JP2015128397A - Phosphorous acid dehydrogenase gene, and selective culture method of budding yeast using gene concerned - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、および、当該遺伝子を用いた出芽酵母の選択的培養方法に関する。 The present invention relates to a phosphite dehydrogenase gene and a method for selectively culturing budding yeast using the gene.
従来から、各種生物（例えば、微生物、細胞など）が、バイオ燃料の生産をはじめ、様々な有用物質の生産に利用されている。有用物質を生産するための生物の培養では、一般的に、目的の生物ではない生物を排除して、目的の生物のみを純粋培養している。純粋培養によって、目的の生物ではない生物による有害な物質の生産を防止することができる。また、純粋培養によって、目的の生物の量を増やすことができ、その結果、より効率的な有用物質の生産を実現することができる。 Conventionally, various organisms (for example, microorganisms, cells, etc.) have been used for the production of various useful substances including the production of biofuels. In the culture of organisms for producing useful substances, generally, organisms that are not the target organism are excluded, and only the target organism is purely cultured. Pure culture can prevent the production of harmful substances by organisms that are not the target organism. Moreover, the amount of the target organism can be increased by pure culture, and as a result, more efficient production of useful substances can be realized.
上記生物としては、例えば、大腸菌に代表される原核生物や、酵母に代表される真核生物が用いられている。それぞれの生物には独自の利点があり、目的に応じて使い分けられている。 For example, prokaryotes represented by E. coli and eukaryotes represented by yeast are used as the organism. Each creature has its own advantages and is used according to purpose.
真核生物である酵母は、原核生物とは異なる特徴的な物質代謝経路等を備えており、有用物質の生産において非常に有用な微生物であるといえる。そして、酵母を用いた有用物質の生産の場合においても、一般的に、酵母を純粋培養することによって有用物質を生産している。 Yeast, which is a eukaryote, has a characteristic substance metabolic pathway that is different from that of prokaryotes, and can be said to be a very useful microorganism in the production of useful substances. In the case of production of useful substances using yeast, generally, useful substances are produced by pure culture of yeast.
従来から、酵母を純粋培養するための方法として、薬剤耐性マーカーを用いる方法（例えば、非特許文献１参照）、および、栄養要求性マーカーを用いる方法（例えば、非特許文献２参照）が利用されている。 Conventionally, as a method for purely culturing yeast, a method using a drug resistance marker (for example, see Non-Patent Document 1) and a method using an auxotrophic marker (for example, see Non-Patent Document 2) have been used. ing.
例えば、薬剤耐性マーカーを用いる方法では、酵母に対して、所望の遺伝子と共に、薬剤耐性遺伝子が導入される。このとき、薬剤耐性遺伝子が導入された酵母は、薬剤を含む培地中であっても生育することができるが、薬剤耐性遺伝子が導入されていない酵母や不要な微生物は、薬剤を含む培地中では生育することができない。 For example, in a method using a drug resistance marker, a drug resistance gene is introduced into yeast together with a desired gene. At this time, the yeast into which the drug resistance gene has been introduced can grow even in a medium containing the drug, but yeast and unnecessary microorganisms into which the drug resistance gene has not been introduced must be present in the medium containing the drug. Cannot grow.
そこで、薬剤を含む培地を用いて培養を行うことによって、目的とする酵母のみを純粋培養することができる。なお、薬剤耐性遺伝子としては、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎ耐性遺伝子、Ｇ４１８耐性遺伝子、Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ耐性遺伝子などを挙げることができる。 Therefore, only the intended yeast can be purely cultured by culturing using a medium containing a drug. Examples of drug resistance genes include Aureobasidin resistance genes, G418 resistance genes, Chlorphenicol resistance genes, and the like.
一方、栄養要求性マーカーを用いる方法では、まず、特定のアミノ酸の代謝（例えば、特定のアミノ酸の生産）に必要な遺伝子を破壊した酵母（栄養要求性変異株）を作製する。なお、当該酵母は、特定のアミノ酸が存在しない培地中では生育できない。 On the other hand, in the method using an auxotrophic marker, first, a yeast (an auxotrophic mutant) in which a gene necessary for metabolism of a specific amino acid (for example, production of a specific amino acid) is destroyed is prepared. Note that the yeast cannot grow in a medium in which a specific amino acid is not present.
次いで、当該酵母に対して、所望の遺伝子と共に、特定のアミノ酸の代謝に必要な遺伝子が導入される。このとき、特定のアミノ酸の代謝に必要な遺伝子が導入された酵母は、当該アミノ酸を含まない培地中であっても生育することができるが、当該遺伝子が導入されていない酵母や不要な微生物は、当該アミノ酸を含まない培地中では生育することができない。 Next, a gene necessary for metabolism of a specific amino acid is introduced into the yeast together with a desired gene. At this time, a yeast into which a gene necessary for metabolism of a specific amino acid is introduced can grow even in a medium not containing the amino acid. It cannot grow in a medium not containing the amino acid.
そこで、特定のアミノ酸を含まない培地を用いて培養を行うことによって、目的とする酵母のみを純粋培養することができる。 Therefore, by culturing using a medium that does not contain a specific amino acid, only the target yeast can be purely cultured.
しかしながら、薬剤耐性マーカーを用いる方法、および、栄養要求性マーカーを用いる方法には、多くの問題点が存在する。 However, there are many problems in the method using a drug resistance marker and the method using an auxotrophic marker.
具体的に、薬剤耐性マーカーを用いる方法では、薬剤を含む培地を用いる必要がある。この場合、薬剤によって、培地のコストが上がるという問題点を有している。また、薬剤の種類によっては、人体や環境にとって有害になり得るという問題点を有している。また、薬剤を含む培地は、廃棄するときに薬剤を除去または無毒化する処理を必要とする場合がある。当該処理は、生物の培養にかかるコストを上げ、かつ、生物の培養に必要な処理を複雑化させるという問題点を有している。 Specifically, in a method using a drug resistance marker, it is necessary to use a medium containing a drug. In this case, there is a problem that the cost of the culture medium increases due to the drug. Also, depending on the type of medicine, there is a problem that it can be harmful to the human body and the environment. Moreover, the culture medium containing a chemical | medical agent may require the process which removes or detoxifies a chemical | medical agent when discarding. The treatment has the problems of increasing the cost for culturing the organism and complicating the treatment necessary for culturing the organism.
つまり、薬剤耐性マーカーを用いる方法は、簡便、安全、かつ低コストにて生物を選択的に培養することができないという問題を有している。 That is, the method using a drug resistance marker has a problem that it is not possible to selectively cultivate organisms simply, safely, and at a low cost.
また、栄養要求性マーカーを用いる方法では、まず、特定のアミノ酸の代謝に必要な遺伝子を破壊した酵母（栄養要求性変異株）を作製する必要がある。しかしながら、実用化されている酵母の多くは多倍体の酵母であって、細胞の中に複数の染色体（換言すれば、特定のアミノ酸の代謝に必要な複数の遺伝子）が存在する。 In the method using an auxotrophic marker, it is first necessary to prepare a yeast (an auxotrophic mutant) in which a gene necessary for metabolism of a specific amino acid is disrupted. However, most of the yeasts in practical use are polyploid yeasts, and a plurality of chromosomes (in other words, a plurality of genes necessary for metabolism of specific amino acids) are present in the cell.
この場合、栄養要求性変異株を作製するためには、複数の遺伝子の全てを破壊する必要があるが、このような栄養要求性変異株の取得は、非常に困難である。 In this case, in order to produce an auxotrophic mutant, it is necessary to destroy all of a plurality of genes, but it is very difficult to obtain such an auxotrophic mutant.
つまり、栄養要求性マーカーを用いる方法は、簡便に生物を選択的に培養することができないという問題を有している。 That is, the method using an auxotrophic marker has a problem that it is not possible to selectively cultivate organisms simply.
そこで、従来から、酵母などの有用生物に関して、新たな選択マーカーを用いた純粋培養の開発が進められている。 Thus, conventionally, development of pure culture using a new selection marker has been advanced for useful organisms such as yeast.
しかしながら、現在までに見出されている新たな選択マーカーは、酵母の中でも特に出芽酵母において正常に機能しないという問題点を有している。 However, the new selection marker found so far has a problem that it does not function normally in budding yeast among yeast.
本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、出芽酵母においても正常に機能し得る選択マーカーとして用いることが可能な遺伝子、および、当該遺伝子を用いた出芽酵母の選択的培養方法を提供することにある。 The present invention has been made in view of the above-mentioned conventional problems, and the object thereof is a gene that can be used as a selection marker that can function normally even in budding yeast, and a budding yeast using the gene. It is an object of the present invention to provide a selective culture method.
本発明者らは、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を選択マーカーとして用いて、目的の生物を選択的に培養する技術の開発を進めてきた（例えば、ＰＣＴ／ＪＰ２０１３／０７１５６９（本願出願時において未公開））。 The present inventors have developed a technique for selectively culturing a target organism using a phosphite dehydrogenase gene as a selection marker (for example, PCT / JP2013 / 071569 (not disclosed at the time of filing this application)). ).
具体的に、本発明者らは、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が導入された微生物を、亜リン酸を唯一のリン源として含む培地中で培養することによって、目的とする微生物を選択的に培養することに成功した。 Specifically, the present inventors selectively cultivate a target microorganism by culturing a microorganism into which a phosphite dehydrogenase gene has been introduced in a medium containing phosphorous acid as a sole phosphorus source. Succeeded.
しかしながら、研究の進展にともなって、本発明者らは、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が導入された微生物であっても、微生物の種類によっては選択マーカーが効率よく機能しない場合があることを見出した。具体的には、実用化されている酵母の多くが分類される出芽酵母の場合、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入したとしても、選択マーカーが効率よく機能しないことを見出した（後述する実施例参照）。 However, with the progress of research, the present inventors have found that even in a microorganism into which a phosphite dehydrogenase gene has been introduced, the selection marker may not function efficiently depending on the type of microorganism. Specifically, in the case of budding yeast in which many of the yeasts in practical use are classified, it has been found that even if a phosphite dehydrogenase gene is introduced, the selection marker does not function efficiently (see Examples described later). ).
選択マーカーが効率よく機能しない理由としては、以下の（ａ）〜（ｄ）のような多くの仮説が考えられ、何れの仮説が正しいのか実証することは容易なことではなかった。
（ａ）選択マーカーを効率よく機能させるためには、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子以外の遺伝子が必要である；
（ｂ）選択マーカーを効率よく機能させるためには、亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質に対する特定の修飾が必要（または、不要）である；
（ｃ）選択マーカーを効率よく機能させるためには、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が転写される過程を効率よく進める必要がある；
（ｄ）選択マーカーを効率よく機能させるためには、亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質が翻訳される過程を効率よく進める必要がある。
There are many hypotheses such as the following (a) to (d) as the reason why the selection marker does not function efficiently, and it has not been easy to demonstrate which hypothesis is correct.
(A) A gene other than the phosphite dehydrogenase gene is required for the selectable marker to function efficiently;
(B) In order for the selectable marker to function efficiently, specific modifications to the phosphite dehydrogenase protein are necessary (or unnecessary);
(C) In order for the selectable marker to function efficiently, it is necessary to efficiently advance the process of transcription of the phosphite dehydrogenase gene;
(D) In order for the selectable marker to function efficiently, it is necessary to efficiently advance the process of translating the phosphite dehydrogenase protein.
本発明者らは、多くの仮説の中でも、特に上記（ｃ）および（ｄ）に着目した。更に具体的に、本発明者らは、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の特定のコドンを改変することによって、出芽酵母の中でも、選択マーカーを機能させることができるのではないか、と考えた。 The present inventors paid particular attention to the above (c) and (d) among many hypotheses. More specifically, the present inventors thought that a selectable marker could function in budding yeast by modifying a specific codon of the phosphite dehydrogenase gene.
