JP2015062388A - Method for detecting quadruple helical structure of nucleic acid chain - Google Patents
Method for detecting quadruple helical structure of nucleic acid chain Download PDFInfo
- Publication number
- JP2015062388A JP2015062388A JP2013199029A JP2013199029A JP2015062388A JP 2015062388 A JP2015062388 A JP 2015062388A JP 2013199029 A JP2013199029 A JP 2013199029A JP 2013199029 A JP2013199029 A JP 2013199029A JP 2015062388 A JP2015062388 A JP 2015062388A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- fluorescent substance
- ligand
- acid probe
- quadruplex structure
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 title claims abstract description 191
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 claims abstract description 123
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 claims abstract description 123
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 111
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 83
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims abstract description 40
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 25
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 79
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 79
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 40
- JADVWWSKYZXRGX-UHFFFAOYSA-M thioflavine T Chemical compound [Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=[N+](C)C2=CC=C(C)C=C2S1 JADVWWSKYZXRGX-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 30
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 29
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 19
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 claims description 8
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 5
- RBTKNAXYKSUFRK-UHFFFAOYSA-N heliogen blue Chemical compound [Cu].[N-]1C2=C(C=CC=C3)C3=C1N=C([N-]1)C3=CC=CC=C3C1=NC([N-]1)=C(C=CC=C3)C3=C1N=C([N-]1)C3=CC=CC=C3C1=N2 RBTKNAXYKSUFRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 41
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 39
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 28
- 239000000463 material Substances 0.000 description 25
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 23
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 18
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 16
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 14
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 14
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 13
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 13
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 102100021569 Apoptosis regulator Bcl-2 Human genes 0.000 description 9
- 108091012583 BCL2 Proteins 0.000 description 9
- 102100039788 GTPase NRas Human genes 0.000 description 9
- 101000744505 Homo sapiens GTPase NRas Proteins 0.000 description 9
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- WMFOQBRAJBCJND-UHFFFAOYSA-M lithium hydroxide Inorganic materials [Li+].[OH-] WMFOQBRAJBCJND-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 6
- 108091081406 G-quadruplex Proteins 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 4
- FGBAVQUHSKYMTC-UHFFFAOYSA-M LDS 751 dye Chemical compound [O-]Cl(=O)(=O)=O.C1=CC2=CC(N(C)C)=CC=C2[N+](CC)=C1C=CC=CC1=CC=C(N(C)C)C=C1 FGBAVQUHSKYMTC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- -1 diethylmethylammonio Chemical group 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N guanidine group Chemical group NC(=N)N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-2,5'-bibenzimidazole Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JSBNEYNPYQFYNM-UHFFFAOYSA-J YoYo-3 Chemical compound [I-].[I-].[I-].[I-].C12=CC=CC=C2C(C=CC=C2N(C3=CC=CC=C3O2)C)=CC=[N+]1CCC(=[N+](C)C)CCCC(=[N+](C)C)CC[N+](C1=CC=CC=C11)=CC=C1C=CC=C1N(C)C2=CC=CC=C2O1 JSBNEYNPYQFYNM-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N acridine orange free base Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 2
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Natural products C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- DJLHTAIFMAKJST-UHFFFAOYSA-N 1h-indole-6-carboximidamide Chemical compound NC(=N)C1=CC=C2C=CNC2=C1 DJLHTAIFMAKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ILZVMRNIDNNCGW-UHFFFAOYSA-N 2-(3h-benzimidazol-5-yl)-1h-benzimidazole Chemical compound C1=CC=C2NC(C3=CC=C4N=CNC4=C3)=NC2=C1 ILZVMRNIDNNCGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101001030211 Homo sapiens Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZVUUXEGAYWQURQ-UHFFFAOYSA-L Yo-Pro-3 Chemical compound [I-].[I-].O1C2=CC=CC=C2[N+](C)=C1C=CC=C1C2=CC=CC=C2N(CCC[N+](C)(C)C)C=C1 ZVUUXEGAYWQURQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- VSTHNGLPHBTRMB-UHFFFAOYSA-N acridine orange Chemical compound [H+].[Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 VSTHNGLPHBTRMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YBHILYKTIRIUTE-UHFFFAOYSA-N berberine Chemical compound C1=C2CC[N+]3=CC4=C(OC)C(OC)=CC=C4C=C3C2=CC2=C1OCO2 YBHILYKTIRIUTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940093265 berberine Drugs 0.000 description 1
- QISXPYZVZJBNDM-UHFFFAOYSA-N berberine Natural products COc1ccc2C=C3N(Cc2c1OC)C=Cc4cc5OCOc5cc34 QISXPYZVZJBNDM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000032677 cell aging Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000002768 hair cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003505 heat denaturation Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
本発明は、核酸鎖の四重螺旋構造の検出方法、より詳細には配列特異的に核酸鎖の四重螺旋構造を検出する方法に関する。更に、本発明は、当該核酸鎖の四重螺旋構造の検出方法を行うための検出キットに関する。 The present invention relates to a method for detecting a quadruplex structure of a nucleic acid chain, and more particularly to a method for detecting a quadruplex structure of a nucleic acid chain in a sequence-specific manner. Furthermore, this invention relates to the detection kit for performing the detection method of the quadruplex structure of the said nucleic acid chain | strand.
ＲＮＡやＤＮＡ等の核酸鎖において、グアニジンに富む配列部分がグアニン四量体（Ｇ-ｑｕａｒｔｅｔ）を形成して四重螺旋構造を形成することが知られている。核酸鎖の四重螺旋構造は、様々な遺伝子の発現や酵素機能を制御することで、細胞の加齢、ガン化等に関与していることが知られている。 In nucleic acid strands such as RNA and DNA, it is known that a sequence portion rich in guanidine forms a guanine tetramer (G-quartet) to form a quadruplex structure. The quadruplex structure of a nucleic acid chain is known to be involved in cell aging, canceration, and the like by controlling the expression of various genes and enzyme functions.
また、四重螺旋構造を形成できる塩基配列は、ＤＮＡでは３０万種類以上、ＲＮＡでは３千種類以上存在すると考えられており（非特許文献１参照）、特に、ガン関連遺伝子（例えば、Ｃ−ＭＹＣ、ＮＲＡＳ、ＢＣＬ２等）、細胞分化関連遺伝子（例えば、ＨＣＫ等）、血管新生関連遺伝子（例えば、ＶＥＧＦ等）、翻訳因子（例えば、ＦＯＳ等）のｍＲＮＡには、四重螺旋構造を形成できる配列が局在化していることも知られている。そのため、医薬品やバイオプローブの開発の観点から、配列特異的に核酸鎖の四重螺旋構造を検出する技術が求められている。 In addition, it is considered that there are 300,000 or more nucleotide sequences that can form a quadruplex structure and 3,000 or more RNAs (see Non-Patent Document 1), and particularly cancer-related genes (for example, C- MYC, NRAS, BCL2, etc.), cell differentiation-related genes (eg, HCK, etc.), angiogenesis-related genes (eg, VEGF, etc.), translation factors (eg, FOS, etc.) mRNA can form a quadruplex structure. It is also known that the sequence is localized. Therefore, from the viewpoint of development of pharmaceuticals and bioprobes, a technique for detecting a quadruplex structure of a nucleic acid chain in a sequence-specific manner is required.
これまでに、ベルベリン、チオフラビンＴ、銅フタロシアニンテトラスルホン酸、Ｎ―メチルメソポルフィリン（ＮＭＭ）等の低分子化合物は、核酸鎖の四重螺旋構造に対して親和性と特異性を持ち、核酸鎖の四重螺旋構造と結合すると蛍光を発する性質があることが解明されており、従来、核酸鎖の四重螺旋構造の検出には、これらの低分子化合物（リガンド）が使用されている（非特許文献２参照）。 So far, low molecular weight compounds such as berberine, thioflavin T, copper phthalocyanine tetrasulfonic acid, N-methylmesoporphyrin (NMM) have affinity and specificity for the quadruplex structure of the nucleic acid chain. It has been elucidated that it has the property of emitting fluorescence when it binds to the quadruplex structure, and these low-molecular compounds (ligands) have been conventionally used to detect the quadruplex structure of nucleic acid strands (non-ligand) Patent Document 2).
しかしながら、このような低分子化合物では、極めて多様な配列が形成する類似の４重螺旋構造を配列特異的に識別することができない。とりわけ、ＲＮＡが形成する四重螺旋構造は、配列に依らず立体構造の類似性が極めて高いことが知られており（非特許文献３参照）、従来技術で、ＲＮＡの四重螺旋構造を配列特異的に識別することは不可能といえる。 However, such a low molecular weight compound cannot distinguish a similar quadruple helical structure formed by extremely diverse sequences in a sequence-specific manner. In particular, it is known that the quadruplex structure formed by RNA has extremely high three-dimensional similarity regardless of the sequence (see Non-Patent Document 3). It can be said that it cannot be specifically identified.
そこで、核酸鎖の四重螺旋構造を配列特異的に検出する技術を開発できれば、疾患の診断、治療薬の開発、生理機能の究明等に福音をもたらすことが期待される。 Thus, if a technique for detecting the quadruplex structure of a nucleic acid chain in a sequence-specific manner can be developed, it is expected to bring the gospel to disease diagnosis, development of therapeutic agents, investigation of physiological functions, and the like.
本発明の目的は、核酸鎖の四重螺旋構造を配列特異的に検出する技術を開発することにある。即ち、本発明は、核酸鎖の四重螺旋構造を配列特異的に検出する方法、及び当該検出方法に使用される検出キットを提供することを目的とする。 An object of the present invention is to develop a technique for detecting a quadruplex structure of a nucleic acid chain in a sequence-specific manner. That is, an object of the present invention is to provide a method for detecting a quadruplex structure of a nucleic acid chain in a sequence-specific manner and a detection kit used in the detection method.
本発明者は、前記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、(i)核酸鎖の四重螺旋構造に特異的に結合でき、当該四重螺旋構造に結合すると蛍光を発する蛍光物質からなるリガンドと、(ii)蛍光物質で標識されてなる核酸プローブであって、標的となる四重螺旋構造を有する核酸鎖に存在し、且つ当該四重螺旋構造から蛍光エネルギー移動が可能な領域に位置している塩基配列に対してハイブリダイズできる相補鎖を有するプローブとを含み、且つ前記(i)リガンドと前記(ii)核酸プローブに標識された蛍光物質として、蛍光エネルギー移動におけるドナー蛍光物質とアクセプター蛍光物質の関係にあるものを使用することによって、核酸鎖の四重螺旋構造を配列特異的に検出できることを見出した。より具体的には、検出対象となる四重螺旋構造を有する核酸鎖に対して前記(i)リガンドと前記(ii)プローブを接触させると、前記(i)リガンドが四重螺旋構造に特異的に結合し、更に前記(ii)核酸プローブが検出対象となる四重螺旋構造を有する核酸鎖を特異的に認識して結合することにより、検出対象となる四重螺旋構造を有する核酸鎖には前記(i)リガンドと前記(ii)核酸プローブが結合した状態になり、前記(i)リガンドと前記(ii)核酸プローブに標識された蛍光物質によって蛍光エネルギー移動（fluorescence resonance energy transfer：ＦＲＥＴ）が生じる。この蛍光エネルギー移動を測定することにより、検出対象となる四重螺旋構造を有する核酸鎖の検出が可能になる。 The present inventor has conducted extensive studies to solve the above problems, and comprises (i) a fluorescent substance that can specifically bind to the quadruplex structure of a nucleic acid chain and emits fluorescence when bound to the quadruplex structure. A nucleic acid probe labeled with a ligand and (ii) a fluorescent substance, which is present in a target nucleic acid chain having a quadruplex structure and located in a region where fluorescence energy can be transferred from the quadruplex structure. A donor fluorescent substance and an acceptor in fluorescence energy transfer as a fluorescent substance labeled with the (i) ligand and the (ii) nucleic acid probe. It has been found that by using a fluorescent substance, the quadruplex structure of the nucleic acid chain can be detected in a sequence-specific manner. More specifically, when the (i) ligand and the (ii) probe are brought into contact with a nucleic acid chain having a quadruplex structure to be detected, the (i) ligand is specific to the quadruplex structure. And (ii) the nucleic acid probe having a quadruplex structure to be detected by specifically recognizing and binding to the nucleic acid chain having the quadruplex structure to be detected. The (i) ligand and the (ii) nucleic acid probe are combined, and fluorescence energy transfer (FRET) is caused by the fluorescent substance labeled on the (i) ligand and the (ii) nucleic acid probe. Arise. By measuring this fluorescence energy transfer, it becomes possible to detect a nucleic acid chain having a quadruple helical structure to be detected.
