JP2015136300A

JP2015136300A - Transgenic silkworm expressing human insulin receptor, and evaluation method, screening method and medicine producing method using transgenic silkworm

Info

Publication number: JP2015136300A
Application number: JP2014007903A
Authority: JP
Inventors: 関水　和久; Kazuhisa Sekimizu; 和久関水; 洋浜本; Hiroshi Hamamoto; 靖彦松本; Yasuhiko Matsumoto; 啓子片岡; Keiko Kataoka; 秀樹瀬筒; Hideki Sezutsu; 拓也坪田; Takuya Tsubota
Original assignee: National Institute of Agrobiological Sciences; University of Tokyo NUC; Genome Pharmaceuticals Institute Co Ltd
Current assignee: National Institute of Agrobiological Sciences; University of Tokyo NUC; Genome Pharmaceuticals Institute Co Ltd
Priority date: 2014-01-20
Filing date: 2014-01-20
Publication date: 2015-07-30
Anticipated expiration: 2034-01-20
Also published as: JP6330236B2

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide model animals and experimental animals expressing human insulin receptor having advantage in cost, having no ethical problem, requiring no long term keeping, and realizing preferable discussion for a substance reducing the blood glucose level, and to provide an evaluation method and screening method for the hypoglycemic substance having advantage in cost and having no ethical problem.SOLUTION: A transgenic silkworm having a feature that it expresses human insulin receptor is produced. The problem is solved with an evaluation method, screening method and medicine producing method using the transgenic silkworm.

Description

本発明は、ヒトインスリン受容体を発現するトランスジェニックカイコ、該トランスジェニックカイコを用いた評価方法、スクリーニング方法、及び、薬剤製造方法に関するものである。 The present invention relates to a transgenic silkworm that expresses a human insulin receptor, an evaluation method using the transgenic silkworm, a screening method, and a drug production method.

ヒトの疾患の発症及び重篤化の機構を理解することは、その疾患の予防、治療法を確立する上で重要である。しかしながら、ヒトの患者を用いて疾患に関する基礎研究や治療薬の開発を行うことは、倫理的な問題があり、一般的には困難であるとされている。
この問題を解決するために、様々なモデル動物を利用した前臨床試験が行われる。その際、ヒトとこれらのモデル動物間の解離が問題となるが、近年この点を解決するための手法として、ヒト化マウス（ｈｕｍａｎｉｚｅｄｍｉｃｅ）の作出方法が開発され、それを利用した疾患の理解や治療法の確立に関する研究が盛んに行われるようになった（非特許文献１） Understanding the onset and severity of human disease is important in establishing prevention and treatment methods for the disease. However, it is generally considered difficult to conduct basic research on diseases and development of therapeutic drugs using human patients due to ethical problems.
In order to solve this problem, preclinical tests using various model animals are conducted. At that time, dissociation between humans and these model animals becomes a problem, but in recent years, a method for creating humanized mice has been developed as a technique for solving this problem, and the use of this method for understanding diseases And research on establishment of treatment methods has been actively conducted (Non-patent Document 1)

ヒト化マウスを用いる研究手法には、（ａ）ヒトの遺伝子の導入、（ｂ）ヒト細胞の導入、及び、（ｃ）ヒトＥＳ細胞やヒトｉＰＳ細胞から作成された組織の導入等がある。近年、ヒトＥＳ細胞やヒトｉＰＳ細胞から様々な組織が作成され、それを移植したマウスを疾患の重篤化機構の解明やワクチン開発のためのモデル動物として利用する研究が活発に行われている（非特許文献２〜４）。 Research methods using humanized mice include (a) introduction of human genes, (b) introduction of human cells, and (c) introduction of tissues created from human ES cells and human iPS cells. In recent years, various tissues have been created from human ES cells and human iPS cells, and research on the use of transplanted mice as model animals for elucidation of disease severity mechanisms and vaccine development has been actively conducted. (Non-patent documents 2 to 4).

しかし、哺乳動物であるマウスを多数犠牲にする化合物のスクリーニングに対しては、コストや動物愛護の視点からの問題があり、ヒト化マウスを薬のシード化合物の探索研究に利用する際の障壁となっている。 However, screening for compounds that sacrifice a large number of mammalian mice has problems from the viewpoint of cost and animal welfare, and there are barriers to the use of humanized mice for exploratory research of drug seed compounds. It has become.

発明者らは、動物倫理的な問題が軽減される無脊椎動物モデルとして、カイコガの幼虫（以下、「カイコ」と略記する）を用いたｉｎｖｉｖｏスクリーニング系の構築と創薬への応用を提案している。
カイコは、マウス等の哺乳動物と比べて飼育の費用がはるかに安く、また小さいスペースで飼育可能である。更に、カイコは動きが緩慢であり、かつ手で扱うのに十分な大きさを備えているため、通常の注射器を用いた定量的な薬液の投与が容易である。
本発明者らは、カイコにおいても哺乳動物と共通した薬物の代謝反応があること、及び、種々の化合物の毒性の指標であるＬＤ５０がカイコと哺乳動物でよく一致することを見出し、報告している（非特許文献５）。
更に、カイコ感染モデルや高血糖カイコモデル等の疾患モデルを確立し、抗生物質の治療効果の指標であるＥＤ５０がカイコと哺乳動物でよく一致することを報告している（非特許文献６、７）。従って、カイコにおいて多くの薬物は、哺乳動物と略一致した体内動態を示すと考えられる。 Inventors proposed the construction of an in vivo screening system using silkworm larvae (hereinafter abbreviated as “Silkworm”) and its application to drug discovery as an invertebrate animal model that reduces animal ethical problems doing.
Silkworms are much cheaper to raise than mammals such as mice, and can be raised in a small space. Furthermore, since silkworms move slowly and are large enough to be handled by hand, it is easy to administer quantitative drug solutions using ordinary syringes.
The present inventors have found and reported that silkworms share a drug metabolic reaction common to mammals, and that LD50, which is an indicator of toxicity of various compounds, matches well between silkworms and mammals. (Non-Patent Document 5).
Furthermore, disease models such as a silkworm infection model and a hyperglycemic silkworm model have been established, and it has been reported that ED50, which is an index of the therapeutic effect of antibiotics, agrees well between silkworms and mammals (Non-Patent Documents 6 and 7). ). Therefore, many drugs in silkworms are considered to exhibit pharmacokinetics that are almost identical to mammals.

また、カイコにおいては、外来遺伝子を導入し発現させるというトランスジェニック技術が確立されている（非特許文献８）。
上記技術を利用して、カイコの一部の生理機能をヒト化し、医薬品の評価に供することができると考えられるが、その具体的な例はこれまでに報告されていない。 In silkworms, a transgenic technique for introducing and expressing a foreign gene has been established (Non-patent Document 8).
Although it is considered that some physiological functions of silkworms can be humanized and used for evaluation of pharmaceuticals using the above technique, no specific example has been reported so far.

一方、ペプチドホルモンであるインスリンは、肝臓や脂肪組織等に作用し、血糖降下作用を有する。糖尿病は、インスリンの不足によって血糖値が異常に高くなり、尿中に糖が排出される慢性の病気であり、生活習慣病の１つである。 On the other hand, the peptide hormone insulin acts on the liver, adipose tissue and the like, and has a hypoglycemic effect. Diabetes is a chronic disease in which blood sugar levels are abnormally high due to lack of insulin and sugar is excreted in urine, and is one of lifestyle-related diseases.

発明者らは、カイコの餌にグルコースを添加するとカイコが高血糖になること、及び、その高血糖となったカイコに高濃度のヒトインスリンを投与すると、カイコの血糖値が低下することを見出している（特許文献１）。また、特許文献１ではヒトインスリンの処理によりカイコの脂肪体のＡｋｔのリン酸化が亢進すること、及び、ＰＩ３キナーゼの阻害剤であるＷｏｒｔｍａｎｎｉｎ（ワートマニン）の処理により、このヒトインスリンによるＡｋｔのリン酸化が阻害されることも開示している。 The inventors have found that adding glucose to the silkworm feed causes the silkworm to become hyperglycemic, and that administering a high concentration of human insulin to the hyperglycemic silkworm decreases the blood sugar level of the silkworm. (Patent Document 1). In addition, in Patent Document 1, phosphorylation of Akt by a human insulin is enhanced by the treatment of human insulin, and the phosphorylation of silkworm fat body is enhanced, and by the treatment of Wortmannin (a wortmannin), an inhibitor of PI3 kinase, phosphorylation of Akt by human insulin. Is also disclosed to be inhibited.

しかしながら、その系では、ヒトの治療に用いられる濃度の１００倍以上のヒトインスリンを投与する必要があり、更なる改良が求められていた。また、更に精度が高く優れた、血糖値を降下させる物質に関する評価方法や、該物質のスクリーニング方法が求められていた。 However, in this system, it is necessary to administer human insulin at a concentration 100 times or more that used for human treatment, and further improvement has been demanded. Further, there has been a demand for an evaluation method for a substance that lowers blood glucose level and a screening method for the substance with higher accuracy and better.

特開２００９−０５８５００号公報JP 2009-058500 A

Shultz LD，Ishikawa F，Greiner DL．Nat Rev Immunol．2007 Feb;7(2):118-30.Shultz LD, Ishikawa F, Greiner DL. Nat Rev Immunol. 2007 Feb; 7 (2): 118-30. Watanabe S，Terashima K，Ohta S，Horibata S，Yajima M，Shiozawa Y，Dewan MZ，Yu Z，Ito M，Morio T，Shimizu N，Honda M，Yamamoto N．Blood．2007 Jan 1;109(1):212-8.Watanabe S, Terashima K, Ohta S, Horibata S, Yajima M, Shiozawa Y, Dewan MZ, Yu Z, Ito M, Morio T, Shimizu N, Honda M, Yamamoto N. Blood. 2007 Jan 1; 109 (1): 212-8. Kneteman NM，Weiner AJ，O'Connell J，Collett M，Gao T，Aukerman L，Kovelsky R，Ni ZJ，Zhu Q，Hashash A，Kline J，Hsi B，Schiller D，Douglas D，Tyrrell DL，Mercer DF．Hepatology．2006 Jun;43(6):1346-53.Kneteman NM, Weiner AJ, O'Connell J, Collett M, Gao T, Aukerman L, Kovelsky R, Ni ZJ, Zhu Q, Hashash A, Kline J, Hsi B, Schiller D, Douglas D, Tyrrell DL, Mercer DF. Hepatology. 2006 Jun; 43 (6): 1346-53. Guirado E，Amat I，Gil O，Diaz J，Arcos V，Caceres N，Ausina V，Cardona PJ．Microbes Infect．2006 Apr;8(5):1252-9.Guirado E, Amat I, Gil O, Diaz J, Arcos V, Caceres N, Ausina V, Cardona PJ. Microbes Infect. 2006 Apr; 8 (5): 1252-9. Hamamoto H，Tonoike A，Narushima K，Horie R，Sekimizu K．Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol．2009 Apr;149(3):334-9.Hamamoto H, Tonoike A, Narushima K, Horie R, Sekimizu K. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 2009 Apr; 149 (3): 334-9. Kaito C，Akimitsu N，Watanabe H，Sekimizu K．Microb Pathog．2002 Apr;32(4):183-90.Kaito C, Akimitsu N, Watanabe H, Sekimizu K. Microb Pathog. 2002 Apr; 32 (4): 183-90. Hamamoto H，Kurokawa K，Kaito C，Kamura K，Manitra Razanajatovo I，Kusuhara H，Santa T，Sekimizu K．Antimicrob Agents Chemother．2004 Mar;48(3):774-9.Hamamoto H, Kurokawa K, Kaito C, Kamura K, Manitra Razanajatovo I, Kusuhara H, Santa T, Sekimizu K. Antimicrob Agents Chemother. 2004 Mar; 48 (3): 774-9. Tomita M，Munetsuna H，Sato T，Adachi T，Hino R，Hayashi M，Shimizu K，Nakamura N，Tamura T，Yoshizato K．Nat Biotechnol．2003 Jan;21(1):52-6.Tomita M, Munetsuna H, Sato T, Adachi T, Hino R, Hayashi M, Shimizu K, Nakamura N, Tamura T, Yoshizato K. Nat Biotechnol. 2003 Jan; 21 (1): 52-6.

本発明は、上記背景技術に鑑みてなされたものであり、その課題は、コスト的に有利であり、倫理的な問題が少なく、ヒトの血糖値を降下させる薬剤に関する検討・評価が正確・適切にできるモデル動物・実験動物を提供することにある。
また、かかるモデル動物・実験動物を用いた、ヒトインスリン受容体に作用するアゴニスト又はアンタゴニストの薬効を評価する方法、及び、ヒトの血糖値を降下させる物質をスクリーニングする方法を提供することである。 The present invention has been made in view of the above-mentioned background art, and its problem is advantageous in terms of cost, has few ethical problems, and is accurately and appropriately studied and evaluated for drugs that lower human blood glucose levels. The purpose is to provide model animals and experimental animals that can be used.
Another object of the present invention is to provide a method for evaluating the efficacy of an agonist or antagonist that acts on a human insulin receptor, and a method for screening a substance that lowers the blood glucose level of a human using such model animals / experimental animals.

本発明者は、上記の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、ＧＡＬ４／ＵＡＳ発現システムを用いてヒトインスリン受容体を発現するトランスジェニックカイコを作製し、該トランスジェニックカイコにヒトインスリンを投与すると血糖値が低下すると共に脂肪体のＡｋｔのリン酸化が亢進されることを見出して本発明をするに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventor produced a transgenic silkworm that expresses a human insulin receptor using the GAL4 / UAS expression system, and administered human insulin to the transgenic silkworm. As a result, it was found that the blood glucose level was lowered and phosphorylation of Akt in the fat body was enhanced, and the present invention was made.

すなわち、本発明は、ヒトインスリン受容体を発現したものであることを特徴とするトランスジェニックカイコを提供するものである。 That is, the present invention provides a transgenic silkworm characterized by expressing a human insulin receptor.

また、本発明は、ヒトインスリン受容体に作用するアゴニスト又はアンタゴニストの薬効を評価する方法であって、
（Ａ）上記トランスジェニックカイコに上記アゴニスト又はアンタゴニストを投与する工程、
（Ｂ）上記アゴニスト又はアンタゴニストが投与されたトランスジェニックカイコの脂肪体又は血液中の糖の濃度を測定する工程、
を有することを特徴とする方法を提供するものである。 Further, the present invention is a method for evaluating the efficacy of an agonist or antagonist that acts on a human insulin receptor,
(A) administering the agonist or antagonist to the transgenic silkworm,
(B) a step of measuring a sugar concentration in a fat body or blood of a transgenic silkworm to which the agonist or antagonist is administered,
To provide a method characterized by comprising:

また、本発明は、被検物質がヒトの血糖値を降下させる物質であるか否かを評価する方法であって、
（ａ）上記トランスジェニックカイコに被検物質を投与する工程、
（ｂ）上記被検物質が投与されたトランスジェニックカイコの脂肪体中又は血液中の糖の濃度を測定する工程、
を有することを特徴とする方法を提供するものである。 Further, the present invention is a method for evaluating whether or not a test substance is a substance that lowers human blood glucose level,
(A) administering a test substance to the transgenic silkworm,
(B) a step of measuring a sugar concentration in a fat body or blood of a transgenic silkworm to which the test substance is administered,
To provide a method characterized by comprising:

また、本発明は、ヒトの血糖値を降下させる物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）上記トランスジェニックカイコに被検物質を投与する工程、
（ｂ）上記被検物質が投与されたトランスジェニックカイコの脂肪体中又は血液中の糖の濃度を測定する工程、
（ｃ）上記被検物質の中から、該トランスジェニックカイコの脂肪体中又は血液中の糖の濃度を低下させる物質を選択する工程、
を有することを特徴とする方法を提供するものである。 Further, the present invention is a method for screening a substance that lowers blood glucose level in humans,
(A) administering a test substance to the transgenic silkworm,
(B) a step of measuring a sugar concentration in a fat body or blood of a transgenic silkworm to which the test substance is administered,
(C) a step of selecting a substance that lowers the sugar concentration in the fat body or blood of the transgenic silkworm, from the test substance,
To provide a method characterized by comprising:

また、本発明は、ヒトの血糖値を降下させる薬剤を製造する方法であって、
（ａ）上記トランスジェニックカイコに被検物質を投与する工程、
（ｂ）上記被検物質が投与されたトランスジェニックカイコの脂肪体中又は血液中の糖の濃度を測定する工程、
（ｃ）上記被検物質の中から、該トランスジェニックカイコの脂肪体中又は血液中の糖の濃度を低下させる物質を選択する工程、
（ｄ）上記工程（ｃ）で選択された物質と製薬上許容される担体を混合する工程、
を有することを特徴とする方法を提供するものである。 The present invention is also a method for producing a drug that lowers blood glucose levels in humans,
(A) administering a test substance to the transgenic silkworm,
(B) a step of measuring a sugar concentration in a fat body or blood of a transgenic silkworm to which the test substance is administered,
(C) a step of selecting a substance that lowers the sugar concentration in the fat body or blood of the transgenic silkworm, from the test substance,
(D) mixing the substance selected in step (c) with a pharmaceutically acceptable carrier;
To provide a method characterized by comprising:

本発明によれば、前記問題点や前記課題を解決し、コスト的に有利であり、倫理的な問題が少なく、飼育も容易であり、「ヒトの血糖値を降下させる薬剤に関する検討・評価」や「種々の薬理実験」等が、容易に、安価に、効率的に、正確・適切にできるモデル動物・実験動物を提供することができる。 According to the present invention, the above-mentioned problems and the above-mentioned problems are solved, cost is advantageous, there are few ethical problems, breeding is easy, and “examination / evaluation on drugs that lower human blood glucose levels” And “various pharmacological experiments” can provide model animals and experimental animals that can be easily, inexpensively, efficiently, accurately and appropriately.

また、本発明の上記モデル動物・実験動物を用いれば、容易に、安価に、効率的に、正確・適切に、ヒトインスリン受容体に作用するアゴニスト又はアンタゴニストの薬効を評価する方法、ヒトの血糖値を降下させる物質をスクリーニングする方法、該物質を製造する方法等を提供することができる。
カイコの餌にグルコースを添加して高血糖状態にしたカイコ（特許文献１参照）では、インスリン受容体のヒトインスリンに対する親和性が低い可能性があるが、その点も解決され、被検物質を大量に投与しなくても、容易に、安価に、効率的に、正確・適切に、該被検物質を検討・評価でき、上記した評価方法、スクリーニング方法等が可能になる。 Further, by using the above model animal / experimental animal of the present invention, a method for evaluating the efficacy of an agonist or antagonist acting on a human insulin receptor easily, inexpensively, efficiently, accurately and appropriately, human blood glucose It is possible to provide a method for screening a substance that lowers the value, a method for producing the substance, and the like.
In silkworms (see Patent Document 1) that have been made hyperglycemic by adding glucose to silkworm food (see Patent Document 1), the affinity of the insulin receptor for human insulin may be low. Even if it is not administered in a large amount, the test substance can be examined and evaluated easily, inexpensively, efficiently, accurately and appropriately, and the above-described evaluation method, screening method and the like become possible.

（Ａ）ヒトインスリン受容体発現用のコンストラクトを模式的に示した図である。（Ｂ）カイコ眼でのＵＡＳ−Ｈｕｍａｎｉｎｓｕｌｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒ（Ｇ）におけるＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）の発現と、ＡｃｔｉｎＡ３−ＧＡＬ４（Ｒ）におけるＤｓＲｅｄの発現を確認した結果を示す写真である。（Ｃ）トランスジェニックカイコ（Ｇ／Ｒ）におけるヒトインスリン受容体の発現確認を、ウエスタンブロット法を用いて行った結果を表す図である。「ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎｉｎｓｕｌｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒ」は、「抗ヒトインスリン受容体抗体」であり、「ａｎｔｉ−Ａｃｔｉｎ」は、「抗アクチン抗体」である。(A) It is the figure which showed typically the construct for human insulin receptor expression. (B) It is a photograph showing the results of confirming the expression of GFP (green fluorescent protein) in UAS-Human insulator receptor (G) and the expression of DsRed in Actin A3-GAL4 (R) in silkworm eyes. (C) It is a figure showing the result of having performed the expression confirmation of the human insulin receptor in a transgenic silkworm (G / R) using the western blotting method. “Anti-Human insulin receptor” is an “anti-human insulin receptor antibody”, and “anti-Actin” is an “anti-actin antibody”. （Ａ）ヒトインスリン受容体を発現していないカイコ（−／Ｒ）とヒトインスリン受容体を発現しているカイコ（Ｇ／Ｒ）に、生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）又はヒトインスリン（Ｈｕｍａｎｉｎｓｕｌｉｎ、５μｇ／ｌａｒｖａ）を投与し、６時間後の血糖値をフェノール硫酸法で測定した結果を示すグラフである。縦軸：血糖値（Ｈｅｍｏｌｙｍｐｈｓｕｇａｒ、ｍｇ／ｍＬ）（Ｂ）ヒトインスリン受容体を発現していないカイコ（−／Ｒ）とヒトインスリン受容体を発現しているカイコ（Ｇ／Ｒ）に、生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）又は各種濃度のヒトインスリン（０．３１２５〜８０μｇ／ｌａｒｖａ）を投与し、６時間後の血糖値をフェノール硫酸法で測定した結果を示すグラフである。縦軸：生理食塩水投与群の血糖値を１としたときの変動率（Ｒｅｌａｔｉｖｅｃｈａｎｇｅｏｆｈｅｍｏｌｙｍｐｈｓｕｇａｒ）(A) A silkworm not expressing a human insulin receptor (-/ R) and a silkworm expressing a human insulin receptor (G / R) to physiological saline (0.9% NaCl) or human insulin ( It is a graph which shows the result of having administered human insulin, 5 microgram / larva), and having measured the blood glucose level 6 hours after by the phenol sulfuric acid method. Vertical axis: blood glucose level (Hemolyph sugar, mg / mL) (B) Silkworm not expressing human insulin receptor (-/ R) and silkworm expressing human insulin receptor (G / R) It is a graph which shows the result of having administered the salt solution (0.9% NaCl) or various concentrations of human insulin (0.3125-80microgram / larva), and measuring the blood glucose level 6 hours after by the phenol sulfuric acid method. Vertical axis: Fluctuation rate when the blood glucose level of the physiological saline administration group is 1 (relative change of hemolymph sugar) ヒトインスリン受容体を発現していないカイコ（−／Ｒ）とヒトインスリン受容体を発現しているカイコ（Ｇ／Ｒ）に、生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）又はヒトインスリン（５μｇ／ｌａｒｖａ）を投与後、摘出した脂肪体のタンパク質を、ウエスタンブロット法を用いて解析した結果を示す図であり、及び、各脂肪体中のリン酸化したＡｋｔ量を比較した結果を示すグラフである。「−」：生理食塩水投与、「＋」：ヒトインスリン投与、「ａｎｔｉ−ｐ−Ａｋｔ」：抗リン酸化Ａｋｔ抗体、「ａｎｔｉ−Ａｋｔ」：抗Ａｋｔ抗体、グラフの横軸は、脂肪体中のＡｋｔ量に対するリン酸化したＡｋｔ量の割合（ＲｅｌａｔｉｖｅＡｋｔｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ（ｐ−Ａｋｔ／ｔｏｔａｌＡｋｔ）である。Silkworms not expressing the human insulin receptor (-/ R) and silkworms expressing the human insulin receptor (G / R) can be treated with physiological saline (0.9% NaCl) or human insulin (5 μg / larva). Is a graph showing the results of analysis of the extracted fat body protein using Western blotting after administration, and the results of comparing the phosphorylated Akt amount in each fat body. "-": Physiological saline administration, "+": human insulin administration, "anti-p-Akt": anti-phosphorylated Akt antibody, "anti-Akt": anti-Akt antibody, horizontal axis of graph is in fat body The ratio of the amount of phosphorylated Akt to the amount of Akt (relative Akt phosphorylation (p-Akt / total Akt)). ヒトインスリン受容体を発現しているカイコ（Ｇ／Ｒ）の脂肪体を摘出後、組織培養系に投入し、培養後の脂肪体タンパク質を、ウエスタンブロット法を用いて解析した結果を示す図、及び、各脂肪体中のリン酸化したＡｋｔ量を比較した結果を示すグラフである。「−」：投与せず、「＋」：投与The figure which shows the result of having analyzed the fat body protein after extracting the fat body of the silkworm (G / R) which expresses a human insulin receptor, putting it into a tissue culture system, and using Western blotting, And it is a graph which shows the result of having compared the amount of phosphorylated Akt in each fat body. “−”: Not administered, “+”: administered （Ａ）ヒトインスリン（Ｈｕｍａｎｉｎｓｕｌｉｎ）とウシインスリン（Ｂｏｖｉｎｅｉｎｓｕｌｉｎ）の構造（アミノ酸配列）の比較をした図である。（Ｂ）ヒトインスリン受容体を発現しているカイコ（Ｇ／Ｒ）に生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）、ウシインスリン（５μｇ／ｌａｒｖａ）、又はヒトインスリン（５μｇ／ｌａｒｖａ）を投与し、６時間後の血糖値をフェノール硫酸法で測定した結果を示すグラフである。(A) It is the figure which compared the structure (amino acid sequence) of human insulin (Human insulin) and bovine insulin (Bovine insulin). (B) administering a physiological saline (0.9% NaCl), bovine insulin (5 μg / larva), or human insulin (5 μg / larva) to a silkworm (G / R) expressing a human insulin receptor; It is a graph which shows the result of having measured the blood glucose level after 6 hours by the phenol sulfuric acid method.

以下、本発明について説明するが、本発明は、以下の具体的態様に限定されるものではなく、技術的思想の範囲内で任意に変形することができる。 Hereinafter, the present invention will be described, but the present invention is not limited to the following specific embodiments, and can be arbitrarily modified within the scope of the technical idea.

［トランスジェニックカイコ］
本発明のトランスジェニックカイコは、ヒトインスリン受容体を発現したものであることを特徴とするトランスジェニックカイコである（以下、単に「トランスジェニックカイコ」と略記する場合がある）。 [Transgenic silkworm]
The transgenic silkworm of the present invention is a transgenic silkworm characterized by expressing a human insulin receptor (hereinafter sometimes simply referred to as “transgenic silkworm”).

ヒトインスリン受容体は細胞外に存在し、インスリンと結合するαサブユニットと、膜貫通タンパク質で細胞内部分にチロシンキナーゼ活性をもつβサブユニットがＳ−Ｓ結合で結ばれている。αサブユニットにインスリンが結合すると、βサブユニットの細胞内部分に存在するチロシンが自己リン酸化され、活性が生じる。この活性化したチロシンキナーゼがインスリンの情報を細胞内へ伝達する。 The human insulin receptor exists extracellularly, and an α subunit that binds to insulin and a β subunit that is a transmembrane protein and has a tyrosine kinase activity in an intracellular portion are connected by an S—S bond. When insulin binds to the α subunit, tyrosine present in the intracellular portion of the β subunit is autophosphorylated to produce activity. This activated tyrosine kinase transmits insulin information into the cell.

ヒトインスリン受容体をコードする遺伝子（以下、単に「ヒトインスリン受容体遺伝子」と略記する場合がある）はすでに公知である。例えば、ヒトインスリン受容体遺伝子は、Ｅｂｉｎａらの文献（Ebina Y．et al．，1985，Cell 40(4)，pp.747-758）及びＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｍ１００５１等で公表されており、自体公知の方法により単離することができる。
本発明において、ヒトインスリン受容体をコードする遺伝子は、全長の一部分が欠損しているヒトインスリン受容体遺伝子を含み、ヒトインスリン受容体の機能を有していれば特に限定されない。例えば、ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｍ１００５１で示される塩基配列等からなり、また、個体差に応じて、多型の範囲で１〜複数個の塩基が異なっているものも含まれる。 A gene encoding a human insulin receptor (hereinafter sometimes simply abbreviated as “human insulin receptor gene”) is already known. For example, the human insulin receptor gene is described in Ebina et al. (Ebina Y. et al., 1985, Cell 40 (4), pp.747-758) and Genbank Accession No. M10051 and the like can be isolated by a method known per se.
In the present invention, the gene encoding the human insulin receptor is not particularly limited as long as it includes a human insulin receptor gene lacking a part of its full length and has a function of a human insulin receptor. For example, GenBank Accession No. It includes a base sequence represented by M10051, etc., and includes those in which one to a plurality of bases are different within a polymorphism range depending on individual differences.

カイコ形質転換用ベクターに組み込むべきヒトインスリン受容体遺伝子は、その形態に特に制限はなく、例えば、公知の配列情報に基づいて適宜プライマーを設計し、ヒトのｃＤＮＡライブラリーから常法のＰＣＲにより容易に増幅して得ることができる。 The form of the human insulin receptor gene to be incorporated into the silkworm transformation vector is not particularly limited. For example, an appropriate primer is designed based on known sequence information and can be easily obtained from a human cDNA library by conventional PCR. Can be obtained by amplification.

ヒトインスリン受容体をカイコに導入する手順としては、ヒトインスリン受容体遺伝子を組み込んだベクターをカイコに導入する方法等、公知の方法を用いることができる。ヒトインスリン受容体遺伝子を効率良く発現させるために、ＧＡＬ４／ＵＡＳ発現システム、すなわち、転写制御因子ＧＡＬ４とその標的プロモーターであるＵＡＳ（Ｕｐｓｔｒｅａｍａｃｔｉｖａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅ）とからなる遺伝子の発現制御下にあるのが好ましい。
より詳細には、ヒトインスリン受容体遺伝子は、標的プロモーターＵＡＳの下流に組み込むのが好ましい。例えば、この融合遺伝子を、ＧＡＬ４を発現するカイコと交配することにより、ＧＡＬ４／ＵＡＳ発現システム等によりヒトインスリン受容体が発現するトランスジェニックカイコが作製できる。
このトランスジェニックカイコには、ＧＡＬ４をコードする遺伝子と、ＵＡＳの下流にヒトインスリン受容体遺伝子とが導入されている。 As a procedure for introducing a human insulin receptor into a silkworm, a known method such as a method of introducing a vector incorporating a human insulin receptor gene into a silkworm can be used. In order to efficiently express the human insulin receptor gene, it is preferably under the expression control of a gene comprising the GAL4 / UAS expression system, that is, the transcription control factor GAL4 and its target promoter UAS (Upstream activation sequence). .
More specifically, the human insulin receptor gene is preferably incorporated downstream of the target promoter UAS. For example, by crossing this fusion gene with a silkworm that expresses GAL4, a transgenic silkworm that expresses a human insulin receptor can be produced by a GAL4 / UAS expression system or the like.
In this transgenic silkworm, a gene encoding GAL4 and a human insulin receptor gene are introduced downstream of UAS.

更には、細胞質アクチンタンパク質をコードする遺伝子のプロモーターの下流に、転写因子ＧＡＬ４をコードする遺伝子を有するトランスジェニックカイコと、ＧＡＬ４の標的プロモーターであるＵＡＳの下流に、ヒトインスリン受容体をコードする遺伝子を有するトランスジェニックカイコを交配させることにより作製されたトランスジェニックカイコは、細胞質アクチンタンパク質をコードする遺伝子のプロモーターにより、ヒトインスリン受容体をカイコの全身で発現させることができる。 Furthermore, a transgenic silkworm having a gene encoding the transcription factor GAL4 downstream of the promoter of the gene encoding cytoplasmic actin protein, and a gene encoding the human insulin receptor downstream of UAS which is the target promoter of GAL4. Transgenic silkworms produced by crossing transgenic silkworms having them can express human insulin receptors throughout the body of silkworms by the promoter of a gene encoding cytoplasmic actin protein.

本発明のトランスジェニックカイコは、以下の利点を有するものである。
（１）カイコ自体の入手が容易である。
（２）カイコを飼育する方法が既に確立されており、更に飼育に利便性がある。
（３）ヒト等の哺乳動物の内臓・器官と類似する性質が、これまでの研究で、ある程度分かっている。
（４）遺伝系統が確立されており、遺伝的均一性の維持ができている。
（５）比較的大型で、動きが緩慢であり、実質上無毛なので、定量的に注射できる等、薬物の投与が容易である。
（６）脂肪体を有しており、脂肪体を取り出して、含有する物質の定量が可能である。
（７）マウス、ラット等に比べると安価で、狭いスペースで多数この個体を飼育でき、倫理的な問題も少ないため、スクリーニング的な評価を行うことが容易である。
（８）被験物質が少量しかない場合でも評価を行うことができる。
（９）齢を揃える等、同じ状態の個体を揃えることが容易である。
（１０）体液を採取して、糖、脂質、酵素等の成分を解析することが可能である。 The transgenic silkworm of the present invention has the following advantages.
(1) It is easy to obtain silkworms themselves.
(2) A method for rearing silkworms has already been established, and it is convenient for rearing.
(3) Properties similar to the internal organs and organs of mammals such as humans have been known to some extent in previous studies.
(4) Genetic lines have been established and genetic homogeneity has been maintained.
(5) Since it is relatively large, slowly moving, and substantially hairless, it is easy to administer drugs, such as being able to inject quantitatively.
(6) Having fat bodies, the fat bodies can be taken out and the contained substances can be quantified.
(7) It is cheaper than mice, rats, etc., and many individuals can be bred in a small space, and there are few ethical problems, so it is easy to perform screening evaluation.
(8) Evaluation can be performed even when there is only a small amount of the test substance.
(9) It is easy to align individuals in the same state, such as aligning ages.
(10) It is possible to collect body fluids and analyze components such as sugars, lipids and enzymes.

本発明のトランスジェニックカイコの作製方法は、特に限定されないが、転写制御因子であるＧＡＬ４をコードする遺伝子と、その標的プロモーターであるＵＡＳ配列の下流にヒトインスリン受容体遺伝子を組み込んだ融合遺伝子とを導入する方法が好ましく、例えば、転写制御因子ＧＡＬ４をコードする遺伝子が導入されたトランスジェニックカイコと、ＵＡＳの下流にヒトインスリン受容体遺伝子が導入されたトランスジェニックカイコとを交配させる方法が好ましい。
更には、細胞質アクチンタンパク質をコードする遺伝子のプロモーターの下流に転写因子ＧＡＬ４をコードする遺伝子を有するトランスジェニックカイコと、ＧＡＬ４の標的プロモーターであるＵＡＳの下流に、ヒトインスリン受容体をコードする遺伝子（以下、「ヒトインスリン受容体遺伝子」と略記する場合がある）を有するトランスジェニックカイコを交配させる方法が好ましい。
ＧＡＬ４／ＵＡＳ発現システムを用いることにより、目的とする遺伝子の発現部位や時期、量を正確に制御できるという利点がある。 The method for producing the transgenic silkworm of the present invention is not particularly limited, but comprises a gene encoding GAL4, which is a transcriptional regulatory factor, and a fusion gene incorporating a human insulin receptor gene downstream of its target promoter, UAS sequence. For example, a method in which a transgenic silkworm into which a gene encoding the transcriptional regulatory factor GAL4 has been introduced and a transgenic silkworm into which a human insulin receptor gene has been introduced downstream of UAS is preferably crossed.
Furthermore, a transgenic silkworm having a gene encoding the transcription factor GAL4 downstream of the promoter of the gene encoding cytoplasmic actin protein, and a gene encoding a human insulin receptor (hereinafter referred to as UAL, which is the target promoter of GAL4). And a method of mating transgenic silkworms having a “human insulin receptor gene” in some cases.
By using the GAL4 / UAS expression system, there is an advantage that the expression site, timing and amount of the target gene can be accurately controlled.

細胞質アクチンタンパク質をコードする遺伝子のプロモーターの下流に、転写因子ＧＡＬ４をコードする遺伝子を有するトランスジェニックカイコは、例えば、細胞質アクチンタンパク質をコードする遺伝子のプロモーターの下流に転写因子ＧＡＬ４をコードする遺伝子をカイコ卵に導入することにより得ることができる。細胞質アクチンタンパク質をコードする遺伝子のプロモーターとして、例えば、アクチン遺伝子のＡ３プロモーターを用いることができる。 A transgenic silkworm having a gene encoding the transcription factor GAL4 downstream of the promoter of the gene encoding cytoplasmic actin protein is, for example, a gene encoding the transcription factor GAL4 downstream of the promoter of the gene encoding cytoplasmic actin protein. It can be obtained by introducing into an egg. As the promoter of the gene encoding cytoplasmic actin protein, for example, the A3 promoter of the actin gene can be used.

ＧＡＬ４をコードする遺伝子が導入されたトランスジェニックカイコは、例えばTomita M，Munetsuna H，Sato T，Adachi T，Hino R，Hayashi M，Shimizu K，Nakamura N，Tamura T，Yoshizato K．Nat Biotechnol．2003 Jan;21(1):52-6.（非特許文献８）に開示されているトランスジェニック技術により作製できる。
眼特異的に赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）を発現するベクター（ｅｆｆｅｃｔｏｒｖｅｃｔｏｒ）中のＡｃｔｉｎ（アクチン）のＡ３プロモーターをＧＡＬ４遺伝子の上流に組み込んだＡ３−ＧＡＬ４（Ｒ）の作製方法は、例えば、Imamura M et al.，2003．Genetics 165:1329-1340やUchino K．et al.，2006 Journal of Insect Biotechnology and Sericology 75:89-97を参照することができる。Ａ３プロモーターにより、ＧＡＬ４をカイコの全身で発現させることができる。 Transgenic silkworms into which a gene encoding GAL4 has been introduced include, for example, Tomita M, Munetsuna H, Sato T, Adachi T, Hino R, Hayashi M, Shimizu K, Nakamura N, Tamura T, Yoshizato K. et al. Nat Biotechnol. 2003 Jan; 21 (1): 52-6. (Non-Patent Document 8).
A method for producing A3-GAL4 (R) in which the A3 promoter of Actin (actin) in a vector (effector vector) that expresses red fluorescent protein (DsRed) specifically in the eye is incorporated upstream of the GAL4 gene is, for example, Imamura M et al., 2003. Genetics 165: 1329-1340 and Uchino K. et al., 2006 Journal of Insect Biotechnology and Sericology 75: 89-97. With the A3 promoter, GAL4 can be expressed throughout the silkworm.

ＧＡＬ４の標的プロモーターであるＵＡＳの下流に、ヒトインスリン受容体遺伝子を有するトランスジェニックカイコは、例えば、ＵＡＳプロモーターの下流にヒトインスリン受容体遺伝子を組み込んだベクターを、カイコ卵にマイクロインジェクションにより導入することにより得ることができる。ベクターとして、ｐｉｇｇｙＢａｃ等のトランスポゾンを用いることが好ましい。 For example, a transgenic silkworm having a human insulin receptor gene downstream of UAS, which is the target promoter of GAL4, introduces a vector incorporating a human insulin receptor gene downstream of the UAS promoter into a silkworm egg by microinjection. Can be obtained. It is preferable to use a transposon such as piggyBac as the vector.

遺伝子の発現を確認するために、ＧＦＰ、ＤｓＲｅｄ等の蛍光タンパク質をコードする遺伝子と同時に組み込んでもよい。蛍光タンパク質を用いることにより、蛍光顕微鏡で観察することにより目的遺伝子の発現確認を容易にすることができる。また、複数の蛍光タンパク質を同時に用いることができる。
例えば、３×Ｐ３プロモーターの下流に緑色蛍光タンパク質であるＧＦＰをコードする遺伝子が組み込まれたベクター中のＵＡＳプロモーターの下流にヒトインスリン受容体遺伝子を組み込んだベクターをカイコに導入する。３×Ｐ３プロモーターは複眼や神経系で機能する。また、３×Ｐ３プロモーターの下流に赤色蛍光タンパク質であるＤｓＲｅｄを発現するベクター中のアクチン（Ａｃｔｉｎ）のＡ３プロモーターをＧＡＬ４遺伝子の上流に組み込んだベクターを別のカイコに導入する。これらのカイコを交配し、蛍光顕微鏡により、カイコの眼でＧＦＰ及びＤｓＲｅｄの両者の発現が確認できれば、ＧＡＬ４遺伝子及びヒトインスリン受容体遺伝子の両方の遺伝子座を有するカイコを選抜することができる。 In order to confirm gene expression, it may be incorporated simultaneously with a gene encoding a fluorescent protein such as GFP or DsRed. By using a fluorescent protein, the expression of the target gene can be easily confirmed by observing with a fluorescent microscope. A plurality of fluorescent proteins can be used simultaneously.
For example, a vector in which a human insulin receptor gene is incorporated downstream of the UAS promoter in a vector in which a gene encoding GFP, which is a green fluorescent protein, is incorporated downstream of the 3 × P3 promoter is introduced into silkworms. The 3 × P3 promoter functions in the compound eye and nervous system. In addition, a vector in which the A3 promoter of actin (Actin) in a vector expressing DsRed, which is a red fluorescent protein, is introduced downstream of the 3 × P3 promoter into another silkworm. If these silkworms are crossed and the expression of both GFP and DsRed can be confirmed in the silkworm eyes by a fluorescence microscope, silkworms having both the GAL4 gene and human insulin receptor gene loci can be selected.

［トランスジェニックカイコを用いる薬効評価方法］
上記により得られた本発明のトランスジェニックカイコを用い、ヒトインスリン受容体に作用するアゴニスト又はアンタゴニストの薬効を評価する方法であって、
（Ａ）トランスジェニックカイコに上記アゴニスト又はアンタゴニストを投与する工程、
（Ｂ）上記アゴニスト又はアンタゴニストが投与されたトランスジェニックカイコの脂肪体又は血液中の糖の濃度を測定する工程、
を有することを特徴とする方法を提供することができる。 [Method for evaluating drug efficacy using transgenic silkworm]
Using the transgenic silkworm of the present invention obtained as described above, a method for evaluating the efficacy of an agonist or antagonist acting on a human insulin receptor,
(A) a step of administering the agonist or antagonist to a transgenic silkworm,
(B) a step of measuring a sugar concentration in a fat body or blood of a transgenic silkworm to which the agonist or antagonist is administered,
The method characterized by having can be provided.

上記薬効評価方法は、必要に応じて更にその他の工程を含んでいてもよい。以下、工程（Ａ）、（Ｂ）について順に説明する。 The above drug efficacy evaluation method may further include other steps as necessary. Hereinafter, steps (A) and (B) will be described in order.

＜工程（Ａ）＞
工程（Ａ）においては、まず、本発明のトランスジェニックカイコにヒトインスリン受容体に作用するアゴニスト又はアンタゴニストを投与する。
ヒトインスリン受容体に作用するアゴニスト（以下、単に「アゴニスト」と略記する場合がある）とは、ヒトインスリン受容体と結合してその情報を細胞の内部に伝達する情報物質のことである。ヒトインスリン受容体に作用するアンタゴニスト（以下、単に「アンタゴニスト」と略記する場合がある）とは、ヒトインスリン受容体には結合するが、その情報をできない（アゴニストとヒトインスリン受容体との結合を阻害する）物質のことである。
ヒトインスリン受容体に作用するアゴニストの例として、ウシインスリンが挙げられる。 <Process (A)>
In step (A), first, an agonist or antagonist that acts on the human insulin receptor is administered to the transgenic silkworm of the present invention.
An agonist that acts on the human insulin receptor (hereinafter sometimes simply referred to as “agonist”) is an information substance that binds to the human insulin receptor and transmits the information to the inside of the cell. An antagonist that acts on the human insulin receptor (hereinafter sometimes simply referred to as “antagonist”) binds to the human insulin receptor, but cannot provide information (the binding between the agonist and the human insulin receptor). It is a substance that inhibits).
An example of an agonist that acts on the human insulin receptor is bovine insulin.

上記アゴニスト又はアンタゴニストの投与の方法としては、特に制限はなく目的に応じて適宜選択することができる。具体的には、例えば、血液中への注射、飼料（餌）への添加等による経口摂取、腸内への注入等が挙げられる。簡便である点、ヒトの臨床との対応という点で、腸管内部への注射、経口摂取が好ましい。 There is no restriction | limiting in particular as the administration method of the said agonist or antagonist, According to the objective, it can select suitably. Specifically, for example, injection into blood, oral intake by addition to feed (food), injection into the intestine, and the like can be mentioned. In terms of simplicity and compatibility with human clinical practice, injection into the intestinal tract and oral ingestion are preferred.

被検物質の投与量としては特に制限はなく、投与する物質、投与方法等に応じて適宜選択することができる。また、ヒトでの体重当たりの投与量を、投与するトランスジェニックカイコの重さに換算して投与することも好ましい。また、その換算値に所定の倍率を乗じた量を投与することも好ましい。また、アゴニスト又はアンタゴニストは、生理食塩水、水等で希釈して投与させることも好ましい。
投与期間は、特に限定はないが、１回に全量投与、あるいは継続的な投与が簡便性の点で好ましい。 There is no restriction | limiting in particular as a dose of a to-be-tested substance, According to the substance to administer, administration method, etc., it can select suitably. It is also preferable to administer the dose per body weight in humans in terms of the weight of the transgenic silkworm to be administered. It is also preferable to administer an amount obtained by multiplying the converted value by a predetermined magnification. The agonist or antagonist is also preferably diluted with physiological saline, water or the like for administration.
The administration period is not particularly limited, but it is preferable to administer the entire amount at a time or continuous administration from the viewpoint of simplicity.

＜工程（Ｂ）＞
工程（Ｂ）では、上記工程（ａ）で得られた「アゴニスト又はアンタゴニストが投与されたトランスジェニックカイコ」の脂肪体又は血液中の糖の濃度を測定する。測定試料の採取方法は脂肪体に関しては、解剖して採取することが好ましく、血液に関しては、切り傷を付けてそこから採取する方法が好ましい。 <Process (B)>
In the step (B), the sugar concentration in the fat body or blood of the “transgenic silkworm administered with the agonist or antagonist” obtained in the step (a) is measured. As for the method of collecting the measurement sample, it is preferable to dissect and collect the fat body, and for blood, the method of collecting from a cut is preferable.

糖の濃度の測定方法としては、糖の定量方法は特に限定はないが、例えば、全ての糖類の定量にはフェノール硫酸法、アンスロン硫酸法、カルバゾール硫酸法等；グルコースの定量にはグルコースオキシダーゼ法等が挙げられる。脂肪体中又は血液中の糖の濃度の測定をする時期については特に限定はなく、例えば、アゴニスト又はアンタゴニストが投与された時点から１分〜１日が好ましく、３０分〜１０時間が特に好ましい。 The method for measuring the sugar concentration is not particularly limited, but for example, the phenol sulfate method, the anthrone sulfate method, the carbazole sulfate method, etc. are used for the determination of all sugars; the glucose oxidase method is used for the glucose determination. Etc. There is no particular limitation on the time when the sugar concentration in the fat body or blood is measured. For example, it is preferably 1 minute to 1 day from the time of administration of the agonist or antagonist, and particularly preferably 30 minutes to 10 hours.

糖の濃度の測定に際しては、アゴニスト又はアンタゴニストを投与していない、「同様に脂肪体中又は血液中の糖濃度を上昇させたトランスジェニックカイコ」を対照として用いることが好ましい。対照には、例えば、生理食塩水を同量だけを投与することが好ましい。対照に比較して、アゴニスト又はアンタゴニストを投与したもので、糖の濃度がどれくらい変化したかによって、アゴニスト又はアンタゴニストの薬効を評価する。 In the measurement of the sugar concentration, it is preferable to use “transgenic silkworm with an increased sugar concentration in the fat body or blood” which is not administered with an agonist or antagonist as a control. For the control, for example, it is preferable to administer only the same amount of physiological saline. Compared with the control, the agonist or antagonist is administered, and the efficacy of the agonist or antagonist is evaluated by how much the sugar concentration has changed.

［トランスジェニックカイコを用いる血糖降下物質の評価方法］
上記により得られた本発明のトランスジェニックカイコを用い、被検物質がヒトの血糖値を降下させる物質であるか否かを評価する方法であって、
（ａ）トランスジェニックカイコに上記被検物質を投与する工程、
（ｂ）上記被検物質が投与されたトランスジェニックカイコの脂肪体中又は血液中の糖の濃度を測定する工程、
を有することを特徴とする方法を提供することができる。 [Method for evaluating hypoglycemic substance using transgenic silkworm]
Using the transgenic silkworm of the present invention obtained as described above, it is a method for evaluating whether a test substance is a substance that lowers human blood glucose level,
(A) administering the test substance to the transgenic silkworm,
(B) a step of measuring a sugar concentration in a fat body or blood of a transgenic silkworm to which the test substance is administered,
The method characterized by having can be provided.

上記評価方法は、必要に応じて更にその他の工程を含んでいてもよい。以下、工程（ａ）、（ｂ）について順に説明する。 The evaluation method may further include other steps as necessary. Hereinafter, steps (a) and (b) will be described in order.

＜工程（ａ）＞
工程（ａ）では、本発明のトランスジェニックカイコに対して被検物質を投与する。 <Process (a)>
In step (a), a test substance is administered to the transgenic silkworm of the present invention.

被検物質を投与する方法としては、特に制限はなく目的に応じて適宜選択することができる。具体的には、例えば、血液中への注射、飼料（餌）への添加等による経口摂取、腸内への注入等が挙げられる。簡便である点、ヒトの臨床との対応という点で、腸管内部への注射、経口摂取が好ましい。 There is no restriction | limiting in particular as a method of administering a test substance, According to the objective, it can select suitably. Specifically, for example, injection into blood, oral intake by addition to feed (food), injection into the intestine, and the like can be mentioned. In terms of simplicity and compatibility with human clinical practice, injection into the intestinal tract and oral ingestion are preferred.

被検物質の投与量としては特に制限はなく、投与する物質、投与方法等に応じて適宜選択することができる。また、ヒトでの体重当たりの投与量を、投与するトランスジェニックカイコの重さに換算して投与することも好ましい。また、その換算値に所定の倍率を乗じた量を投与することも好ましい。また、被検物質は、生理食塩水、水等で希釈して投与させることも好ましい。
投与期間は、特に限定はないが、１回に全量投与、あるいは継続的な投与が簡便性の点で好ましい。 There is no restriction | limiting in particular as a dose of a to-be-tested substance, According to the substance to administer, administration method, etc., it can select suitably. It is also preferable to administer the dose per body weight in humans in terms of the weight of the transgenic silkworm to be administered. It is also preferable to administer an amount obtained by multiplying the converted value by a predetermined magnification. It is also preferable to administer the test substance diluted with physiological saline, water or the like.
The administration period is not particularly limited, but it is preferable to administer the entire amount at a time or continuous administration from the viewpoint of simplicity.

＜工程（ｂ）＞
工程（ｂ）では、上記工程（ａ）で、被検物質が投与されたトランスジェニックカイコの脂肪体中又は血液中の糖の濃度を測定する。測定試料の採取方法は脂肪体に関しては、解剖して採取することが好ましく、血液に関しては、切り傷を付けてそこから採取する方法が好ましい。 <Step (b)>
In the step (b), the sugar concentration in the fat body or blood of the transgenic silkworm to which the test substance is administered in the step (a) is measured. As for the method of collecting the measurement sample, it is preferable to dissect and collect the fat body, and for blood, the method of collecting from a cut is preferable.

糖の濃度の測定方法としては、糖の定量方法は特に限定はないが、例えば、全ての糖類の定量にはフェノール硫酸法、アンスロン硫酸法、カルバゾール硫酸法等；グルコースの定量にはグルコースオキシダーゼ法等が挙げられる。脂肪体中又は血液中の糖の濃度の測定をする時期については特に限定はなく、工程（ａ）において被検物質が投与された直後から、被検物質による糖の濃度の減少の効果が見られなくなるまでの期間から選択すればよい。具体的には、例えば、被検物質が投与された時点から１分〜１日が好ましく、３０分〜１０時間が特に好ましい。 The method for measuring the sugar concentration is not particularly limited, but for example, the phenol sulfate method, the anthrone sulfate method, the carbazole sulfate method, etc. are used for the determination of all sugars; the glucose oxidase method is used for the glucose determination. Etc. There is no particular limitation on the time when the sugar concentration in the fat body or blood is measured, and the effect of reducing the sugar concentration by the test substance is observed immediately after the test substance is administered in step (a). What is necessary is just to select from the period until it becomes impossible. Specifically, for example, 1 minute to 1 day is preferable from the time when the test substance is administered, and 30 minutes to 10 hours is particularly preferable.

糖の濃度の測定に際しては、被検物質を投与していない、「同様に脂肪体中又は血液中の糖濃度を上昇させたトランスジェニックカイコ」を対照として用いることが好ましい。対照には、例えば、生理食塩水を同量だけを投与することが好ましい。対照に比較して、被検物質を投与したもので、糖の濃度がどれくらい減少していたかによって、被検物質を評価する。 In measuring the sugar concentration, it is preferable to use “transgenic silkworm with a similarly increased sugar concentration in fat body or blood” not administered with a test substance as a control. For the control, for example, it is preferable to administer only the same amount of physiological saline. The test substance is evaluated according to how much the sugar concentration is decreased in the test substance administered compared to the control.

［トランスジェニックカイコを用いるスクリーニング方法］
上記により得られた本発明のトランスジェニックカイコを用い、ヒトの血糖値を降下させる物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）上記トランスジェニックカイコに被検物質を投与する工程、
（ｂ）上記被検物質が投与されたトランスジェニックカイコの脂肪体中又は血液中の糖の濃度を測定する工程、
（ｃ）上記被検物質の中から、該トランスジェニックカイコの脂肪体中又は血液中の糖の濃度を低下させる物質を選択する工程、
を有することを特徴とする方法を提供することができる。 [Screening method using transgenic silkworm]
Using the transgenic silkworm of the present invention obtained as described above, a method for screening a substance that lowers human blood glucose level,
(A) administering a test substance to the transgenic silkworm,
(B) a step of measuring a sugar concentration in a fat body or blood of a transgenic silkworm to which the test substance is administered,
(C) a step of selecting a substance that lowers the sugar concentration in the fat body or blood of the transgenic silkworm, from the test substance,
The method characterized by having can be provided.

上記スクリーニング方法は、必要に応じて更にその他の工程を含んでいてもよい。工程（ａ）及び（ｂ）については、上記評価方法と同様である。 The screening method may further include other steps as necessary. About process (a) and (b), it is the same as that of the said evaluation method.

＜工程（ｃ）＞
工程（ｃ）において、上記工程（ａ）及び（ｂ）によって使用された被検物質の中から、該トランスジェニックカイコの脂肪体中又は血液中の糖の濃度を低下させる物質を選択する。対照に比較して、被検物質を投与したもので、糖の濃度がどれくらいまでに減少した場合に有意差と判定してその被検物質を選択するかについては、用いたトランスジェニックカイコの数にも依存し特に限定はないが、通常、対照の糖の濃度の９５％以下〜８０％以下である。 <Step (c)>
In step (c), a substance that lowers the sugar concentration in the fat body or blood of the transgenic silkworm is selected from the test substances used in steps (a) and (b). The number of transgenic silkworms used to determine whether the test substance was selected as a significant difference when the sugar concentration was reduced compared to the control. Although there is no particular limitation, it is usually 95% or less to 80% or less of the concentration of the control sugar.

１条件に用いるトランスジェニックカイコの数については特に限定はないが、１個〜２００個が好ましく、２個〜５０個が好ましく、３個〜１０個が特に好ましい。この範囲であると、薬学的にも統計学的にも正しい選択が可能である。 The number of transgenic silkworms used in one condition is not particularly limited, but preferably 1 to 200, more preferably 2 to 50, and particularly preferably 3 to 10. Within this range, pharmacologically and statistically correct selection is possible.

上記スクリーニング方法によって、コスト的に有利に、倫理的にも問題がない方法で、糖尿病治療薬等の「ヒトの血糖値を降下させる物質」のスクリーニングが可能である。 According to the above screening method, it is possible to screen for “substances that lower blood glucose levels in humans” such as antidiabetic drugs, in a cost-effective manner and with no ethical problem.

培養細胞系を用いた方法は、ヒトの血糖値を降下させる物質の開発手法として一般的に行われている。
しかしながら、一般に、培養細胞系で効果を示す殆どの物質は、動物個体では血糖降下作用を示さない。その理由は、培養細胞系では、動物個体内における薬物動態を反映できないためである。
そのため、前記方法には、培養細胞系ではなく、動物個体を用いることが必須である。 A method using a cultured cell system is generally performed as a method for developing a substance that lowers blood glucose level in humans.
However, in general, most substances that are effective in cultured cell lines do not exhibit hypoglycemic activity in animal individuals. The reason is that the cultured cell system cannot reflect the pharmacokinetics in the animal individual.
For this reason, it is essential to use an animal individual, not a cultured cell system, in the method.

本発明の方法（薬効を評価する方法、被検物質がヒトの血糖値を降下させる物質や薬剤であるか否かを評価する方法、該物質・薬剤をスクリーニングする方法、該薬剤を製造する方法）は、カイコを用いて行うことに特徴があり、それによって前記顕著な効果を奏するものである。
本発明の方法は、動物個体として、ヒトに近い哺乳動物等ではなく、カイコを用いた場合であっても、上記方法が可能である、すなわち「ヒトの血糖値を降下させる物質」の評価やスクリーニング等が可能であることを見出してなされたものである。
従って、ヒトインスリン受容体を発現したトランスジェニックマウス等の哺乳類に属する実験動物・動物個体、又は、脊椎動物等のヒトに近い実験動物・動物個体で、上記方法が可能であったとしても、それをカイコに転用して、本発明の方法を見出すことはできない。 Method of the present invention (method for evaluating drug efficacy, method for evaluating whether a test substance is a substance or drug that lowers blood glucose level in humans, method for screening the substance / drug, method for producing the drug ) Is characterized in that it is performed using silkworms, thereby producing the remarkable effect.
The method of the present invention allows the above method to be used even when a silkworm is used as an animal individual, not a mammal close to a human or the like, that is, an evaluation of “a substance that lowers blood glucose levels in humans” It has been made by finding that screening and the like are possible.
Accordingly, even if the above method is possible for laboratory animals / animals belonging to mammals such as transgenic mice expressing human insulin receptor, or laboratory animals / animals close to humans such as vertebrates, Cannot be converted into silkworms to find the method of the present invention.

［トランスジェニックカイコを用いる薬剤製造方法］
上記により得られた本発明のトランスジェニックカイコを用い、ヒトの血糖値を降下させる薬剤を製造する方法であって、
（ａ）上記トランスジェニックカイコに被検物質を投与する工程、
（ｂ）上記被検物質が投与されたトランスジェニックカイコの脂肪体中又は血液中の糖の濃度を測定する工程、
（ｃ）上記被検物質の中から、該トランスジェニックカイコの脂肪体中又は血液中の糖の濃度を低下させる物質を選択する工程、
（ｄ）上記工程（ｃ）で選択された物質と製薬上許容される担体を混合する工程、
を有することを特徴とする方法を提供することができる。 [Drug production method using transgenic silkworm]
Using the transgenic silkworm of the present invention obtained as described above, a method for producing a drug that lowers human blood glucose level,
(A) administering a test substance to the transgenic silkworm,
(B) a step of measuring a sugar concentration in a fat body or blood of a transgenic silkworm to which the test substance is administered,
(C) a step of selecting a substance that lowers the sugar concentration in the fat body or blood of the transgenic silkworm, from the test substance,
(D) mixing the substance selected in step (c) with a pharmaceutically acceptable carrier;
The method characterized by having can be provided.

上記薬剤製造方法は、必要に応じて更にその他の工程を含んでいてもよい。工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）については、上記スクリーニング方法と同様である。 The said chemical | medical agent manufacturing method may include the other process further as needed. Steps (a), (b) and (c) are the same as in the above screening method.

＜工程（ｄ）＞
工程（ｄ）は、上記工程（ｃ）で選択された物質と製薬上許容される担体とを混合する工程である。 <Step (d)>
Step (d) is a step of mixing the substance selected in step (c) and a pharmaceutically acceptable carrier.

本発明の、評価する方法、スクリーニングする方法によって見出された「ヒトの血糖値を降下させる物質」は、それを含有させて薬剤が製造される。該薬剤の剤型については特に限定はないが、経口投与のための製剤としては、錠剤、丸剤、顆粒剤、カプセル剤、散剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤、舌下剤等が挙げられ、また、非経口投与のための製剤としては、注射剤、経皮吸収剤、吸入剤、坐剤等が挙げられる。 The “substance that lowers the blood glucose level of humans” found by the method of evaluating and screening of the present invention is used to produce a drug. There are no particular limitations on the dosage form of the drug, but preparations for oral administration include tablets, pills, granules, capsules, powders, solutions, suspensions, syrups, sublinguals, etc. Examples of the preparation for parenteral administration include injections, transdermal absorption agents, inhalants, suppositories and the like.

製剤化に際しては、製薬上許容される担体を混合することが可能である。担体の種類及び組成は、投与経路や投与方法によって適宜決定することができる。例えば、液状担体としては、水、アルコール、食用油等を用いることができる。固体担体としては、リジン等のアミノ酸類、シクロデキストリン等の多糖類、ステアリン酸マグネシウム等の有機酸塩類、ヒドロキシルプロピルセルロース等のセルロース誘導体等を用いることができる。 In formulating, a pharmaceutically acceptable carrier can be mixed. The type and composition of the carrier can be appropriately determined depending on the administration route and administration method. For example, water, alcohol, edible oil, or the like can be used as the liquid carrier. As the solid carrier, amino acids such as lysine, polysaccharides such as cyclodextrin, organic acid salts such as magnesium stearate, cellulose derivatives such as hydroxylpropylcellulose, and the like can be used.

上記工程（ｃ）で選択された物質には、更に、等張化剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解補助剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、希釈剤、緩衝剤、着色剤、着香剤等の各種医薬用添加剤を配合することができる。注射剤の場合には適当な担体と共に滅菌処理を行なって薬剤とする。 The substances selected in step (c) further include isotonic agents, preservatives, wetting agents, emulsifiers, dispersants, stabilizers, solubilizers, excipients, binders, disintegrants, dilutions. Various pharmaceutical additives such as an agent, a buffer, a coloring agent, and a flavoring agent can be blended. In the case of injections, sterilization is performed together with a suitable carrier to obtain a drug.

［作用］
本発明において、糖の濃度を低下させる物質が、ヒト等の哺乳類と共通していることによって、ヒトの血糖値を降下させる物質が、評価、スクリーニングできる作用・原理は明らかではなく、また、本発明は、かかる作用・原理の範囲に限定されるわけではないが、以下のことが考えられる。
すなわち、カイコは血糖値の恒常性を維持する機構を有しており、筋肉及びヒトの肝臓に相当する脂肪体に糖を貯蔵でき、また、インスリン様ペプチドホルモンであるボンビキシンを有しており、ボンビキシンの下流には、ヒトの場合と同様なＭＡＰＫシグナル伝達経路を含むインスリンシグナル伝達経路が存在する。また、組み換え型ヒトインスリンがＰＩ３キナーゼの活性化を介して、カイコの脂肪体の糖の取り込みを亢進させる作用を有する。すなわち、カイコにはヒトの血糖調節機構と同様な機構があるために、本発明の前記効果が表れたと考えられる。 [Action]
In the present invention, since the substance that lowers the sugar concentration is common with mammals such as humans, the action and principle that a substance that lowers human blood glucose level can be evaluated and screened is not clear. Although the invention is not limited to the scope of such action and principle, the following can be considered.
That is, silkworms have a mechanism for maintaining homeostasis of blood sugar levels, can store sugar in fat bodies corresponding to muscles and human liver, and have bombyxin, which is an insulin-like peptide hormone, Downstream of bombyxin is an insulin signaling pathway including the MAPK signaling pathway similar to that in humans. In addition, recombinant human insulin has an action of enhancing the uptake of sugar in the fat body of silkworm through the activation of PI3 kinase. That is, since the silkworm has a mechanism similar to that of human blood glucose control, it is considered that the effect of the present invention was exhibited.

以下、実施例及び試験例に基づき本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例等の具体的範囲に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated further in detail based on an Example and a test example, this invention is not limited to specific ranges, such as a following example.

＜ヒトインスリン受容体のクローニング＞
ヒトインスリン受容体の全長ｃＤＮＡを含むベクターＤＮＡであるｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯ（ＯｐｅｎＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、フナコシＩＭＡＧＥクローンより購入）に対して制限酵素ＸｂａＩの切断配列をもつプライマーセット（ｆｏｒｗａｒｄｐｒｉｍｅｒ；5’-tctagaatgggcaccgggggccggcggggg-3’（配列番号１）、ｒｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒ；5’-tctagattaggaaggattggaccgaggcaa-3’（配列番号２））を用いてＰＣＲ反応を行い、ＸｂａＩ切断部位を末端にもつヒトインスリン受容体遺伝子配列を作製した。 <Cloning of human insulin receptor>
Primer set (forward primer; 5'-tctagaatgggcaccgggggccggcggggg) with a restriction enzyme XbaI cleavage sequence against pCR-XL-TOPO (purchased from Open Biosystems, Funakoshi IMAGE clone) which is a vector DNA containing the full-length cDNA of human insulin receptor -3 ′ (SEQ ID NO: 1), reverse primer; 5′-tctagattaggaaggattggaccgaggcaa-3 ′ (SEQ ID NO: 2)) was used to prepare a human insulin receptor gene sequence having an XbaI cleavage site at the end.

このＰＣＲ産物を、マルチクローニングサイトを有するベクターＤＮＡであるｐＺＥｒＯ−２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に対してライゲーションし、ヒトインスリン受容体遺伝子配列を有するベクターを作製した。コンピテント大腸菌にトランスフォーメーションして、プレート上で一晩・３７℃で培養後、薬剤耐性及びアガロースゲル電気泳動の泳動像を指標として増幅させた挿入配列をもつベクターｐＺＥｒＯ−２−ｈＩＲを取得した。そして、挿入されたヒトインスリン受容体遺伝子配列を含む部位の配列を、各種プライマー（配列番号３〜１２）を用いて解析した。 This PCR product was ligated to pZErO-2 (Invitrogen), which is a vector DNA having a multiple cloning site, to prepare a vector having a human insulin receptor gene sequence. After transformation into competent E. coli and culturing on a plate overnight at 37 ° C., a vector pZErO-2-hIR having an insertion sequence amplified using drug electrophoresis and an agarose gel electrophoresis migration image as an index was obtained. . And the arrangement | sequence of the site | part containing the inserted human insulin receptor gene sequence was analyzed using various primers (sequence number 3-12).

一方、ｕｐｓｔｒｅａｍａｃｔｉｖａｔｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅ（ｕａｓ）遺伝子とｇｆｐ遺伝子が組み込まれたベクターｐＢａｃＭＣＳ［ＵＡＳ−ＳＶ４０、３ｘＰ３−ｅｇｆｐ］を制限酵素ＢｌｎＩ（Ｔａｋａｒａ，Ｊａｐａｎ）で消化した後、脱リン酸化処理を実施した。同時に、上記で作出したヒトインスリン受容体遺伝子配列を含むベクターｐＺＥｒＯ−２−ｈＩＲを制限酵素ＸｂａＩ（Ｔａｋａｒａ，Ｊａｐａｎ）で消化した。
ＢｌｎＩ消化済ｐＢａｃＭＣＳ［ＵＡＳ−ＳＶ４０、３ｘＰ３−ｅｇｆｐ］とＸｂａＩ消化済ヒトインスリン受容体遺伝子配列をライゲーションした後、コンピテント大腸菌にトランスフォーメーションした。プレート上で一晩・３７℃で培養後、薬剤耐性及びアガロースゲル電気泳動の泳動像を指標として目的のベクターｐＢａｃ−ＵＡＳ−ｈＩＲ．ＳＶ４０−３ｘＰ３ＧＦＰを作出した。
なお、当該ベクターのヒトインスリン受容体遺伝子を含む部位の配列を上記と同様に解析し、正しい配列を有する完全長ヒトインスリン受容体遺伝子が組み込まれていることを確認した。 On the other hand, the vector pBacMCS [UAS-SV40, 3xP3-egfp] in which the upstream activating sequence (uas) gene and the gfp gene were incorporated was digested with the restriction enzyme BlnI (Takara, Japan) and then dephosphorylated. At the same time, the vector pZErO-2-hIR containing the human insulin receptor gene sequence produced above was digested with the restriction enzyme XbaI (Takara, Japan).
BlnI digested pBacMCS [UAS-SV40, 3xP3-egfp] and XbaI digested human insulin receptor gene sequence were ligated and then transformed into competent E. coli. After culturing overnight at 37 ° C. on a plate, the target vector pBac-UAS-hIR. SV40-3xP3GFP was created.
The sequence of the site containing the human insulin receptor gene in the vector was analyzed in the same manner as described above, and it was confirmed that a full-length human insulin receptor gene having the correct sequence was incorporated.

＜トランスジェニックカイコの作製＞
カイコ（ｐｎｄ−ｗ１）の卵に対して、上記で作製したベクターｐＢａｃ−ＵＡＳ−ｈＩＲ．ＳＶ４０−３ｘＰ３ＧＦＰをマイクロインジェクトして、ＵＡＳプロモーターに応答してヒトインスリン受容体を発現するカイコ（ＵＡＳ−ｈＩＲ（Ｇ））を構築した。このベクターは、カイコの複眼において特異的に発現する遺伝子のプロモーター配列３ｘＰ３の下流にｇｆｐ遺伝子を組み込んでいることから、蛍光顕微鏡下において複眼にＧＦＰの発現を認めたカイコを遺伝子導入カイコとして選別した。
このカイコと、Ａｃｔｉｎ遺伝子のＡ３プロモーターの下流にＧＡＬ４遺伝子、複眼特異的に発現を誘導するプロモーターの下流にＤｓＲｅｄ遺伝子を組み込んだベクターｐＢａｃ−Ａ３−ＧＡＬ４−３ｘＰ３−ＤｓＲｅｄ（図１Ａ）を有するカイコ（Ａ３−ＧＡＬ４（Ｒ））(Osanai-Futahashi M．et al，Nature Commun．2012;3:1295)を交配させた。 <Production of transgenic silkworm>
For the silkworm (pnd-w1) egg, the vector pBac-UAS-hIR. SV40-3xP3GFP was microinjected to construct a silkworm (UAS-hIR (G)) that expresses the human insulin receptor in response to the UAS promoter. Since this vector incorporates the gfp gene downstream of the promoter sequence 3xP3 of a gene that is specifically expressed in the compound eyes of silkworms, silkworms that showed GFP expression in the compound eyes under a fluorescence microscope were selected as transgenic silkworms. .
A silkworm having a vector pBac-A3-GAL4-3xP3-DsRed (FIG. 1A) in which the GAL4 gene is inserted downstream of the A3 promoter of the Actin gene and the DsRed gene is inserted downstream of the promoter that specifically induces compound eye expression. A3-GAL4 (R)) (Osanai-Futahashi M. et al, Nature Commun. 2012; 3: 1295).

複眼においてＧＦＰ、及びＲＦＰの両者を発現するトランスジェニックカイコ（Ｇ／Ｒ）を蛍光顕微鏡下で選別し、ヒトインスリン受容体発現カイコを作出した。なお、当該カイコの脂肪体中においてヒトインスリン受容体が発現していることは、抗ヒトインスリン受容体抗体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）を用いたウエスタンブロット解析により確認した。 Transgenic silkworms (G / R) that express both GFP and RFP in compound eyes were selected under a fluorescence microscope to produce human insulin receptor-expressing silkworms. The expression of human insulin receptor in the silkworm fat body was confirmed by Western blot analysis using an anti-human insulin receptor antibody (Calbiochem, La Jolla, Calif.).

＜血糖降下実験＞
体液（２０μＬ）は第一腹肢（ｆｉｒｓｔｐｒｏｌｅｇ）にはさみでつけた切り傷から採取し、タンパク質を沈殿させるために９倍量の０．６Ｎ過塩素酸と混合した。３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を体液抽出液（ｈｅｍｏｌｙｍｐｈｅｘｔｒａｃｔ）とした。カイコ血液中の総糖量はフェノール硫酸法（Hodge et al）により定量した。蒸留水で適当な濃度に希釈した体液抽出液１００μＬと５％（ｗ／ｖ）フェノール水溶液１００μＬを混合し、濃硫酸５００μＬを加えて激しく撹拌し、室温で２０分間静置した後、４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。グルコース水溶液を標準糖溶液とした。 <Glucose-lowering experiment>
Body fluid (20 μL) was taken from a cut made with scissors on the first proleg and mixed with 9 volumes of 0.6 N perchloric acid to precipitate the protein. Centrifugation was performed at 3,000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was used as a body fluid extract (hemolymph extract). The total sugar content in silkworm blood was determined by the phenol sulfate method (Hodge et al). 100 μL of bodily fluid extract diluted to an appropriate concentration with distilled water and 100 μL of 5% (w / v) phenol aqueous solution were mixed, 500 μL of concentrated sulfuric acid was added, and the mixture was vigorously stirred and allowed to stand at room temperature for 20 minutes, followed by absorbance at 490 nm. Was measured. A glucose aqueous solution was used as a standard sugar solution.

＜ウエスタンブロット＞
カイコから摘出した脂肪体を、Ｉｎｓｅｃｔｓａｌｉｎｅ（１０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌｐＨ７．９、１３０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＣａＣｌ_２）で洗浄した後、ペニシリン、ストレプトマイシンを添加したＧｒａｃｅ’ｓｍｅｄｉｕｍ２００μＬ中で２７℃において馴染ませた。ワートマニン（ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ）を用いた実験においては、同時に培地中にワートマニンを加えた。
３０分間の前培養の後、培地にインスリン（３ｍｇ／ｍＬ）を５０μＬ添加し、２７℃で２時間培養した。 <Western blot>
A fat body excised from a silkworm was washed with Insect saline (10 mM Tris / HCl pH 7.9, 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl ₂ ), and then at 27 ° C. in Grace's medium 200 μL supplemented with penicillin and streptomycin. I got used to it. In an experiment using wortmannin, wortmannin was added to the medium at the same time.
After 30 minutes of pre-culture, 50 μL of insulin (3 mg / mL) was added to the medium and cultured at 27 ° C. for 2 hours.

脂肪体をＩｎｓｅｃｔｓａｌｉｎｅで洗浄した後、ＮＰ−４０ｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ＝７．５）、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．５ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＤＴＴ、１％ＮＰ−４０、１０ｍＭＮａＦ、１ｍＭＮａ_３ＶＯ_４）２５０μＬの溶液と混合し、２０秒間、超音波処理した。その後、ＴＣＡ沈殿を行い、タンパク質をＳＤＳ電気泳動し、ＰＶＤＦメンブレンに移行させた。
抗Ａｋｔ抗体及び抗リン酸化Ａｋｔ抗体を用いてウエスタンブロットを行い、脂肪体のリン酸化Ａｋｔ量（リン酸化Ａｋｔ量／全Ａｋｔ量）を測定した。 After washing the fat pad with Insect sale, NP-40 lysis buffer (10 mM Tris / HCl (pH = 7.5), 150 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 1 mM DTT, 1% NP-40, 10 mM NaF, 1 mM Na ₃ VO ₄ ) mixed with 250 μL of solution and sonicated for 20 seconds. Thereafter, TCA precipitation was performed, the protein was subjected to SDS electrophoresis, and transferred to a PVDF membrane.
Western blotting was performed using an anti-Akt antibody and an anti-phosphorylated Akt antibody, and the amount of phosphorylated Akt (phosphorylated Akt amount / total Akt amount) of the fat body was measured.

実施例１
上述に示した非特許文献８（Tomita M，Munetsuna H，Sato T，Adachi T，Hino R，Hayashi M，Shimizu K，Nakamura N，Tamura T，Yoshizato K．Nat Biotechnol．2003 Jan;21(1):52-6.）に示されている、ＧＡＬ４／Ｕｐｓｒｅａｍａｃｔｉｖａｔｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＵＡＳ）ｓｙｓｔｅｍを用いてカイコに遺伝子を導入させる（トランスジェニック）技術を利用し、ヒトインスリン受容体を発現するカイコの系統の樹立を行った。
複眼において特異的に発現するプロモーター配列（３×Ｐ３プロモーター）の下流に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子が組み込まれたベクター（ｅｆｆｅｃｔｏｒｖｅｃｔｏｒ）中のＵＡＳプロモーターの下流にヒトインスリン受容体遺伝子を組み込んだＵＡＳ−Ｈｕｍａｎｉｎｓｕｌｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒ（Ｇ）を構築し、複眼においてＧＦＰを発現するカイコの系統を選別した（図１Ａ、Ｂ）。 Example 1
Non-Patent Document 8 shown above (Tomita M, Munetsuna H, Sato T, Adachi T, Hino R, Hayashi M, Shimizu K, Nakamura N, Tamura T, Yoshizato K. Nat Biotechnol. 2003 Jan; 21 (1): 52-6.) Establishment of a silkworm strain that expresses a human insulin receptor using the GAL4 / Upstream activation sequence (UAS) system for introducing a gene into a silkworm (transgenic). Went.
A human insulin receptor gene is downstream of the UAS promoter in a vector (effector vector) in which a gene encoding a green fluorescent protein (GFP) is incorporated downstream of a promoter sequence specifically expressed in the compound eye (3 × P3 promoter). An incorporated UAS-Human insulin receptor (G) was constructed, and silkworm strains expressing GFP in the compound eye were selected (FIGS. 1A and B).

次に、上記の複眼でＧＦＰを発現するカイコと、複眼特異的に赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）を発現するベクター（ｅｆｆｅｃｔｏｒｖｅｃｔｏｒ）中のＡｃｔｉｎ（アクチン）遺伝子のＡ３プロモーターをＧＡＬ４遺伝子の上流に組み込んだＡ３−ＧＡＬ４（Ｒ）（図１Ａ）を有する系統のカイコと交配させた。Ａ３−ＧＡＬ４（Ｒ）の作製方法は、例えば、Imamura M et al.，2003．Genetics 165:1329-1340やUchino K．et al.，2006 Journal of Insect Biotechnology and Sericology 75:89-97を参照することができる。 Next, the silkworm that expresses GFP in the above compound eye and the A3 promoter of the Actin (actin) gene in the vector (effector vector) that expresses red fluorescent protein (DsRed) specifically in the compound eye were incorporated upstream of the GAL4 gene. It was crossed with a silkworm having a line having A3-GAL4 (R) (FIG. 1A). A method for producing A3-GAL4 (R) is described in, for example, Imamura M et al., 2003. Genetics 165: 1329-1340 and Uchino K. et al., 2006 Journal of Insect Biotechnology and Sericology 75: 89-97.

複眼において、ＧＦＰ、及びＲＦＰの両者を発現するトランスジェニックカイコ（Ｇ／Ｒ）の脂肪体中においてヒトインスリン受容体が発現していることを、抗インスリン受容体によるウエスタンブロット解析により確認した（図１Ｃ）。
ＵＡＳ−Ｈｕｍａｎｉｎｓｕｌｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒ（Ｇ）及びＡ３−ＧＡＬ４（Ｒ）の両方、又はどちらか一方を欠失したカイコ（（−／−）、（Ｇ／−）、（−／Ｒ））では、ヒトインスリン受容体の発現は検出されなかった。 In compound eyes, it was confirmed by Western blot analysis using anti-insulin receptors that human insulin receptors are expressed in the fat bodies of transgenic silkworms (G / R) that express both GFP and RFP (Fig. 1C).
In silkworms ((− / −), (G / −), (− / R)) lacking both UAS-Human insulin receptor (G) and A3-GAL4 (R), human insulin Receptor expression was not detected.

試験例１
カイコで発現させたヒトインスリン受容体が機能しているかを確認するため、ヒトインスリンの投与による血糖値の低下がみられるかを検討した。
ヒトインスリン受容体を発現しているカイコ（Ｇ／Ｒ）にヒトインスリン（５μｇ／ｌａｒｖａ）を投与するとカイコの血糖値が低下した（図２Ａ）。一方、ヒトインスリン受容体が発現していないカイコ（−／Ｒ）に同量のインスリンを投与してもカイコの血糖値の低下はみられなかった。以上の結果は、トランスジェニックカイコで発現させたヒトインスリン受容体が機能し、投与したヒトインスリンによりインスリン経路が活性化されたことを示唆する。 Test example 1
In order to confirm whether the human insulin receptor expressed in the silkworm is functioning, it was examined whether the blood glucose level was decreased by administration of human insulin.
When human insulin (5 μg / larva) was administered to a silkworm (G / R) expressing a human insulin receptor, the blood sugar level of the silkworm decreased (FIG. 2A). On the other hand, even when the same amount of insulin was administered to silkworms (-/ R) that did not express human insulin receptor, the blood sugar level of silkworms was not reduced. The above results suggest that the human insulin receptor expressed in the transgenic silkworm functions and that the insulin pathway is activated by the administered human insulin.

次に、この系での血糖降下作用について、ヒトインスリンの容量依存性を検討した。ヒトインスリン受容体を発現しているカイコ（Ｇ／Ｒ）にヒトインスリン５、２０、８０μｇ／ｌａｒｖａを投与した場合、何れの容量においてもカイコの血糖値が低下した（図２Ｂ）。一方、ヒトインスリン０．５、２μｇ／ｌａｒｖａを投与した場合には、カイコの血糖値の低下はみられなかった。更に、ヒトインスリン受容体が発現していないカイコ（−／Ｒ）にヒトインスリン５、２０、８０μｇ／ｌａｒｖａを投与してもカイコの血糖値の低下は見られなかった。 Next, the volume dependence of human insulin was examined for the hypoglycemic effect in this system. When human insulin 5, 20, and 80 μg / larva were administered to a silkworm (G / R) expressing a human insulin receptor, the blood sugar level of the silkworm decreased in any volume (FIG. 2B). On the other hand, when human insulin 0.5, 2 μg / larva was administered, the blood sugar level of silkworms was not reduced. Furthermore, even when human insulin 5, 20, and 80 μg / larva were administered to silkworms (− / R) that did not express the human insulin receptor, the blood sugar level of silkworms was not reduced.

以上の結果は、カイコにヒトインスリン受容体を発現させることにより、ヒトインスリンに対する応答性が増大したことを示唆している。また、作出したトランスジェニックカイコにおいて血糖降下作用を引き起こすのに必要なヒトインスリン量は、８μｇ／ｌａｒｖａであることも分った。 The above results suggest that the response to human insulin was increased by expressing a human insulin receptor in silkworms. It was also found that the amount of human insulin necessary to cause hypoglycemic action in the produced transgenic silkworm was 8 μg / larva.

試験例２
ヒトインスリン受容体を発現しているカイコにヒトインスリンを作用させたとき、カイコ体内の臓器の細胞においてインスリンシグナル伝達経路が活性化するかを検討した。
ヒトインスリン受容体を発現しているカイコ（Ｇ／Ｒ）にヒトインスリンを投与すると、カイコの体内の脂肪体細胞においてＡｋｔのリン酸化が亢進していることが判明した（図３）。
一方、ヒトインスリン受容体が発現していないカイコ（−／Ｒ）にヒトインスリンを投与しても、脂肪体細胞でのＡｋｔのリン酸化の亢進はみられなかった。
以上の結果は、ヒトインスリン受容体の発現に依存したカイコの脂肪体におけるヒトインスリン経路の活性化が起きたことを示唆している。 Test example 2
We examined whether the insulin signaling pathway is activated in cells of organs in silkworms when human insulin is allowed to act on silkworms expressing human insulin receptors.
When human insulin was administered to a silkworm (G / R) expressing a human insulin receptor, it was found that phosphorylation of Akt was increased in fat body cells in the silkworm body (FIG. 3).
On the other hand, even when human insulin was administered to silkworms (− / R) that did not express human insulin receptor, enhancement of phosphorylation of Akt in fat body cells was not observed.
The above results suggest that activation of the human insulin pathway in the silkworm fat body dependent on the expression of the human insulin receptor occurred.

試験例３
インスリンシグナル伝達経路において、ＰＩ３キナーゼ（ＰＩ３ｋｉｎａｓｅ）は、Ａｋｔの上流因子として働く鍵因子であることが知られている。そこで、ヒトインスリン受容体を発現しているカイコ（Ｇ／Ｒ）の脂肪体細胞におけるヒトインスリンによるＡｋｔのリン酸化の亢進が、ＰＩ３キナーゼを介しているかを検討した。
ヒトインスリン受容体を発現しているカイコ（Ｇ／Ｒ）から摘出した脂肪体におけるヒトインスリンの添加によるＡｋｔのリン酸化の亢進は、ＰＩ３キナーゼの阻害剤でワートマニンの前処理により抑制された（図４）。
以上の結果は、ヒトインスリン受容体を発現しているカイコ（Ｇ／Ｒ）の脂肪体におけるヒトインスリンによるＡｋｔのリン酸化の亢進は、ＰＩ３キナーゼを介することを示唆している。すなわち、ヒトインスリン受容体を発現しているカイコ（Ｇ／Ｒ）の脂肪体において、ヒトインスリンの投与により、哺乳動物で明らかにされているＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔを介するインスリンシグナル伝達経路が活性化していると考えられる。 Test example 3
It is known that PI3 kinase (PI3 kinase) is a key factor that acts as an upstream factor of Akt in the insulin signaling pathway. Therefore, it was investigated whether the enhancement of phosphorylation of Akt by human insulin in the adipocytes of the silkworm (G / R) expressing the human insulin receptor is mediated by PI3 kinase.
Enhancement of phosphorylation of Akt by addition of human insulin in fat bodies excised from silkworms (G / R) expressing human insulin receptor was suppressed by pretreatment with wortmannin with an inhibitor of PI3 kinase (Fig. 4).
The above results suggest that enhancement of phosphorylation of Akt by human insulin in the fat body of silkworm (G / R) expressing human insulin receptor is mediated by PI3 kinase. That is, in the fat body of the silkworm (G / R) expressing the human insulin receptor, administration of human insulin activates the insulin signaling pathway via PI3 kinase / Akt, which has been revealed in mammals. It is thought that there is.

試験例４
ウシインスリンは、ヒトインスリンと３つのアミノ酸残基が異なっているが、ヒトインスリン受容体に対する両者の親和性には差がないことが報告されている（図５Ａ中四角、Kotzke G et al.，Dibetologia，1995，38，757-63）。更に、ウシインスリンは、体内での安定性が低いのでヒトインスリンに比べてヒトに投与したときの血糖降下作用が弱いことが知られている（Nosadini R et al.，Diabetes，1981，30，650-5）。
そこで、本発明であるヒトインスリン受容体が発現しているカイコを用いて、個体におけるウシインスリンとヒトインスリンの血糖降下作用の差を評価できるかを検討した。 Test example 4
It has been reported that bovine insulin differs from human insulin in three amino acid residues, but there is no difference in the affinity of both to the human insulin receptor (square in FIG. 5A, Kotzke G et al., Dibetologia, 1995, 38, 757-63). Furthermore, bovine insulin is known to have a lower blood glucose lowering effect when administered to humans than human insulin due to its low stability in the body (Nosadini R et al., Diabetes, 1981, 30, 650). -Five).
Thus, it was investigated whether a difference in the hypoglycemic effect between bovine insulin and human insulin in an individual can be evaluated using silkworms expressing the human insulin receptor of the present invention.

ヒトインスリン受容体を発現しているカイコ（Ｇ／Ｒ）にウシインスリン、ヒトインスリン（５μｇ／ｌａｒｖａ）を投与すると、何れの場合においてもカイコの血糖値が低下した（図５Ｂ）。しかし、その作用はウシインスリン投与群の方が、ヒトインスリンよりも弱いことが判明した。
以上の結果は、ヒトインスリン受容体を発現しているカイコを用いて、ヒトインスリン受容体に作用するアゴニストの個体レベルでの薬効を評価できることを示唆する。 When bovine insulin or human insulin (5 μg / larva) was administered to a silkworm (G / R) expressing a human insulin receptor, the blood sugar level of the silkworm decreased in any case (FIG. 5B). However, the action was found to be weaker in the bovine insulin administration group than in human insulin.
The above results suggest that the efficacy of an agonist acting on the human insulin receptor at the individual level can be evaluated using a silkworm expressing the human insulin receptor.

また、血糖降下薬であるインスリンを投与することにより、本発明のトランスジェニックカイコの血糖値が低下することが明らかになった。このことから、本発明のトランスジェニックカイコを用いて血糖値を降下させる可能性がある薬剤の評価・スクリーニング方法を提供できることが示唆される。 Moreover, it became clear by administering insulin which is a hypoglycemic agent that the blood sugar level of the transgenic silkworm of the present invention decreases. This suggests that it is possible to provide a method for evaluating / screening drugs that may lower blood glucose levels using the transgenic silkworm of the present invention.

培養細胞系を用いて血糖降下薬の候補となる化合物をスクリーニングする方法は、糖尿病治療薬の開発手法として一般的に行われている。しかしながら、一般に培養細胞系で効果を示す殆どの化合物は、動物個体では血糖降下作用を示さない。その理由は、培養細胞系では、個体における薬物動態を反映できないためである。そのため、動物個体を用いた評価系は必須である。
しかし、マウス、ラット等の哺乳類の個体を用いた場合、多くの化合物をスクリーニングするときに、飼育スペース、飼育費用、動物愛護等の観点からの問題がある。カイコは、哺乳類を用いた場合と比べ、これらの問題を抑えることが可能である。よって、カイコ個体を用いた、血糖値を降下させる物質の評価系・スクリーニング系は有用であると考えられる。 A method for screening a compound that is a hypoglycemic drug candidate using a cultured cell system is generally performed as a method for developing a therapeutic agent for diabetes. However, most compounds that are generally effective in cultured cell lines do not exhibit hypoglycemic activity in animal individuals. The reason is that the cultured cell system cannot reflect the pharmacokinetics in the individual. Therefore, an evaluation system using animal individuals is essential.
However, when mammals such as mice and rats are used, when screening many compounds, there are problems from the viewpoint of breeding space, breeding cost, animal welfare and the like. Silkworms can suppress these problems compared to the case of using mammals. Therefore, it is considered that an evaluation system / screening system for substances that lower blood glucose levels using silkworm individuals is useful.

本発明の、ヒトインスリン受容体を発現したものであることを特徴とするトランスジェニックカイコを利用して、前記方法が可能であるのみならず、インスリン受容体を介した血糖降下作用の理解や、インスリン受容体を標的とする医薬品開発の知見を得ることも可能であるため、医薬開発分野等に広く利用されるものである。 Using the transgenic silkworm characterized by expressing human insulin receptor of the present invention, not only the above method is possible, but also understanding of hypoglycemic action via insulin receptor, Since it is possible to obtain knowledge of drug development targeting insulin receptor, it is widely used in the field of drug development.

Claims

A transgenic silkworm characterized by expressing a human insulin receptor.

The transgenic silkworm according to claim 1, wherein the transgenic silkworm is produced by crossing the transgenic silkworm according to the following (1) and (2).
(1) A transgenic silkworm having a gene encoding a transcription factor GAL4 downstream of a promoter of a gene encoding cytoplasmic actin protein. (2) A gene encoding a human insulin receptor downstream of UAS which is a target promoter of GAL4. Transgenic silkworm having

A method for evaluating the efficacy of an agonist or antagonist acting on a human insulin receptor,
(A) administering the agonist or antagonist to the transgenic silkworm of claim 1 or 2, and
(B) a step of measuring a sugar concentration in a fat body or blood of a transgenic silkworm to which the agonist or antagonist is administered,
A method characterized by comprising:

A method for evaluating whether a test substance is a substance that lowers blood sugar levels in humans,
(A) a step of administering a test substance to the transgenic silkworm according to claim 1 or 2,
(B) a step of measuring a sugar concentration in a fat body or blood of a transgenic silkworm to which the test substance is administered,
A method characterized by comprising:

A method of screening for a substance that lowers blood sugar levels in humans,
(A) a step of administering a test substance to the transgenic silkworm according to claim 1 or 2,
(B) a step of measuring a sugar concentration in a fat body or blood of a transgenic silkworm to which the test substance is administered,
(C) a step of selecting a substance that lowers the sugar concentration in the fat body or blood of the transgenic silkworm, from the test substance,
A method characterized by comprising:

A method of producing a drug that lowers human blood sugar levels,
(A) a step of administering a test substance to the transgenic silkworm according to claim 1 or 2,
(B) a step of measuring a sugar concentration in a fat body or blood of a transgenic silkworm to which the test substance is administered,
(C) a step of selecting a substance that lowers the sugar concentration in the fat body or blood of the transgenic silkworm, from the test substance,
(D) mixing the substance selected in step (c) with a pharmaceutically acceptable carrier;
A method characterized by comprising: