JP2015136349A - Method for manufacturing pluripotent stem cell with improved chimera forming ability from prime-type pluripotent stem cell, and composition and combination for the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、プライム型多能性幹細胞をより未分化な状態にする方法、プライム型多能性幹細胞からキメラ形成能を向上させた多能性幹細胞を製造する方法、および、これらの方法により得られた多能性幹細胞を用いてキメラ動物を作製する方法に関する。本発明はまた、Ｗｎｔ／βカテニンシグナル抑制剤およびシグナル伝達及び転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）シグナル活性化剤を含んでなる組成物およびＳＴＡＴ３シグナル活性化剤とＷｎｔ／βカテニンシグナル抑制剤との組合せ、並びに該組成物および該組合せを含んでなるキットに関する。 The present invention provides a method for making prime-type pluripotent stem cells more undifferentiated, a method for producing pluripotent stem cells with improved chimera-forming ability from prime-type pluripotent stem cells, and a method obtained by these methods. The present invention relates to a method for producing a chimeric animal using the obtained pluripotent stem cells. The present invention also provides a composition comprising a Wnt / β-catenin signal inhibitor and a signal transduction and transcriptional activator 3 (STAT3) signal activator, and a STAT3 signal activator and a Wnt / β-catenin signal inhibitor. Combinations as well as the compositions and kits comprising the combinations.
胚盤胞の内部細胞塊（ＩＣＭ）から得られる多能性幹細胞は、キメラ形成能が高いことで知られているが、より発生段階の進んだ胚（例えば、エピブラスト以降の胚）から得られる多能性幹細胞はキメラ形成能を損なっていると考えられている（非特許文献１〜３）。 Pluripotent stem cells obtained from the inner cell mass (ICM) of blastocysts are known for their high chimera-forming ability, but are obtained from embryos that have progressed further in development (for example, embryos after epiblast). It is considered that the pluripotent stem cells obtained have impaired chimera-forming ability (Non-Patent Documents 1 to 3).
多能性幹細胞には、高いキメラ形成能を有するナイーブ型多能性幹細胞とキメラ形成能が低いプライム型多能性幹細胞が存在する。プライム型多能性幹細胞をナイーブ型に変換（Reversion）することができれば、キメラ形成の際に胚導入細胞として用いることのできる細胞の選択の幅が大きく広がることとなる。 Pluripotent stem cells include naïve pluripotent stem cells having high chimera-forming ability and prime-type pluripotent stem cells having low chimera-forming ability. If prime-type pluripotent stem cells can be converted into a naive type (Reversion), the range of selection of cells that can be used as embryo-introduced cells during chimera formation will be greatly expanded.
本発明は、プライム型多能性幹細胞をより未分化な状態にする方法、プライム型多能性幹細胞からキメラ形成能を向上させた多能性幹細胞を製造する方法、および、これらの方法により得られた多能性幹細胞を用いてキメラ動物を作製する方法を提供する。本発明はまた、Ｗｎｔ／βカテニンシグナル抑制剤を含んでなる組成物およびＳＴＡＴ３シグナル活性化剤とＷｎｔ／βカテニンシグナル抑制剤との組合せ並びに該組成物および該組合せを含んでなるキットを提供する。 The present invention provides a method for making prime-type pluripotent stem cells more undifferentiated, a method for producing pluripotent stem cells with improved chimera-forming ability from prime-type pluripotent stem cells, and a method obtained by these methods. A method for producing a chimeric animal using the obtained pluripotent stem cells is provided. The present invention also provides a composition comprising a Wnt / β-catenin signal inhibitor, a combination of a STAT3 signal activator and a Wnt / β-catenin signal inhibitor, and the composition and a kit comprising the combination. .
本発明者らは、Ｗｎｔ／βカテニンシグナルを抑制することによりプライム型多能性幹細胞が、より未分化な状態になること、具体的には、そのキメラ形成能を向上させること、さらには、ナイーブ型多能性幹細胞に効率良く変換することを見出した。本発明者らはまた、Ｗｎｔ／βカテニンシグナルの抑制と組み合わせてさらにＳＴＡＴ３シグナルを活性化させることにより、より効果的に、プライム型多能性幹細胞が、より未分化な状態になること、具体的には、そのキメラ形成能を向上させること、さらには、ナイーブ型多能性幹細胞に極めて効率良く変換することを見出した。本発明は、このような知見に基づくものである。 By suppressing Wnt / β-catenin signal, the present inventors make prime-type pluripotent stem cells more undifferentiated, specifically improving their chimera-forming ability, The present inventors have found that they can be efficiently converted into naive pluripotent stem cells. The inventors have also made it possible to more effectively activate prime-type pluripotent stem cells by further activating STAT3 signal in combination with suppression of Wnt / β-catenin signal, Specifically, it has been found that the chimera-forming ability can be improved, and furthermore, it can be converted into naive pluripotent stem cells very efficiently. The present invention is based on such knowledge.
すなわち、本発明では、以下の発明が提供される。
（１）プライム型多能性幹細胞をより未分化な状態にする方法であって、プライム型多能性幹細胞をＷｎｔ／βカテニンシグナル抑制状態、かつシグナル伝達及び転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）シグナル活性化状態にすることを含んでなる、方法。
（２）プライム型多能性幹細胞のキメラ形成能を向上させることに用いるための、請求項１に記載の方法。
（３）プライム型多能性幹細胞からキメラ形成能を向上させた多能性幹細胞を製造する方法であって、プライム型多能性幹細胞をＷｎｔ／βカテニンシグナル抑制状態、かつシグナル伝達及び転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）シグナル活性化状態にすることを含んでなる、方法。
（４）キメラ動物を作製する方法であって、上記（３）に記載の方法により製造された多能性幹細胞を哺乳動物の胚に導入することを含んでなる、方法。
（５）Ｗｎｔ／βカテニンシグナル抑制剤とシグナル伝達及び転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）シグナル活性化剤とを含んでなる、プライム型多能性幹細胞をナイーブ型多能性幹細胞に変換するための組成物。
（６）シグナル伝達及び転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）シグナル活性化剤とＷｎｔ／βカテニンシグナル抑制剤との組合せ。
（７）プライム型多能性幹細胞をより未分化な状態にするための、上記（６）に記載の組合せ。
（８）プライム型多能性幹細胞のキメラ形成能を向上させるための、上記（６）または（７）に記載の組合せ。
（９）上記（５）に記載の組成物または上記（６）に記載の組合せを含んでなる、プライム型多能性幹細胞をより未分化な状態にするための、または、プライム型多能性幹細胞のキメラ形成能を向上させるための、キット。
（１０）ＣＤ３１陽性細胞を分画する手段をさらに含んでなる、上記（９）に記載のキット。
（１１）プライム型多能性幹細胞のキメラ形成能を向上させる方法であって、プライム型多能性幹細胞にＥ−カドヘリンを導入することを含んでなる、方法。
（１２）プライム型多能性幹細胞からキメラ形成能を向上させた多能性幹細胞を製造する方法であって、プライム型多能性幹細胞にＥ−カドヘリンを導入することを含んでなる、方法。
That is, the present invention provides the following inventions.
(1) A method for bringing prime-type pluripotent stem cells into a more undifferentiated state, wherein the prime-type pluripotent stem cells are in a Wnt / β-catenin signal-suppressed state, and signal transduction and transcription activator 3 (STAT3) signals A method comprising activating.
(2) The method according to claim 1, for use in improving the chimera-forming ability of prime-type pluripotent stem cells.
(3) A method for producing a pluripotent stem cell having an improved chimera-forming ability from a prime-type pluripotent stem cell, wherein the prime-type pluripotent stem cell is in a Wnt / β-catenin signal-suppressed state, and signal transduction and transcriptional activity A activating factor 3 (STAT3) signal activated state.
(4) A method for producing a chimeric animal, comprising introducing pluripotent stem cells produced by the method according to (3) above into a mammalian embryo.
(5) Converting a prime-type pluripotent stem cell comprising a Wnt / β-catenin signal inhibitor and a signal transduction and transcriptional activator 3 (STAT3) signal activator into a naive pluripotent stem cell Composition.
(6) A combination of a signal transduction and transcriptional activator 3 (STAT3) signal activator and a Wnt / β-catenin signal inhibitor.
(7) The combination according to (6) above, which makes prime-type pluripotent stem cells more undifferentiated.
(8) The combination according to (6) or (7) above, which improves the chimera-forming ability of prime-type pluripotent stem cells.
(9) Prime-type pluripotency for making prime-type pluripotent stem cells more undifferentiated, comprising the composition described in (5) above or the combination described in (6) above A kit for improving the chimera-forming ability of stem cells.
(10) The kit according to (9), further comprising means for fractionating CD31 positive cells.
(11) A method for improving the chimera-forming ability of prime-type pluripotent stem cells, comprising introducing E-cadherin into prime-type pluripotent stem cells.
(12) A method for producing a pluripotent stem cell having an improved chimera-forming ability from a primed pluripotent stem cell, the method comprising introducing E-cadherin into the primed pluripotent stem cell.
本発明によれば、プライム型多能性幹細胞を極めて効率良く、より未分化な状態にし、そのキメラ形成能を向上させ、および／または、ナイーブ型多能性幹細胞に変換することができる。 According to the present invention, prime-type pluripotent stem cells can be made extremely efficient and more undifferentiated, their chimera-forming ability can be improved, and / or converted into naive-type pluripotent stem cells.
本発明では、「プライム型の多能性幹細胞」とは、プライム型のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞などのプライム型の多能性幹細胞を意味する。本発明では、「多能性幹細胞」としては、特に限定されないが、例えば、ヒトおよびサルなどの霊長類の多能性幹細胞、並びに、ブタ、ウシ、ヒツジおよびヤギなどの哺乳類の多能性幹細胞などを挙げることができる。本発明で用いられるプライム型の多能性幹細胞は、例えば、哺乳類のエピブラスト幹細胞（ＥｐｉＳＣ）である。本発明で用いられるプライム型の多能性幹細胞は、例えば、プライム型のヒト胚性幹細胞（ＥＳ細胞）またはヒト誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）である。プライム型多能性幹細胞のキメラ形成能は、ナイーブ型多能性幹細胞のキメラ形成能に劣る。 In the present invention, the “prime type pluripotent stem cell” means a prime type pluripotent stem cell such as a prime type ES cell or iPS cell. In the present invention, the “pluripotent stem cell” is not particularly limited, but for example, primate pluripotent stem cells such as humans and monkeys, and mammalian pluripotent stem cells such as pigs, cows, sheep and goats. And so on. Prime-type pluripotent stem cells used in the present invention are, for example, mammalian epiblast stem cells (EpiSC). The prime-type pluripotent stem cells used in the present invention are, for example, prime-type human embryonic stem cells (ES cells) or human-induced pluripotent stem cells (iPS cells). The chimera-forming ability of prime-type pluripotent stem cells is inferior to the chimera-forming ability of naive-type pluripotent stem cells.
本発明者らは、プライム型の多能性幹細胞が、Ｗｎｔ／βカテニンシグナルを抑制することにより、より未分化な状態に変換されること、より具体的には、そのキメラ形成能を向上させること、さらにより具体的には、ナイーブ型多能性幹細胞に変換されることを見出した。本発明者らはまた、プライム型の多能性幹細胞が、そのシグナル伝達及び転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）シグナルを活性化し、かつ、そのＷｎｔ／βカテニンシグナルを抑制することにより、極めて高い効率で、より未分化な状態に変換されること、より具体的には、そのキメラ形成能を向上させること、さらにより具体的には、ナイーブ型多能性幹細胞に変換されることを見出した。 The present inventors can convert prime-type pluripotent stem cells to a more undifferentiated state by suppressing Wnt / β-catenin signal, and more specifically, improve the chimera-forming ability. More specifically, it has been found that it is converted into naive pluripotent stem cells. The inventors have also found that prime-type pluripotent stem cells activate their signaling and transcriptional activator 3 (STAT3) signals and suppress their Wnt / β-catenin signals, resulting in extremely high efficiency. Thus, the present inventors have found that it is converted into a more undifferentiated state, more specifically, its chimera-forming ability is improved, and more specifically, it is converted into naive pluripotent stem cells.
本発明では、プライム型多能性幹細胞を、Ｗｎｔ／βカテニンシグナルが抑制状態であり、かつシグナル伝達及び転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）シグナルが活性化状態である細胞にすればよい。従って、本発明では、Ｗｎｔ／βカテニンシグナルが抑制されているプライム型多能性幹細胞に対しては、ＳＴＡＴ３シグナルの活性化だけを行なえば同等の発明の効果が発揮され、すでにＳＴＡＴ３シグナルが活性化されているプライム型多能性幹細胞に対しては、Ｗｎｔ／βカテニンシグナルの抑制だけを行なえば同等の発明の効果が発揮されることは容易に理解できることである。Ｗｎｔ／βカテニンシグナルの抑制は、β−カテニンの分解や核内のβ−カテニンの存在量により確認することができる。ＳＴＡＴ３シグナルの活性化は例えば、リン酸化ＳＴＡＴ３の存在により確認することができる。Ｗｎｔ／βカテニンシグナルの抑制は、下記の通りに行なってもよい。ＳＴＡＴ３シグナルの活性化は、下記の通りに行なってもよい。Ｗｎｔ／βカテニンシグナルの抑制とＳＴＡＴ３シグナルの活性化は、プライム型多能性幹細胞が備えた性質であることもあり得る。 In the present invention, the prime-type pluripotent stem cell may be a cell in which the Wnt / β-catenin signal is in a suppressed state and the signal transduction and transcriptional activation factor 3 (STAT3) signal is in an activated state. Therefore, in the present invention, only the activation of the STAT3 signal exerts the same effect on the prime-type pluripotent stem cell in which the Wnt / β-catenin signal is suppressed, and the STAT3 signal is already active. It can be easily understood that the same effect of the invention can be exerted on the primed pluripotent stem cells that have been converted to only the Wnt / β-catenin signal. Inhibition of the Wnt / β-catenin signal can be confirmed by the degradation of β-catenin and the abundance of β-catenin in the nucleus. Activation of the STAT3 signal can be confirmed by the presence of phosphorylated STAT3, for example. Suppression of Wnt / β-catenin signal may be performed as follows. Activation of the STAT3 signal may be performed as follows. Suppression of the Wnt / β-catenin signal and activation of the STAT3 signal may be the properties of prime-type pluripotent stem cells.
ＳＴＡＴ３シグナルの活性化方法を説明する。ＳＴＡＴ３シグナルは、ＩＬ−６ファミリーのタンパク質によりｇｐ１３０（すなわち、ＣＤ１３０）およびｇｐ１３０と会合する受容体を介して活性化されると考えられている。従って、ＳＴＡＴ３シグナルは、例えば、ＩＬ−６ファミリーのタンパク質および／またはｇｐ１３０アゴニストを細胞に接触させることにより活性化することができる。ＩＬ−６ファミリーのタンパク質としては、白血球遊走阻止因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、およびＩＬ−１１が挙げられ、本発明で用いられ得る。 A method for activating STAT3 signal will be described. The STAT3 signal is believed to be activated by IL-6 family proteins through receptors associated with gp130 (ie CD130) and gp130. Thus, a STAT3 signal can be activated, for example, by contacting a cell with an IL-6 family protein and / or a gp130 agonist. IL-6 family proteins include leukocyte migration inhibitory factor (LIF), oncostatin M (OSM), ciliary neurotrophic factor (CNTF), and IL-11, which can be used in the present invention.
Ｗｎｔ／βカテニンシグナルの抑制方法を説明する。Ｗｎｔ／βカテニンシグナルが活性化されると、βカテニンの核内移行が促進される。Ｗｎｔ／βカテニンシグナルの抑制は、例えば、βカテニンの核内移行を阻害することにより達成することができる。βカテニンの核内移行の阻害は、βカテニンの細胞質での分解の促進により達成することができる。従って、Ｗｎｔ／βカテニンシグナルの抑制は、例えば、βカテニンの細胞質での分解の促進および／またはβカテニンの核内移行の抑制により行なうことができる。 A method for suppressing the Wnt / β-catenin signal will be described. When the Wnt / β-catenin signal is activated, β-catenin translocation into the nucleus is promoted. Suppression of the Wnt / β-catenin signal can be achieved, for example, by inhibiting the translocation of β-catenin into the nucleus. Inhibition of nuclear translocation of β-catenin can be achieved by promoting degradation of β-catenin in the cytoplasm. Accordingly, Wnt / β-catenin signal can be suppressed by, for example, promoting degradation of β-catenin in the cytoplasm and / or suppressing β-catenin translocation into the nucleus.
βカテニンの核内移行を抑制するためには、βカテニンの核内移行抑制剤で細胞を処理することができる。βカテニンの核内移行抑制剤としては、例えば、ＩＷＰ−２が挙げられる。ＩＷＰ−２は、Ｎ−（６−メチル−２−ベンゾチアゾリル）−２−［（３，４，６，７−テトラヒドロ−４−オキソ−３−フェニルチエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−２−イル）チオ］−アセトアミドの別名を有し、Ｐｏｒｃｕｐｉｎと呼ばれるタンパク質を阻害することによりβカテニンの核内移行を抑制すると考えられる。当業者であれば、既知のβカテニンの核内移行抑制剤を用いて適宜βカテニンの核内移行を抑制することができる。 In order to suppress β-catenin nuclear translocation, cells can be treated with a β-catenin nuclear translocation inhibitor. Examples of the β catenin nuclear translocation inhibitor include IWP-2. IWP-2 is N- (6-methyl-2-benzothiazolyl) -2-[(3,4,6,7-tetrahydro-4-oxo-3-phenylthieno [3,2-d] pyrimidine-2- Yl) thio] -acetamide, which is considered to suppress the translocation of β-catenin into the nucleus by inhibiting a protein called Porcupin. A person skilled in the art can appropriately suppress the nuclear translocation of β-catenin using a known β-catenin nuclear translocation inhibitor.
βカテニンの細胞質での分解を促進するためには、βカテニンの分解促進剤で細胞を処理することができる。βカテニンの分解促進剤としては、例えば、ＸＡＶ９３９が挙げられる。ＸＡＶ９３９は、３，５，７，８−テトラヒドロ−２−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−４Ｈ−チオピラノ［４，３−ｄ］ピリミジン−４−オンの別名を有し、Ａｘｉｎ（アキシン）と呼ばれるタンパク質に結合して、βカテニン結合タンパク質の分解を促進すると考えられる。当業者であれば、既知のβカテニンの分解促進剤を用いて適宜βカテニンの核内移行を抑制することができる。 In order to promote the degradation of β-catenin in the cytoplasm, the cells can be treated with a β-catenin degradation promoter. Examples of β-catenin degradation accelerators include XAV939. XAV939 has the alias of 3,5,7,8-tetrahydro-2- [4- (trifluoromethyl) phenyl] -4H-thiopyrano [4,3-d] pyrimidin-4-one, and represents Axin (Axin It is thought to promote the degradation of β-catenin binding protein. A person skilled in the art can appropriately suppress the translocation of β-catenin into the nucleus using a known β-catenin degradation accelerator.
その他、Ｗｎｔ／βカテニンシグナルの抑制は、Ｗｎｔ／βカテニンシグナルの抑制剤として知られる分子を用いて適宜行なうことができる。当業者であれば、既知のＷｎｔ／βカテニンシグナルの抑制剤を用いてβカテニンの核内移行を適宜抑制することができる。 In addition, suppression of Wnt / β-catenin signal can be appropriately performed using a molecule known as an inhibitor of Wnt / β-catenin signal. A person skilled in the art can appropriately suppress the translocation of β-catenin into the nucleus using a known Wnt / β-catenin signal inhibitor.
プライム型多能性幹細胞において、Ｗｎｔ／βカテニンシグナルを抑制すると、ナイーブ型多能性幹細胞のマーカーとして知られるＰｅｃａｍ１（すなわち、ＣＤ３１）の発現が増強され、細胞のキメラ形成能が向上し、かつ、細胞の遺伝子発現がナイーブ型多能性幹細胞の遺伝子発現プロフィールに近づく。このことから、プライム型多能性幹細胞はＷｎｔ／βカテニンシグナルを抑制すると、ナイーブ型多能性幹細胞へのリバーション（reversion）を起すことが分かった。 In the prime-type pluripotent stem cells, when Wnt / β-catenin signal is suppressed, the expression of Pecam1 (ie, CD31), which is known as a marker for naive pluripotent stem cells, is enhanced, and the chimera-forming ability of the cells is improved. , The gene expression of the cells approaches the gene expression profile of naïve pluripotent stem cells. From this, it was found that when the prime-type pluripotent stem cells suppress Wnt / β-catenin signal, reversion to naive-type pluripotent stem cells occurs.
