JP2015092853A - Supplementary pcr primer set for als disease related gene sequence analysis, analyzing method of als disease related gene sequence, and inspection method of als disease - Google Patents

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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a supplementary PCR primer set for ALS disease related gene sequence analysis which can analyze gene sequence of ALS disease related gene unanalyzable in the conventional amyotrophic lateral sclerosis (ALS)-PCR primer set.SOLUTION: The invention provides a supplementary PCR primer set for ALS disease related gene sequence analysis comprising at least one kind of PCR primer set selected from the first to 42nd PCR primer sets consisting of a specific gene sequences.

Description

本発明は、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ；以下、「ＡＬＳ」と記載することがある。）疾患関連遺伝子配列解析用の補足ＰＣＲプライマーセット（以下、ＡＬＳ疾患関連遺伝子配列解析用の補足ＰＣＲプライマーセットを「ＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセット」と記載することがある。）に関する発明であって、特に、（１）従来から用いられているＡＬＳ疾患関連遺伝子配列解析用のＰＣＲプライマーセット（以下、従来から用いられているＡＬＳ疾患関連遺伝子配列解析用のＰＣＲプライマーセットを「ＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセット」と記載することがある。）と組み合わせてＰＣＲを行うことでＡＬＳ疾患関連遺伝子の遺伝子配列を解析する、又は（２）ＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセットとは別にＰＣＲを行い、ＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセット及びＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットを用いて得られた遺伝子配列情報を組合せてＡＬＳ疾患関連遺伝子の遺伝子配列を解析することで、従来のＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセットでは解析することができなかった遺伝子配列部分を解析するためのＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットに関する。また、本発明は、該ＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットを用いたＡＬＳ疾患関連遺伝子配列の解析方法、及び前記解析方法により得られたＡＬＳ疾患関連遺伝子配列を用いたＡＬＳ疾患の検査方法に関する。   The present invention relates to a complementary PCR primer set for analyzing an amyotrophic lateral sclerosis (hereinafter sometimes referred to as “ALS”) disease-related gene sequence (hereinafter referred to as an ALS disease-related gene sequence analysis). In particular, (1) a PCR primer set for analyzing an ALS disease-related gene sequence that has been used in the past (hereinafter, referred to as “ALS complementary PCR primer set”). Hereinafter, a conventional PCR primer set for analyzing an ALS disease-related gene sequence may be referred to as an “ALS-PCR primer set”). Or (2) ALS-PCR By performing PCR separately from the Immerset and combining the gene sequence information obtained using the ALS-PCR primer set and the ALS supplemented PCR primer set, the gene sequence of the ALS disease-related gene is analyzed, so that the conventional ALS-PCR The present invention relates to an ALS-supplemented PCR primer set for analyzing a gene sequence portion that could not be analyzed with the primer set. The present invention also relates to a method for analyzing an ALS disease-related gene sequence using the ALS-supplemented PCR primer set, and a method for examining an ALS disease using an ALS disease-related gene sequence obtained by the analysis method.

ＡＬＳは、重篤な筋肉の萎縮と筋力低下をきたす神経変性疾患で、運動ニューロン病の一種である。ＡＬＳは、極めて進行が速く、人工呼吸器の装着による延命は可能であるものの、半数ほどが発症後３年から５年で呼吸筋麻痺により死亡する。ＡＬＳは進行性の重篤な疾患であるため、早期検査や早期治療が望まれる。   ALS is a neurodegenerative disease that causes severe muscle atrophy and weakness, and is a type of motor neuron disease. Although ALS is extremely fast and life can be prolonged by wearing a ventilator, about half die from respiratory muscle paralysis 3 to 5 years after onset. Since ALS is a progressive serious disease, early examination and early treatment are desired.

ＡＬＳの検査方法としては、例えば、脳脊髄液から単離した幹細胞内のＨ３Ｋ２７のメチル化のレベルを調べる方法（特許文献１参照）、生体から分離した試料のイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ１遺伝子及び／又はイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ２遺伝子のコピー数を測定する方法（特許文献２参照）、ＺＮＦ５１２Ｂ遺伝子の一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて筋萎縮性側索硬化症を検査する方法（特許文献３参照）、等が知られている。   Examples of ALS testing methods include a method for examining the level of H3K27 methylation in stem cells isolated from cerebrospinal fluid (see Patent Document 1), isopentenyl diphosphate isomerase 1 gene in a sample isolated from a living body, and / Or a method for measuring the copy number of isopentenyl diphosphate isomerase 2 gene (see Patent Document 2), single nucleotide polymorphism of ZNF512B gene is analyzed, and amyotrophic lateral sclerosis is examined based on the analysis result And the like (see Patent Document 3).

ＡＬＳ疾患関連遺伝子の遺伝子配列を解析するためには、従来はＳａｎｇｅｒ法を活用したシークエンサーで１つ１つのＡＬＳ疾患関連遺伝子をＰＣＲ法で増幅した上で読んで行く必要があり、検査に時間が要するという問題があった。しかしながら、近年は次世代シークエンサーが開発され、複数のＰＣＲプライマーセットを用いてゲノム上の広い範囲を一回のシークエンスで読めるようになってきた。   In order to analyze the gene sequence of an ALS disease-related gene, conventionally, it is necessary to read each ALS disease-related gene after it has been amplified by the PCR method using a sequencer utilizing the Sanger method. There was a problem that it took. However, in recent years, next-generation sequencers have been developed, and a wide range on the genome can be read with a single sequence using a plurality of PCR primer sets.

ところで、次世代シークエンサーの開発により、遺伝子配列の解析速度は著しく向上し、また、解析に要する費用は低くなってきたものの、患者の全ゲノムを解析することは、依然として時間が必要で且つコストも要するため現実的ではない。そのため、一般的には、目的とする遺伝子の遺伝子配列を解析する場合には、マルチプレックスＰＣＲなどの技術を用いて、目的とする遺伝子の遺伝子配列のみを抽出する必要がある。現在、複数の会社から、ゲノム上の目的とする遺伝子を増幅して遺伝子配列を解析するためのＰＣＲプライマーセットが発売されており、ＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセットについても入手することができる。   By the way, with the development of the next-generation sequencer, the analysis speed of gene sequences has been remarkably improved, and the cost required for the analysis has been reduced, but it still takes time and cost to analyze the whole genome of a patient. It is not realistic because it requires. Therefore, in general, when analyzing the gene sequence of the target gene, it is necessary to extract only the gene sequence of the target gene using a technique such as multiplex PCR. Currently, PCR primer sets for analyzing a gene sequence by amplifying a target gene on a genome from a plurality of companies are on the market, and ALS-PCR primer sets can also be obtained.

しかしながら、一般的に入手できるＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセットを用いた遺伝子配列解析では、ＡＬＳ疾患関連遺伝子の全ての配列を解析することができず、ＡＬＳ疾患の有無を検査するための方法としては不十分で、臨床の場で使用するには信頼性が低いという問題がある。   However, gene sequence analysis using a generally available ALS-PCR primer set cannot analyze all sequences of ALS disease-related genes, and is insufficient as a method for examining the presence or absence of ALS disease. However, there is a problem that it is not reliable for use in clinical settings.

