自己複製による増殖能とを有する体細胞由来の人工の幹細胞である（Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｓ．Ｙａｍａｎａｋａ（２００６）Ｃｅｌｌ，１２６：６６３−６７６；Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００７），Ｃｅｌｌ，１３１：８６１−８７２；Ｊ．Ｙｕ ｅｔ ａｌ．（２００７），Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１８：１９１７−１９２０；Ｎａｋａｇａｗａ，Ｍ．ら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：１０１−１０６（２００８）；国際公開ＷＯ２００７／０６９６６６）。再プログラミング因子は、ＥＳ細胞に特異的に発現している遺伝子またはＥＳ細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子もしくはその遺伝子産物であればよく、特に限定されないが、例えばＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２およびＫＬＦ４；ＯＣＴ３／４、ＫＬＦ４およびＣ−ＭＹＣ；ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびＣ−ＭＹＣ；ＯＣＴ３／４およびＳＯＸ２；ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２およびＮＡＮＯＧ；ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２およびＬＩＮ２８；ＯＣＴ３／４およびＫＬＦ４などの組み合わせを含む。 Artificial pluripotent stem (iPS) cells can be made by introducing specific reprogramming factors into somatic cells in the form of DNA or protein, and have pluripotency and proliferation ability by self-replication Artificial stem cells derived from somatic cells (K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126: 663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131: 861-872; J. Yu et. al. (2007), Science, 318: 1917-1920; Nakagawa, M. et al., Nat.Biotechnol.26: 101-106 (2008); International Publication WO2007 / 069666). The reprogramming factor is not particularly limited as long as it is a gene specifically expressed in ES cells, a gene that plays an important role in maintaining undifferentiation of ES cells, or a gene product thereof. For example, OCT3 / 4, SOX2 And KLF4; OCT3 / 4, KLF4 and C-MYC; OCT3 / 4, SOX2, KLF4 and C-MYC; OCT3 / 4 and SOX2; OCT3 / 4, SOX2 and NANOG; OCT3 / 4, SOX2 and LIN28; OCT3 / 4 And combinations such as KLF4.
これらの因子は、タンパク質の形態で、例えばリポフェクション、細胞膜透過性ペプチドとの結合、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよいし、あるいは、ＤＮＡの形態で、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソームを利用する手法、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよい。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター（Ｃｅｌｌ，１２６，ｐｐ．６６３−６７６，２００６；Ｃｅｌｌ，１３１，ｐｐ．８６１−８７２，２００７；Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１８，ｐｐ．１９１７−１９２０，２００７）、アデノウイルスベクター（Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２２，９４５−９４９，２００８）、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどが例示される。本発明の一実施態様において、再プログラミング因子の導入に使用されるウイルスベクターはセンダイウイルスである。センダイウイルスはＲＮＡをゲノムするが、レトロウイルスとは異なり、ＲＮＡのまま細胞質に留まり、そこで複製、転写および翻訳が行われる。したがって、センダイウイルスの使用は、ウイルス由来遺伝子のゲノムへの挿入がなく、癌化のリスクを低く抑えることができるという利点を有している。 These factors may be introduced into somatic cells in the form of proteins, for example, by lipofection, binding to cell membrane permeable peptides, microinjection, or in the form of DNA, for example, viruses, plasmids, etc. Alternatively, the vector may be introduced into a somatic cell by a technique such as a vector such as an artificial chromosome, lipofection, a technique using a liposome, or microinjection. As viral vectors, retroviral vectors, lentiviral vectors (Cell, 126, pp. 663-676, 2006; Cell, 131, pp. 861-872, 2007; Science, 318, pp. 1917-1920, 2007), Examples include adenovirus vectors (Science, 322, 945-949, 2008), adeno-associated virus vectors, Sendai virus vectors, and the like. In one embodiment of the invention, the viral vector used to introduce the reprogramming factor is Sendai virus. Sendai virus genomes RNA, but unlike retroviruses, RNA remains in the cytoplasm where it is replicated, transcribed and translated. Therefore, the use of Sendai virus has the advantage that there is no insertion of a virus-derived gene into the genome and the risk of canceration can be kept low.
ベクターには、再プログラミング因子が発現可能なように、プロモーター、エンハンサーなどの制御配列を含むことができる。また、必要に応じて、再プログラミング因子が導入された細胞を選別するための、薬剤耐性遺伝子（例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ＦＬＡＧなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。 The vector may contain regulatory sequences such as promoters and enhancers so that the reprogramming factor can be expressed. In addition, drug resistance genes (for example, kanamycin resistance gene, ampicillin resistance gene, puromycin resistance gene, etc.), thymidine kinase gene, diphtheria toxin gene, etc. for selecting cells into which a reprogramming factor has been introduced are selected. Selection marker sequences, reporter gene sequences such as green fluorescent protein (GFP), β-glucuronidase (GUS), FLAG, and the like can be included.
ｉＰＳ細胞誘導のための培養培地としては、例えば、１０〜１５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２またはＤＭＥ培地、ＰＳＧ、ノックアウト血清リプレースメント（ＫＳＲ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）またはＳＣＦを含有するＥＳ細胞培養用培地、例えばマウスＥＳ細胞培養用培地（例えばＴＸ−ＷＥＳ培地、トロンボＸ社）または霊長類ＥＳ細胞培養用培地（例えば霊長類（ヒトおよびサル）ＥＳ細胞用培地、リプロセル、京都、日本）などが含まれ、これらを適宜混合して使用することができる。また、これらの培養培地は、ＬＩＦ、ペニシリン／ストレプトマイシン、ピューロマイシン、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸類、β−メルカプトエタノールなどを適宜補充して使用することができる。 Examples of the culture medium for iPS cell induction include DMEM, DMEM / F12 or DME medium containing 10-15% FBS, PSG, knockout serum replacement (KSR), basic fibroblast growth factor (bFGF) or ES cell culture medium containing SCF, such as mouse ES cell culture medium (eg TX-WES medium, Thrombo X) or primate ES cell culture medium (eg primate (human and monkey) ES cell culture medium, Reprocell, Kyoto, Japan) and the like, and these can be used by appropriately mixing them. These culture media can be used by appropriately supplementing LIF, penicillin / streptomycin, puromycin, L-glutamine, non-essential amino acids, β-mercaptoethanol and the like.
培養法の例としては、例えば、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭまたはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地上で細胞と再プログラミング因子（ＤＮＡまたはタンパク質）を接触させて約４〜７日間培養し、その後、細胞をフィーダー細胞（例えば、マイトマイシンＣ処理ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞等）上に蒔き直し、細胞と再プログラミング因子の接触から約１０日後からｂＦＧＦ含有霊長類ＥＳ細胞培養用培地で培養し、該接触から約３０〜約４５日またはそれ以上ののちにｉＰＳ様コロニーを生じさせることができる。 Examples of the culture method include, for example, contacting cells with a reprogramming factor (DNA or protein) on DMEM or DMEM / F12 medium containing 10% FBS in the presence of 5% CO 2 at 37 ° C. The cells are cultured for 7 days, and then the cells are repopulated on feeder cells (for example, mitomycin C-treated STO cells, SNL cells, etc.), and about 10 days after the contact of the cells with the reprogramming factor, the medium is cultured with bFGF-containing primate ES cell culture medium Culturing and generating iPS-like colonies about 30 to about 45 days or more after the contact.
あるいは、細胞は、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて、フィーダー細胞（たとえば、マイトマイシンＣ処理ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞等）上で１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（これにはさらに、ＬＩＦ、ペニシリン／ストレプトマイシン、ピューロマイシン、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸類、β−メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）で培養し、約２５〜約３０日またはそれ以上ののちにＥＳ様コロニーを生じさせることができる。 Alternatively, the cells may be cultured on feeder cells (eg, mitomycin C-treated STO cells, SNL cells, etc.) in the presence of 5% CO 2 at 37 ° C. with 10% FBS-containing DMEM medium (including LIF, Culturing with streptomycin, puromycin, L-glutamine, non-essential amino acids, β-mercaptoethanol, etc.) to form ES-like colonies after about 25 to about 30 days or more Can do.
上記培養の間には、培養開始２日目以降から毎日１回新鮮な培地と培地交換を行う。また、再プログラミング化に使用する細胞の細胞数は、限定されないが、培養ディッシュ１００ｃｍ２あたり約５×１０３〜約５×１０６細胞の範囲である。 During the culture, the medium is replaced with a fresh medium once a day from the second day after the start of the culture. The number of cells used for reprogramming is not limited, but ranges from about 5 × 10 3 to about 5 × 10 6 cells per 100 cm 2 of culture dish.
マーカー遺伝子として薬剤耐性遺伝子などの遺伝子を用いた場合は、対応する薬剤を含む培地（選択培地）で培養を行うことによりマーカー遺伝子発現細胞を選択することができる。またマーカー遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子の場合は蛍光顕微鏡で観察することによって、マーカー遺伝子を発現する細胞を検出することができる。マーカー遺伝子が発光酵素遺伝子である場合は、発光基質を加えることによってマーカー遺伝子発現細胞を検出することができる。 When a gene such as a drug resistance gene is used as the marker gene, a marker gene-expressing cell can be selected by culturing in a medium (selective medium) containing the corresponding drug. When the marker gene is a fluorescent protein gene, cells expressing the marker gene can be detected by observing with a fluorescent microscope. When the marker gene is a luminescent enzyme gene, a marker gene-expressing cell can be detected by adding a luminescent substrate.
本発明において、多能性幹細胞は、ヒト体細胞から誘導されたヒト多能性幹細胞であり、好ましくは、ヒト血液Ｔ細胞から誘導されたヒト多能性幹細胞である。また本発明の一実施態様において、多能性幹細胞は、分化誘導されたメラノサイトによって治療されるべき対象から取得された細胞から誘導されたものである。 In the present invention, the pluripotent stem cells are human pluripotent stem cells derived from human somatic cells, and preferably human pluripotent stem cells derived from human blood T cells. In one embodiment of the present invention, the pluripotent stem cell is derived from a cell obtained from a subject to be treated with differentiation-induced melanocytes.