本発明は、かかる知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。即ち、本発明は、下記に掲げる態様の検出方法及び検出キットを提供する。
項１． 下記第１工程及び第２工程を含むことを特徴とする、核酸鎖の四重螺旋構造を配列特異的に検出する方法：
第１工程：被検核酸試料に対して(i)リガンドと(ii)核酸プローブを接触させる工程；
ここで、前記(i)リガンドが、核酸鎖の四重螺旋構造に特異的に結合でき、当該四重螺旋構造に結合すると蛍光を発する蛍光物質からなるリガンドであり、
前記(ii)核酸プローブが、蛍光物質で標識されてなる核酸プローブであって、標的となる四重螺旋構造を有する核酸鎖に存在し、且つ当該四重螺旋構造から蛍光エネルギー移動が可能な領域に位置している塩基配列に対してハイブリダイズできる塩基配列を有するプローブであり、
前記(i)リガンドと前記(ii)核酸プローブに標識された蛍光物質が、蛍光エネルギー移動におけるドナー蛍光物質とアクセプター蛍光物質の関係にある。
第２工程：前記ドナー蛍光物質を励起させて蛍光エネルギー移動を測定する工程。
項２． 前記被検核酸試料がＲＮＡを含む試料であり、ＲＮＡの四重螺旋構造を配列特異的に検出する、項１に記載の検出方法。
項３． 前記(i)リガンドが、チオフラビンＴ、銅フタロシアニンテトラスルホン酸及びその塩、並びにＮ―メチルメソポルフィリンよりなる群から選択される少なくとも１種である、項１又は２に記載の検出方法。
項４． 前記核酸鎖において、前記(ii)核酸プローブがハイブリダイズする領域の塩基配列の３’末端が、核酸鎖において標的となる四重螺旋構造を形成している塩基配列の５’末端の塩基をｎ位とした場合にｎ−１位〜ｎ−２５位である、項１〜３のいずれかに記載の検出方法。
項５． 前記核酸鎖において、前記(ii)核酸プローブがハイブリダイズする領域の塩基配列の５’末端が、核酸鎖において標的となる四重螺旋構造を形成している塩基配列の３’末端の塩基をｎ位とした場合にｎ＋１位〜ｎ＋２５位である、項１〜３のいずれかに記載の検出方法。
項６． 前記(ii)核酸プローブに含まれる塩基数が５〜２０個である、項１〜５のいずれかに記載の検出方法。
項７． 前記(i)リガンドがチオフラビンＴであり、(ii)核酸プローブを標識している蛍光物質がＲＯＸである、項１〜６のいずれかに記載の検出方法。
項８． 核酸鎖の四重螺旋構造を配列特異的に検出するための検出キットであって、
(i)核酸鎖の四重螺旋構造に特異的に結合でき、当該四重螺旋構造に結合すると蛍光を発する蛍光物質からなるリガンドと、
(ii)蛍光物質で標識されてなる核酸プローブであって、標的となる四重螺旋構造を有する核酸鎖に存在し、且つ当該四重螺旋構造から蛍光エネルギー移動が可能な領域に位置している塩基配列に対してハイブリダイズできる相補鎖を有する核酸プローブと、を含み、
前記(i)リガンドと前記(ii)核酸プローブに標識された蛍光物質が、蛍光エネルギー移動におけるドナー蛍光物質とアクセプター蛍光物質の関係にある、ことを特徴とする、検出キット。
The present invention has been completed by further studies based on such knowledge. That is, this invention provides the detection method and detection kit of the aspect hung up below.
Item 1. A method for detecting a quadruplex structure of a nucleic acid strand in a sequence-specific manner, comprising the following first step and second step:
First step: (i) a ligand and (ii) a nucleic acid probe are brought into contact with a test nucleic acid sample;
Here, the ligand (i) is a ligand composed of a fluorescent substance that can specifically bind to the quadruplex structure of the nucleic acid chain and emits fluorescence when bound to the quadruplex structure.
(Ii) The nucleic acid probe is a nucleic acid probe labeled with a fluorescent substance, present in a nucleic acid chain having a target quadruple helical structure, and a region where fluorescence energy can be transferred from the quadruple helical structure A probe having a base sequence capable of hybridizing to the base sequence located at
The fluorescent substance labeled with the (i) ligand and the (ii) nucleic acid probe has a relationship between a donor fluorescent substance and an acceptor fluorescent substance in fluorescence energy transfer.
Second step: a step of measuring fluorescence energy transfer by exciting the donor fluorescent substance.
Item 2. Item 2. The detection method according to Item 1, wherein the test nucleic acid sample is a sample containing RNA, and the quadruplex structure of RNA is detected in a sequence-specific manner.
Item 3. Item 3. The detection method according to Item 1 or 2, wherein (i) the ligand is at least one selected from the group consisting of thioflavin T, copper phthalocyanine tetrasulfonic acid and salts thereof, and N-methylmesoporphyrin.
Item 4. In the nucleic acid chain, (ii) the 3 ′ end of the base sequence in the region to which the nucleic acid probe hybridizes is the n ′ base at the 5 ′ end of the base sequence forming the target quadruplex structure in the nucleic acid chain. Item 4. The detection method according to any one of Items 1 to 3, wherein the position is n-1 position to n-25 position.
Item 5. In the nucleic acid chain, (ii) the 5 ′ end of the base sequence of the region to which the nucleic acid probe hybridizes is the n ′ base at the 3 ′ end of the base sequence forming the target quadruplex structure in the nucleic acid chain. Item 4. The detection method according to any one of Items 1 to 3, wherein the position is n + 1 position to n + 25 position.
Item 6. Item 6. The detection method according to any one of Items 1 to 5, wherein the nucleic acid probe contains 5 to 20 bases.
Item 7. Item 7. The detection method according to any one of Items 1 to 6, wherein (i) the ligand is thioflavin T, and (ii) the fluorescent substance that labels the nucleic acid probe is ROX.
Item 8. A detection kit for sequence-specific detection of a quadruplex structure of a nucleic acid chain,
(i) a ligand consisting of a fluorescent substance that can specifically bind to the quadruplex structure of a nucleic acid chain and emits fluorescence when bound to the quadruplex structure;
(ii) a nucleic acid probe labeled with a fluorescent substance, present in a target nucleic acid chain having a quadruplex structure and located in a region where fluorescence energy can be transferred from the quadruplex structure A nucleic acid probe having a complementary strand capable of hybridizing to the base sequence,
The detection kit, wherein the fluorescent substance labeled with the (i) ligand and the (ii) nucleic acid probe has a relationship between a donor fluorescent substance and an acceptor fluorescent substance in fluorescence energy transfer.
本発明によれば、核酸鎖の四重螺旋構造を配列特異的に検出することができる。特に、本発明によれば、配列に依らず立体構造の類似性が極めて高いことが知られているＲＮＡの四重螺旋構造であっても、配列特異的にＲＮＡの四重らせん構造を検出することが可能になっている。 According to the present invention, the quadruplex structure of a nucleic acid chain can be detected in a sequence-specific manner. In particular, according to the present invention, even in the case of an RNA quadruplex structure that is known to have extremely high three-dimensional similarity regardless of the sequence, the RNA quadruplex structure is detected in a sequence-specific manner. It is possible.
また、本発明を利用した配列特異的な四重螺旋構造の検出技術は、癌細胞等の検出キットの開発、新規バイオマーカーの探索、新たな四重螺旋構造のリガンドとなる化合物の探索、核酸鎖の四重螺旋構造を標的とした医薬の開発、核酸鎖で四重螺旋構造を形成する部位の特定等の検討を加速させ、様々な分野で福音をもたらすことが期待される。 In addition, sequence-specific quadruplex structure detection technology using the present invention includes the development of detection kits for cancer cells, search for new biomarkers, search for compounds that serve as ligands for new quadruplex structures, nucleic acids It is expected to accelerate the development of pharmaceuticals targeting the quadruplex structure of the chain and the identification of the site that forms the quadruplex structure in the nucleic acid chain, thereby bringing the gospel in various fields.
１．核酸鎖の四重螺旋構造の検出方法
本発明の検出方法は、核酸鎖の四重螺旋構造を配列特異的に検出する方法であって、被検核酸試料に対して(i)特定のリガンドと(ii)特定の核酸プローブを接触させる第１工程、及び蛍光エネルギー移動を測定する第２工程を含むことを特徴とする。以下、本発明の検出方法について詳述する。
1. Method for detecting quadruplex structure of nucleic acid chain The detection method of the present invention is a method for detecting the quadruplex structure of a nucleic acid chain in a sequence-specific manner, and comprises (i) a specific ligand and a test nucleic acid sample. (ii) It includes a first step of contacting a specific nucleic acid probe and a second step of measuring fluorescence energy transfer. Hereinafter, the detection method of the present invention will be described in detail.
[検出対象]
図１に示すように、ＲＮＡやＤＮＡ等の核酸鎖において、グアニジンに富む塩基配列部分がグアニン四量体（Ｇ−ｑｕａｒｔｅｔ）を形成して四重螺旋構造（Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ）を形成することが知られている。本発明の検出方法では、核酸鎖における四重螺旋構造を配列特異的に検出する。
[Detection target]
As shown in FIG. 1, in a nucleic acid chain such as RNA or DNA, a base sequence portion rich in guanidine forms a guanine tetramer (G-quartet) to form a quadruplex structure (G-quadruplex). Are known. In the detection method of the present invention, the quadruplex structure in the nucleic acid chain is detected in a sequence-specific manner.
また、本発明の検出対象となる核酸鎖は、ＲＮＡ、ＤＮＡのいずれであってもよい。ＲＮＡにおいて、四重螺旋構造は、塩基配列の種類に依らず平行型と呼ばれる立体構造を形成し、従来の四重螺旋構造の検出方法では、配列特異的な検出は不可能であったが、本発明によれば、ＲＮＡの四重螺旋構造を配列特異的に検出することができる。かかる本発明の効果に鑑みれば、本発明の検出対象となる核酸鎖として、好ましくはＲＮＡ、更に好ましくはｍＲＮＡが挙げられる。 Further, the nucleic acid chain to be detected in the present invention may be either RNA or DNA. In RNA, the quadruplex structure forms a three-dimensional structure called a parallel type regardless of the type of base sequence, and sequence-specific detection was impossible with the conventional detection method of the quadruplex structure, According to the present invention, the quadruplex structure of RNA can be detected in a sequence-specific manner. In view of the effects of the present invention, the nucleic acid chain to be detected in the present invention is preferably RNA, more preferably mRNA.
また、本発明の検出対象となる核酸鎖の種類については特に制限されず、四重螺旋構造の検出目的等に応じて適宜設定されるが、例えば、Ｃ−ＭＹＣ、ＮＲＡＳ、ＢＣＬ２等のガン関連遺伝子；ＨＣＫ等の細胞分化関連遺伝子；ＶＥＧＦ等の血管新生関連遺伝子；ＦＯＳ等翻訳因子；これらのｍＲＮＡ等が挙げられる。 In addition, the type of the nucleic acid chain to be detected in the present invention is not particularly limited, and is appropriately set according to the purpose of detecting the quadruplex structure, for example, cancer-related such as C-MYC, NRAS, BCL2, etc. Genes; cell differentiation-related genes such as HCK; angiogenesis-related genes such as VEGF; translation factors such as FOS; and mRNAs thereof.
また、本発明の検出対象となる核酸鎖の由来についても、特に制限されず、ヒト又は非ヒト動物から採取した生体サンプル（血液、毛髪細胞、粘膜細胞、皮膚細胞、組織等）であってもよく、またiPS細胞等の人工的に作成された細胞、培養細胞、ＰＣＲ法や化学合成法等によって人工的に製造されたもの等であってもよい。 In addition, the origin of the nucleic acid chain to be detected in the present invention is not particularly limited, and it may be a biological sample (blood, hair cell, mucosal cell, skin cell, tissue, etc.) collected from a human or non-human animal. Alternatively, artificially produced cells such as iPS cells, cultured cells, artificially produced by PCR method, chemical synthesis method, or the like may be used.
本発明の検出対象となる核酸鎖の塩基数については、特に制限されないが、例えば、１０〜１０００塩基、好ましくは２５〜２００塩基、更に好ましくは３５〜５０塩基が挙げられる。 Although it does not restrict | limit especially about the base number of the nucleic acid chain used as the detection object of this invention, For example, 10-1000 bases, Preferably it is 25-200 bases, More preferably, 35-50 bases is mentioned.
本発明は、被検核酸試料において、検出対象となる核酸鎖の四重螺旋構造を定性的又は定量的に検出する方法であり、当該被検核酸試料は、ＲＮＡ又はＤＮＡの公知の抽出法によって調製することができる。 The present invention is a method for qualitatively or quantitatively detecting a quadruplex structure of a nucleic acid chain to be detected in a test nucleic acid sample, and the test nucleic acid sample is obtained by a known extraction method for RNA or DNA. Can be prepared.
[(i)リガンド]
本発明では、リガンドとして、核酸鎖の四重螺旋構造に特異的に結合でき、当該四重螺旋構造に結合すると蛍光を発する蛍光物質を使用する。
[(i) Ligand]
In the present invention, a fluorescent substance that can specifically bind to the quadruplex structure of a nucleic acid chain and emits fluorescence when bound to the quadruplex structure is used as a ligand.
核酸鎖の四重螺旋構造に特異的に結合可能で、当該四重螺旋構造に結合すると蛍光を発する蛍光物質については公知である。このような特性を示す蛍光物質としては、具体的には、チオフラビンＴ（Ｅｘ４５０ｎｍ、Ｅｍ４８５ｎｍ）、銅フタロシアニンテトラスルホン酸又はそのナトリウム塩等の塩（Ｅｘ６６０ｎｍ、Ｅｍ６６８０ｎｍ）、Ｎ―メチルメソポルフィリン（Ｅｘ３９９ｎｍ、Ｅｍ６１０ｎｍ）等が挙げられる。なお、前記蛍光物質に示す括弧内の「Ｅｘ」は励起波長、「Ｅｍ」は四重螺旋構造に結合した状態で当該励起波長の光照射を受けた際に発する蛍光波長である。 Fluorescent substances that can specifically bind to the quadruplex structure of a nucleic acid chain and emit fluorescence when bound to the quadruplex structure are known. Specific examples of fluorescent substances exhibiting such characteristics include thioflavin T (Ex450 nm, Em485 nm), copper phthalocyanine tetrasulfonic acid or a salt thereof such as its sodium salt (Ex660 nm, Em6680 nm), N-methylmesoporphyrin (Ex399 nm, Em610nm) and the like. Note that “Ex” in parentheses shown in the fluorescent material is an excitation wavelength, and “Em” is a fluorescence wavelength emitted when irradiated with light of the excitation wavelength in a state of being coupled to a quadruple spiral structure.
これらのリガンドは、後述する(ii)核酸プローブを標識している蛍光物質との関係に基づいて、蛍光エネルギー移動が生じ得るものを適宜選択すればよい。 These ligands may be appropriately selected from those that can cause fluorescence energy transfer based on the relationship with a fluorescent substance that is labeled with (ii) a nucleic acid probe described later.