特表２０１３−５２６７０５号公報Special table 2013-526705 gazette 特開２０１２−８５６３９号公報JP 2012-85639 A 特開２０１１−５５７２９号公報JP 2011-55729A

本発明は、上記従来の問題を解決するためになされた発明であり、鋭意研究を行ったところ、入手可能なＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセットは、公知のＡＬＳ疾患関連遺伝子２８種類の内、１２種類のＡＬＳ疾患関連遺伝子に関しては全ての遺伝子配列を解析していないことを発見した。そして、前記１２種類のＡＬＳ疾患関連遺伝子の未解析遺伝子配列部分を解析できる４２種類のＰＣＲプライマーセットを新たに設計し、ＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセットと組み合わせて用いることで、公知の２８種類のＡＬＳ疾患関連遺伝子の遺伝子配列を全て解析できること、及び、解析したＡＬＳ疾患関連遺伝子の遺伝子配列からＡＬＳ疾患を正確に検査できることを新たに見出し、本発明を完成した。   The present invention has been made in order to solve the above-mentioned conventional problems. As a result of extensive research, the available ALS-PCR primer sets include 12 types of 28 known ALS disease-related genes. It was discovered that not all gene sequences were analyzed for ALS disease-related genes. Then, 42 kinds of PCR primer sets capable of analyzing the unanalyzed gene sequence portion of the 12 kinds of ALS disease-related genes are newly designed and used in combination with the ALS-PCR primer set, so that 28 kinds of known ALS diseases The present invention was completed by newly discovering that all gene sequences of related genes can be analyzed and that ALS diseases can be accurately examined from the analyzed gene sequences of ALS disease-related genes.

すなわち、本発明の目的は、ＡＬＳ疾患関連遺伝子配列解析用の補足ＰＣＲプライマーセット、該ＰＣＲプライマーセットを用いたＡＬＳ疾患関連遺伝子配列の解析方法、及びＡＬＳ疾患の検査方法を提供することである。   That is, an object of the present invention is to provide a complementary PCR primer set for analyzing an ALS disease-related gene sequence, an ALS disease-related gene sequence analysis method using the PCR primer set, and an ALS disease test method.

本発明は、以下に示す、ＡＬＳ疾患関連遺伝子配列解析用の補足ＰＣＲプライマーセット、ＡＬＳ疾患関連遺伝子配列の解析方法、及びＡＬＳ疾患の検査方法に関する。   The present invention relates to the following complementary PCR primer set for analyzing an ALS disease-related gene sequence, an ALS disease-related gene sequence analysis method, and an ALS disease test method.

（１）配列番号１及び２に記載の塩基配列からなる第１ＰＣＲプライマーセット、配列番号３及び４に記載の塩基配列からなる第２ＰＣＲプライマーセット、配列番号５及び６に記載の塩基配列からなる第３ＰＣＲプライマーセット、配列番号７及び８に記載の塩基配列からなる第４ＰＣＲプライマーセット、配列番号９及び１０に記載の塩基配列からなる第５ＰＣＲプライマーセット、配列番号１１及び１２に記載の塩基配列からなる第６ＰＣＲプライマーセット、配列番号１３及び１４に記載の塩基配列からなる第７ＰＣＲプライマーセット、配列番号１５及び１６に記載の塩基配列からなる第８ＰＣＲプライマーセット、配列番号１７及び１８に記載の塩基配列からなる第９ＰＣＲプライマーセット、配列番号１９及び２０に記載の塩基配列からなる第１０ＰＣＲプライマーセット、配列番号２１及び２２に記載の塩基配列からなる第１１ＰＣＲプライマーセット、配列番号２３及び２４に記載の塩基配列からなる第１２ＰＣＲプライマーセット、配列番号２５及び２６に記載の塩基配列からなる第１３ＰＣＲプライマーセット、配列番号２７及び２８に記載の塩基配列からなる第１４ＰＣＲプライマーセット、配列番号２９及び３０に記載の塩基配列からなる第１５ＰＣＲプライマーセット、配列番号３１及び３２に記載の塩基配列からなる第１６ＰＣＲプライマーセット、配列番号３３及び３４に記載の塩基配列からなる第１７ＰＣＲプライマーセット、配列番号３５及び３６に記載の塩基配列からなる第１８ＰＣＲプライマーセット、配列番号３７及び３８に記載の塩基配列からなる第１９ＰＣＲプライマーセット、配列番号３９及び４０に記載の塩基配列からなる第２０ＰＣＲプライマーセット、配列番号４１及び４２に記載の塩基配列からなる第２１ＰＣＲプライマーセット、配列番号４３及び４４に記載の塩基配列からなる第２２ＰＣＲプライマーセット、配列番号４５及び４６に記載の塩基配列からなる第２３ＰＣＲプライマーセット、配列番号４７及び４８に記載の塩基配列からなる第２４ＰＣＲプライマーセット、配列番号４９及び５０に記載の塩基配列からなる第２５ＰＣＲプライマーセット、配列番号５１及び５２に記載の塩基配列からなる第２６ＰＣＲプライマーセット、配列番号５３及び５４に記載の塩基配列からなる第２７ＰＣＲプライマーセット、配列番号５５及び５６に記載の塩基配列からなる第２８ＰＣＲプライマーセット、配列番号５７及び５８に記載塩基配列からなる第２９ＰＣＲプライマーセット、配列番号５９及び６０に記載の塩基配列からなる第３０ＰＣＲプライマーセット、配列番号６１及び６２に記載の塩基配列からなる第３１ＰＣＲプライマーセット、配列番号６３及び６４に記載の塩基配列からなる第３２ＰＣＲプライマーセット、配列番号６５及び６６に記載の塩基配列からなる第３３ＰＣＲプライマーセット、配列番号６７及び６８に記載の塩基配列からなる第３４ＰＣＲプライマーセット、配列番号６９及び７０に記載の塩基配列からなる第３５ＰＣＲプライマーセット、配列番号７１及び７２に記載の塩基配列からなる第３６ＰＣＲプライマーセット、配列番号７３及び７４に記載の塩基配列からなる第３７ＰＣＲプライマーセット、配列番号７５及び７６に記載の塩基配列からなる第３８ＰＣＲプライマーセット、配列番号７７及び７８に記載の塩基配列からなる第３９ＰＣＲプライマーセット、配列番号７９及び８０に記載の塩基配列からなる第４０ＰＣＲプライマーセット、配列番号８１及び８２に記載の塩基配列からなる第４１ＰＣＲプライマーセット、配列番号８３及び８４に記載の塩基配列からなる第４２ＰＣＲプライマーセット、から選択される少なくとも１種のＰＣＲプライマーセットを含むことを特徴とする筋萎縮性側索硬化症疾患関連遺伝子配列解析用の補足ＰＣＲプライマーセット。
（２）前記第１〜第４２ＰＣＲプライマーセットを全て含むことを特徴とする上記（１）に記載の筋萎縮性側索硬化症疾患関連遺伝子配列解析用の補足ＰＣＲプライマーセット。
（３）上記（１）又は（２）に記載の筋萎縮性側索硬化症疾患関連遺伝子配列解析用の補足ＰＣＲプライマーセットを用いて、被検体から抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとした筋萎縮性側索硬化症疾患関連遺伝子の塩基配列を決定することを特徴とする筋萎縮性側索硬化症疾患関連遺伝子配列の解析方法。
（４）上記（３）に記載の解析方法により得られた筋萎縮性側索硬化症疾患関連遺伝子配列情報を用いて、既知の筋萎縮性側索硬化症疾患関連遺伝子配列と比較することを特徴とする筋萎縮性側索硬化症疾患の検査方法。 (1) a first PCR primer set comprising the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 1 and 2, a second PCR primer set comprising the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 3 and 4, and a first PCR primer set comprising the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 5 and 6. 3 PCR primer set, 4th PCR primer set consisting of base sequences set forth in SEQ ID NOs: 7 and 8, 5th PCR primer set consisting of base sequences set forth in SEQ ID NOs: 9 and 10, and consisting of base sequences set forth in SEQ ID NOs: 11 and 12 From the sixth PCR primer set, the seventh PCR primer set consisting of the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 13 and 14, the eighth PCR primer set consisting of the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 15 and 16, and the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 17 and 18 The ninth PCR primer set, the salt of SEQ ID NOS: 19 and 20 The 10th PCR primer set comprising the sequences, the 11th PCR primer set comprising the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 21 and 22, the 12th PCR primer set comprising the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 23 and 24, and the sequences described in SEQ ID NOs: 25 and 26 The 13th PCR primer set consisting of the base sequence, the 14th PCR primer set consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NOs: 27 and 28, the 15th PCR primer set consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NOs: 29 and 30, and the sequence numbers 31 and 32 The 16th PCR primer set consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 33 and 34, the 17th PCR primer set consisting of the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 33 and 34, the 18th PCR primer set consisting of the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 35 and 36, Listed salt The 19th PCR primer set consisting of the sequences, the 20th PCR primer set consisting of the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 39 and 40, the 21st PCR primer set consisting of the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 41 and 42, and the sequences described in SEQ ID NOs: 43 and 44 The 22nd PCR primer set consisting of the base sequence, the 23rd PCR primer set consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NOs: 45 and 46, the 24th PCR primer set consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NOs: 47 and 48, and the sequence numbers 49 and 50 The 25th PCR primer set consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 51 and 52, the 26th PCR primer set consisting of the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 51 and 52, the 27th PCR primer set consisting of the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 53 and 54, Listed bases The 28th PCR primer set comprising the sequences, the 29th PCR primer set comprising the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 57 and 58, the 30th PCR primer set comprising the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 59 and 60, and the bases set forth in SEQ ID NOs: 61 and 62 The 31st PCR primer set consisting of the sequences, the 32nd PCR primer set consisting of the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 63 and 64, the 33rd PCR primer set consisting of the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 65 and 66, and the sequence numbers 67 and 68 34th PCR primer set consisting of base sequences, 35th PCR primer set consisting of base sequences set forth in SEQ ID NOs: 69 and 70, 36th PCR primer set consisting of base sequences set forth in SEQ ID NOs: 71 and 72, and SEQ ID NOs: 73 and 74 Base configuration A 37th PCR primer set consisting of: a 38th PCR primer set consisting of the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 75 and 76; a 39th PCR primer set consisting of the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 77 and 78; and the bases set forth in SEQ ID NOs: 79 and 80 At least one selected from the 40th PCR primer set comprising the sequences, the 41st PCR primer set comprising the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 81 and 82, and the 42nd PCR primer set comprising the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 83 and 84 A complementary PCR primer set for analyzing a gene sequence associated with amyotrophic lateral sclerosis disease, comprising a PCR primer set.
(2) The complementary PCR primer set for analyzing a gene sequence related to amyotrophic lateral sclerosis disease according to (1) above, comprising all of the first to 42nd PCR primer sets.
(3) Muscular atrophy using the genomic DNA extracted from the subject as a template using the complementary PCR primer set for analyzing the gene sequence related to the amyotrophic lateral sclerosis disease described in (1) or (2) above A method for analyzing an amyotrophic lateral sclerosis disease-related gene sequence, comprising determining a base sequence of a lateral sclerosis disease-related gene.
(4) Using the amyotrophic lateral sclerosis disease related gene sequence information obtained by the analysis method described in (3) above, comparing with a known amyotrophic lateral sclerosis disease related gene sequence A testing method for a characteristic amyotrophic lateral sclerosis disease.