２．活性型ビタミンＤ３
本発明の方法は、ヒト多能性幹細胞からメラノサイトへの分化誘導系に、活性型ビタミンＤ３を含有させることを特徴とする。活性型ビタミンＤ３は、１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールとも称するホルモン活性を有する脂溶性ビタミンである。本発明の方法において、活性型ビタミンＤ３は、主に、ケラチノサイトへの最終分化を促進すると考えられ、これによりヒト多能性幹細胞からメラノサイトへの分化期間を大幅に短縮することができる。具体的に、本発明の方法によれば、ヒト多能性幹細胞からの分化誘導開始後、例えば、４０日未満、好ましくは３５日未満、より好ましくは３０日未満、より好ましくは２５日未満、そして最も好ましくは２０日未満で、メラノサイトへの分化を実現することができる。
2. Active vitamin D3
The method of the present invention is characterized in that active vitamin D3 is contained in the differentiation induction system from human pluripotent stem cells to melanocytes. Active vitamin D3 is a fat-soluble vitamin having hormonal activity, also called 1α, 25-dihydroxycholecalciferol. In the method of the present invention, active vitamin D3 is considered to mainly promote final differentiation into keratinocytes, and this can greatly shorten the differentiation period from human pluripotent stem cells to melanocytes. Specifically, according to the method of the present invention, after initiation of differentiation induction from human pluripotent stem cells, for example, less than 40 days, preferably less than 35 days, more preferably less than 30 days, more preferably less than 25 days, Most preferably, differentiation into melanocytes can be realized in less than 20 days.
本発明の方法において、使用される活性型ビタミンＤ３の濃度は、併用する他の成分の数および種類に応じて変化する場合があるが、１０−７Ｍ〜１０−５Ｍの範囲とすることができる。本発明の一実施態様において、活性型ビタミンＤ３の使用濃度は１０−６Ｍである。なお、活性型ビタミンＤ３は、分化誘導開始後に培養系に添加してもよいし、培養系に予め含有されていてもよい。活性型ビタミンＤ３を分化誘導開始後に培養系に添加する場合、メラノサイトへの分化期間短縮の観点から、分化誘導開始後数日以内、例えば５日以内、あるいは１０日以内に添加することが好ましい。 In the method of the present invention, the concentration of active vitamin D3 used may vary depending on the number and type of other components used together, but should be in the range of 10 −7 M to 10 −5 M. Can do. In one embodiment of the invention, the use concentration of active vitamin D3 is 10 −6 M. The active vitamin D3 may be added to the culture system after the initiation of differentiation induction, or may be contained in advance in the culture system. When active vitamin D3 is added to the culture system after initiation of differentiation induction, it is preferably added within a few days, for example within 5 days, or within 10 days after the initiation of differentiation induction, from the viewpoint of shortening the differentiation period into melanocytes.
３．メラノサイトへの分化を誘導する成分
本発明の方法において、メラノサイトへの分化誘導には、表皮誘導を刺激する成分、およびケラチノサイトへの最終分化を刺激する成分が使用される。
3. Component that induces differentiation into melanocytes In the method of the present invention, a component that stimulates epidermal induction and a component that stimulates terminal differentiation into keratinocytes are used for inducing differentiation into melanocytes.
本発明の方法に使用される表皮誘導を刺激する成分は、特に制限されず、当業者に公知の成分のいずれかを用いることができる。そのような成分として、これに限定されるものではないが、例えば幹細胞因子（ＳＣＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７）、受容体制御型Ｓｍａｄタンパク質（例えばＳｍａｄ１、Ｓｍａｄ５、Ｓｍａｄ７）、ＴＧＦ−βファミリーのリガンド（例えば成長および分化因子６；ＧＦＤ−６）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、Ｗｎｔ３ａ、繊維芽細胞増殖因子（例えばＦＧＦ−２）などを挙げることができる。前記成分は表皮誘導を刺激する成分として単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。 The component that stimulates the induction of epidermis used in the method of the present invention is not particularly limited, and any component known to those skilled in the art can be used. Examples of such components include, but are not limited to, stem cell factor (SCF), bone morphogenetic proteins (BMP-2, BMP-4, BMP-7), receptor-regulated Smad proteins (for example, Smad1, Smad5, Smad7), TGF-β family ligand (eg, growth and differentiation factor 6; GFD-6), epidermal growth factor (EGF), Wnt3a, fibroblast growth factor (eg, FGF-2) and the like. . The said component may be used independently as a component which stimulates skin induction | guidance | derivation, and may be used in combination of multiple types.
本発明の一実施態様においては、表皮誘導を刺激する成分として、ＳＣＦおよびＢＭＰ−４の組み合わせが使用される。なお、天然ＢＭＰ−４アミノ酸配列は、ＧｅｎＰｅｐｔデータベースにおいてＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＡＡＣ７２２７８下で提供される。 In one embodiment of the invention, a combination of SCF and BMP-4 is used as a component that stimulates epidermal induction. The native BMP-4 amino acid sequence is provided under Accession Number AAC72278 in the GenPept database.
表皮誘導を刺激する成分の使用濃度は、選択した成分の種類、組み合わせ等に応じて変化する場合があり、当業者は適宜適切な濃度を選択することができる。例えば、表皮誘導を刺激する成分としてＳＣＦおよびＢＭＰ−４の組み合わせが使用される場合には、使用されるＳＣＦの濃度は、１０ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌの間で変化し、本発明の一実施態様において、ＳＣＦの使用濃度は２０ｎｇ／ｍｌである。またこの場合に使用されるＢＭＰ−４の使用濃度は、１０ｎＭ〜５０ｎＭの間で変化し、本発明の一実施態様において、ＢＭＰ−４の使用濃度は２０ｎＭである。 The use concentration of the component that stimulates the epidermis induction may vary depending on the type, combination, etc. of the selected component, and those skilled in the art can appropriately select an appropriate concentration. For example, when a combination of SCF and BMP-4 is used as a component that stimulates epidermal induction, the concentration of SCF used varies between 10 ng / ml and 50 ng / ml, In an embodiment, the working concentration of SCF is 20 ng / ml. In addition, the use concentration of BMP-4 used in this case varies between 10 nM and 50 nM, and in one embodiment of the present invention, the use concentration of BMP-4 is 20 nM.
本発明の方法に使用されるケラチノサイトへの最終分化を刺激する成分は、特に制限されず、当業者に公知の成分のいずれかを用いることができる。そのような成分として、これに限定されるものではないが、例えばＥｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−３、アスコルビン酸、レチノイン酸などを挙げることができる。前記成分はケラチノサイトへの最終分化を刺激する成分として単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。 The component that stimulates terminal differentiation into keratinocytes used in the method of the present invention is not particularly limited, and any component known to those skilled in the art can be used. Examples of such components include, but are not limited to, Endothelin-3, ascorbic acid, retinoic acid, and the like. The said component may be used independently as a component which stimulates the final differentiation to a keratinocyte, and may be used in combination of multiple types.
本発明の一実施態様においては、ケラチノサイトへの最終分化を刺激する成分として、アスコルビン酸およびレチノイン酸の組み合わせが使用される。なお、本発明において、レチノイン酸には、二重結合がすべてトランス型であるＡｌｌ−ｔｒａｎｓ−ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ（トレチノイン）も包含される。 In one embodiment of the invention, a combination of ascorbic acid and retinoic acid is used as a component that stimulates terminal differentiation into keratinocytes. In the present invention, retinoic acid also includes All-trans-retinoic acid (tretinoin) in which all double bonds are trans.
ケラチノサイトへの最終分化を刺激する成分の使用濃度は、選択した成分の種類、組み合わせ等に応じて変化する場合があり、当業者は適宜適切な濃度を選択することができる。例えば、ケラチノサイトへの最終分化を刺激する成分としてアスコルビン酸およびレチノイン酸の組み合わせが使用される場合には、使用されるアスコルビン酸の濃度は、０．１ｍＭ〜１０ｍＭの間で変化し、本発明の一実施態様において、アスコルビン酸の使用濃度は０．３ｍＭである。またこの場合に使用されるレチノイン酸の使用濃度は、１０−７Ｍ〜１０−５Ｍの範囲で変化し、本発明の一実施態様において、レチノイン酸の使用濃度は１０−６Ｍである。 The concentration of the component that stimulates terminal differentiation into keratinocytes may vary depending on the type, combination, etc. of the selected components, and those skilled in the art can appropriately select an appropriate concentration. For example, when a combination of ascorbic acid and retinoic acid is used as a component that stimulates terminal differentiation into keratinocytes, the concentration of ascorbic acid used varies between 0.1 mM and 10 mM, In one embodiment, the use concentration of ascorbic acid is 0.3 mM. Moreover, the use concentration of retinoic acid used in this case varies in the range of 10 −7 M to 10 −5 M, and in one embodiment of the present invention, the use concentration of retinoic acid is 10 −6 M.
４．ヒト多能性幹細胞の維持
一般的に、幹細胞の培養（前培養）において、未分化状態を保つためにフィーダー細胞が使用される。本発明の方法において、フィーダー細胞は必ずしも必要ないが、フィーダー細胞を存在させることも可能である。
4). Maintenance of human pluripotent stem cells Generally, feeder cells are used to maintain an undifferentiated state in stem cell culture (preculture). In the method of the present invention, feeder cells are not necessarily required, but feeder cells can also be present.