[(ii)核酸プローブ]
本発明では、検出対象となる特定の核酸鎖に結合する蛍光標識核酸プローブを使用する。
[(ii) Nucleic acid probe]
In the present invention, a fluorescently labeled nucleic acid probe that binds to a specific nucleic acid chain to be detected is used.
当該核酸プローブとして、標的となる四重螺旋構造を有する核酸鎖に存在する塩基配列であって、当該四重螺旋構造から蛍光エネルギー移動が可能な領域に位置している塩基配列に対してハイブリダイズできる塩基配列を有するものを使用する。 As the nucleic acid probe, it hybridizes to a base sequence present in a nucleic acid chain having a target quadruplex structure and located in a region where fluorescence energy can be transferred from the quadruplex structure. Those having a possible base sequence are used.
ここで、標的となる四重螺旋構造から蛍光エネルギー移動が可能な領域に位置している塩基配列（以下、「核酸プローブ標的配列」と表記することもある）とは、標的となる四重螺旋構造を有する核酸鎖に存在し、且つ当該四重螺旋構造に前記(i)リガンドが結合した際に、蛍光エネルギー移動が可能な領域に存在する塩基配列である。このような塩基配列にハイブリダイズできるプローブを使用することによって、前記前記(i)リガンドと当該核酸プローブに結合している蛍光物質によって蛍光エネルギー移動を生じさせることが可能になる。 Here, the base sequence located in a region where fluorescence energy transfer is possible from the target quadruple spiral structure (hereinafter sometimes referred to as “nucleic acid probe target sequence”) is the target quadruple spiral. This is a base sequence that exists in a nucleic acid chain having a structure and exists in a region where fluorescence energy transfer is possible when the ligand (i) is bound to the quadruplex structure. By using a probe capable of hybridizing to such a base sequence, fluorescence energy transfer can be caused by the fluorescent substance bound to the (i) ligand and the nucleic acid probe.
核酸プローブ標的配列として、具体的には、核酸鎖において、標的となる四重螺旋構造を形成している塩基配列の５’末端又は３’末端の塩基を起点として、当該起点となる塩基に対して結合している塩基又は１〜１５塩基離れた領域にある塩基を開始点とする塩基配列が挙げられる。より具体的には、核酸鎖において、標的となる四重螺旋構造を形成している塩基配列の５’末端の塩基をｎ位とした場合に、ｎ−１位〜ｎ−２５位、好ましくはｎ−２位〜ｎ−１５位の塩基を開始点（３’末端）として核酸鎖の５’末端側に位置する塩基配列；標的となる四重螺旋構造を形成している塩基配列の３’末端の塩基をｎ位とした場合に、ｎ＋１位〜−ｎ＋２５位、好ましくはｎ＋２位〜−（ｎ＋１５）位の塩基を開始点（５’末端）として核酸鎖の３’末端側に位置する塩基配列が挙げられる。なお、本明細書において、塩基配列における塩基の位置に関する表記は、起点となる塩基をｎ位とした場合に、起点となる塩基から５’末端側にｍ番目に位置する塩基をｎ−ｍ位とし、起点となる塩基から３’末端側にｍ番目に位置する塩基をｎ＋ｍ位とする。 As a nucleic acid probe target sequence, specifically, in the nucleic acid chain, starting from the base at the 5 ′ end or 3 ′ end of the base sequence forming the target quadruple helical structure, Base sequences starting from a base that is bound to each other or a base that is 1 to 15 bases away. More specifically, in the nucleic acid chain, when the base at the 5 ′ end of the base sequence forming the target quadruplex structure is n-position, n-1 to n-25, preferably a base sequence located on the 5 ′ end side of the nucleic acid chain starting from the base at the n-2 position to the n-15 position (3 ′ end); 3 ′ of the base sequence forming the target quadruplex structure When the terminal base is the n-position, the base located at the 3'-end side of the nucleic acid chain starting from the base at the n + 1-position to the -n + 25-position, preferably the n + 2-position to the-(n + 15) -position Examples include sequences. In addition, in this specification, the notation regarding the position of the base in the base sequence is that the base located at the 5th position from the base that is the origin is the n-m position when the base that is the origin is the n-position. And the base located at the m-th position on the 3 ′ end side from the base serving as the starting point is defined as n + m position.
また、検出対象となる核酸鎖において、当該核酸プローブの塩基数（核酸プローブ標的配列の塩基数）については、ハイブリダイズが可能であることを限度として特に制限されないが、例えば５〜５０塩基、好ましくは５〜２５塩基、更に好ましくは１０〜２０塩基が挙げられる。 Further, in the nucleic acid chain to be detected, the number of bases of the nucleic acid probe (the number of bases of the nucleic acid probe target sequence) is not particularly limited as long as hybridization is possible, but for example 5 to 50 bases, Includes 5 to 25 bases, more preferably 10 to 20 bases.
また、当該核酸プローブは、前記標的配列の相補鎖であることが好ましいが、前記標的配列にハイブリダイズが可能であることを限度として、前記標的配列の相補鎖に対して１又は数個の塩基においてミスマッチがある塩基配列であってもよい。 In addition, the nucleic acid probe is preferably a complementary strand of the target sequence. However, the nucleic acid probe is one or several bases to the complementary strand of the target sequence as long as it can hybridize to the target sequence. May be a base sequence having a mismatch.
また、当該核酸プローブは、ＲＮＡ、ＤＮＡのいずれであってもよいが、検出対象となる核酸鎖がＲＮＡである場合は、当該核酸プローブはＤＮＡであることが好ましい。また、当該核酸プローブは、酵素耐性の向上やハイブリダイズを安定に行えるように化学修飾を施した人工核酸（例えば、Locked Nucleic AcidやPeptide Nucleic Aid）であってもよい。 The nucleic acid probe may be either RNA or DNA, but when the nucleic acid chain to be detected is RNA, the nucleic acid probe is preferably DNA. The nucleic acid probe may be an artificial nucleic acid (for example, Locked Nucleic Acid or Peptide Nucleic Aid) that has been chemically modified so that enzyme resistance can be improved and hybridization can be performed stably.
検出対象となる核酸鎖の塩基配列、及び四重螺旋構造を形成する塩基配列は公知であるので、当該核酸プローブに備えさせるべき塩基配列は、当業者であれば適宜設定することが可能である。 Since the base sequence of the nucleic acid chain to be detected and the base sequence forming the quadruplex structure are known, those skilled in the art can appropriately set the base sequence to be provided in the nucleic acid probe. .
また、当該核酸プローブとして、前記(i)リガンドと蛍光エネルギー移動が生じ得る蛍光物質で標識したものを使用する。このような蛍光物質としては、使用する前記(i)リガンドと蛍光エネルギー移動が可能なものを適宜設定すればよいが、例えば、ＲＯＸ（5'-calboxy-X-rhodamine）（Ｅｘ５７６ｎｍ、Ｅｍ６０１ｎｍ）、ＰＩ（Propidium iodide 3,8-diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenyl-, diiodide）（Ｅｘ５３５ｎｍ、Ｅｍ６１７ｎｍ）、ヘキシジウムイオジド（3,8-diamino-5-hexyl-6-phenyl-, iodide）（Ｅｘ５１８ｎｍ、Ｅｍ６００ｎｍ）、ＹＯＹＯ−３イオジド(Quinolinium, 4-[3-(3-methyl-2(3H)-benzoxazolylidene)-1-propenyl]-1-[3-(trimethylammonio)propyl]-, diiodide)（Ｅｘ６１２ｎｍ、Ｅｍ６３１ｎｍ）、ＬＤＳ７５１(Quinolinium, 6-(dimethylamino)-2-[4-[4-(dimethylamino)phenyl]-1,3-butadienyl]-1-ethyl, perchlorate)（Ｅｘ５５１ｎｍ、Ｅｍ７１３ｎｍ）、ＤＡＰＩ(1H-Indole-6-carboximidamide, 2-[4-(aminoiminomethyl)phenyl]-, dihydrochloride)（Ｅｘ３５８ｎｍ、Ｅｍ４６１ｎｍ）、ヘキスト33342(2,5'-Bi-1H-benzimidazole, 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl))（Ｅｘ３５０ｎｍ、Ｅｍ４６１ｎｍ）、ＴＯＴＯ−３イオジド(4-[3-(3-methyl-2(3H)-benzothiazolylidene)-1-propenyl]-1-[3-(trimethylammonio)propyl]-, diiodide)（Ｅｘ６４２ｎｍ、Ｅｍ６６１ｎｍ）、アクリジンオレンジ(3,6-Acridinediamine, N,N,N',N'-tetramethyl-, monohydrochloride) （Ｅｘ４６０ｎｍ、Ｅｍ６５０ｎｍ）等が挙げられる。 Further, as the nucleic acid probe, one labeled with a fluorescent substance capable of causing fluorescence energy transfer with the ligand (i) is used. As such a fluorescent substance, it is only necessary to appropriately set a substance capable of transferring fluorescence energy with the ligand (i) used. For example, ROX (5′-calboxy-X-rhodamine) (Ex576 nm, Em601 nm), PI (Propidium iodide 3,8-diamino-5- [3- (diethylmethylammonio) propyl] -6-phenyl-, diiodide) (Ex 535 nm, Em 617 nm), hexium iodide (3,8-diamino-5-hexyl-6 -phenyl-, iodide) (Ex518 nm, Em600 nm), YOYO-3 iodide (Quinolinium, 4- [3- (3-methyl-2 (3H) -benzoxazolylidene) -1-propenyl] -1- [3- (trimethylammonio) propyl]-, diiodide) (Ex612 nm, Em631 nm), LDS751 (Quinolinium, 6- (dimethylamino) -2- [4- [4- (dimethylamino) phenyl] -1,3-butadienyl] -1-ethyl, perchlorate) ( Ex551nm, Em713nm), DAPI (1H-Indole-6-carboximidamide, 2- [4- (aminoiminomethyl) phenyl]-, dihydrochloride) (E 358 nm, Em461 nm), Hoechst 33342 (2,5'-Bi-1H-benzimidazole, 2 '-(4-ethoxyphenyl) -5- (4-methyl-1-piperazinyl)) (Ex350 nm, Em461 nm), TOTO-3 iodide (4- [3- (3-methyl-2 (3H) -benzothiazolylidene) -1-propenyl] -1- [3- (trimethylammonio) propyl]-, diiodide) (Ex642 nm, Em661 nm), acridine orange (3,6 -Acridinediamine, N, N, N ′, N′-tetramethyl-, monohydrochloride) (Ex 460 nm, Em 650 nm) and the like.
当該核酸プローブにおいて、前記蛍光物質の標識部位については、前記(i)リガンドと蛍光エネルギー移動が生じ得ることを限度として特に制限されず、当該核酸プローブを構成する核酸の５’末端、３’末端、又は非末端領域のいずれであってもよい。前記(i)リガンドと蛍光エネルギー移動の効率を高めるという観点から、当該核酸プローブが、四重螺旋構造を有する核酸鎖において、標的となる四重螺旋構造を形成している塩基配列の５’末端側にハイブリダイズする場合には、当該核酸プローブを構成する核酸の５’末端に蛍光物質が標識されていることが好ましい。また、四重螺旋構造を有する核酸鎖において、標的となる四重螺旋構造を形成している塩基配列の３’末端側にハイブリダイズする場合には、当該核酸プローブを構成する核酸の３’末端に蛍光物質が標識されていることが好ましい。 In the nucleic acid probe, the labeling site of the fluorescent substance is not particularly limited as long as fluorescence energy transfer can occur with the ligand (i), and the 5 ′ end and 3 ′ end of the nucleic acid constituting the nucleic acid probe are not limited. Or any non-terminal region. (I) From the viewpoint of increasing the efficiency of fluorescence energy transfer with the ligand, the nucleic acid probe has a nucleic acid chain having a quadruplex structure, and the 5 ′ end of the base sequence forming the target quadruplex structure. In the case of hybridization on the side, a fluorescent substance is preferably labeled at the 5 ′ end of the nucleic acid constituting the nucleic acid probe. In addition, in a nucleic acid chain having a quadruplex structure, when hybridizing to the 3 ′ end side of the base sequence forming the target quadruplex structure, the 3 ′ end of the nucleic acid constituting the nucleic acid probe is used. It is preferable that the fluorescent substance is labeled.
[(i)リガンドと(ii)核酸プローブに標識された蛍光物質の関係]
本発明では、前記(i)リガンドと前記(ii)核酸プローブに標識された蛍光物質が蛍光エネルギー移動を起すことによって、核酸鎖の四重螺旋構造を配列特異的に検出される。即ち、本発明では、前記(i)リガンドと前記(ii)核酸プローブに標識された蛍光物質は、それぞれ蛍光エネルギー移動におけるドナー蛍光物質とアクセプター蛍光物質の関係にあるものが選択して使用される。
[Relationship between (i) ligand and (ii) fluorescent substance labeled on nucleic acid probe]
In the present invention, the fluorescent substance labeled with (i) the ligand and (ii) the nucleic acid probe causes fluorescence energy transfer, whereby the quadruplex structure of the nucleic acid chain is detected in a sequence-specific manner. That is, in the present invention, the fluorescent substances labeled with the (i) ligand and the (ii) nucleic acid probe are selected and used in a relationship between a donor fluorescent substance and an acceptor fluorescent substance in fluorescence energy transfer, respectively. .
前記(i)リガンドがドナー蛍光物質であり、且つ前記(ii)核酸プローブに標識された蛍光物質がアクセプター蛍光物質であってもよく、また、前記(i)リガンドがアクセプター蛍光物質であり、且つ前記(ii)核酸プローブに標識された蛍光物質がドナー蛍光物質であってもよい。 The (i) ligand may be a donor fluorescent material, and the fluorescent material labeled on the (ii) nucleic acid probe may be an acceptor fluorescent material, and the (i) ligand may be an acceptor fluorescent material, and The fluorescent substance labeled on the (ii) nucleic acid probe may be a donor fluorescent substance.