プライム型多能性幹細胞において、ＳＴＡＴ３シグナルを活性化し、かつ、そのＷｎｔ／βカテニンシグナルを抑制すると、ナイーブ型多能性幹細胞のマーカーとして知られるＰｅｃａｍ１（すなわち、ＣＤ３１）の発現が増強され、細胞のキメラ形成能が向上し、かつ、細胞の遺伝子発現がナイーブ型多能性幹細胞の遺伝子発現プロフィールに近づく。このことから、プライム型多能性幹細胞はＳＴＡＴ３シグナルを活性化し、かつ、そのＷｎｔ／βカテニンシグナルを抑制すると、ナイーブ型多能性幹細胞へのリバーション（reversion）を起こすことが分かった。そして、その効果は、Ｗｎｔ／βカテニンシグナルだけを抑制することと比べると顕著であった。 In prime-type pluripotent stem cells, when STAT3 signal is activated and its Wnt / β-catenin signal is suppressed, expression of Pecam1 (that is, CD31) known as a marker for naive-type pluripotent stem cells is enhanced. The chimera-forming ability is improved, and the gene expression of the cell approaches the gene expression profile of naive pluripotent stem cells. From this, it was found that prime-type pluripotent stem cells revert to naive-type pluripotent stem cells when STAT3 signal is activated and its Wnt / β-catenin signal is suppressed. And the effect was remarkable compared with suppressing only a Wnt / (beta) catenin signal.
従って、本発明のある態様では、プライム型多能性幹細胞において、Ｗｎｔ／βカテニンシグナルを抑制することを特徴とする、プライム型多能性幹細胞をより未分化な状態にする方法、プライム型多能性幹細胞のキメラ形成能を向上させる方法、およびプライム型多能性幹細胞からキメラ形成能を向上させた多能性幹細胞（具体的には、ナイーブ型多能性幹細胞）を製造する方法が提供される。また、本発明のより好ましい態様では、プライム型多能性幹細胞において、ＳＴＡＴ３シグナルを活性化し、かつ、そのＷｎｔ／βカテニンシグナルを抑制することを特徴とする、プライム型多能性幹細胞をより未分化な状態にする方法、プライム型多能性幹細胞のキメラ形成能を向上させる方法、およびプライム型多能性幹細胞からキメラ形成能を向上させた多能性幹細胞（具体的には、ナイーブ型多能性幹細胞）を製造する方法が提供される。 Therefore, in one aspect of the present invention, a method for bringing a prime-type pluripotent stem cell into a more undifferentiated state, which comprises suppressing a Wnt / β-catenin signal in the prime-type pluripotent stem cell, Provided are a method for improving the chimera-forming ability of pluripotent stem cells and a method for producing pluripotent stem cells (specifically, naïve pluripotent stem cells) having improved chimera-forming ability from prime-type pluripotent stem cells Is done. In a more preferred embodiment of the present invention, a prime-type pluripotent stem cell characterized by activating the STAT3 signal and suppressing the Wnt / β-catenin signal in the prime-type pluripotent stem cell is further reduced. A method for achieving differentiation, a method for improving chimera-forming ability of prime-type pluripotent stem cells, and a pluripotent stem cell having chimera-forming ability improved from prime-type pluripotent stem cells (specifically, naive-type A method for producing a pluripotent stem cell) is provided.
また、本発明によれば、Ｗｎｔ／βカテニンシグナルを抑制したプライム型多能性幹細胞は高効率でキメラ動物に寄与する。従って、本発明によれば、キメラ動物を作製する方法であって、哺乳動物のプライム型多能性幹細胞のＷｎｔ／βカテニンシグナルを抑制することと、得られた多能性幹細胞を哺乳動物の胚に導入することを含んでなる、方法が提供される。さらに、本発明によれば、ＳＴＡＴ３シグナルを活性化し、かつ、そのＷｎｔ／βカテニンシグナルを抑制したプライム型多能性幹細胞は高効率でキメラ動物に寄与する。従って、本発明の好ましい態様によれば、キメラ動物を作製する方法であって、哺乳動物のプライム型多能性幹細胞のシグナル伝達及び転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）シグナルを活性化し、かつ、そのＷｎｔ／βカテニンシグナルを抑制することと、得られた多能性幹細胞を哺乳動物の胚に導入することを含んでなる、方法が提供される。 Further, according to the present invention, the prime-type pluripotent stem cell that suppresses the Wnt / β-catenin signal contributes to the chimeric animal with high efficiency. Therefore, according to the present invention, there is provided a method for producing a chimeric animal, comprising suppressing a Wnt / β-catenin signal of a prime type pluripotent stem cell of a mammal, and obtaining the pluripotent stem cell of a mammal. A method is provided comprising introducing into an embryo. Furthermore, according to the present invention, the prime-type pluripotent stem cell that activates the STAT3 signal and suppresses the Wnt / β-catenin signal contributes to the chimeric animal with high efficiency. Therefore, according to a preferred embodiment of the present invention, there is provided a method for producing a chimeric animal, comprising activating the signaling and transcriptional activator 3 (STAT3) signal of a primed pluripotent stem cell of a mammal, There is provided a method comprising suppressing Wnt / β-catenin signal and introducing the resulting pluripotent stem cells into a mammalian embryo.
また、本発明によれば、プライム型多能性幹細胞をより未分化な状態にすることに用いるための、プライム型多能性幹細胞のキメラ形成能を向上させることに用いるための、または、プライム型多能性幹細胞をナイーブ型多能性幹細胞に変換することに用いるための、組成物が提供される。本発明の組成物は、少なくともＷｎｔ／βカテニンシグナルの抑制剤を含んでなる。本発明の組成物は、より好ましくは、ＳＴＡＴ３シグナルの活性剤をさらに含んでなる。本発明で用いられるＷｎｔ／βカテニンシグナルの抑制剤は、ＳＴＡＴ３シグナルを活性化する作用を有していてもよい。 Further, according to the present invention, for use in making prime-type pluripotent stem cells more undifferentiated, for use in improving chimera-forming ability of prime-type pluripotent stem cells, or for prime A composition for use in converting pluripotent stem cells into naïve pluripotent stem cells is provided. The composition of the present invention comprises at least an inhibitor of Wnt / β-catenin signal. More preferably, the composition of the present invention further comprises an activator of STAT3 signal. The Wnt / β-catenin signal inhibitor used in the present invention may have an action of activating STAT3 signal.
Ｅ−カドヘリンは、プライム型多能性幹細胞に導入すると、そのキメラ形成能を向上させた。従って、本発明では、プライム型多能性幹細胞のキメラ形成能を向上させる方法であって、プライム型多能性幹細胞にＥ−カドヘリンを導入することを含んでなる方法が提供される。本発明ではまた、Ｅ−カドヘリンを導入する手段（例えば、Ｅ−カドヘリン発現ベクターまたはＥ−カドヘリンタンパク質）を含んでなる、プライム型多能性幹細胞のキメラ形成能を向上させることに用いるための組成物が提供される。本発明の方法は、ＳＴＡＴ３シグナルを活性化することをさらに含んでいてもよい。本発明ではさらに、Ｅ−カドヘリンを導入する手段と本発明の組成物との組合せが提供される。本発明の組合せは、プライム型多能性幹細胞のキメラ形成能を向上させることに用いられ得る。本発明の組合せはまた、プライム型多能性幹細胞をナイーブ型幹細胞に変換することに用いられ得る。 When introduced into prime-type pluripotent stem cells, E-cadherin improved its chimera-forming ability. Therefore, the present invention provides a method for improving the chimera-forming ability of primed pluripotent stem cells, which comprises introducing E-cadherin into primed pluripotent stem cells. The present invention also provides a composition for improving chimera-forming ability of primed pluripotent stem cells, comprising means for introducing E-cadherin (for example, E-cadherin expression vector or E-cadherin protein). Things are provided. The method of the present invention may further comprise activating STAT3 signal. The present invention further provides a combination of means for introducing E-cadherin and the composition of the present invention. The combination of the present invention can be used to improve the chimera-forming ability of primed pluripotent stem cells. The combinations of the present invention can also be used to convert primed pluripotent stem cells into naive stem cells.
また、本発明によれば、プライム型多能性幹細胞をより未分化な状態にすることに用いるための、ＳＴＡＴ３シグナルの活性剤とＷｎｔ／βカテニンシグナルの抑制剤との組合せ、プライム型多能性幹細胞のキメラ形成能を向上させることに用いるための、ＳＴＡＴ３シグナルの活性剤とＷｎｔ／βカテニンシグナルの抑制剤との組合せ、および、プライム型多能性幹細胞をナイーブ型多能性幹細胞に変換することに用いるための、ＳＴＡＴ３シグナルの活性剤とＷｎｔ／βカテニンシグナルの抑制剤との組合せが提供される。 Further, according to the present invention, a combination of an activator of STAT3 signal and an inhibitor of Wnt / β-catenin signal for use in making prime-type pluripotent stem cells more undifferentiated, prime-type pluripotency Combination of activator of STAT3 signal and inhibitor of Wnt / β-catenin signal, and conversion of primed pluripotent stem cell to naive pluripotent stem cell for use in improving chimera forming ability of sex stem cell A combination of an activator of STAT3 signal and an inhibitor of Wnt / β-catenin signal is provided for use.
本発明の組合せは、組成物中に混合物として含まれていてもよい。従って、本発明によれば、本発明の組合せを含んでなる組成物が提供される。本発明の組合せはまた、別々の形態で提供されていてもよい。本発明の組成物は、プライム型多能性幹細胞をより未分化な状態にするため、プライム型多能性幹細胞のキメラ形成能を向上させるため、および／または、プライム型多能性幹細胞をナイーブ型多能性幹細胞に変換するために用いることができる。 The combinations of the present invention may be included as a mixture in the composition. Thus, according to the present invention, a composition comprising the combination of the present invention is provided. The combinations of the present invention may also be provided in separate forms. The composition of the present invention makes prime-type pluripotent stem cells more undifferentiated, improves the chimera-forming ability of prime-type pluripotent stem cells, and / or makes prime-type pluripotent stem cells naive Can be used to convert to type pluripotent stem cells.
本発明によればまた、本発明の組合せを含んでなる、プライム型多能性幹細胞をより未分化な状態にすることに用いるためのキットまたは試薬、プライム型多能性幹細胞のキメラ形成能を向上させることに用いるためのキットまたは試薬、または、プライム型多能性幹細胞をナイーブ型多能性幹細胞に変換することに用いるためのキットまたは試薬が提供される。キットまたは試薬には、細胞への組合せの適用法が記載された説明書を付属させてもよい。本発明のキットは、ＣＤ３１陽性細胞を分画するための手段（例えば、ソーティング用の蛍光標識抗体などの抗ＣＤ３１抗体）をさらに含んでいてもよい。 According to the present invention, a kit or a reagent comprising the combination of the present invention for use in making a prime-type pluripotent stem cell more undifferentiated, a chimera-forming ability of a prime-type pluripotent stem cell Kits or reagents for use in improving, or kits or reagents for use in converting primed pluripotent stem cells into naive pluripotent stem cells are provided. The kit or reagent may be accompanied by instructions describing how to apply the combination to the cells. The kit of the present invention may further contain a means for fractionating CD31 positive cells (for example, an anti-CD31 antibody such as a fluorescently labeled antibody for sorting).
本発明によれば、上述のように、キメラ動物を作製する方法であって、本発明の方法によりキメラ形成能を向上させた多能性幹細胞を得ることと、得られた多能性幹細胞を哺乳動物の胚に導入することを含んでなる、方法が提供される。本発明の方法によれば、細胞を導入して得られた胚を非ヒト仮親動物の母胎中で発生させて胎児または産仔を得ることをさらに含んでいてもよい。キメラ哺乳動物の作製は、一般的には、哺乳動物のＥＳ細胞などのキメラ形成能を有する細胞を、哺乳動物の胚に導入すること、得られた胚を仮親動物の子宮に移植すること、および仮親動物からキメラの産仔を得ることを含んでなる。本発明では、非ヒト仮親動物は、細胞を導入する胚と同種であり得る。 According to the present invention, as described above, a method for producing a chimeric animal, comprising obtaining a pluripotent stem cell having improved chimera-forming ability by the method of the present invention, and obtaining the obtained pluripotent stem cell A method is provided comprising introducing into a mammalian embryo. According to the method of the present invention, the method may further comprise generating an embryo obtained by introducing the cell in the womb of a non-human foster animal to obtain a fetus or a litter. The production of a chimeric mammal generally involves introducing a cell having a chimera-forming ability, such as a mammalian ES cell, into a mammalian embryo, and transplanting the obtained embryo into the uterus of a foster mother, And obtaining a chimeric offspring from the foster animal. In the present invention, the non-human foster animal can be the same species as the embryo into which the cell is introduced.
遺伝子改変動物の作製においては、キメラ形成能を有する多能性幹細胞が求められるが、本発明は、高いキメラ形成能を有する多能性幹細胞を提供するものである。従って、本発明によれば、例えば、非ヒト遺伝子改変動物の作製方法であって、(i)非ヒト動物のプライム型多能性幹細胞の遺伝子を改変することと、(ii)上記(i)により得られた細胞のＷｎｔ／βカテニンシグナルを抑制することと、(iii)上記(ii)により得られた細胞を非ヒト動物胚に導入することを含んでなる、方法が提供される。本発明の好ましい態様によれば、例えば、非ヒト遺伝子改変動物の作製方法であって、(i)非ヒト動物のプライム型多能性幹細胞の遺伝子を改変することと、(ii)上記(i)により得られた細胞のシグナル伝達及び転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）シグナルを活性化し、かつ、そのＷｎｔ／βカテニンシグナルを抑制することと、(iii)上記(ii)により得られた細胞を非ヒト動物胚に導入することを含んでなる、方法が提供される。 In the production of genetically modified animals, pluripotent stem cells having a chimera-forming ability are required, but the present invention provides pluripotent stem cells having a high chimera-forming ability. Therefore, according to the present invention, for example, a method for producing a non-human genetically modified animal, comprising: (i) modifying a prime-type pluripotent stem cell gene of a non-human animal; and (ii) the above (i) There is provided a method comprising suppressing the Wnt / β-catenin signal of a cell obtained by (iii), and (iii) introducing the cell obtained by (ii) above into a non-human animal embryo. According to a preferred embodiment of the present invention, for example, a method for producing a non-human genetically modified animal, comprising: (i) modifying a prime pluripotent stem cell gene of a non-human animal; and (ii) the above (i ) Activating the signal transduction and transcriptional activator 3 (STAT3) signal of the cell obtained by (ii) and suppressing the Wnt / β-catenin signal, and (iii) the cell obtained by (ii) above A method is provided comprising introducing into a non-human animal embryo.
遺伝子改変動物を作製する方法としては、例えば、ノックアウトマウスやトランスジェニックマウスなどの遺伝子改変動物を作製する方法が周知である。遺伝子改変動物では、遺伝子改変された多能性幹細胞（例えば、遺伝子改変されたＥＳ細胞）を胚盤胞の卵割腔に導入し、仮親の子宮に移植してキメラ動物である産仔を得る。ノックアウト動物を得る場合には、キメラ動物を得た後は、野生型動物と交配させて、キメラ動物からさらに遺伝子改変されたゲノムをヘテロで有する産仔を得る、あるいは、得られたヘテロの産仔同士をさらに掛け合わせて遺伝子改変されたゲノムをホモで有する産仔を得ることができる。 As a method for producing a genetically modified animal, for example, a method for producing a genetically modified animal such as a knockout mouse or a transgenic mouse is well known. In a genetically modified animal, a genetically modified pluripotent stem cell (for example, a genetically modified ES cell) is introduced into the cleavage space of a blastocyst and transplanted into a temporary parent uterus to obtain a litter that is a chimeric animal . In the case of obtaining a knockout animal, after obtaining a chimeric animal, it is bred with a wild-type animal to obtain a litter having a heterogeneous genome further modified from the chimeric animal, or production of the obtained heterozygote. The offspring can be further crossed to obtain a litter having a genetically modified genome.
本発明の方法でも、プライム型多能性幹細胞を遺伝子改変し、得られた遺伝子改変された細胞を非ヒト動物（例えば、げっ歯類以外の非ヒト哺乳動物または鳥類などの脊椎動物）の胚（８細胞期、桑実胚期または胚盤胞期の胚）に導入して、胚を仮親の子宮に戻すことによりキメラ動物を作製することができる。キメラ動物中では、導入したプライム型多能性幹細胞は生殖系列に寄与するから、本発明によれば、げっ歯類以外の哺乳動物においてプライム型多能性幹細胞を胚導入細胞として用いて遺伝子改変動物を得ることができる。遺伝子改変動物の作製においては、好ましくは、導入される細胞と胚との関係は同種である。得られた遺伝子改変された細胞は、胚に導入される前および／または後にシグナル伝達及び転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）シグナルを活性化し、および／または、そのＷｎｔ／βカテニンシグナルを抑制することができる。 Even in the method of the present invention, prime-type pluripotent stem cells are genetically modified, and the resulting genetically modified cells are used as embryos of non-human animals (for example, non-human mammals other than rodents or vertebrates such as birds). A chimeric animal can be produced by introducing the embryo into the 8-cell stage, morula stage or blastocyst stage embryo, and returning the embryo to the foster parent uterus. In chimeric animals, the introduced prime-type pluripotent stem cells contribute to the germ line, and according to the present invention, the prime-type pluripotent stem cells are used as embryo transfer cells in mammals other than rodents. Animals can be obtained. In the production of a genetically modified animal, the relationship between the introduced cell and the embryo is preferably the same. The resulting genetically modified cells activate signaling and transcriptional activator 3 (STAT3) signals and / or suppress their Wnt / β-catenin signals before and / or after introduction into the embryo Can do.
本発明の方法により得られた細胞は、胚盤胞補完を利用した臓器の再生に用いることができる（引用することにより本出願の一部とされるWO2008/102602およびWO2010/021390を参照）。これらの方法では、胚盤胞と胚導入細胞との関係は、同種であっても異種であってもよい。本発明者らは、マーモセットｉＰＳ細胞をマウス胚盤胞に導入してキメラ動物を得ることができることを確認済である。また、本発明の方法により得られた細胞は、生存し得ないか生存困難となる臓器または身体部分の欠陥の原因遺伝子をホモで有する動物を胚盤胞補完により生殖可能年齢まで成長させる方法に用いることができる（引用することにより本出願の一部とされるWO2009/104794を参照）。この方法によれば、生存し得ないか生存困難となる臓器または身体部分の欠陥の原因遺伝子をホモで有する非ヒト動物同士（例えば、ノックアウト非ヒト哺乳動物）の交配により、次世代では生存し得ないか生存困難となる臓器または身体部分の欠陥の原因遺伝子をホモで有する産仔を理論上１００％の確率で得ることが可能である。従って、この方法によれば、生存し得ないか生存困難となる臓器または身体部分の欠陥の原因遺伝子をホモで有する哺乳動物（ファウンダー哺乳動物）を得ることができる。この方法では、胚盤胞と胚導入細胞との関係は、同種であることが好ましい。 The cells obtained by the method of the present invention can be used for organ regeneration utilizing blastocyst complementation (see WO2008 / 102602 and WO2010 / 021390, which are hereby incorporated by reference). In these methods, the relationship between the blastocyst and the embryo-introduced cell may be the same or different. The present inventors have confirmed that marmoset iPS cells can be introduced into mouse blastocysts to obtain chimeric animals. In addition, the cells obtained by the method of the present invention can be used to grow an animal having a homologous gene causing a defect in an organ or body part that cannot survive or become difficult to live to a reproductive age by blastocyst complementation. (See WO2009 / 104794, which is hereby incorporated by reference). According to this method, non-human animals having homozygous genes that cause defects in organs or body parts that are difficult to survive or difficult to survive (eg, knockout non-human mammals) can be bred in the next generation. It is theoretically possible to obtain a litter having a homologous causative gene of an organ or body part defect that is difficult to survive or difficult to survive. Therefore, according to this method, it is possible to obtain a mammal (founder mammal) having a homologous gene causing a defect in an organ or body part that cannot survive or is difficult to survive. In this method, the relationship between the blastocyst and the embryo-introduced cell is preferably the same type.
本発明では、「臓器」とは、動物の内臓を構成する器官をいう。臓器としては、特に限定されないが、例えば、心臓、肺、腎臓、膵臓、胸腺、脾臓、肝臓、小脳、小腸、結腸および膀胱などが挙げられ、例えば、膵臓、腎臓または胸腺とすることができる。 In the present invention, “organ” refers to an organ that constitutes an internal organ of an animal. Examples of the organ include, but are not limited to, heart, lung, kidney, pancreas, thymus, spleen, liver, cerebellum, small intestine, colon, and bladder, and can be, for example, pancreas, kidney, or thymus.
本発明では、「身体部分」とは、身体のいずれかの部分をいう。身体部分としては、血管、血液、リンパ球、骨および毛髪などが挙げられ、リンパ球または毛髪とすることができる。本明細書では、組織も身体部分に含まれる。 In the present invention, “body part” refers to any part of the body. Examples of the body part include blood vessels, blood, lymphocytes, bones and hair, and can be lymphocytes or hair. As used herein, tissue is also included in the body part.
本発明では、「該非ヒト動物とは異個体の動物の細胞」とは、非ヒト動物の胚が有する異常または欠陥を補完できる細胞をいい、例えば、野生型の細胞および蛍光タンパク質等を発現する細胞などが挙げられる。 In the present invention, “an animal cell different from the non-human animal” refers to a cell capable of complementing an abnormality or defect possessed by a non-human animal embryo, and expresses, for example, a wild-type cell and a fluorescent protein. Examples include cells.
また、本発明によれば、Ｗｎｔ／βカテニンシグナルを抑制したプライム型多能性幹細胞からＣＤ３１陽性細胞を分画し、得られたＣＤ３１陽性細胞を胚に導入すると、非常に高い確率でキメラ動物を作製することができた。また、本発明によれば、ＳＴＡＴ３シグナルを活性化し、かつ、そのＷｎｔ／βカテニンシグナルを抑制したプライム型多能性幹細胞からＣＤ３１陽性細胞を分画し、得られたＣＤ３１陽性細胞を胚に導入すると、非常に高い確率でキメラ動物を作製することができた。すなわち、ＣＤ３１陽性画分には、キメラ形成能の高い多能性幹細胞が多く存在する。従って、本発明のいずれの方法も、Ｗｎｔ／βカテニンシグナルを抑制したプライム型多能性幹細胞、より好ましくは、ＳＴＡＴ３シグナルを活性化し、かつ、そのＷｎｔ／βカテニンシグナルを抑制したプライム型多能性幹細胞からＣＤ３１陽性細胞を分画すること（選別すること）をさらに含んでいてもよい。 In addition, according to the present invention, when a CD31 positive cell is fractionated from a prime-type pluripotent stem cell that suppresses Wnt / β-catenin signal, and the obtained CD31 positive cell is introduced into an embryo, a chimeric animal has a very high probability. Was able to be produced. In addition, according to the present invention, CD31 positive cells are fractionated from primed pluripotent stem cells that activate STAT3 signal and suppress Wnt / β-catenin signal, and introduce the obtained CD31 positive cell into an embryo Then, a chimeric animal could be produced with a very high probability. That is, the CD31 positive fraction has many pluripotent stem cells with high chimera-forming ability. Therefore, in any of the methods of the present invention, a prime-type pluripotent stem cell that suppresses the Wnt / β-catenin signal, more preferably a pluripotent stem cell that activates the STAT3 signal and suppresses the Wnt / β-catenin signal. Fractionation (selection) of CD31 positive cells from sex stem cells may be further included.
実施例１：エピブラスト幹細胞の調製
本実施例では、マウスエピブラスト幹細胞を調製した。
Example 1 Preparation of Epiblast Stem Cells In this example, mouse epiblast stem cells were prepared.
実施例に用いたエピブラスト幹細胞（ＥｐｉＳＣ）は、ＢＤＦ１由来およびＥＢ３ＤＲ由来のＥｐｉＳＣの２株である。ＢＤＦ１由来のＥｐｉＳＣ（ＢＤＦ１−ＥｐｉＳＣ）は、マウスの系統であるＣ５７ＢＬ／６とＤＢＡ２マウスを交配して得た雑種第一代（Ｆ１）のエピブラスト胚から樹立した。また、ＥＢ３ＤＲ由来のＥｐｉＳＣ（ＥＢ３ＤＲ−ＥｐｉＳＣ）は、ＥＢ３ＤＲ−ＥＳ細胞に由来し、ＣＡＧ発現ユニットの制御下にＤｓＲｅｄ−Ｔ４遺伝子が連結された遺伝子を有するＥｐｉＳＣである。ＥＢ３ＤＲマウスＥＳ細胞株は丹羽仁史博士（理化学研究所発生・再生センター）より供与を受けた。ＥＢ３ＤＲをマウス胚に移植して作製したキメラエピブラスト胚よりＥｐｉＳＣを樹立したのち、ＦＡＣＳを用いてＤｓＲｅｄ発現細胞を単離した。いずれのＥｐｉＳＣ株もTesar et al., Nature (2007), 448(7150): 196-199に記載の方法に基づいて作製した。すなわち、細胞は、マウスのエピブラストを切り裂いて得た細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ溶液で解離させた後に、マウス胎児繊維芽細胞（ＭＥＦ）コートプレートに播種し、次いで増殖したコロニーをクローン化してＥｐｉＳＣ株を樹立した。 The epiblast stem cells (EpiSC) used in the examples are two strains, BDF1-derived and EB3DR-derived EpiSCs. BDF1-derived EpiSC (BDF1-EpiSC) was established from a hybrid first-generation (F1) epiblast embryo obtained by crossing a mouse strain C57BL / 6 with a DBA2 mouse. Moreover, EpiSC derived from EB3DR (EB3DR-EpiSC) is EpiSC having a gene derived from EB3DR-ES cells and linked with a DsRed-T4 gene under the control of a CAG expression unit. The EB3DR mouse ES cell line was provided by Dr. Hitoshi Niwa (RIKEN Center for Development and Regeneration). EpiSCs were established from chimeric epiblast embryos prepared by transplanting EB3DR into mouse embryos, and then DsRed-expressing cells were isolated using FACS. All EpiSC strains were prepared based on the method described in Tesar et al., Nature (2007), 448 (7150): 196-199. That is, cells were dissociated with trypsin / EDTA solution after dissociating the mouse epiblast and seeded on mouse embryo fibroblast (MEF) coated plates, and then the grown colonies were cloned and the EpiSC strain Was established.
得られたＥｐｉＳＣは、１５％ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ血清代替物（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、１％非必須アミノ酸（ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）、２ｍＭ グルタマックス（Ｇｌｕｔａｍａｘ）またはＬ−グルタミン、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール（Life Technologies社製）、および塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）（Peprotech社製）を添加したＫｎｏｃｋｏｕｔ Ｄ−ＭＥＭ培地中で維持した。ＥｐｉＳＣは、完全にコンフルエントになる前に３〜５日おきに継代した。 The resulting EpiSC is composed of 15% Knockout serum replacement, 1% non-essential amino acid, 2 mM Glutamax or L-glutamine, 0.1 mM 2-mercaptoethanol ( Life Technologies), and a Knockout D-MEM medium supplemented with basic fibroblast growth factor (bFGF) (Peprotech). EpiSCs were passaged every 3-5 days before becoming fully confluent.
実施例２：Ｅ−カドヘリンの強制発現による多能性幹細胞のリバーション
本実施例では、プライム型多能性幹細胞にＥ−カドヘリンを強制発現させて、得られた多能性幹細胞の性質を確認した。
Example 2: Reversal of pluripotent stem cells by forced expression of E-cadherin In this example, primed pluripotent stem cells were forced to express E-cadherin and the properties of the obtained pluripotent stem cells were confirmed. did.
実施例２−１：Ｅ−カドヘリン遺伝子を導入したプライム型多能性幹細胞の調製
プライム型多能性幹細胞としては、ＢＤＦ１−ＥｐｉＳＣを用いた。Ｅ−カドヘリン遺伝子（Cdh1, Genbank Assession No. BC098501）は、Ｔｅｔ−ｏｎ ａｌｌ−ｉｎ−ｏｎｅ誘導性レンチウイルスベクター（ＡｉＬＶ；Yamaguchi et al, PLOS ONE, 2012）を用いて細胞に導入した。具体的には、Ｔｅｔ−ｏｎ ＡｉＬＶは、テトラサイクリン（ｔｅｔ）応答エレメントおよびリバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｅｔ ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ（ｒｔＴＡ））を用いて構築した。この系では、テトラサイクリンやその誘導体であるドキシサイクリンの添加により、細胞内でＥ−カドヘリンを発現させることができる。なお、ウイルスがインテグレートした細胞としていない細胞とを見分けるために、このＴｅｔ−ｏｎ ＡｉＬＶには、ヒトユビキチンＣ（Ｕｂｃ）プロモーターにより駆動されるｒｔＴＡにＥＧＦＰを発現可能に導入した。
Example 2-1 Preparation of Primed Pluripotent Stem Cell Introduced with E-Cadherin Gene BDF1-EpiSC was used as a primed pluripotent stem cell. The E-cadherin gene (Cdh1, Genbank Assession No. BC098501) was introduced into cells using a Tet-on all-in-one inducible lentiviral vector (AiLV; Yamaguchi et al, PLOS ONE, 2012). Specifically, Tet-on AiLV was constructed using a tetracycline (tet) response element and a reverse tetracycline-regulated transactivator (rtTA). In this system, E-cadherin can be expressed intracellularly by the addition of tetracycline or its derivative doxycycline. In addition, in order to distinguish from cells that have not been integrated with the virus, TGFP was introduced into this Tet-on AiLV so that EGFP can be expressed in rtTA driven by the human ubiquitin C (Ubc) promoter.
その後、遺伝子導入がなされたＢＤＦ１−ＥｐｉＳＣをＥＧＦＰの蛍光強度を指標として分画した。分画は、ＭｏＦｌｏ（ベックマン・コールター社）またはＡｒｉａ（ベクトン・ディッキンソン社）を用いて行なった。このようにして得られたＢＤＦ１−ＥｐｉＳＣを以降ＢＤＦ１−ＥｐｉＳＣ−ＴＲＥ−Ｃｄｈ１と表記する。 Thereafter, BDF1-EpiSC into which the gene was introduced was fractionated using the fluorescence intensity of EGFP as an index. Fractionation was performed using MoFlo (Beckman Coulter) or Aria (Becton Dickinson). The BDF1-EpiSC thus obtained is hereinafter referred to as BDF1-EpiSC-TRE-Cdh1.
対照としては、ＥＧＦＰを導入したＢＤＦ１−ＥｐｉＳＣを用いた。ＥＧＦＰを導入したＢＤＦ１−ＥｐｉＳＣは、ＢＤＦ１−ＥｐｉＳＣにＣＡＧプロモーター下にＥＧＦＰ遺伝子を発現可能に組み込んだレンチウイルスベクターを感染させて得た。上述と同じ方法でＥＧＦＰの蛍光を指標として遺伝子導入がなされたＢＤＦ１−ＥｐｉＳＣを分画した。このようにして得られたＢＤＦ１−ＥｐｉＳＣを以降ＢＤＦ１−ＥｐｉＳＣ−ＧＦＰと表記する。 As a control, BDF1-EpiSC introduced with EGFP was used. BDF1-EpiSC into which EGFP was introduced was obtained by infecting BDF1-EpiSC with a lentiviral vector in which the EGFP gene was incorporated under the CAG promoter so as to allow expression. In the same manner as described above, BDF1-EpiSC into which gene introduction was performed using EGFP fluorescence as an index was fractionated. The BDF1-EpiSC thus obtained is hereinafter referred to as BDF1-EpiSC-GFP.
以下、ＥＧＦＰを単にＧＦＰと呼ぶことがある。 Hereinafter, EGFP may be simply referred to as GFP.
実施例２−２：プライム型多能性幹細胞のリバーションの評価
次に、得られた細胞にＥ−カドヘリンを強制発現させてそのリバーションを評価した。
Example 2-2: Evaluation of reversal of primed pluripotent stem cells Next, E-cadherin was forcibly expressed in the obtained cells to evaluate the reversal.
まず、実施例２−２で得られたＢＤＦ１−ＥｐｉＳＣ−ＴＲＥ−Ｃｄｈ１およびＢＤＦ１−ＥｐｉＳＣ−ＧＦＰを、通常の培地（Dox(-)）または１０μｇ／ｍＬのドキシサイクリンを添加した培地（Dox(+)）で４日間培養した。その後、細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ（Life Technologies社）で完全に解離したのち、ＣＤ３１（Ｐｅｃａｍ１）に対する蛍光標識抗体（ＡＰＣ標識抗マウスＣＤ３１−ＡＰＣ抗体）で染色し、ＦＡＣＳ ＣＡＮＴＯ（ベクトン・ディッキンソン社製）で解析した。ＣＤ３１（Ｐｅｃａｍ１）は、マウスＥＳ細胞は発現しているがＥｐｉＳＣでは発現しない、ナイーブ型多能性幹細胞マーカーである。 First, BDF1-EpiSC-TRE-Cdh1 and BDF1-EpiSC-GFP obtained in Example 2-2 were added to a normal medium (Dox (−)) or a medium (Dox (+)) supplemented with 10 μg / mL doxycycline. ) For 4 days. Thereafter, the cells were completely dissociated with trypsin / EDTA (Life Technologies), and then stained with a fluorescently labeled antibody against CD31 (Pecam1) (APC-labeled anti-mouse CD31-APC antibody), and FACS CANTO (Becton Dickinson) We analyzed with. CD31 (Pecam1) is a naive pluripotent stem cell marker that is expressed in mouse ES cells but not in EpiSC.
その結果、ＢＤＦ１−ＥｐｉＳＣ−ＧＦＰでは、Dox(+)の条件でもＣＤ３１陽性の細胞はほとんど観察されなかったが、ＢＤＦ１−ＥｐｉＳＣ−ＴＲＥ−Ｃｄｈ１では、Dox(+)の条件ではＣＤ３１陽性の細胞集団が出現した（図１Ａ〜Ｄ、特に図１ＢおよびＤ）。このことから、Ｅ−カドヘリンを強制発現させると、プライム型多能性幹細胞はＣＤ３１陽性細胞に変化することが明らかとなった。 As a result, in BDF1-EpiSC-GFP, almost no CD31-positive cells were observed even under the condition of Dox (+), but in BDF1-EpiSC-TRE-Cdh1, a cell population positive for CD31 was obtained under the condition of Dox (+). Appeared (FIGS. 1A-D, especially FIGS. 1B and D). This revealed that when E-cadherin was forcibly expressed, primed pluripotent stem cells changed to CD31 positive cells.
次に、Ｅ−カドヘリンを強制発現させたＢＤＦ１−ＥｐｉＳＣ−ＴＲＥ−Ｃｄｈ１（図１Ｄに対応）を、ＣＤ３１陽性細胞（ＣＤ３１（＋））とＣＤ３１陰性細胞（ＣＤ３１（−））とにソーティングして、それぞれのキメラ形成能を検証した。 Next, BDF1-EpiSC-TRE-Cdh1 (corresponding to FIG. 1D) in which E-cadherin was forcibly expressed was sorted into CD31 positive cells (CD31 (+)) and CD31 negative cells (CD31 (−)). Each chimera forming ability was verified.
まず、ＢＤＦ１またはＩＣＲ系統マウスの胚をＭｅｄｉｕｍ２（ミリポア社製）で培養して、８細胞期または桑実胚期とした。得られた胚をＫＳＯＭ培地（ミリポア社製）中に移動し、２４時間培養して胚盤胞期まで発生させて、マウスの胚盤胞を得た。 First, embryos of BDF1 or ICR strain mice were cultured in Medium 2 (Millipore) to obtain the 8-cell stage or morula stage. The obtained embryo was transferred into KSOM medium (Millipore), cultured for 24 hours, and developed to the blastocyst stage to obtain a mouse blastocyst.
次に、得られた胚盤胞に、ソートして得たＣＤ３１陽性細胞とＣＤ３１陰性細胞をそれぞれ導入した。具体的には、顕微鏡下で、ピエゾに基づくマイクロマニピュレータを用いて透明体に穴を空け、帯下の空間に胚当り約１０個のＥｐｉＳＣを注入して、キメラ胚を作製した。その後、偽妊娠のレシピエントＩＣＲメスマウスの子宮に移植した。キメラ胚は移植から７日後、妊娠後９．５日相当の発生段階でレシピエントから摘出した。摘出した胚は、蛍光顕微鏡（ライカ社製）により観察した。 Next, CD31 positive cells and CD31 negative cells obtained by sorting were respectively introduced into the obtained blastocysts. Specifically, under a microscope, a transparent body was pierced using a piezo-based micromanipulator, and about 10 EpiSCs per embryo were injected into the space under the belt to produce a chimeric embryo. Thereafter, it was transplanted into the uterus of a pseudopregnant recipient ICR female mouse. The chimeric embryo was removed from the recipient at a developmental stage equivalent to 9.5 days after pregnancy, 7 days after transplantation. The extracted embryos were observed with a fluorescence microscope (Leica).
その結果、ＣＤ３１陽性細胞（ＣＤ３１（＋））では、ＧＦＰを発現する胚が高頻度で観察されたのに対して、ＣＤ３１陰性細胞（ＣＤ３１（−））では、ＧＦＰシグナルが観察されなかった（図１ＦおよびＧ）。このことから、Ｅ−カドヘリンを導入することによりＣＤ３１を発現するに至ったプライム型多能性幹細胞は、そのキメラ形成能を向上させていることが明らかとなった。一方、Ｅ−カドヘリンを強制発現させたＢＤＦ１−ＥｐｉＳＣ−ＴＲＥ−Ｃｄｈ１をＣＤ３１を指標としたソーティングをしないで胚盤胞に導入しても高いキメラ形成が観察された。キメラ形成率を図２Ａに示す。 As a result, embryos expressing GFP were frequently observed in CD31 positive cells (CD31 (+)), whereas no GFP signal was observed in CD31 negative cells (CD31 (−)) ( Figures 1F and G). From this, it was revealed that prime-type pluripotent stem cells that led to the expression of CD31 by introducing E-cadherin had improved chimera-forming ability. On the other hand, even when BDF1-EpiSC-TRE-Cdh1 forcibly expressing E-cadherin was introduced into blastocysts without sorting using CD31 as an index, high chimera formation was observed. The chimera formation rate is shown in FIG. 2A.
これらの結果から、Ｅ−カドヘリンの強制発現により、プライム型多能性幹細胞がキメラ形成能を向上させることが明らかとなった。キメラ形成能は分化が進むと失われると考えられていることから、Ｅ−カドヘリンの強制発現により、プライム型多能性幹細胞は、より未分化な状態になったと考えられる。 From these results, it was revealed that prime-type pluripotent stem cells improve the chimera-forming ability by forced expression of E-cadherin. Since chimera-forming ability is thought to be lost as differentiation progresses, it is considered that prime-type pluripotent stem cells have become more undifferentiated due to forced expression of E-cadherin.
さらに、Ｅ−カドヘリンを強制発現させたプライム型多能性幹細胞の遺伝子発現プロファイルを調べた。 Furthermore, the gene expression profile of prime-type pluripotent stem cells in which E-cadherin was forcibly expressed was examined.
Ｅ−カドヘリンを強制発現させて得られたＣＤ３１陽性細胞（ＣＤ３１（＋））とＣＤ３１陰性細胞（ＣＤ３１（−））とから常法によりそれぞれｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成した。その後、Ｔａｑｍａｎ Ｍｏｕｓｅ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ Ａｒｒａｙ（Life Technologies社製）を用いて製造者マニュアルに従って遺伝子発現パターンを比較した。 MRNA was extracted from CD31 positive cells (CD31 (+)) and CD31 negative cells (CD31 (−)) obtained by forced expression of E-cadherin, respectively, and cDNA was synthesized. Then, gene expression patterns were compared according to the manufacturer's manual using Taqman Mouse Stem Cell Pluripotency Array (manufactured by Life Technologies).
その結果、Ｅ−カドヘリンを強制発現させて得られたＣＤ３１陽性細胞（ＣＤ３１（＋））では、Ｒｅｘ１やＰｅｃａｍ１などのナイーブ型多能性幹細胞のマーカーとして知られる遺伝子の発現が高まっていた（図２Ｂ）。また、Ｔなどのプライム型多能性幹細胞のマーカーとして知られる遺伝子の発現が低下していた（図２Ｂ）。 As a result, expression of genes known as markers for naive pluripotent stem cells such as Rex1 and Pecam1 was increased in CD31 positive cells (CD31 (+)) obtained by forced expression of E-cadherin (FIG. 2B). In addition, the expression of genes known as markers for prime-type pluripotent stem cells such as T was decreased (FIG. 2B).
このことから、Ｅ−カドヘリンの強制発現により、プライム型多能性幹細胞は、ナイーブ型多能性幹細胞に変換していること（すなわち、リバーションしていること）が示された。 From this, it was shown that prime-type pluripotent stem cells were converted to naïve pluripotent stem cells (ie, reversed) by forced expression of E-cadherin.
実施例３：Ｅ−カドヘリンの強制発現とＳＴＡＴ３シグナルの活性化の組合せによるリバーション効率の向上
本実施例では、Ｅ−カドヘリンの強制発現に加えて、ＳＴＡＴ３シグナルを活性化することでリバーションの効率が顕著に向上することを示す。
Example 3 Improvement of Reversion Efficiency by Combination of Forced Expression of E-Cadherin and Activation of STAT3 Signal In this example, in addition to forced expression of E-cadherin, reversion was achieved by activating STAT3 signal. It shows that the efficiency is remarkably improved.
ＳＴＡＴ３シグナルの活性化は、細胞をＬＩＦで刺激することにより行なった。 Activation of STAT3 signal was performed by stimulating cells with LIF.
ＥＢ３ＤＲ−ＥｐｉＳＣには、実施例２−１と同じ方法でドキシサイクリン依存性Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ誘導系を得た（以後、ＥＢ３ＤＲ−ＥｐｉＳＣ−ＴＲＥ−Ｃｄｈ１と表記する）。 For EB3DR-EpiSC, a doxycycline-dependent E-cadherin induction system was obtained in the same manner as in Example 2-1 (hereinafter referred to as EB3DR-EpiSC-TRE-Cdh1).
ＥＢ３ＤＲ−ＥｐｉＳＣ−ＴＲＥ−Ｃｄｈ１を、通常の培地（Dox(-)）または１０μｇ／ｍＬのドキシサイクリンを添加した培地（Dox(+)）で、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）またはＬＩＦの存在下で、７日間培養して、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液で細胞を剥離し、ＡＰＣ標識抗マウスＣＤ３１抗体で染色したのち、ＦＡＣＳで解析を行った。 Presence of basic fibroblast growth factor (bFGF) or LIF in EB3DR-EpiSC-TRE-Cdh1 in normal medium (Dox (−)) or medium supplemented with 10 μg / mL doxycycline (Dox (+)) Then, the cells were cultured for 7 days, detached with trypsin / EDTA solution, stained with APC-labeled anti-mouse CD31 antibody, and analyzed by FACS.
その結果、ＥＢ３ＤＲ−ＥｐｉＳＣ−ＴＲＥ−Ｃｄｈ１では、ＬＩＦ刺激およびＥ−カドヘリンの強制発現の両方を組み合わせた場合にのみ、高い割合でＣＤ３１（Ｐｅｃａｍ１）陽性細胞が観察された（図３ＡおよびＢ）。ｂＦＧＦを含む培地でもＣＤ３１の発現は誘導されたもののそのレベルは限定的であった。また、ＣＤ３１（Ｐｅｃａｍ１）陽性細胞の出現の経時的変化を確認したところ、図３Ｃに示されるように、ＬＩＦ刺激およびＥ−カドヘリンの強制発現の両方を組み合わせた場合には、わずか４日間でＣＤ３１（Ｐｅｃａｍ１）を発現する細胞が出現することが明らかとなった。 As a result, in EB3DR-EpiSC-TRE-Cdh1, CD31 (Pecam1) positive cells were observed at a high rate only when both LIF stimulation and forced expression of E-cadherin were combined (FIGS. 3A and B). Even in the medium containing bFGF, the expression of CD31 was induced, but its level was limited. In addition, when time-dependent changes in the appearance of CD31 (Pecam1) positive cells were confirmed, as shown in FIG. 3C, when both LIF stimulation and forced expression of E-cadherin were combined, CD31 was observed in only 4 days. It was revealed that cells expressing (Pecam1) appeared.
実施例２−２に記載の方法で、Ｅ−カドヘリンを強制発現させ、ＬＩＦで刺激したＥＢ３ＤＲ−ＥｐｉＳＣ−ＴＲＥ−Ｃｄｈ１からＣＤ３１陽性細胞をソーティングし、キメラ形成能を確認した。すると、図３Ｅに示されるように、ＥＢ３ＤＲ−ＥｐｉＳＣ−ＴＲＥ−Ｃｄｈ１に由来するＤｓＲｅｄの蛍光が観察され、ＥＢ３ＤＲ−ＥｐｉＳＣがキメラ形成能を獲得していることが明らかとなった。特に強い蛍光が観察された個体を図中では点線により囲んだ（図３Ｅ）。 By the method described in Example 2-2, CD31 positive cells were sorted from EB3DR-EpiSC-TRE-Cdh1 in which E-cadherin was forcibly expressed and stimulated with LIF, and chimera formation ability was confirmed. Then, as shown in FIG. 3E, fluorescence of DsRed derived from EB3DR-EpiSC-TRE-Cdh1 was observed, and it became clear that EB3DR-EpiSC has acquired the ability to form chimeras. An individual in which particularly intense fluorescence was observed was surrounded by a dotted line in the figure (FIG. 3E).
このように、Ｅ−カドヘリンの強制発現に加えて、ＳＴＡＴ３シグナルを活性化すると、プライム型多能性幹細胞はそのキメラ形成能を劇的に向上させることが明らかとなった。 Thus, in addition to forced expression of E-cadherin, activating the STAT3 signal has revealed that prime-type pluripotent stem cells dramatically improve their chimera-forming ability.
実施例４：Ｗｎｔ／βカテニンシグナルの抑制と多能性幹細胞のリバーション
本実施例では、Ｗｎｔ／βカテニンシグナルの抑制剤として、ＩＷＰ−２およびＸＡＶ９３９を用いて、そのリバーションに対する効果を確認した。
Example 4: Suppression of Wnt / β-catenin signal and reversal of pluripotent stem cells In this example, IWP-2 and XAV939 were used as inhibitors of Wnt / β-catenin signal, and their effects on reversion were confirmed. did.
まず、ＩＷＰ−２のＷｎｔ／βカテニンシグナル抑制効果を確認するために、ウェスタンブロットでβカテニンのタンパク質量を確認した。培養条件は上記の通りとしてＥＢ３ＤＲ−ＥｐｉＳＣを培養し、ＩＷＰ−２（終濃度５ｎＭ）を添加してさらに２日間培養した。対照にはＩＷＰ−２の代わりに同量のＤＭＳＯを添加した。次に、Nuclear/Cytosol Fractionation Kit (Bio Vision, Mountain View, CA)を用いて製造者マニュアルに従って細胞質分画と核分画とを分離した。さらに得られたそれぞれの分画をLaemmli Sample Buffer (Bio-Rad, Hercules, CA)に溶解し、SDS-PAGEを行った。SDS-PAGEによって分離されたタンパクは、PVDF転写膜 (Millipore社製) にブロットし、一次抗体反応を行った。一次抗体としては、Cell Signaling Technology社から購入した抗β−カテニン抗体(#9562, 1:1000)、抗β−アクチン抗体(#3770, 1:1000)、抗ヒストンＨ３抗体 (#4499, 1:2000)を用いた。二次抗体として、抗β−カテニン抗体および抗ヒストンＨ３抗体に対しては、抗ラビットＩｇＧHorseradish peroxidase-conjugated抗体 (NA934V, 1:100, GE Healthcare UK, Little Chalfont, UK)で反応させ、抗β−アクチン抗体に対しては、抗マウスＩｇＧHorseradish peroxidase-conjugated抗体 (NA931V, 1:1000, GE Healthcare UK, Little Chalfont, UK)に反応させたあと、SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo, Rockford, IL)で二次抗体が結合したバンドを検出した。この結果、ＩＷＰ−２によって核分画におけるβ−カテニンの量が減少し、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナルが抑制されていることが確認できた（図４Ａ）。 First, in order to confirm the inhibitory effect of IWP-2 on the Wnt / β-catenin signal, the amount of β-catenin protein was confirmed by Western blot. The culture conditions were as described above, EB3DR-EpiSC was cultured, IWP-2 (final concentration 5 nM) was added, and further cultured for 2 days. The same amount of DMSO was added to the control instead of IWP-2. Next, the cytoplasmic fraction and the nuclear fraction were separated using the Nuclear / Cytosol Fractionation Kit (BioVision, Mountain View, CA) according to the manufacturer's manual. Furthermore, each obtained fraction was dissolved in Laemmli Sample Buffer (Bio-Rad, Hercules, CA) and subjected to SDS-PAGE. Proteins separated by SDS-PAGE were blotted onto a PVDF transfer membrane (Millipore) and subjected to a primary antibody reaction. As primary antibodies, anti-β-catenin antibodies (# 9562, 1: 1000), anti-β-actin antibodies (# 3770, 1: 1000) purchased from Cell Signaling Technology, anti-histone H3 antibodies (# 4499, 1: 2000) was used. As secondary antibodies, anti-β-catenin antibody and anti-histone H3 antibody were reacted with anti-rabbit IgG Horsesadish peroxidase-conjugated antibody (NA934V, 1: 100, GE Healthcare UK, Little Chalfont, UK), and anti-β- The actin antibody was reacted with an anti-mouse IgG Horseradish peroxidase-conjugated antibody (NA931V, 1: 1000, GE Healthcare UK, Little Chalfont, UK) and then treated with SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo, Rockford, IL). A band bound to the next antibody was detected. As a result, it was confirmed that the amount of β-catenin in the nuclear fraction was reduced by IWP-2 and the Wnt / β-catenin signal was suppressed (FIG. 4A).
１，０００Ｕ／ｍＬのマウスＬＩＦおよび１μＭのＰＤ０３２５９０１ (Axon, Groeningen, The Netherlands) を添加したＮ２Ｂ２７培地（Ying et al., Nature(2008), 435, 519-523）中でＥＢ３ＤＲ−ＥｐｉＳＣを培養した。５ｎＭのＩＷＰ−２（Wako, Osaka, Japan）を添加して、またはＩＷＰ−２の代わりにＧＳＫ３βの抑制剤として知られるＣＨＩＲ若しくは同量のＤＭＳＯを添加して、ＥＢ３ＤＲ−ＥｐｉＳＣに対する影響を確認した。 EB3DR-EpiSC were cultured in N2B27 medium (Ying et al., Nature (2008), 435, 519-523) supplemented with 1,000 U / mL mouse LIF and 1 μM PD0325901 (Axon, Groeningen, The Netherlands). . The effect on EB3DR-EpiSC was confirmed by adding 5 nM IWP-2 (Wako, Osaka, Japan), or adding CHIR known as an inhibitor of GSK3β or the same amount of DMSO instead of IWP-2. .
その結果、ＩＷＰ−２を添加した条件下では、培養７日目までにナイーブ型多能性幹細胞様の形態を示すコロニーの出現が観察され、培養１４日目にはその頻度が増加した（図４Ｃ）。また、培養１４日目におけるナイーブ型多能性幹細胞に特徴的なコロニー（図４Ｃ中の矢じり）の出現頻度は、ＩＷＰ−２添加によって有意に上昇した（図４ＣおよびＤ）。また、その後長期間継代を続けても、この形質を維持させたまま培養することが可能であった（データ省略）。このことから、ＬＩＦとＩＷＰ−２の処理により、ＥｐｉＳＣがナイーブ型多能性幹細胞に変換されたことが明らかとなった。 As a result, under the condition where IWP-2 was added, the appearance of colonies showing naive pluripotent stem cell-like morphology was observed by day 7 of culture, and the frequency increased on day 14 of culture (Fig. 4C). In addition, the appearance frequency of colonies (arrowheads in FIG. 4C) characteristic of naive pluripotent stem cells on day 14 of culture was significantly increased by the addition of IWP-2 (FIGS. 4C and D). Moreover, even if the passage was continued for a long time after that, it was possible to culture while maintaining this character (data not shown). From this, it became clear that EpiSC was converted into naive pluripotent stem cells by the treatment with LIF and IWP-2.
次に、これらの細胞でのＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ１）の発現を解析した。ＡＰＣ標識ラット抗マウスＣＤ３１抗体（eBioscience社製,17-0311）を用いてＣＤ３１の発現量をＦＡＣＳにより確認した。その結果、ＬＩＦとＩＷＰ−２の存在下では短期間に高頻度にＣＤ３１を発現することが分かった（図４ＥおよびＦ）。また、これらのＣＤ３１発現細胞のコロニーをクローニングして継代培養すると、マウスＥＳ細胞様の形態を示し（図４Ｇ）、マウスＥＳ細胞と同様に長期間継代を続けることが可能であった。該細胞はＥＢ３ＤＲ−ＥｐｉＳＣに由来するので、ＤｓＲｅｄを発現している（図４Ｈ）。 Next, the expression of CD31 (PECAM1) in these cells was analyzed. The expression level of CD31 was confirmed by FACS using an APC-labeled rat anti-mouse CD31 antibody (eBioscience, 17-0311). As a result, it was found that in the presence of LIF and IWP-2, CD31 was expressed frequently in a short period of time (FIGS. 4E and F). Moreover, when these colonies of CD31-expressing cells were cloned and subcultured, they showed a mouse ES cell-like morphology (FIG. 4G), and it was possible to continue passage for a long period of time as with mouse ES cells. Since the cells are derived from EB3DR-EpiSC, they express DsRed (FIG. 4H).
さらに、ＬＩＦとＩＷＰ−２で処理したＥＢ３ＤＲ−ＥｐｉＳＣのキメラ形成能を確認した。具体的には、ＢＤＦ１（Ｃ５７ＢＬ６／Ｎ；ＤＢＡ１ Ｆ１）系統マウスの胚をＭｅｄｉｕｍ２（ミリポア社製）で培養して、８細胞期または桑実胚期とした。得られた胚をＫＳＯＭ培地（ミリポア社製）中に移動し、２４時間培養して胚盤胞期まで発生させた。胚に注入するため、該細胞はトリプシン処理によって単一細胞にまで解離し、培地で懸濁した。顕微鏡下で、ピエゾに基づくマイクロマニピュレータを用いて透明体に穴を空け、帯下の空間に胚当り約１０個の細胞を注入して、キメラ胚を作製した。注入後、胚を割球になるまでＫＳＯＭ培地中で培養し、その後、偽妊娠のレシピエントＩＣＲメスマウスの子宮に移植した。キメラ形成は、毛の色により確認した。ＢＤＦ１×Ｃ５７ＢＬ／６由来の細胞は黒色の毛をはやし、１２９／Ｏｌａ由来の細胞は茶色の毛（アグーチ(Agouti)の色）をはやす。出生後のマウスの毛色を確認したところ、黒色と茶色とがキメラとなっており、毛色から得られたマウスはキメラマウスであることが確認できた（図４Ｉ）。すなわち、ＩＷＰ−２で処理したＥｐｉＳＣはキメラ形成能を向上させており、キメラ動物の作製が可能なナイーブ型多能性幹細胞へと変換されたことが明らかとなった。 Furthermore, chimera formation ability of EB3DR-EpiSC treated with LIF and IWP-2 was confirmed. Specifically, BDF1 (C57BL6 / N; DBA1 F1) strain mouse embryos were cultured in Medium2 (Millipore) to obtain the 8-cell stage or morula stage. The obtained embryo was transferred into a KSOM medium (Millipore), cultured for 24 hours, and developed to the blastocyst stage. For injection into embryos, the cells were dissociated into single cells by trypsinization and suspended in medium. Under a microscope, a transparent body was pierced using a micromanipulator based on piezo, and about 10 cells per embryo were injected into the space under the belt to produce a chimeric embryo. After injection, embryos were cultured in KSOM medium until blastomeres were then transplanted into the uterus of pseudopregnant recipient ICR female mice. Chimera formation was confirmed by hair color. Cells derived from BDF1 × C57BL / 6 have black hair, and cells derived from 129 / Ola have brown hair (Agouti color). When the hair color of the mouse after birth was confirmed, black and brown became chimera, and it was confirmed that the mouse obtained from the hair color was a chimeric mouse (FIG. 4I). That is, it was revealed that EpiSCs treated with IWP-2 had improved chimera-forming ability and were converted into naive pluripotent stem cells capable of producing chimeric animals.
さらに、他のＷｎｔ／βカテニンシグナル抑制剤を用いて細胞のリバーションを確認した。 Furthermore, cell reversion was confirmed using other Wnt / β-catenin signal inhibitors.
Ｗｎｔ／βカテニンシグナル抑制剤として、ＩＷＰ−２の代わりにＸＡＶ９３９ (Sigma-Aldrich, S.Louis, MO, USA )を用いる以外は、上記と同じ方法で、ナイーブ様コロニー形成およびキメラ形成を確認した。 Naive-like colony formation and chimera formation were confirmed by the same method as above except that XAV939 (Sigma-Aldrich, S. Louis, MO, USA) was used instead of IWP-2 as a Wnt / β-catenin signal inhibitor. .
すると、Ｗｎｔ／βカテニンシグナル抑制剤としてＸＡＶ９３９を用いた場合も、ＩＷＰ−２の結果と同様に、ＬＩＦと組み合わせると細胞が処理７日後にはナイーブ様コロニーを形成した（図５Ａ）。また、ＣＤ３１の発現を確認すると、Ｗｎｔ／βカテニンシグナル抑制剤としてＸＡＶ９３９を用いた場合も、ＩＷＰ−２の結果と同様に、ＣＤ３１陽性細胞が高頻度に観察された（図５Ｂ）。また、処理７日後にＣＤ１（Ｐｅｃａｍ１）陽性細胞の割合を確認したところ、Ｗｎｔ／βカテニンシグナル抑制剤としてＸＡＶ９３９を用いた場合も、ＩＷＰ−２の結果と同様に、ＬＩＦと組み合わせるとＣＤ１（Ｐｅｃａｍ１）陽性細胞の割合が顕著に増加した（図５Ｃ）。また、キメラ動物を形成させると、Ｗｎｔ／βカテニンシグナル抑制剤としてＸＡＶ９３９を用いた場合も、ＩＷＰ−２の結果と同様に、キメラ動物が形成された（図５Ｅ）。 Then, even when XAV939 was used as a Wnt / β-catenin signal inhibitor, the cells formed naive-like colonies after 7 days of treatment when combined with LIF, as in the case of IWP-2 (FIG. 5A). In addition, when the expression of CD31 was confirmed, CD31 positive cells were observed at high frequency as in the case of IWP-2 even when XAV939 was used as a Wnt / β-catenin signal inhibitor (FIG. 5B). Moreover, when the ratio of CD1 (Pecam1) positive cells was confirmed 7 days after the treatment, when XAV939 was used as a Wnt / β-catenin signal inhibitor, CD1 (Pecam1) was combined with LIF as in the case of IWP-2. ) The percentage of positive cells increased significantly (FIG. 5C). In addition, when a chimeric animal was formed, a chimeric animal was also formed when XAV939 was used as a Wnt / β-catenin signal inhibitor, similar to the result of IWP-2 (FIG. 5E).
実施例５：リバーションした細胞の遺伝子発現プロファイル
実施例４でＷｎｔ／βカテニンシグナルを抑制し、ＳＴＡＴ３シグナルを活性化したプライム型多能性幹細胞（ｗｉｔ−ｒＥＳＣ）の遺伝子プロファイルを確認した。
Example 5 Gene Expression Profile of Reversed Cells In Example 4, the gene profile of prime-type pluripotent stem cells (wit-rESC) that suppressed the Wnt / β-catenin signal and activated the STAT3 signal was confirmed.
遺伝子プロファイルは、実施例２−２に記載した通りに行なった。比較対象として、マウスＥＳ細胞（ＥＳＣ）、実施例２で得たＥ−カドヘリン強制発現細胞（Ｅ−ｃａｄ ｒＥＳＣ）およびＥｐｉＳＣを用いた。 The gene profile was performed as described in Example 2-2. As comparative objects, mouse ES cells (ESC), E-cadherin forced expression cells (E-cad rESC) obtained in Example 2 and EpiSC were used.
プライム型多能性幹細胞のマーカーとして知られるＬｅｆｔｙ１とＦｇｆ５の発現を調べると、実施例２および４で得られたＣＤ３１陽性の多能性幹細胞（ｗｉｔ−ｒＥＳＣおよびＥ−ｃａｄ ｒＥＳＣ）はいずれもＥＳ細胞と同等レベルまで発現を低下させていた（図６Ａ）。 When the expression of Lefty1 and Fgf5, which are known as markers of prime-type pluripotent stem cells, was examined, all of CD31-positive pluripotent stem cells (wit-rESC and E-cad rESC) obtained in Examples 2 and 4 were ES. Expression was reduced to the same level as the cells (FIG. 6A).
ナイーブ型多能性幹細胞のマーカーとして知られるＲｅｘ１、Ｐｅｃａｍ１、Ｋｉｔなどの発現を調べると、実施例２および４で得られた多能性幹細胞（ｗｉｔ−ｒＥＳＣおよびＥ−ｃａｄ ｒＥＳＣ）はいずれもＥＳ細胞と同等レベルまで発現を増加させていた（図６Ｂ）。 When the expression of Rex1, Pecam1, Kit, etc., which are known as markers for naive pluripotent stem cells, was examined, all of the pluripotent stem cells (wit-rESC and E-cad rESC) obtained in Examples 2 and 4 were ES. Expression was increased to the same level as the cells (FIG. 6B).
このことから、遺伝子発現プロファイルにおいても、Ｗｎｔ／βカテニンシグナルの抑制とＳＴＡＴ３の活性化を行なったプライム型多能性幹細胞は、ナイーブ型多能性幹細胞に変換されていることが理解できる。また、Ｅ−カドヘリンを強制発現させ、ＳＴＡＴ３の活性化を行なったプライム型多能性幹細胞は、ナイーブ型多能性幹細胞に変換されていることが理解できる。 From this, it can be understood that even in the gene expression profile, the prime-type pluripotent stem cell that has suppressed Wnt / β-catenin signal and activated STAT3 has been converted into a naive-type pluripotent stem cell. Moreover, it can be understood that the prime-type pluripotent stem cell in which E-cadherin is forcibly expressed and STAT3 is activated is converted into a naive-type pluripotent stem cell.
また、ＥＢ３ＤＲ−ＥｐｉＳＣをＬＩＦで刺激して刺激２日後の細胞を回収し、ＳＴＡＴ３シグナルの活性化をウェスタンブロット法により確認した。ＳＴＡＴ３シグナルの活性化は、リン酸化型Ｓｔａｔ３の存在により確認した。リン酸化型Ｓｔａｔ３は、一次抗体としてリン酸化型Ｓｔａｔ３を特異的に認識する抗Ｐ−Ｓｔａｔ３抗体（#9145, 1:2000, Cell Signaling Technology社製）（1:1000）を用いて検出した。 Further, EB3DR-EpiSC was stimulated with LIF, and the cells two days after the stimulation were collected, and activation of STAT3 signal was confirmed by Western blotting. Activation of the STAT3 signal was confirmed by the presence of phosphorylated Stat3. Phosphorylated Stat3 was detected using an anti-P-Stat3 antibody (# 9145, 1: 2000, manufactured by Cell Signaling Technology) (1: 1000) that specifically recognizes phosphorylated Stat3 as a primary antibody.
すると、ＬＩＦ非存在下ではＳＴＡＴ３シグナルの活性化は確認されなかったが、ＬＩＦ存在下では、ＳＴＡＴ３シグナルの活性化が確かに認められた（図６Ｃ）。また、ＳＴＡＴ３シグナルの活性化は、ＩＷＰ−２またはＸＡＶ９３９の存在下でも認められた（図６Ｃ）。 Then, activation of STAT3 signal was not confirmed in the absence of LIF, but activation of STAT3 signal was confirmed in the presence of LIF (FIG. 6C). Activation of STAT3 signal was also observed in the presence of IWP-2 or XAV939 (FIG. 6C).
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