本発明の４２種類のＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットは、それぞれ新規なＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットである。したがって、例えば、ＡＬＳ疾患の発症頻度の高いＡＬＳ遺伝子の遺伝子配列のみを補足して解析できるＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットを選択してＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセットと組み合わせる等、４２種類のＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーから少なくとも１種以上の補足ＰＣＲプライマーセットを解析用途に応じて用いることができる。
更に従来のＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセットに加え、本発明の４２種類の補足ＰＣＲプライマーセットを全て組合せて用いることで、ＡＬＳ疾患関連遺伝子の遺伝子配列を解析することができる。
本発明の補足ＰＣＲプライマーセットは、ＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセットと組み合わせてシークエンスを行うことができる。したがって、例えば、ＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセット及び４２種類の補足ＰＣＲプライマーセットを組合せてシークエンスを行うことで、一回のシークエンスでＡＬＳ疾患関連遺伝子の遺伝子配列を解析することができる。
また、本発明のＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットは、ＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセットとは別にシークエンスを行うこともできる。そして、ＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセット及びＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットを用いて得られた別々の遺伝子配列情報を組合せてＡＬＳ疾患関連遺伝子の遺伝子配列を解析することができるので、既存のＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセットで得られた遺伝子配列情報に、後日ＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットから得られた遺伝子配列情報を加えて再解析を行うことで、既存のＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセットを用いて行ったＡＬＳ疾患の検査の精度を上げることができる。 The 42 types of ALS supplement PCR primer sets of the present invention are each a novel ALS supplement PCR primer set. Therefore, for example, an ALS supplement PCR primer set capable of supplementing and analyzing only the gene sequence of the ALS gene having a high incidence of ALS disease is selected and combined with the ALS-PCR primer set. One or more complementary PCR primer sets can be used depending on the analysis application.
Furthermore, in addition to the conventional ALS-PCR primer set, the 42 complementary PCR primer sets of the present invention can be used in combination to analyze the gene sequence of the ALS disease-related gene.
The supplementary PCR primer set of the present invention can be sequenced in combination with the ALS-PCR primer set. Therefore, for example, by performing a sequence by combining an ALS-PCR primer set and 42 types of complementary PCR primer sets, the gene sequence of an ALS disease-related gene can be analyzed in a single sequence.
Moreover, the ALS supplement PCR primer set of the present invention can be sequenced separately from the ALS-PCR primer set. Since the gene sequences of ALS disease-related genes can be analyzed by combining separate gene sequence information obtained using the ALS-PCR primer set and the ALS supplement PCR primer set, the existing ALS-PCR primer set By adding the gene sequence information obtained from the ALS supplement PCR primer set to the obtained gene sequence information at a later date and performing reanalysis, the accuracy of the ALS disease test performed using the existing ALS-PCR primer set can be improved. Can be raised.

図１は、図面代用写真で、ＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセット候補の電気泳動写真である。FIG. 1 is a drawing-substituting photograph and an electrophoresis photograph of ALS supplement PCR primer set candidates.