フィーダー細胞としては、例えば胎仔線維芽細胞、ストローマ細胞などが挙げられる。胎仔線維芽細胞には、例えばＭＥＦ（マウス胎仔線維芽細胞）、ＳＴＯ細胞（マウス胎仔線維芽細胞株）、ＳＮＬ細胞（ＳＴＯ細胞のサブクローン；例えばＳＮＬ ７６／７細胞）などが含まれる。また、ストローマ細胞には、例えばＰＡ６細胞（マウスストローマ細胞株（理研ＢＲＣ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ（日本）））、ＭＳ−５細胞（Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ．１７：１４５−５３（１９８９））、ＯＰ９細胞（Ｓｃｉｅｎｃｅ．２６５：１０９８−１１０１（１９９４））などが挙げられる。 Examples of feeder cells include fetal fibroblasts and stromal cells. Fetal fibroblasts include, for example, MEF (mouse fetal fibroblasts), STO cells (mouse fetal fibroblast cell line), SNL cells (STO cell subclone; for example, SNL 76/7 cells), and the like. Examples of stromal cells include PA6 cells (mouse stromal cell line (RIKEN BRC Cell Bank (Japan))), MS-5 cells (Exp Hematol. 17: 145-53 (1989)), OP9 cells (Science. 265). : 1098-1101 (1994)).
５．メラノサイトの分化誘導培養
分化誘導培地は、基礎培地に表皮誘導を刺激する成分とケラチノサイトへの最終分化を刺激する成分とを補充することにより調製することができる。活性型ビタミンＤ３は、このようにして調製される分化誘導培地に予め含有させてもよいし、分化誘導開始後に添加してもよい。基礎培地としては、ヒト表皮細胞培養用の任意の培地、例えばＭｅｄｉｕｍ ２５４（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））およびこれらの混合培地などが包含される。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。
5. Melanocyte differentiation-inducing culture A differentiation-inducing medium can be prepared by supplementing a basal medium with a component that stimulates epidermal induction and a component that stimulates terminal differentiation into keratinocytes. The active vitamin D3 may be preliminarily contained in the differentiation-inducing medium thus prepared, or may be added after the initiation of differentiation induction. The basal medium includes any medium for culturing human epidermal cells, such as Medium 254 (Gibco®) and a mixed medium thereof. The medium may contain serum or may be serum-free.
培地はまた、必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、ノックアウト血清リプレースメント、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール、３’−チオールグリセロール、Ｂ２７−サプリメント、Ｎ２−サプリメントなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、ならびに、脂質、アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの１つ以上の物質も含有しうる。 The medium can also be used, for example, albumin, transferrin, knockout serum replacement, fatty acid, insulin, collagen precursor, trace elements, 2-mercaptoethanol, 3′-thiolglycerol, B27-supplement, N2-supplement, etc. One or more serum replacements may be included, and one or more of lipids, amino acids, non-essential amino acids, vitamins, growth factors, cytokines, antibiotics, antioxidants, pyruvate, buffers, inorganic salts, etc. These substances may also be included.
分化誘導培地の例は、後述の実施例に記載されるような、表皮分化を刺激する成分としてのＳＣＦおよびＢＭＰ−４の組み合わせと、ケラチノサイトへの最終分化を刺激する成分としてのアスコルビン酸およびレチノイン酸の組み合わせとが補充されたＭｅｄｉｕｍ ２５４に対して、さらに活性型ビタミンＤ３が補充されたものである。 Examples of differentiation-inducing media include combinations of SCF and BMP-4 as components that stimulate epidermal differentiation, ascorbic acid and retinoin as components that stimulate terminal differentiation into keratinocytes, as described in the examples below. Medium 254 supplemented with an acid combination is supplemented with active vitamin D3.
本発明の方法において、ｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞からメラノサイトへの分化誘導に際して、これらの細胞を、例えばＣｈａｍｂｅｒｓ ＳＭ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７：４８５，２００９に記載の方法を用いて培養する。 In the method of the present invention, upon induction of differentiation from pluripotent stem cells such as iPS cells to melanocytes, these cells are treated with, for example, Chambers SM, et al. Nat Biotechnol. 27: 485, 2009.
本発明の一実施態様において、ヒト多能性幹細胞からメラノサイトへの分化誘導は、上記分化培地を用いて、フィーダー細胞の存在下で培養することによって行うことができる。フィーダー細胞は、例えば上に例示されるようなＭＥＦ（マウス胎仔線維芽細胞）、ＳＴＯ細胞（マウス胎仔線維芽細胞株）、ＰＡ６細胞（マウスストローマ細胞株（理研ＢＲＣ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ（日本）））、ＳＮＬ細胞（ＳＴＯ細胞のサブクローン；例えばＳＮＬ ７６／７細胞など）などを使用することができる。本発明の一実施態様において、フィーダー細胞はマウス胎児繊維芽細胞である。またフィーダー細胞を使用する場合、一般に、細胞増殖を停止させるためにマイトマイシンＣ処理が行われる。 In one embodiment of the present invention, differentiation induction from human pluripotent stem cells to melanocytes can be performed by culturing in the presence of feeder cells using the differentiation medium. The feeder cells include, for example, MEF (mouse fetal fibroblasts), STO cells (mouse fetal fibroblasts), PA6 cells (mouse stromal cell line (RIKEN BRC Cell Bank (Japan))) as exemplified above, SNL cells (STO cell subclone; such as SNL 76/7 cells) and the like can be used. In one embodiment of the invention, the feeder cells are mouse embryonic fibroblasts. When using feeder cells, mitomycin C treatment is generally performed to stop cell growth.
培養開始時のヒト多能性幹細胞の培地中の密度は特に制限されないが、例えば約５０〜２００細胞／ｍｌとすることができる。 The density of human pluripotent stem cells in the culture medium at the start of the culture is not particularly limited, and can be, for example, about 50 to 200 cells / ml.
培養の具体例は、非接着性条件下での三次元培養、例えば浮遊培養（例えば、分散培養、凝集浮遊培養など）、または接着条件下での二次元培養、例えば平板培養、あるいは、三次元培養後に二次元培養を行うという連続的な組み合わせ培養、などを包含する。通常、フィーダー細胞の存在下で分化誘導する場合には、二次元培養を使用することができ、フィーダー細胞の非存在下で分化誘導する場合には、三次元培養を使用することができる。 Specific examples of the culture include three-dimensional culture under non-adhesive conditions, such as suspension culture (for example, dispersion culture, aggregation suspension culture, etc.), or two-dimensional culture under adhesion conditions, such as plate culture, or three-dimensional culture. This includes continuous combination culture in which two-dimensional culture is performed after the culture. Usually, two-dimensional culture can be used when differentiation is induced in the presence of feeder cells, and three-dimensional culture can be used when differentiation is induced in the absence of feeder cells.
細胞接着性の培養器では、細胞との接着性を向上させる目的で、その表面を、細胞支持物質、例えばコラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ラミニン、フィブロネクチン、ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）などの物質でコーティングすることができる。 In the cell-adhesive incubator, for the purpose of improving the adhesion to cells, the surface is coated with a cell support material such as collagen, gelatin, poly-L-lysine, poly-D-lysine, laminin, fibronectin, Matrigel ™. (Becton, Dickinson and Company).
培養温度は、特に限定されないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ２含有空気の雰囲気下で培養が行われる。ＣＯ２濃度は、好ましくは約２〜５％である。培養期間は、分化誘導開始から４０日未満とすべきである。本発明の一実施態様において、培養期間は、３５日未満であり、より好ましくは３０日未満であり、より好ましくは２５日未満であり、そして最も好ましくは２０日未満である。 The culture temperature is not particularly limited, but is about 30 to 40 ° C., preferably about 37 ° C., and the culture is performed in an atmosphere of CO 2 -containing air. CO 2 concentration is preferably about 2-5%. The culture period should be less than 40 days from the start of differentiation induction. In one embodiment of the invention, the culture period is less than 35 days, more preferably less than 30 days, more preferably less than 25 days, and most preferably less than 20 days.
６．メラノサイト細胞群
本発明はまた、上記方法によって分化誘導されたメラノサイト細胞群を提供する。本発明の方法によって取得できるメラノサイト細胞群は、従来の分化誘導方法に比較して極めて短期間で調製することができる。また、本発明の方法によって分化誘導されたメラノサイト細胞群は、メラノサイトの成熟度、すなわち低い未分化細胞残存率、ヒトメラノサイトとの高い相同性等の点で優れたものであり得る。
6). Melanocyte Cell Group The present invention also provides a melanocyte cell group induced to differentiate by the above method. The melanocyte cell group that can be obtained by the method of the present invention can be prepared in a very short period of time compared to the conventional differentiation induction method. Moreover, the melanocyte cell group induced to differentiate by the method of the present invention may be excellent in terms of melanocyte maturity, that is, low undifferentiated cell residual rate, high homology with human melanocytes, and the like.
メラノサイトの成熟度は、例えば遺伝子発現プロファイルの取得によるヒトメラノサイトとの相同性評価、およびＦＡＣＳまたはＲＴ−ＰＣＲを使用した、小眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ）、チロシナーゼ関連タンパク（Ｔｒｐ−１、Ｔｒｐ−２／ＤＯＰＡクロムトウトメラーゼ；Ｄｃｔ）、チロシンキナーゼ（Ｋｉｔ）、チロシナーゼ、エンドセリンＢレセプター、ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）などの色素細胞マーカーの発現レベルを確認することによって評価することができる。 Melanocyte maturity is determined by, for example, homology evaluation with human melanocytes by obtaining a gene expression profile, and microphthalmia-related transcription factor (MITF), tyrosinase-related protein (Trp-1, Trp using FACS or RT-PCR. -2 / DOPA chrome tomerase; Dct), tyrosine kinase (Kit), tyrosinase, endothelin B receptor, dihydroxyphenylalanine (DOPA) and the like can be evaluated by confirming the expression level.
７．医療への応用
本発明のメラノサイト細胞群は、メラノサイトが欠乏した表皮組織の正常化のために有効に使用し得る。したがって、この細胞群は、メラノサイト欠乏に起因する任意の疾患の治療用細胞になり得る。
7). Medical application The melanocyte cell group of the present invention can be effectively used for normalization of epidermal tissue deficient in melanocytes. Therefore, this cell group can be a therapeutic cell for any disease caused by melanocyte deficiency.
