JP2004262828A - Molecule to be bonded to telomere or the like and use thereof - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、テロメア等の１本鎖のオリゴヌクレオチドに結合し得る分子、およびその利用法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
テロメアは染色体の末端に存在するＤＮＡ配列であり、ヒト染色体の場合にはＴＴＡＧＧＧ配列が繰り返し続き、初期の状態では約１０ｋｂほどの長さのＤＮＡ配列である。このテロメアには種々の結合タンパク質が結合して、ＤＮＡの末端同士が結合して環状のＤＮＡになることを抑制したり、核膜との結合などの働きをしたりしている。このうちの大部分は２本鎖であるが、最末端の数十塩基は３’末端側が１本鎖で突出している。細胞分裂の際にはＤＮＡが複製されるが、この複製機構において複製のたびに、約５０〜１５０塩基程度のテロメアの配列が短縮されることがわかっている。そして、テロメア部分の長さが約５ｋｂ程度になると、細胞は分裂寿命を迎え（Ｍ１期）、細胞の分裂を停止する。
【０００３】
正常細胞においては、テロメアの２本鎖部分にテロメア結合タンパク質の１種であるＴＲＦ１が結合して、テロメアの延長を抑制しており、分裂寿命を迎えた細胞は、テロメアＤＮＡが次第に不安定となり、遂に染色体の安定性を保つことができなくなり、そして自然死（アポトシス）（Ｍ２期）する。
【０００４】
一方、ガン細胞では、テロメアの配列を伸張させる酵素「テロメラーゼ」が活性化され、細胞分裂により短くなったテロメア配列を長くする。このテロメラーゼは、テロメアＤＮＡの１本鎖部分を延長する逆転写酵素であり、ＴＴＡＧＧＧの１．５回分に相当する相補鎖の鋳型ＲＮＡを内在しており、これをプライマーとして伸長反応を行う。このため、ガン細胞ではテロメアの短縮が抑制され、無限に細胞増殖を繰り返すことができるとされている。これが、ガン細胞が正常細胞とは異なり、前記したＭ１期やＭ２期を迎えることなく異常に増殖を繰り返すことができる理由だと考えられている。
【０００５】
このことから、ガン細胞に特有のテロメラーゼによるテロメア配列の伸長反応を阻害する化合物が、次世代の抗ガン剤として注目されている。特に、テロメア配列は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、４本のＤＮＡが集まり４重鎖（クアドラプレックス）構造、特にグアニン４重鎖構造を形成することが知られている。このため、グアニン４重鎖構造を安定化できれば、テロメラーゼによるテロメア配列の伸張を阻害できるとの考えのもと、テロメアＤＮＡのグアニン４重鎖構造に結合するテロメア伸長阻害物質が数多く設計された。しかし、細胞核内において、テロメアＤＮＡがクアドラプレックス構造（特に、グアニン４重鎖構造）を形成している証拠はなく、従来のテロメア伸長阻害物質の分子ターゲットは明確ではなかった。
【０００６】
そこで、本発明者らは、以前に、テロメアＤＮＡの１本鎖部分における相互の塩基の対において、正常な塩基対を形成することができない塩基対（ミスマッチ塩基対）に擬似的に塩基対を形成させ、ヘアピン構造等の２本鎖構造等を安定化させることによりテロメラーゼの作用を阻害することができる方法等を開発した（特許文献１参照）。
【０００７】
上記方法について簡単に説明する。まず、図１に示すＤＮＡの塩基配列は、テロメアの３’末端側の１本鎖の部分がヘアピン構造を形成した場合を模式的に示したものであり、同図の右側はヘアピン構造のループ部分で全体としては１本鎖である。この１本鎖のテロメア末端の５’側が２本鎖ＤＮＡになっており、３’側はテロメアの末端、すなわち染色体の末端である。同図の縦線は相補的な配列であることを示すが、その他はミスマッチの配列となっていることを示す。すなわち、１本鎖のテロメア配列は、上述のとおりＴＴＡＡＧＧＧの繰り返し配列であるため、１本鎖のテロメア配列がヘアピン構造を形成する場合に発生する相補的な配列は「ＴＡ」の部分しかない。例えば、図１に示すようにこの「ＴＡ」の部分において相補鎖を形成してもその前後においてＧ−Ｇミスマッチ（グアニン−グアニンミスマッチ）などの塩基のミスマッチが生じることになる。このように、テロメアの１本鎖部分において安定なヘアピン構造を形成させることは通常は困難であり、ガン細胞においては、このテロメアの１本鎖部分にテロメラーゼが作用してテロメアの伸長反応が生起することになる。
【０００８】
しかし、テロメアの１本鎖部分におけるＧ−Ｇミスマッチなどの塩基のミスマッチを解消することができれば、テロメアの１本鎖部分において安定なヘアピン構造を形成させることができ、テロメラーゼの作用を阻害することができる。そこで、本発明者らは、テロメアのヘアピン構造等における２本鎖ＤＮＡ中に生成するＧ−Ｇミスマッチに特異的に結合し、安定化する分子であるＤＮＡ認識分子を用いて、テロメアＤＮＡの１本鎖ＤＮＡが安定なヘアピン構造や４本鎖構造等を形成できる方法等を開発した。テロメラーゼは、上述したようにテロメアＤＮＡの１本鎖部分と作用し、これを延長するものであるから、上記方法等を利用することで、テロメラーゼの活性を阻害することができ、ひいてはガン細胞の増殖を抑制できることになる。
【０００９】
【特許文献１】
特開２００２−３００９４号公報（公開日 平成１４年 １月２９日）
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
上述のような従来のテロメアＤＮＡの１本鎖ＤＮＡが安定なヘアピン構造や４本鎖構造等を形成できる方法等は、一般式（Ｉ）、Ａ−Ｌ−Ｂ （Ｉ）（式中、Ａは正常な塩基対を形成することができない塩基の対の片方の塩基と対を形成し得る化学構造部分、Ｂは正常な塩基対を形成することができない塩基の対のもう一方の塩基と対を形成し得る化学構造部分、Ｌは化学構造部分Ａ及びＢを結合するリンカー構造を示す。）で表される、その各々の塩基と対を形成し得る化学構造部分Ａ及び化学構造部分Ｂ、並びに当該化学構造部分Ａ及びＢを結合するリンカー部分Ｌを有する化合物を用いていた。
【００１１】
しかしながら、ＴＴＡＧＧＧの繰り返し配列からなる１本鎖のテロメアＤＮＡが形成するヘアピンループ構造では、Ｇ−Ｇミスマッチが連続して多数存在するため、上記化合物では十分にヘアピンループ構造を安定化することができないという問題点がある。
【００１２】
したがって、Ｇ−Ｇミスマッチが連続して多数存在する１本鎖のテロメアＤＮＡが形成するヘアピンループ構造等を安定化させるための化合物、方法、および薬剤等が強く望まれていた。
【００１３】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、不対塩基、特にＧ−Ｇミスマッチが連続して多数存在するオリゴヌクレオチド（例えば、１本鎖のテロメアＤＮＡ）に特異的に結合し、当該オリゴヌクレオチドが形成するヘアピンループ構造等を安定化等させるための化合物、およびその利用法を提供することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ヒトのテロメアＤＮＡの１本鎖部分に特徴的な配列であるＴＴＡＧＧＧの繰り返し配列がヘアピン構造等により２本鎖や４本鎖構造を形成する場合、塩基のミスマッチ（特にＧ−Ｇミスマッチ）が連続して存在することに着目し、これらの連続する塩基のミスマッチ部分に特異的に結合し、擬似的に塩基対を形成することができる化合物、ビスナフチリジンダイマーを作製した。そして、この化合物とヒトのテロメアＤＮＡの１本鎖ＤＮＡとを混合したところ、従来のＧ−Ｇミスマッチ認識（結合）分子と比較して、より強力に塩基のミスマッチ部分に特異的に結合し、その結果、テロメアＤＮＡの１本鎖部分におけるヘアピン構造等の形成をより安定化することを見出した。すなわち、上記化合物を用いることにより、より強力にテロメラーゼの作用を阻害することができる。
【００１５】
すなわち、本発明にかかる化合物またはその固定化物は、上記の課題を解決するために、下記の一般式（２）、
【００１６】
【化２】
（式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ３、およびＲ４は、水素原子、炭素数１〜１５のアルキル基であって当該アルキル基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、窒素原子、及び／又は硫黄原子で置換されてもよいアルキル基、炭素数１〜１５のアルコキシル基であって当該アルコキシ基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、窒素原子、及び／又は硫黄原子で置換されてもよいアルコキシル基、又は、炭素数１〜１５のモノ若しくはジアルキルアミノ基であって当該アルキルアミノ基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、窒素原子、及び／又は硫黄原子で置換されてもよいモノ若しくはジアルキルアミノ基を示し、Ｒ２およびＲ５は、炭素数１〜２０のアルキレン基であって当該アルキレン基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、窒素原子又はカルボニル基で置換されてもよいアルキレン基を示す。）で表される化合物またはその固定化物である。
【００１８】
上記の化合物またはその固定化物は、Ｇ−Ｇミスマッチ、特に連続して存在するＧ−Ｇミスマッチに強力に結合することができる。これによって、例えば、Ｇ−Ｇミスマッチ、特に連続して存在するＧ−Ｇミスマッチを感度よく検出、同定することができる。さらに、Ｇ−Ｇミスマッチが連続して存在するテロメアＤＮＡの１本鎖部分におけるヘアピン構造等の形成をより安定化することが可能である。したがって、より強力にテロメラーゼの作用を阻害することができる。
【００１９】
また、本発明でいう「固定化物」とは、化合物をチップ、センサー、またはプレート等の担体（化合物の機能を阻害しないもの）に固定化したもの又は固定化され得るように「枝」をのばした状態の化合物をいう。なお、化合物の担体への固定化には、リンカー部分から担体に固定化するための枝を結合させる等の従来公知の化学的、物理的な方法を利用することができ、特に限定されるものではない。また、上記のように、硫黄を含む化合物（特にメルカプト基を含む化合物）は、その分子を固定化（例えばチップなどに固定化）するときに、その固定化が容易である。
【００２０】
また、本発明にかかる化合物は、上記一般式（２）で表される化合物またはその固定化物が、下記の構造式（３）、
【００２１】
【化３】
であることが好ましい。
【００２３】
また、本発明にかかる、擬似的塩基対形成方法は、下記の一般式（１）、
【００２４】
【化１】
（式中、Ａ、Ｃは正常な塩基対を形成することができない塩基の対の片方の塩基と対を形成し得る化学構造部分、Ｂ、Ｄは正常な塩基対を形成することができない塩基の対のもう一方の塩基と対を形成し得る化学構造部分、Ｌ１は化学構造部分Ａ及びＢを結合するリンカー構造を示し、Ｌ２は化学構造部分Ｃ及びＤを結合するリンカー構造を示し、Ｌ１とＬ２とは結合している。）で表される化合物またはその固定化物を用いて、１本鎖オリゴヌクレオチド鎖の分子内における塩基の対において、正常な塩基対を形成することができない塩基の対に擬似的に塩基対を形成させる方法である。
【００２６】
上記の方法によれば、従来のミスマッチ認識分子を用いる場合に比べて、１本鎖オリゴヌクレオチド鎖の分子内における塩基の対において、連続して存在する正常な塩基対を形成することができない塩基の対に、より強力に擬似的な塩基対を形成させることができる。
【００２７】