以下に、本発明のＡＬＳ疾患関連遺伝子配列解析用の補足ＰＣＲプライマーセット、ＡＬＳ疾患関連遺伝子配列の解析方法、及びＡＬＳ疾患の検査方法について詳しく説明する。   The supplementary PCR primer set for ALS disease-related gene sequence analysis, the ALS disease-related gene sequence analysis method, and the ALS disease test method of the present invention will be described in detail below.

本発明のＡＬＳ疾患関連遺伝子配列解析用のＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットは、被検体の遺伝子を鋳型として、ＰＣＲ法を用いてＡＬＳ疾患関連遺伝子のエクソン部分の遺伝子を増幅し、遺伝子配列を解析するためのＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセットに補足的に用いられるもので、例えば、以下の手順により作製することができる。   The ALS supplement PCR primer set for analyzing an ALS disease-related gene sequence according to the present invention is used to amplify a gene in an exon portion of an ALS disease-related gene using a subject gene as a template and analyze the gene sequence. The ALS-PCR primer set is supplementarily used, and can be prepared, for example, by the following procedure.

先ず、公知のＡＬＳ疾患関連遺伝子及びその遺伝子配列情報を入手する。表１は、入手したＡＬＳ疾患関連遺伝子の内、発病頻度等の観点から、発明者が特に検査すべき必要性が高いと判断して選択した２８種類のＡＬＳ疾患関連遺伝子名、並びに当該遺伝子の染色体上の位置及び塩基数を示す。表１に示すＡＬＳ疾患関連遺伝子配列情報は、ＮＣＢＩが運営するヒトの遺伝性疾患のデータベースであるＯＭＩＭ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝ＯＭＩＭ）、ＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）から入手することができる。あるいは、“Ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ”，Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ，２０１２，１２４：３３９−３５２、又は、「すべてがわかる ＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化症）・運動ニューロン疾患」（中山書店２０１３）等の文献から入手することができる。なお、表１に示す２８種類のＡＬＳ疾患関連遺伝子以外にも、必要に応じてＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセット及びＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットの作製に用いてもよい。また、不要な場合には使用せずに一部のみで解析を行っても良い。   First, a known ALS disease-related gene and its gene sequence information are obtained. Table 1 shows the names of 28 types of ALS disease-related genes selected by the inventor, judging from the viewpoint of the incidence of the ALS disease-related genes among the obtained ALS disease-related genes. The position on the chromosome and the number of bases are shown. The ALS disease-related gene sequence information shown in Table 1 is OMIM (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=OMIM) which is a database of human hereditary diseases operated by NCBI. ), UCSC Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/index.html). Alternatively, “The genetics and neuropathology of amyotrophic lateral sclerosis”, Acta Neuropathol, 2012, 124: 339-352, or “All you know is ALS (amyotrophic lateral sclerosis) / Motor neuron disease 13” Etc. can be obtained from the literature. In addition to the 28 types of ALS disease-related genes shown in Table 1, it may be used for the production of an ALS-PCR primer set and an ALS supplement PCR primer set as necessary. If unnecessary, the analysis may be performed with only a part without using it.

次に、例えば、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社のＩｏｎ Ａｍｐｌｉｓｅｑ ｃｕｓｔｕｍ ｐａｎｅｌ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｍｐｌｉｓｅｑ．ｃｏｍ／ｂｒｏｗｓｅ．ａｃｔｉｏｎ）に、上記２８種類のＡＬＳ疾患関連遺伝子の塩基配列情報を入力することで、全エクソン領域をカバーするＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセットをＬｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から入手する。また、上記のＩｏｎ Ａｍｐｌｉｓｅｑ ｃｕｓｔｕｍ ｐａｎｅｌで設計したＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセットでは解析できないＡＬＳ疾患関連遺伝子及び解析できない塩基配列数についても同時に入手する。表２は、ＡＬＳ疾患関連遺伝子名及び塩基数、並びにＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセットで解析できる塩基数、未解析塩基数及び解析率（解析塩基数／塩基数）を示す。   Next, for example, by inputting the nucleotide sequence information of the above 28 types of ALS disease-related genes into Ion Ampliseq customs panel (https://www.ampliseq.com/browse.action) of Life Technology, all exons ALS-PCR primer sets covering the region are obtained from Life technology. In addition, an ALS disease-related gene that cannot be analyzed with the ALS-PCR primer set designed by the above Ion Ampliq customs panel and the number of base sequences that cannot be analyzed are also obtained. Table 2 shows the ALS disease-related gene name and the number of bases, the number of bases that can be analyzed with the ALS-PCR primer set, the number of unanalyzed bases, and the analysis rate (the number of analyzed bases / the number of bases).

次に、表２に示す、解析率が１以外の、ＡＬＳ２、ＳＥＴＸ、ＳＰＧ１１、ＦＩＧ４、ＯＰＴＮ、ＮＥＦＨ、ＴＡＦ１５、ＥＷＳＲ１、ＣＨＭＰ２Ｂ、ＡＴＸＮ２、ＴＦＧ、ｄｏｒｆｉｎ、ＳＱＳＴＭ１について、未解析の塩基配列部分を解析するためのＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットの設計を行う。設計に際しては、専門のソフトウェアＰｒｉｍｅｒ３を用いて、（１）一塩基繰り返し配列が多数含まれる領域も解析できること、（２）各ＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットのＴｍ値の差をできるだけ小さくすること、（３）２０〜２５ｍｅｒのプライマー長となるようにすること、（４）ＰＣＲ増幅産物の長さが可能な限り４００ｂｐ以下となること、等に留意しながら創意工夫をしながら複数のＰＣＲプライマーセット候補の設計を行う。ＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットは、設計した塩基配列情報に基づき、市販されているＤＮＡ合成装置を用いて合成することで作製することができる。なお、上記の（１）〜（４）に留意して設計を行っても、実際にＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセットの未解析塩基配列部分を解析できない場合もあることから、合成したＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットが実際に未解析塩基配列を解析できるのか確認を行うことでＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットを作製する。   Next, the unanalyzed base sequence portion is analyzed for ALS2, SETX, SPG11, FIG4, OPTN, NEFH, TAF15, EWSR1, CHMP2B, ATXN2, TFG, dorfin, and SQSTM1 as shown in Table 2 where the analysis rate is other than 1. To design an ALS supplement PCR primer set. In designing, using specialized software Primer3, (1) it is possible to analyze a region containing a large number of single nucleotide repeat sequences, (2) making the difference in Tm values of each ALS-supplemented PCR primer set as small as possible, (3 ) Primer length of 20-25mer, (4) The length of the PCR amplification product should be 400 bp or less as much as possible, etc. Do the design. The ALS supplement PCR primer set can be prepared by synthesis using a commercially available DNA synthesizer based on the designed nucleotide sequence information. In addition, even if the design is performed while paying attention to the above (1) to (4), the unanalyzed base sequence portion of the ALS-PCR primer set may not actually be analyzed. ALS supplement PCR primer set is prepared by confirming whether or not can actually analyze the unanalyzed base sequence.