蛍光エネルギー移動を起すドナー蛍光物質とアクセプター蛍光物質の組み合わせについては公知であり、前記(i)リガンドと前記(ii)核酸プローブに標識された蛍光物質の組み合わせについては適宜設定することが可能である。具体的には、前記(i)リガンドとしてチオフラビンＴをドナー蛍光物質として使用する場合であれば、(ii)核酸プローブの標識に使用されるアクセプター蛍光物質として、ＲＯＸ、ＰＩ又はヘキシジウムイオジドを選択すればよい。また、例えば、前記(i)リガンドとしてチオフラビンＴをアクセプター蛍光物質として使用する場合であれば、(ii)核酸プローブの標識に使用されるドナー蛍光物質として、ＤＡＰＩ又はヘキスト33342を選択すればよい。また、例えば、前記(i)リガンドとしてＮ―メチルメソポルフィリンをドナー蛍光物質として使用する場合であれば、(ii)核酸プローブの標識に使用されるアクセプター蛍光物質として、ＹＯＹＯ−３イオジド又はＬＤＳ７５１を選択すればよい。また、例えば、前記(i)リガンドとして銅フタロシアニンテトラスルホン酸又はそのナトリウム塩等の塩をドナー蛍光物質として使用する場合であれば、(ii)核酸プローブの標識に使用されるアクセプター蛍光物質として、ＴＯＴＯ−３イオジド又はアクリジンオレンジを選択すればよい。 The combination of the donor fluorescent substance and the acceptor fluorescent substance that causes fluorescence energy transfer is known, and the combination of the fluorescent substance labeled with the (i) ligand and the (ii) nucleic acid probe can be appropriately set. . Specifically, if (i) thioflavin T is used as a donor fluorescent substance as a ligand, (ii) ROX, PI, or hexium iodide is used as an acceptor fluorescent substance used for labeling a nucleic acid probe. Just choose. For example, when (i) thioflavin T is used as an acceptor fluorescent substance as a ligand, (ii) DAPI or Hoechst 33342 may be selected as a donor fluorescent substance used for labeling a nucleic acid probe. For example, when (i) N-methylmesoporphyrin is used as a donor fluorescent substance as a ligand, (ii) YOYO-3 iodide or LDS751 is used as an acceptor fluorescent substance used for labeling a nucleic acid probe. Just choose. Further, for example, if (i) a salt such as copper phthalocyanine tetrasulfonic acid or its sodium salt is used as a donor fluorescent substance as the ligand, (ii) as an acceptor fluorescent substance used for labeling a nucleic acid probe, What is necessary is just to select TOTO-3 iodide or acridine orange.
これらの(i)リガンドと(ii)核酸プローブに標識された蛍光物質の組み合わせの中でも、好ましくは、前記(i)リガンドとしてチオフラビンＴをドナー蛍光物質として使用し、(ii)核酸プローブの標識にＲＯＸをアクセプター蛍光物質として使用する組み合わせ態様が挙げられる。 Among the combinations of these (i) ligands and (ii) fluorescent substances labeled on nucleic acid probes, preferably, (i) thioflavin T is used as a donor fluorescent substance as a ligand, and (ii) nucleic acid probes are labeled. The combination aspect which uses ROX as an acceptor fluorescent substance is mentioned.
[第１工程]
本発明の検出方法における第１工程では、被検核酸試料に対して(i)リガンドと(ii)核酸プローブを接触させる。被検核酸試料に、検出目的となる四重螺旋構造を有する核酸鎖が含まれている場合には、当該核酸鎖の四重螺旋構造部分に前記(i)リガンドが結合し、且つ当該核酸鎖の四重螺旋構造の近傍にある塩基配列に前記(ii)核酸プローブがハイブリダイズした状態になる（図２に示す状態）。このような状態で、検出目的となる四重螺旋構造を有する核酸鎖と、前記(i)リガンドと、前記(ii)核酸プローブとが複合化することにより、前記(i)リガンドと前記(ii)核酸プローブに標識された蛍光物質の間で蛍光エネルギー移動が生じる状態になる。なお、図２には、便宜上、検出目的となる四重螺旋構造を有する核酸鎖としてＶＥＧＦのｍＲＮＡの部分配列（総塩基数３４、５’末端側から１〜１８位の塩基配列において四重螺旋構造を形成）、前記(i)リガンドとしてチオフラビンＴ、前記(ii)核酸プローブとしてＲＯＸ標識されたＤＮＡプローブ（総塩基数１５、前記核酸鎖の５’末端側から２０〜３４位の塩基配列に対する相補鎖）を使用した場合の模式図が示されている。
[First step]
In the first step of the detection method of the present invention, (i) a ligand and (ii) a nucleic acid probe are brought into contact with a test nucleic acid sample. When the test nucleic acid sample contains a nucleic acid chain having a quadruplex structure to be detected, the (i) ligand binds to the quadruplex structure part of the nucleic acid chain, and the nucleic acid chain (Ii) The nucleic acid probe is hybridized to the base sequence in the vicinity of the quadruplex structure (the state shown in FIG. 2). In such a state, the nucleic acid chain having a quadruple helical structure to be detected, the (i) ligand, and the (ii) nucleic acid probe are complexed, whereby the (i) ligand and the (ii) ) Fluorescence energy transfer occurs between the fluorescent substances labeled on the nucleic acid probe. For convenience, FIG. 2 shows a partial sequence of VEGF mRNA as a nucleic acid chain having a quadruple helical structure for detection purposes (total base number 34, quadruple helix in the base sequence at positions 1 to 18 from the 5 ′ end. Forming a structure), (i) Thioflavin T as a ligand, (ii) ROX-labeled DNA probe as a nucleic acid probe (total number of bases: 15 to the base sequence at positions 20 to 34 from the 5 ′ end of the nucleic acid strand) A schematic diagram in the case of using a complementary strand) is shown.
被検核酸試料に対して前記(i)リガンドと前記(ii)核酸プローブを接触させるには、前記(i)リガンドが四重螺旋構造に結合可能で且つ前記(ii)核酸プローブが核酸鎖にハイブリダイズできる反応溶液中に、被検核酸試料、前記(i)リガンド、及び前記(ii)核酸プローブを添加して共存させればよい。このような反応溶液は、使用する前記(i)リガンドと前記(ii)核酸プローブの種類等に応じて適宜設定すればよく、例えば、緩衝液が好適に使用される。また、当該反応溶液のｐＨとしては、例えば３〜１０、好ましくは６〜９が挙げられる。また、前記(i)リガンドとしてチオフラビンＴを使用する場合であれば、チオフラビンＴが四重螺旋構造に結合するためには、一価のカチオン（ナトリウム、カリウム、リチウム等）が必要になるため、一価のカチオンが１〜１０００ｍＭ程度存在する溶液、好ましくはＫＣｌを１〜２００ｍＭ程度含む溶液を使用すればよい。 In order to bring the (i) ligand and the (ii) nucleic acid probe into contact with the test nucleic acid sample, the (i) ligand can bind to a quadruplex structure, and the (ii) nucleic acid probe is attached to the nucleic acid chain. What is necessary is just to add a test nucleic acid sample, the (i) ligand, and the (ii) nucleic acid probe to coexist in a reaction solution capable of hybridizing. Such a reaction solution may be appropriately set according to the type of the (i) ligand and the (ii) nucleic acid probe to be used. For example, a buffer solution is preferably used. Moreover, as pH of the said reaction solution, 3-10 are mentioned, for example, Preferably 6-9 is mentioned. In addition, when thioflavin T is used as the ligand (i), a monovalent cation (sodium, potassium, lithium, etc.) is required for thioflavin T to bind to the quadruplex structure. A solution containing about 1 to 1000 mM of a monovalent cation, preferably a solution containing about 1 to 200 mM of KCl may be used.
反応溶液中の被検核酸試料の濃度については、特に制限されないが、例えば、当該被検核酸試料に含まれる核酸が総量で１０〜１００００ｎＭ、好ましくは１００〜１０００ｎＭとなるように設定すればよい。 The concentration of the test nucleic acid sample in the reaction solution is not particularly limited. For example, the nucleic acid contained in the test nucleic acid sample may be set to a total amount of 10 to 10,000 nM, preferably 100 to 1000 nM.
また、反応溶液中の前記(i)リガンドの濃度については、特に制限されないが、例えば、１００〜５００００ｎＭ、好ましくは１０００〜１００００ｎＭとなるように設定すればよい。 Further, the concentration of the ligand (i) in the reaction solution is not particularly limited, but may be set to 100 to 50000 nM, preferably 1000 to 10000 nM, for example.
更に、反応溶液中の前記(ii)核酸プローブの濃度については、特に制限されないが、例えば、１〜５００００ｎＭ、好ましくは１０〜１００００ｎＭとなるように設定すればよい。 Furthermore, the concentration of the nucleic acid probe (ii) in the reaction solution is not particularly limited, but may be set to 1 to 50000 nM, preferably 10 to 10000 nM, for example.
また、反応溶液中で、被検核酸試料、前記(i)リガンド、及び前記(ii)核酸プローブを共存させるのに先立って、反応液中で被検核酸試料に対して５０〜１００℃程度、好ましくは８５〜９５℃程度で、０．５〜１０分間程度、好ましくは１〜３分間程度加熱することによって、核酸鎖の四重螺旋構造を一本鎖状態に一旦解いた後に、０．１〜５℃／分程度、好ましくは０．５〜１℃／分で冷却してアニーリングさせて再度四重螺旋構造を形成させることが望ましい。このように加熱処理後にアニーリングさせることによって、検出対象となる核酸鎖の四重螺旋構造が反応溶液中で安定化され、より一層効率的に四重螺旋構造を有する核酸鎖を検出することが可能になる。なお、当該加熱処理は、反応溶液中に被検核酸試料を添加した後に行えばよく、当該加熱処理に供される反応溶液は、被検核酸試料以外に、前記(i)リガンド及び／又は前記(ii)核酸プローブが既に添加されている状態であってもよい。勿論、前記加熱処理による被検核酸試料のアニーリングは、行わなくてもよい。 Further, prior to coexistence of the test nucleic acid sample, the (i) ligand, and the (ii) nucleic acid probe in the reaction solution, about 50 to 100 ° C. with respect to the test nucleic acid sample in the reaction solution, Preferably, after heating the quadruplex structure of the nucleic acid strand to a single-stranded state by heating at about 85 to 95 ° C. for about 0.5 to 10 minutes, preferably about 1 to 3 minutes, It is desirable to form a quadruplex structure again by cooling and annealing at about -5 ° C / minute, preferably 0.5-1 ° C / minute. By annealing after heat treatment in this way, the quadruplex structure of the nucleic acid strand to be detected is stabilized in the reaction solution, and the nucleic acid strand having the quadruplex structure can be detected more efficiently. become. The heat treatment may be performed after the test nucleic acid sample is added to the reaction solution, and the reaction solution to be subjected to the heat treatment may include the above (i) ligand and / or the above-described nucleic acid sample. (ii) The nucleic acid probe may be already added. Of course, annealing of the test nucleic acid sample by the heat treatment may not be performed.
[第２工程]
本発明の検出方法における第２工程では、被検核酸試料、前記(i)リガンド、及び前記(ii)核酸プローブを共存させた状態で、前記ドナー蛍光物質を励起させて蛍光エネルギー移動を測定する。前述するように、被検核酸試料に検出対象となる「四重螺旋構造を有する核酸鎖」が含まれている場合には、蛍光エネルギー移動が生じるので、当該蛍光エネルギー移動を測定することによって、核酸鎖の四重螺旋構造を配列特異的に定性的又は定量的に求めることが可能になる。
[Second step]
In the second step of the detection method of the present invention, fluorescence energy transfer is measured by exciting the donor fluorescent substance in the state where the test nucleic acid sample, the (i) ligand, and the (ii) nucleic acid probe coexist. . As described above, when the nucleic acid sample to be detected contains a “nucleic acid chain having a quadruple helical structure” to be detected, fluorescence energy transfer occurs, so by measuring the fluorescence energy transfer, The quadruplex structure of the nucleic acid chain can be determined qualitatively or quantitatively in a sequence-specific manner.
第２工程においてドナー蛍光物質を励起させるには、ドナー蛍光物質の種類に応じた励起光を照射すればよい。 In order to excite the donor fluorescent material in the second step, excitation light corresponding to the type of the donor fluorescent material may be irradiated.
また、第２工程において蛍光エネルギー移動を測定するには、アクセプター蛍光物質の蛍光強度を測定してもよく、またドナー蛍光物質の蛍光硬度を測定してもよい。 In order to measure the fluorescence energy transfer in the second step, the fluorescence intensity of the acceptor fluorescent material may be measured, or the fluorescence hardness of the donor fluorescent material may be measured.
アクセプター蛍光物質の蛍光強度を測定する場合であれば、検出対象となる「四重螺旋構造を有する核酸鎖」の量が多い程、高い蛍光強度を示すことになる。 In the case of measuring the fluorescence intensity of the acceptor fluorescent substance, the greater the amount of “nucleic acid chain having a quadruple helical structure” to be detected, the higher the fluorescence intensity.
また、ドナー蛍光物質の蛍光硬度を測定する場合であれば、予め、アクセプター蛍光物質を添加しない状態でのドナー蛍光物質の蛍光硬度をコントロールとして測定しておき、当該コントロールのドナー蛍光物質の蛍光強度に対して、被検核酸試料、前記(i)リガンド、及び前記(ii)核酸プローブを共存させた状態でのドナー蛍光物質の蛍光強度が低い程、検出対象となる「四重螺旋構造を有する核酸鎖」の量が多いと判定される。 When measuring the fluorescence hardness of the donor fluorescent substance, the fluorescence intensity of the donor fluorescent substance in the state where no acceptor fluorescent substance is added is measured in advance as a control, and the fluorescence intensity of the donor fluorescent substance of the control is measured. In contrast, the lower the fluorescence intensity of the donor fluorescent substance in the state in which the test nucleic acid sample, the (i) ligand, and the (ii) nucleic acid probe coexist, the lower the fluorescence intensity of the donor fluorescent substance, It is determined that the amount of “nucleic acid chain” is large.