そのような疾患の例としては、尋常性白斑、遺伝性対側性色素異常症や白皮症などの遺伝性色素異常症が挙げられる。 Examples of such diseases include vulgaris vulgaris, inherited dyschromatosis such as hereditary contralateral dyslipidemia and albinism.
メラノサイト細胞群を治療のために用いる場合、メラノサイト細胞を単離するかまたはその純度を高めることが望ましい。このために、例えばフローサイトメトリー法などが挙げられる。フローサイトメトリー法は、非常に細い流液中に細胞粒子を高速度で流し、レーザー光を照射して、粒子が発生する蛍光（細胞が予め蛍光標識された場合）、散乱光などの光を測定するものであり、セルソーターを備えると、目的の細胞を選別・分離することができる。細胞の蛍光標識は、神経前駆細胞に特異的な抗体（蛍光標識化）、例えば抗Ｎｅｓｔｉｎ抗体、によって行うことができる。また、抗癌剤含有培地での処理によって、未分化細胞を除去することができる。抗癌剤の例は、マイトマイシンＣ、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、メトトレキセートなどである。 When melanocyte cells are used for therapy, it is desirable to isolate or increase the purity of the melanocyte cells. For this purpose, for example, a flow cytometry method and the like can be mentioned. In the flow cytometry method, cell particles are flowed at a high speed in a very thin flow liquid, and laser light is irradiated to emit light such as fluorescence (when cells are pre-fluorescently labeled) and scattered light. If a cell sorter is provided for measurement, target cells can be selected and separated. Fluorescence labeling of cells can be performed with an antibody specific to neural progenitor cells (fluorescence labeling), such as an anti-Nestin antibody. In addition, undifferentiated cells can be removed by treatment with an anticancer agent-containing medium. Examples of anticancer agents are mitomycin C, 5-fluorouracil, adriamycin, methotrexate and the like.
上記のようにして単離または純度が高められたメラノサイト細胞群は、皮膚疾患部位へ直接移植してもよいし、皮膚疾患治療のための細胞製剤として製剤化してもよい。 The melanocyte cell group isolated or increased in purity as described above may be directly transplanted to a skin disease site, or may be formulated as a cell preparation for treatment of skin disease.
本発明の細胞製剤は、細胞の維持および増殖を補助する成分や他の医薬的に許容しうる担体を含んでいてもよい。 The cell preparation of the present invention may contain components that assist in the maintenance and growth of cells and other pharmaceutically acceptable carriers.
細胞の維持・増殖に必要な成分としては、炭素源、窒素源、ビタミン、ミネラル、塩類、各種サイトカイン等の培地成分、あるいはＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ等の細胞外マトリックス調製品、が挙げられる。 Ingredients necessary for cell maintenance / proliferation include medium components such as carbon sources, nitrogen sources, vitamins, minerals, salts, various cytokines, and extracellular matrix preparations such as Matrigel ™ .
本発明の細胞製剤に使用することができる医薬的に許容しうる担体として、これに限定されるものではないが、医薬的に許容される有機溶剤、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤等が挙げられる。 Examples of pharmaceutically acceptable carriers that can be used in the cell preparation of the present invention include, but are not limited to, pharmaceutically acceptable organic solvents, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, carboxyvinyl polymer, carboxy Sodium methylcellulose, sodium polyacrylate, sodium alginate, water-soluble dextran, sodium carboxymethyl starch, pectin, methylcellulose, ethylcellulose, xanthan gum, gum arabic, casein, agar, polyethylene glycol, diglycerin, glycerin, propylene glycol, petroleum jelly, paraffin, Stearyl alcohol, stearic acid, mannitol, sorbitol, lactose, surfactants acceptable as pharmaceutical additives, buffers, emulsifiers, suspending agents, none Agents, stabilizers, and the like.
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention concretely, this invention is not limited to these Examples.
１．ヒトｉＰＳ細胞
メラノサイトの分化誘導培養に使用した細胞は、東京慈恵会医科大学から提供されたものを使用した。この細胞は、４種類の遺伝子：ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、およびｃ−ＭＹＣが導入されたセンダイウイルスを血液内Ｔリンパ球に遺伝子導入（リプログラミング）に用いることによって樹立されたものである。
上記細胞について、下記のとおり免疫染色およびＲＴ−ＰＣＲを用いて、幹細胞（未分化）マーカーの発現を確認した。
1. Human iPS cells The cells used for differentiation induction culture of melanocytes were those provided by Tokyo Jikei University School of Medicine. This cell was established by using Sendai virus into which four types of genes: OCT3 / 4, SOX2, KLF4, and c-MYC were introduced for gene transfer (reprogramming) into blood T lymphocytes. .
About the said cell, the expression of the stem cell (undifferentiation) marker was confirmed using the immuno-staining and RT-PCR as follows.
免疫染色
免疫染色法で、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、およびＴＲＡ−１−８１細胞表面抗原の発現を検証した。
Immunostaining Immunostaining was used to verify the expression of SSEA-4, TRA-1-60, and TRA-1-81 cell surface antigens.
ＣＳＴジャパン株式会社の「免疫蛍光染色プロトコール（メタノール透過処理）」に従って、ｉＰＳ細胞の免疫染色を行った。一次抗体は、ＳｔｅｍＬｉｔｅ（商標）Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ ｋｉｔ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｃａｔ＃：９６５６）に含まれるもの（ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１）を用いた。また二次抗体としてＡｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（Ｒ）４８８Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，Ｈｏｓｔ；Ｇｏａｔ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｃａｔ＃：Ａ１１００１）を用いた。 In accordance with “Immunofluorescence staining protocol (methanol permeation treatment)” of CST Japan, iPS cells were immunostained. The primary antibodies (SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81) included in Stemlite (TM) Pluripotency Kit (Cell Signaling, Cat #: 9656) were used. Anti-mouse IgG (Alexa Fluor (R) 488 Conjugate, Host; Goat) (Molecular Probes, Cat #: A11001) was used as a secondary antibody.
その結果、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、およびＴＲＡ−１−８１細胞表面抗原の発現を示す蛍光が確認された（図１）。 As a result, fluorescence showing the expression of SSEA-4, TRA-1-60, and TRA-1-81 cell surface antigens was confirmed (FIG. 1).
ＲＴ−ＰＣＲ
ＲＴ−ＰＣＲを用いて幹細胞マーカーＤＤＰＡ４、ＥＳＧ１、ＬＩＮ２８、ＮＡＮＯＧ、ＲＥＸ１、ＴＤＧＦ１、ＴＥＲＴ、およびＺＩＣ３の発現を確認した。
RT-PCR
The expression of stem cell markers DDPA4, ESG1, LIN28, NANOG, REX1, TDGF1, TERT, and ZIC3 was confirmed using RT-PCR.
全ＲＮＡ抽出は、ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、製品プロトコールに従って行った。抽出後、ＭＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて、ｃＤＮＡ合成を行い、ＰＣＲ反応は、Ｅｘ−Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を使用した。ＲＴ−ＰＣＲの増幅産物を２％アガロースゲル電気泳動により分析した（図２）。 Total RNA extraction was performed by RNA isolation kit (QIAGEN, Hilden, Germany) according to the product protocol. After extraction, cDNA synthesis was performed using MMLV Reverse Transscriptase (Gibco / BRL, Gaithersburg, MD), and Ex-Taq polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) was used for the PCR reaction. RT-PCR amplification products were analyzed by 2% agarose gel electrophoresis (FIG. 2).
図２から明らかなとおり、本細胞抽出物において、幹細胞マーカーＤＤＰＡ４、ＥＳＧ１、ＬＩＮ２８、ＮＡＮＯＧ、ＲＥＸ１、ＴＤＧＦ１、ＴＥＲＴ、およびＺＩＣ３についての発現を確認することができた。 As is clear from FIG. 2, the expression of stem cell markers DDPA4, ESG1, LIN28, NANOG, REX1, TDGF1, TERT, and ZIC3 could be confirmed in this cell extract.
以上の結果に基づき、この細胞をメラノサイトの分化誘導に使用するヒトｉＰＳ細胞として以下の培養実験に用いた。 Based on the above results, this cell was used in the following culture experiment as a human iPS cell used for induction of melanocyte differentiation.
２．ヒトｉＰＳ細胞の培養
ヒトｉＰＳ細胞は、ＤＭＥＭ−Ｆ１２（ＳＩＧＭＡ Ｄ６４２１）、１０％Ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ（１００Ｘ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１．２５％ＰＳＧ（１００Ｘ）、２５％ＫｎｏｃｋＯｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ５５ｍＭ ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５ｎｇ／ｍｌｂＦＧＦ（Ｗａｋｏ）を含むｉＰＳ細胞培養用培地を用い、マウス胎児繊維芽細胞上で維持した。すなわち、マイトマイシンＣ処理済みマウス胎児線維芽細胞上にヒトｉＰＳ細胞を播種し、ｉＰＳ細胞培養用培地中、３７℃、５％ＣＯ２，２０％Ｏ２の雰囲気下で維持した。原則として毎日培地交換を行い、コロニーが十分に大きくなった際には継代を行った。
2. Culture of human iPS cells Human iPS cells are expressed in DMEM-F12 (SIGMA D6421), 10% Nonsensible amino acid (100X) (Invitrogen), 1.25% PSG (100X), 25% KnockOut Serum Replacement (KSR) (Invitrogen) IPS cell culture medium containing 0.1 mM 55 mM 2-mercaptoethanol (Invitrogen), 5 ng / ml bFGF (Wako), and maintained on mouse fetal fibroblasts. That is, human iPS cells were seeded on mitomycin C-treated mouse embryonic fibroblasts and maintained in an iPS cell culture medium at 37 ° C. in an atmosphere of 5% CO 2 and 20% O 2 . In principle, the medium was changed every day, and subculture was performed when the colonies became sufficiently large.