本発明者らは、鋭意検討した結果、亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質を構成する多くの種類のアミノ酸の中でも特にアルギニンおよび／またはアラニンをコードするコドンが特定のコドンに置換された遺伝子を用いることによって、出芽酵母の中でも選択マーカーを機能させることができることを見出し、本発明を完成させるに至った。 As a result of intensive studies, the present inventors have used a gene in which a codon encoding arginine and / or alanine is replaced with a specific codon among many types of amino acids constituting a phosphite dehydrogenase protein. The inventors have found that a selectable marker can be made to function among budding yeast, and have completed the present invention.
つまり、本発明の出芽酵母の選択的培養方法は、上記課題を解決するために、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードしている遺伝子であって、上記タンパク質内に存在する全てのアルギニンが、ＣＧＴ、ＡＧＡ、または、ＡＧＧのコドンによってコードされており、上記タンパク質内に存在する全てのアラニンが、ＧＣＴ、ＧＣＣ、または、ＧＣＡのコドンによってコードされている遺伝子、が導入された出芽酵母を、亜リン酸を唯一のリン源として含む培地中で培養することを特徴としている。 That is, in order to solve the above-described problem, the selective culturing method for budding yeast of the present invention is a gene encoding a protein having phosphite dehydrogenase activity, and all arginines present in the protein are present. Saccharomyces cerevisiae, which is encoded by CGT, AGA, or AGG codon, and in which all alanine present in the protein is encoded by GCT, GCC, or GCA codon. It is characterized by culturing in a medium containing phosphorous acid as the only phosphorus source.
本発明の出芽酵母の選択的培養方法では、上記タンパク質内に存在するアルギニンの５０％以上が、ＡＧＡのコドンによってコードされていることが好ましい。 In the selective culturing method for budding yeast of the present invention, it is preferable that 50% or more of arginine present in the protein is encoded by an AGA codon.
本発明の出芽酵母の選択的培養方法では、上記タンパク質内に存在するアラニンの５０％以上が、ＧＣＴのコドンによってコードされていることが好ましい。 In the selective culturing method of budding yeast of the present invention, it is preferable that 50% or more of alanine present in the protein is encoded by a codon of GCT.
本発明の出芽酵母の選択的培養方法では、上記遺伝子は、以下の（１）または（２）のタンパク質をコードしていることが好ましい。つまり、
（１）配列番号１または４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号１または４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
In the selective culturing method of budding yeast of the present invention, the gene preferably encodes the following protein (1) or (2). That means
(1) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 4;
(2) A protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 4, and having phosphite dehydrogenase activity.
本発明の出芽酵母の選択的培養方法では、上記遺伝子は、以下の（３）または（４）のＤＮＡからなることが好ましい。つまり、
（３）配列番号３または６に示される塩基配列からなるＤＮＡ；
（４）配列番号３または６に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
In the selective culturing method for budding yeast of the present invention, the gene preferably comprises the following DNA (3) or (4). That means
(3) DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 6;
(4) DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 6 and encodes a protein having phosphite dehydrogenase activity .
本発明の出芽酵母の選択的培養方法では、上記培養は、無殺菌条件下にて行われることが好ましい。 In the selective culturing method for budding yeast of the present invention, the culturing is preferably performed under non-sterile conditions.
本発明の出芽酵母の選択的培養方法では、上記培地は、無殺菌の培地であることが好ましい。 In the selective culturing method for budding yeast of the present invention, the medium is preferably a non-sterile medium.
本発明の遺伝子は、上記課題を解決するために、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードしている遺伝子であって、上記タンパク質内に存在する全てのアルギニンが、ＣＧＴ、ＡＧＡ、または、ＡＧＧのコドンによってコードされており、上記タンパク質内に存在する全てのアラニンが、ＧＣＴ、ＧＣＣ、または、ＧＣＡのコドンによってコードされていることを特徴としている。 In order to solve the above problems, the gene of the present invention is a gene encoding a protein having phosphite dehydrogenase activity, and all the arginines present in the protein are CGT, AGA, or AGG. And all alanines present in the protein are encoded by GCT, GCC, or GCA codons.
本発明の遺伝子では、上記タンパク質内に存在するアルギニンの５０％以上が、ＡＧＡのコドンによってコードされていることが好ましい。 In the gene of the present invention, it is preferable that 50% or more of arginine present in the protein is encoded by an AGA codon.
本発明の遺伝子では、上記タンパク質内に存在するアラニンの５０％以上が、ＧＣＴのコドンによってコードされていることが好ましい。 In the gene of the present invention, it is preferable that 50% or more of alanine present in the protein is encoded by a GCT codon.
本発明の遺伝子は、以下の（１）または（２）のタンパク質をコードしていることが好ましい。つまり。
（１）配列番号１または４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号１または４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
The gene of the present invention preferably encodes the following protein (1) or (2). In other words.
(1) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 4;
(2) A protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 4, and having phosphite dehydrogenase activity.
本発明の遺伝子は、以下の（３）または（４）のＤＮＡからなることが好ましい。つまり、
（３）配列番号３または６に示される塩基配列からなるＤＮＡ；
（４）配列番号３または６に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
The gene of the present invention is preferably composed of the following DNA (3) or (4). That means
(3) DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 6;
(4) DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 6 and encodes a protein having phosphite dehydrogenase activity .
本発明は、野生型の亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入しても、亜リン酸を唯一のリン源として含む培地中にて増殖することができなかった出芽酵母を、当該培地中で増殖させることができるという効果を奏する。つまり、本発明は、従来は選択的に培養することができなかった出芽酵母を、選択的に培養することができるという効果を奏する。 According to the present invention, a budding yeast that has not been able to grow in a medium containing phosphorous acid as a sole phosphorus source even when a wild-type phosphite dehydrogenase gene is introduced is grown in the medium. There is an effect that can be. That is, this invention has the effect that the budding yeast which was not able to be selectively cultured conventionally can be selectively cultured.
本発明は、低コストにて出芽酵母の選択的な培養を行うことができるという効果を奏する。 The present invention has an effect that selective culturing of budding yeast can be performed at low cost.
例えば、薬剤耐性マーカーを用いる方法では、薬剤としてＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎ ＡまたはＺｏｅｃｉｎなどを用いる。このとき、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎ Ａを含む培地では、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎ Ａの濃度が約０．１μｇ／ｍＬである必要があり、当該培地のコストが約４２０円／Ｌになる。また、Ｚｏｅｃｉｎを含む培地では、Ｚｏｅｃｉｎの濃度が約１００μｇ／ｍＬである必要があり、当該培地のコストが約３２２６円／Ｌになる。 For example, in a method using a drug resistance marker, Aureobasidin A or Zoecin is used as a drug. At this time, in the medium containing Aureobasidin A, the concentration of Aureobasidin A needs to be about 0.1 μg / mL, and the cost of the medium is about 420 yen / L. In addition, in a medium containing Zooecin, the concentration of Zoecin needs to be about 100 μg / mL, and the cost of the medium is about 3226 yen / L.
一方、本願発明であれば、リン源として亜リン酸を含む培地を用いればよく、当該培地における亜リン酸の濃度を４１５μｇ／ｍＬとすれば、培地のコストが約３．３円／Ｌになる。 On the other hand, according to the present invention, a medium containing phosphorous acid may be used as a phosphorus source. If the concentration of phosphorous acid in the medium is 415 μg / mL, the cost of the medium is about 3.3 yen / L. Become.
つまり、本願発明は、従来技術と比べて、培地の費用を１／１００以下に抑えることができるという効果を奏する。有用な物質の生産などでは、１０００Ｌ以上、または、１００００Ｌ以上という大量の培地を用いて出芽酵母を培養する場合が多々ある。本願発明であれば、培地にかかる膨大なコストを大幅に削減することができる。 That is, the present invention has an effect that the cost of the culture medium can be suppressed to 1/100 or less as compared with the prior art. In the production of useful substances, budding yeast is often cultured using a large amount of medium of 1000 L or more, or 10,000 L or more. If it is this invention, the huge cost concerning a culture medium can be reduced significantly.
本発明は、薬剤耐性マーカーを用いる方法とは異なり抗生物質などの薬剤を用いないので、使用後の培地中の薬剤を除去または無毒化する必要がない。それ故に、本発明は、使用後の培地を、安全かつ容易に廃棄することができるという効果を奏する。 Unlike the method using a drug resistance marker, since the present invention does not use a drug such as an antibiotic, it is not necessary to remove or detoxify the drug in the medium after use. Therefore, the present invention has an effect that the used medium can be safely and easily discarded.
例えば、出芽酵母などの真核生物の選択的培養に用いられる薬剤は、人体や環境にとって非常に有害である場合がある。本発明であれば、このような有害な薬剤の使用を避けることができる。 For example, drugs used for selective culturing of eukaryotic organisms such as budding yeast may be very harmful to the human body and the environment. According to the present invention, the use of such harmful drugs can be avoided.
本発明は、栄養要求性マーカーを用いる方法とは異なり出芽酵母内の遺伝子を予め破壊しておく必要はない、それ故に、本発明は、簡便に出芽酵母の選択的培養を行うことができるという効果を奏する。 Unlike the method using an auxotrophic marker, the present invention does not require disruption of genes in the budding yeast in advance, and therefore the present invention can easily perform selective culturing of the budding yeast. There is an effect.
例えば、有用な出芽酵母には多倍体が多く、多倍体では、複数存在する遺伝子の全てを破壊することが困難であった。本願発明は、多倍体であっても、簡便に選択的培養を行うことができるという効果を奏する。 For example, there are many polyploids of useful budding yeast, and it has been difficult to destroy all of the genes present in the polyploid. The present invention has an effect that even if it is a polyploid, selective culture can be easily performed.
以下に、本発明の実施形態の一例について説明する。なお、本発明は、以下に説示する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。 Below, an example of embodiment of this invention is demonstrated. It should be noted that the present invention is not limited to the configurations described below, and various modifications are possible within the scope indicated in the claims, and the technical disclosure disclosed in different embodiments and examples. Embodiments and examples obtained by appropriately combining means are also included in the technical scope of the present invention.
なお、本明細書において「Ａ〜Ｂ」と記載した場合には、当該記載は「Ａ以上Ｂ以下」を意図するものとする。 In the present specification, when “A to B” is described, the description is intended to be “A or more and B or less”.
〔１．出芽酵母の選択的培養方法〕
本発明の出芽酵母の選択的培養方法は、本発明の遺伝子が導入された出芽酵母を、亜リン酸を唯一のリン源として含む培地中で培養することを特徴としている。
[1. (Selective culture method of budding yeast)
The selective culturing method for budding yeast of the present invention is characterized in that the budding yeast introduced with the gene of the present invention is cultured in a medium containing phosphorous acid as a sole phosphorus source.
出芽酵母は、亜リン酸を資化して生育することができない。つまり、亜リン酸を唯一のリン源として含む培地中にて出芽酵母を培養した場合、出芽酵母は、増殖することができない。 Budding yeast cannot assimilate phosphorous acid and grow. That is, when budding yeast is cultured in a medium containing phosphorous acid as the only phosphorus source, the budding yeast cannot grow.
しかしながら、本発明の遺伝子を出芽酵母に導入すれば、野生型の亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を用いた場合には亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質が発現しなかった出芽酵母において、確実に亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質を発現させることができる。 However, when the gene of the present invention is introduced into a budding yeast, the phosphite dehydrogenase protein is surely expressed in the budding yeast in which the phosphite dehydrogenase protein was not expressed when the wild-type phosphite dehydrogenase gene was used. Can be expressed.
出芽酵母内において亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質が発現すれば、当該出芽酵母内において、亜リン酸がリン酸へと変換される。そして、当該出芽酵母は、亜リン酸から生成されたリン酸を資化することによって、亜リン酸を唯一のリン源として含む培地中でも増殖することが可能になる。 If the phosphite dehydrogenase protein is expressed in the budding yeast, phosphorous acid is converted into phosphoric acid in the budding yeast. The budding yeast can grow in a medium containing phosphorous acid as a sole phosphorus source by assimilating phosphoric acid produced from phosphorous acid.
つまり、本発明では、本発明の遺伝子が導入された出芽酵母を、確実に選択的に培養することができる。 That is, in the present invention, the budding yeast introduced with the gene of the present invention can be reliably and selectively cultured.
本明細書において、「出芽酵母の選択的培養方法」とは、目的の出芽酵母以外の生物の非存在下において、目的の出芽酵母のみを選択的に培養することを意味するが、更に、目的の出芽酵母以外の生物の存在下において、目的の出芽酵母を優先的に培養することをも意味する。 In the present specification, the “selective culturing method of budding yeast” means that only the target budding yeast is selectively cultured in the absence of an organism other than the target budding yeast. This also means that the target budding yeast is preferentially cultured in the presence of an organism other than the budding yeast.
換言すれば、本発明の選択的培養方法においては、目的の出芽酵母のみが培養されることが好ましいが、必ずしもこれに限定されるものではなく、目的の出芽酵母以外の生物に対して目的の出芽酵母が優先的に培養されていればよい。 In other words, in the selective culturing method of the present invention, it is preferable that only the target budding yeast is cultured. However, the present invention is not necessarily limited thereto, and the target budding yeast is not limited to the target budding yeast. The budding yeast should just be cultured preferentially.
生物の中で、亜リン酸を資化することができる生物の種類は、多くはない。それ故に、たとえ、目的の出芽酵母と、目的の出芽酵母以外の生物とが混在していたとしても、目的の出芽酵母のみが増殖することができる。そして、当該増殖の結果、目的の出芽酵母を優先的に培養することができる。 There are not many types of organisms that can assimilate phosphorous acid. Therefore, even if the target budding yeast and an organism other than the target budding yeast are mixed, only the target budding yeast can grow. As a result of the growth, the target budding yeast can be preferentially cultured.
本発明の遺伝子の具体的な構成については、後述する〔２．遺伝子〕にて説明する。 The specific configuration of the gene of the present invention will be described later [2. Gene].
また、選択的に培養される出芽酵母は、単一種類の出芽酵母であってもよいが、複数種類の出芽酵母であってもよい。 The budding yeast that is selectively cultured may be a single type of budding yeast or a plurality of types of budding yeast.
上記出芽酵母としては、多倍体の出芽酵母を用いることが可能である。例えば、上記出芽酵母は、二倍体またはそれよりも多くの染色体を有する出芽酵母であってもよく、三倍体またはそれよりも多くの染色体を有する出芽酵母であってもよく、四倍体またはそれよりも多くの染色体を有する出芽酵母であってもよい。 As the budding yeast, polyploid budding yeast can be used. For example, the budding yeast may be a diploid or a budding yeast having more chromosomes, a triploid or a budding yeast having more chromosomes, and a tetraploid. Alternatively, it may be a budding yeast having more chromosomes.
本発明では出芽酵母内の特定の遺伝子を予め破壊しておく必要が無いので、多倍体の出芽酵母であっても、選択的に、かつ、安価に培養することができる。 In the present invention, since it is not necessary to destroy a specific gene in the budding yeast in advance, even a polyploid budding yeast can be selectively and inexpensively cultured.
出芽酵母は、例えば、サッカロミセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）であり得る。 The budding yeast can be, for example, Saccharomyces cerevisiae.
出芽酵母には実用化されている酵母の多くが分類されるが、出芽酵母は、分裂酵母と比較して、野生型の亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を用いた場合に亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の発現量が極めて低い（後述する実施例参照）。一方、本発明の遺伝子を用いた場合、出芽酵母において、亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の発現量が高い。それ故に、本発明であれば、出芽酵母を、選択的に、かつ、安価に培養することができる。 Although most yeasts that are put into practical use are classified as budding yeast, the expression level of phosphite dehydrogenase protein is higher in budding yeast when compared to fission yeast when the wild-type phosphite dehydrogenase gene is used. Is extremely low (see Examples below). On the other hand, when the gene of the present invention is used, the phosphite dehydrogenase protein expression level is high in budding yeast. Therefore, according to the present invention, budding yeast can be selectively and inexpensively cultured.
出芽酵母へ遺伝子を導入する方法としては特に限定されず、適宜周知の方法を用いればよい。 The method for introducing a gene into budding yeast is not particularly limited, and a known method may be used as appropriate.
本発明の出芽酵母の選択的培養方法では、本発明の遺伝子が導入された出芽酵母を、亜リン酸を唯一のリン源として含む培地中で培養する。 In the selective culturing method for budding yeast of the present invention, the budding yeast introduced with the gene of the present invention is cultured in a medium containing phosphorous acid as a sole phosphorus source.
ここで、「亜リン酸を唯一のリン源として含む培地」とは、亜リン酸以外のリン元素を供給する成分（例えば、リン酸、次亜リン酸、ホスフィン等）を実質的に含有していない培地を意味する。なお、「実質的に含有していない」とは、濃度が１０μＭ以下であること、更に具体的には濃度が１μＭ以下であること、更に具体的には濃度が０．１μＭ以下であること、更に具体的には濃度が０．０１μＭ以下であること、を意味する。 Here, the “medium containing phosphorous acid as the only phosphorus source” substantially contains components that supply phosphorus elements other than phosphorous acid (for example, phosphoric acid, hypophosphorous acid, phosphine, etc.). Means no medium. “Substantially free” means that the concentration is 10 μM or less, more specifically, the concentration is 1 μM or less, more specifically, the concentration is 0.1 μM or less, More specifically, it means that the concentration is 0.01 μM or less.
上記培地は、亜リン酸を唯一のリン源として含む培地であれば、特に限定されるものではなく、生物の種類等に応じて適宜選択すればよい。ただし、リン源を亜リン酸のみにコントロールし易いとの観点から、完全合成培地が好ましい。例えば、モルホリノプロパンスルホン酸培地（ＭＯＰＳ培地）、ＥＭＭ最小培地、または、ＳＤＭ最小培地を用いることができるが、勿論、当該培地に限定されない。 The medium is not particularly limited as long as it is a medium containing phosphorous acid as the only phosphorus source, and may be appropriately selected according to the type of organism. However, a completely synthetic medium is preferable from the viewpoint that the phosphorus source can be easily controlled only by phosphorous acid. For example, a morpholinopropanesulfonic acid medium (MOPS medium), an EMM minimum medium, or an SDM minimum medium can be used, but of course, the medium is not limited thereto.
上記培地における亜リン酸の濃度は特に限定されず、生物の種類等に応じて適宜選択すればよい。例えば、培地中の亜リン酸の濃度は、０．１ｍＭ〜１Ｍ、０．１ｍＭ〜９００ｍＭ、０．１ｍＭ〜８００ｍＭ、０．１ｍＭ〜７００ｍＭ、０．１ｍＭ〜６００ｍＭ、０．１ｍＭ〜５００ｍＭ、０．１ｍＭ〜４００ｍＭ、０．１ｍＭ〜３００ｍＭ、０．１ｍＭ〜２００ｍＭ、０．１ｍＭ〜１００ｍＭ、０．１ｍＭ〜７５ｍＭ、０．１ｍＭ〜５０ｍＭ、０．１ｍＭ〜２５ｍＭ、０．１ｍＭ〜１５ｍＭ、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ、０．１ｍＭ〜７．５ｍＭ、０．１ｍＭ〜５ｍＭ、または、０．１ｍＭ〜１ｍＭであり得る。 The concentration of phosphorous acid in the medium is not particularly limited, and may be appropriately selected according to the type of organism. For example, the concentration of phosphorous acid in the medium is 0.1 mM to 1 M, 0.1 mM to 900 mM, 0.1 mM to 800 mM, 0.1 mM to 700 mM, 0.1 mM to 600 mM, 0.1 mM to 500 mM, 0. 1 mM to 400 mM, 0.1 mM to 300 mM, 0.1 mM to 200 mM, 0.1 mM to 100 mM, 0.1 mM to 75 mM, 0.1 mM to 50 mM, 0.1 mM to 25 mM, 0.1 mM to 15 mM, 0.1 mM to 0.1 mM It can be 10 mM, 0.1 mM to 7.5 mM, 0.1 mM to 5 mM, or 0.1 mM to 1 mM.
コストを低減させるという観点から、上記亜リン酸の濃度は、低いほど好ましいといえる。 From the viewpoint of reducing costs, it can be said that the lower the concentration of phosphorous acid, the better.
本発明では亜リン酸の資化能力を指標として出芽酵母を選択的に培養するので、上記培地には抗生物質が含まれている必要はない。このため、本発明の出芽酵母の選択的培養方法に適用される培地は、抗生物質を含有していない培地であり得る。勿論、必要に応じて、抗生物質を含有している培地を用いることもできる。 In the present invention, since the budding yeast is selectively cultured using the assimilation ability of phosphorous acid as an index, the medium need not contain antibiotics. For this reason, the medium applied to the selective culturing method of budding yeast of the present invention may be a medium not containing antibiotics. Of course, if necessary, a medium containing antibiotics can also be used.
また、本発明の出芽酵母の選択的培養方法による効果は、培養スケールが大きくなればなるほど顕著となる。このため、本発明の出芽酵母の選択的培養方法は、１００Ｌ以上、より好ましくは１０００Ｌ以上、さらに好ましくは５０００Ｌ以上、最も好ましくは１００００Ｌ以上の培地を用いて実施されることが好ましい。 Moreover, the effect by the selective culture | cultivation method of the budding yeast of this invention becomes so remarkable that a culture scale becomes large. For this reason, the selective culturing method for budding yeast of the present invention is preferably carried out using a medium of 100 L or more, more preferably 1000 L or more, still more preferably 5000 L or more, and most preferably 10,000 L or more.
本発明の出芽酵母の選択的培養方法では、上記培養は、殺菌条件下にて行われてもよいし、無殺菌条件下にて行われてもよい。簡便かつ低コストにて培養を行うという観点からは、無殺菌条件下にて培養を行うことが好ましい。 In the selective culturing method for budding yeast of the present invention, the culturing may be performed under sterilized conditions or may be performed under non-sterile conditions. From the viewpoint of performing culture simply and at low cost, it is preferable to perform the culture under non-sterile conditions.
生物の多くは、亜リン酸を資化して生育することができない。つまり、亜リン酸を唯一のリン源として含む培地中にて生物を培養した場合、多くの生物は、増殖することができない。それ故に、無殺菌条件下にて培養を行ったとしても、良好に目的の出芽酵母を選択的に培養することができる。更には、無殺菌条件下の培養を採用すれば、培養のスケールを容易に大きくすることができ、その結果、物質の大量生産等を容易に行うことができる。 Many organisms cannot assimilate phosphorous acid and grow. That is, when organisms are cultured in a medium containing phosphorous acid as the only phosphorus source, many organisms cannot grow. Therefore, even if culturing is performed under non-sterile conditions, the target budding yeast can be selectively cultured well. Furthermore, if culture under non-sterile conditions is employed, the scale of the culture can be easily increased, and as a result, mass production of substances can be easily performed.
殺菌条件下の培養とは、例えば、加熱、フィルター濾過、ＵＶ照射、オゾン照射等の殺菌処理が、培養系（例えば、培養装置、培地に供給される気体（酸素等））に対して行われている条件にて培養することを意図する。また、殺菌条件下の培養には、閉鎖系の培養も包含される。 Cultivation under sterilization conditions means, for example, sterilization such as heating, filter filtration, UV irradiation, and ozone irradiation is performed on a culture system (for example, a culture apparatus, a gas (oxygen, etc.) supplied to the medium). It is intended to be cultured under conditions. Further, the culture under sterilization conditions includes closed culture.
一方、無殺菌条件下の培養とは、例えば、加熱、フィルター濾過、ＵＶ照射、オゾン照射等の殺菌処理が、培養系（例えば、培養装置、培地に供給される気体（酸素等））に対して一切行われていない条件にて培養することを意図する。また、無殺菌条件下の培養には、開放系の培養も包含される。 On the other hand, culturing under non-sterile conditions means that, for example, sterilization treatment such as heating, filter filtration, UV irradiation, and ozone irradiation is performed on a culture system (for example, culture apparatus, gas supplied to the medium (oxygen, etc.)). It is intended to cultivate under conditions that are not performed at all. The culture under non-sterile conditions also includes open culture.
本発明の出芽酵母の選択的培養方法では、上記培地は、殺菌された培地であってもよいし、無殺菌の培地であってもよい。簡便かつ低コストにて培養を行うという観点からは、無殺菌の培地を用いることが好ましい。 In the selective culturing method for budding yeast of the present invention, the medium may be a sterilized medium or a non-sterilized medium. From the viewpoint of culturing simply and at low cost, it is preferable to use a non-sterile medium.
生物の多くは、亜リン酸を資化して生育することができない。つまり、亜リン酸を唯一のリン源として含む培地中にて生物を培養した場合、多くの生物は、増殖することができない。それ故に、無殺菌の培地を用いて培養を行ったとしても、良好に目的の出芽酵母を選択的に培養することができる。更には、無殺菌の培地を採用すれば、培養のスケールを容易に大きくすることができ、その結果、物質の大量生産等を容易に行うことができる。 Many organisms cannot assimilate phosphorous acid and grow. That is, when organisms are cultured in a medium containing phosphorous acid as the only phosphorus source, many organisms cannot grow. Therefore, even if culturing is performed using a non-sterile medium, the target budding yeast can be selectively cultured well. Furthermore, if a non-sterilized medium is employed, the scale of culture can be easily increased, and as a result, mass production of substances can be easily performed.
殺菌された培地とは、例えば、加熱、フィルター濾過、ＵＶ照射、オゾン照射等の殺菌処理を施された培地を意図する。 The sterilized medium is intended to be a medium that has been sterilized by heating, filter filtration, UV irradiation, ozone irradiation, or the like.
一方、無殺菌の培地とは、例えば、加熱、フィルター濾過、ＵＶ照射、オゾン照射等の殺菌処理を施されていない培地を意図する。 On the other hand, a non-sterile medium is intended to be a medium that has not been subjected to a sterilization treatment such as heating, filter filtration, UV irradiation, or ozone irradiation.
〔２．遺伝子〕
以下に、本発明の遺伝子について説明する。なお、本明細書において、用語「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。
[2. gene〕
Hereinafter, the gene of the present invention will be described. In the present specification, the term “gene” is used interchangeably with “polynucleotide”, “nucleic acid” or “nucleic acid molecule”, and is intended to be a polymer of nucleotides.
本発明の遺伝子は、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質（換言すれば、亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質）をコードする遺伝子（換言すれば、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子）であって、上記亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質内に存在する全てのアルギニンが、ＣＧＴ、ＡＧＡ、または、ＡＧＧのコドンによってコードされており、上記タンパク質内に存在する全てのアラニンが、ＧＣＴ、ＧＣＣ、または、ＧＣＡのコドンによってコードされている遺伝子である。 The gene of the present invention is a gene encoding a protein having phosphite dehydrogenase activity (in other words, phosphite dehydrogenase protein) (in other words, a phosphite dehydrogenase gene), and the phosphite dehydrogenase protein All arginines present in the protein are encoded by CGT, AGA, or AGG codons, and all alanines present in the protein are encoded by GCT, GCC, or GCA codons It is.
また、本発明の遺伝子は、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子であって、上記亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子内に存在する全てのアルギニンをコードするコドンが、ＣＧＴ、ＡＧＡ、または、ＡＧＧであり、上記遺伝子内に存在する全てのアラニンをコードするコドンが、ＧＣＴ、ＧＣＣ、または、ＧＣＡである亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子である。 The gene of the present invention is a phosphite dehydrogenase gene, and all the codons encoding arginine present in the phosphite dehydrogenase gene are CGT, AGA, or AGG, The codon encoding all alanines present is the phosphite dehydrogenase gene which is GCT, GCC or GCA.
亜リン酸デヒドロゲナーゼは、以下の反応式に示すように、ＮＡＤ依存的またはＮＡＤＰ依存的に亜リン酸を酸化して、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨと、リン酸とを生成する酵素である。 As shown in the following reaction formula, phosphite dehydrogenase is an enzyme that generates NADH or NADPH and phosphate by oxidizing phosphorous acid in an NAD-dependent or NADP-dependent manner.
ＨＰＯ３ ２−＋ＮＡＤ＋＋Ｈ２Ｏ → ＨＰＯ４ ２−+ＮＡＤＨ＋Ｈ＋
ＨＰＯ３ ２−＋ＮＡＤＰ＋＋Ｈ２Ｏ → ＨＰＯ４ ２−+ＮＡＤＰＨ＋Ｈ＋
出芽酵母は、亜リン酸を資化して生育することができない。つまり、亜リン酸を唯一のリン源として含む培地中にて出芽酵母を培養した場合、出芽酵母は増殖することができない。
HPO 3 2− + NAD + + H 2 O → HPO 4 2− + NADH + H +
HPO 3 2 + NADP + + H 2 O → HPO 4 2 + + NADPH + H +
Budding yeast cannot assimilate phosphorous acid and grow. That is, when budding yeast is cultured in a medium containing phosphorous acid as the only phosphorus source, the budding yeast cannot grow.
更に、出芽酵母へ野生型の亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入しても、当該遺伝子は、出芽酵母内で正常に機能しない。 Furthermore, even if a wild-type phosphite dehydrogenase gene is introduced into a budding yeast, the gene does not function normally in the budding yeast.
しかしながら、本発明の遺伝子を出芽酵母に導入すれば、野生型の亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を用いた場合には亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質が発現しなかった出芽酵母において、確実に亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質を発現させることができる。 However, when the gene of the present invention is introduced into a budding yeast, the phosphite dehydrogenase protein is surely expressed in the budding yeast in which the phosphite dehydrogenase protein was not expressed when the wild-type phosphite dehydrogenase gene was used. Can be expressed.
出芽酵母内において亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質が発現すれば、出芽酵母内において、亜リン酸がリン酸へと変換される。そして、当該出芽酵母は、亜リン酸から生成されたリン酸を資化することによって、亜リン酸を唯一のリン源として含む培地中でも増殖することが可能になる。換言すれば、本発明では、本発明の遺伝子が導入された出芽酵母を、確実に選択的に培養することができる。 If the phosphite dehydrogenase protein is expressed in the budding yeast, phosphorous acid is converted into phosphoric acid in the budding yeast. The budding yeast can grow in a medium containing phosphorous acid as a sole phosphorus source by assimilating phosphoric acid produced from phosphorous acid. In other words, in the present invention, the budding yeast into which the gene of the present invention has been introduced can be reliably and selectively cultured.
つまり、本発明の遺伝子は、出芽酵母を選択的に培養するための選択マーカーとして利用することができる。 That is, the gene of the present invention can be used as a selection marker for selectively culturing budding yeast.
なお、タンパク質が亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質であるか否かは、ＮＡＤ依存的またはＮＡＤＰ依存的な亜リン酸の酸化によって生成される、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ、および／または、リン酸を検出することによって確認することができる。なお、ＮＡＤＨ、ＨＡＤＰＨおよびリン酸の検出方法は周知であるので、当該周知の方法にしたがってＮＡＤＨ、ＨＡＤＰＨおよびリン酸の各々を検出すればよい。 Whether or not the protein is a phosphite dehydrogenase protein is confirmed by detecting NADH or NADPH and / or phosphate produced by NAD-dependent or NADP-dependent phosphite oxidation. can do. In addition, since the detection method of NADH, HADPH, and phosphoric acid is well-known, each of NADH, HADPH, and phosphoric acid should just be detected according to the said well-known method.
上記亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質としては特に限定されず、周知の亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質であればよい。 The phosphite dehydrogenase protein is not particularly limited as long as it is a known phosphite dehydrogenase protein.
例えば、上記亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質は、以下の生物に由来する亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質、または、当該亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質の変異型タンパク質であり得る。更に具体的に、上記変異型タンパク質は、以下の生物に由来する亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、であり得る。 For example, the phosphite dehydrogenase protein may be a phosphite dehydrogenase protein derived from the following organism or a mutant protein of the phosphite dehydrogenase protein. More specifically, the mutant protein comprises an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of a phosphite dehydrogenase protein derived from the following organism, and A protein having acid dehydrogenase activity.
上記生物としては、Ralstonia sp. 4506、Pseudomonas stutzeri WM88、Desulfotignum phosphitoxidans、Dietzia cinnamea、Methylobacterium extorquens、Comamonas testosterone、Acidovorax ebreus、Cupriavidus metallidurans、Cupriavidus metallidurans、Thioalkalivibrio sp.、Klebsiella pneumoniae、Pseudomonas aeruginosa、Marinobacter algicola、Marinobacter aquaeolei、Shewanella putrefaciens、Prochlorococcus sp.、Cyanothece sp.、Trichodesmium erythraeum、Nostoc sp.、Nodularia spumigena、Nostoc punmtiforme、Gallionella capsiferriformans、Burkholderia vietnamiensis、Acinetobacter radioresistens、Herminiimonas arsenicoxydans、Alcaligenes faecalis、および、Oxalobacter formigenesを挙げることができる。 Examples of the organisms include Ralstonia sp. 4506, Pseudomonas stutzeri WM88, Desulfotignum phosphitoxidans, Dietzia cinnamea, Methylobacterium extorquens, Comamonas testosterone, Acidovorax ebreus, Cupriavidus metallidurans, Cupriavidus metallidurans, Thellaalus , Shewanella putrefaciens, Prochlorococcus sp., Cyanothece sp., Trichodesmium erythraeum, Nostoc sp., Nodularia spumigena, Nostoc punmtiforme, Gallionella capsiferriformans, Burkholderia vietnamiensis, Alcinetobacter radioreimon
更に具体的に、本発明の遺伝子は、以下の（１）または（２）のタンパク質をコードする遺伝子であって、タンパク質内に存在する全てのアルギニンが、ＣＧＴ、ＡＧＡ、または、ＡＧＧのコドンによってコードされており、タンパク質内に存在する全てのアラニンが、ＧＣＴ、ＧＣＣ、または、ＧＣＡのコドンによってコードされている遺伝子であってもよい。つまり、
（１）配列番号１または４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号１または４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
More specifically, the gene of the present invention is a gene encoding the following protein (1) or (2), and all arginines present in the protein are represented by CGT, AGA, or AGG codons. It may be a gene that is encoded and all alanines present in the protein are encoded by GCT, GCC or GCA codons. That means
(1) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 4;
(2) A protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 4, and having phosphite dehydrogenase activity.
なお、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質とは、具体的には、Pseudomonas stutzeri WM88に由来する亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質であり、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質とは、Ralstonia sp. 4506に由来する亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質である。 The protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is specifically a phosphite dehydrogenase protein derived from Pseudomonas stutzeri WM88, and the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 is Ralstonia It is a phosphite dehydrogenase protein derived from sp. 4506.
本明細書における「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸」では、欠失、置換若しくは付加が生じる位置は特に限定されない。 In the present specification, in the “amino acid in which one or several amino acids are deleted, substituted or added”, the position where the deletion, substitution or addition occurs is not particularly limited.