また、検出対象となる「四重螺旋構造を有する核酸鎖」の濃度が既知の標準サンプルを用いて、予め濃度と測定される蛍光強度の関係を示す標準曲線を作成しておくことにより、検出対象となる「四重螺旋構造を有する核酸鎖」の量を定量することも可能になる。 In addition, using a standard sample with a known concentration of the “nucleic acid strand having a quadruple helical structure” to be detected, a standard curve indicating the relationship between the concentration and the measured fluorescence intensity is prepared in advance. It is also possible to quantify the amount of the target “nucleic acid chain having a quadruplex structure”.
２．核酸鎖の四重螺旋構造の検出するためのキット
本発明の検出キットは、前記「１．核酸鎖の四重螺旋構造の検出方法」を実施するために使用されるキットであって、前記(i)リガンドと、前記(ii)核酸プローブを含むことを特徴とする。
2. Kit for Detecting Quadruplex Structure of Nucleic Acid Chain The detection kit of the present invention is a kit used for carrying out the above-mentioned “1. Method for detecting quadruplex structure of nucleic acid chain”, It comprises i) a ligand and (ii) a nucleic acid probe.
本発明の検出キットに含まれる前記(i)リガンドと、前記(ii)核酸プローブの内容については、前記「１．核酸鎖の四重螺旋構造の検出方法」に示す通りである。 The contents of the (i) ligand and the (ii) nucleic acid probe contained in the detection kit of the present invention are as described in “1. Method for detecting a quadruplex structure of a nucleic acid chain”.
また、本発明の検出キットには、前記(i)リガンドと、前記(ii)核酸プローブ以外に、必要に応じて、前述する反応溶液、実験手順書等が含まれていてもよい。 In addition to the (i) ligand and the (ii) nucleic acid probe, the detection kit of the present invention may contain the above-mentioned reaction solution, experimental procedure, etc., if necessary.
以下に、実施例を挙げて、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
実施例１：四重螺旋構造を有する核酸鎖、リガンド、及び核酸プローブの複合体の形成の確認
１．実験材料
以下の実験材料を準備した。
核酸鎖１：ＶＥＧＦのｍＲＮＡの部分配列（配列番号１：5'-GGAGGAGGGGGAGGAGGAAGAAGAGAAGGAAGAG-3'、５’末端側から１〜１５位の塩基配列で四重螺旋構造を形成）
核酸鎖２：ＶＥＧＦのｍＲＮＡの部分配列（配列番号２：5'-AGAAGAGAAGGAAGA-3'、四重螺旋構造の形成なし）
核酸プローブ１：３’末端がＲＯＸで標識されたＤＮＡプローブ（配列番号３：5'-CTCTTCCTTCTCTTC-3'、配列番号１の５’末端側から２０〜３４位の塩基配列に対する相補鎖）
核酸プローブ２：３’末端がＲＯＸで標識されたＤＮＡプローブ（配列番号４：5'-TCTTCCTTCTCTTCT-3'、配列番号２の塩基配列に対する相補鎖）
リガンド：チオフラビンＴ
反応溶液：１００ｍＭのＫＣｌを含む５０ｍＭのＭＥＳ-ＬｉＯＨ緩衝液（ｐＨ７）
Example 1: Confirmation of formation of a complex of a nucleic acid chain having a quadruplex structure, a ligand, and a nucleic acid probe
1. Experimental materials The following experimental materials were prepared.
Nucleic acid chain 1: Partial sequence of VEGF mRNA (SEQ ID NO: 1 5′-GGAGGAGGGGGAGGAGGAAGAAGAGAAGGAAGAG-3 ′, forming a quadruple helical structure with the base sequence of positions 1 to 15 from the 5 ′ end)
Nucleic acid chain 2: Partial sequence of VEGF mRNA (SEQ ID NO: 5'-AGAAGAGAAGGAAGA-3 ', no formation of quadruplex structure)
Nucleic acid probe 1: DNA probe labeled with ROX at the 3 ′ end (SEQ ID NO: 5: 5′-CTCTTCCTTCTCTTC-3 ′, complementary strand to the base sequence at positions 20 to 34 from the 5 ′ end of SEQ ID NO: 1)
Nucleic acid probe 2: DNA probe labeled at the 3 ′ end with ROX (SEQ ID NO: 5: 5′-TCTTCCTTCTCTTCT-3 ′, complementary strand to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2)
Ligand: Thioflavin T
Reaction solution: 50 mM MES-LiOH buffer (pH 7) containing 100 mM KCl
２．実験方法
（条件１：実施例）
反応溶液中に、２０μＭの核酸鎖１、２０μＭの核酸プローブ１、及び１０μＭのリガンドを添加して混合した後に、０〜９０℃温度領域における２６０ｎｍにおける吸光度（２６０ｎｍにおけるＵＶ溶解曲線）と、０〜９０℃温度領域における２９５ｎｍにおける吸光度（２９５ｎｍにおけるＵＶ溶解曲線）を、紫外可視近赤外分光光度計（UV-1800、島津製作所社製）を用いて測定した。
（条件２：コントロール１）
反応溶液中に、２０μＭの核酸鎖２、２０μＭの核酸プローブ２、及び１０μＭのリガンドを添加して混合した後、前記条件１と同様に、２６０ｎｍにおけるＵＶ溶解曲線を測定した。
（条件３：コントロール２）
反応溶液中に、２０μＭの核酸鎖１、及び１０μＭのリガンドを添加して混合した後、前記条件１と同様に、２９５ｎｍにおけるＵＶ溶解曲線を測定した。
2. Experimental method (Condition 1: Example)
After adding and mixing 20 μM nucleic acid strand 1, 20 μM nucleic acid probe 1 and 10 μM ligand in the reaction solution, absorbance at 260 nm (UV dissolution curve at 260 nm) in the temperature range of 0 to 90 ° C. Absorbance at 295 nm (UV dissolution curve at 295 nm) in the 90 ° C. temperature range was measured using an ultraviolet-visible near-infrared spectrophotometer (UV-1800, manufactured by Shimadzu Corporation).
(Condition 2: Control 1)
In the reaction solution, 20 μM nucleic acid strand 2, 20 μM nucleic acid probe 2 and 10 μM ligand were added and mixed, and then the UV dissolution curve at 260 nm was measured in the same manner as in the above condition 1.
(Condition 3: Control 2)
In the reaction solution, 20 μM nucleic acid strand 1 and 10 μM ligand were added and mixed, and then the UV dissolution curve at 295 nm was measured in the same manner as in Condition 1 above.
３．結果
得られた結果を図３に示す。図３から明らかなように、核酸鎖１、核酸プローブ１及びリガンドを共存させた場合（条件１）では、核酸鎖２、核酸プローブ２及びリガンドを共存させた場合（条件２）とは２６０ｎｍにおけるＵＶ溶解曲線が異なっているが融解挙動が見られた。更に、核酸鎖１及びリガンドを共存させた場合（条件３）とは２９５ｎｍにおけるＵＶ溶解曲線が異なっていたが、融解挙動が見られた。２６０ｎｍにおけるＵＶ溶解挙動と２９５ｎｍにおけるＵＶ溶解挙動は、二重螺旋構造の熱変性と四重螺旋構造の熱変性を示している。即ち、本実験結果から、核酸鎖１、核酸プローブ１及びリガンドを共存させることによって、四重螺旋構造を有する核酸鎖と、リガンドと、核酸プローブによって複合体が形成されていることが示された。
3. Results The results obtained are shown in FIG. As is clear from FIG. 3, when the nucleic acid strand 1, the nucleic acid probe 1 and the ligand coexist (condition 1), the case where the nucleic acid strand 2, the nucleic acid probe 2 and the ligand coexist (condition 2) is at 260 nm. Although the UV dissolution curves were different, melting behavior was observed. Furthermore, although the UV dissolution curve at 295 nm was different from that in the case where the nucleic acid chain 1 and the ligand coexist (condition 3), melting behavior was observed. The UV dissolution behavior at 260 nm and the UV dissolution behavior at 295 nm indicate thermal denaturation of the double helix structure and heat denaturation of the quadruple helix structure. That is, the results of this experiment showed that the nucleic acid chain 1, the nucleic acid probe 1 and the ligand coexisted to form a complex of the nucleic acid chain having the quadruplex structure, the ligand, and the nucleic acid probe. .
実施例２：蛍光エネルギー移動を利用した四重螺旋構造を有する核酸鎖の配列特異的検出
１．実験材料
以下の実験材料を準備した。
核酸鎖１：ＶＥＧＦのｍＲＮＡの部分配列（配列番号１：5'-GGAGGAGGGGGAGGAGGAAGAAGAGAAGGAAGAG-3'、５’末端側から１〜１５位の塩基配列で四重螺旋構造を形成）
核酸プローブ１：３’末端がＲＯＸで標識されたＤＮＡプローブ（配列番号３：5'-CTCTTCCTTCTCTTC-3'、配列番号１の５’末端側から２０〜３４位の塩基配列に対する相補鎖）
リガンド：チオフラビンＴ
反応溶液：１００ｍＭのＫＣｌを含む５０ｍＭのＭＥＳ-ＬｉＯＨ緩衝液（ｐＨ７）
Example 2: Sequence-specific detection of a nucleic acid strand having a quadruplex structure using fluorescence energy transfer
1. Experimental materials The following experimental materials were prepared.
Nucleic acid chain 1: Partial sequence of VEGF mRNA (SEQ ID NO: 1 5′-GGAGGAGGGGGAGGAGGAAGAAGAGAAGGAAGAG-3 ′, forming a quadruple helical structure with the base sequence of positions 1 to 15 from the 5 ′ end)
Nucleic acid probe 1: DNA probe labeled with ROX at the 3 ′ end (SEQ ID NO: 5: 5′-CTCTTCCTTCTCTTC-3 ′, complementary strand to the base sequence at positions 20 to 34 from the 5 ′ end of SEQ ID NO: 1)
Ligand: Thioflavin T
Reaction solution: 50 mM MES-LiOH buffer (pH 7) containing 100 mM KCl
２．実験方法
反応溶液中に１μＭの核酸鎖１及び１０μＭのリガンドを添加して、９５℃で５分間静置して、一本鎖状態に一旦解いた後に、０．５℃／分の冷却速度で２５℃まで冷却してアニーリングさせた。次いで、０、０．００１、０．００３、０．０１、０．０３、０．１、０．３、及び１．０μＭとなるように核酸プローブ１を反応溶液に添加し、マルチスペクトロマイクロプレートリーダ（Varioskan Flash）にて４５０ｎｍの励起光を照射して４５０ｎｍ〜７５０ｎｍの蛍光強度を測定した。
2. Experimental Method Add 1 μM nucleic acid strand 1 and 10 μM ligand to the reaction solution, let stand at 95 ° C. for 5 minutes, and once unwind to a single strand, then at a cooling rate of 0.5 ° C./min. It was cooled to 25 ° C. and annealed. Next, the nucleic acid probe 1 was added to the reaction solution so as to be 0, 0.001, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, and 1.0 μM, and the multi-spectrometer microplate The reader was irradiated with excitation light of 450 nm with a reader (Varioskan Flash), and the fluorescence intensity of 450 nm to 750 nm was measured.
３．結果
得られた結果を図４に示す。図４に示されているように、核酸プローブ１の添加量を増やすほど、リガンドであるチオフラビンＴの蛍光強度（４８５ｎｍ）が減少し、核酸プローブ１に使用されているＲＯＸ蛍光強度（６０１ｎｍ）が増加する傾向が確認された。即ち、本結果から、核酸鎖１、核酸プローブ１及びリガンドが複合体を形成し、リガンドであるチオフラビンＴから核酸プローブ１のＲＯＸに蛍光エネルギー移動が生じ、チオフラビンＴの蛍光強度の低下とＲＯＸの蛍光強度の上昇が起こったことが明らかとなった。
3. Results The results obtained are shown in FIG. As shown in FIG. 4, as the amount of the nucleic acid probe 1 added is increased, the fluorescence intensity (485 nm) of the ligand thioflavin T is decreased, and the ROX fluorescence intensity (601 nm) used in the nucleic acid probe 1 is decreased. An increasing trend was confirmed. That is, from this result, the nucleic acid strand 1, the nucleic acid probe 1 and the ligand form a complex, and fluorescence energy transfer occurs from the ligand thioflavin T to the ROX of the nucleic acid probe 1, resulting in a decrease in the fluorescence intensity of the thioflavin T and the ROX. It became clear that an increase in fluorescence intensity occurred.
実施例３：蛍光エネルギー移動を利用した、四重螺旋構造を有するＶＥＧＦのｍＲＮＡの部分配列の配列特異的検出
１．実験材料
以下の実験材料を準備した。
核酸鎖１：ＶＥＧＦのｍＲＮＡの部分配列（配列番号１：5'-GGAGGAGGGGGAGGAGGAAGAAGAGAAGGAAGAG-3'、５’末端側から１〜１５位の塩基配列で四重螺旋構造を形成）
核酸プローブ１：３’末端がＲＯＸで標識されたＤＮＡプローブ（配列番号３：5'-CTCTTCCTTCTCTTC-3'、配列番号１の５’末端側から２０〜３４位の塩基配列に対する相補鎖）
リガンド：チオフラビンＴ
反応溶液：１００ｍＭのＫＣｌを含む５０ｍＭのＭＥＳ-ＬｉＯＨ緩衝液（ｐＨ７）
Example 3: Sequence-specific detection of a partial sequence of VEGF mRNA having a quadruplex structure using fluorescence energy transfer
1. Experimental materials The following experimental materials were prepared.
Nucleic acid chain 1: Partial sequence of VEGF mRNA (SEQ ID NO: 1 5′-GGAGGAGGGGGAGGAGGAAGAAGAGAAGGAAGAG-3 ′, forming a quadruple helical structure with the base sequence of positions 1 to 15 from the 5 ′ end)
Nucleic acid probe 1: DNA probe labeled with ROX at the 3 ′ end (SEQ ID NO: 5: 5′-CTCTTCCTTCTCTTC-3 ′, complementary strand to the base sequence at positions 20 to 34 from the 5 ′ end of SEQ ID NO: 1)
Ligand: Thioflavin T
Reaction solution: 50 mM MES-LiOH buffer (pH 7) containing 100 mM KCl
２．実験方法
反応溶液中に０又は１μＭの核酸鎖１、及び０又は１０μＭのリガンドを添加して、９５℃で５分間静置して、一本鎖状態に一旦解いた後に、０．５℃／分の冷却速度で２５℃まで冷却してアニーリングさせた。次いで、０、０．００３、０．１、０．３、及び１．０μＭとなるように核酸プローブ１を反応溶液に添加し、マルチスペクトロマイクロプレートリーダ（Varioskan Flash）にて４５０ｎｍの励起光を照射して５９３ｎｍの蛍光強度を測定した。
2. Experimental Method Add 0 or 1 μM of nucleic acid strand 1 and 0 or 10 μM of ligand to the reaction solution, let stand at 95 ° C. for 5 minutes, and once unravel in a single-stranded state. It was cooled to 25 ° C. at a cooling rate of minutes and annealed. Next, the nucleic acid probe 1 is added to the reaction solution so that it becomes 0, 0.003, 0.1, 0.3, and 1.0 μM, and excitation light of 450 nm is emitted with a multi-spectro microplate reader (Varioskan Flash). Irradiation was performed and the fluorescence intensity at 593 nm was measured.
３．結果
得られた結果を図５に示す。図５に示されているように、核酸鎖１及びリガンドのいずれか一方又は双方を塩化しなかった場合には、ＲＯＸの蛍光波長に対応する５９３ｎｍの蛍光強度の上昇は観察されなかったが、核酸鎖１、リガンド及び核酸プローブ１が添加されたされた場合には、５９３ｎｍの蛍光強度の著しい上昇が認められた。即ち、本結果から、核酸プローブ１が核酸鎖１に配列特異的に結合することによって、リガンドであるチオフラビンＴから核酸プローブ１のＲＯＸに蛍光エネルギー移動が生じていることが明らかとなった。
3. Results The results obtained are shown in FIG. As shown in FIG. 5, when either or both of the nucleic acid strand 1 and the ligand were not salified, an increase in fluorescence intensity of 593 nm corresponding to the fluorescence wavelength of ROX was not observed. When the nucleic acid strand 1, the ligand, and the nucleic acid probe 1 were added, a remarkable increase in fluorescence intensity at 593 nm was observed. That is, it was clarified from this result that fluorescence energy transfer occurred from the ligand thioflavin T to the ROX of the nucleic acid probe 1 by binding the nucleic acid probe 1 to the nucleic acid chain 1 in a sequence-specific manner.
実施例４：蛍光エネルギー移動を利用した、四重螺旋構造を有するＶＥＧＦのｍＲＮＡの部分配列の検出における配列特異性の評価
１．実験材料
以下の実験材料を準備した。
核酸鎖３：ＶＥＧＦのｍＲＮＡの部分配列（配列番号５：5'-GGGGCGGGCCGGGGGCGGGGUCCCGGCGGGGCGGAG-3'、５’末端側から１〜２０位の塩基配列で四重螺旋構造を形成）
核酸プローブ３：３’末端がＲＯＸで標識されたＤＮＡプローブ（配列番号６：5'-CTCCGCCCCGCCGGG-3'、配列番号５の５’末端側から２２〜３６位の塩基配列に対する相補鎖）
核酸プローブ４：３’末端がＲＯＸで標識されたＤＮＡプローブ（配列番号７：5'-CTCCGAAAAACCGGG-3'、配列番号５の５’末端側から２２〜２６及び３２〜３６位の塩基配列に対して相補的な塩基配列であるが、配列番号５の５’末端側から２７〜３１位塩基配列に対しては非相補的（ミスマッチ）な塩基配列である）
リガンド：チオフラビンＴ
反応溶液：１００ｍＭのＫＣｌを含む５０ｍＭのＭＥＳ-ＬｉＯＨ緩衝液（ｐＨ７）
Example 4: Evaluation of sequence specificity in detection of partial sequence of VEGF mRNA having a quadruplex structure using fluorescence energy transfer
1. Experimental materials The following experimental materials were prepared.
Nucleic acid chain 3: Partial sequence of mRNA of VEGF (SEQ ID NO: 5: 5′-GGGGCGGGCCGGGGGCGGGGUCCCGGCGGGGCGGAG-3 ′, forming a quadruplex structure with the base sequence from 1 to 20 position from the 5 ′ end)
Nucleic acid probe 3: DNA probe labeled with ROX at the 3 ′ end (SEQ ID NO: 6: 5′-CTCCGCCCCGCCGGG-3 ′, complementary strand to the base sequence at positions 22 to 36 from the 5 ′ end of SEQ ID NO: 5)
Nucleic acid probe 4: DNA probe labeled with ROX at the 3 ′ end (SEQ ID NO: 7: 5′-CTCCGAAAAACCGGG-3 ′, with respect to the base sequences at positions 22 to 26 and 32 to 36 from the 5 ′ end of SEQ ID NO: 5 A complementary nucleotide sequence, but a non-complementary (mismatched) nucleotide sequence from the 5 'end of SEQ ID NO: 5 to the 27th to 31st nucleotide sequence)
Ligand: Thioflavin T
Reaction solution: 50 mM MES-LiOH buffer (pH 7) containing 100 mM KCl
２．実験方法
反応溶液中に１μＭの核酸鎖３及び１０μＭのリガンドを添加して、９５℃で５分間静置して、一本鎖状態に一旦解いた後に、０．５℃／分の冷却速度で２５℃まで冷却してアニーリングさせた。次いで、０、０．００１、０．００３、０．０１、０．０３、０．１、０．３、及び１．０μＭとなるように核酸プローブ３又は核酸プローブ４を反応溶液に添加し、マルチスペクトロマイクロプレートリーダ（Varioskan Flash）にて４５０ｎｍの励起光を照射して４５０ｎｍ〜７５０ｎｍの蛍光強度を測定した。
2. Experimental Method Add 1 μM nucleic acid strand 3 and 10 μM ligand to the reaction solution, let stand at 95 ° C. for 5 minutes, and once unwind to a single-stranded state, at a cooling rate of 0.5 ° C./minute. It was cooled to 25 ° C. and annealed. Next, the nucleic acid probe 3 or the nucleic acid probe 4 is added to the reaction solution so as to be 0, 0.001, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, and 1.0 μM, The fluorescence intensity of 450 nm to 750 nm was measured by irradiating 450 nm excitation light with a multi-spectro microplate reader (Varioskan Flash).
３．結果
得られた結果を図６に示す。図６に示されているように、核酸鎖３及びリガンドの存在下で、核酸鎖３に対して相補的な配列を有する核酸プローブ３を添加した場合には、核酸プローブ３の添加量の増加に伴って、リガンドであるチオフラビンＴの蛍光波長に対応する４８５ｎｍの蛍光強度の低下、及びＲＯＸの蛍光波長に対応する５９３ｎｍの蛍光強度の上昇が認められた。一方、核酸鎖３及びリガンドの存在下で、核酸鎖３に対してハイブリダイズできない核酸プローブ４を添加した場合には、核酸プローブ４の添加量を増加させても、チオフラビンＴの蛍光強度の減少とＲＯＸの蛍光強度の上昇は共に認められなかった。即ち、本結果から、核酸プローブとして、標的となる核酸鎖に特異的にハイブリダイズできるものを使用することによって、四重螺旋構造を有する核酸鎖を配列特異的に検出可能になることが明らかとなった。
3. Results The results obtained are shown in FIG. As shown in FIG. 6, when the nucleic acid probe 3 having a sequence complementary to the nucleic acid strand 3 is added in the presence of the nucleic acid strand 3 and the ligand, the addition amount of the nucleic acid probe 3 is increased. Along with this, a decrease in fluorescence intensity of 485 nm corresponding to the fluorescence wavelength of the ligand thioflavin T and an increase in fluorescence intensity of 593 nm corresponding to the fluorescence wavelength of ROX were observed. On the other hand, when the nucleic acid probe 4 that cannot hybridize to the nucleic acid chain 3 is added in the presence of the nucleic acid chain 3 and the ligand, the fluorescence intensity of the thioflavin T is decreased even if the amount of the nucleic acid probe 4 is increased. And ROX fluorescence intensity were not increased. That is, it is clear from this result that a nucleic acid probe having a quadruple helical structure can be detected in a sequence-specific manner by using a nucleic acid probe that can specifically hybridize to a target nucleic acid chain. became.
実施例５：蛍光エネルギー移動を利用した、四重螺旋構造を有する核酸鎖の検出における核酸プローブの直交性の評価
１．実験材料
以下の実験材料を準備した。
核酸鎖４：ＮＲＡＳのｍＲＮＡの部分配列（配列番号８：5'-GGGAGGGGCGGGUCUGGGUGCGGCCUGCCGCAUG-3'、５’末端側から１〜１８位の塩基配列で四重螺旋構造を形成）
核酸鎖５：ＢＣＬ２のｍＲＮＡの部分配列（配列番号９：5'-CUCCUCUUCUUUCUCUGGGGGCCGUGGGGUGGGAGCUGGGG-3'、５’末端側から１７〜４１位の塩基配列で四重螺旋構造を形成）
核酸プローブ３：３’末端がＲＯＸで標識されたＤＮＡプローブ（配列番号６：5'-CTCCGCCCCGCCGGG-3'、配列番号５の５’末端側から２２〜３６位の塩基配列に対する相補鎖）
リガンド：チオフラビンＴ
反応溶液：１００ｍＭのＫＣｌを含む５０ｍＭのＭＥＳ-ＬｉＯＨ緩衝液（ｐＨ７）
Example 5: Evaluation of orthogonality of nucleic acid probes in detection of nucleic acid strands having a quadruplex structure using fluorescence energy transfer
1. Experimental materials The following experimental materials were prepared.
Nucleic acid chain 4: Partial sequence of mRNA of NRAS (SEQ ID NO: 8: 5′-GGGAGGGGCGGGUCUGGGUGCGGCCUGCCGCAUG-3 ′, forming a quadruplex structure with the base sequence 1 to 18 from the 5 ′ end)
Nucleic acid chain 5: partial sequence of mRNA of BCL2 (SEQ ID NO: 9: 5′-CUCCUCUUCUUUCUCUGGGGGCCGUGGGGUGGGAGCUGGGG-3 ′, forming a quadruplex structure with a base sequence at positions 17 to 41 from the 5 ′ end)
Nucleic acid probe 3: DNA probe labeled with ROX at the 3 ′ end (SEQ ID NO: 6: 5′-CTCCGCCCCGCCGGG-3 ′, complementary strand to the base sequence at positions 22 to 36 from the 5 ′ end of SEQ ID NO: 5)
Ligand: Thioflavin T
Reaction solution: 50 mM MES-LiOH buffer (pH 7) containing 100 mM KCl
２．実験方法
反応溶液中に１μＭの核酸鎖４又は核酸鎖５、及び１０μＭのリガンドを添加して、９５℃で５分間静置して、一本鎖状態に一旦解いた後に、０．５℃／分の冷却速度で２５℃まで冷却してアニーリングさせた。次いで、０、０．００１、０．００３、０．０１、０．０３、０．１、０．３、及び１．０μＭとなるように核酸プローブ３を反応溶液に添加し、マルチスペクトロマイクロプレートリーダ（Varioskan Flash）にて４５０ｎｍの励起光を照射して４５０ｎｍ〜７５０ｎｍの蛍光強度を測定した。
2. Experimental Method Add 1 μM of nucleic acid strand 4 or nucleic acid strand 5 and 10 μM of ligand to the reaction solution, let stand at 95 ° C. for 5 minutes, and once unravel in a single strand state, It was cooled to 25 ° C. at a cooling rate of minutes and annealed. Next, the nucleic acid probe 3 was added to the reaction solution so as to be 0, 0.001, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, and 1.0 μM, and the multi-spectrometer microplate The reader was irradiated with excitation light of 450 nm with a reader (Varioskan Flash), and the fluorescence intensity of 450 nm to 750 nm was measured.
３．結果
得られた結果を図７に示す。図７から明らかなように、核酸鎖４及び核酸鎖５のいずれの場合でも、核酸プローブ３の添加量を増加させても、チオフラビンＴの蛍光強度の減少とＲＯＸの蛍光強度の上昇は共に認められなかった。即ち、本結果から、核酸プローブとして、標的となる核酸鎖に特異的にハイブリダイズできるものを使用しない場合には、蛍光エネルギー移動が生じないことが確認された。
3. Results The results obtained are shown in FIG. As is clear from FIG. 7, in both cases of the nucleic acid strand 4 and the nucleic acid strand 5, even if the addition amount of the nucleic acid probe 3 is increased, both a decrease in the fluorescence intensity of thioflavin T and an increase in the fluorescence intensity of ROX are observed. I couldn't. That is, from this result, it was confirmed that no fluorescence energy transfer occurs when a nucleic acid probe that can specifically hybridize to a target nucleic acid chain is not used.