３．分化誘導培養
ｉＰＳ細胞のマトリゲル上への継代
メラノサイトへの分化誘導を実施するにあたり、無フィーダー培養とするため、マトリゲル上にｉＰＳ細胞を継代した。ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ（基底膜マトリックス）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をＤＭＥＭ−Ｆ１２で３０倍に希釈し、これを２ｍＬずつ６０ｍｍ ｄｉｓｈ加え、３７℃で１時間コーティングした。継代可能となったｉＰＳ細胞コロニーの育っているｄｉｓｈを、ＲＯＣＫ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを添加したｉＰＳ細胞培養用培地で１時間以上Ｐｒｅ―ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎし、通常の継代と同様にｉＰＳ細胞のコロニーを剥がした。剥がしたコロニーを１５ｍＬ遠心ｔｕｂｅに回収し、１０００ｒｐｍ、５ｍｉｎで遠心分離した。上清を除き、ＲＯＣＫ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを添加したｉＰＳ細胞培養用培地に懸濁した。これを予めゼラチンコートした６０ｍｍ ｄｉｓｈに播種し、３７℃のＣＯ2インキュベーター内で２時間培養した。この間に、フィーダー細胞のＭＥＦは接着するが、ｉＰＳ細胞のコロニーは接着しなかった。２時間後、上清ごとｉＰＳ細のコロニーを１５ｍＬ遠心ｔｕｂｅに回収し、１０００ｒｐｍ、５ｍｉｎで遠心分離した。遠心分離後、予め調製したＭＥＦ―Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ Ｍｅｄｉｕｍにコロニーを懸濁し、Ｍａｔｒｉｇｅｌをコーティングした６０ｍｍ ｄｉｓｈに播種した。播種後の６０ｍｍ ｄｉｓｈあたりのコロニー数は２０前後であった。その後、３７℃、５％ＣＯ2で１晩培養した。
3. Differentiation induction culture
Passage of iPS cells onto matrigel In order to induce differentiation into melanocytes, iPS cells were passaged on matrigel to achieve feeder-free culture. Matrigel ™ (basement membrane matrix) (BD Biosciences) was diluted 30-fold with DMEM-F12, and 2 mL each was added in 60 mm dish and coated at 37 ° C. for 1 hour. The dishes in which iPS cell colonies that had become passable were grown were pre-incubated for 1 hour or more in an iPS cell culture medium supplemented with ROCK inhibitor, and the iPS cell colonies were peeled off in the same manner as in normal passage. The peeled colonies were collected in a 15 mL centrifugal tube and centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes. The supernatant was removed and suspended in an iPS cell culture medium supplemented with ROCK inhibitor. This was seeded on a gelatin-coated 60 mm dish and cultured in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 2 hours. During this time, feeder cell MEFs adhered, but iPS cell colonies did not adhere. After 2 hours, the iPS fine colonies together with the supernatant were collected in a 15 mL centrifuge tube and centrifuged at 1000 rpm for 5 min. After centrifugation, colonies were suspended in MEF-Conditioned Medium prepared in advance and seeded in a 60 mm dish coated with Matrigel. The number of colonies per 60 mm dish after sowing was around 20. Thereafter, the cells were cultured overnight at 37 ° C. and 5% CO 2 .
ｉＰＳ細胞の分化誘導培養
ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ（基底膜マトリックス）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上への継代翌日、コロニーが接着しているのを確認してから、上記組成の培地に培地交換を行った。次いで、ヒトｉＰＳ細胞（５０〜２００細胞／ｍＬ）をＭＥＦ−Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ Ｍｅｄｉｕｍに懸濁下で播種し、Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ ｍｅｄｉｕｍ ２５４（ＧＩＢＣＯ）、Ｇｒｏｗｔｈ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ Ｈｕｍａｎ Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ−２（ＧＩＢＣＯ）、２０ｎＭ ｈｕｍａｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＢＭＰ４（Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、０．３ｍＭ ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、５０ｎｇ／ｍｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ（ＳＣＦ，Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１０−７Ｍ ａｌｌ−ｔｒａｎｓ Ｒｅｔｉｎｏｉｃ Ａｃｉｄ （Ｓｉｇｍａ）を含む分化誘導培地に、１０−７Ｍ 活性型ビタミンＤ３（１，２５−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎ Ｄ３；１，２５（ＯＨ）２Ｄ３）（Ｅｎｚｏ）をさらに加え、培地交換を行った。培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下、接着での培養によるものであった。
培養後１日目、４日目および１９日目の培養細胞の写真図を図３に示す。
On the next day after passage on the differentiation-inducing culture Matrigel ™ (basement membrane matrix) (BD Biosciences) of iPS cells, the medium was changed to the medium having the above composition. Subsequently, human iPS cells (50-200 cells / mL) were seeded in suspension in MEF-Conditioned Medium, Melanocycle medium 254 (GIBCO), Growth supplements for melanocites Human Gypsum Mine Cycle Migrate BMP4 (R & D Systems), 0.3 mM ascorbic acid (Sigma-Aldrich), 50 ng / ml stem cell factor (SCF, R & D Systems), 10 −7 Mall-trans Retinoic Acid (Sigma differentiation medium) -7 M active vitamin D3 (1,25 -Dihydroxyvitamin D3; 1,25 (OH) 2D3) (Enzo) was further added, and the medium was changed. The culture conditions were as follows: culture at 37 ° C. and 5% CO 2 atmosphere.
The photograph figure of the cultured cell of the 1st day, the 4th day, and the 19th day after culture | cultivation is shown in FIG.
３．分化誘導細胞の検証
分化誘導後の細胞について、免疫染色法によりメラノサイトマーカーであるＳ１００、およびエンドセリンレセプター（ＥＤＮＢ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の発現を評価した。また、細胞によるメラニン産生を、ＤＯＰＡ反応およびチロシナーゼ活性を測定することによって確認した。
3. Verification of differentiation-inducing cells The cells after differentiation induction were evaluated for expression of S100, which is a melanocyte marker, and endothelin receptor (EDNB Receptor) by immunostaining. In addition, melanin production by the cells was confirmed by measuring DOPA reaction and tyrosinase activity.
免疫染色法
分化誘導開始後、１９日が経過した細胞をコラーゲンコート済み８ｗｅｌｌチャンバースライド(ＢＤ Ｆａｌｃｏｎカルチャースライド、Ｃａｔ. Ｎｏ. ３５４６３０)上に１．８ｘ１０×４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種した。
９５％アルコールで細胞を固定し、一次抗体として抗Ｓ‐１００抗体(ＤＡＫＯ)および抗エンドセリンＢ受容体抗体（ａｂｃａｍ，１３５６１１）を用いて免疫染色を行った。二次抗体としてＨＲＰ標識抗体（Ｇｏａｔ ｐＡｂ ｔｏ Ｒｂ ＩｇＧ（ＨＰＲ），ａｂｃａｍ９７０５１）を用い、ＤＡＢ（３，３’‐ＤｉａｍｉｎｏＢｅｎｚｉｄｉｎｅ）にて発色させた。対比染色として核をヌクレアファストレッドにて染色した。ネガティブコントロールとして一次抗体を添加せず染色を行い、評価に用いた。画像撮影はＢＩＯＲＥＶＯ (ＫＥＹＥＮＣＥ)にて撮影した（図４および５）。
19 days after the initiation of differentiation by immunostaining , cells that had passed 19 days were seeded at 1.8 × 10 × 4 cells / well on collagen-coated 8-well chamber slides (BD Falcon culture slide, Cat. No. 354630).
Cells were fixed with 95% alcohol, and immunostaining was performed using anti-S-100 antibody (DAKO) and anti-endothelin B receptor antibody (abcam, 135611) as primary antibodies. An HRP-labeled antibody (Goat pAb to Rb IgG (HPR), abcam97051) was used as a secondary antibody, and color was developed with DAB (3,3′-DiaminoBenzidine). As a counterstain, nuclei were stained with Nuclea Fast Red. As a negative control, staining was performed without adding a primary antibody and used for evaluation. Images were taken with BIOREVO (KEYENCE) (FIGS. 4 and 5).
図４および図５から分かるとおり、メラノサイトマーカーであるＳ１００タンパク質、エンドリンレセプターの存在を示す染色が観察された。 As can be seen from FIGS. 4 and 5, staining indicating the presence of the melanocyte marker S100 protein, an endrin receptor, was observed.
ＤＯＰＡ反応
分化誘導開始後、１９日が経過した細胞を６０ｍｍ ｄｉｓｈ上で２％パラホルムアルデヒドｉｎ ＰＢＳ（−）で室温、１５分間固定した。固定後、細胞をＰＢＳ（−）で３回洗浄し、０．１Ｍ リン酸Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．２）中の０．１％ＤＯＰＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を加え、３７℃にて５時間反応させた。反応液は反応開始より２．５時間の時点で１度交換した。対比染色として核をヌクレアファストレッドにて染色した。画像撮影はＢＩＯＲＥＶＯ（ＫＥＹＥＮＣＥ）にて撮影した（図６）。図６から分かるとおり、チロシナーゼとＤＯＰＡの反応に由来する染色を観察することができた。
After starting the induction of DOPA reaction differentiation, the cells after 19 days were fixed with 2% paraformaldehyde in PBS (−) on a 60 mm dish at room temperature for 15 minutes. After fixation, the cells were washed 3 times with PBS (−), 0.1% DOPA (Sigma, St Louis, MO) in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.2) was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 5 hours. Reacted. The reaction solution was changed once at 2.5 hours from the start of the reaction. As a counterstain, nuclei were stained with Nuclea Fast Red. Images were taken with BIOREVO (KEYENCE) (FIG. 6). As can be seen from FIG. 6, staining derived from the reaction of tyrosinase and DOPA could be observed.
チロシナーゼ活性の測定
分化誘導開始後、２５日が経過した細胞を、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１％ＮＰ−４０、０．０１％ＳＤＳ、１００μＭ ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍＬ Ａｐｒｏｔｉｎｉｎを組成とする抽出Ｂｕｆｆｅｒで回収し、チロシナーゼ活性の測定を行った。活性測定にはコロニーが１５〜２０個程度育った６０ｍｍ ｄｉｓｈを1枚用いた。抽出Ｂｕｆｆｅｒ １５０μＬを６０ｍｍ ｄｉｓｈに加え、４℃にて３時間可溶化した。３時間経過後、１．５ｍＬ ｔｕｂｅに細胞溶解液を回収し、タッチミキサーでよく混和した。この細胞溶解液２０μＬをとり、チロシナーゼ活性測定に用いた。９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅの各ｗｅｌｌに細胞溶解液２０μＬ、４％Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ、１００ｍＭ リン酸Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．１）からなるＡｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ ８０μＬ、２０．７ｍＭ ＭＢＴＨ溶液（３−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｏｎｅ ｈｙｄｒａｚｏｎｅ）６０μＬ、５ｍＭ Ｌ―ＤＯＰＡ溶液（３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）４０μＬをそれぞれ加え、３７℃にて３０分間反応させた。呈色反応後、４９２ｎｍでの吸光度をｔｒｉｐｌｉｃａｔｅで測定し、チロシナーゼ活性を評価した（図７）。陰性コントロールとして細胞溶解液の代わりに抽出Ｂｕｆｆｅｒを加えた系を用いた。
図７から明らかなとおり、分化誘導開始後２５日目の細胞において、チロシナーゼ活性の存在が有意に認められた。
Measurement of tyrosinase activity Cells that have passed 25 days after the initiation of differentiation were composed of 0.1 M Tris-HCl (pH 7.5), 1% NP-40, 0.01% SDS, 100 μM PMSF, 1 μg / mL Aprotinin. And recovered with an extraction buffer, and tyrosinase activity was measured. For the activity measurement, one 60 mm dish in which about 15 to 20 colonies were grown was used. 150 μL of extracted buffer was added to a 60 mm dish and solubilized at 4 ° C. for 3 hours. After 3 hours, the cell lysate was collected in 1.5 mL tube and mixed well with a touch mixer. 20 μL of this cell lysate was taken and used for tyrosinase activity measurement. Cell well 20 μL, 96% plate lysate 20 μL, 4% dimethylformamide, 100 mM phosphate buffer (pH 7.1) Assay Buffer 80 μL, 20.7 mM MBTH solution (3-methyl-2-benzothiolinone) 60 μL 40 μL of a DOPA solution (3,4-dihydroxy-L-phenylalanine) was added thereto and reacted at 37 ° C. for 30 minutes. After the color reaction, the absorbance at 492 nm was measured by triplicate to evaluate tyrosinase activity (FIG. 7). As a negative control, a system in which an extraction buffer was added instead of the cell lysate was used.
As is clear from FIG. 7, the presence of tyrosinase activity was significantly observed in the cells on the 25th day after the initiation of differentiation induction.
このように、上に示した分化誘導培養によれば、分化誘導開始後１９日目には、メラノサイトの分化マーカーの発現が確認され、分化誘導開始後２５日目には、メラニン生成能が確認された。従来の方法がメラノサイトの分化誘導に少なくとも４０日以上要していたことに鑑みれば、この結果は驚くべきことである。 Thus, according to the differentiation-inducing culture shown above, the expression of the differentiation marker of melanocytes was confirmed on the 19th day after the initiation of differentiation induction, and the ability to produce melanin was confirmed on the 25th day after the initiation of differentiation induction. It was done. This result is surprising in view of the fact that conventional methods required at least 40 days or more for induction of melanocyte differentiation.
４．活性型ビタミンＤ３のメラノサイト分化誘導に及ぼす影響
活性型ビタミンＤ３のメラノサイトの分化誘導に及ぼす影響をさらに評価するために、以下の試験を実施した。
4). Effect of active vitamin D3 on melanocyte differentiation induction In order to further evaluate the effect of active vitamin D3 on melanocyte differentiation induction, the following test was performed.
ＤＯＰＡ反応
活性型ビタミンＤ３の有無による分化誘導効率を比較するために、上記３．の分化誘導培養において、活性型ビタミンＤ３（１０−７Ｍ）の有無の点でのみ異なる２つの培養条件で分化誘導した細胞におけるＤＯＰＡ反応を比較した。すなわち、分化誘導開始後、２８日が経過した細胞を６０ｍｍ ｄｉｓｈ上で２％パラホルムアルデヒドｉｎ ＰＢＳ（−）で室温、１５分間固定し、固定後、細胞をＰＢＳ（−）で３回洗浄し、０．１Ｍ リン酸Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．２）中の０．１％ＤＯＰＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を加え、３７℃にて５時間反応させた。反応液は反応開始より２．５時間の時点で１度交換した。対比染色として核をヌクレアファストレッドにて染色した（図８）。
図８の結果が示す通り、活性型ビタミンＤ３を添加して分化誘導を行った場合の方が、ＤＯＰＡ反応陽性の細胞の割合が多いことが確認された。
In order to compare the differentiation induction efficiency with and without DOPA reaction active vitamin D3, the above 3. In the differentiation-inducing culture, the DOPA reaction in cells induced to differentiate under two different culture conditions only in the presence or absence of active vitamin D3 (10 −7 M) was compared. That is, after the initiation of differentiation, cells that had passed 28 days were fixed with 2% paraformaldehyde in PBS (−) for 15 minutes at room temperature on a 60 mm dish, and after fixation, the cells were washed three times with PBS (−). 0.1% DOPA (Sigma, St Louis, MO) in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.2) was added, and reacted at 37 ° C. for 5 hours. The reaction solution was changed once at 2.5 hours from the start of the reaction. As a counterstain, nuclei were stained with Nuclea Fast Red (FIG. 8).
As shown in the results of FIG. 8, it was confirmed that the proportion of cells positive for DOPA reaction was higher when differentiation was induced by adding active vitamin D3.
活性型ビタミンＤ３の濃度検討
メラノサイト分化培養における活性型ビタミンＤ３の適切な濃度を検証するために、活性型ビタミンＤ３の存在下でのメラノサイト前駆体であるヒトメラノブラストを用いた培養試験を行った。
Examination of concentration of active vitamin D3 In order to verify the appropriate concentration of active vitamin D3 in melanocyte differentiation culture, a culture test using human melanoblast, a melanocyte precursor in the presence of active vitamin D3, was conducted. .
（試験１）
９６ウェルプレートに２０００個のヒトメラノブラスト（放射線医学総合研究所、広部知久博士から提供された）を播種し、ヒトメラノブラスト増殖培養液ＭＤＭＤＦ（Ｆ−１０ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｈａｍ） ｗｉｔｈ Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ （ＧＩＢＣＯ）、５０μｇ／ｍＬ Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ（ＧＩＢＣＯ）、１００Ｕ、１００μｇ／ｍＬ Ｐｅｎｉｃｉｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＧＩＢＣＯ）、０．２５μｇ／ｍＬ Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂ、１０μｇ／ｍＬ Ｉｎｓｕｌｉｎ、１０μｇ／ｍＬ ＢＳＡ、６ｎｇ／ｍＬ Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、１μｇ／ｍＬ Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、１０ｎＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｓｅｌｅｎｉｔｅ、０．５ｍＭ Ｎ６，２−Ｏ−Ｄｉｂｕｔｙｒｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ３’，５’−ｃｙｃｌｉｃ ｍｏｎｏｐｈｏｓｕｐｈａｔｅ ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ、２．５ｎｇ／ｍＬ Ｂａｓｉｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、１００μｇ／ｍＬ ａｐｏ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｂｏｖｉｎｅ、１０ｎＭ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１、５ｎｇ／ｍＬ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒ）中で培養し、翌日に活性型ビタミンＤ３を１０−10Ｍ〜１０−7Ｍの各濃度で培養し、５日後にＡｌａｍａｒｂｌｕｅｄｙｅ（Ｔｒｅｋ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｉｎc）で４時間培養し、マイクロプレートリーダーを用いて吸光度を計測した。
図９に示す結果から、ヒトメラノブラストは、活性型ビタミンＤ３の存在に起因して、増殖が阻害される一方で培養細胞が適切に維持されることが確認された。細胞の分化と増殖とが同時には起こらないことに鑑みれば、この結果は、活性型ビタミンＤ３が、少なくとも上記の濃度範囲において、培養細胞に悪影響を及ぼすことなく、メラノサイトの分化誘導に使用できることを示している。
(Test 1)
A 96-well plate was seeded with 2000 human melanoblasts (provided by Dr. Tomohisa Hirobe, National Institute of Radiological Sciences), and human melanoblast growth medium MDMDF (F-10 neutral mixture (Ham) with L-Glutamine). (GIBCO), 50 μg / mL Gentaminin (GIBCO), 100 U, 100 μg / mL Penicillin-Streptomycin (GIBCO), 0.25 μg / mL Amphotericin B, 10 μg / mL Insulin, 10 μg / mL BSA, 6 ng / mL Eth O-phosphoethanolamine, 10 nM sodium serene, 0.5 mM N6, 2-O-Dibutylyl adenosine 3 ′, 5′-cyclic monophosphosodium salt, 2.5 ng / mL Basic Fibroblast Growth Factor, 100 μg / mL apo-Transferrin bovine, 10 nM Endogent Vitamin D3 was cultured at various concentrations of 10 −10 M to 10 −7 M, and after 5 days, cultured for 4 hours in Alamarblueye (Trek Diagnostics System, Inc), and the absorbance was measured using a microplate reader.
From the results shown in FIG. 9, it was confirmed that human melanoblast was inhibited from growing and maintained cultured cells appropriately due to the presence of active vitamin D3. In view of the fact that cell differentiation and proliferation do not occur simultaneously, this result indicates that active vitamin D3 can be used to induce differentiation of melanocytes without adversely affecting cultured cells at least in the above concentration range. Show.
（試験２）
９６ウェルプレートに５０００個のヒトメラノブラスト（放射線医学総合研究所、広部知久博士から提供された）を播種し、ヒトメラノブラスト増殖培養液ＭＤＭＤＦ（Ｆ−１０ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｈａｍ） ｗｉｔｈ Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ （ＧＩＢＣＯ）、５０μｇ／ｍＬ Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ（ＧＩＢＣＯ）、１００Ｕ、１００μｇ／ｍＬ Ｐｅｎｉｃｉｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＧＩＢＣＯ）、０．２５μｇ／ｍＬ Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂ、１０μｇ／ｍＬ Ｉｎｓｕｌｉｎ、１０μｇ／ｍＬ ＢＳＡ、６ｎｇ／ｍＬ Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、１μｇ／ｍＬ Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、１０ｎＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｓｅｌｅｎｉｔｅ、０．５ｍＭ Ｎ６，２’−Ｏ−Ｄｉｂｕｔｙｒｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ３’，５’−ｃｙｃｌｉｃ ｍｏｎｏｐｈｏｓｕｐｈａｔｅ ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ、２．５ｎｇ／ｍＬ Ｂａｓｉｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、１００μｇ／ｍＬ ａｐｏ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｂｏｖｉｎｅ、１０ｎＭ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１、５ｎｇ／ｍＬ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒ）中、活性型ビタミンＤ３を１０−１０Ｍ〜１０−７Ｍの各濃度で７２時間培養し、チロシナーゼ活性の測定をした。
すなわち、細胞をＰＢＳ（−）にて洗浄後、抽出Ｂｕｆｆｅｒ（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）／１％ ＮＰ−４０／０．０１％ ＳＤＳ／１００μＭ ＰＭＳＦ／１μｇ／ｍＬ Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）を２０μＬ／ｗｅｌｌ加え、冷蔵庫で３時間可溶化する。細胞を可溶化後、Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ（４％ Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ／１００ｍＭ リン酸Ｂｕｆｆｅｒ）を８０μＬ／ｗｅｌｌ、２０．７ｍＭ ＭＢＴＨ（３−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｌｉｎｏｎｅ ｈｙｄｒａｚｏｎｅ）を６０μＬ／ｗｅｌｌ、５ｍＭ Ｌ−ＤＯＰＡを４０μＬ／ｗｅｌｌ添加し３７℃にて３０−６０ｍｉｎ反応させる。４９２ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーにて測定した。
図１０に示す結果から、ヒトメラノブラストのチロシナーゼ活性は、活性型ビタミンＤ３の濃度に依存して増加することが確認された。また、この結果は、活性型ビタミンＤ３が、培養細胞に悪影響を及ぼすことなく、メラノサイトの分化誘導に使用できることを支持するものである。
(Test 2)
A 96-well plate was seeded with 5000 human melanoblasts (provided by Dr. Tomohisa Hirobe, National Institute of Radiological Sciences), and human melanoblast growth medium MDMDF (F-10 Nutrient mixture (Ham) with L-Glutamine). (GIBCO), 50 μg / mL Gentaminin (GIBCO), 100 U, 100 μg / mL Penicillin-Streptomycin (GIBCO), 0.25 μg / mL Amphotericin B, 10 μg / mL Insulin, 10 μg / mL BSA, 6 ng / mL Eth O-phosphoylethanolamine, 10 nM sodium serene, 0.5 mM N6,2′-O-Dibutyry adenosine3 ', 5'-cyclic monophosuphate sodium salt, 2.5ng / mL Basic Fibroblast Growth Factor, 100μg / mL apo-Transferrin bovine, 10nM Endothelin-1,5ng / mL Stem Cell Factor) in the active vitamin D3 10 - Culturing was carried out at a concentration of 10 M to 10 −7 M for 72 hours, and tyrosinase activity was measured.
That is, after washing the cells with PBS (−), 20 μL of extraction buffer (0.1 M Tris-HCl (pH 7.2) / 1% NP-40 / 0.01% SDS / 100 μM PMSF / 1 μg / mL Aprotinin) was used. Add / well and solubilize in refrigerator for 3 hours. After solubilization of the cells, Assay Buffer (4% Dimethylformamide / 100 mM Phosphate Buffer) was 80 μL / well, 20.7 mM MBTH (3-methyl-2-benzoline hydrazine) was 60 μL / well, and 5 mM L-DOPA 40 μL / well. Add and react at 37 ° C. for 30-60 min. Absorbance at 492 nm was measured with a microplate reader.
From the results shown in FIG. 10, it was confirmed that the tyrosinase activity of human melanoblast increases depending on the concentration of active vitamin D3. This result also supports that active vitamin D3 can be used for induction of melanocyte differentiation without adversely affecting cultured cells.
（試験３）
ヒトメラノブラストを６０ｍｍ ｄｉｓｈに播種し、１０−５Ｍの活性型ビタミンＤ３を添加して５日間培養し、ＤＯＰＡ反応を１０−５Ｍの活性型ビタミンＤ３を添加しなかった場合と比較した。なお、本培養には、以下の組成を有するヒトメラノブラスト増殖培養液ＭＤＭＤＦを用いた：Ｆ−１０ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｈａｍ） ｗｉｔｈ Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ （ＧＩＢＣＯ）、５０μｇ／ｍＬ Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ（ＧＩＢＣＯ）、１００Ｕ、１００μｇ／ｍＬ Ｐｅｎｉｃｉｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＧＩＢＣＯ）、０．２５μｇ／ｍＬ Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂ、１０μｇ／ｍＬ Ｉｎｓｕｌｉｎ、１０μｇ／ｍＬ ＢＳＡ、６ｎｇ／ｍＬ Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、１μｇ／ｍＬ Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、１０ｎＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｓｅｌｅｎｉｔｅ、０．５ｍＭ Ｎ６，２’−Ｏ−Ｄｉｂｕｔｙｒｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ３’，５’−ｃｙｃｌｉｃ ｍｏｎｏｐｈｏｓｕｐｈａｔｅ ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ、２．５ｎｇ／ｍＬ Ｂａｓｉｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、１００μｇ／ｍＬ ａｐｏ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｂｏｖｉｎｅ、１０ｎＭ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１、５ｎｇ／ｍＬ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒ）
細胞を６０ｍｍ ｄｉｓｈ上で、ＰＢＳ（−）中の２％パラホルムアルデヒドで室温下、１５分間固定した。固定後、細胞をＰＢＳ（−）で３回洗浄し、０．１Ｍ リン酸Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．２）中の０．１％ＤＯＰＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を加え、３７℃にて５時間反応させた。反応液は途中で２度交換した。対比染色として核をヌクレアファストレッドにて染色した。画像撮影はＢＩＯＲＥＶＯ（ＫＥＹＥＮＣＥ）にて撮影した（図１１）。
図１１から、活性型ビタミンＤ３を加えて培養を行ったヒトメラノブラストにおいて、ＤＯＰＡ反応に陽性の割合がより多いことが確認された。また、この結果は、活性型ビタミンＤ３が、１０−５Ｍの濃度において、培養細胞に悪影響を及ぼすことなく、メラノサイトの分化誘導に使用できることを支持するものである。
(Test 3)
Human melanoblasts were seeded in a 60 mm dish, 10 −5 M active vitamin D3 was added and cultured for 5 days, and the DOPA reaction was compared with the case where 10 −5 M active vitamin D3 was not added. In addition, human melanoblast growth medium MDMDF having the following composition was used for the main culture: F-10 Nutrient mixture (Ham) with L-Glutamin (GIBCO), 50 μg / mL Gentamin (GIBCO), 100 U, 100 μg / ML Penicillin-Streptomycin (GIBCO), 0.25 μg / mL Amphotericin B, 10 μg / mL Insulin, 10 μg / mL BSA, 6 ng / mL Ethanolamine, 1 μg / mL O-phosphorethanemine, 10 nM -O-Dibutylyladenosine 3 ', 5'-cyclic monophosphophat sodium salt, 2.5ng / mL Basic Fibroblast Growth Factor, 100μg / mL apo-Transferrin bovine, 10nM Endothelin-1,5ng / mL Stem Cell Factor)
Cells were fixed on a 60 mm dish with 2% paraformaldehyde in PBS (-) for 15 minutes at room temperature. After fixation, the cells were washed 3 times with PBS (−), 0.1% DOPA (Sigma, St Louis, MO) in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.2) was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 5 hours. Reacted. The reaction solution was changed twice during the process. As a counterstain, nuclei were stained with Nuclea Fast Red. Images were taken with BIOREVO (KEYENCE) (FIG. 11).
From FIG. 11, it was confirmed that the human melanoblast cultured with the addition of active vitamin D3 has a higher ratio of positive to DOPA reaction. This result also supports that active vitamin D3 can be used for inducing differentiation of melanocytes without adversely affecting cultured cells at a concentration of 10 −5 M.