また、「１若しくは数個のアミノ酸」が意図するアミノ酸の数は特に限定されないが、２０個以内のアミノ酸であることが好ましく、１９個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、１８個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、１７個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、１６個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、１５個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、１４個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、１３個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、１２個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、１１個のアミノ酸であることが更に好ましく、１０個以内のアミノ酸であることが好ましく、９個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、８個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、７個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、６個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、５個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、４個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、３個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、２個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、１個のアミノ酸であることが最も好ましい。 Further, the number of amino acids intended by “one or several amino acids” is not particularly limited, but is preferably 20 amino acids or less, more preferably 19 amino acids or less, and 18 amino acids or less. More preferably, it is more preferably no more than 17 amino acids, still more preferably no more than 16 amino acids, still more preferably no more than 15 amino acids, and no more than 14 amino acids. More preferably, it is 13 amino acids or less, more preferably 12 amino acids or less, further preferably 11 amino acids, more preferably 10 amino acids or less. More preferably, it is 9 amino acids or less, more preferably 8 amino acids or less, and 7 amino acids or less. More preferably, it is 6 amino acids or less, more preferably 5 amino acids or less, further preferably 4 amino acids or less, further preferably 4 amino acids or less. More preferably, it is more preferably 2 amino acids or less, and most preferably 1 amino acid.
アミノ酸の置換は、保存的置換であることが好ましい。なお、保存的置換とは、特定のアミノ酸から、当該アミノ酸と同様な化学的性質および／または構造を有する他のアミノ酸に置換されることをいう。化学的性質としては、例えば、疎水性度（疎水性および親水性）、電荷（中性、酸性および塩基性）が挙げられる。構造としては、例えば、側鎖、または、側鎖の官能基として存在する芳香環、脂肪炭化水素基およびカルボキシル基が挙げられる。 The amino acid substitution is preferably a conservative substitution. The conservative substitution means that a specific amino acid is substituted with another amino acid having the same chemical properties and / or structure as the amino acid. Chemical properties include, for example, hydrophobicity (hydrophobic and hydrophilic), charge (neutral, acidic and basic). Examples of the structure include an aromatic ring, an aliphatic hydrocarbon group, and a carboxyl group that exist as a side chain or a functional group of the side chain.
保存的置換の例としては、例えば、セリンとスレオニンとの置換、リジンとアルギニンとの置換、およびフェニルアラニンとトリプトファンアミノとの置換、が挙げられる。勿論、本発明は、これらの置換に限定されない。 Examples of conservative substitutions include, for example, substitution of serine and threonine, substitution of lysine and arginine, and substitution of phenylalanine and tryptophan amino. Of course, the present invention is not limited to these substitutions.
また、本発明の遺伝子には、以下の（５）のタンパク質をコードする遺伝子であって、タンパク質内に存在する全てのアルギニンが、ＣＧＴ、ＡＧＡ、または、ＡＧＧのコドンによってコードされており、タンパク質内に存在する全てのアラニンが、ＧＣＴ、ＧＣＣ、または、ＧＣＡのコドンによってコードされている遺伝子が包含されていてもよい。つまり、
（５）配列番号１または４に示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
The gene of the present invention encodes the following protein (5), and all arginines present in the protein are encoded by CGT, AGA, or AGG codons. A gene in which all alanines present therein are encoded by GCT, GCC, or GCA codons may be included. That means
(5) A protein comprising an amino acid sequence having 90% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 4, and having phosphite dehydrogenase activity.
上述した相同性は、９０％以上であればよいが、９１％以上であることが更に好ましく、９２％以上であることが更に好ましく、９３％以上であることが更に好ましく、９４％以上であることが更に好ましく、９５％以上であることが更に好ましく、９６％以上であることが更に好ましく、９７％以上であることが更に好ましく、９８％以上であることが更に好ましく、９９％以上であることが最も好ましい。 The homology described above may be 90% or more, more preferably 91% or more, further preferably 92% or more, further preferably 93% or more, and 94% or more. More preferably, it is 95% or more, more preferably 96% or more, still more preferably 97% or more, further preferably 98% or more, and 99% or more. Most preferred.
アミノ酸配列の相同性は、公知の方法で求めることができる。具体的には、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ（株式会社ゼネティックス社製）を、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮのマニュアルに従って使用し、例えば、特定のアミノ酸配列と比較対象のアミノ酸配列とのホモロジーサーチ（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｓｅａｒｃｈ）を行い、同一のアミノ酸の割合（％）として相同性を算出することができる。 Amino acid sequence homology can be determined by a known method. Specifically, GENETYX-WIN (manufactured by GENETICS Co., Ltd.) is used according to the GENETYX-WIN manual, for example, a homology search (homology search) between a specific amino acid sequence and an amino acid sequence to be compared is performed, and the same The homology can be calculated as the percentage (%) of amino acids.
更に具体的には、比較するアミノ酸配列のうちの長い方のアミノ酸配列の総アミノ酸数に対する、同一のアミノ酸の数の割合（％）として、相同性を算出することができる。 More specifically, the homology can be calculated as the ratio (%) of the number of identical amino acids to the total number of amino acids in the longer amino acid sequence of the amino acid sequences to be compared.
本発明の遺伝子では、当該遺伝子がコードするタンパク質内に存在する全てのアルギニンを、ＣＧＴ、ＡＧＡ、または、ＡＧＧという３種類のコドンによってコードしている。 In the gene of the present invention, all arginines present in the protein encoded by the gene are encoded by three types of codons, CGT, AGA, or AGG.
上述した３種類のコドンのうち、ＡＧＡというコドンが多いほど、生物内において、亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質を安定的に発現させることができる。 Of the three types of codons described above, the more the codon AGA, the more stably the phosphite dehydrogenase protein can be expressed in the organism.
各コドンの出現頻度は特に限定されないが、例えば、タンパク質内に存在するアルギニンのうちの１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上が、７０％以上、８０％以上、または、９０％以上が、ＡＧＡというコドンによってコードされ得る。 The frequency of appearance of each codon is not particularly limited. For example, 10% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more of arginine present in a protein is 70% or more. 80% or more, or 90% or more can be encoded by the codon AGA.
本発明の遺伝子では、当該遺伝子がコードするタンパク質内に存在する全てのアラニンを、ＧＣＴ、ＧＣＣ、または、ＧＣＡという３種類のコドンによってコードしている。 In the gene of the present invention, all alanines present in the protein encoded by the gene are encoded by three types of codons, GCT, GCC, and GCA.
上述した３種類のコドンのうち、ＧＣＴというコドンが多いほど、生物内において、亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質を安定的に発現させることができる。 Of the three types of codons described above, the more the codon GCT, the more stably the phosphite dehydrogenase protein can be expressed in the organism.
各コドンの出現頻度は特に限定されないが、例えば、タンパク質内に存在するアラニンのうちの１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、または、９０％以上が、ＧＣＴというコドンによってコードされ得る。 Although the frequency of appearance of each codon is not particularly limited, for example, 10% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more of alanine present in the protein, More than 80%, or more than 90% can be encoded by the codon GCT.
更に具体的に、本発明の遺伝子は、以下の（３）または（４）のＤＮＡからなるものであってもよい。つまり、
（３）配列番号３または６に示される塩基配列からなるＤＮＡ；
（４）配列番号３または６に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
More specifically, the gene of the present invention may be composed of the following DNA (3) or (4). That means
(3) DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 6;
(4) DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 6 and encodes a protein having phosphite dehydrogenase activity .
なお、配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡとは、具体的には、Pseudomonas stutzeri WM88に由来する亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子であり、配列番号６に示される塩基配列からなるＤＮＡとは、Ralstonia sp. 4506に由来する亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子である。 The DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 is specifically a phosphite dehydrogenase gene derived from Pseudomonas stutzeri WM88, and the DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 is Ralstonia It is a phosphite dehydrogenase gene derived from sp. 4506.
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することが意図されるが、ハイブリダイゼーションさせるポリヌクレオチドによって、高ストリンジェンシーでの洗浄条件は適宜変更され、例えば、哺乳類由来ＤＮＡを用いる場合は、０．１％ ＳＤＳを含む０．５×ＳＳＣ中にて６５℃での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましく、Ｅ．ｃｏｌｉ由来ＤＮＡを用いる場合は、０．１％ ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中にて６８℃での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましく、ＲＮＡを用いる場合は、０．１％ ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中にて６８℃での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましく、オリゴヌクレオチドを用いる場合は、０．１％ ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中にてハイブリダイゼーション温度での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましい。また、上記ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている周知の方法で行うことができる。 As used herein, the term “stringent conditions” refers to hybridization solutions (50% formamide, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH 7). .6) Incubate overnight at 42 ° C. in 5 × Denhart solution, 10% dextran sulfate, and 20 μg / ml denatured sheared salmon sperm DNA, then in 0.1 × SSC at about 65 ° C. However, depending on the polynucleotide to be hybridized, the washing conditions at high stringency are appropriately changed. For example, when mammalian DNA is used, 0.1% SDS containing 0.1% SDS is used. Washing at 65 ° C. in 5 × SSC (preferably 15 minutes × 2 times) is preferred. When using E. coli-derived DNA, washing at 68 ° C. in 0.1 × SSC containing 0.1% SDS (preferably 15 minutes × 2 times) is preferable, and when using RNA, 0.1% Washing at 68 ° C. in 0.1 × SSC containing SDS (preferably twice for 15 minutes) is preferable. When oligonucleotides are used, in 0.1 × SSC containing 0.1% SDS Washing at the hybridization temperature (preferably 15 minutes × 2 times) is preferred. In addition, the hybridization is described in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory (1989).
本発明の遺伝子は、周知の方法によって作製することができる。例えば、周知の変異導入方法またはコドン変換方法にしたがって、野生型の亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子内の特定のコドンを別のコドンへ置換することによって、本発明の遺伝子を作製すればよい。 The gene of the present invention can be prepared by a known method. For example, the gene of the present invention may be prepared by substituting a specific codon in the wild-type phosphite dehydrogenase gene with another codon according to a well-known mutation introduction method or codon conversion method.
＜１．亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、および、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のコドン改変型遺伝子＞
実施例に用いたアリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の野生型遺伝子、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のコドン改変型遺伝子、および、これらの遺伝子がコードするタンパク質について、以下に説明する。
<1. Phosphite dehydrogenase gene and codon-modified gene of phosphite dehydrogenase gene>
The wild type gene of the allate dehydrogenase gene, the codon-modified gene of the phosphite dehydrogenase gene, and the proteins encoded by these genes used in the examples are described below.
まず、実施例に用いたアリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の野生型遺伝子、および、亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のコドン改変型遺伝子を列挙する。 First, the wild type genes of the allate dehydrogenase gene and the codon-modified genes of the phosphite dehydrogenase gene used in the examples are listed.
ａ）Pseudomonas stutzeri WM88に由来する亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の野生型遺伝子（以下、ＰｓｐｔｘＤ遺伝子と呼ぶ（配列番号２））；
ｂ）Pseudomonas stutzeri WM88に由来する亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のコドン改変型遺伝子（以下、ＯＰ＿ＰｓｐｔｘＤ遺伝子と呼ぶ（配列番号３））；
ｃ）Ralstonia sp. 4506に由来する亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の野生型遺伝子（以下、ＲｓｐｔｘＤ遺伝子と呼ぶ（配列番号５））；
ｄ）Ralstonia sp. 4506に由来する亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のコドン改変型遺伝子（以下、ＯＰ＿ＲｓｐｔｘＤ遺伝子と呼ぶ（配列番号６））；
ｅ）Klebsiella sp. 4507に由来する亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の野生型遺伝子（以下、ＫｌｐｔｘＤ遺伝子と呼ぶ（配列番号８））。
a) a wild-type gene of a phosphite dehydrogenase gene derived from Pseudomonas stutzeri WM88 (hereinafter referred to as PsptxD gene (SEQ ID NO: 2));
b) a codon-modified gene of a phosphite dehydrogenase gene derived from Pseudomonas stutzeri WM88 (hereinafter referred to as OP_PsptxD gene (SEQ ID NO: 3));
c) a wild type gene of a phosphite dehydrogenase gene derived from Ralstonia sp. 4506 (hereinafter referred to as RsptxD gene (SEQ ID NO: 5));
d) a codon-modified gene of a phosphite dehydrogenase gene derived from Ralstonia sp. 4506 (hereinafter referred to as OP_RsptxD gene (SEQ ID NO: 6));
e) A wild type gene of a phosphite dehydrogenase gene derived from Klebsiella sp. 4507 (hereinafter referred to as KlptxD gene (SEQ ID NO: 8)).
上記ＯＰ＿ＲｓｐｔｘＤ遺伝子は、コードされているタンパク質のアミノ酸配列を変えないように、ＲｓｐｔｘＤ遺伝子内のコドンを変更した遺伝子である。 The OP_RsptxD gene is a gene in which a codon in the RsptxD gene is changed so as not to change the amino acid sequence of the encoded protein.
具体的に、ＯＰ＿ＲｓｐｔｘＤ遺伝子では、ＲｓｐｔｘＤ遺伝子内のアルギニンをコードするコドンである６個の「ＣＧＣ」、１個の「ＣＧＡ」および４個の「ＣＧＧ」の全てを、アルギニンをコードするコドンである「ＡＧＡ」に改変している。 Specifically, in the OP_RsptxD gene, all six “CGC”, one “CGA” and four “CGG”, which are codons encoding arginine in the RsptxD gene, are codons encoding arginine. It has been modified to “AGA”.
上記改変の結果、ＯＰ＿ＲｓｐｔｘＤ遺伝子は、アルギニンをコードするコドンである４個の「ＣＧＴ」、１１個の「ＡＧＡ」および２個の「ＡＧＧ」を含んでいる。 As a result of the above modification, the OP_RsptxD gene contains 4 “CGT”, 11 “AGA” and 2 “AGG” which are codons encoding arginine.
つまり、ＯＰ＿ＲｓｐｔｘＤ遺伝子がコードしているタンパク質では、当該タンパク質内に含まれるアルギニンの約６４．７％（１１／１７）が「ＡＧＡ」によってコードされ、当該タンパク質内に含まれるアルギニンの約２３．５％（４／１７）が「ＣＧＴ」によってコードされ、当該タンパク質内に含まれるアルギニンの約１１．８％（２／１７）が「ＡＧＧ」によってコードされている。 That is, in the protein encoded by the OP_RsptxD gene, about 64.7% (11/17) of arginine contained in the protein is encoded by “AGA” and about 23.5% of arginine contained in the protein. % (4/17) is encoded by “CGT” and about 11.8% (2/17) of arginine contained in the protein is encoded by “AGG”.
更に、ＯＰ＿ＲｓｐｔｘＤ遺伝子では、ＲｓｐｔｘＤ遺伝子内のアラニンをコードするコドンである１４個の「ＧＣＧ」の全てを、アラニンをコードするコドンである「ＧＣＴ」に改変している。 Further, in the OP_RsptxD gene, all 14 “GCGs” that are codons encoding alanine in the RsptxD gene are modified to “GCT” that is a codon encoding alanine.
上記改変の結果、ＯＰ＿ＲｓｐｔｘＤ遺伝子は、アラニンをコードするコドンである２３個の「ＧＣＴ」、１０個の「ＧＣＣ」および１０個の「ＧＣＡ」を含んでいる。 As a result of the above modification, the OP_RsptxD gene contains 23 “GCT”, 10 “GCC” and 10 “GCA” which are codons encoding alanine.
つまり、ＯＰ＿ＲｓｐｔｘＤ遺伝子がコードしているタンパク質では、当該タンパク質内に含まれるアラニンの約５３．４％（２３／４３）が「ＧＣＴ」によってコードされ、当該タンパク質内に含まれるアラニンの約２３．３％（１０／４３）が「ＧＣＣ」によってコードされ、当該タンパク質内に含まれるアラニンの約２３．３％（１０／４３）が「ＧＣＡ」によってコードされている。 That is, in the protein encoded by the OP_RsptxD gene, about 53.4% (23/43) of alanine contained in the protein is encoded by “GCT”, and about 23.3 of alanine contained in the protein. % (10/43) is encoded by “GCC”, and about 23.3% (10/43) of the alanine contained in the protein is encoded by “GCA”.
一方、上記ＯＰ＿ＰｓｐｔｘＤ遺伝子は、コードされているタンパク質のアミノ酸配列を変えないように、ＰｓｐｔｘＤ遺伝子内のコドンを変更した遺伝子である。 On the other hand, the OP_PsptxD gene is a gene in which the codon in the PsptxD gene is changed so as not to change the amino acid sequence of the encoded protein.
具体的に、ＯＰ＿ＰｓｐｔｘＤ遺伝子では、ＰｓｐｔｘＤ遺伝子内のアルギニンをコードするコドンである１２個の「ＣＧＣ」、２個の「ＣＧＡ」および７個の「ＣＧＧ」の全てを、アルギニンをコードするコドンである「ＡＧＡ」に改変している。 Specifically, in the OP_PsptxD gene, all of 12 “CGC”, 2 “CGA” and 7 “CGG”, which are codons encoding arginine in the PsptxD gene, are codons encoding arginine. It has been modified to “AGA”.
上記改変の結果、ＯＰ＿ＰｓｐｔｘＤ遺伝子は、アルギニンをコードするコドンである３個の「ＣＧＴ」、２２個の「ＡＧＡ」を含んでいる。 As a result of the above modification, the OP_PsptxD gene contains 3 “CGT” and 22 “AGA” which are codons encoding arginine.
つまり、ＯＰ＿ＰｓｐｔｘＤ遺伝子がコードしているタンパク質では、当該タンパク質内に含まれるアルギニンの約８８％（２２／２５）が「ＡＧＡ」によってコードされ、当該タンパク質内に含まれるアルギニンの約１２％（３／２５）が「ＣＧＴ」によってコードされている。 That is, in the protein encoded by the OP_PsptxD gene, about 88% (22/25) of arginine contained in the protein is encoded by “AGA” and about 12% (3/3) of arginine contained in the protein. 25) is encoded by “CGT”.
更に、ＯＰ＿ＰｓｐｔｘＤ遺伝子では、ＰｓｐｔｘＤ遺伝子内のアラニンをコードするコドンである２２個の「ＧＣＧ」の全てを、アラニンをコードするコドンである「ＧＣＴ」に改変している。 Further, in the OP_PsptxD gene, all 22 “GCGs” that are codons encoding alanine in the PsptxD gene are changed to “GCT” that is a codon encoding alanine.
上記改変の結果、ＯＰ＿ＰｓｐｔｘＤ遺伝子は、アラニンをコードするコドンである３２個の「ＧＣＴ」、１２個の「ＧＣＣ」および６個の「ＧＣＡ」を含んでいる。 As a result of the above modification, the OP_PsptxD gene contains 32 “GCT”, 12 “GCC” and 6 “GCA” which are codons encoding alanine.
つまり、ＯＰ＿ＰｓｐｔｘＤ遺伝子がコードしているタンパク質では、当該タンパク質内に含まれるアラニンの約６４％（３２／５０）が「ＧＣＴ」によってコードされ、当該タンパク質内に含まれるアラニンの約２４％（１２／５０）が「ＧＣＣ」によってコードされ、当該タンパク質内に含まれるアラニンの約１２％（６／５０）が「ＧＣＡ」によってコードされている。 That is, in the protein encoded by the OP_PsptxD gene, about 64% (32/50) of alanine contained in the protein is encoded by “GCT”, and about 24% (12/50) of alanine contained in the protein. 50) is encoded by “GCC”, and about 12% (6/50) of the alanine contained in the protein is encoded by “GCA”.
ＲｓｐｔｘＤ遺伝子とＯＰ＿ＲｓｐｔｘＤ遺伝子とは、単にコドンが異なるのみであって、ＲｓｐｔｘＤ遺伝子がコードするタンパク質とＯＰ＿ＲｓｐｔｘＤ遺伝子がコードするタンパク質とは、同一である（配列番号４）。 The RsptxD gene and the OP_RsptxD gene differ only in codons, and the protein encoded by the RsptxD gene and the protein encoded by the OP_RsptxD gene are the same (SEQ ID NO: 4).
ＫｌｐｔｘＤ遺伝子がコードするタンパク質（配列番号７）は、ＰｓｐｔｘＤ遺伝子がコードするタンパク質（配列番号１）と、アミノ酸レベルで相同性が非常に高い（相同性：３３５／３３７＝９９．４％）。それ故に、後述する実施例では、ＰｓｐｔｘＤ遺伝子がコードするタンパク質の代わりとして、ＫｌｐｔｘＤ遺伝子がコードするタンパク質を酵母内にて発現させている場合もある。 The protein encoded by the KlptxD gene (SEQ ID NO: 7) has very high homology at the amino acid level with the protein encoded by the PsptxD gene (SEQ ID NO: 1) (homology: 335/337 = 99.4%). Therefore, in the examples described later, the protein encoded by the KlptxD gene may be expressed in yeast instead of the protein encoded by the PsptxD gene.
また、ＰｓｐｔｘＤ遺伝子とＯＰ＿ＰｓｐｔｘＤ遺伝子とは、単にコドンが異なるのみであって、ＰｓｐｔｘＤ遺伝子がコードするタンパク質とＯＰ＿ＰｓｐｔｘＤ遺伝子がコードするタンパク質とは、同一である。 The PsptxD gene and the OP_PsptxD gene are merely different in codons, and the protein encoded by the PsptxD gene and the protein encoded by the OP_PsptxD gene are the same.
野生型遺伝子のコドンを改変したＯＰ＿ＰｓｐｔｘＤ遺伝子およびＯＰ＿ＲｓｐｔｘＤ遺伝子は、周知のコドン置換法によって作製した。更に具体的には、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）へ依頼して、ＯＰ＿ＰｓｐｔｘＤ遺伝子およびＯＰ＿ＲｓｐｔｘＤ遺伝子を作製した。 The OP_PsptxD gene and the OP_RsptxD gene in which the codons of the wild type gene were modified were prepared by a well-known codon substitution method. More specifically, GenScript (Piscataway, NJ) was requested to produce the OP_PsptxD gene and the OP_RsptxD gene.
＜２．野生型の亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を用いた、分裂酵母の形質転換＞
＜２−１．発現ベクターの作製＞
分裂酵母（シゾサッカロミセスポンベ：Schizosaccharomyces pombe）内にて亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質を発現させるために、周知の方法にしたがって、上述したＫｌｐｔｘＤ遺伝子を挿入した発現ベクターを作製した。図１に、当該発現ベクターの基本構成を示す（Matsuyama et al. 2004, Yeast）。なお、図１の「ＲｓｐｔｘＤ」と記載した箇所に、ＫｌｐｔｘＤ遺伝子が挿入されている。
<2. Transformation of fission yeast using wild-type phosphite dehydrogenase gene>
<2-1. Preparation of expression vector>
In order to express the phosphite dehydrogenase protein in fission yeast (Schizosaccharomyces pombe), an expression vector into which the above-mentioned KlptxD gene was inserted was prepared according to a well-known method. FIG. 1 shows the basic structure of the expression vector (Matsuyama et al. 2004, Yeast). In addition, the KlptxD gene is inserted at the location indicated as “RsptxD” in FIG.
具体的に、上記発現ベクターとしては、異なるプロモーターを含む、３種類の発現ベクターを作製した。 Specifically, three types of expression vectors containing different promoters were prepared as the expression vectors.
上記発現ベクターの１つ目は、ＫｌｐｔｘＤ遺伝子の上流に強力なプロモーターが挿入されている発現ベクターであって、当該発現ベクターをｐｔｘＤ−１と呼ぶ。 The first of the above expression vectors is an expression vector in which a strong promoter is inserted upstream of the KlptxD gene, and this expression vector is called ptxD-1.
上記発現ベクターの２つ目は、ＫｌｐｔｘＤ遺伝子の上流に、ｐｔｘＤ−１に含まれるプロモーターよりも弱いプロモーターが挿入されている発現ベクターであって、当該発現ベクターをｐｔｘＤ−４１と呼ぶ。 The second expression vector is an expression vector in which a promoter weaker than the promoter contained in ptxD-1 is inserted upstream of the KlptxD gene, and this expression vector is called ptxD-41.
上記発現ベクターの３つ目は、ＫｌｐｔｘＤ遺伝子の上流に、ｐｔｘＤ−４１に含まれるプロモーターよりも弱いプロモーターが挿入されている発現ベクターであって、当該発現ベクターをｐｔｘＤ−８１と呼ぶ。 The third expression vector is an expression vector in which a weaker promoter than the promoter included in ptxD-41 is inserted upstream of the KlptxD gene, and this expression vector is called ptxD-81.
上述した３種類の発現ベクターを用いて、分裂酵母であるSchizosaccharomyces pombe KSP635（Leu-）を形質転換した。なお、形質転換の具体的な方法は、周知の方法にしたがった。具体的には、以下の方法にしたがった。 The three types of expression vectors described above were used to transform Schizosaccharomyces pombe KSP635 (Leu-), a fission yeast. In addition, the specific method of transformation followed the well-known method. Specifically, the following method was followed.
＜２−２．形質転換＞
分裂酵母を３ｍＬのＹＰＡＤ培地（Bacto Yeast extract（１％）、Bacto peptone（２％）、グルコース（２％）、硫酸アデニン（４０ｍｇ））中で３０℃にて一晩培養した後、３００μＬの培養液を分取した。
<2-2. Transformation>
Fission yeast was cultured overnight at 30 ° C. in 3 mL of YPAD medium (Bacto Yeast extract (1%), Bacto peptone (2%), glucose (2%), adenine sulfate (40 mg)) and then 300 μL of culture. The liquid was collected.
当該培養液を１００００ｒｐｍ、３分間、室温にて遠心分離し、上清を捨てて、沈殿物である分裂酵母を取得した。その後、当該分裂酵母を、滅菌水で一回洗浄した後、酢酸リチウム溶液（０．１Ｍ 酢酸リチウム、ＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）ｐＨ７．５）で一回洗浄した。分裂酵母が懸濁されている酢酸リチウム溶液を１００００ｒｐｍ、３分間、室温にて遠心分離し、上清を捨てて、沈殿物である分裂酵母を取得した。 The culture solution was centrifuged at 10,000 rpm for 3 minutes at room temperature, the supernatant was discarded, and fission yeast as a precipitate was obtained. Then, the fission yeast was washed once with sterilized water, and then washed once with a lithium acetate solution (0.1 M lithium acetate, TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) pH 7.5). The lithium acetate solution in which the fission yeast was suspended was centrifuged at 10,000 rpm for 3 minutes at room temperature, and the supernatant was discarded to obtain a fission yeast as a precipitate.
取得した分裂酵母を１００μＬの酢酸リチウム溶液に懸濁し、当該懸濁液に１μｇのＤＮＡ（発現ベクター）と２μＬのキャリアーＤＮＡ（Clontech社）とを加え、軽く混ぜた。 The obtained fission yeast was suspended in 100 μL of lithium acetate solution, and 1 μg of DNA (expression vector) and 2 μL of carrier DNA (Clontech) were added to the suspension and mixed gently.
上記懸濁液を１０分間室温にて静置させた後、当該懸濁液に５０％ ＰＥＧ（ポリエチレングリコール（平均分子量：ＭＷ３３５０）、５０％（ｗ／ｖ））を２６０μＬ加え、よく混合させた後、６０分間室温にて静置させた。 After allowing the suspension to stand at room temperature for 10 minutes, 260 μL of 50% PEG (polyethylene glycol (average molecular weight: MW 3350), 50% (w / v)) was added to the suspension and mixed well. Then, it was left still at room temperature for 60 minutes.
上記懸濁液に４３μＬのＤＭＳＯ（dimethyl sulfoxide）を加え、よく混ぜた後、当該懸濁液を、５分間、４２℃に加熱した。 After 43 μL of DMSO (dimethyl sulfoxide) was added to the suspension and mixed well, the suspension was heated to 42 ° C. for 5 minutes.
その後、上記懸濁液を６０００ｒｐｍ、２分間、室温にて遠心分離し、上清を捨てて、沈殿物である分裂酵母を取得した。当該分裂酵母を、更に滅菌水で２回洗浄して、試験に用いる分裂酵母を得た。 Thereafter, the suspension was centrifuged at 6000 rpm for 2 minutes at room temperature, and the supernatant was discarded to obtain fission yeast as a precipitate. The fission yeast was further washed twice with sterilized water to obtain a fission yeast used for the test.
＜２−３．酵母の培養＞
上記＜２−２．形質転換＞にて得られた分裂酵母を、２種類の液体培地中にて、３０℃にて培養した。
<2-3. Yeast culture>
<2-2. The fission yeast obtained in <Transformation> was cultured at 30 ° C. in two types of liquid media.
２種類の液体培地の１つとして、リン源としてリン酸を含んでいるＥＭＭ最小培地（フタル酸カリウム（３ｇ／Ｌ）、デキストロース（２０ｇ／Ｌ）、ＮＨ４Ｃｌ（５ｇ／Ｌ）、リン酸（１５ｍＭ）、ミネラルおよびビタミン類を含む）を用いた。 As one of the two types of liquid media, EMM minimal medium (potassium phthalate (3 g / L), dextrose (20 g / L), NH 4 Cl (5 g / L), phosphoric acid) containing phosphoric acid as a phosphorus source (15 mM), including minerals and vitamins).
２種類の液体培地の他方として、リン源として亜リン酸を含んでいるＥＭＭ最小培地（フタル酸カリウム（３ｇ／Ｌ）、デキストロース（２０ｇ／Ｌ）、ＮＨ４Ｃｌ（５ｇ／Ｌ）、亜リン酸（１５ｍＭ）、ミネラルおよびビタミン類を含む）を用いた。 EMM minimal medium containing potassium phosphite as a phosphorus source (potassium phthalate (3 g / L), dextrose (20 g / L), NH 4 Cl (5 g / L), phosphorous) Acid (15 mM), minerals and vitamins included).
培養を開始してから経時的に液体培地をサンプリングし、当該液体培地のＯＤ６００を測定して、分裂酵母の増殖状況を確認した。 The liquid medium was sampled over time after the start of culture, and the OD600 of the liquid medium was measured to confirm the growth status of fission yeast.
＜２−４．試験結果＞
図２に、分裂酵母の増殖を表すグラフを示す。
<2-4. Test results>
FIG. 2 shows a graph representing the growth of fission yeast.
図２において「ｐｔｘＤ−１」は、ｐｔｘＤ−１を用いて形質転換された分裂酵母を、亜リン酸を含んでいるＥＭＭ最小培地にて培養した場合の試験結果を示している。
また、図２において「ｐｔｘＤ−１（Ｐｉ）」は、ｐｔｘＤ−１を用いて形質転換された分裂酵母を、リン酸を含んでいるＥＭＭ最小培地にて培養した場合の試験結果を示している。
In FIG. 2, “ptxD-1” indicates a test result when fission yeast transformed with ptxD-1 is cultured in an EMM minimal medium containing phosphorous acid.
In FIG. 2, “ptxD-1 (Pi)” indicates a test result when fission yeast transformed with ptxD-1 is cultured in an EMM minimal medium containing phosphate. .
図２において「ｐｔｘＤ−４１」は、ｐｔｘＤ−４１を用いて形質転換された分裂酵母を、亜リン酸を含んでいるＥＭＭ最小培地にて培養した場合の試験結果を示している。 In FIG. 2, “ptxD-41” indicates a test result when fission yeast transformed with ptxD-41 is cultured in an EMM minimal medium containing phosphorous acid.
図２において「ｐｔｘＤ−８１」は、ｐｔｘＤ−８１を用いて形質転換された分裂酵母を、亜リン酸を含んでいるＥＭＭ最小培地にて培養した場合の試験結果を示している。 In FIG. 2, “ptxD-81” indicates the test result when fission yeast transformed with ptxD-81 is cultured in an EMM minimal medium containing phosphorous acid.
図２において「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は、ＲｓｐｔｘＤ遺伝子が挿入されていない発現ベクターを用いて形質転換された分裂酵母を、亜リン酸を含んでいるＥＭＭ最小培地にて培養した場合の試験結果を示している。 In FIG. 2, “Control” indicates the test results when fission yeast transformed with an expression vector into which the RsptxD gene has not been inserted is cultured in an EMM minimal medium containing phosphorous acid. .
図２に示すように、弱いプロモーターと野生型の亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子との組み合わせの場合、分裂酵母は、亜リン酸を含む培地では増殖速度が遅いことが明らかになった。 As shown in FIG. 2, in the case of a combination of a weak promoter and a wild-type phosphite dehydrogenase gene, it was revealed that fission yeast has a slow growth rate in a medium containing phosphite.
一方、図２に示すように、強いプロモーターと野生型の亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子との組み合わせの場合、分裂酵母は、リン酸を含む培地の場合と同様に、亜リン酸を含む培地において増殖速度が速いことが明らかになった。 On the other hand, as shown in FIG. 2, in the case of a combination of a strong promoter and a wild-type phosphite dehydrogenase gene, fission yeast grows in a medium containing phosphorous acid in the same manner as in a medium containing phosphoric acid. Was found to be fast.
以上のことは、野生型の亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を分裂酵母の選択マーカーとして使用できることを示しているが、選択マーカーとして使用するためには、強力なプロモーターが必要であることも示している。 Although the above shows that the wild-type phosphite dehydrogenase gene can be used as a selection marker for fission yeast, it also indicates that a strong promoter is required for use as a selection marker.
また、このことは、分裂酵母における野生型の亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を用いたタンパク質の発現性能は十分ではあるものの、当該発現性能については、更なる改良の余地があることを示している。 This also indicates that although the expression performance of the protein using the wild-type phosphite dehydrogenase gene in fission yeast is sufficient, there is room for further improvement in the expression performance.
＜３．野生型の亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を用いた、出芽酵母の形質転換＞
＜３−１．発現ベクターの作製＞
出芽酵母（サッカロミセスセレビシエ：Saccharomyces cerevisiae）内にて亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質を発現させるために、周知の方法にしたがって、上述したＲｓｐｔｘＤ遺伝子を挿入した発現ベクターを作製した。図３に、当該発現ベクターの基本構成を示す。なお、図３に示すベクターは、出芽酵母用の発現ベクターであるＹＥｐ２４にＲｓｐｔｘＤ遺伝子を挿入することによって作製されている。
<3. Transformation of Saccharomyces cerevisiae Using Wild-type Phosphite Dehydrogenase Gene>
<3-1. Preparation of expression vector>
In order to express the phosphite dehydrogenase protein in budding yeast (Saccharomyces cerevisiae), an expression vector into which the above-described RsptxD gene was inserted was prepared according to a well-known method. FIG. 3 shows the basic configuration of the expression vector. The vector shown in FIG. 3 is prepared by inserting the RsptxD gene into YEp24, which is an expression vector for budding yeast.
＜３−２．形質転換、および、酵母の培養＞
上述した＜２−２．形質転換＞に記載の方法にしたがって、図３に示す発現ベクターを用いて、出芽酵母を形質転換した。
<3-2. Transformation and yeast culture>
<2-2. According to the method described in <Transformation>, a budding yeast was transformed with the expression vector shown in FIG.