上記ＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセットと、ＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットは、混合して用いることで、一度の操作で被検体の遺伝子の塩基配列解析を行うことができる。なお、ＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットが増幅する増幅生産物長（塩基配列数）が、シークエンサーが解析できる塩基配列数より大きい場合は、当該ＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットのみ別に解析をすることが好ましく、使用するシークエンサーに応じて、一度の操作で塩基配列解析を行うのか、別々に塩基配列解析を行うのか決めればよい。また、ＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセットを用いた解析とは別に解析を行い、得られた塩基配列情報を組合せて再解析することもできる。本発明の４２種類のＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットは、それぞれ新規なＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットであることから、病院等において、被検体から抽出した遺伝子をＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセットを用いて解析したデータがある場合、例えば、特にＯＰＴＮ遺伝子を正確に解析したい際には、第１及び第２ＡＬＳ補足プライマーセットを用いて同一被検体のＯＰＴＮ遺伝子の塩基配列を解析し、既存のＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセットを用いて解析したデータと組み併せて再解析を行うことで、ＯＰＴＮ遺伝子に由来するＡＬＳ疾患を正確に検査することができる。   By using the ALS-PCR primer set and the ALS-supplemented PCR primer set in combination, the base sequence analysis of the gene of the subject can be performed with a single operation. In addition, when the length of amplified product (number of base sequences) amplified by the ALS-supplemented PCR primer set is larger than the number of base sequences that can be analyzed by the sequencer, it is preferable to analyze only the ALS-supplemented PCR primer set. Depending on the sequencer, it may be determined whether the base sequence analysis is performed in a single operation or the base sequence analysis is performed separately. Further, the analysis can be performed separately from the analysis using the ALS-PCR primer set, and reanalysis can be performed by combining the obtained base sequence information. Since the 42 types of ALS supplement PCR primer sets of the present invention are each a novel ALS supplement PCR primer set, there are data obtained by analyzing genes extracted from subjects using ALS-PCR primer sets in hospitals and the like. In particular, for example, when it is desired to analyze the OPTN gene accurately, the base sequence of the OPTN gene of the same subject is analyzed using the first and second ALS supplement primer sets, and the existing ALS-PCR primer set is used. By performing reanalysis in combination with the analyzed data, the ALS disease derived from the OPTN gene can be accurately examined.

本発明のＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットを用いたＰＣＲ法としては、当該プライマーセットを用いて被検体の遺伝子を増幅することができれば特に制限は無いが、電気泳動の手間を省くことができ、迅速な測定が可能となることから、リアルタイムＰＣＲ法が好ましい。   The PCR method using the ALS-supplemented PCR primer set of the present invention is not particularly limited as long as the gene of the subject can be amplified using the primer set, but the labor of electrophoresis can be saved and rapid. Real-time PCR is preferred because it allows measurement.

ＡＬＳ疾患関連遺伝子の検査を行うための鋳型ＤＮＡは、被検体から先ず採血を行い、血中から白血球を抽出し、次いで、白血球から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として使用する。ゲノＤＮＡの抽出は、一般的な、フェノールおよびクロロホルムを用いた方法を用いてもよいし、あるいは、ＱＩＡＧＥＮ社などから販売されている、ゲノムＤＮＡ抽出キット（ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔなど）を用いてもよい。更に、抽出したＤＮＡにＲＮＡ分解酵素を添加し、ＲＮＡを除去することで抽出したＤＮＡをクリーンアップしてもよい。   As a template DNA for testing an ALS disease-related gene, blood is first collected from a subject, white blood cells are extracted from the blood, and then genomic DNA extracted from the white blood cells is used as a template. Geno DNA may be extracted by using a general method using phenol and chloroform, or by using a genomic DNA extraction kit (DNeasy Blood & Tissue Kit, etc.) sold by QIAGEN or the like. Also good. Further, the extracted DNA may be cleaned up by adding RNA-degrading enzyme to the extracted DNA and removing the RNA.

ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡの解析は、次世代シークエンサーを用いて一度に塩基配列の解析を行えばよい。次世代シークエンサーとしては、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＩｏｎ Ｐｒｏｔｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、Ｉｏｎ ＰＧＭ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＨｉｓｅｑ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒシリーズ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、Ｒｏｃｈ ＧＳｊｕｎｉｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ等が挙げられる。これら次世代シークエンサーの操作は、添付マニュアルに従って操作をすればよい。   The DNA amplified by the PCR method may be analyzed at once by using a next-generation sequencer. Next-generation sequencers include Life Technologies, Ion Proton sequencer, Ion PGM sequencer, Illumina's Hiseq sequencer, Illumina Misequencier, and Roch GSjunor. These next-generation sequencers may be operated according to the attached manual.

また、次世代シークエンサーにより塩基配列を解析するためのＤＮＡライブラリ（ＰＣＲにより増幅した多様な長さを持ち、蛍光マーカーやビーズ等が付加しシークエンサーにより塩基配列を解析するためのＤＮＡ断片の混合物）は、各次世代シークエンサー用のＤＮＡライブラリ作成キットを用いればよい。例えば、上記Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ社の次世代シークエンサーを用いる場合は、Ｉｏｎ ｐｌｕｓ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｉｂｒａｒｙ ｋｉｔ、Ｉｏｎ ＰＧＭTM Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ４００ Ｋｉｔ、Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑTM Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔ ２．０、Ｉｏｎ ＰＧＭTM Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＯＴ２ ４００ Ｋｉｔ等を用いて、添付のマニュアルに従ってＤＮＡライブラリを作成すればよい。 In addition, DNA libraries for analyzing base sequences with next-generation sequencers (mixtures of DNA fragments with various lengths amplified by PCR, with added fluorescent markers and beads, etc. for analyzing base sequences with sequencers) A DNA library preparation kit for each next-generation sequencer may be used. For example, when the next-generation sequencer of Ion Torrent is used, Ion plus fragment library kit, Ion PGM ™ Sequencing 400 Kit, Ion AmpliSeq ™ Library Kit 2.0, Ion PGM ™ Temp 400, etc. A DNA library may be created according to the manual.

なお、次世代シークエンサーの多くは、現状ではＰＣＲ増幅産物の長さが４００ｂｐ程度までしか解析することができない。そのため、得られるＰＣＲ増幅産物の塩基長が４００ｂｐを超えるＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットを用いる場合、得られたＰＣＲ増幅産物についてはＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社のＡＭＰｕｒｅ ＸＰ ｋｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ社のＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＫｉｔなどのＤＮＡ精製キットで精製した後、超音波エネルギー等の照射により断片化した後に、ＤＮＡライブライを作成することが好ましい。断片化は、得られたＤＮＡを断片できるものであれば特に制限はなく、例えば、コバリス社のアコースティックソルビライザー等の装置を用いればよい。   Many of next-generation sequencers can only analyze PCR amplification products up to about 400 bp in length. Therefore, when using an ALS-supplemented PCR primer set in which the base length of the obtained PCR amplification product exceeds 400 bp, DNA purification such as Beckman Coulter's AMPure XP kit and QIAGEN's QIAquick PCR Purification Kit is used for the obtained PCR amplification product. It is preferable to prepare a DNA library after purification with a kit and fragmentation by irradiation with ultrasonic energy or the like. Fragmentation is not particularly limited as long as the obtained DNA can be fragmented. For example, an apparatus such as an acoustic solver manufactured by Covalis may be used.

上記の手順により解析した遺伝子配列情報を、既知のＡＬＳ疾患関連遺伝子配列と比較することで、被検体がＡＬＳに疾患しているか否か検査することができる。   By comparing the gene sequence information analyzed by the above procedure with a known ALS disease-related gene sequence, it can be examined whether or not the subject has ALS.