また、上記一般式（１）で表される化合物またはその固定化物の化学構造部分Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤが、擬似的に塩基対を形成する塩基と水素結合を形成し、かつ周囲の塩基とのスタッキング効果により安定化されることにより塩基と対を形成する化合物であることが好ましい。さらに、上記一般式（１）で表される化合物またはその固定化物の化学構造部分Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤが、塩基との水素結合が可能な２個以上の化学構造部分を含有する複素環式芳香族基を有するものであることが好ましい。
【００２８】
また、上記一般式（１）で表される化合物またはその固定化物の化学構造部分Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤの少なくともひとつが、ナフチリジン又はその誘導体であるであることが好ましい。さらに、上記一般式（１）で表される化合物またはその固定化物の化学構造部分ＡおよびＢとリンカー部分Ｌ１との結合、及び／又は化学構造部分ＣおよびＤとリンカー部分Ｌ２との結合が、カルボン酸アミド結合であることが好ましい。
【００２９】
また、上記一般式（１）で表される化合物またはその固定化物が、上記一般式（２）で表される化合物であるであることが好ましい。さらに、上記一般式（２）で表される化合物またはその固定化物におけるＲ２およびＲ５は、それぞれ窒素原子を有しており、それらの窒素原子間が、炭素−炭素結合で結合されていることが好ましい。
【００３０】
また、上記オリゴヌクレオチド鎖が、ＤＮＡ鎖であることが好ましい。さらに、上記ＤＮＡ鎖が、テロメア領域のＤＮＡ鎖であることが好ましい。また、上記テロメア領域のＤＮＡ鎖が、ＴＴＡＧＧＧの繰り返し配列であることが好ましい。
【００３１】
また、上記１本鎖のオリゴヌクレオチド鎖における分子内の（相互の）塩基の対であって、正常な塩基対を形成することができない塩基の対が、Ｇ−Ｇミスマッチであることが好ましい。さらに、上記擬似的に塩基対を形成させられた構造が、ヘアピン構造であることが好ましい。
【００３２】
また、本発明にかかる安定化方法、すなわち、１本鎖オリゴヌクレオチド鎖の分子内における（相互の）塩基の対であって正常な塩基対を形成することができない塩基の対を安定化させる方法は、上記一般式（１）で表される化合物またはその固定化物を用いて、１本鎖オリゴヌクレオチド鎖の分子内における塩基の対において、正常な塩基対を形成することができない塩基の対に擬似的に塩基対を形成させる工程を含んでいる、１本鎖のオリゴヌクレオチド鎖における分子内の塩基の対であって正常な塩基対を形成することができない塩基の対を安定化させる方法である。また、本発明にかかる安定化剤は、上記一般式（１）で表される化合物またはその固定化物を含んでおり、１本鎖オリゴヌクレオチド鎖の分子内における塩基の対において、正常な塩基対を形成することができない塩基の対に擬似的に塩基対を形成させて、塩基対を安定化させるための、１本鎖のオリゴヌクレオチド鎖における相互の塩基の対の形成の安定化剤である。
【００３３】
上記の方法等によれば、従来のミスマッチ認識分子を用いる場合に比べて、１本鎖オリゴヌクレオチド鎖の分子内（相互の）における塩基の対であって正常な塩基対を形成することができない塩基の対をより強力に安定化させることができる。
【００３４】
また、本発明にかかる酵素活性阻害剤は、１本鎖オリゴヌクレオチド鎖の分子内における塩基の対において、正常な塩基対を形成することができない塩基の対に擬似的な塩基対を形成させ得る、上記一般式（１）で表される化合物またはその固定化物を含んでいる、オリゴヌクレオチド鎖の相補鎖を合成する酵素の活性阻害剤である。また、本発明にかかる酵素活性阻害方法は、上記一般式（１）で表される化合物またはその固定化物を用いて、１本鎖オリゴヌクレオチド鎖の分子内における塩基の対において、正常な塩基対を形成することができない塩基の対に擬似的に塩基対を形成させる工程を含んでいる、オリゴヌクレオチド鎖の相補鎖を合成する酵素の活性を阻害する方法である。
【００３５】
上記の構成によれば、従来のミスマッチ認識分子を用いている場合よりも、より強力にオリゴヌクレオチド鎖の相補鎖を合成する酵素の活性を阻害することができる。
【００３６】
また、上記酵素活性阻害剤は、上記擬似的に塩基対を形成させる領域が、オリゴヌクレオチド鎖の相補鎖を合成する酵素におけるプライマー領域であることが好ましい。また、上記オリゴヌクレオチド鎖の相補鎖を合成する酵素が、ＤＮＡの合成酵素であることが好ましい。さらに、上記オリゴヌクレオチド鎖の相補鎖を合成する酵素が、テロメラーゼであることが好ましい。
【００３７】
また、上記酵素活性阻害方法は、上記オリゴヌクレオチド鎖の相補鎖を合成する酵素が、ＤＮＡの合成酵素であることが好ましい。さらに、上記オリゴヌクレオチド鎖の相補鎖を合成する酵素が、テロメラーゼであることが好ましい。
【００３８】
また、本発明にかかる医薬組成物は、１本鎖オリゴヌクレオチド鎖の分子内における塩基の対において、正常な塩基対を形成することができない塩基の対に擬似的な塩基対を形成させ得る、上記一般式（１）で表される化合物またはその固定化物を含んでいる医薬組成物である。また、上記オリゴヌクレオチド鎖の相補鎖を合成する酵素の活性化による疾患の治療、処置または予防のためのものであることが好ましい。さらに、上記オリゴヌクレオチド鎖の相補鎖を合成する酵素が、テロメラーゼであることが好ましい。また、上記オリゴヌクレオチド鎖の相補鎖を合成する酵素の活性化による疾患が、ガンであることが好ましい。
【００３９】
上記の構成によれば、従来のミスマッチ認識分子を用いる場合よりも、より強力に疾患を予防、治療、または処置することができる。
【００４０】
さらに、本発明にかかる不対塩基対検出同定方法は、上記一般式（１）で表される化合物またはその固定化物を用いて、オリゴヌクレオチド鎖の塩基の対において、正常な塩基対を形成することができない塩基の対に擬似的に塩基対を形成させ、当該擬似的な塩基対の形成を測定する工程を含んでいる、正常な塩基対を形成することができない塩基の対を検出、同定する方法である。また、本発明にかかる不対塩基対検出同定試薬は、上記一般式（１）で表される化合物またはその固定化物を含んでいる、正常な塩基対を形成することができない塩基の対を検出、同定するための試薬である。
【００４１】
上記の構成によれば、従来のミスマッチ認識分子を用いているものよりも、正常な塩基対を形成することができない塩基の対、特に連続して存在する正常な塩基対を形成することができない塩基の対を、より感度よく検出、同定することができる。
【００４２】
本発明にかかる器具は、上記一般式（１）で表される化合物を固定化させたものである。この固定化された器具を用いることにより、テロメア長の違いを検出することができ、ひいては、ガンの診断に使用することができる。
【００４３】
なお、上記器具としては、例えば、何らかの化学結合によって、上記一般式（１）で表される化合物を基盤（担体）上に固定化したチップ、センサー、キュベット、またはプレート等が挙げられる。そして、何らかの化学結合によって上記一般式（１）で表される化合物を基盤（担体）上に固定化するとき、硫黄を一般式（１）で表される化合物（特にメルカプト基（−ＳＨ）を含む化合物）を用いれば、その固定化が容易となる。
【００４４】
【発明の実施の形態】
本発明は、連続した塩基対のミスマッチを検出、同定し得る化合物、および当該化合物を用いて、ミスマッチの配列を有する１本鎖のＤＮＡやＲＮＡなどの核酸類に安定なヘアピン構造や４本鎖構造等を形成させる方法を提供するものである。また、本発明は、１本鎖のテロメア配列に安定なヘアピン構造や４本鎖構造などを形成させてテロメラーゼ等の酵素活性を阻害する方法、そしてガン細胞の増殖を抑制する方法及びガン増殖抑制剤を提供するものである。さらに、本発明は、正常な塩基対を形成することができない塩基の対を検出、同定するための方法、および当該試薬を提供するものである。
【００４５】
そこで、以下に、まず当該化合物について説明し、その後、その利用方法等について説明することとする。
【００４６】
なお、以下の説明においては、前記した「正常な塩基対を形成することができない塩基の対の片方の塩基と対を形成し得る化学構造部分（一般式（１）におけるＡ、Ｂ、Ｃ、及び／又はＤの部分）」のことを単に「塩基認識部位」ということもある。
【００４７】
（１）本発明にかかる化合物
本発明にかかる化合物は、上記一般式（２）で表される化合物であればよい。なお、式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ３、およびＲ４は、水素原子、炭素数１〜１５のアルキル基であって当該アルキル基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、窒素原子、及び／又は硫黄原子で置換されてもよいアルキル基、炭素数１〜１５のアルコキシル基であって当該アルコキシ基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、窒素原子、及び／又は硫黄原子で置換されてもよいアルコキシル基、又は、炭素数１〜１５のモノ若しくはジアルキルアミノ基であって当該アルキルアミノ基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、窒素原子、及び／又は硫黄原子で置換されてもよいモノ若しくはジアルキルアミノ基を示し、Ｒ２およびＲ５は、炭素数１〜２０のアルキレン基であって当該アルキレン基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、窒素原子又はカルボニル基で置換されてもよいアルキレン基を示す。なかでも、上記構造式（３）で表される化合物であることが好ましい。
【００４８】
上記化合物は、低分子有機化合物であり、通常の有機合成法により適宜製造することができ、特に限定されるものではない。例えば、前記した１，８−ナフチリジン誘導体は、２−アミノ−１，８−ナフチリジン又は２−アミノ−７−メチル−１，８−ナフチリジンをＮ−保護−４−アミノ−酪酸の反応性誘導体、例えば酸塩化物を反応させて、２位のアミノ基をアシル化した後、アミノ基を保護基を脱保護して製造することができる。この際の保護基としては、塩酸塩やアシル基やアルコキシカルボニル基などのペプチド合成において使用されるアミノ保護基を使用することができる。このようにして得られた塩基認識部位を、両末端にカルボキシル基又はその反応性誘導体基を有するリンカー用の化合物と反応させることにより目的のミスマッチ塩基認識分子を得ることができる。この際に、リンカー用化合物の分子中に窒素原子などの反応性の基が存在している場合には、前記した保護基などで適宜保護して使用することができる。なお、上記構造式（３）で表される化合物の詳細な合成方法は、後述の実施例に示す。
【００４９】
上記化合物は、グアニンと水素結合を形成し、かつ周囲の塩基とスタッキング効果により安定化され得る１，８−ナフチリジン誘導体を用いて、これをリンカーにより結合させ、合成された四量体の化合物である。上記化合物は、不対塩基と水素結合をするだけでなく、２本鎖ＤＮＡ中に生成する不対塩基（バルジ塩基）の存在により生じてくる空間に、芳香環とバルジ近傍の塩基とのスタッキング相互作用を利用してインターカーレーションし、安定化される。さらに、バルジ塩基を有するＤＮＡ（バルジＤＮＡ）に特異的に結合し、安定化する分子であるバルジＤＮＡ認識分子でもある。また、塩基対のミスマッチが生じている箇所においても、塩基と対を形成し得る分子種を４個有する化合物がこのようなスタッキング効果により比較的安定に取り込まれ得る。そして、ＤＮＡの２本鎖に取り込まれた上記化合物は、比較的安定な対を形成し、このような対の形成により天然の酵素が認識することができない塩基の配列を新たに形成していると考えられる。
【００５０】
