JP2015070803A - Method and kit for determination of prognosis of lung cancer patient based on cxcl1 expression level - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ＣＸＣＬ１の発現量に基づく肺癌患者の予後判定方法およびキットに関する。 The present invention relates to a prognosis determination method and kit for patients with lung cancer based on the expression level of CXCL1.
早期肺癌は、手術による治療が主であるが、術後、数十％で癌の再発がおきることが問題となっている。その問題を解決するため、術後の補助療法により５年生存率が改善することが報告されている（非特許文献１）。再発リスクの低い患者に対してもそのような補助療法を行うことは好ましいことではなく、再発リスクの高い患者を判定できる方法や判定を補助する方法の開発が求められている。 Early lung cancer is mainly treated by surgery, but there is a problem that cancer recurrence occurs in several tens of percent after surgery. In order to solve the problem, it has been reported that the 5-year survival rate is improved by postoperative adjuvant therapy (Non-patent Document 1). It is not preferable to perform such adjuvant therapy for patients with a low risk of recurrence, and there is a need for the development of a method that can determine a patient with a high risk of recurrence and a method that assists the determination.
このような肺癌の予後を予測できる方法として、１３９個の遺伝子セットの発現プロファイルによる肺癌の予後予測法が開発されている（特許文献１および非特許文献２）。 As a method for predicting the prognosis of such lung cancer, a method for predicting the prognosis of lung cancer based on the expression profile of 139 gene sets has been developed (Patent Document 1 and Non-Patent Document 2).
本発明は、少なくとも一つの遺伝子で肺癌患者の予後を判定する方法を提供する。 The present invention provides a method for determining the prognosis of a lung cancer patient with at least one gene.
本発明者らは、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（ＣＸＣＬ１）の発現量が、肺癌患者の予後と相関することを見出した。本発明はそのような発見に基づいてなされた発明である。 The present inventors have found that the expression level of chemokine (C—X—C motif) ligand 1 (CXCL1) correlates with the prognosis of lung cancer patients. The present invention has been made based on such findings.
すなわち、本発明によれば以下の発明が提供される。
（１）肺癌患者サンプルにおいて、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（ＣＸＣＬ１）の発現量を測定することを含んでなる、肺癌予後の判定方法。
（２）肺癌患者サンプルにおいて、スペルミンオキシダーゼ（ＳＭＯＸ）の発現量をさらに測定する、上記（１）に記載の判定方法。
（３）肺癌患者サンプルにおいて、ＤＮＡ結合阻害因子１（ＩＤ１）の発現量をさらに測定する、上記（１）または（２）に記載の判定方法。
（４）発現量が、定量的ＰＣＲ法により測定される、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の判定方法。
（５）肺癌患者サンプルにおいて、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（ＣＸＣＬ１）とスペルミンオキシダーゼ（ＳＭＯＸ）および／またはＤＮＡ結合阻害因子１（ＩＤ１）の遺伝子発現プロファイルを得て、該遺伝子発現プロファイルに基づいて、肺癌の予後を判定する方法。
（６）１以上の更なる遺伝子の発現量を測定して、遺伝子発現プロファイルを得る、上記（５）に記載の方法。
（７）ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（ＣＸＣＬ１）の発現量を測定するための測定手段を含んでなる、肺癌予後の判定キット。
（８）スペルミンオキシダーゼ（ＳＭＯＸ）および／またはＤＮＡ結合阻害因子１（ＩＤ１）の発現量を測定するための測定手段をさらに含んでなる、上記（７）に記載のキット。
（９）測定手段が、抗体またはＰＣＲプライマーを含んでなるものである、上記（７）または（８）に記載のキット。
That is, according to the present invention, the following inventions are provided.
(1) A method for determining lung cancer prognosis, comprising measuring the expression level of a chemokine (C—C—C motif) ligand 1 (CXCL1) in a lung cancer patient sample.
(2) The determination method according to (1), wherein the expression level of spermine oxidase (SMOX) is further measured in a lung cancer patient sample.
(3) The determination method according to (1) or (2), wherein the expression level of DNA binding inhibitor 1 (ID1) is further measured in a lung cancer patient sample.
(4) The determination method according to any one of (1) to (3), wherein the expression level is measured by a quantitative PCR method.
(5) Gene expression profile of chemokine (C—X—C motif) ligand 1 (CXCL1), spermine oxidase (SMOX) and / or DNA binding inhibitor 1 (ID1) is obtained in a lung cancer patient sample, and the gene expression A method for determining the prognosis of lung cancer based on a profile.
(6) The method according to (5) above, wherein the expression level of one or more additional genes is measured to obtain a gene expression profile.
(7) A determination kit for prognosis of lung cancer, comprising a measurement means for measuring the expression level of a chemokine (C—X—C motif) ligand 1 (CXCL1).
(8) The kit according to (7), further comprising a measurement means for measuring the expression level of spermine oxidase (SMOX) and / or DNA binding inhibitor 1 (ID1).
(9) The kit according to (7) or (8) above, wherein the measuring means comprises an antibody or a PCR primer.
本発明において、肺癌予後の判定の対象は、肺癌患者である。本発明では、肺癌患者としては、非小細胞癌患者、より好ましくは肺腺癌患者が挙げられる。本発明では、肺癌患者は、ステージＩ、ＩＩおよびＩＩＩの患者である。 In the present invention, the subject of determination of lung cancer prognosis is a lung cancer patient. In the present invention, lung cancer patients include non-small cell cancer patients, more preferably lung adenocarcinoma patients. In the present invention, lung cancer patients are stage I, II and III patients.
本発明では、肺癌患者サンプルとしては、肺癌患者の癌組織や血清を用いることができる。癌組織は、手術により得られた組織およびそれを凍結して得られる凍結標本を用いることができる。 In the present invention, as a lung cancer patient sample, cancer tissue or serum of a lung cancer patient can be used. As the cancer tissue, a tissue obtained by surgery and a frozen specimen obtained by freezing it can be used.
ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（ＣＸＣＬ１）は、ＣＸＣケモカインファミリーに属するサイトカインである。本発明によれば、ＣＸＣＬ１の発現量は、肺癌の予後と関連する。予後の判定は、下記に説明するリスクスコアにより判定してもよいし、予後が明らかとなっている肺癌患者のサンプルにおける発現量と比較して決定してもよい。 Chemokine (C—X—C motif) ligand 1 (CXCL1) is a cytokine belonging to the CXC chemokine family. According to the present invention, the expression level of CXCL1 is associated with the prognosis of lung cancer. The prognosis may be determined by a risk score described below, or may be determined by comparison with the expression level in a sample of a lung cancer patient whose prognosis is clear.
また、本発明によれば、ＣＸＣＬ１は、単独で予後判定に用いてもよいし、他の遺伝子と組み合わせて予後判定に用いてもよい。ＣＸＣＬ１と組み合わせて用いることができる遺伝子としては、特に限定されないが、例えば、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１９、ＡＤＡＭ８、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＡＴＦ２、ＣＥＮＰＦ、ＥＴＳ２、ＧＡＰＤＨ、ＧＮＧ１１、ＧＲＢ１０、ＨＯＰＸ、ＨＳＰＡ８、ＩＤ１、ＩＧＦＢＰ３、ＩＧＦＢＰ６、ＩＬ１ＲＮ、ＩＴＧＢ８、ＩＴＰＲ１、ＭＭＰ１２、ＭＴＨＦＤ２、ＭＶＫ、ＮＤＲＧ１、ＰＡＫ２、ＰＨＬＤＡ２、ＰＩＫ３ＣＤ、ＲＡＣ２、ＳＥＰＷ１、ＳＭＯＸ、ＳＰＤＥＦ、ＳＰＲＹ４、ＴＨＲＡ、ＴＭＳＢ１０、ＵＢＥ２Ｃ、ＵＳＴ、ＶＣＰ、ＶＥＧＦＡおよびＹＷＨＡＱを挙げることができ、特に好ましくは、ＩＤ１またはＳＭＯＸである。 According to the present invention, CXCL1 may be used alone for prognosis determination, or may be used for prognosis determination in combination with other genes. A gene that can be used in combination with CXCL1 is not particularly limited. For example, ADAM10, ADAM19, ADAM8, ALOX15B, ATF2, CENPF, ETS2, GAPDH, GNG11, GRB10, HOPX, HSPA8, ID1, IGFBP3, IGFBP6, IL1RN , ITGB8, ITPR1, MMP12, MTHFD2, MVK, NDRG1, PAK2, PHLDA2, PIK3CD, RAC2, SEEP1, SMOX, SPDEF, SPRY4, THRA, TMSB10, UBE2C, UST, VCP, VEGFA and YWHQ can be mentioned. Is ID1 or SMOX.
発現量が多い場合に、患者の予後が不良であることを示す遺伝子としては、特に限定されないが、表１において正のβ値を有する遺伝子、例えば、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１９、ＡＤＡＭ８、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＧＲＢ１０、ＩＤ１、ＩＧＦＢＰ３、ＩＧＦＢＰ６、ＩＬ１ＲＮ、ＭＭＰ１２、ＭＴＨＦＤ２、ＭＶＫ、ＮＤＲＧ１、ＰＩＫ３ＣＤ、ＳＭＯＸ、ＳＰＤＥＦ、ＳＰＲＹ４、ＴＨＲＡ、ＵＢＥ２Ｃ、ＶＣＰ、ＶＥＧＦＡおよびＹＷＨＡＱが挙げられる。患者の予後が不良であることを示す遺伝子の発現量が多い場合には、患者の予後が不良であることが示され、該遺伝子の発現量が少ない場合には、患者の予後が良好であることが示される。発現量が多いか少ないかは、健常者または予後が明らかとなっている患者のサンプルにおける発現量と比較して決定することができる。予後の判定対象である患者の肺癌組織サンプルにおける遺伝子の発現量が、予後が明らかとなっている患者のサンプルにおける発現量よりも多い場合には、予後が明らかとなっている患者よりも予後が不良であると判定することができる。また、予後の判定対象である患者の肺癌組織サンプルにおける遺伝子の発現量が、予後が明らかとなっている患者のサンプルにおける発現量よりも少ない場合には、予後が明らかとなっている患者よりも予後が良好であると判定することができる。 The gene showing that the prognosis of the patient is poor when the expression level is large is not particularly limited, but genes having a positive β value in Table 1, such as ADAM10, ADAM19, ADAM8, ALOX15B, GRB10, ID1 , IGFBP3, IGFBP6, IL1RN, MMP12, MTHFD2, MVK, NDRG1, PIK3CD, SMOX, SPDEF, SPRY4, THRA, UBE2C, VCP, VEGFA and YWHAQ. When the gene expression level is high, which indicates that the patient's prognosis is poor, the patient's prognosis is poor. When the gene expression level is low, the patient's prognosis is good Is shown. Whether the expression level is large or small can be determined by comparison with the expression level in a sample of a healthy subject or a patient whose prognosis is clear. If the gene expression level in the lung cancer tissue sample of the patient whose prognosis is determined is greater than the expression level in the sample of the patient whose prognosis is known, the prognosis is higher than that of the patient whose prognosis is clear. It can be determined that it is defective. In addition, when the expression level of the gene in the lung cancer tissue sample of the patient who is the prognosis judgment target is smaller than the expression level in the sample of the patient whose prognosis is clear, the prognosis is clearer than the patient whose prognosis is clear. It can be determined that the prognosis is good.
また、発現量が多い場合に患者の予後が良好であることを示す遺伝子としては、特に限定されないが、表１において負のβ値を有する遺伝子、例えば、ＡＴＦ２、ＣＥＮＰＦ、ＥＴＳ２、ＧＡＰＤＨ、ＧＮＧ１１、ＨＯＰＸ、ＨＳＰＡ８、ＩＴＧＢ８、ＩＴＰＲ１、ＰＡＫ２、ＰＨＬＤＡ２、ＰＡＫ２、ＰＨＬＤＡ２、ＲＡＣ２、ＳＥＰＷ１、ＴＭＳＢ１０およびＵＳＴが挙げられる。患者の予後が良好であることを示す遺伝子の発現量が多い場合には、患者の予後が良好であることが示され、該遺伝子の発現量が少ない場合には、患者の予後が不良であることが示される。発現量が多いか少ないかは、健常者または予後が明らかとなっている患者のサンプルにおける発現量と比較して決定することができる。予後の判定対象である患者の肺癌組織サンプルにおける遺伝子の発現量が、予後が明らかとなっている患者のサンプルにおける発現量よりも多い場合には、予後が明らかとなっている患者よりも予後が良好であると判定することができる。また、予後の判定対象である患者の肺癌組織サンプルにおける遺伝子の発現量が、予後が明らかとなっている患者のサンプルにおける発現量よりも少ない場合には、予後が明らかとなっている患者よりも予後が不良であると判定することができる。 In addition, the gene showing that the prognosis of the patient is good when the expression level is large is not particularly limited, but genes having a negative β value in Table 1, such as ATF2, CENPF, ETS2, GAPDH, GNG11, HOPX, HSPA8, ITGB8, ITPR1, PAK2, PHLDA2, PAK2, PHLDA2, RAC2, SEPW1, TMSB10 and UST. If the gene expression level indicating that the patient's prognosis is good is high, the patient's prognosis is good. If the gene expression level is low, the patient's prognosis is poor. Is shown. Whether the expression level is large or small can be determined by comparison with the expression level in a sample of a healthy subject or a patient whose prognosis is clear. If the gene expression level in the lung cancer tissue sample of the patient whose prognosis is determined is greater than the expression level in the sample of the patient whose prognosis is known, the prognosis is higher than that of the patient whose prognosis is clear. It can be determined that it is good. In addition, when the expression level of the gene in the lung cancer tissue sample of the patient who is the prognosis judgment target is smaller than the expression level in the sample of the patient whose prognosis is clear, the prognosis is clearer than the patient whose prognosis is clear. It can be determined that the prognosis is poor.
ＣＸＣＬ１遺伝子の発現量を指標とした予後の判定は、例えば、以下のように行うことができる。まず、予後が良好であった患者および／または予後が不良であった患者の肺癌組織サンプルと、予後の判定対象である患者の肺癌組織サンプルとでそれぞれ、ＣＸＣＬ１遺伝子の発現量を測定する。予後の判定対象である患者の肺癌組織サンプルにおける当該遺伝子の発現量が、予後が良好であった患者よりも高い場合には、予後は良好であると判定することができる。また、予後の判定対象である患者の肺癌組織サンプルにおける当該遺伝子の発現量が、予後が不良であった患者よりも低い場合には、予後は不良であると判定することができる。また、下記で説明するリスクスコアにより予後を判定してもよい。例えば、リスクスコアが患者全体の平均よりも高い場合には、予後が不良であると判定し、平均よりも低い場合には、予後が良好であると判定してもよい。 The prognosis determination using the expression level of the CXCL1 gene as an index can be performed, for example, as follows. First, the expression level of the CXCL1 gene is measured in a lung cancer tissue sample of a patient with a good prognosis and / or a patient with a poor prognosis and a lung cancer tissue sample of a patient whose prognosis is determined. When the expression level of the gene in a lung cancer tissue sample of a patient who is a prognosis determination target is higher than that of a patient with a good prognosis, it can be determined that the prognosis is good. Further, when the expression level of the gene in a lung cancer tissue sample of a patient who is a prognosis determination target is lower than that of a patient with a poor prognosis, it can be determined that the prognosis is poor. Moreover, you may determine a prognosis by the risk score demonstrated below. For example, when the risk score is higher than the average of all patients, it may be determined that the prognosis is poor, and when the risk score is lower than the average, it may be determined that the prognosis is good.
上述の通り、ＣＸＣＬ１に加えて、さらに他の遺伝子の発現量を指標として予後判定を行ってもよい。その場合、まず、β値が正である遺伝子の発現量を指標とする場合には、予後の判定対象である患者の肺癌組織サンプルにおける当該遺伝子の発現量が、予後が良好であった患者よりも低い場合には、予後は良好であると判定することができる。また、予後の判定対象である患者の肺癌組織サンプルにおける当該遺伝子の発現量が、予後が不良であった患者よりも高い場合には、予後は不良であると判定することができる。次に、β値が負である遺伝子の発現量を指標とする場合には、予後の判定対象である患者の肺癌組織サンプルにおける当該遺伝子の発現量が、予後が良好であった患者よりも高い場合には、予後は良好であると判定することができる。また、予後の判定対象である患者の肺癌組織サンプルにおける当該遺伝子の発現量が、予後が不良であった患者よりも低い場合には、予後は不良であると判定することができる。 As described above, in addition to CXCL1, the prognosis may be determined using the expression level of another gene as an index. In that case, when the expression level of a gene having a positive β value is used as an index, the expression level of the gene in the lung cancer tissue sample of the patient whose prognosis is to be determined is higher than that of a patient with a good prognosis. If it is low, it can be determined that the prognosis is good. In addition, when the expression level of the gene in a lung cancer tissue sample of a patient who is a prognosis determination target is higher than that of a patient with a poor prognosis, it can be determined that the prognosis is poor. Next, when the expression level of a gene having a negative β value is used as an index, the expression level of the gene in a lung cancer tissue sample of a patient whose prognosis is to be determined is higher than that of a patient having a good prognosis In that case, it can be determined that the prognosis is good. Further, when the expression level of the gene in a lung cancer tissue sample of a patient who is a prognosis determination target is lower than that of a patient with a poor prognosis, it can be determined that the prognosis is poor.
例えば、表１の各遺伝子のβ値は、肺癌患者の予後に与える各遺伝子の影響の強さを表すものである。従って、β値の絶対値が大きい１個以上の遺伝子の発現量に基づいて肺癌患者の予後を判定することができる。好ましくは、表１のβ値の絶対値が０．３以上の遺伝子、より好ましくは０．４以上の遺伝子、さらに好ましくは０．５以上の遺伝子、さらにより好ましくは、β値の絶対値が０．７以上である遺伝子から選択される１以上の遺伝子の発現量に基づいて肺癌患者の予後を判定することができる。β値の絶対値が０．７以上である遺伝子としては、例えば、ＩＤ１、ＳＭＯＸ、ＧＡＰＤＨ、ＳＥＰＷ１、ＰＡＫ２およびＧＮＧ１１が挙げられる。複数の遺伝子の発現量に基づいて肺癌患者の予後を判定する場合には、例えば、すべての遺伝子の発現量が、予後が良好であることまたは不良であることを示唆する場合にはそれぞれ、予後が良好であるまたは不良であると判定することができる。これにより判定精度を向上させることが可能となる。複数の遺伝子の発現量を測定した場合に、発現量が指し示す結果が矛盾した場合には、例えば、ＣＸＣＬ１の発現量から示される結果に従って予後を判定してもよいし、下記のリスクスコアにより発現量を統合的に解析して判定してもよい。 For example, the β value of each gene in Table 1 represents the strength of the influence of each gene on the prognosis of lung cancer patients. Therefore, the prognosis of a lung cancer patient can be determined based on the expression level of one or more genes having a large absolute β value. Preferably, the absolute value of β value in Table 1 is 0.3 or more, more preferably 0.4 gene or more, still more preferably 0.5 gene or more, and even more preferably, the absolute value of β value is The prognosis of a lung cancer patient can be determined based on the expression level of one or more genes selected from genes that are 0.7 or more. Examples of genes having an absolute β value of 0.7 or more include ID1, SMOX, GAPDH, SEPW1, PAK2, and GNG11. When determining the prognosis of patients with lung cancer based on the expression level of multiple genes, for example, when the expression level of all genes suggests that the prognosis is good or poor, Can be determined to be good or bad. As a result, the determination accuracy can be improved. When the expression levels of a plurality of genes are measured and the results indicated by the expression levels are contradictory, for example, the prognosis may be determined according to the results indicated by the expression level of CXCL1, and the expression is expressed according to the following risk score The amount may be determined by analyzing the amount in an integrated manner.
ある遺伝子の発現量は、サンプル中の遺伝子の転写産物（すなわち、ｍＲＮＡ）またはその翻訳産物（すなわち、タンパク質）を定量することにより決定することができる。ｍＲＮＡは、ＰＣＲ産物の電気泳動、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、ＤＮＡチップおよびノーザンブロット法などの周知の様々な方法により定量することができる。また、タンパク質は、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）およびウェスタンブロット法などの周知の様々な方法により定量することができる。定量的ＲＴ−ＰＣＲ用のプローブは、当業者であれば適宜設計することができるが、遺伝子名を指定するとプローブ設計から製造までを行う企業が複数存在し、このような企業からプローブの提供を受けることもできる。 The expression level of a gene can be determined by quantifying a gene transcription product (ie, mRNA) or its translation product (ie, protein) in a sample. mRNA can be quantified by various well-known methods such as electrophoresis of PCR products, quantitative RT-PCR, DNA chips and Northern blotting. Proteins can be quantified by various well-known methods such as ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) and Western blotting. Probes for quantitative RT-PCR can be designed as appropriate by those skilled in the art. However, when a gene name is specified, there are several companies that perform probe design to manufacturing, and such companies provide probes. You can also receive it.
ＣＸＣＬ１は、組織中および血中に分泌されることが知られているので、癌患者から採取した癌組織中の発現量を定量してもよいし、血清中に分泌された量を定量してもよい。例えば、ＣＸＣＬ１アッセイキットが市販されており、血清、組織および細胞培養液中のＣＸＣＬ１を定量することが可能である。従って、このような市販のＣＸＣＬ１定量キットを用いてＣＸＣＬ１を定量することも可能である。 Since CXCL1 is known to be secreted into tissues and blood, the expression level in cancer tissues collected from cancer patients may be quantified, or the amount secreted into serum may be quantified. Also good. For example, a CXCL1 assay kit is commercially available, and CXCL1 in serum, tissue, and cell culture medium can be quantified. Therefore, CXCL1 can be quantified using such a commercially available CXCL1 quantification kit.
本発明では、ＣＸＣＬ１の発現量のみによって肺癌の予後を判定することができるが、上述のような遺伝子と組み合わせて評価することにより、判定の精度を向上させることができる。 In the present invention, the prognosis of lung cancer can be determined only by the expression level of CXCL1, but the determination accuracy can be improved by evaluating in combination with the above-described genes.
本発明により、肺癌予後が良好と判定された場合には、その後の補助療法は不要である可能性があり、予後が不良と判定された場合には、その後の補助療法が必要になる可能性がある。補助療法としては、J. Thorac. Oncol., 7, Suppl., 3: S125, 2007に記載された補助療法などが挙げられ、５年生存率が上昇することが報告されている。 According to the present invention, if lung cancer prognosis is determined to be good, subsequent adjuvant therapy may be unnecessary, and if the prognosis is determined to be poor, subsequent adjuvant therapy may be necessary. There is. Adjuvant therapy includes adjuvant therapy described in J. Thorac. Oncol., 7, Suppl., 3: S125, 2007, and the 5-year survival rate has been reported to increase.
本発明の別の側面では、肺癌患者サンプルにおいて、ＣＸＣＬ１を含んでなる複数の遺伝子の発現プロファイルを取得し、その発現プロファイルに基づいて肺癌患者の予後を判定することができる。本発明では、遺伝子の発現プロファイルを得るために測定する遺伝子の数は、測定の手間や費用を低減させる観点では、好ましくは１００以下、より好ましくは７５以下、さらに好ましくは５０以下、さらにより好ましくは、２５以下である。 In another aspect of the present invention, an expression profile of a plurality of genes comprising CXCL1 can be obtained in a lung cancer patient sample, and the prognosis of the lung cancer patient can be determined based on the expression profile. In the present invention, the number of genes to be measured for obtaining a gene expression profile is preferably 100 or less, more preferably 75 or less, even more preferably 50 or less, and even more preferably, from the viewpoint of reducing the labor and cost of measurement. Is 25 or less.
本発明では、遺伝子の発現プロファイルは、好ましくは、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１９、ＡＤＡＭ８、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＡＴＦ２、ＣＥＮＰＦ、ＥＴＳ２、ＧＡＰＤＨ、ＧＮＧ１１、ＧＲＢ１０、ＨＯＰＸ、ＨＳＰＡ８、ＩＤ１、ＩＧＦＢＰ３、ＩＧＦＢＰ６、ＩＬ１ＲＮ、ＩＴＧＢ８、ＩＴＰＲ１、ＭＭＰ１２、ＭＴＨＦＤ２、ＭＶＫ、ＮＤＲＧ１、ＰＡＫ２、ＰＨＬＤＡ２、ＰＩＫ３ＣＤ、ＲＡＣ２、ＳＥＰＷ１、ＳＭＯＸ、ＳＰＤＥＦ、ＳＰＲＹ４、ＴＨＲＡ、ＴＭＳＢ１０、ＵＢＥ２Ｃ、ＵＳＴ、ＶＣＰ、ＶＥＧＦＡおよびＹＷＨＡＱから選択される１以上の遺伝子とＣＸＣＬ１の発現プロファイルに基づいて肺癌患者の予後を判定することができる。 In the present invention, the gene expression profile is preferably ADAM10, ADAM19, ADAM8, ALOX15B, ATF2, CENPF, ETS2, GAPDH, GNG11, GRB10, HOPX, HSPA8, ID1, IGFBP3, IGFBP6, IL1RN, ITGB8, ITPR1, MPPR CXCL1 expression profile with one or more genes selected from MTHFD2, MVK, NDRG1, PAK2, PHLDA2, PIK3CD, RAC2, SEWP1, SMOX, SPDEF, SPRY4, THRA, TMSB10, UBE2C, UST, VCP, VEGFA and YWHAQ Based on this, the prognosis of lung cancer patients can be determined.
例えば、表１の各遺伝子のβ値は、肺癌患者の予後に与える各遺伝子の影響の強さを表すものである。従って、β値の絶対値が大きい１以上の遺伝子とＣＸＣＬ１の発現プロファイルに基づいて肺癌患者の予後を判定することができる。好ましくは、表１のβ値の絶対値が０．３以上の遺伝子、より好ましくは０．４以上の遺伝子、さらに好ましくは０．５以上の遺伝子、さらにより好ましくは０．７以上の遺伝子、具体的には、ＩＤ１、ＳＭＯＸ、ＧＡＰＤＨ、ＳＥＰＷ１、ＰＡＫ２およびＧＮＧ１１から選択される１以上の遺伝子とＣＸＣＬ１の発現プロファイルに基づいて肺癌患者の予後を判定することができる。また、本発明では、好ましくは、ＣＸＣＬ１とＩＤ１、または、ＣＸＣＬ１とＳＭＯＸの発現プロファイルに基づいて肺癌患者の予後を判定することができる。 For example, the β value of each gene in Table 1 represents the strength of the influence of each gene on the prognosis of lung cancer patients. Therefore, the prognosis of a lung cancer patient can be determined based on one or more genes having a large β value and the expression profile of CXCL1. Preferably, the absolute value of β value in Table 1 is 0.3 or more gene, more preferably 0.4 or more gene, still more preferably 0.5 or more gene, even more preferably 0.7 or more gene, Specifically, the prognosis of a lung cancer patient can be determined based on one or more genes selected from ID1, SMOX, GAPDH, SEPW1, PAK2, and GNG11 and the expression profile of CXCL1. In the present invention, preferably, the prognosis of a lung cancer patient can be determined based on the expression profile of CXCL1 and ID1, or CXCL1 and SMOX.
発現プロファイルに基づく肺癌患者の予後判定は、以下のように行うことができる。まず、測定対象となる遺伝子の発現量を測定する。そして各遺伝子の発現量から得られる発現プロファイルを、予後が良好であった肺癌患者および／または予後が不良であった肺癌患者と比較することにより、予後を判定することができる。具体的には、ある肺癌患者サンプルから得られた発現プロファイルが、予後が良好であった肺癌患者と類似している場合、該肺癌患者は、予後が良好であると判定することができる。また、ある肺癌患者サンプルから得られた発現プロファイルが、予後が不良であった肺癌患者と類似している場合、該肺癌患者は、予後が不良であると判定することができる。類似しているか否かは、パターン解析や最小二乗法により判定することができる。これらの類似性の評価は、統計的手法として既に確立されており、当業者であれば適宜選択して用いることができる。 Prognosis determination of a lung cancer patient based on an expression profile can be performed as follows. First, the expression level of the gene to be measured is measured. The prognosis can be determined by comparing the expression profile obtained from the expression level of each gene with a lung cancer patient with a good prognosis and / or a lung cancer patient with a poor prognosis. Specifically, when an expression profile obtained from a sample of a lung cancer patient is similar to a lung cancer patient having a good prognosis, the lung cancer patient can be determined to have a good prognosis. Moreover, when the expression profile obtained from a certain lung cancer patient sample is similar to a lung cancer patient with a poor prognosis, the lung cancer patient can be determined to have a poor prognosis. Whether or not they are similar can be determined by pattern analysis or a least square method. Evaluation of these similarities has already been established as a statistical method, and those skilled in the art can appropriately select and use them.
また、遺伝子発現プロファイルは、各遺伝子発現の強度を数値的に得ることも可能である。従って、遺伝子発現プロファイルの比較は、特に限定されないが、コックスハザード分析などを用いて行うことも可能である。 The gene expression profile can also obtain the intensity of each gene expression numerically. Therefore, the comparison of gene expression profiles is not particularly limited, but can be performed using Cox hazard analysis or the like.
コックスハザード解析では、以下の数式：
によりハザードが計算され、この数式の各係数はカプランマイヤー法で求めた推定値から求めることができることが周知である。
In the Cox hazard analysis, the following formula:
It is well known that the hazard is calculated by the above equation, and each coefficient of this equation can be obtained from the estimated value obtained by the Kaplan-Meier method.
そして、各肺癌患者の予後は、リスクスコアにより判定することができる。具体的には、
で表されるリスクスコアが正である場合には、予後が不良であると判定し、負である場合には予後が良好であると判定することができる。一遺伝子で予後を判定する場合には、患者集団の平均値よりもリスクスコアが高い場合には、予後が不良であると判定し、低い場合には、予後が良好であると判定することができる。
And the prognosis of each lung cancer patient can be determined by a risk score. In particular,
If the risk score represented by is positive, it can be determined that the prognosis is poor, and if it is negative, it can be determined that the prognosis is good. When determining the prognosis with one gene, if the risk score is higher than the average value of the patient population, it is determined that the prognosis is poor, and if it is low, the prognosis is determined to be good. it can.
表１に、コックスハザード分析を行った一例を示す。なお、表１は、実施例２に基づいて計算されたものである。表１中でβ値が正である遺伝子は、発現量が増加するほど、患者の予後が不良であることを示し、β値が負である遺伝子は、発現量が増加するほど、患者の予後が良好であることを示す。
このようにして、本発明によれば、遺伝子プロファイルにより肺癌患者の予後を判定することができる。被験体の予後が良好であるか不良であるかは医師等の判断により決定される。従って、本発明の方法は、癌の予後診断を補助する方法として用いることができる。 Thus, according to the present invention, the prognosis of a lung cancer patient can be determined from the gene profile. Whether the subject's prognosis is good or bad is determined by the judgment of a doctor or the like. Therefore, the method of the present invention can be used as a method for assisting the prognosis of cancer.
本発明の別の側面では、肺癌患者の予後を判定するための予後判定キットが提供される。本発明の予後判定キットは、ＣＸＣＬ１の遺伝子発現量の測定手段を含んでなる。本発明の予後判定キットは、ＳＭＯＸおよび／またはＤＮＡ結合阻害因子１（ＩＤ１）の発現量を測定するための測定手段をさらに含んでいてもよい。遺伝子発現量の測定手段としては、遺伝子の翻訳産物に対する抗体、遺伝子の翻訳産物用のＥＬＩＳＡキット、遺伝子の転写産物を増幅するための、ＰＣＲプライマーセットまたは定量的ＰＣＲ用標識プライマーセットなどが挙げられる。 In another aspect of the present invention, a prognosis determination kit for determining the prognosis of a lung cancer patient is provided. The prognosis determination kit of the present invention comprises means for measuring the gene expression level of CXCL1. The prognosis determination kit of the present invention may further include a measurement means for measuring the expression level of SMOX and / or DNA binding inhibitor 1 (ID1). Examples of the means for measuring gene expression include antibodies to gene translation products, ELISA kits for gene translation products, PCR primer sets for amplifying gene transcription products, and labeled primer sets for quantitative PCR. .
実施例１：肺癌患者の症例に基づく予後判定
本実施例では、予後との関連が疑われた表１に示す３８遺伝子を診断マーカーとして用いてその発現量と予後との関係を明らかにした。
Example 1 Prognosis Determination Based on Cases of Lung Cancer Patients In this example, the relationship between the expression level and prognosis was clarified using 38 genes shown in Table 1 suspected to be associated with prognosis as diagnostic markers.
３８遺伝子としては、表１に示される遺伝子の発現量を評価した。遺伝子の発現量は、定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて評価した。 As the 38 genes, the expression levels of the genes shown in Table 1 were evaluated. The expression level of the gene was evaluated using quantitative RT-PCR.
肺癌患者のサンプルとしては、Shedden K., et al, Nature Medicine, 2008, p822-827に記載された肺腺癌患者１０３症例の癌組織の凍結標本を使用した。 As samples of lung cancer patients, frozen specimens of cancer tissues of 103 lung adenocarcinoma patients described in Shedden K., et al, Nature Medicine, 2008, p822-827 were used.
肺癌患者の癌組織からのｍＲＮＡの抽出は、RNeasy kit（キアゲン社）を用いて行った。常法によりｃＤＮＡを作製し、その後、定量的ＲＴ−ＰＣＲは、TaqMan Low Density Array（商標）（Life Technology社）を用いて製造者マニュアルに従って行った。定量的ＰＣＲは、Applied Biosystems社製7900HT Fast Real-Time Systemを用いてデフォルト設定で行った。定量的ＰＣＲは、Life Technology社から表２のＩＤにより入手できるプライマーおよびTaqman probeを用いて実施した。定量的ＰＣＲの内部対照としては、アクチンを用いた。各遺伝子の発現量は、アクチンで標準化して求めた。 Extraction of mRNA from cancer tissues of lung cancer patients was performed using RNeasy kit (Qiagen). CDNA was prepared by a conventional method, and then quantitative RT-PCR was performed according to the manufacturer's manual using TaqMan Low Density Array (trademark) (Life Technology). Quantitative PCR was performed using Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time System with default settings. Quantitative PCR was performed using primers and Taqman probe available from Life Technology by ID in Table 2. Actin was used as an internal control for quantitative PCR. The expression level of each gene was obtained by standardizing with actin.
実施例２：リスクスコアリングモデルの構築
本実施例では、実施例１で調べた３８遺伝子についてリスクスコアリングモデルを構築した。
Example 2: Construction of risk scoring model In this example, a risk scoring model was constructed for the 38 genes examined in Example 1.
リスクスコアリングモデルの構築には、コックス比較ハザードモデルを用いた。コックス比較ハザードモデルによれば、以下の数式：
によりハザードが計算され、この数式の各係数は実施例１に記載した１０３症例に関するカプランマイヤー曲線から求めた。
The Cox comparison hazard model was used to construct the risk scoring model. According to the Cox comparison hazard model, the following formula:
The hazard was calculated by the following equation, and each coefficient of this equation was obtained from the Kaplan-Meier curve for 103 cases described in Example 1.
その結果、各遺伝子のβ値は、表３の通りであった。
ここで、各患者のリスクスコアは、
で表されるリスクスコアが大きいときには、予後が不良であることを意味し、リスクスコアが小さいときには、予後が良好であることを意味する。以下の実施例では、リスクスコアが正である場合には予後が不良である可能性が高いと判定し、リスクスコアが負である場合には予後が不良である可能性が低いと判定した。
Where the risk score for each patient is
When the risk score represented by is large, it means that the prognosis is poor, and when the risk score is small, it means that the prognosis is good. In the following examples, when the risk score is positive, it is determined that the prognosis is likely to be bad, and when the risk score is negative, it is determined that the possibility that the prognosis is poor is low.
実施例３：肺癌患者の予後判定
本実施例では、実施例２で求めたリスクスコアリングモデルを用いて、ステージＩ、ＩＩおよびＩＩＩの別の肺腺癌患者１０１例の凍結標本での遺伝子発現プロファイルを求め、予後を判定した。
Example 3 Prognosis Determination of Lung Cancer Patients In this example, gene expression in frozen specimens of 101 other lung adenocarcinoma patients at stage I, II and III using the risk scoring model determined in Example 2 A profile was determined to determine prognosis.
すると、驚くべきことに、他の３７遺伝子では、１遺伝子による予後判定を可能とする条件が見いだせなかったのに対して（データ示さず）、ＣＸＣＬ１遺伝子については、１遺伝子で肺癌の予後判定に成功した（図１Ａ）。このとき、各患者のＣＸＣＬ１の発現量から１０１例の凍結標本におけるＣＸＣＬ１の発現量の平均値を差し引いた値でリスクスコアを求め、リスクスコアが正の場合にはリスクが高いと判定し、リスクスコアが低い場合にはリスクが低いと判定した。 Surprisingly, in the other 37 genes, conditions that allow prognosis determination by one gene were not found (data not shown), whereas for CXCL1 gene, one gene was used for prognosis determination of lung cancer. Successful (FIG. 1A). At this time, the risk score is obtained by subtracting the average value of the expression level of CXCL1 in 101 frozen specimens from the expression level of CXCL1 of each patient. If the risk score is positive, it is determined that the risk is high. If the score was low, the risk was determined to be low.
このことから、ＣＸＣＬ１遺伝子は、１遺伝子であっても予後判定に用いることが可能であることが分かった。 From this, it was found that the CXCL1 gene can be used for prognosis determination even if it is one gene.
次に、ＣＸＣＬ１遺伝子と他の遺伝子を組み合せてリスクスコアを求め、予後判定を試みた。すると、他の遺伝子を組み合わせた場合でも予後判定が可能であった。例えば、ＣＸＣＬ１とＩＤ１を組み合わせてリスクスコアを求めて判定した場合、およびＣＸＣＬ１とＳＭＯＸを組み合わせてリスクスコアを求めて判定した場合の例をそれぞれ図１Ｂおよび１Ｃに示す。図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃのいずれのケースでも、ｐ＜０．０５であり、統計的に有意であった。このように、ＣＸＣＬ１は、１遺伝子でも予後判定に用いることができたが、他の遺伝子と組み合わせても予後判定に用いることができた。 Next, a risk score was obtained by combining the CXCL1 gene with other genes, and prognosis was attempted. Then, even when other genes were combined, the prognosis could be determined. For example, FIG. 1B and FIG. 1C show an example of the case where the risk score is determined by combining CXCL1 and ID1, and the case where the risk score is determined by combining CXCL1 and SMOX, respectively. In all cases of FIGS. 1A, 1B and 1C, p <0.05, which was statistically significant. Thus, although CXCL1 could be used for prognosis determination even with one gene, it could be used for prognosis determination even when combined with other genes.
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