そして、上述した＜２−３．酵母の培養＞に記載の方法にしたがって、形質転換された出芽酵母を培養した。 And <2-3. The transformed budding yeast was cultured according to the method described in <Culture of yeast>.
＜３−３．試験結果＞
図３に示す発現ベクター（換言すれば、野生型の亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が挿入された発現ベクター）にて形質転換された出芽酵母は、亜リン酸を含む培地では全く増殖できなかった。
<3-3. Test results>
Saccharomyces cerevisiae transformed with the expression vector shown in FIG. 3 (in other words, an expression vector into which a wild type phosphite dehydrogenase gene was inserted) could not grow at all in a medium containing phosphorous acid.
更に具体的には、野生型の亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が挿入された発現ベクターによって形質転換された出芽酵母は、野生型の亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が挿入された発現ベクターによって形質転換された分裂酵母と比較して、亜リン酸を含む培地における増殖能力が、はるかに劣っていた。 More specifically, a budding yeast transformed with an expression vector into which a wild-type phosphite dehydrogenase gene has been inserted is a fission yeast transformed with an expression vector into which a wild-type phosphite dehydrogenase gene has been inserted. Compared with, the growth ability in the medium containing phosphorous acid was much inferior.
＜４．コドンを置換した亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を用いた、出芽酵母の形質転換−１＞
＜４−１．発現ベクターの作製＞
出芽酵母（サッカロミセスセレビシエ：Saccharomyces cerevisiae）内にて、コドンが置換された亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を用いて亜リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質を発現させるために、周知の方法にしたがって、上述したＯＰ＿ＰｓｐｔｘＤ遺伝子、または、ＯＰ＿ＲｓｐｔｘＤ遺伝子を挿入した発現ベクターを作製した。
<4. Transformation of Saccharomyces cerevisiae Using Codon-Substituted Phosphite Dehydrogenase Gene-1>
<4-1. Preparation of expression vector>
In order to express a phosphite dehydrogenase protein in a budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) using a codon-substituted phosphite dehydrogenase gene, the OP_PsptxD gene described above or An expression vector into which the OP_RsptxD gene was inserted was prepared.
図４に、当該発現ベクターの基本構成を示す。なお、当該発現ベクターでは、図４に記載の「ＯＰＴｐｔｘＤ」の位置に、ＯＰ＿ＰｓｐｔｘＤ遺伝子、または、ＯＰ＿ＲｓｐｔｘＤ遺伝子が挿入されている。 FIG. 4 shows the basic configuration of the expression vector. In the expression vector, the OP_PsptxD gene or the OP_RsptxD gene is inserted at the position of “OPTptxD” shown in FIG.
＜４−２．形質転換、および、酵母の培養＞
上述した＜２−２．形質転換＞に記載の方法にしたがって、図４に示す発現ベクターを用いて、様々な出芽酵母の株を形質転換した。
<4-2. Transformation and yeast culture>
<2-2. According to the method described in <Transformation>, various budding yeast strains were transformed with the expression vector shown in FIG.
具体的に、上記株としては、当該分野において一般的に用いられているＷ３０３ａ、Ｋｙｏｋａｉ６、Ｋｙｏｋａｉ７、Ｋｙｏｋａｉ９、および、Ｓｈｏｃｈｕ ＳＨ４を用いた。 Specifically, W303a, Kyokai6, Kyokai7, Kyokai9, and Shochu SH4, which are generally used in this field, were used as the strain.
得られた出芽酵母の形質転換体を、リン源として亜リン酸を含んでいる、固体状のＳＤＭ最小培地（Yeast Nitrogen Base without Amino Acid and without Phosphate（Formedium）（５．８ｇ／Ｌ）、デキストロース（２％）、亜リン酸（７．５ｍＭ））上にて、３０℃にて１０日間培養した。 The obtained Saccharomyces cerevisiae transformant was prepared by using solid SDM minimal medium (Yeast Nitrogen Base without Amino Acid and Without Phosphate (Formedium) (5.8 g / L), dextrose) containing phosphorous acid as a phosphorus source. (2%) and phosphorous acid (7.5 mM) were cultured at 30 ° C. for 10 days.
＜４−３．試験結果＞
１０日間の培養の後、固体状のＳＤＭ最小培地上に出現したコロニーの数をカウントした。なお、各株に対して独立して３回の試験を行い、これらの３回の試験の平均値として、試験結果を算出した。
<4-3. Test results>
After 10 days of culture, the number of colonies that appeared on the solid SDM minimal medium was counted. Each strain was independently tested three times, and the test result was calculated as an average value of these three tests.
以下の表に、ＯＰ＿ＲｓｐｔｘＤ遺伝子を挿入した発現ベクターによって形質転換された酵母の試験結果を示す。 The following table shows the test results of yeast transformed with an expression vector inserted with the OP_RsptxD gene.
表から明らかなように、コドンを置換した亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を用いて形質転換した酵母は、リン源として亜リン酸を含んでいる培地であっても、活発に増殖することができた。 As is apparent from the table, the yeast transformed with the codon-substituted phosphite dehydrogenase gene was able to grow actively even in a medium containing phosphorous acid as a phosphorus source.
＜５．コドンを置換した亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を用いた、出芽酵母の形質転換−２＞
＜５−１．発現ベクターの作製＞
上述した＜４−１．発現ベクターの作製＞に記載の方法にしたがって、ＰｓｐｔｘＤ遺伝子、または、ＲｓｐｔｘＤ遺伝子が挿入されている発現ベクターを作製した。
<5. Transformation of Saccharomyces cerevisiae Using Codon-Substituted Phosphite Dehydrogenase Gene-2>
<5-1. Preparation of expression vector>
<4-1. An expression vector into which the PsptxD gene or the RsptxD gene was inserted was prepared according to the method described in <Production of expression vector>.
＜５−２．形質転換、および、酵母の培養＞
ＰｓｐｔｘＤ遺伝子が挿入されている発現ベクター、ＲｓｐｔｘＤ遺伝子が挿入されている発現ベクター、ＯＰ＿ＰｓｐｔｘＤ遺伝子が挿入されている発現ベクター（＜４−１＞参照）、ＯＰ＿ＲｓｐｔｘＤ遺伝子が挿入されている発現ベクター（＜４−１＞参照）、および、遺伝子が挿入されていない空の発現ベクターの各々を用いて、出芽酵母の株の１つであるＷ３０３ａを形質転換した。
<5-2. Transformation and yeast culture>
An expression vector in which the PsptxD gene is inserted, an expression vector in which the RsptxD gene is inserted, an expression vector in which the OP_PsptxD gene is inserted (see <4-1>), an expression vector in which the OP_RsptxD gene is inserted (<4 -1>) and an empty expression vector into which no gene was inserted were used to transform W303a, which is one of the budding yeast strains.
得られた５種類の形質転換体を、リン源として亜リン酸を含んでいる、液体状のＳＤＭ最小培地（Yeast Nitrogen Base without Amino Acid and without Phosphate（Formedium）（５．８ｇ／Ｌ）、デキストロース（２％）、亜リン酸（７．５ｍＭ））中にて、３０℃にて培養した。そして、経時的にＳＤＭ最小培地をサンプリングし、当該ＳＤＭ最小培地のＯＤ６００（換言すれば、酵母の増殖）を測定した。 The obtained five types of transformants were prepared by using liquid SDM minimal medium (Yeast Nitrogen Base without Amino Acid and without Phosphate (Formedium) (5.8 g / L), dextrose) containing phosphorous acid as a phosphorus source. (2%) and phosphorous acid (7.5 mM) were cultured at 30 ° C. Then, the SDM minimum medium was sampled over time, and the OD 600 (in other words, yeast growth) of the SDM minimum medium was measured.
＜５−３．試験結果＞
図５に、ＰｓｐｔｘＤ遺伝子が挿入されている発現ベクター、ＲｓｐｔｘＤ遺伝子が挿入されている発現ベクター、または、遺伝子が挿入されていない空の発現ベクターによって形質転換されている形質転換体の試験結果を示す。
<5-3. Test results>
FIG. 5 shows the test results of an transformant transformed with an expression vector into which the PsptxD gene has been inserted, an expression vector into which the RsptxD gene has been inserted, or an empty expression vector into which no gene has been inserted. .
図５に示すように、これらの形質転換体は、リン源として亜リン酸を含んでいる培地では、全く増殖しなかった。 As shown in FIG. 5, these transformants did not grow at all in a medium containing phosphorous acid as a phosphorus source.
図６に、ＯＰ＿ＰｓｐｔｘＤ遺伝子が挿入されている発現ベクター、ＯＰ＿ＲｓｐｔｘＤ遺伝子が挿入されている発現ベクター、または、遺伝子が挿入されていない空の発現ベクターによって形質転換されている形質転換体の試験結果を示す。 FIG. 6 shows the test results of an transformant transformed with an expression vector into which the OP_PsptxD gene is inserted, an expression vector into which the OP_RsptxD gene is inserted, or an empty expression vector into which no gene is inserted. .
図６に示すように、ＯＰ＿ＰｓｐｔｘＤ遺伝子が挿入されている発現ベクター、または、ＯＰ＿ＲｓｐｔｘＤ遺伝子が挿入されている発現ベクターによって形質転換されている形質転換体は、リン源として亜リン酸を含んでいる培地において増殖することができた。 As shown in FIG. 6, an expression vector into which the OP_PsptxD gene is inserted or a transformant transformed with an expression vector into which the OP_RsptxD gene is inserted contains a medium containing phosphorous acid as a phosphorus source. Could proliferate.
なお、図５および６において「ＷＴ」は、遺伝子が挿入されていない空の発現ベクターによって形質転換されている形質転換体の試験結果を示している。 In FIG. 5 and FIG. 6, “WT” indicates the test results of transformants transformed with an empty expression vector into which no gene has been inserted.
本発明は、出芽酵母の選択的培養に利用することができる。 The present invention can be used for selective culture of budding yeast.
更に具体的に、本発明は、バイオ燃料の生産をはじめとする、出芽酵母を利用した物質生産の分野において広く利用することができる。 More specifically, the present invention can be widely used in the field of substance production using budding yeast, including biofuel production.
Claims (12)
（１）配列番号１または４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号１または４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。 The method for selectively culturing budding yeast according to any one of claims 1 to 3, wherein the gene encodes the following protein (1) or (2):
(1) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 4;
(2) A protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 4, and having phosphite dehydrogenase activity.
（３）配列番号３または６に示される塩基配列からなるＤＮＡ；
（４）配列番号３または６に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。 The method for selective culturing budding yeast according to any one of claims 1 to 4, wherein the gene comprises the following DNA (3) or (4):
(3) DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 6;
(4) DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 6 and encodes a protein having phosphite dehydrogenase activity .
上記タンパク質内に存在する全てのアルギニンが、ＣＧＴ、ＡＧＡ、または、ＡＧＧのコドンによってコードされており、
上記タンパク質内に存在する全てのアラニンが、ＧＣＴ、ＧＣＣ、または、ＧＣＡのコドンによってコードされていることを特徴とする遺伝子。 A gene encoding a protein having phosphite dehydrogenase activity,
All arginines present in the protein are encoded by CGT, AGA or AGG codons;
A gene characterized in that all alanines present in the protein are encoded by GCT, GCC, or GCA codons.
（１）配列番号１または４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号１または４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。 The gene according to any one of claims 8 to 10, which encodes the following protein (1) or (2):
(1) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 4;
(2) A protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 4, and having phosphite dehydrogenase activity.
（３）配列番号３または６に示される塩基配列からなるＤＮＡ；
（４）配列番号３または６に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。 The gene according to any one of claims 8 to 11, which comprises the following DNA (3) or (4):
(3) DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 6;
(4) DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 6 and encodes a protein having phosphite dehydrogenase activity .
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