したがって、上記化合物は、Ｇ−Ｇミスマッチ、特に連続して存在するＧ−Ｇミスマッチを感度よく認識することができる。また、上記化合物は、１本鎖のオリゴヌクレオチド鎖において、正常な塩基対を形成することができない塩基の対が存在するために安定なヘアピン構造のような２本鎖構造をとることができない１本鎖のオリゴヌクレオチド鎖の正常な塩基対を形成することができない塩基の対（ミスマッチの塩基対）を安定化させて安定な擬似的な塩基対を形成させる方法、１本鎖のオリゴヌクレオチド鎖の正常な塩基対を形成することができない塩基の対（ミスマッチの塩基対）を安定化させる方法に利用可能である。また、上記化合物は、このような擬似的な塩基対を形成させて比較的安定なヘアピン構造のような２本鎖構造を形成させることにより、当該１本鎖のオリゴヌクレオチド鎖の相補的なオリゴヌクレオチド鎖を合成する酵素の活性を阻害する方法にも利用可能である。さらに、当該相補的なオリゴヌクレオチド鎖を合成する酵素の活性を阻害することにより、それに関連する各種の疾患（例えば、ガン等）を治療、予防、処置するための医薬組成物への応用が可能である。
【００５１】
以下に、上記化合物をはじめとした、オリゴヌクレオチドに結合し得る分子を用いた応用方法を順に説明する。
【００５２】
（２）オリゴヌクレオチドに結合し得る分子の利用方法
まず、本発明にかかる各種方法に用いられる、オリゴヌクレオチドに結合し得る分子について説明する。
【００５３】
上記オリゴヌクレオチドに結合し得る分子は、上記一般式（１）で表される化合物であればよい。上記一般式（１）で表される化合物は、４個の塩基認識部位（式中のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）を適当な長さで、かつ適当な自由度を有するリンカー（式中のＬ１、Ｌ２）で結合させた化合物であればよく、当該塩基認識部位Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤは、グアニンを認識するものに限定されるものではない。すなわち、上記の例では、グアニン（Ｇ）−グアニン（Ｇ）のミスマッチを例に取り、グアニン塩基と安定な水素結合を形成する１，８−ナフチリジン誘導体を塩基認識部位に用いた化合物を示したが、ミスマッチの認識、または擬似塩基対を形成できる箇所は、Ｇ−Ｇミスマッチの箇所に限定されるものではない。つまり、上記塩基認識部位は、ミスマッチの塩基の片方を認識し当該塩基とワトソン−クリック（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）型の塩基対を形成することができ、周囲の塩基によるスタッキング効果を得られる分子種を選択することにより、例示したグアニンに限らず、各種の塩基と塩基対を形成し得るものであればよい。例えば、ミスマッチの塩基がシトシンの場合には、塩基認識部位として２−アミノナフチリジン−４−オン又はその誘導体等が、ミスマッチの塩基がアデニンの場合には、２−キノロン誘導体、例えば３−（２−アミノエチル）−２−キノロン又はその誘導体等が、また、ミスマッチの塩基がチミンの場合には、２−アミノナフチリジン−７−オン又はその誘導体等が用いられるが、特に限定されるものではない。したがって、上記塩基認識部位（一般式（１）におけるＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤの化学構造部分）は、単に目的の塩基と水素結合ができるということのみではなく、前後又は周囲の塩基によるスタッキング効果が得られる化学構造であることが好ましい。
【００５４】
特定のミスマッチの塩基を特異的に認識等できる、上記オリゴヌクレオチドに結合し得る分子における塩基認識部位は、水素結合を形成するための水素結合部位と、近傍の塩基にスタッキングされるための平面構造を有している複素環式芳香族基を有するものが好ましいが、さらに、塩基に対する選択性を増強するためにある程度の立体障害を有する置換基を有する複素環式芳香族基が好ましい。このような置換基としては、例えば、炭素数１〜１５、好ましくは１〜１０より好ましくは１〜７の直鎖状又は分枝状のアルキル基、炭素数１〜１５、好ましくは１〜１０より好ましくは１〜７の直鎖状又は分枝状のアルキル基からなるアルコキシル基、炭素数１〜１５、好ましくは１〜１０より好ましくは１〜７の直鎖状又は分枝状のアルキル基でモノ又はジ置換されているモノ若しくはジアルキルアミノ基などが挙げられる。これらのアルキル基、アルコキシル基又はモノ若しくはジアルキルアミノ基における１個又はそれ以上の炭素原子は、酸素原子、窒素原子、及び／又は硫黄原子で置換されていてもよい。
【００５５】
また、上記一般式（１）で表される化合物におけるリンカー部Ｌ１、Ｌ２としては、２個の塩基認識部位（例えば、ＡとＢ、またはＣとＤ）を適当な長さ、かつ適当な自由度を与えて結合させるとともに、Ｌ１とＬ２とが適当な長さかつ適当な自由度で結合するものであれば特に制限されるものではない。例えば、炭素数１〜２０、好ましくは１〜１５、より好ましくは１〜１２の直鎖状又は分枝状の飽和又は不飽和のアルキレン基であって、当該アルキレン基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、窒素原子又はカルボニル基で置換されてもよいアルキレン基が挙げられる。好ましいリンカーとしては、前記した式（３）の化合物のように、両端がアミド結合の部分を有し、中央部に窒素原子を有し、この窒素原子同士によって、Ｌ１とＬ２とが結合しているものが挙げられる。なお、このリンカー部Ｌ１、Ｌ２は、２個の塩基認識部位を結合させるだけでなく、このリンカー部分から担体に固定化するための枝を結合させることもできる。
【００５６】
また、上記一般式（１）における塩基認識部位ＡまたはＢとリンカー部Ｌ１との結合、ＣまたはＤとリンカー部Ｌ２との結合は、炭素−炭素結合であってもよいが、合成の簡便さから官能基による結合が好ましい。官能基による結合としては、エーテル結合、エステル結合、アミド結合、リン酸による結合など種々のタイプのものを選択することができるが、アミド結合が好ましい。
【００５７】
また、Ｇ−Ｇミスマッチに対する好ましい一般式（１）の化合物として、上記一般式（２）で表される化合物を挙げることができる。なお、式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ３、およびＲ４は、水素原子、炭素数１〜１５のアルキル基であって当該アルキル基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、窒素原子、及び／又は硫黄原子で置換されてもよいアルキル基、炭素数１〜１５のアルコキシル基であって当該アルコキシル基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、窒素原子、及び／又は硫黄原子で置換されてもよいアルコキシル基、又は、炭素数１〜１５のモノ若しくはジアルキルアミノ基であって当該アルキルアミノ基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、窒素原子、及び／又は硫黄原子で置換されてもよいモノ若しくはジアルキルアミノ基を示し、Ｒ２、Ｒ５は、炭素数１〜２０のアルキレン基であって当該アルキレン基中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、窒素原子又はカルボニル基で置換されてもよいアルキレン基を示す。）で表される化合物又はその固定化物が挙げられる。ここにおける「固定化物」とは、前記した化合物が担体に固定化されている状態のもの又は固定化され得るように前記した「枝」をのばした状態の化合物をいう。なお、Ｒ２、Ｒ５におけるアルキレン基は、一般式（２）に示されているように２価のアルキレン基である。
【００５８】
また、上記オリゴヌクレオチドに結合し得る分子は、これを単独で使用することもできるが、分子中の適当な位置に、例えばリンカー部分やリンカーから固定化のためなどのための延ばされた枝などに、放射性元素を導入したり、化学発光又は蛍光を発する分子種を導入したりするなどして、標識化して使用することもできる。なお、測定手段としての標識化は、検出対象のＤＮＡやＲＮＡなどの核酸部分の標識化によることもできる。さらに、本発明のミスマッチ塩基認識分子の適当な位置においてポリスチレンなどの高分子材料と直接又はアルキレン基などを用いて結合させて、これを固定化して使用することもできる。
【００５９】
また、上記オリゴヌクレオチドに結合し得る分子は、低分子有機化合物であるため、上記（１）で述べた通常の有機合成法により適宜製造することができる。
【００６０】
（２−１）本発明にかかる擬似的塩基対形成方法、安定化方法、安定化剤
本発明にかかる擬似的塩基対形成方法は、上記オリゴヌクレオチドに結合し得る分子を用いて、１本鎖オリゴヌクレオチド鎖において、正常な塩基対を形成することができない塩基の対が存在するために安定なヘアピン構造のような２本鎖構造をとることができない１本鎖オリゴヌクレオチド鎖の正常な塩基対を形成することができない塩基の対（ミスマッチの塩基対）を安定化させて、安定な擬似的な塩基対を形成させる方法である。
【００６１】
また、本発明にかかる安定化方法は、上記オリゴヌクレオチドに結合し得る分子を用いて、１本鎖オリゴヌクレオチド鎖において、正常な塩基対を形成することができない塩基の対が存在するために安定なヘアピン構造のような２本鎖構造をとることができない１本鎖オリゴヌクレオチド鎖の正常な塩基対を形成することができない塩基の対（ミスマッチの塩基対）を安定化させる方法であり、本発明にかかる安定化剤は、上記オリゴヌクレオチドに結合し得る分子を用いて、１本鎖オリゴヌクレオチド鎖において、正常な塩基対を形成することができない塩基の対が存在するために安定なヘアピン構造のような２本鎖構造をとることができない１本鎖オリゴヌクレオチド鎖の正常な塩基対を形成することができない塩基の対（ミスマッチの塩基対）を安定化させるものである。
【００６２】
本発明にかかる擬似的塩基対形成方法、安定化方法、および安定化剤には、上記した一般式（１）で表される化合物の１種又は２種以上をそのまま使用してもよいし、適当な担体と共に使用することもできる。また、標的細胞に特異的に作用するように、標的細胞に親和性を有する物質で修飾して使用することもできる。さらに、使用状況を計測するために適当なマーカーで修飾して使用することもできる。
【００６３】
上記１本鎖のオリゴヌクレオチド鎖としては、ｍＲＮＡやｒＲＮＡなどの全体が１本鎖のものであってもよいし、その一部においてヘアピン構造のような２本鎖部分を有するものであってもよいし、末端が平滑端でない２本鎖ＤＮＡの末端部分の１本鎖のオリゴヌクレオチド鎖であってもよい。
【００６４】
例えば、真核細胞における染色体の末端部分であるテロメア領域においては、その末端の数十塩基が１本鎖の状態にあり、この部分を本発明における１本鎖のオリゴヌクレオチド鎖として使用することができる。例えば、ヒトのテロメア配列における１本鎖部分において、ヘアピン構造を形成するのに必要な相補的な配列はＴＡの部分しかなく、図１に示すように、この「ＴＡ」の部分において相補鎖を形成してもその前後において、Ｇ−Ｇミスマッチなどの塩基のミスマッチが連続して生じることになる。
【００６５】
ここで、本発明にかかる擬似的塩基対形成方法を用いることによって、このテロメア配列の１本鎖部分における、ミスマッチとなっているＧ−Ｇミスマッチ、及び／又はＧ−Ｔミスマッチに、擬似的な塩基対を形成させることができる。これによって、このテロメア配列の１本鎖部分において安定なヘアピン構造を形成させることが可能となる。
【００６６】
（２−２）本発明にかかる酵素活性阻害方法、酵素活性阻害剤
本発明にかかる酵素活性阻害方法、および酵素活性阻害剤は、テロメアの末端のように、１本鎖の状態のオリゴヌクレオチド鎖において、通常の状態では生起しない擬似的な塩基対を形成させることにより、１本鎖のオリゴヌクレオチド鎖の相補鎖を合成する酵素の活性を阻害するものである。
【００６７】
相補鎖を合成する酵素の活性を阻害できるのであれば、１本鎖のオリゴヌクレオチド鎖のどの部分に擬似的な塩基対を形成させてもよい。例えば、プライマー領域や伸長反応が進行する領域であってもよい。また、相補鎖を合成する酵素としてはＤＮＡポリメラーゼのようなＤＮＡ合成酵素であってもよいし、ＲＮＡポリメラーゼのようなＲＮＡ合成酵素であってもよいし、さらに逆転写酵素であってもよい。
【００６８】
また、本発明にかかる酵素活性阻害方法、酵素活性阻害剤には、上記した一般式（１）で表される化合物の１種又は２種以上をそのまま使用してもよいし、適当な担体と共に使用することもできる。また、標的細胞に特異的に作用するように、標的細胞に親和性を有する物質で修飾して使用することもできる。さらに、使用状況を計測するために適当なマーカーで修飾して使用することもできる。
【００６９】
また、上記「１本鎖のオリゴヌクレオチド鎖」としては、上記（２−１）に記載のものを用いることができる。ここで、ヒトテロメアの構造、特に１本鎖の部分が通常はどのような構造となっているのかということは充分には解析されてきていないが、ヘアピン構造のような形態や四重鎖構造（クアドプレックス）のような形態をしていると考えられている。しかし、上記構造においても、このような構造を安定に保つために必要な充分な塩基対を形成することはできず、テロメラーゼなどの作用により簡単に１本鎖構造に戻ることができ、テロメラーゼにより末端のテロメアの伸長反応が進行することになる。
【００７０】
しかし、本発明にかかる酵素活性阻害方法、酵素活性阻害剤により、テロメアの末端部分に、本発明のオリゴヌクレオチドに結合し得る分子を添加することによって、通常はミスマッチである塩基対においても（例えば、Ｇ−Ｇミスマッチ）、擬似的に塩基対を形成させることができ、一部の塩基対により形成されているヘアピン構造や四重鎖構造（クアドプレックス）を当該擬似的な塩基対の形成により酵素が作用できない程度に安定な構造にすることができる。
【００７１】
したがって、オリゴヌクレオチド鎖の相補鎖を合成する酵素の活性を阻害することができる。
【００７２】
（２−３）本発明にかかる医薬組成物
本発明にかかる医薬組成物は、塩基対のミスマッチにより安定な２本鎖又は４重鎖の構造をとることができない１本鎖のオリゴヌクレオチド鎖において、当該ミスマッチ部分に一般式（１）で表される分子を用いて「擬似的な塩基対」を形成させて、安定な２本鎖又は４重鎖の構造を形成させて、１本鎖のオリゴヌクレオチド鎖が有する機能、例えばその相補鎖を合成する酵素による相補鎖の合成などを阻害することにより、当該１本鎖のオリゴヌクレオチド鎖の機能に起因する各種の疾患を治療、予防及び／又は処置することができるものである。
【００７３】
また、本発明の医薬組成物としては、前記した一般式（１）で表される化合物の１種又は２種以上をそのまま使用してもよいし、適当な担体と共に使用することもできる。担体としては薬学的に許容される担体であればよい。本発明の医薬組成物は、経口又は非経口投与することができる。
【００７４】
また、上記「１本鎖のオリゴヌクレオチド鎖」としては、上記（２−１）に記載のものを用いることができる。例えば、ヒトテロメアの場合、本発明の医薬組成物を用いることによって、テロメアの末端部分における、通常はミスマッチである塩基対においても（例えば、Ｇ−Ｇミスマッチ）、擬似的に塩基対を形成させることができ、一部の塩基対により形成されているヘアピン構造や四重鎖構造（クアドプレックス）を当該擬似的な塩基対の形成により酵素が作用できない程度に安定な構造にすることができる。そして、その結果としてテロメラーゼによるテロメア末端の伸長反応を阻害することができ、テロメアの伸長が行われない細胞はやがて増殖の寿命が尽きることになる。その結果、ガン細胞も通常細胞と同様に増殖が停止して死滅することになる。
【００７５】
（２−４）本発明にかかる不対塩基対検出同定方法、不対塩基対検出同定試薬本発明にかかる不対塩基対検出同定方法、不対塩基対検出同定試薬は、塩基対のミスマッチ部分においてバルジ塩基と同様な塩基対を形成し、しかもこれらのバルジ認識分子が２本鎖を形成しているＤＮＡやＲＮＡの鎖の中に比較的安定に取り込まれることにより、ハイブリダイズしている核酸の中で塩基対がミスマッチを生じている箇所を簡便に特定し得るものである。
【００７６】
本発明の不対塩基対検出同定方法、不対塩基対検出同定試薬に用いる、化合物としては、不対塩基対の位置や量を特定するために、上記した一般式（１）で表される化合物の１種又は２種以上を、検出または計測するために適当なマーカーで修飾して使用することが好ましい。具体的には、上記化合物分子中の適当な位置に、例えばリンカー部分やリンカーから固定化のためなどのための延ばされた枝などに、放射性元素を導入したり、化学発光又は蛍光を発する分子種を導入したりするなどして、標識化して使用することもできる。なお、測定手段としての標識化は、検出対象のＤＮＡやＲＮＡなどの核酸部分の標識化によることもできる。さらに、本発明のミスマッチ塩基認識分子の適当な位置においてポリスチレンなどの高分子材料と直接又はアルキレン基などを用いて結合させて、これを固定化して使用することもできる。さらに、標的細胞に特異的に作用するように、標的細胞に親和性を有する物質で修飾して使用することもできる。
【００７７】
以上の説明では、主にＧ−Ｇミスマッチの場合を具体的に説明してきたが、一般式（１）で表される化合物の塩基認識部位Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤの部分を他の塩基と対を形成できるものに代えることにより、Ｔ（チミン）−Ｇ（グアニン）ミスマッチ、Ｔ（チミン）−Ｔ（チミン）ミスマッチ、Ｔ（チミン）−Ｃ（シトシン）ミスマッチ、Ａ（アデニン）−Ｇ（グアニン）ミスマッチ、Ｃ（シトシン）−Ｃ（シトシン）ミスマッチ、Ａ（アデニン）−Ａ（アデニン）ミスマッチ、またはＡ（アデニン）−Ｃ（シトシン）ミスマッチ等についても同様な手法により行うことができる。さらに、Ｕ（ウラシル）−Ｔ（チミン）ミスマッチ、Ｕ（ウラシル）−Ｃ（シトシン）ミスマッチ、Ｕ（ウラシル）−Ｇ（グアニン）ミスマッチについても、同様な手法により行うことができる。
【００７８】
なお、本明細書において使用している「擬似的な塩基対」というのは、天然に存在する塩基の対とは異なる塩基の対であるという意味であり、塩基対の強度を意味するものではない。また、本明細書において使用される「正常な塩基対」とは天然に存在する塩基の対であって、Ｇ（グアニン）−Ｃ（シトシン）、Ａ（アデニン）−Ｔ（チミン）、またはＡ（アデニン）−Ｕ（ウラシル）の塩基対をいう。
【００７９】
以下添付した図面に沿って実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【００８０】
【実施例】
〔１〕ヒトのテロメア配列に結合し得る化合物の合成
まず、ヒトのテロメア配列中の１本鎖ＤＮＡ部分における、不対塩基対部分に特異的に結合し得る化合物、すなわち、上記構造式（３）で表される化合物を合成した。
【００８１】
具体的な合成スキームを図３に示す。具体的な方法は、以下のように行った。まず、２５％ のグルタルアルデヒド水溶液に食塩を加え、クロロホルムで抽出、乾燥後濃縮することによりグルタルアルデヒドを調製した。ナフチリジンダイマー（化合物１）（１１０ ｍｇ）のメタノール溶液に酢酸数滴を加えｐＨ ５とした。この溶液にグルタルアルデヒド（１２ ｍｇ）を加え、続いて水素化シアノホウ素ナトリウム（１８．７ ｍｇ）を加え室温で１０分反応させた。反応混合物を水−クロロホルムで分配し、有機層を乾燥後濃縮した。粗生成物を、分取ＴＬＣを使って精製し、ビスナフチリジンダイマー（化合物２、構造式（３））を白色固体として得た（３４．５ ｍｇ）。
【００８２】
１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤ３ＯＤ， ４００ ＭＨｚ） ｄ ＝ ８．１０ （ｄ， ４Ｈ， Ｊ ＝ ８．８ Ｈｚ）， ７．８３ （ｄ， ４Ｈ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ）， ７．８３ （ｄ， ４Ｈ， Ｊ ＝ ８．８ Ｈｚ）， ７．１３ （ｄ， ４Ｈ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ）， ２．７９ （ｔ， ８Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）， ２．５９ （ｓ， １２Ｈ）， ２．５８ （８Ｈ）， ２．５３ （ｔ， ４Ｈ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ）， １．６７ （ｍ， ４Ｈ）， １．４４ （ｍ， ２Ｈ）； １３Ｃ ＮＭＲ （ＣＤ３ＯＤ， １００ ＭＨｚ） ｄ ＝ １７４．１， １６３．７， １５５．０， １５４．９， １３９．６， １３８．２， １２２．４， １１９．４， １１５．５， ５５．２， ５０．４， ３５．５， ２７．４， ２６．５， ２５．０．
〔２〕構造式（３）で示される化合物の解析
次に、上記〔１〕で合成し精製して得た構造式（３）で示される化合物の解析を行った。具体的には、ヒトテロメア配列ＴＴＡＧＧＧの繰り返し配列を持つ一本鎖ＤＮＡ ｄ（ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡ）の融解温度（Ｔｍ）を、ナフチリジンダイマー（１）とビスナフチリジンダイマー（２）とで比較した。
【００８３】
具体的な実験条件は、 ｄ（ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡ）（５ ｍＭ， ｓｔｒａｎｄ 濃度）の食塩（１００ ｍＭ）を含むカコジル酸バッファー（ｐＨ ７．０）溶液に、ナフチリジンダイマー（化合物１）を３０ ｍＭ、もしくはビスナフチリジンダイマー（化合物２）を１５ ｍＭ加え、温度変化に対する２６０ｎｍの吸収変化を測定し、変曲点から融解温度（Ｔｍ）を算出した。
【００８４】
既にテロメラーゼによる伸張阻害が確認されているナフチリジンダイマー（化合物１）を加えた場合の融解温度は６３．６℃であったが、ビスナフチリジンダイマー（化合物２）ではさらに融解温度が上昇し、７２．１℃であった。また、化合物１，２を加えない場合、融解温度は測定限界（４℃）以下であった。このことは、ビスナフチリジンダイマー（化合物２）が、ナフチリジンダイマー（化合物１）に比べ強くヒトテロメア配列に結合していることを示すものであり、その結果として、テロメラーゼに対するより強い伸張阻害が期待される。
【００８５】
【発明の効果】
以上のように、一般式（２）で表される化合物は、不対塩基対、特に連続して存在するＧ−Ｇミスマッチに特異的、かつ強力に結合することができるという効果を奏する。この性質により、種々の応用が可能である。すなわち、本発明にかかる方法により、一般式（１）で表される化合物を用いて、１本鎖のオリゴヌクレオチド鎖に擬似的な塩基対を形成させることにより、当該１本鎖のオリゴヌクレオチド鎖中に比較的安定な２本鎖又は４本鎖の構造を簡便に形成させることができるという効果を奏する。１本鎖のオリゴヌクレオチド鎖中にこのような比較的安定な構造を形成させることにより、当該１本鎖のオリゴヌクレオチド鎖が有する機能を阻害することができ、例えば、染色体の末端におけるテロメア領域の伸長反応を阻害することができ、当該１本鎖のオリゴヌクレオチド鎖が有する機能に起因する各種の疾患、例えばガンなどの治療、予防、処置に有用となるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【図１】１本鎖のテロメア配列におけるヘアピン構造の形成、およびその際の相補的な配列関係を模式的に示した図である。
【図２】上記構造式（３）で表されるビスナフチリジンダイマーの合成スキームを示す図である。
【図３】ヒトテロメア配列ＴＴＡＧＧＧの繰り返し配列の融解温度（Ｔｍ）に対する、ナフチリジンダイマー（化合物１）およびビスナフチリジンダイマー（化合物２）の影響を調べた結果を示す図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a molecule capable of binding to a single-stranded oligonucleotide such as a telomere, and a method of using the same.
[0002]
[Prior art]
A telomere is a DNA sequence present at the end of a chromosome. In the case of a human chromosome, a TTAGGG sequence continues repeatedly. In an initial state, the telomere is a DNA sequence having a length of about 10 kb. Various binding proteins are bound to the telomere to prevent the ends of the DNA from binding to each other to form a circular DNA, and to function such as binding to the nuclear membrane. Most of these are double-stranded, but the most terminal tens of bases are single-stranded and protrude at the 3′-terminal side. DNA is replicated at the time of cell division, and it is known that the telomere sequence of about 50 to 150 bases is shortened at each replication in this replication mechanism. Then, when the length of the telomere portion becomes about 5 kb, the cell reaches the divisional life (M1 phase) and stops dividing the cell.
[0003]
In normal cells, TRF1 which is a kind of telomere binding protein binds to the double-stranded portion of telomere to suppress telomere elongation. Eventually, chromosome stability cannot be maintained and spontaneous death (apoptosis) (M2 phase).
[0004]
On the other hand, in cancer cells, the enzyme "telomerase" that extends the telomere sequence is activated, and the telomere sequence shortened by cell division is lengthened. This telomerase is a reverse transcriptase that extends the single-stranded portion of the telomere DNA. The telomerase internally contains a template RNA of a complementary strand corresponding to 1.5 times of TTAGGG, and performs an extension reaction using this as a primer. For this reason, it is said that telomere shortening is suppressed in cancer cells, and cell proliferation can be repeated indefinitely. This is thought to be the reason that cancer cells, unlike normal cells, can abnormally repeat proliferation without entering the M1 or M2 phase.
[0005]
For this reason, compounds that inhibit telomere sequence elongation by telomerase specific to cancer cells have attracted attention as next-generation anticancer agents. In particular, it is known that the telomere sequence is composed of four DNAs gathered in vitro to form a quadruplex (quadraplex) structure, particularly a guanine quadruplex structure. Therefore, many telomere elongation inhibitors that bind to the guanine quadruplex structure of telomere DNA have been designed based on the idea that if the guanine quadruplex structure can be stabilized, telomerase sequence elongation can be inhibited. However, there is no evidence that telomere DNA forms a quadraplex structure (particularly a guanine quadruplex structure) in the cell nucleus, and the molecular target of a conventional telomere elongation inhibitor was not clear.
[0006]
Therefore, the present inventors have previously simulated a base pair that cannot form a normal base pair (mismatched base pair) in a mutual base pair in a single-stranded portion of telomeric DNA. A method has been developed which can inhibit the action of telomerase by forming and stabilizing a double-stranded structure such as a hairpin structure (see Patent Document 1).
[0007]
The above method will be briefly described. First, the base sequence of the DNA shown in FIG. 1 schematically shows the case where the single-stranded portion at the 3 ′ end of the telomere forms a hairpin structure, and the right side of the figure shows the loop of the hairpin structure. The part is entirely single-stranded. The 5 'side of the single-stranded telomere end is a double-stranded DNA, and the 3' side is the telomere end, that is, the end of the chromosome. The vertical line in the figure indicates a complementary sequence, while the others indicate mismatched sequences. That is, since the single-stranded telomere sequence is a repeat sequence of TTAAGGG as described above, the complementary sequence generated when the single-stranded telomere sequence forms a hairpin structure has only a “TA” portion. For example, as shown in FIG. 1, even if a complementary strand is formed in this "TA" portion, a base mismatch such as a GG mismatch (guanine-guanine mismatch) occurs before and after that. As described above, it is usually difficult to form a stable hairpin structure in the single-stranded portion of the telomere. In cancer cells, telomerase acts on the single-stranded portion of the telomere to cause a telomere elongation reaction. Will do.
[0008]
However, if a base mismatch such as a GG mismatch in the single-stranded portion of the telomere can be eliminated, a stable hairpin structure can be formed in the single-stranded portion of the telomere, thereby inhibiting the action of telomerase. Can be. Thus, the present inventors have proposed the use of a DNA recognition molecule, which is a molecule that specifically binds to and stabilizes a GG mismatch generated in double-stranded DNA in a telomere hairpin structure, etc. A method was developed in which single-stranded DNA could form a stable hairpin structure, quadruple-stranded structure, and the like. As described above, telomerase acts on and extends the single-stranded portion of telomere DNA, and thus can inhibit the activity of telomerase by using the above-described methods and the like, and thus can inhibit cancer cells. Proliferation can be suppressed.
[0009]
[Patent Document 1]
Japanese Patent Application Laid-Open Publication No. 2002-30094 (Published January 29, 2002)
[0010]
[Problems to be solved by the invention]
The method and the like in which a single-stranded DNA of the conventional telomeric DNA as described above can form a stable hairpin structure, a four-stranded structure, and the like are represented by the general formula (I), ALB (I) (where A Is a chemical structural part capable of forming a pair with one base of a base pair that cannot form a normal base pair, and B is paired with another base of a base pair that cannot form a normal base pair. And L represents a linker structure connecting the chemical structural parts A and B.), and a chemical structural part A and a chemical structural part B capable of forming a pair with each base thereof. Further, a compound having a linker portion L connecting the chemical structural portions A and B is used.
[0011]
However, in a hairpin loop structure formed by a single-stranded telomeric DNA comprising a repetitive sequence of TTAGGG, a large number of GG mismatches are continuously present, so that the above compound cannot sufficiently stabilize the hairpin loop structure. There is a problem.
[0012]
Therefore, compounds, methods, drugs, and the like for stabilizing a hairpin loop structure formed by single-stranded telomeric DNA having a large number of GG mismatches in succession have been strongly desired.
[0013]
The present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to provide an oligonucleotide (for example, a single-stranded telomere DNA) having a large number of unpaired bases, particularly GG mismatches in a row. An object of the present invention is to provide a compound that specifically binds and stabilizes a hairpin loop structure or the like formed by the oligonucleotide, and a method of using the same.
[0014]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have proposed a base mismatch (especially G GG) when a repetitive sequence of TTAGGG, which is a sequence characteristic of a single-stranded portion of human telomeric DNA, forms a double-stranded or quadruple-stranded structure due to a hairpin structure or the like. −G mismatch), a bisnaphthyridine dimer, a compound capable of specifically binding to the mismatched portion of these consecutive bases and forming a pseudo base pair, was prepared. When this compound is mixed with a single-stranded human telomere DNA, the compound specifically binds to the base mismatching region more strongly than the conventional GG mismatch recognition (binding) molecule, As a result, they have found that the formation of a hairpin structure or the like in the single-stranded portion of telomeric DNA is further stabilized. That is, by using the above compound, the action of telomerase can be more strongly inhibited.
[0015]
That is, the compound according to the present invention or an immobilized product thereof has the following general formula (2):
[0016]
Embedded image
(Wherein, R, R1, R3, and R4 are a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 15 carbon atoms, and one or more carbon atoms in the alkyl group are an oxygen atom, a nitrogen atom, and / or Or an alkyl group which may be substituted with a sulfur atom, an alkoxyl group having 1 to 15 carbon atoms, wherein one or more carbon atoms in the alkoxy group are substituted with an oxygen atom, a nitrogen atom, and / or a sulfur atom An alkoxyl group or a mono- or di-alkylamino group having 1 to 15 carbon atoms, wherein one or more carbon atoms in the alkylamino group are an oxygen atom, a nitrogen atom, and / or a sulfur atom. R2 and R5 each represent an alkylene group having 1 to 20 carbon atoms, wherein one or more carbon atoms in the alkylene group are oxygen; Child, is replaced with a nitrogen atom or a carbonyl group indicates also alkylene group.) Is a compound or a fixed product represented by.
[0018]
The above-mentioned compound or its immobilized substance can strongly bind to a GG mismatch, particularly a continuously existing GG mismatch. As a result, for example, a GG mismatch, particularly a GG mismatch existing continuously, can be detected and identified with high sensitivity. Furthermore, it is possible to further stabilize the formation of a hairpin structure or the like in the single-stranded portion of telomere DNA in which GG mismatches are continuously present. Therefore, the action of telomerase can be more strongly inhibited.
[0019]
In the present invention, the term "immobilized substance" refers to a substance in which a compound is immobilized on a carrier (one that does not inhibit the function of the compound) such as a chip, a sensor, or a plate, or a "branch" that can be immobilized. It refers to a compound in a stale state. For the immobilization of the compound on the carrier, a conventionally known chemical or physical method, such as bonding a branch for immobilizing the compound to the carrier from the linker portion, can be used, and it is particularly limited. is not. Further, as described above, a compound containing sulfur (particularly, a compound containing a mercapto group) can be easily immobilized when the molecule is immobilized (for example, immobilized on a chip or the like).
[0020]
Further, in the compound according to the present invention, the compound represented by the general formula (2) or an immobilized product thereof is represented by the following structural formula (3):
[0021]
Embedded image
It is preferable that
[0023]
Further, the method of forming a pseudo base pair according to the present invention comprises the following general formula (1):
[0024]
Embedded image
(Where A and C are chemical structural parts capable of forming a pair with one base of a base pair that cannot form a normal base pair, and B and D are bases that cannot form a normal base pair. L1 represents a linker structure that binds the chemical structure portions A and B, L2 represents a linker structure that binds the chemical structure portions C and D, and L1 represents a linker structure that binds the chemical structure portions A and B. And L2 are bonded to each other) or a fixed immobilized product thereof, in a base pair in a molecule of a single-stranded oligonucleotide chain, of a base that cannot form a normal base pair. This is a method of forming a base pair in a pseudo manner.
[0026]
According to the above method, as compared to the case where a conventional mismatch recognition molecule is used, in the base pairs in the molecule of the single-stranded oligonucleotide chain, bases that cannot form continuous normal base pairs exist. Can more strongly form pseudo base pairs.
[0027]
In addition, the chemical structural parts A, B, C, and D of the compound represented by the general formula (1) or the immobilized product thereof form hydrogen bonds with bases that form a pseudo-base pair, and The compound is preferably a compound that forms a pair with a base by being stabilized by a stacking effect with the base. Furthermore, the compound represented by the above general formula (1) or the chemical structure portion A, B, C, and D of the immobilized product is a compound containing two or more chemical structure portions capable of hydrogen bonding with a base. It is preferable that the compound has a cyclic aromatic group.
[0028]
In addition, it is preferable that at least one of the chemical structural parts A, B, C, and D of the compound represented by the general formula (1) or the immobilized product thereof is naphthyridine or a derivative thereof. Further, the bond between the chemical structure portions A and B and the linker portion L1 and / or the bond between the chemical structure portions C and D and the linker portion L2 of the compound represented by the general formula (1) or the immobilized product thereof are: It is preferably a carboxylic acid amide bond.
[0029]
Further, it is preferable that the compound represented by the general formula (1) or the immobilized product thereof is a compound represented by the general formula (2). Further, R2 and R5 in the compound represented by the general formula (2) or the immobilized product thereof each have a nitrogen atom, and the nitrogen atoms may be bonded by a carbon-carbon bond. preferable.
[0030]
Further, it is preferable that the oligonucleotide chain is a DNA chain. Further, it is preferable that the above-mentioned DNA chain is a DNA chain of a telomere region. Further, it is preferable that the DNA chain of the telomere region is a TTAGGG repeating sequence.
[0031]
In addition, it is preferable that a pair of bases in the molecule of the single-stranded oligonucleotide chain (mutual) that cannot form a normal base pair is a GG mismatch. Further, the structure in which the pseudo base pairs are formed is preferably a hairpin structure.
[0032]
Further, the stabilization method according to the present invention, that is, a method for stabilizing a base pair that is a (mutual) base pair in a molecule of a single-stranded oligonucleotide chain and cannot form a normal base pair. Is determined by using the compound represented by the above general formula (1) or an immobilized product thereof to form a base pair that cannot form a normal base pair in a single-stranded oligonucleotide chain molecule. A method of stabilizing a base pair in a single-stranded oligonucleotide chain that cannot form a normal base pair, the method including a step of forming a pseudo base pair. is there. Further, the stabilizer according to the present invention contains the compound represented by the above general formula (1) or an immobilized product thereof, and a normal base pair in the base pair in the molecule of the single-stranded oligonucleotide chain. Is a stabilizer for the formation of a pair of bases in a single-stranded oligonucleotide chain for stabilizing the base pair by forming a pseudo-base pair in a base pair that cannot form a base. .
[0033]
According to the above-described method and the like, a normal base pair cannot be formed as a base pair in a molecule (mutual) of a single-stranded oligonucleotide chain as compared with the case where a conventional mismatch recognition molecule is used. Base pairs can be more strongly stabilized.
[0034]
In addition, the enzyme activity inhibitor according to the present invention can form a pseudo base pair with a base pair that cannot form a normal base pair in a base pair in a molecule of a single-stranded oligonucleotide chain. An activity inhibitor of an enzyme for synthesizing a complementary strand of an oligonucleotide chain, comprising the compound represented by the general formula (1) or an immobilized product thereof. In addition, the enzyme activity inhibiting method according to the present invention uses a compound represented by the above general formula (1) or an immobilized product thereof to form a normal base pair in a single-stranded oligonucleotide chain molecule. A method for inhibiting the activity of an enzyme that synthesizes a complementary strand of an oligonucleotide chain, comprising a step of causing a base pair that cannot form a base to form a pseudo base pair.
[0035]
According to the above configuration, the activity of the enzyme that synthesizes the complementary strand of the oligonucleotide chain can be more strongly inhibited than in the case where a conventional mismatch recognition molecule is used.
[0036]
Further, in the enzyme activity inhibitor, it is preferable that the pseudo base pair-forming region is a primer region in an enzyme that synthesizes a complementary strand of an oligonucleotide chain. It is preferable that the enzyme that synthesizes the complementary strand of the oligonucleotide chain is a DNA synthase. Furthermore, it is preferable that the enzyme that synthesizes the complementary strand of the oligonucleotide chain is telomerase.
[0037]
In the enzyme activity inhibiting method, the enzyme that synthesizes the complementary strand of the oligonucleotide chain is preferably a DNA synthase. Furthermore, it is preferable that the enzyme that synthesizes the complementary strand of the oligonucleotide chain is telomerase.
[0038]
In addition, the pharmaceutical composition according to the present invention can form a pseudo base pair with a base pair that cannot form a normal base pair in a base pair in a molecule of a single-stranded oligonucleotide chain. A pharmaceutical composition containing the compound represented by the general formula (1) or an immobilized product thereof. Further, it is preferably for treating, treating or preventing a disease by activating an enzyme for synthesizing a complementary strand of the oligonucleotide chain. Furthermore, it is preferable that the enzyme that synthesizes the complementary strand of the oligonucleotide chain is telomerase. In addition, it is preferable that the disease caused by the activation of the enzyme that synthesizes the complementary strand of the oligonucleotide chain is cancer.
[0039]
According to the above configuration, it is possible to prevent, treat, or treat a disease more strongly than when a conventional mismatch recognition molecule is used.
[0040]
Furthermore, the method for detecting and identifying an unpaired base pair according to the present invention forms a normal base pair in the base pair of the oligonucleotide chain using the compound represented by the general formula (1) or the immobilized product thereof. Detecting and identifying base pairs that cannot form normal base pairs, including the step of causing the base pairs that cannot form base pairs to form pseudo base pairs and measuring the formation of the pseudo base pairs. How to The unpaired base pair detection and identification reagent according to the present invention detects a base pair that cannot form a normal base pair, including the compound represented by the general formula (1) or an immobilized product thereof. , A reagent for identification.
[0041]
According to the above configuration, a base pair that cannot form a normal base pair, in particular, a continuous normal base pair cannot be formed, as compared with a conventional mismatch recognition molecule. Base pairs can be detected and identified with higher sensitivity.
[0042]
The device according to the present invention is obtained by immobilizing the compound represented by the general formula (1). By using this immobilized device, a difference in telomere length can be detected, and the device can be used for diagnosis of cancer.
[0043]
In addition, examples of the device include a chip, a sensor, a cuvette, and a plate in which the compound represented by the general formula (1) is immobilized on a base (carrier) by some chemical bonding. Then, when the compound represented by the general formula (1) is immobilized on a substrate (carrier) by some chemical bond, the sulfur is converted to a compound represented by the general formula (1) (particularly, a mercapto group (-SH)). ) Can be easily immobilized.
[0044]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The present invention relates to a compound capable of detecting and identifying a mismatch between consecutive base pairs, and a hairpin structure or a quadruple strand that is stable against nucleic acids such as single-stranded DNA or RNA having a mismatched sequence using the compound. It is intended to provide a method for forming a structure or the like. Further, the present invention provides a method for inhibiting the activity of an enzyme such as telomerase by forming a stable hairpin structure or a four-stranded structure in a single-stranded telomere sequence, a method for suppressing the growth of cancer cells, and a method for suppressing cancer growth. The agent is provided. Furthermore, the present invention provides a method for detecting and identifying a base pair that cannot form a normal base pair, and the reagent.
[0045]
Therefore, the compound will be described first, and then the method of using the compound will be described.
[0046]
In the following description, the above-mentioned “chemical structure portion capable of forming a pair with one of the base pairs that cannot form a normal base pair (A, B, C, And / or D portion) "may be simply referred to as" base recognition site ".
[0047]
(1) Compound according to the present invention
The compound according to the present invention may be a compound represented by the general formula (2). In the formula, R, R1, R3, and R4 are a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 15 carbon atoms, and one or more carbon atoms in the alkyl group are an oxygen atom, a nitrogen atom, and And / or an alkyl group which may be substituted with a sulfur atom, an alkoxyl group having 1 to 15 carbon atoms, wherein one or more carbon atoms in the alkoxy group is an oxygen atom, a nitrogen atom, and / or a sulfur atom. An alkoxyl group which may be substituted, or a mono- or di-alkylamino group having 1 to 15 carbon atoms, wherein one or more carbon atoms in the alkylamino group are an oxygen atom, a nitrogen atom, and / or a sulfur atom And R2 and R5 are an alkylene group having 1 to 20 carbon atoms, wherein one or more carbon atoms in the alkylene group are Atom indicates a nitrogen atom or a carbonyl alkylene group which may be substituted with group. Among them, the compound represented by the structural formula (3) is preferable.
[0048]
The above compound is a low molecular weight organic compound, can be appropriately produced by a usual organic synthesis method, and is not particularly limited. For example, the aforementioned 1,8-naphthyridine derivative is a reactive derivative of 2-amino-1,8-naphthyridine or 2-amino-7-methyl-1,8-naphthyridine with N-protected-4-amino-butyric acid, For example, it can be produced by reacting an acid chloride to acylate the 2-position amino group, and then deprotecting the amino group with a protecting group. As the protecting group at this time, an amino protecting group used in peptide synthesis such as a hydrochloride, an acyl group or an alkoxycarbonyl group can be used. The target mismatch recognition molecule can be obtained by reacting the thus obtained base recognition site with a linker compound having carboxyl groups or reactive derivative groups at both ends. In this case, when a reactive group such as a nitrogen atom is present in the molecule of the linker compound, the compound can be appropriately protected with the above-described protecting group before use. The detailed method for synthesizing the compound represented by the structural formula (3) will be described in Examples described later.
[0049]
The above compound is a tetramer compound synthesized by using a 1,8-naphthyridine derivative which forms a hydrogen bond with guanine and can be stabilized by a stacking effect with surrounding bases, and which is bonded with a linker, and synthesized. is there. The above compound not only forms hydrogen bonds with unpaired bases, but also stacks aromatic rings with bases near bulges in the space created by the presence of unpaired bases (bulge bases) generated in double-stranded DNA. It is intercalated and stabilized using interaction. Further, it is a bulge DNA recognition molecule which specifically binds to and stabilizes DNA having a bulge base (bulge DNA). Further, even at a position where a base pair mismatch occurs, a compound having four molecular species capable of forming a pair with a base can be relatively stably incorporated by such a stacking effect. The compound incorporated into the double strand of DNA forms a relatively stable pair, and a new base sequence that cannot be recognized by the natural enzyme due to the formation of such a pair. it is conceivable that.
[0050]
Therefore, the compound can recognize a GG mismatch, particularly a continuously existing GG mismatch, with high sensitivity. In addition, the compound cannot take a double-stranded structure such as a stable hairpin structure due to the presence of a base pair that cannot form a normal base pair in a single-stranded oligonucleotide chain. A method for stabilizing a base pair (mismatched base pair) that cannot form a normal base pair of a single-stranded oligonucleotide chain to form a stable pseudo base pair, a single-stranded oligonucleotide chain The present invention can be used for a method for stabilizing a base pair that cannot form a normal base pair (mismatched base pair). In addition, the compound forms a double-stranded structure such as a relatively stable hairpin structure by forming such a pseudo base pair, whereby a complementary oligonucleotide of the single-stranded oligonucleotide chain is formed. It can also be used for a method of inhibiting the activity of an enzyme that synthesizes a nucleotide chain. Furthermore, by inhibiting the activity of the enzyme that synthesizes the complementary oligonucleotide chain, it can be applied to a pharmaceutical composition for treating, preventing, or treating various diseases (eg, cancer and the like) related thereto. It is.
[0051]
Hereinafter, application methods using molecules that can bind to oligonucleotides, including the above compounds, will be described in order.
[0052]
(2) Use of molecules capable of binding to oligonucleotides
First, molecules capable of binding to an oligonucleotide used in various methods according to the present invention will be described.
[0053]
The molecule capable of binding to the oligonucleotide may be a compound represented by the general formula (1). The compound represented by the above general formula (1) is a linker having four base recognition sites (A, B, C, and D in the formula) having an appropriate length and an appropriate degree of freedom (in the formula, L1 and L2), and the base recognition sites A, B, C, and D are not limited to those that recognize guanine. That is, in the above example, taking a guanine (G) -guanine (G) mismatch as an example, a compound using a 1,8-naphthyridine derivative which forms a stable hydrogen bond with a guanine base as a base recognition site was shown. However, the site where mismatch recognition or pseudo base pair can be formed is not limited to the GG mismatch site. In other words, the base recognition site recognizes one of the mismatched bases, forms a Watson-Crick type base pair with the base, and determines a molecular species that can obtain a stacking effect by surrounding bases. The selection is not limited to the exemplified guanine, but may be any as long as it can form a base pair with various bases. For example, when the mismatched base is cytosine, 2-aminonaphthyridin-4-one or a derivative thereof is used as the base recognition site. When the mismatched base is adenine, a 2-quinolone derivative such as 3- (2 -Aminoethyl) -2-quinolone or a derivative thereof, and when the mismatched base is thymine, 2-aminonaphthyridin-7-one or a derivative thereof is used, but is not particularly limited. . Therefore, the above-mentioned base recognition site (the chemical structure portion of A, B, C, and D in the general formula (1)) is not only capable of forming a hydrogen bond with the target base, but also is not limited to stacking by the surrounding base. It is preferable that the chemical structure has an effect.
[0054]
A base recognition site in a molecule capable of binding to the oligonucleotide, which can specifically recognize a specific mismatched base or the like, has a hydrogen bonding site for forming a hydrogen bond, and a planar structure for stacking by a nearby base. A heterocyclic aromatic group having a heterocyclic aromatic group having the following formula is preferable, and a heterocyclic aromatic group having a substituent having a certain degree of steric hindrance is more preferable in order to enhance the selectivity to a base. Examples of such a substituent include a linear or branched alkyl group having 1 to 15 carbon atoms, preferably 1 to 10 carbon atoms, more preferably 1 to 7 carbon atoms, and 1 to 15 carbon atoms, preferably 1 to 10 carbon atoms. More preferably, an alkoxyl group comprising a linear or branched alkyl group having 1 to 7 carbon atoms, a linear or branched alkyl group having 1 to 15 carbon atoms, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 7 carbon atoms. And mono- or di-substituted mono- or dialkylamino groups. One or more carbon atoms in these alkyl, alkoxyl or mono- or dialkylamino groups may be replaced by oxygen, nitrogen and / or sulfur atoms.
[0055]
In addition, as the linker portions L1 and L2 in the compound represented by the general formula (1), two base recognition sites (for example, A and B or C and D) have an appropriate length and an appropriate free length. There is no particular limitation as long as L1 and L2 are coupled with an appropriate length and with an appropriate degree of freedom, while providing a degree of coupling. For example, a linear or branched saturated or unsaturated alkylene group having 1 to 20, preferably 1 to 15, and more preferably 1 to 12 carbon atoms, and one or more of the alkylene group And an alkylene group which may be substituted with an oxygen atom, a nitrogen atom or a carbonyl group. As a preferable linker, as in the compound of the above formula (3), both ends have an amide bond portion and a nitrogen atom in the center, and L1 and L2 are bonded by the nitrogen atoms. Are included. The linker portions L1 and L2 can not only bind two base recognition sites, but also bind a branch for immobilizing the linker portion to the carrier from the linker portion.
[0056]
In addition, the bond between the base recognition site A or B and the linker portion L1 and the bond between C or D and the linker portion L2 in the above general formula (1) may be a carbon-carbon bond. To a functional group. As the bond by the functional group, various types such as an ether bond, an ester bond, an amide bond, and a bond by phosphoric acid can be selected, and an amide bond is preferable.
[0057]
Further, as a preferable compound of the general formula (1) for the GG mismatch, a compound represented by the above general formula (2) can be exemplified. In the formula, R, R1, R3, and R4 are a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 15 carbon atoms, and one or more carbon atoms in the alkyl group are an oxygen atom, a nitrogen atom, and And / or an alkyl group which may be substituted with a sulfur atom, an alkoxyl group having 1 to 15 carbon atoms, wherein one or more carbon atoms in the alkoxyl group are an oxygen atom, a nitrogen atom, and / or a sulfur atom. An alkoxyl group which may be substituted, or a mono- or di-alkylamino group having 1 to 15 carbon atoms, wherein one or more carbon atoms in the alkylamino group are an oxygen atom, a nitrogen atom, and / or a sulfur atom And R2 and R5 are alkylene groups having 1 to 20 carbon atoms, and one or more carbon atoms in the alkylene group are acid groups. Atom, a nitrogen atom or a carbonyl alkylene group which may be substituted with group. ) Or an immobilized product thereof. The term “immobilized product” as used herein refers to a compound in which the above-described compound is immobilized on a carrier or a compound in which the above-mentioned “branch” is extended so that it can be immobilized. In addition, the alkylene group in R2 and R5 is a divalent alkylene group as shown in the general formula (2).
[0058]
The molecule capable of binding to the oligonucleotide may be used alone, but may be provided at an appropriate position in the molecule, for example, a linker portion or an extended branch for immobilization from the linker. For example, by introducing a radioactive element, or introducing a chemical species that emits chemiluminescence or fluorescence, it is possible to label and use it. In addition, labeling as a measuring means can also be performed by labeling a nucleic acid portion such as DNA or RNA to be detected. Furthermore, it can be used by immobilizing the mismatched base-recognition molecule of the present invention by immobilizing it at an appropriate position with a polymer material such as polystyrene directly or by using an alkylene group or the like.
[0059]
Since the molecule capable of binding to the oligonucleotide is a low molecular weight organic compound, it can be appropriately produced by the ordinary organic synthesis method described in the above (1).
[0060]
(2-1) Pseudo base pair formation method, stabilization method, and stabilizer according to the present invention
The method for forming a pseudo base pair according to the present invention uses a molecule capable of binding to the above-described oligonucleotide, because there is a base pair that cannot form a normal base pair in a single-stranded oligonucleotide chain. By stabilizing a base pair (mismatched base pair) that cannot form a normal base pair of a single-stranded oligonucleotide chain that cannot form a double-stranded structure such as a stable hairpin structure, This is a method for forming pseudo base pairs.
[0061]
In addition, the stabilization method according to the present invention uses a molecule capable of binding to the above-mentioned oligonucleotide to stabilize a single-stranded oligonucleotide chain because there is a base pair that cannot form a normal base pair. This method is for stabilizing a base pair (mismatched base pair) that cannot form a normal base pair of a single-stranded oligonucleotide chain that cannot take a double-stranded structure such as a simple hairpin structure. The stabilizer according to the present invention uses a molecule capable of binding to the above-mentioned oligonucleotide to form a stable hairpin structure due to the presence of a base pair that cannot form a normal base pair in a single-stranded oligonucleotide chain. Base pairs that cannot form a normal base pair of a single-stranded oligonucleotide chain that cannot take a double-stranded structure such as It is intended to stabilize the group pairs).
[0062]
One or more of the compounds represented by the above general formula (1) may be used as they are for the pseudo base pair forming method, the stabilizing method, and the stabilizing agent according to the present invention, It can also be used with a suitable carrier. Further, it can be used after being modified with a substance having an affinity for the target cell so as to specifically act on the target cell. Furthermore, it can be used after being modified with an appropriate marker to measure the use situation.
[0063]
The single-stranded oligonucleotide chain may be a single-stranded oligonucleotide such as mRNA or rRNA, or may have a double-stranded portion such as a hairpin structure in a part thereof. Alternatively, it may be a single-stranded oligonucleotide chain at the end of a double-stranded DNA whose end is not blunt.
[0064]
For example, in a telomere region which is a terminal portion of a chromosome in a eukaryotic cell, several tens of bases at the terminal are in a single-stranded state, and this portion may be used as a single-stranded oligonucleotide chain in the present invention. it can. For example, in the single-stranded portion of the human telomere sequence, the only complementary sequence required to form a hairpin structure is the TA portion, and as shown in FIG. Even after formation, base mismatches such as GG mismatches occur continuously before and after the formation.
[0065]
Here, by using the pseudo base pairing method according to the present invention, the GG mismatch and / or GT mismatch that are mismatched in the single-stranded portion of the telomere sequence are pseudo-matched. Base pairs can be formed. This makes it possible to form a stable hairpin structure in the single-stranded portion of the telomere sequence.
[0066]
(2-2) Enzyme activity inhibiting method and enzyme activity inhibitor according to the present invention
The enzyme activity inhibiting method and the enzyme activity inhibitor according to the present invention form pseudo-base pairs that do not occur in a normal state in a single-stranded oligonucleotide chain such as a telomere terminal. It inhibits the activity of an enzyme that synthesizes a complementary strand of a single-stranded oligonucleotide chain.
[0067]
As long as the activity of the enzyme that synthesizes the complementary strand can be inhibited, any part of the single-stranded oligonucleotide chain may form a pseudo base pair. For example, it may be a primer region or a region where an extension reaction proceeds. The enzyme for synthesizing the complementary strand may be a DNA synthase such as a DNA polymerase, an RNA synthase such as an RNA polymerase, or a reverse transcriptase.
[0068]
In the enzyme activity inhibiting method and the enzyme activity inhibitor according to the present invention, one or more of the compounds represented by the above general formula (1) may be used as they are, or together with a suitable carrier. Can also be used. Further, it can be used after being modified with a substance having an affinity for the target cell so as to specifically act on the target cell. Furthermore, it can be used after being modified with an appropriate marker to measure the use situation.
[0069]
Further, as the “single-stranded oligonucleotide chain”, those described in the above (2-1) can be used. Here, the structure of the human telomere, in particular, the structure of the single-stranded portion usually, has not been sufficiently analyzed. However, the morphology such as the hairpin structure and the quadruplex structure ( Quadplex). However, even in the above structure, it is not possible to form a sufficient base pair necessary for maintaining such a structure stably, and it is possible to easily return to a single-stranded structure by the action of telomerase or the like. The extension reaction of the terminal telomere proceeds.
[0070]
However, by adding the molecule capable of binding to the oligonucleotide of the present invention to the terminal portion of the telomere using the enzyme activity inhibiting method and the enzyme activity inhibitor according to the present invention, even a base pair that is usually mismatched (for example, , GG mismatch), a pseudo base pair can be formed, and a hairpin structure or a quadruplex structure (quadplex) formed by a part of the base pairs can be formed by the formation of the pseudo base pair. The structure can be made stable to the extent that the enzyme cannot act.
[0071]
Therefore, the activity of the enzyme that synthesizes the complementary strand of the oligonucleotide chain can be inhibited.
[0072]
(2-3) Pharmaceutical composition according to the present invention
The pharmaceutical composition according to the present invention comprises a single-stranded oligonucleotide chain that cannot form a stable double-stranded or quadruplex structure due to a base pair mismatch, and the mismatch portion represented by the general formula (1): A "pseudo base pair" is formed using the molecule to be formed to form a stable double-stranded or quadruplex structure, and the function of the single-stranded oligonucleotide chain, for example, its complementary chain By inhibiting the synthesis of the complementary strand by the enzyme to be synthesized, various diseases caused by the function of the single-stranded oligonucleotide chain can be treated, prevented and / or treated.
[0073]
Further, as the pharmaceutical composition of the present invention, one or more of the compounds represented by the above general formula (1) may be used as it is, or may be used together with a suitable carrier. The carrier may be any pharmaceutically acceptable carrier. The pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally.
[0074]
Further, as the “single-stranded oligonucleotide chain”, those described in the above (2-1) can be used. For example, in the case of human telomeres, the use of the pharmaceutical composition of the present invention allows pseudo-base pairs to be formed even at normally mismatched base pairs (for example, GG mismatches) at the terminal portion of the telomeres. Thus, a hairpin structure or a quadruplex structure (quadplex) formed by some base pairs can be made to a structure that is so stable that the enzyme cannot act due to the formation of the pseudo base pairs. As a result, the extension reaction of the telomere terminal by telomerase can be inhibited, and the cell in which telomere extension is not performed eventually expires. As a result, cancer cells stop growing and die like normal cells.
[0075]
(2-4) The unpaired base pair detection / identification method and the unpaired base pair detection / identification reagent according to the present invention The unpaired base pair detection / identification method and the unpaired base pair detection / identification reagent according to the present invention comprise a base pair mismatch portion Nucleic acids that form base pairs similar to bulge bases and that are relatively stably incorporated into DNA or RNA strands forming a double-stranded form, thereby hybridizing nucleic acids. In the above, a portion where a base pair causes a mismatch can be easily specified.
[0076]
The compound used in the unpaired base pair detection identification method and unpaired base pair detection identification reagent of the present invention is represented by the above-mentioned general formula (1) in order to specify the position and amount of the unpaired base pair. It is preferable to use one or more of the compounds after modifying them with an appropriate marker for detection or measurement. Specifically, a radioactive element is introduced or chemiluminescence or fluorescence is emitted at an appropriate position in the compound molecule, for example, into a linker portion or an extended branch for immobilization from the linker. Labeling, such as by introducing a molecular species, can also be used. In addition, labeling as a measuring means can also be performed by labeling a nucleic acid portion such as DNA or RNA to be detected. Furthermore, it can be used by immobilizing the mismatched base-recognition molecule of the present invention by immobilizing it at an appropriate position with a polymer material such as polystyrene directly or by using an alkylene group or the like. Furthermore, it can be used after being modified with a substance having an affinity for the target cell so as to specifically act on the target cell.
[0077]
In the above description, mainly the case of GG mismatch has been specifically described. However, the base recognition sites A, B, C, and D of the compound represented by the general formula (1) are replaced with other bases. T (thymine) -G (guanine) mismatch, T (thymine) -T (thymine) mismatch, T (thymine) -C (cytosine) mismatch, A (adenine) -G A (guanine) mismatch, a C (cytosine) -C (cytosine) mismatch, an A (adenine) -A (adenine) mismatch, an A (adenine) -C (cytosine) mismatch, and the like can be performed in the same manner. Furthermore, U (uracil) -T (thymine) mismatch, U (uracil) -C (cytosine) mismatch, and U (uracil) -G (guanine) mismatch can be performed by the same method.
[0078]
As used herein, the term "pseudo base pair" means a base pair different from a naturally occurring base pair, and does not mean a base pair strength. Absent. As used herein, the term “normal base pair” refers to a naturally occurring base pair, such as G (guanine) -C (cytosine), A (adenine) -T (thymine), or A (guanine). (Adenine) -U (uracil) refers to base pairs.
[0079]
Hereinafter, embodiments will be described with reference to the accompanying drawings, and embodiments of the present invention will be described in further detail. Of course, the present invention is not limited to the following examples, and it goes without saying that various aspects are possible in detail. Furthermore, the present invention is not limited to the above-described embodiment, and various changes can be made within the scope shown in the claims, and embodiments obtained by appropriately combining the disclosed technical means are also described. It is included in the technical scope of the invention.
[0080]
【Example】
[1] Synthesis of compound capable of binding to human telomere sequence
First, a compound capable of specifically binding to an unpaired base pair in a single-stranded DNA portion in a human telomere sequence, that is, a compound represented by the above structural formula (3) was synthesized.
[0081]
FIG. 3 shows a specific synthesis scheme. The specific method was performed as follows. First, glutaraldehyde was prepared by adding sodium chloride to a 25% aqueous solution of glutaraldehyde, extracting with chloroform, drying and concentrating. A few drops of acetic acid were added to a methanol solution of the naphthyridine dimer (Compound 1) (110 mg) to adjust the pH to 5. Glutaraldehyde (12 mg) was added to this solution, followed by sodium cyanoborohydride (18.7 mg), and the mixture was reacted at room temperature for 10 minutes. The reaction mixture was partitioned with water-chloroform, and the organic layer was dried and concentrated. The crude product was purified using preparative TLC to give bisnaphthyridine dimer (Compound 2, Structural Formula (3)) as a white solid (34.5 mg).
[0082]
1 1 H NMR (CD3OD, 400 MHz) d = 8.10 (d, 4H, J = 8.8 Hz), 7.83 (d, 4H, J = 8.4 Hz), 7.83 (d, 4H, J = 8.8 Hz), 7.13 (d, 4H, J = 8.4 Hz), 2.79 (t, 8H, J = 6.0 Hz), 2.59 (s, 12H), 2 .58 (8H), 2.53 (t, 4H, J = 7.2 Hz), 1.67 (m, 4H), 1.44 (m, 2H); 13C NMR (CD3OD, 100 MHz) d = 174.1, 163.7, 155.0, 154.9, 139.6, 138.2, 122.4, 119.4, 115.5, 55.2, 50.4, 35.5, 27. 4, 26.5, 25.0.
[2] Analysis of compound represented by structural formula (3)
Next, the compound represented by the structural formula (3) obtained by synthesis and purification in the above [1] was analyzed. Specifically, the melting temperature (Tm) of single-stranded DNA d (TTAGGGTTGGGTTA) having a repeating sequence of human telomeric sequence TTAGGG was compared between naphthyridine dimer (1) and bisnaphthyridine dimer (2).
[0083]
The specific experimental conditions were as follows: a naphthyridine dimer (compound 1) was added to 30 mM or bismuth in a cacodylate buffer (pH 7.0) solution containing d (TTAGGTGTGGGTTA) (5 mM, strand concentration) in saline (100 mM). Naphthyridine dimer (compound 2) was added at 15 mM, the absorption change at 260 nm with respect to the temperature change was measured, and the melting temperature (Tm) was calculated from the inflection point.
[0084]
When a naphthyridine dimer (compound 1), for which elongation inhibition by telomerase was already confirmed, was added, the melting temperature was 63.6 ° C. However, with a bisnaphthyridine dimer (compound 2), the melting temperature further increased. 1 ° C. In addition, when Compounds 1 and 2 were not added, the melting temperature was below the measurement limit (4 ° C.). This indicates that the bisnaphthyridine dimer (compound 2) binds to the human telomere sequence more strongly than the naphthyridine dimer (compound 1), and as a result, stronger extension inhibition on telomerase is expected. .
[0085]
【The invention's effect】
As described above, the compound represented by the general formula (2) has an effect of being able to specifically and strongly bind to unpaired base pairs, particularly GG mismatches that are continuously present. Due to this property, various applications are possible. That is, by using the compound represented by the general formula (1) to form a pseudo base pair in a single-stranded oligonucleotide chain by the method according to the present invention, the single-stranded oligonucleotide chain The effect is that a relatively stable double-stranded or quadruple-stranded structure can be easily formed therein. By forming such a relatively stable structure in the single-stranded oligonucleotide chain, the function of the single-stranded oligonucleotide chain can be inhibited. For example, the telomere region at the end of the chromosome It can inhibit the elongation reaction, and has the effect of being useful for the treatment, prevention, and treatment of various diseases caused by the function of the single-stranded oligonucleotide chain, for example, cancer.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram schematically showing the formation of a hairpin structure in a single-stranded telomere sequence and the complementary sequence relationship at that time.
FIG. 2 is a diagram showing a synthesis scheme of a bisnaphthyridine dimer represented by the above structural formula (3).
FIG. 3 is a view showing the results of examining the effect of a naphthyridine dimer (compound 1) and a bisnaphthyridine dimer (compound 2) on the melting temperature (Tm) of a repeat sequence of the human telomeric sequence TTAGGG.
Claims (30)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003054711A JP2004262828A (en) | 2003-02-28 | 2003-02-28 | Molecule to be bonded to telomere or the like and use thereof |
Applications Claiming Priority (1)
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Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2004262828A true JP2004262828A (en) | 2004-09-24 |
Family
ID=33118967
Family Applications (1)
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Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2004262828A (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2015062388A (en) * | 2013-09-25 | 2015-04-09 | 学校法人甲南学園 | Method for detecting quadruple helical structure of nucleic acid chain |
| EP2960340A4 (en) * | 2012-12-12 | 2016-06-29 | Elena Andreyevna Chiryasova | Method for influencing proliferative status of cells using specific g-chain nucleotide sequences of human telomeric dna |
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| JP2002030094A (en) * | 2000-07-17 | 2002-01-29 | Japan Science & Technology Corp | Molecule capable of bonding with telomere and method for using the same e |
-
2003
- 2003-02-28 JP JP2003054711A patent/JP2004262828A/en active Pending
Patent Citations (1)
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