実施例６：蛍光エネルギー移動を利用した、四重螺旋構造を有する核酸鎖の配列特異的検出における一般性
１．実験材料
以下の実験材料を準備した。
核酸鎖４：ＮＲＡＳのｍＲＮＡの部分配列（配列番号８：5'-GGGAGGGGCGGGUCUGGGUGCGGCCUGCCGCAUG-3'、５’末端側から１〜１８位の塩基配列で四重螺旋構造を形成）
核酸鎖５：ＢＣＬ２のｍＲＮＡの部分配列（配列番号９：5'-CUCCUCUUCUUUCUCUGGGGGCCGUGGGGUGGGAGCUGGGG-3'、５’末端側から１７〜４１位の塩基配列で四重螺旋構造を形成）
核酸プローブ５：５’末端がＲＯＸで標識されたＤＮＡプローブ（配列番号１０：5'-CATGCGGCAGGCCGC-3'、配列番号８の５’末端側から２０〜３４位の塩基配列に対する相補鎖）
核酸プローブ６：３’末端がＲＯＸで標識されたＤＮＡプローブ（配列番号１１：5'-GAGAAAGAAGAGGAG-3'、配列番号９の５’末端側から１〜１５位の塩基配列に対する相補鎖）
リガンド：チオフラビンＴ
反応溶液：１００ｍＭのＫＣｌを含む５０ｍＭのＭＥＳ-ＬｉＯＨ緩衝液（ｐＨ７）
Example 6: Generality in sequence-specific detection of nucleic acid strands having a quadruplex structure using fluorescence energy transfer
1. Experimental materials The following experimental materials were prepared.
Nucleic acid chain 4: Partial sequence of mRNA of NRAS (SEQ ID NO: 8: 5′-GGGAGGGGCGGGUCUGGGUGCGGCCUGCCGCAUG-3 ′, forming a quadruplex structure with the base sequence 1 to 18 from the 5 ′ end)
Nucleic acid chain 5: partial sequence of mRNA of BCL2 (SEQ ID NO: 9: 5′-CUCCUCUUCUUUCUCUGGGGGCCGUGGGGUGGGAGCUGGGG-3 ′, forming a quadruplex structure with a base sequence at positions 17 to 41 from the 5 ′ end)
Nucleic acid probe 5: DNA probe labeled with ROX at the 5 ′ end (SEQ ID NO: 10: 5′-CATGCGGCAGGCCGC-3 ′, complementary strand to the base sequence at positions 20 to 34 from the 5 ′ end of SEQ ID NO: 8)
Nucleic acid probe 6: DNA probe labeled with ROX at the 3 ′ end (SEQ ID NO: 11: 5′-GAGAAAGAAGAGGAG-3 ′, complementary strand to the base sequence at positions 1 to 15 from the 5 ′ end of SEQ ID NO: 9)
Ligand: Thioflavin T
Reaction solution: 50 mM MES-LiOH buffer (pH 7) containing 100 mM KCl
２．実験方法
反応溶液中に１μＭの核酸鎖４、及び１０μＭのリガンドを添加して、９５℃で５分間静置して、一本鎖状態に一旦解いた後に、０．５℃／分の冷却速度で２５℃まで冷却してアニーリングさせた。次いで、０、０．００１、０．００３、０．０１、０．０３、０．１、０．３、及び１．０μＭとなるように核酸プローブ５を反応溶液に添加し、マルチスペクトロマイクロプレートリーダ（Varioskan Flash）にて４５０ｎｍの励起光を照射して４５０ｎｍ〜７５０ｎｍの蛍光強度を測定した。
2. Experimental method 1 μM nucleic acid strand 4 and 10 μM ligand were added to the reaction solution, allowed to stand at 95 ° C. for 5 minutes, and once unwound into a single strand state, a cooling rate of 0.5 ° C./min. At 25 ° C. and annealed. Next, the nucleic acid probe 5 was added to the reaction solution so as to be 0, 0.001, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, and 1.0 μM, and the multi-spectrometer microplate The reader was irradiated with excitation light of 450 nm with a reader (Varioskan Flash), and the fluorescence intensity of 450 nm to 750 nm was measured.
また、別途、反応溶液中に１μＭの核酸鎖５、及び１０μＭのリガンドを添加して、９５℃で５分間静置して、一本鎖状態に一旦解いた後に、０．５℃／分の冷却速度で２５℃まで冷却してアニーリングさせた。次いで、０、０．００１、０．００３、０．０１、０．０３、０．１、０．３、及び１．０μＭとなるように核酸プローブ６を反応溶液に添加し、マルチスペクトロマイクロプレートリーダ（Varioskan Flash）にて４５０ｎｍの励起光を照射して４５０ｎｍ〜７５０ｎｍの蛍光強度を測定した。 Separately, 1 μM nucleic acid strand 5 and 10 μM ligand were added to the reaction solution, and allowed to stand at 95 ° C. for 5 minutes. It cooled to 25 degreeC with the cooling rate, and annealed. Next, the nucleic acid probe 6 was added to the reaction solution so that the concentration was 0, 0.001, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, and 1.0 μM. The reader was irradiated with excitation light of 450 nm with a reader (Varioskan Flash), and the fluorescence intensity of 450 nm to 750 nm was measured.
３．結果
得られた結果を図８に示す。図８から明らかなように、ＮＲＡＳのｍＲＮＡの部分配列である核酸鎖４、及びＢＣＬ２のｍＲＮＡの部分配列である核酸鎖５のいずれの場合でも、当該核酸鎖に相補的な配列を有する核酸プローブとリガンド（チオフラビンＴ）を添加した場合に、核酸プローブの添加量の増加に伴って、チオフラビンＴの蛍光強度の減少とＲＯＸの蛍光強度の上昇が認められ、蛍光エネルギー移動が生じたことが確認された。即ち、本結果からも、核酸プローブとして、標的となる核酸鎖に特異的にハイブリダイズできるものを使用することによって、四重螺旋構造を有する核酸鎖を配列特異的に検出可能になることが明らかとなった。
3. Results The results obtained are shown in FIG. As is apparent from FIG. 8, in any case of the nucleic acid strand 4 which is a partial sequence of NRAS mRNA and the nucleic acid strand 5 which is a partial sequence of BCL2 mRNA, a nucleic acid probe having a sequence complementary to the nucleic acid strand. And the ligand (thioflavin T) was added, a decrease in the fluorescence intensity of thioflavin T and an increase in the fluorescence intensity of ROX were observed as the amount of nucleic acid probe added increased, confirming that fluorescence energy transfer occurred It was done. That is, also from this result, it is clear that a nucleic acid probe having a quadruplex structure can be detected in a sequence-specific manner by using a nucleic acid probe that can specifically hybridize to a target nucleic acid chain. It became.
実施例７：蛍光エネルギー移動を利用した、四重螺旋構造を有する核酸鎖の配列特異的検出における一般性
１．実験材料
以下の実験材料を準備した。
核酸鎖１：ＶＥＧＦのｍＲＮＡの部分配列（配列番号１：5'-GGAGGAGGGGGAGGAGGAAGAAGAGAAGGAAGAG-3'、５’末端側から１〜１５位の塩基配列で四重螺旋構造を形成）
核酸鎖４：ＮＲＡＳのｍＲＮＡの部分配列（配列番号８：5'-GGGAGGGGCGGGUCUGGGUGCGGCCUGCCGCAUG-3'、５’末端側から１〜１８位の塩基配列で四重螺旋構造を形成）
核酸鎖５：ＢＣＬ２のｍＲＮＡの部分配列（配列番号９：5'-CUCCUCUUCUUUCUCUGGGGGCCGUGGGGUGGGAGCUGGGG-3'、５’末端側から１７〜４１位の塩基配列で四重螺旋構造を形成）
核酸プローブ１：３’末端がＲＯＸで標識されたＤＮＡプローブ（配列番号３：5'-CTCTTCCTTCTCTTC-3'、配列番号１の５’末端側から２０〜３４位の塩基配列に対する相補鎖）
核酸プローブ５：５’末端がＲＯＸで標識されたＤＮＡプローブ（配列番号１０：5'-CATGCGGCAGGCCGC-3'、配列番号８の５’末端側から２０〜３４位の塩基配列に対する相補鎖）
核酸プローブ６：３’末端がＲＯＸで標識されたＤＮＡプローブ（配列番号１１：5'-GAGAAAGAAGAGGAG-3'、配列番号９の５’末端側から１〜１５位の塩基配列に対する相補鎖）
リガンド：チオフラビンＴ
反応溶液：１００ｍＭのＫＣｌを含む５０ｍＭのＭＥＳ-ＬｉＯＨ緩衝液（ｐＨ７）
Example 7: Generality in sequence-specific detection of nucleic acid strands having a quadruplex structure using fluorescence energy transfer
1. Experimental materials The following experimental materials were prepared.
Nucleic acid chain 1: Partial sequence of VEGF mRNA (SEQ ID NO: 1 5′-GGAGGAGGGGGAGGAGGAAGAAGAGAAGGAAGAG-3 ′, forming a quadruple helical structure with the base sequence of positions 1 to 15 from the 5 ′ end)
Nucleic acid chain 4: Partial sequence of mRNA of NRAS (SEQ ID NO: 8: 5′-GGGAGGGGCGGGUCUGGGUGCGGCCUGCCGCAUG-3 ′, forming a quadruplex structure with the base sequence 1 to 18 from the 5 ′ end)
Nucleic acid chain 5: partial sequence of mRNA of BCL2 (SEQ ID NO: 9: 5′-CUCCUCUUCUUUCUCUGGGGGCCGUGGGGUGGGAGCUGGGG-3 ′, forming a quadruplex structure with a base sequence at positions 17 to 41 from the 5 ′ end)
Nucleic acid probe 1: DNA probe labeled with ROX at the 3 ′ end (SEQ ID NO: 5: 5′-CTCTTCCTTCTCTTC-3 ′, complementary strand to the base sequence at positions 20 to 34 from the 5 ′ end of SEQ ID NO: 1)
Nucleic acid probe 5: DNA probe labeled with ROX at the 5 ′ end (SEQ ID NO: 10: 5′-CATGCGGCAGGCCGC-3 ′, complementary strand to the base sequence at positions 20 to 34 from the 5 ′ end of SEQ ID NO: 8)
Nucleic acid probe 6: DNA probe labeled with ROX at the 3 ′ end (SEQ ID NO: 11: 5′-GAGAAAGAAGAGGAG-3 ′, complementary strand to the base sequence at positions 1 to 15 from the 5 ′ end of SEQ ID NO: 9)
Ligand: Thioflavin T
Reaction solution: 50 mM MES-LiOH buffer (pH 7) containing 100 mM KCl
２．実験方法
反応溶液中に１μＭの核酸鎖１、核酸鎖４又は核酸鎖５、及び１０μＭのリガンドを添加して、９５℃で５分間静置して、一本鎖状態に一旦解いた後に、０．５℃／分の冷却速度で２５℃まで冷却してアニーリングさせた。次いで、１μＭの核酸プローブ１、核酸プローブ５又は核酸プローブ６を反応溶液に添加し、マルチスペクトロマイクロプレートリーダ（Varioskan Flash）にて４５０ｎｍの励起光を照射して、４８５ｎｍの蛍光強度（ドナー蛍光物質の蛍光強度）を測定した。また、核酸プローブを添加しないこと以外は、上記と同様の条件で、４８５ｎｍの蛍光強度（ドナー蛍光物質の蛍光強度）を測定した。次いで、下記算出式に基づいて、FRET効率を求めた。
FRET効率＝１−（ＦDA／ＦD）
ＦDA：アクセプター蛍光物質（核酸プローブ）存在下でのドナー蛍光物質の蛍光強度
ＦD：アクセプター蛍光物質（核酸プローブ）非存在下でのドナー蛍光物質の蛍光強度
2. Experimental Method Add 1 μM of nucleic acid strand 1, nucleic acid strand 4 or nucleic acid strand 5, and 10 μM of ligand to the reaction solution, let stand for 5 minutes at 95 ° C. Annealing was performed by cooling to 25 ° C. at a cooling rate of 5 ° C./min. Next, 1 μM of nucleic acid probe 1, nucleic acid probe 5 or nucleic acid probe 6 is added to the reaction solution, irradiated with 450 nm excitation light with a multi-spectro microplate reader (Varioskan Flash), and 485 nm fluorescence intensity (donor fluorescent substance) Fluorescence intensity). In addition, the fluorescence intensity at 485 nm (fluorescence intensity of the donor fluorescent substance) was measured under the same conditions as above except that no nucleic acid probe was added. Subsequently, FRET efficiency was calculated | required based on the following formula.
FRET efficiency = 1- (F DA / F D )
F DA : fluorescence intensity of the donor fluorescent substance in the presence of the acceptor fluorescent substance (nucleic acid probe) F D : fluorescence intensity of the donor fluorescent substance in the absence of the acceptor fluorescent substance (nucleic acid probe)
３．結果
得られた結果を図９に示す。図９に示されているように、核酸鎖と当該核酸鎖にハイブリダイズ可能な核酸プローブの組み合わせの場合においてのみ、高いFRET効率が認められた。即ち、本結果からも、核酸プローブとして、標的となる核酸鎖に特異的にハイブリダイズできるものを使用することによって、蛍光エネルギー移動を利用した、四重螺旋構造を有する核酸鎖の配列特異的な検出が可能になることが明らかとなった。
3. Results The results obtained are shown in FIG. As shown in FIG. 9, high FRET efficiency was recognized only in the case of a combination of a nucleic acid chain and a nucleic acid probe capable of hybridizing to the nucleic acid chain. That is, also from this result, by using a nucleic acid probe that can specifically hybridize to the target nucleic acid strand, the sequence-specificity of the nucleic acid strand having a quadruple helical structure utilizing fluorescence energy transfer is used. It became clear that detection was possible.