以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。   The present invention will be described in detail with reference to the following examples, which are provided merely for the purpose of illustrating the present invention and for reference to specific embodiments thereof. These exemplifications are for explaining specific specific embodiments of the present invention, but are not intended to limit or limit the scope of the invention disclosed in the present application.

＜実施例１＞
〔ＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセット候補の作製〕
ＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ ＢｒｏｗｓｅｒよりＡＬＳ２、ＳＥＴＸ、ＳＰＧ１１、ＦＩＧ４、ＯＰＴＮ、ＮＥＦＨ、ＴＡＦ１５、ＥＷＳＲ１、ＣＨＭＰ２Ｂ、ＡＴＸＮ２、ＴＦＧ、ｄｏｒｆｉｎ、ＳＱＳＴＭ１遺伝子の配列情報を入手した。Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社のＩｏｎ Ａｍｐｌｉｓｅｑ ｃｕｓｔｕｍ ｐａｎｅｌに前記ＡＬＳ遺伝子群の配列情報を入力することで、前記ＡＬＳ遺伝子群の全エクソン領域をカバーするＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセットを設計するとともに、当該設計したＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセットでは解析できない塩基配列情報を同時に入手した。なお、Ｉｏｎ Ａｍｐｌｉｓｅｑ ｃｕｓｔｕｍ ｐａｎｅｌは、同じ遺伝子配列情報を入力すれば、同じＰＣＲプライマーセットを入手することができるようになっている。次に、Ｐｒｉｍｅｒ３ソフトを使用して、前記入手したＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセットでは解析できない塩基配列部分を解析するためのＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセット候補の設計を行い、設計したＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセット候補の塩基配列に基づき、ＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセット候補を合成した。 <Example 1>
[Preparation of ALS supplement PCR primer set candidates]
The sequence information of ALS2, SETX, SPG11, FIG4, OPTN, NEFH, TAF15, EWSR1, CHMP2B, ATXN2, TFG, dorfin, SQSTM1 gene was obtained from UCSC Genome Browser. The ALS-PCR primer set that covers the entire exon region of the ALS gene group is designed by inputting the sequence information of the ALS gene group into the Ion Ampleqq customs panel of Life technology, and the designed ALS-PCR primer The base sequence information that cannot be analyzed by the set was obtained at the same time. Note that the same PCR primer set can be obtained from the Ion Ampliq customs panel by inputting the same gene sequence information. Next, using Primer 3 software, the ALS supplement PCR primer set candidate for analyzing the base sequence portion that cannot be analyzed by the obtained ALS-PCR primer set is designed, and the base of the designed ALS supplement PCR primer set candidate Based on the sequence, ALS supplement PCR primer set candidates were synthesized.

〔被検体のゲノムＤＮＡの調整〕
被検体から採血を行い、次いで、血中の白血球のみをＱｉａｇｅｎ社のＲＢＣ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒにより抽出した。次に、ゲノムＤＮＡ抽出キット（ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、添付のマニュアルに従って、抽出した白血球からゲノムＤＮＡを調整した。 [Preparation of genomic DNA of the subject]
Blood was collected from the subject, and then only leukocytes in the blood were extracted with an RBC lysis buffer from Qiagen. Next, genomic DNA was prepared from the extracted leukocytes using a genomic DNA extraction kit (DNeasy Blood & Tissue Kit, manufactured by QIAGEN) according to the attached manual.

〔ＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットの作製〕
合成したＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセット候補を用いて、実際に未解析部分を増幅することができるのか確認を行った。先ず、ｄｏｒｆｉｎ遺伝子の未解析部分を解析するためのＡＬＳ補足ＰＣＲプライマー候補について、以下の手順で確認を行った。
（１）調整したゲノムＤＮＡと、
塩基配列：ＧＧＡＧＣＴＧＣＡＡＴＣＡＣＡＴＧＡＣＡ
塩基配列：ＣＣＣＴＡＧＴＣＣＴＣＣＡＴＴＡＴＣＣＴＣＡ
からなるｄｏｒｆｉｎ遺伝子用の補足ＰＣＲプライマーセット候補を、Ｔａｋａｒａ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ Ａｓｓａｙ ｋｉｔを用いて増幅した。
（２）調整したゲノムＤＮＡと、
塩基配列：ＧＧＡＧＣＴＧＣＡＡＴＣＡＣＡＴＧＡＣＡ
塩基配列：ＧＴＣＣＴＣＣＡＴＴＡＴＣＣＴＣＡＡＡＣＣＣ
からなるｄｏｒｆｉｎ遺伝子用の補足ＰＣＲプライマーセット候補を、Ｔａｋａｒａ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ Ａｓｓａｙ ｋｉｔを用いて増幅した。
（３）調整したゲノムＤＮＡと、配列番号７１及び７２に記載の塩基配列からなるｄｏｒｆｉｎ遺伝子用の補足ＰＣＲプライマーセット候補を、Ｔａｋａｒａ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ Ａｓｓａｙ ｋｉｔを用いて増幅した。
アガロースゲルで作製した電気泳動用ゲルのレーン１及び５に、サイズマーカーｐＨＹ Ｍａｒｋｅｒ（ＴＡＫＡＲＡ）を載せ、上記（１）の増幅産物をレーン２に、上記（２）の増幅産物をレーン３に、上記（３）の増幅産物をレーン４に載せ、電気泳動を行った。 [Preparation of ALS supplement PCR primer set]
Using the synthesized ALS supplement PCR primer set candidate, it was confirmed whether the unanalyzed portion could actually be amplified. First, ALS supplement PCR primer candidates for analyzing the unanalyzed portion of the dofin gene were confirmed by the following procedure.
(1) adjusted genomic DNA;
Base sequence: GGAGCTGCAATCACATGACA
Base sequence: CCCTAGTCCTCCATTATCCTCA
A complementary PCR primer set candidate for the dofin gene consisting of was amplified using Takara multiplex PCR Assay kit.
(2) adjusted genomic DNA;
Base sequence: GGAGCTGCAATCACATGACA
Base sequence: GTCTCTCCATTATCTCCAAACCC
A complementary PCR primer set candidate for the dofin gene consisting of was amplified using Takara multiplex PCR Assay kit.
(3) A complementary PCR primer set candidate for the dolphin gene consisting of the prepared genomic DNA and the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 71 and 72 was amplified using Takara multiplex PCR Assay kit.
The size marker pHY Marker (TAKARA) is placed on lanes 1 and 5 of the gel for electrophoresis prepared on an agarose gel, the amplification product of (1) above is in lane 2, the amplification product of (2) above is in lane 3, The amplification product of (3) above was placed on lane 4 and subjected to electrophoresis.

図１は、電気泳動写真で、写真から明らかなように、同じｄｏｒｆｉｎ遺伝子の未解析部分を増幅するように設計した補足ＰＣＲプライマーセット候補であっても、（１）及び（２）の補足ＰＣＲプライマーセット候補は、未解析部分を増幅することはできなかった。そのため、他の補足ＰＣＲプライマーセットの候補についても、同様の手順で確認を行い、配列番号１〜８４に記載されている塩基配列の４２種類のＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットを作製した。表３に、作製した合計４２組のＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットの配列番号及び塩基配列、並びに各ＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットが増幅する増幅生産物長さを示す。   FIG. 1 is an electrophoretic photograph. As is clear from the photograph, supplemental PCR primer sets of (1) and (2) are used even if they are candidate complementary PCR primer sets designed to amplify the unanalyzed part of the same dofin gene. The candidate primer set could not amplify the unanalyzed part. Therefore, other candidate complementary PCR primer sets were also confirmed in the same procedure, and 42 types of ALS supplemented PCR primer sets having the base sequences described in SEQ ID NOs: 1 to 84 were prepared. Table 3 shows the SEQ ID NOs and base sequences of a total of 42 ALS-supplemented PCR primer sets prepared, and the length of the amplified product amplified by each ALS-supplemented PCR primer set.

〔ＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットによる未解析部分の解析〕
＜実施例２＞
実施例１で作製した４２種類のＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットの内、配列番号７及び８に記載の塩基配列からなる第４ＰＣＲプライマーセット、配列番号１３及び１４に記載の塩基配列からなる第７ＰＣＲプライマーセット、配列番号１５及び１６に記載の塩基配列からなる第８ＰＣＲプライマーセット、配列番号７１及び７２に記載の塩基配列からなる第３６ＰＣＲプライマーセットを混合し、Ｔａｋａｒａ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ Ａｓｓａｙ ｋｉｔを用いて増幅した。増幅後はＡＭＰｕｒｅ ＸＰ ｋｉｔで精製し、超音波装置（アコースティックソルビライザー Ｃｏｖａｒｉｓ Ｓ２２０；コバリス社製）を用いてＤＮＡを断片化した後、Ｉｏｎ ｐｌｕｓ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｉｂｒａｒｙ ｋｉｔ（ライフテクノロジー社製）を用いて、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔシークエンサー（ライフテクノロジー社製）用のＤＮＡライブラリを作成した。上記４種類を除いた３８種類のＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットについては、増幅後に精製及び超音波処理しなかった以外は、上記４種類と同様の手順でＤＮＡライブラリを作成した。 [Analysis of unanalyzed part by ALS supplement PCR primer set]
<Example 2>
Of the 42 types of ALS-supplemented PCR primer sets prepared in Example 1, a fourth PCR primer set consisting of the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 7 and 8 and a seventh PCR primer set consisting of the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 13 and 14 The 8th PCR primer set consisting of the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 15 and 16 and the 36th PCR primer set consisting of the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 71 and 72 were mixed and amplified using Takara multiplex PCR Assay kit. After amplification, the DNA is purified with an AMPure XP kit, and DNA is fragmented using an ultrasonic device (Acoustic solvizer Covaris S220; manufactured by Covalis), and then Ion plus fragment library kit (Life Technology) is used. A DNA library for a torrent sequencer (Life Technology) was created. For the 38 types of ALS-supplemented PCR primer sets excluding the above 4 types, a DNA library was prepared in the same manner as the above 4 types except that purification and sonication were not performed after amplification.

得られた２つのＤＮＡライブラリを混合した上で、Ｉｏｎ ｏｎｅ ｔｏｕｃｈ２ システムを用いてエマルジョンＰＣＲを行い、その後、Ｉｏｎ ＰＧＭTM Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ４００ Ｋｉｔを用いて、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒでシークエンスの解析を行った。 After mixing the obtained two DNA libraries, emulsion PCR was performed using the Ion one touch2 system, and then the sequence analysis was performed using the Ion PGM ™ Sequencing 400 Kit with the Ion Torrent sequencer.

表４はシークエンス結果の概要を示しており、表５は解析率を示している。表４に示すとおり、従来のＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセットでは解析できない４２のアンプリコン及び当該アンプリコンに含まれる１，５１２個の未解析塩基配列について、本発明の４２種類のＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットを用いて解析したところ、表５に示すように、１００％解析できた。なお、表４において、「Ｎｕｍｂｅｒ ｔａｒｇｅｔ ｒｅｇｉｏｎｓ」が４３であるのは、（１）１つのアンプリコンで２つのｔａｒｇｅｔ ｒｅｇｉｏｎをカバーするもの、及び（２）１つのｔａｒｇｅｔ ｒｅｇｉｏｎを複数のアンプリコンでカバーするもの、があり、その結果４３になったと思われる。   Table 4 shows an overview of the sequence results, and Table 5 shows the analysis rate. As shown in Table 4, 42 types of ALS-supplemented PCR primer sets of the present invention were used for 42 amplicons that cannot be analyzed by conventional ALS-PCR primer sets and 1,512 unanalyzed base sequences contained in the amplicons. As shown in Table 5, 100% analysis was possible. In Table 4, “Number target regions” is 43 because (1) one amplicon covers two target regions, and (2) one target region is covered by a plurality of amplicons. It seems that it became 43 as a result.

本発明に係るＡＬＳ補足ＰＣＲプライマーセットと従来のＡＬＳ−ＰＣＲプライマーセットを組合せて用いることで、ＡＬＳ疾患関連遺伝子の全ての遺伝子配列を解析することができる。したがって、ＡＬＳ疾患の検査の精度を向上することができ、医療機関や大学医学部などの研究機関等におけるＡＬＳ疾患検査及び研究に利用が可能である。   By using the ALS supplement PCR primer set according to the present invention in combination with the conventional ALS-PCR primer set, all gene sequences of ALS disease-related genes can be analyzed. Therefore, it is possible to improve the accuracy of testing for ALS disease, and it can be used for ALS disease testing and research in research institutions such as medical institutions and university medical departments.

Claims (4)

配列番号１及び２に記載の塩基配列からなる第１ＰＣＲプライマーセット、配列番号３及び４に記載の塩基配列からなる第２ＰＣＲプライマーセット、配列番号５及び６に記載の塩基配列からなる第３ＰＣＲプライマーセット、配列番号７及び８に記載の塩基配列からなる第４ＰＣＲプライマーセット、配列番号９及び１０に記載の塩基配列からなる第５ＰＣＲプライマーセット、配列番号１１及び１２に記載の塩基配列からなる第６ＰＣＲプライマーセット、配列番号１３及び１４に記載の塩基配列からなる第７ＰＣＲプライマーセット、配列番号１５及び１６に記載の塩基配列からなる第８ＰＣＲプライマーセット、配列番号１７及び１８に記載の塩基配列からなる第９ＰＣＲプライマーセット、配列番号１９及び２０に記載の塩基配列からなる第１０ＰＣＲプライマーセット、配列番号２１及び２２に記載の塩基配列からなる第１１ＰＣＲプライマーセット、配列番号２３及び２４に記載の塩基配列からなる第１２ＰＣＲプライマーセット、配列番号２５及び２６に記載の塩基配列からなる第１３ＰＣＲプライマーセット、配列番号２７及び２８に記載の塩基配列からなる第１４ＰＣＲプライマーセット、配列番号２９及び３０に記載の塩基配列からなる第１５ＰＣＲプライマーセット、配列番号３１及び３２に記載の塩基配列からなる第１６ＰＣＲプライマーセット、配列番号３３及び３４に記載の塩基配列からなる第１７ＰＣＲプライマーセット、配列番号３５及び３６に記載の塩基配列からなる第１８ＰＣＲプライマーセット、配列番号３７及び３８に記載の塩基配列からなる第１９ＰＣＲプライマーセット、配列番号３９及び４０に記載の塩基配列からなる第２０ＰＣＲプライマーセット、配列番号４１及び４２に記載の塩基配列からなる第２１ＰＣＲプライマーセット、配列番号４３及び４４に記載の塩基配列からなる第２２ＰＣＲプライマーセット、配列番号４５及び４６に記載の塩基配列からなる第２３ＰＣＲプライマーセット、配列番号４７及び４８に記載の塩基配列からなる第２４ＰＣＲプライマーセット、配列番号４９及び５０に記載の塩基配列からなる第２５ＰＣＲプライマーセット、配列番号５１及び５２に記載の塩基配列からなる第２６ＰＣＲプライマーセット、配列番号５３及び５４に記載の塩基配列からなる第２７ＰＣＲプライマーセット、配列番号５５及び５６に記載の塩基配列からなる第２８ＰＣＲプライマーセット、配列番号５７及び５８に記載塩基配列からなる第２９ＰＣＲプライマーセット、配列番号５９及び６０に記載の塩基配列からなる第３０ＰＣＲプライマーセット、配列番号６１及び６２に記載の塩基配列からなる第３１ＰＣＲプライマーセット、配列番号６３及び６４に記載の塩基配列からなる第３２ＰＣＲプライマーセット、配列番号６５及び６６に記載の塩基配列からなる第３３ＰＣＲプライマーセット、配列番号６７及び６８に記載の塩基配列からなる第３４ＰＣＲプライマーセット、配列番号６９及び７０に記載の塩基配列からなる第３５ＰＣＲプライマーセット、配列番号７１及び７２に記載の塩基配列からなる第３６ＰＣＲプライマーセット、配列番号７３及び７４に記載の塩基配列からなる第３７ＰＣＲプライマーセット、配列番号７５及び７６に記載の塩基配列からなる第３８ＰＣＲプライマーセット、配列番号７７及び７８に記載の塩基配列からなる第３９ＰＣＲプライマーセット、配列番号７９及び８０に記載の塩基配列からなる第４０ＰＣＲプライマーセット、配列番号８１及び８２に記載の塩基配列からなる第４１ＰＣＲプライマーセット、配列番号８３及び８４に記載の塩基配列からなる第４２ＰＣＲプライマーセット、から選択される少なくとも１種のＰＣＲプライマーセットを含むことを特徴とする筋萎縮性側索硬化症疾患関連遺伝子配列解析用の補足ＰＣＲプライマーセット。   The first PCR primer set consisting of the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 1 and 2, the second PCR primer set consisting of the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 3 and 4, and the third PCR primer set consisting of the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 5 and 6 A fourth PCR primer set consisting of the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 7 and 8, a fifth PCR primer set consisting of the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 9 and 10, and a sixth PCR primer consisting of the base sequences set forth in SEQ ID NOS: 11 and 12 Set, seventh PCR primer set consisting of base sequences set forth in SEQ ID NOs: 13 and 14, eighth PCR primer set consisting of base sequences set forth in SEQ ID NOs: 15 and 16, and ninth PCR consisting of base sequences set forth in SEQ ID NOs: 17 and 18 Primer set, nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 19 and 20 A 10th PCR primer set consisting of: a 11th PCR primer set consisting of the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 21 and 22; a 12th PCR primer set consisting of the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 23 and 24; and the bases set forth in SEQ ID NOs: 25 and 26 The 13th PCR primer set consisting of the sequences, the 14th PCR primer set consisting of the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 27 and 28, the 15th PCR primer set consisting of the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 29 and 30, and the SEQ ID NOs: 31 and 32 16th PCR primer set consisting of base sequences, 17th PCR primer set consisting of base sequences described in SEQ ID NOs: 33 and 34, 18th PCR primer set consisting of base sequences described in SEQ ID NOs: 35 and 36, and SEQ ID NOs: 37 and 38 Nucleotide sequence The 19th PCR primer set, the 20th PCR primer set consisting of the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 39 and 40, the 21st PCR primer set consisting of the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 41 and 42, and the bases set forth in SEQ ID NOs: 43 and 44 The 22nd PCR primer set consisting of the sequences, the 23rd PCR primer set consisting of the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 45 and 46, the 24th PCR primer set consisting of the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 47 and 48, and the sequence numbers 49 and 50 The 25th PCR primer set consisting of the base sequence, the 26th PCR primer set consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NOs: 51 and 52, the 27th PCR primer set consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NOs: 53 and 54, and the sequence numbers 55 and 56 Or base sequence The 28th PCR primer set, the 29th PCR primer set consisting of the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 57 and 58, the 30th PCR primer set consisting of the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 59 and 60, and the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 61 and 62 The 31st PCR primer set consisting of: the 32nd PCR primer set consisting of the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 63 and 64; the 33rd PCR primer set consisting of the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 65 and 66; and the bases set forth in SEQ ID NOs: 67 and 68 The 34th PCR primer set consisting of the sequences, the 35th PCR primer set consisting of the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 69 and 70, the 36th PCR primer set consisting of the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 71 and 72, and the sequence numbers 73 and 74 From the base sequence The 37th PCR primer set, the 38th PCR primer set consisting of the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 75 and 76, the 39th PCR primer set consisting of the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 77 and 78, and the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 79 and 80 At least one PCR selected from the 40th PCR primer set consisting of: the 41st PCR primer set consisting of the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 81 and 82; and the 42nd PCR primer set consisting of the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 83 and 84: A complementary PCR primer set for analyzing a gene sequence associated with amyotrophic lateral sclerosis disease characterized by comprising a primer set. 前記第１〜第４２ＰＣＲプライマーセットを全て含むことを特徴とする請求項１に記載の筋萎縮性側索硬化症疾患関連遺伝子配列解析用の補足ＰＣＲプライマーセット。   The supplementary PCR primer set for analyzing a gene sequence related to amyotrophic lateral sclerosis disease according to claim 1, comprising all of the first to 42nd PCR primer sets. 請求項１又は２に記載の筋萎縮性側索硬化症疾患関連遺伝子配列解析用の補足ＰＣＲプライマーセットを用いて、被検体から抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとした筋萎縮性側索硬化症疾患関連遺伝子の塩基配列を決定することを特徴とする筋萎縮性側索硬化症疾患関連遺伝子配列の解析方法。   Using the supplementary PCR primer set for gene sequence analysis for amyotrophic lateral sclerosis disease-related gene according to claim 1 or 2, amyotrophic lateral sclerosis disease-related using genomic DNA extracted from a subject as a template A method for analyzing a gene sequence associated with amyotrophic lateral sclerosis disease, comprising determining a base sequence of the gene. 請求項３に記載の解析方法により得られた筋萎縮性側索硬化症疾患関連遺伝子配列情報を用いて、既知の筋萎縮性側索硬化症疾患関連遺伝子配列と比較することを特徴とする筋萎縮性側索硬化症疾患の検査方法。   A muscle that is compared with a known amyotrophic lateral sclerosis disease-related gene sequence using the amyotrophic lateral sclerosis disease-related gene sequence information obtained by the analysis method according to claim 3. Test method for atrophic lateral sclerosis disease.
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