（試験４）
ヒトメラノブラストを１００ｍｍ ｄｉｓｈに播種し、１０−５Ｍの活性型ビタミンＤ３を添加して５日間培養し、電子顕微鏡を用いて、Ｍｅｌａｎｏｓｏｍｅの形態を、活性型ビタミンＤ３を添加しなかった場合と比較した（図１２）。なお、本培養には、以下の組成を有するヒトメラノブラスト増殖培養液ＭＤＭＤＦを用いた：Ｆ−１０ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｈａｍ） ｗｉｔｈ Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ （ＧＩＢＣＯ）、５０μｇ／ｍＬ Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ（ＧＩＢＣＯ）、１００Ｕ、１００μｇ／ｍＬ Ｐｅｎｉｃｉｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＧＩＢＣＯ）、０．２５μｇ／ｍＬ Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂ、１０μｇ／ｍＬ Ｉｎｓｕｌｉｎ、１０μｇ／ｍＬ ＢＳＡ、６ｎｇ／ｍＬ Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、１μｇ／ｍＬ Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、１０ｎＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｓｅｌｅｎｉｔｅ、０．５ｍＭ Ｎ６，２’−Ｏ−Ｄｉｂｕｔｙｒｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ３’，５’−ｃｙｃｌｉｃ ｍｏｎｏｐｈｏｓｕｐｈａｔｅ ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ、２．５ｎｇ／ｍＬ Ｂａｓｉｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、１００μｇ／ｍＬ ａｐｏ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｂｏｖｉｎｅ、１０ｎＭ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１、５ｎｇ／ｍＬ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒ）
図１２から、活性型ビタミンＤ３を加えて培養したヒトメラノブラストの方が、Ｍｅｌａｎｏｓｏｍｅの発達段階が進んでいることが確認された。また、この結果は、活性型ビタミンＤ３が、１０−５Ｍの濃度において、培養細胞に悪影響を及ぼすことなく、メラノサイトの分化誘導に使用できることを支持するものである。
(Test 4)
Human melanoblasts were seeded on a 100 mm dish, 10 −5 M active vitamin D3 was added and cultured for 5 days, and the form of Melanosome was observed using an electron microscope and no active vitamin D3 was added. Comparison was made (FIG. 12). In addition, human melanoblast growth medium MDMDF having the following composition was used for the main culture: F-10 Nutrient mixture (Ham) with L-Glutamin (GIBCO), 50 μg / mL Gentamin (GIBCO), 100 U, 100 μg / ML Penicillin-Streptomycin (GIBCO), 0.25 μg / mL Amphotericin B, 10 μg / mL Insulin, 10 μg / mL BSA, 6 ng / mL Ethanolamine, 1 μg / mL O-phosphorethanemine, 10 nM -O-Dibutylyladenosine 3 ', 5'-cyclic monophosphophat sodium salt, 2.5ng / mL Basic Fibroblast Growth Factor, 100μg / mL apo-Transferrin bovine, 10nM Endothelin-1,5ng / mL Stem Cell Factor)
From FIG. 12, it was confirmed that the developmental stage of Melanosome was advanced in human melanoblast cultured with the addition of active vitamin D3. This result also supports that active vitamin D3 can be used for inducing differentiation of melanocytes without adversely affecting cultured cells at a concentration of 10 −5 M.
（試験５）
ヒトメラノブラストを６０ｍｍ ｄｉｓｈに播種し、ヒトメラノブラスト増殖培養液ＭＤＭＤＦ（Ｆ−１０ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｈａｍ） ｗｉｔｈ Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ （ＧＩＢＣＯ）、５０μｇ／ｍＬ Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ（ＧＩＢＣＯ）、１００Ｕ、１００μｇ／ｍＬ Ｐｅｎｉｃｉｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＧＩＢＣＯ）、０．２５μｇ／ｍＬ Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂ、１０μｇ／ｍＬ Ｉｎｓｕｌｉｎ、１０μｇ／ｍＬ ＢＳＡ、６ｎｇ／ｍＬ Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、１μｇ／ｍＬ Ｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、１０ｎＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｓｅｌｅｎｉｔｅ、０．５ｍＭ Ｎ６，２’−Ｏ−Ｄｉｂｕｔｙｒｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ３’，５’−ｃｙｃｌｉｃ ｍｏｎｏｐｈｏｓｕｐｈａｔｅ ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ、２．５ｎｇ／ｍＬ Ｂａｓｉｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、１００μｇ／ｍＬ ａｐｏ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｂｏｖｉｎｅ、１０ｎＭ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１、５ｎｇ／ｍＬ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒ）中、活性型ビタミンＤ３を１０−１０Ｍ〜１０−６Ｍの各濃度で添加して５日間培養し、抗Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ抗体（Ａｂｄａｍ）を用いてウェスタンブロットを行った（図１３）。
図１３から、ヒトメラノブラストのＥｎｄｏｔｈｅｌｉｎ Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒの発現は、ビタミンＤ３の濃度依存的に増加することが確認された。また、この結果は、活性型ビタミンＤ３が、１０−１０Ｍ〜１０−６Ｍの濃度範囲において、培養細胞に悪影響を及ぼすことなく、メラノサイトの分化誘導に使用できることを支持するものである。
(Test 5)
Human melanoblasts were seeded in a 60 mm dish, and human melanoblast growth medium MDMDF (F-10 Nutrient mixture (Ham) with L-Glutamine (GIBCO), 50 μg / mL Gentamin (GIBCO), 100 U, 100 μg / t pmtomin (GIBCO), 0.25 [mu] g / mL Amphotericin B, 10 [mu] g / mL Insulin, 10 [mu] g / mL BSA, 6 ng / mL Ethanolamine, 1 [mu] g / mL O-phospholeethanolamine, 10 nM Sodium serum, 0.5 mM N6, 2'- 3'-O'3 ', , 5'-cyclic monophospha e sodium salt, 2.5ng / mL Basic Fibroblast Growth Factor, 100μg / mL apo-Transferrin bovine, 10nM Endothelin-1,5ng / mL Stem Cell Factor) in the active vitamin D3 10 -10 M~10 -6 M Each of these concentrations was added and cultured for 5 days, and Western blotting was performed using an anti-Endothelin B receptor antibody (Abdam) (FIG. 13).
From FIG. 13, it was confirmed that the expression of Endothelin B receptor of human melanoblast increases depending on the concentration of vitamin D3. In addition, this result supports that active vitamin D3 can be used for inducing differentiation of melanocytes without adversely affecting cultured cells in a concentration range of 10 −10 M to 10 −6 M.
以上の通り、メラノサイトの分化誘導方法において、これまでに使用実績のなかった活性型ビタミンＤ３を培養系に含有させることで、従来のメラノサイトの分化誘導方法と比較して、はるかに短期間または効率的にメラノサイトを分化誘導できることが示された。 As described above, in the method for inducing differentiation of melanocytes, by containing active vitamin D3, which has not been used so far, in the culture system, compared with the conventional method for inducing differentiation of melanocytes, it is much shorter in time or efficiency. It was shown that differentiation of melanocytes can be induced.
本発明の方法によれば、従来のヒトメラノサイト分化誘導方法と比較して、極めて短期間で、多能性幹細胞からヒトメラノサイトの分化を誘導することができる。 According to the method of the present invention, differentiation of human melanocytes can be induced from pluripotent stem cells in a very short period of time compared to conventional methods for inducing differentiation of human melanocytes.
こうして分化誘導されたヒトメラノサイト細胞群は、高いメラノサイト成熟度を有し得るため、尋常性色素斑、遺伝性対側性色素症、白皮症など、メラノサイトの欠乏に起因する疾患を含む様々な疾患への利用が期待できる。 The human melanocyte cell group thus induced to differentiate can have a high degree of maturation of melanocytes, and thus various diseases including diseases caused by deficiency of melanocytes such as plaque plaques, hereditary contralateral pigmentation, and albinism. Expected to be used for diseases.
Claims (9)
ヒト多能性幹細胞を、表皮誘導を刺激する成分およびケラチノサイトへの最終分化を刺激する成分の存在下で培養することを含んでおり、
培養系に活性型ビタミンＤ３を含有させることを特徴とする、
方法。 A method for promoting differentiation induction of melanocytes,
Culturing human pluripotent stem cells in the presence of a component that stimulates epidermal induction and a component that stimulates terminal differentiation to keratinocytes,
An active vitamin D3 is contained in the culture system,
Method.
表皮誘導を刺激する成分は、ＳＣＦ、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ５、Ｓｍａｄ７、ＧＦＤ−６、ＥＧＦ、Ｗｎｔ３ａ、およびＦＧＦ−２よりなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする、
方法。 The method of claim 1, comprising:
The component that stimulates epidermal induction is at least one selected from the group consisting of SCF, BMP-2, BMP-4, BMP-7, Smad1, Smad5, Smad7, GFD-6, EGF, Wnt3a, and FGF-2 It is characterized by
Method.
表皮誘導を刺激する成分としてＳＣＦおよびＢＭＰ−４の組み合わせを用いることを特徴とする、
方法。 The method of claim 1, comprising:
A combination of SCF and BMP-4 is used as a component that stimulates epidermal induction,
Method.
ケラチノサイトへの最終分化を刺激する成分は、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−３、アスコルビン酸、およびレチノイン酸よりなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする、
方法。 The method of claim 1, comprising:
The component that stimulates terminal differentiation into keratinocytes is at least one selected from the group consisting of Endothelin-3, ascorbic acid, and retinoic acid,
Method.
ケラチノサイトへの最終分化を刺激する成分として、アスコルビン酸およびレチノイン酸の組み合わせを使用することを特徴とする、
方法。 The method of claim 1, comprising:
Using a combination of ascorbic acid and retinoic acid as a component that stimulates terminal differentiation into keratinocytes,
Method.
前記ヒト多能性幹細胞は、ヒト人工多能性幹細胞である、
方法。 The method of claim 1, comprising:
The human pluripotent stem cell is a human induced pluripotent stem cell,
Method.
ヒト人工多能性幹細胞は、ヒト血液Ｔ細胞から誘導されたものである、
方法。 The method of claim 6, comprising:
Human induced pluripotent stem cells are those derived from human blood T cells,
Method.
請求項１〜７のいずれか１項記載の方法で得られたメラノサイト細胞群を含む、
細胞製剤。 A cell preparation for treating diseases caused by melanocyte deficiency,
A melanocyte cell group obtained by the method according to any one of claims 1 to 7,
Cell preparation.
メラノサイトの欠乏に起因する疾患は、尋常性白斑、遺伝性対側性色素異常症および白皮症よりなる群から選択されるいずれかの疾患である、
細胞製剤。 The cell preparation according to claim 8, wherein
The disease caused by melanocyte deficiency is any disease selected from the group consisting of vitiligo vulgaris, hereditary contralateral dyslipidemia and albinism,
Cell preparation.
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