実施例８：蛍光エネルギー移動を利用した、四重螺旋構造を有する調査核酸鎖の配列特異的な検出
１．実験材料
以下の実験材料を準備した。
核酸鎖６：ＶＥＧＦのｍＲＮＡの部分配列（配列番号１２：5'-GCCGAGCGGAGCCGCGAGAAGUGCUAGCUCGGGCCGGGAGGAGCCGCAGCCGGAGGAGGGGGAGGAGGAAGAAGAGAAGGAAGAGGAGAGGGGGCCGCAGUGGCGACUCGGCGCUCGGAA-3'、５’末端側から５２〜６９位の塩基配列で四重螺旋構造を形成）
核酸プローブ１：３’末端がＲＯＸで標識されたＤＮＡプローブ（配列番号３：5'-CTCTTCCTTCTCTTC-3'、配列番号１２の５’末端側から７１〜８５位の塩基配列に対する相補鎖）
リガンド：チオフラビンＴ
反応溶液：１００ｍＭのＫＣｌを含む５０ｍＭのＭＥＳ-ＬｉＯＨ緩衝液（ｐＨ７）
Example 8: Sequence-specific detection of a probe nucleic acid strand having a quadruplex structure using fluorescence energy transfer
1. Experimental materials The following experimental materials were prepared.
Nucleic acid chain 6: Partial sequence of mRNA of VEGF (SEQ ID NO: 12: 5′-GCCGAGCGGAGCCGCGAGAAGUGCUAGCUCGGGCCGGGAGGAGCCGCAGCCGGAGGAGGGGGAGGAGGAAGAAGAGAAGGAAGAGGAGAGGGGGCCGCAGUGGCGACUCGGCGCUCGGAA-3 ′, 5th-position of the base structure forming the 4-fold helical structure
Nucleic acid probe 1: DNA probe labeled with ROX at the 3 ′ end (SEQ ID NO: 5: 5′-CTCTTCCTTCTCTTC-3 ′, complementary strand to the base sequence at positions 71 to 85 from the 5 ′ end of SEQ ID NO: 12)
Ligand: Thioflavin T
Reaction solution: 50 mM MES-LiOH buffer (pH 7) containing 100 mM KCl
２．実験方法
反応溶液中に１μＭの核酸鎖６、及び１０μＭのリガンドを添加して、９５℃で５分間静置して、一本鎖状態に一旦解いた後に、０．５℃／分の冷却速度で２５℃まで冷却してアニーリングさせた。次いで、０、０．００１、０．００３、０．０１、０．０３、０．１、０．３、及び１．０μＭとなるように核酸プローブ１を反応溶液に添加し、マルチスペクトロマイクロプレートリーダ（Varioskan Flash）にて４５０ｎｍの励起光を照射して４５０ｎｍ〜７５０ｎｍの蛍光強度を測定した。
2. Experimental Method Add 1 μM nucleic acid strand 6 and 10 μM ligand to the reaction solution, let stand at 95 ° C. for 5 minutes, and once unwind to a single-stranded state, then cool at a rate of 0.5 ° C./min. At 25 ° C. and annealed. Next, the nucleic acid probe 1 was added to the reaction solution so as to be 0, 0.001, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, and 1.0 μM, and the multi-spectrometer microplate The reader was irradiated with excitation light of 450 nm with a reader (Varioskan Flash), and the fluorescence intensity of 450 nm to 750 nm was measured.
３．結果
得られた結果を図１０に示す。図１０に示されているように、核酸鎖が長鎖ＲＮＡであっても、当該核酸鎖にハイブリダイズ可能な核酸プローブとリガンド（チオフラビンＴ）を共存させることにより、蛍光エネルギー移動が生じることが確認された。即ち、本結果から、比較的長い核酸鎖を検出対象としても、四重螺旋構造を配列特異的に検出できることが明らかとなった。
3. Results The results obtained are shown in FIG. As shown in FIG. 10, even when the nucleic acid chain is a long RNA, fluorescence energy transfer may occur when a nucleic acid probe capable of hybridizing to the nucleic acid chain and a ligand (thioflavin T) coexist. confirmed. That is, from this result, it was revealed that the quadruple helical structure can be detected in a sequence-specific manner even when a relatively long nucleic acid chain is a detection target.
Claims (8)
第１工程：被検核酸試料に対して(i)リガンドと(ii)核酸プローブを接触させる工程；
ここで、前記(i)リガンドが、核酸鎖の四重螺旋構造に特異的に結合でき、当該四重螺旋構造に結合すると蛍光を発する蛍光物質からなるリガンドであり、
前記(ii)核酸プローブが、蛍光物質で標識されてなる核酸プローブであって、標的となる四重螺旋構造を有する核酸鎖に存在し、且つ当該四重螺旋構造から蛍光エネルギー移動が可能な領域に位置している塩基配列に対してハイブリダイズできる塩基配列を有するプローブであり、
前記(i)リガンドと前記(ii)核酸プローブに標識された蛍光物質が、蛍光エネルギー移動におけるドナー蛍光物質とアクセプター蛍光物質の関係にある。
第２工程：前記ドナー蛍光物質を励起させて蛍光エネルギー移動を測定する工程。 A method for detecting a quadruplex structure of a nucleic acid strand in a sequence-specific manner, comprising the following first step and second step:
First step: (i) a ligand and (ii) a nucleic acid probe are brought into contact with a test nucleic acid sample;
Here, the ligand (i) is a ligand composed of a fluorescent substance that can specifically bind to the quadruplex structure of the nucleic acid chain and emits fluorescence when bound to the quadruplex structure.
(Ii) The nucleic acid probe is a nucleic acid probe labeled with a fluorescent substance, present in a nucleic acid chain having a target quadruple helical structure, and a region where fluorescence energy can be transferred from the quadruple helical structure A probe having a base sequence capable of hybridizing to the base sequence located at
The fluorescent substance labeled with the (i) ligand and the (ii) nucleic acid probe has a relationship between a donor fluorescent substance and an acceptor fluorescent substance in fluorescence energy transfer.
Second step: a step of measuring fluorescence energy transfer by exciting the donor fluorescent substance.
(i)核酸鎖の四重螺旋構造に特異的に結合でき、当該四重螺旋構造に結合すると蛍光を発する蛍光物質からなるリガンドと、
(ii)蛍光物質で標識されてなる核酸プローブであって、標的となる四重螺旋構造を有する核酸鎖に存在し、且つ当該四重螺旋構造から蛍光エネルギー移動が可能な領域に位置している塩基配列に対してハイブリダイズできる相補鎖を有する核酸プローブと、を含み、
前記(i)リガンドと前記(ii)核酸プローブに標識された蛍光物質が、蛍光エネルギー移動におけるドナー蛍光物質とアクセプター蛍光物質の関係にある、ことを特徴とする、検出キット。 A detection kit for sequence-specific detection of a quadruplex structure of a nucleic acid chain,
(i) a ligand consisting of a fluorescent substance that can specifically bind to the quadruplex structure of a nucleic acid chain and emits fluorescence when bound to the quadruplex structure;
(ii) a nucleic acid probe labeled with a fluorescent substance, present in a target nucleic acid chain having a quadruplex structure and located in a region where fluorescence energy can be transferred from the quadruplex structure A nucleic acid probe having a complementary strand capable of hybridizing to the base sequence,
The detection kit, wherein the fluorescent substance labeled with the (i) ligand and the (ii) nucleic acid probe has a relationship between a donor fluorescent substance and an acceptor fluorescent substance in fluorescence energy transfer.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2013199029A JP6300263B2 (en) | 2013-09-25 | 2013-09-25 | Method for detecting quadruplex structure of nucleic acid chain |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2013199029A JP6300263B2 (en) | 2013-09-25 | 2013-09-25 | Method for detecting quadruplex structure of nucleic acid chain |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2015062388A true JP2015062388A (en) | 2015-04-09 |
| JP6300263B2 JP6300263B2 (en) | 2018-03-28 |
Family
ID=52830906
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2013199029A Active JP6300263B2 (en) | 2013-09-25 | 2013-09-25 | Method for detecting quadruplex structure of nucleic acid chain |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP6300263B2 (en) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107271408A (en) * | 2016-04-08 | 2017-10-20 | 中国科学院化学研究所 | The detection method of the discontinuous serobilas of RNA G- tetra- |
| CN107271377A (en) * | 2016-04-08 | 2017-10-20 | 中国科学院化学研究所 | The detection method of the serobilas of RNA G- tetra- |
| CN112226487A (en) * | 2020-10-09 | 2021-01-15 | 南通大学 | DNA frame-wrapped G-quadruplex structure and preparation method and application thereof |
| CN114397282A (en) * | 2021-12-24 | 2022-04-26 | 江苏鑫蓝鑫生物科技有限公司 | Method for detecting chloramphenicol by using aptamer and G-quadruplex label-free fluorescence analysis method |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004262828A (en) * | 2003-02-28 | 2004-09-24 | Japan Science & Technology Agency | Molecule to be bonded to telomere or the like and use thereof |
| JP2008514197A (en) * | 2004-09-24 | 2008-05-08 | インジェネウス インコーポレイテッド | Genome assay |
| WO2009144914A1 (en) * | 2008-05-27 | 2009-12-03 | パナソニック株式会社 | G-quadruplex detection method, g-quadruplex dna detection method, and telomerase activity measurement method |
| JP2011177092A (en) * | 2010-02-26 | 2011-09-15 | Canon Inc | Screening method for ligand |
| WO2013021536A1 (en) * | 2011-08-11 | 2013-02-14 | パナソニック株式会社 | Method for detecting g-quadruplex formation |
-
2013
- 2013-09-25 JP JP2013199029A patent/JP6300263B2/en active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004262828A (en) * | 2003-02-28 | 2004-09-24 | Japan Science & Technology Agency | Molecule to be bonded to telomere or the like and use thereof |
| JP2008514197A (en) * | 2004-09-24 | 2008-05-08 | インジェネウス インコーポレイテッド | Genome assay |
| WO2009144914A1 (en) * | 2008-05-27 | 2009-12-03 | パナソニック株式会社 | G-quadruplex detection method, g-quadruplex dna detection method, and telomerase activity measurement method |
| JP2011177092A (en) * | 2010-02-26 | 2011-09-15 | Canon Inc | Screening method for ligand |
| WO2013021536A1 (en) * | 2011-08-11 | 2013-02-14 | パナソニック株式会社 | Method for detecting g-quadruplex formation |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| CHEMBIOCHEM, vol. Vol.14, JPN6017024878, 2013, pages 540 - 558 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107271408A (en) * | 2016-04-08 | 2017-10-20 | 中国科学院化学研究所 | The detection method of the discontinuous serobilas of RNA G- tetra- |
| CN107271377A (en) * | 2016-04-08 | 2017-10-20 | 中国科学院化学研究所 | The detection method of the serobilas of RNA G- tetra- |
| CN112226487A (en) * | 2020-10-09 | 2021-01-15 | 南通大学 | DNA frame-wrapped G-quadruplex structure and preparation method and application thereof |
| CN114397282A (en) * | 2021-12-24 | 2022-04-26 | 江苏鑫蓝鑫生物科技有限公司 | Method for detecting chloramphenicol by using aptamer and G-quadruplex label-free fluorescence analysis method |
| CN114397282B (en) * | 2021-12-24 | 2023-11-17 | 江苏鑫蓝鑫生物科技有限公司 | Method for detecting chloramphenicol by using nucleic acid aptamer and G-quadruplex label-free fluorescence analysis method |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP6300263B2 (en) | 2018-03-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hövelmann et al. | DNA stains as surrogate nucleobases in fluorogenic hybridization probes | |
| Okamoto | ECHO probes: a concept of fluorescence control for practical nucleic acid sensing | |
| EP2633067B1 (en) | Luminophore-labeled molecules coupled with particles for microarray-based assays | |
| WO2017008177A1 (en) | Compositions and methods for detection of genetic deafness gene mutation | |
| Hövelmann et al. | Single Labeled DNA FIT Probes for Avoiding False‐Positive Signaling in the Detection of DNA/RNA in qPCR or Cell Media | |
| JP6300263B2 (en) | Method for detecting quadruplex structure of nucleic acid chain | |
| Larkey et al. | Detection of miRNA using a double-strand displacement biosensor with a self-complementary fluorescent reporter | |
| JP5932808B2 (en) | Target nucleic acid detection method | |
| CN106687589A (en) | Dna amplification technology | |
| Goldman et al. | High affinity γPNA sandwich hybridization assay for rapid detection of short nucleic acid targets with single mismatch discrimination | |
| Lee et al. | Amplification-free and direct fluorometric determination of telomerase activity in cell lysates using chimeric DNA-templated silver nanoclusters | |
| JP4873427B2 (en) | Hairpin primer used in nucleic acid amplification reaction and use thereof | |
| Charvin et al. | Topoisomerase IV bends and overtwists DNA upon binding | |
| JP6661171B2 (en) | Fluorescently labeled single-stranded nucleic acids and uses thereof | |
| Bazzi et al. | The integration of hybridization chain reaction (HCR) with fluorogenic silver nanoclusters (AgNCs) in an aggregation induced emission (AIE)-based nanosensor for sex determination and its forensic application | |
| CN110628888B (en) | Nucleic acid probe assembled by triggering miRNA-21 and cell fluorescence imaging | |
| Gui et al. | Direct detection of circulating free DNA extracted from serum samples of breast cancer using locked nucleic acid molecular beacon | |
| Zhou et al. | Photoinduced Electron Transfer‐Based Fluorescence Quenching Combined with Rolling Circle Amplification for Sensitive Detection of MicroRNA | |
| US20210388420A1 (en) | Method for detecting a plurality of short-chain nucleic acid in sample, combinatorial analysis kit, analysis kit supply management method | |
| US20230212652A1 (en) | Luminescence hybridisation assay method | |
| Zhang et al. | Toehold-mediated nonenzymatic DNA strand displacement coupling UDG mediated PCR and multi-code magnetic beads for DNA genotyping | |
| Bazzi et al. | A dual-targeting nanobiosensor for Gender Determination applying Signal Amplification Methods and integrating Fluorometric Gold and Silver Nanoclusters | |
| Géron‐Landre et al. | Stem–loop oligonucleotides as tools for labelling double‐stranded DNA | |
| Okamoto | Thiazole Orange-tethered nucleic acids and ECHO Probes for fluorometric detection of nucleic acids | |
| JP5967785B2 (en) | Target nucleic acid detection method |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20160920 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170704 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20170901 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170921 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20180206 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20180221 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6300263 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |