JP2015031515A - Near-field optical observation apparatus, sample-containing environmental cell manufacturing method, scanning electron optical microscope, and method of using scanning electron optical microscope - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、近接場光学観察装置、試料含有環境セル作製方法、走査電子光学顕微鏡及び走査電子光学顕微鏡の使用方法に関するものである。 The present invention relates to a near-field optical observation apparatus, a sample-containing environment cell preparation method, a scanning electron optical microscope, and a method of using a scanning electron optical microscope.
光学顕微鏡は、様々な環境下での様々な対象物の多用な情報を含んだ画像を提供でき、特に生物学において重要な役割を果たしてきた。
光学顕微鏡には、例えば、位相差顕微鏡や蛍光顕微鏡がある。位相差顕微鏡は、液中の生きたままの細胞を染色せずに観察することができる。蛍光顕微鏡は、特定の分子や組織だけを可視化でき、多くの生物学的な発見を生み出してきた。しかし、これらの光学顕微鏡の画像分解能は、回折限界により制限されている。
光学顕微鏡の分野においては、次に示す新しい技術が積極的に開発されている。
Optical microscopes have been able to provide images containing extensive information on different objects in different environments and have played an important role in biology in particular.
Examples of the optical microscope include a phase contrast microscope and a fluorescence microscope. The phase-contrast microscope can observe living cells in the liquid without staining them. Fluorescence microscopy has made it possible to visualize only specific molecules and tissues, creating many biological discoveries. However, the image resolution of these optical microscopes is limited by the diffraction limit.
In the field of optical microscopes, the following new technologies are being actively developed.
<光学顕微鏡の動向:(1)近接場光学顕微鏡>
光学顕微鏡においては、レンズを用いずに、先端を細く尖らせた光ファイバの外周を金属で遮光コーティングし、先端だけに微小な開口を設けた光ファイバプローブを機械的に走査して、対象物の表面の光学特性を画像化する近接場光学顕微鏡(Scanning Near−field Optical Microscopy:SNOMと略記する。)が回折限界の壁を破り、今では、ナノ構造における光の局在の様子を観察する一般的な手法として確立している。
<Trends in optical microscopes: (1) Near-field optical microscope>
In an optical microscope, without using a lens, the outer periphery of an optical fiber with a sharp tip is coated with a light-shielding coating with metal, and an optical fiber probe with a minute opening only on the tip is mechanically scanned to scan the object. Scanning Near-field Optical Microscopy (abbreviated as SNOM) breaks the diffraction limit wall and now observes the state of light localization in nanostructures Established as a general method.
しかし、液中ではプローブと対象物間の距離制御が困難なために液中の細胞への応用事例は限らており、また、たいていの場合、対象物を蛍光染色して観察している。近接場光学顕微鏡技術の一種であるチップ増強ラマン散乱法は染色を必要としない独特の手法として期待されているが、生物試料への応用はまだ始まったばかりで、事例がほとんどない。 However, since it is difficult to control the distance between the probe and the object in the liquid, there are limited applications to cells in the liquid, and in most cases, the object is observed by fluorescent staining. The chip-enhanced Raman scattering method, which is a kind of near-field optical microscope technology, is expected as a unique technique that does not require staining, but its application to biological samples has just started and there are few cases.
<光学顕微鏡の動向:(2)遠方場ナノ分解能蛍光光学顕微鏡>
この10年ほどの間に、蛍光の非線形性や、単一分子検出を利用する、様々な遠方場ナノ分解能蛍光光学顕微鏡(Optical far−field fluorescence nanoscopy)が開発され、レンズを用いた伝統的な光学系で液中の生きた細胞を3次元的に、かつ、回折限界を超えた超解像観察することが可能となった。
<Trends in optical microscopes: (2) Far-field nano-resolution fluorescence optical microscope>
In the last decade or so, various far-field nano-resolution fluorescence optical microscopes utilizing the nonlinearity of fluorescence and single-molecule detection have been developed and traditional lenses are used. It became possible to observe living cells in the liquid three-dimensionally and super-resolution exceeding the diffraction limit with an optical system.
しかし、これらの手法は原理的に蛍光染色を必要とする。これらに準ずる手法で、無染色の生きた細胞をどのようにして観察するかは今後の重要な研究課題とされている。 However, these techniques in principle require fluorescent staining. How to observe unstained living cells by a method similar to these methods is considered as an important research topic in the future.
一方、電子顕微鏡は、光学顕微鏡の分解能の壁をはるかに超える分解能をもたらした。
しかし、電子顕微鏡では、試料を真空環境下に置かねばならないため、水中の生きた細胞の観察が困難となる。例えば、対象物の自然の状態を維持するために、光学顕微鏡では必要なかったような複雑な試料作製技術が必要となった。更に、光学顕微鏡において重要な情報をもたらした蛍光、光吸収、屈折率などの情報も失われた。
電子顕微鏡の分野においても、次に示す新しい技術が積極的に開発されている。
On the other hand, electron microscopes have provided resolutions that far exceed the resolution barrier of optical microscopes.
However, in an electron microscope, it is difficult to observe living cells in water because the sample must be placed in a vacuum environment. For example, in order to maintain the natural state of an object, a complicated sample preparation technique that is not necessary with an optical microscope is required. In addition, information such as fluorescence, light absorption, and refractive index, which have provided important information in the optical microscope, has been lost.
In the field of electron microscopes, the following new technologies are being actively developed.
<電子顕微鏡の動向:(1)電子線による光学的情報の観察>
電子顕微鏡においては、電子線により光学的な特性を観察する手法が開発されてきた。電子線により励起された発光を検出するカソードルミネッセンス法(CL,電子線発光法)はその代表例で、染色あるいは無染色の生物試料(ただし、真空下に置かれた乾燥した死んだ状態に限る)の観察に古くから利用されてきた。
<Trends of electron microscope: (1) Observation of optical information by electron beam>
In the electron microscope, a technique for observing optical characteristics with an electron beam has been developed. The cathodoluminescence method (CL, electron beam emission method) for detecting luminescence excited by an electron beam is a typical example, and is a stained or unstained biological sample (however, it is limited to a dry dead state placed under vacuum) ) For a long time.
微小な分子や粒子を観察したい特定の分子や組織に化学的に結合して利用し、電子線で発光する発光マーカーの開発は今も進められている。
真空中に曝しても問題のない非生物試料に対しては、その他にも様々な電子顕微鏡技術が、種々の光学的特性を観察するために利用され、ナノフォトニクスの分野では一般的になっている。
Development of luminescent markers that emit light with an electron beam by using chemically bonded to specific molecules or tissues that want to observe minute molecules and particles is still in progress.
For non-biological samples that can be safely exposed to vacuum, a variety of other electron microscopy techniques are used to observe various optical properties and are becoming more common in the field of nanophotonics. Yes.
<電子顕微鏡の動向:(2)環境セルの開発>
電子顕微鏡技術におけるもう一つの特筆すべき進展が、環境セルの開発である。
液中の、無染色の、非固定の生物試料の観察は、電子顕微鏡の歴史の初期の頃からの重要課題であったが、この10年間の進歩は目覚ましいものであった。なお、非固定の生物試料とは、殺していない生物試料、すなわち、生きている生物試料のことである。
薄い膜により試料を取り囲む領域を真空環境と遮断する環境セルを用いて、透過電子顕微鏡(TEM)、走査透過電子顕微鏡(STEM)、走査電子顕微鏡(SEM)で、透過電子、散乱電子、あるいはCLを検出することにより、液中の物体の観察に成功した事例が多数報告された。
<Trends in electron microscopes: (2) Development of environmental cells>
Another notable advance in electron microscope technology is the development of environmental cells.
The observation of unstained, non-fixed biological samples in liquid has been an important issue since the early days of electron microscope history, but progress over the past decade has been remarkable. The non-fixed biological sample is a biological sample that has not been killed, that is, a living biological sample.
Using an environmental cell that shuts off the region surrounding the sample with a thin film from the vacuum environment, transmission electron microscope (TEM), scanning transmission electron microscope (STEM), scanning electron microscope (SEM), transmission electrons, scattered electrons, or CL Many cases of successful observation of objects in liquids have been reported.
非特許文献3には、2枚のSi基板の間に、SiNメンブレン、スペーサー、SiNメンブレンをこの順序で挟み込み、かつ、スペーサーにより設けられた空間部内に細胞をAu粒子等とともに配置する構成を具備するSTEM用の環境セルが記載されている。高密度電子線を貫通させ、散乱電子を測定する構成なので、光学顕微鏡ではない。また、細胞を試料とすると測定により、死滅する。また、一般に無染色の細胞ではコントラストが得られないので、細胞をAu粒子にて標識して、Au粒子のみを観測する構成である。
非特許文献4には、2枚のSi基板の間に、SiO2(9nm)、スペーサー(Epoxy)、SiO2(9nm)をこの順序で挟み込み、かつ、スペーサーにより設けられた空間部内に細胞を配置する構成を具備するTEM用の環境セルが記載されている。低密度電子線を貫通させ、透過電子像を投影する構成なので、光学顕微鏡ではない。
Non-Patent Document 3 has a configuration in which a SiN membrane, a spacer, and a SiN membrane are sandwiched between two Si substrates in this order, and cells are arranged together with Au particles in a space provided by the spacer. An environmental cell for STEM is described. It is not an optical microscope because it is configured to penetrate a high-density electron beam and measure scattered electrons. When cells are used as samples, they die by measurement. Further, since contrast is generally not obtained with unstained cells, the cells are labeled with Au particles, and only the Au particles are observed.
In Non-Patent Document 4, SiO 2 (9 nm), spacer (Epoxy), SiO 2 (9 nm) are sandwiched in this order between two Si substrates, and cells are placed in the space provided by the spacer. An environmental cell for a TEM having a configuration to be arranged is described. It is not an optical microscope because it is configured to penetrate a low-density electron beam and project a transmission electron image.
特許文献4及び非特許文献5には、電子線側基板、光ファイバがこの順序で配置されており、かつ、電子線側基板と光ファイバとの間に設けられた空間部内に細胞を配置する構成を具備するSEM用の環境セルが記載されている。電子線は細胞表面で反射し、反射電子を反射電子検出器により、CLを、光ファイバを介して光検出器により観測する構成である。 In Patent Document 4 and Non-Patent Document 5, the electron beam side substrate and the optical fiber are arranged in this order, and the cells are arranged in a space provided between the electron beam side substrate and the optical fiber. An environmental cell for SEM having a configuration is described. The electron beam is reflected on the cell surface, and the reflected electrons are observed by a reflected electron detector, and CL is observed by a photodetector through an optical fiber.
環境セルに関しては、Protochips社がSTEM又はTEM用製品を作製・出荷している(非特許文献6)。また、Quantomix社がSEM用製品を作製・出荷している(非特許文献7)。しかし、光学顕微鏡用途の環境セルはない。 Regarding environmental cells, Protochips manufactures and ships STEM or TEM products (Non-Patent Document 6). In addition, Quantomix manufactures and ships products for SEM (Non-patent Document 7). However, there is no environmental cell for optical microscope applications.
別のアプローチとして、環境セルを用いずに液中の試料を観察するために、通常とは上下を逆に作った専用のSEMも開発されている。 As another approach, in order to observe a sample in a liquid without using an environmental cell, a dedicated SEM made upside down is also developed.
液中の生物試料を電子顕微鏡で観察する上での深刻な問題は、電子線による対象物の損傷である。画像の取得原理が対象物による電子線の吸収、散乱、CLに基づく以上、対象物への電子線照射は原理的に避けられない。TEMでは電子線照射量を極小化することにより、観察後にも細胞が生きていたことを実証した事例もあるが、一般的なSTEMを用いた手法では、従来、知られていた損傷閾値よりも電子線照射量を抑制したにもかかわらず、細胞は生きていられなかったと報告されている。SEMを用いた手法でも、液中の生物試料が観察後に生きていたという報告はない。 A serious problem in observing a biological sample in a liquid with an electron microscope is damage to an object due to an electron beam. As long as the principle of image acquisition is based on absorption, scattering, and CL of an electron beam by the object, irradiation of the object with an electron beam is inevitable in principle. In TEM, there are cases in which cells were alive after observation by minimizing the electron beam irradiation dose. However, in the method using a general STEM, the damage threshold value that has been conventionally known is exceeded. It has been reported that cells were not able to survive despite the suppression of electron beam dose. Even in the technique using SEM, there is no report that the biological sample in the liquid was alive after observation.
特許文献1には、「光学顕微鏡部」と「電子顕微鏡結像系による光励起を行う部分」が連結された構成を具備する光学顕微鏡が記載されている。また、非特許文献1は、特許文献1に係る光学顕微鏡を、上下を逆に作った特殊な倒立型SEMを用いて実現したものである。しかし、試料への電子線照射を抑制し、試料に電子線損傷を与えずに画像を得るための方法は示されていない。また、これらの文献には、倒立型ではない一般的な電子顕微鏡を用いて、生物試料を光学観察するための方法は記載されていない。特許文献2、3には、環境セルを用いたX線顕微鏡が開示されている。これは、観察試料支持部材から発生する特性X線により試料のX線透過像を観察するものである。しかし、光学顕微像を得ることはできない。 Patent Document 1 describes an optical microscope having a configuration in which an “optical microscope section” and a “portion for performing optical excitation by an electron microscope imaging system” are connected. Non-Patent Document 1 is an implementation of the optical microscope according to Patent Document 1 using a special inverted SEM made upside down. However, a method for suppressing an electron beam irradiation to a sample and obtaining an image without damaging the sample with an electron beam is not shown. In addition, these documents do not describe a method for optically observing a biological sample using a general electron microscope that is not an inverted type. Patent Documents 2 and 3 disclose an X-ray microscope using an environmental cell. In this method, an X-ray transmission image of the sample is observed with characteristic X-rays generated from the observation sample support member. However, an optical microscopic image cannot be obtained.
本発明は、液中の、無染色の、非固定の生物試料を高分解能で光学観察可能な近接場光学観察装置、試料含有環境セル作製方法、走査電子光学顕微鏡及び走査電子光学顕微鏡の使用方法を提供することを課題とする。 The present invention relates to a near-field optical observation apparatus capable of optically observing an unstained, non-fixed biological sample in a liquid with high resolution, a sample-containing environment cell preparation method, a scanning electron optical microscope, and a method of using the scanning electron optical microscope It is an issue to provide.
本発明者は、上記事情を鑑み、試行錯誤することにより、環境セル(Environmental cell)を具備した近接場光学観察装置と電子顕微法とを融合して、環境セル内に液中の、無染色の、非固定の生物試料を保持して、電子顕微鏡の真空槽内部に配置した状態で、機械的に走査する先鋭光ファイバプローブの代わりに、電子線が照射され発光する蛍光色素の光を照明プローブ(照明光源)として用いる走査電子光学顕微鏡(Scanning Electoronic Optical Microscopy:SEOMと略記する。)を開発した。これは、近接場光学顕微鏡(SNOM)でもある。 In view of the above circumstances, the present inventor fused the near-field optical observation apparatus equipped with the environmental cell and the electron microscopic method by trial and error, so that there is no staining in the liquid in the environmental cell. Instead of a sharp optical fiber probe that mechanically scans while holding a non-fixed biological sample and placed inside a vacuum chamber of an electron microscope, it illuminates with a fluorescent dye that emits light when irradiated with an electron beam. A scanning electron optical microscope (abbreviated as SEOM) for use as a probe (illumination light source) was developed. This is also a near-field optical microscope (SNOM).
具体的には、環境セルの厚さ50nmの電子線で発光する窓を、低エネルギー電子線で走査し、発生したフォトンを下に配置した光電子増倍管(PMT)で計数することにより、窓材の反対面に付着させた試料の近接場光学像を試料の回折限界の影響を受けずに、100nmを超える高分解能からなる光学画像を下部に配置した光電子増倍管にて、機械的走査に頼らずに、取得することができた。従来の理論では回折限界により240nm以下のものは光学顕微鏡では識別できないとされていたが、双極子放射増強あるいはエネルギー移動現象により形成され、62nmという小さな構造の画像を観察できた。 Specifically, a window that emits light with an electron beam having a thickness of 50 nm in an environmental cell is scanned with a low-energy electron beam, and the generated photons are counted with a photomultiplier tube (PMT) disposed below. The near-field optical image of the sample attached to the opposite surface of the material is mechanically scanned by a photomultiplier tube with an optical image having a high resolution exceeding 100 nm disposed below, without being affected by the diffraction limit of the sample. I was able to get it without relying on. According to the conventional theory, it is considered that the light of 240 nm or less cannot be identified by the optical microscope due to the diffraction limit. However, an image having a small structure of 62 nm can be observed due to the formation of dipole radiation enhancement or energy transfer phenomenon.
この近接場光学観察装置は、既設の走査電子顕微鏡の試料室に容易に取り付けることができ、近接場光学観察装置と電子顕微鏡を組み合わせだけで走査電子光学顕微鏡(SEOM)を実現できた。 This near-field optical observation apparatus can be easily attached to the sample chamber of an existing scanning electron microscope, and a scanning electron optical microscope (SEOM) can be realized only by combining the near-field optical observation apparatus and the electron microscope.
近接場光学観察装置の環境セル中には、試料を、大気、水、生理食塩水、培養液など、任意の環境中に保持することができた。
試料としては細胞やナノ粒子を用いることができ、液中の無染色で生きたままのヒト肺表皮細胞の表面構造や、細胞内に取り込まれた細胞毒性を持ったナノ粒子を観察できた。
In the environment cell of the near-field optical observation apparatus, the sample could be held in any environment such as air, water, physiological saline, or culture solution.
Cells and nanoparticles could be used as the sample, and the surface structure of human lung epidermis cells that remained alive without staining in the liquid and cytotoxic nanoparticles incorporated into the cells could be observed.
画像は、先に記載したように、対象物の屈折率に応じて双極子放射増強により形成され、対象物が吸収性物質の場合には、エネルギー移動によるCLの消光現象もコントラスト形成に寄与した。 As described above, the image is formed by dipole radiation enhancement according to the refractive index of the object, and when the object is an absorptive substance, the quenching phenomenon of CL due to energy transfer also contributed to the contrast formation. .
一般的な電子線エネルギーはSEMでは5〜30kV、TEM、STEMでは100〜200kVであるのに対し、0.8〜1.2kVという低エネルギー電子線を用いる構成なので、窓材にて十分に遮蔽され、窓材の反対側に付着した試料に損傷を与えなかった。 General electron beam energy is 5 to 30 kV in SEM and 100 to 200 kV in TEM and STEM, but it uses a low energy electron beam of 0.8 to 1.2 kV. And the sample adhered to the opposite side of the window material was not damaged.
以上説明したように、走査電子光学顕微鏡(SEOM)により、液中の生きた細胞の無染色、解像光学観察を可能であること、具体的には、生きたヒト肺表皮細胞の付着界面の微細構造や毒性ナノ粒子の細胞内取り込み過程の観察に利用できることを見出して、本発明を完成した。
本発明は、以下の構成を有する。
As explained above, the scanning electron optical microscope (SEOM) enables unstained and resolved optical observation of living cells in the liquid, specifically, the adhesion interface of living human lung epidermal cells. The present invention has been completed by finding that it can be used for observation of the microstructure and the intracellular uptake process of toxic nanoparticles.
The present invention has the following configuration.
(1)試料を密封保持可能な空間部と、前記空間部の一方に設けられた入射窓と、前記空間部の他方に設けられた出射窓とを備えた環境セルと、発光測定モジュールとを有し、前記入射窓が電子線励起により発光可能な発光材料を有していることを特徴とする近接場光学観察装置。 (1) An environmental cell including a space part capable of sealingly holding a sample, an incident window provided in one of the space parts, an emission window provided in the other of the space parts, and a luminescence measurement module. A near-field optical observation apparatus comprising: a light emitting material capable of emitting light by electron beam excitation.
(2)前記入射窓に接するようにフレーム部が設けられていることを特徴とする(1)に記載の近接場光学観察装置。
(3)前記フレーム部に一面側と他面側を連通するように孔部が形成されていることを特徴とする(2)に記載の近接場光学観察装置。
(4)前記フレーム部の一面側に前記入射窓が設けられていることを特徴とする(3)に記載の近接場光学観察装置。
(2) The near-field optical observation apparatus according to (1), wherein a frame portion is provided in contact with the incident window.
(3) The near-field optical observation apparatus according to (2), wherein a hole is formed in the frame portion so as to communicate one surface side and the other surface side.
(4) The near-field optical observation apparatus according to (3), wherein the entrance window is provided on one surface side of the frame portion.
(5)前記孔部が前記空間部の一部であることを特徴とする(3)又は(4)に記載の近接場光学観察装置。
(6)前記フレーム部の他面側に前記入射窓が設けられていることを特徴とする(3)に記載の近接場光学観察装置。
(7)前記フレーム部の他面側に又は前記他面側に離間して出射窓が設けられていることを特徴とする(1)〜(6)のいずれかに記載の近接場光学観察装置。
(5) The near-field optical observation apparatus according to (3) or (4), wherein the hole is a part of the space.
(6) The near-field optical observation apparatus according to (3), wherein the entrance window is provided on the other surface side of the frame portion.
(7) The near-field optical observation apparatus according to any one of (1) to (6), wherein an exit window is provided on the other surface side of the frame portion or spaced apart from the other surface side. .
(8)前記フレーム部の一面側と他面側を連通する前記孔部が、入射窓側から出射窓側に向けて広がるよう形成されていることを特徴とする(3)に記載の近接場光学観察装置。
(9)前記孔部に面する前記フレーム部の壁面が光反射性の高い材料で被覆されていることを特徴とする(8)のいずれかに記載の近接場光学観察装置。
(10)前記入射窓が、2層以上で形成されており、高強度材料からなる構造層と、前記構造層に積層され、電子線励起により発光可能な発光材料を有している発光層と、を有していることを特徴とする(1)〜(9)のいずれかに記載の近接場光学観察装置。
(8) The near-field optical observation according to (3), wherein the hole portion that communicates the one surface side and the other surface side of the frame portion is formed so as to expand from the incident window side toward the emission window side. apparatus.
(9) The near-field optical observation apparatus according to any one of (8), wherein a wall surface of the frame portion facing the hole is covered with a highly light-reflective material.
(10) The incident window is formed of two or more layers, a structural layer made of a high-strength material, and a light-emitting layer that is laminated on the structural layer and has a light-emitting material that can emit light by electron beam excitation; The near-field optical observation apparatus according to any one of (1) to (9), wherein
(11)前記発光層が、電子線励起により発光可能な発光材料からなることを特徴とする(10)に記載の近接場光学観察装置。
(12)前記発光層が、前記発光材料に電子線励起により発光可能な別の発光材料が添加されて形成されていることを特徴とする(11)に記載の近接場光学観察装置。
(13)前記構造層が、SiN、SiO2、SiC,Si、ポリイミド、パリレン、カーボン、コロジオン、フォルムバール、トリアセチルセルロースのいずれかの高強度材料からなるメンブレンであることを特徴とする(10)〜(12)のいずれかに記載の近接場光学観察装置。
(11) The near-field optical observation apparatus according to (10), wherein the light emitting layer is made of a light emitting material capable of emitting light by electron beam excitation.
(12) The near-field optical observation apparatus according to (11), wherein the light-emitting layer is formed by adding another light-emitting material capable of emitting light by electron beam excitation to the light-emitting material.
(13) The structure layer is a membrane made of a high-strength material of any one of SiN, SiO 2 , SiC, Si, polyimide, parylene, carbon, collodion, formval, and triacetylcellulose (10 ) To (12) The near-field optical observation device according to any one of the above.
(14)前記入射窓の膜厚が、5nm以上500nm以下であることを特徴とする(1)〜(13)のいずれかに記載の近接場光学観察装置。
(15)前記出射窓が、ガラス、ポリエステル、ポリイミド、SiN、SiO2、SiC,Si、パリレン、カーボン、コロジオン、フォルムバール、トリアセチルセルロースのいずれかの材料からなることを特徴とする(1)〜(14)のいずれかに記載の近接場光学観察装置。
(16)前記入射窓が複数設けられていることを特徴とする(1)〜(15)のいずれかに記載の近接場光学観察装置。
(14) The near-field optical observation apparatus according to any one of (1) to (13), wherein the incident window has a thickness of 5 nm to 500 nm.
(15) The exit window is made of any one of glass, polyester, polyimide, SiN, SiO 2 , SiC, Si, parylene, carbon, collodion, formval, and triacetylcellulose (1) The near-field optical observation apparatus according to any one of to (14).
(16) The near-field optical observation apparatus according to any one of (1) to (15), wherein a plurality of the incident windows are provided.
(17)前記発光測定モジュールが、前記環境セルの出射窓側に配置されていることを特徴とする(1)〜(16)のいずれかに記載の近接場光学観察装置。
(18)前記発光測定モジュールが、前記環境セルと離間して配置されており、前記環境セルの出射窓側と前記発光測定モジュールの光電面とを結ぶ光路システムが設けられていることを特徴とする(1)〜(16)のいずれかに記載の近接場光学観察装置。
(19)前記光路システムが、レンズと、ミラーと、光ファイバの群から選択される二以上の光部品を組み合わせて形成されていることを特徴とする(18)に記載の近接場光学観察装置。
(20)前記発光測定モジュールが光電子倍増管を有するモジュール、分光測定システム、多波長発光測定モジュールのいずれかであることを特徴とする(1)〜(19)のいずれかに記載の近接場光学観察装置。
(17) The near-field optical observation apparatus according to any one of (1) to (16), wherein the light emission measurement module is disposed on an exit window side of the environmental cell.
(18) The light emission measurement module is disposed apart from the environmental cell, and an optical path system that connects an emission window side of the environmental cell and a photoelectric surface of the light emission measurement module is provided. The near-field optical observation apparatus according to any one of (1) to (16).
(19) The near-field optical observation apparatus according to (18), wherein the optical path system is formed by combining two or more optical components selected from a group of a lens, a mirror, and an optical fiber. .
(20) The near-field optics according to any one of (1) to (19), wherein the light emission measurement module is any one of a module having a photomultiplier tube, a spectroscopic measurement system, and a multiwavelength light emission measurement module. Observation device.
(21)一面側と他面側を連通する孔部を有するフレーム部の一面側または他面側に入射窓を設けた第1の基板を用意し、前記入射窓の他面側に試料を付着させてから、前記試料を覆うように充填媒体を滴下する工程と、出射窓を有する第2の基板を用意し、前記出射窓を覆うように充填媒体を滴下する工程と、前記第1の基板と前記第2の基板を充填媒体が混じり合うように重ね合わせる工程とを有することを特徴とする試料含有環境セル作製方法。 (21) Prepare a first substrate having an entrance window on one side or the other side of the frame part having a hole communicating between the one side and the other side, and attach a sample to the other side of the entrance window And then dropping the filling medium so as to cover the sample, preparing a second substrate having an exit window, dropping the filling medium so as to cover the exit window, and the first substrate And a step of superposing the second substrate so that the filling medium is mixed therewith.
(22)充填媒体を滴下する工程の前工程として、高強度材料からなる構造層上に発光層をドロップ・コーティングして、入射窓を形成することを特徴とする(21)に記載の試料含有環境セル作製方法。
(23)重ね合わせる工程で、第1の基板又は第2の基板に設けられた充填媒体排出用孔部から、余分な充填媒体を排出・除去してから、前記充填媒体排出用孔部の充填媒体排出側に設けられた封止シールに別の封止シールを重ねて接着することを特徴とする(21)又は(22)に記載の試料含有環境セル作製方法。
(24)重ね合わせる工程後、第1の基板と第2の基板を第3の基板にねじ止め固定することを特徴とする(21)〜(23)のいずれかに記載の試料含有環境セル作製方法。
(22) The sample containing according to (21), wherein the light emitting layer is dropped and coated on a structural layer made of a high-strength material to form an incident window as a pre-step of the step of dropping the filling medium. Environmental cell fabrication method.
(23) In the superimposing step, excess filling medium is discharged and removed from the filling medium discharging hole provided in the first substrate or the second substrate, and then the filling medium discharging hole is filled. The method for preparing a sample-containing environmental cell according to (21) or (22), wherein another sealing seal is overlapped and adhered to the sealing seal provided on the medium discharge side.
(24) The sample-containing environmental cell according to any one of (21) to (23), wherein the first substrate and the second substrate are screwed and fixed to the third substrate after the overlapping step. Method.
(25)(1)〜(20)のいずれかに記載の近接場光学観察装置と、電子顕微鏡とを有することを特徴とする走査電子光学顕微鏡。
(26)前記近接場光学観察装置が、電子顕微鏡の真空槽内に配置されていることを特徴とする(25)に記載の走査電子光学顕微鏡。
(27)前記近接場光学観察装置の環境セルが、環境セル保持部に保持されており、前記近接場光学観察装置の発光測定モジュールが、保持部に保持されており、前記保持部に対して前記環境セル保持部の位置合わせ移動機構が備えられていることを特徴とする(25)又は(26)に記載の走査電子光学顕微鏡。
(28)前記位置合わせ移動機構により、前記保持部から前記環境セル保持部を取り外して、電子顕微鏡の真空槽に接続された別の真空槽に移動可能であることを特徴とする(27)に記載の走査電子光学顕微鏡。
(25) A scanning electron optical microscope comprising the near-field optical observation apparatus according to any one of (1) to (20) and an electron microscope.
(26) The scanning electron optical microscope according to (25), wherein the near-field optical observation device is arranged in a vacuum chamber of an electron microscope.
(27) The environmental cell of the near-field optical observation device is held by an environmental cell holding unit, and the light emission measurement module of the near-field optical observation device is held by the holding unit, with respect to the holding unit The scanning electron optical microscope according to (25) or (26), further comprising an alignment movement mechanism for the environmental cell holding unit.
(28) According to (27), the environmental cell holding unit can be detached from the holding unit and moved to another vacuum chamber connected to a vacuum chamber of an electron microscope by the alignment moving mechanism. The scanning electron optical microscope as described.
(29)(24)〜(28)のいずれかに記載の走査電子光学顕微鏡の使用方法であって、環境セルの入射窓の電子線透過率が1%以下となるエネルギーの電子線を環境セルの入射窓に照射することを特徴とする走査電子光学顕微鏡の使用方法。
(30)0.8kV以上1.2kV以下のエネルギーの電子線を環境セルの入射窓に照射することを特徴とする(29)に記載の走査電子光学顕微鏡の使用方法。
(29) A method for using the scanning electron optical microscope according to any one of (24) to (28), wherein an electron beam having an energy at which an electron beam transmittance of an incident window of the environmental cell is 1% or less is applied to the environmental cell. A method of using a scanning electron optical microscope characterized by irradiating an incident window of a scanning electron microscope.
(30) The method of using the scanning electron optical microscope according to (29), wherein an electron beam having an energy of 0.8 kV or more and 1.2 kV or less is irradiated to an incident window of an environmental cell.
本発明の近接場光学観察装置は、試料を密封保持可能な空間部と、前記空間部の一方に設けられた入射窓と、前記空間部の他方に設けられた出射窓とを備えた環境セルと、発光測定モジュールとを有し、前記入射窓が電子線励起により発光可能な発光材料を有している構成なので、環境セルに保持することにより、真空槽内部でも液中の、無染色の、非固定の生物試料を安定して測定対象として保持することができ、環境セルの窓内の蛍光材料を電子線励起により発光させることにより、窓に付着させた試料の極めて近傍で、ナノオーダーの光源として発光させて、これを近接場光源として利用できるので、回折限界を超えた高分解能で光学観察することができる。 The near-field optical observation apparatus according to the present invention includes an environment cell including a space part capable of sealingly holding a sample, an incident window provided in one of the space parts, and an exit window provided in the other of the space parts. And a light emission measuring module, and the incident window has a light emitting material capable of emitting light by electron beam excitation. Non-fixed biological sample can be stably held as a measurement target, and the fluorescent material in the window of the environmental cell emits light by electron beam excitation. The light source can be used as a near-field light source, so that optical observation can be performed with high resolution exceeding the diffraction limit.
本発明の試料含有環境セル作製方法は、一面側と他面側を連通する孔部を有するフレーム部の一面側に入射窓を設けた第1の基板を用意し、前記入射窓の他面側に試料を付着させてから、前記試料を覆うように充填媒体を滴下する工程と、出射窓を有する第2の基板を用意し、前記出射窓を覆うように充填媒体を滴下する工程と、前記第1の基板と前記第2の基板を充填媒体が混じり合うように重ね合わせる工程とを有する構成なので、入射窓に試料を付着させ、充填媒体で環境セル内を充填して、内部を閉じた系として、液中の、無染色の、非固定の生物試料を含有する環境セルを容易に作製できる。 In the sample-containing environment cell manufacturing method of the present invention, a first substrate having an entrance window provided on one side of a frame part having a hole communicating with one side and the other side is prepared, and the other side of the entrance window is provided. A step of dropping a filling medium so as to cover the sample, a step of preparing a second substrate having an exit window, and dropping a filling medium so as to cover the exit window; Since the first substrate and the second substrate are superposed so that the filling medium is mixed, the sample is attached to the incident window, the inside of the environmental cell is filled with the filling medium, and the inside is closed. As a system, an environmental cell containing an unstained, non-fixed biological sample in a liquid can be easily prepared.
本発明の走査電子光学顕微鏡は、先に記載の近接場光学観察装置と、電子顕微鏡とを有する構成なので、液中の、無染色の、非固定の生物試料を含有する環境セルを電子顕微鏡の真空槽内が配置され、液中の、無染色の、非固定の生物試料を高分解能で光学観察することができる。 Since the scanning electron optical microscope of the present invention has the above-mentioned near-field optical observation apparatus and the electron microscope, an environmental cell containing an unstained, non-fixed biological sample in the liquid is used as an electron microscope. The inside of the vacuum chamber is arranged, and an unstained, non-fixed biological sample in the liquid can be optically observed with high resolution.
本発明の走査電子光学顕微鏡の使用方法は、先に記載の走査電子光学顕微鏡の使用方法であって、環境セルの入射窓の電子線透過率が1%以下となるエネルギーの電子線を環境セルの入射窓に照射する構成なので、液中の、無染色の、非固定の生物試料を含有する環境セルを電子顕微鏡の真空槽内が配置され、液中の、無染色の、非固定の生物試料を痛めたり、破壊することなく、高分解能で光学観察することができる。 The method of using the scanning electron optical microscope of the present invention is the above-described method of using the scanning electron optical microscope, wherein an electron beam having an energy at which the electron beam transmittance of the incident window of the environmental cell is 1% or less is applied to the environmental cell. The environment cell containing the unstained, non-fixed biological sample in the liquid is placed in the vacuum chamber of the electron microscope, and the non-stained, non-fixed organism in the liquid. Optical observation can be performed with high resolution without damaging or destroying the sample.
(本発明の第1の実施形態)
以下、添付図面を参照しながら、本発明の実施形態である近接場光学観察装置、試料含有環境セル作製方法,走査電子光学顕微鏡及び走査電子光学顕微鏡の使用方法について説明する。
(First embodiment of the present invention)
Hereinafter, a near-field optical observation apparatus, a sample-containing environment cell preparation method, a scanning electron optical microscope, and a method of using the scanning electron optical microscope, which are embodiments of the present invention, will be described with reference to the accompanying drawings.
<走査電子光学顕微鏡>
まず、本発明の第1の実施形態である走査電子光学顕微鏡について説明する。
図1は、本発明の第1の実施形態である走査電子光学顕微鏡の一例を示す模式図(a)と、そのシステム全体のブロック図(b)である。
図1(a)に示すように、本発明の第1の実施形態である走査電子光学顕微鏡101は、近接場光学観察装置11と、電子顕微鏡とを有して概略構成されている。
具体的には、内部を減圧可能な略筒状の真空槽103と、真空槽103内部の先端側に配置された電子源(電子銃)102と、電子源102から放射された電子線91の進行方向を制御する走査コイル104と、真空槽103内部の基端側に配置された近接場光学観察装置11とを有している。
真空槽103には、別の真空槽105が接続されている。真空槽103と真空槽105の間は開閉自在とされている。
環境セル12と電子銃102との間にはシャッター108が配置されている。シャッター108は必要に応じて電子線91が環境セル12に照射されないように、電子線91を電磁的あるいは機械的に開閉する装置で、電極間に電界を生じさせて電子線を遮断するビームブランカーが一般的である。本願装置では、ビームブランカーの代わりに機械的シャッターを用いている。
電子線91としては、0.8〜1.2kVという低エネルギー電子線を用いる。これにより、試料に与える損傷を低減できる。
<Scanning electron optical microscope>
First, the scanning electron optical microscope which is the 1st Embodiment of this invention is demonstrated.
FIG. 1 is a schematic diagram (a) illustrating an example of a scanning electron optical microscope according to the first embodiment of the present invention, and a block diagram (b) of the entire system.
As shown in FIG. 1A, a scanning electron optical microscope 101 according to a first embodiment of the present invention is roughly configured to include a near-field optical observation device 11 and an electron microscope.
Specifically, a substantially cylindrical vacuum chamber 103 capable of reducing the pressure inside, an electron source (electron gun) 102 disposed on the tip side inside the vacuum chamber 103, and an electron beam 91 emitted from the electron source 102 It has a scanning coil 104 that controls the traveling direction, and a near-field optical observation device 11 that is disposed on the proximal end side inside the vacuum chamber 103.
Another vacuum chamber 105 is connected to the vacuum chamber 103. The vacuum chamber 103 and the vacuum chamber 105 can be freely opened and closed.
A shutter 108 is disposed between the environmental cell 12 and the electron gun 102. The shutter 108 is a device that electromagnetically or mechanically opens and closes the electron beam 91 so that the electron beam 91 is not irradiated onto the environmental cell 12 as necessary. A beam blanker that generates an electric field between the electrodes and blocks the electron beam. Is common. In the present apparatus, a mechanical shutter is used instead of the beam blanker.
As the electron beam 91, a low energy electron beam of 0.8 to 1.2 kV is used. Thereby, the damage given to a sample can be reduced.
近接場光学観察装置11は、環境セル12と発光測定モジュール13とからなる。
環境セル12は環境セル保持部110に保持されており、発光測定モジュール13は発光測定モジュールの保持部109に保持されている。保持部109に対して前記環境セル保持部110の位置合わせ移動機構(図示略)が備えられている。
前記位置合わせ移動機構(図示略)により、保持部109から前記環境セル保持部110を取り外して、電子顕微鏡の真空槽103に接続された別の真空槽105に移動可能とされている。これにより、真空槽103中の真空を破らずに、試料交換が可能とされている。
The near-field optical observation device 11 includes an environmental cell 12 and a light emission measurement module 13.
The environmental cell 12 is held in the environmental cell holding unit 110, and the luminescence measurement module 13 is held in the luminescence measurement module holding unit 109. An alignment moving mechanism (not shown) for the environmental cell holding unit 110 is provided with respect to the holding unit 109.
The environmental cell holding unit 110 is detached from the holding unit 109 and can be moved to another vacuum chamber 105 connected to the vacuum chamber 103 of the electron microscope by the alignment moving mechanism (not shown). Thereby, the sample can be exchanged without breaking the vacuum in the vacuum chamber 103.
図1(b)に示すように、本発明の実施形態である走査電子光学顕微鏡のシステムは、電子銃制御回路121と、走査信号制御回路122と、電子線照射制御回路123と、光検出器電源回路124と、光信号整形回路125と、2次電子信号整形回路126と、2次電子信号整形回路126に接続された2次電子検出器127と、これらの回路に接続された制御PC128と、制御PC128に接続されたモニター129とを有して、概略構成されている。 As shown in FIG. 1B, the scanning electron optical microscope system according to the embodiment of the present invention includes an electron gun control circuit 121, a scanning signal control circuit 122, an electron beam irradiation control circuit 123, and a photodetector. A power supply circuit 124, an optical signal shaping circuit 125, a secondary electron signal shaping circuit 126, a secondary electron detector 127 connected to the secondary electron signal shaping circuit 126, and a control PC 128 connected to these circuits , And a monitor 129 connected to the control PC 128.
ここで、電子銃制御回路121は、電子線エネルギーや電流を制御する回路である。走査信号制御回路122は、目的の位置に次々に電子線が照射されるような信号を走査コイルに出力する回路である。電子線照射制御回路123は、シャッターの開閉を制御する回路である。 Here, the electron gun control circuit 121 is a circuit that controls electron beam energy and current. The scanning signal control circuit 122 is a circuit that outputs to the scanning coil a signal that irradiates the target position with the electron beam one after another. The electron beam irradiation control circuit 123 is a circuit that controls opening and closing of the shutter.
光検出器電源回路124は本願装置の場合には光電子増倍管用の高圧電源であり、本願装置の場合には発光測定モジュール13の内部に組み込まれている。光信号整形回路125は、本願装置の場合には前置増幅器とフォトンカウンティング回路とからなり、フォトンの計数値を出力する。本願装置の場合には、前置増幅器は真空槽の中で、検出器近傍に組み込まれている。2次電子信号整形回路126は、2次電子検出器127からの信号を増幅する整形回路である。2次電子検出器127は、SEMにもともと備えられている検出器である。 The photodetector power supply circuit 124 is a high-voltage power supply for a photomultiplier tube in the case of the device of the present application, and is incorporated in the light emission measuring module 13 in the case of the device of the present application. In the case of the device of the present application, the optical signal shaping circuit 125 includes a preamplifier and a photon counting circuit, and outputs a photon count value. In the case of the present device, the preamplifier is incorporated in the vicinity of the detector in the vacuum chamber. The secondary electron signal shaping circuit 126 is a shaping circuit that amplifies the signal from the secondary electron detector 127. The secondary electron detector 127 is a detector originally provided in the SEM.
<近接場光学観察装置>
次に、本発明の実施形態である近接場光学観察装置について説明する。
図2は、本発明の実施形態である近接場光学観察装置の一例を示す模式図である。図3は、本発明の実施形態である近接場光学観察装置の環境セルに試料を充填した状態の一例を示す模式図である。
<Near-field optical observation device>
Next, a near-field optical observation apparatus that is an embodiment of the present invention will be described.
FIG. 2 is a schematic diagram showing an example of a near-field optical observation apparatus that is an embodiment of the present invention. FIG. 3 is a schematic diagram illustrating an example of a state in which a sample is filled in the environmental cell of the near-field optical observation apparatus according to the embodiment of the present invention.
図2、3に示すように、本発明の実施形態である近接場光学観察装置11は、環境セル12と発光測定モジュール13とを有して、概略構成されている。
環境セル12は、試料を密封保持可能な空間部19と、空間部19の一方に設けられた入射窓30と、空間部19の他方に設けられた出射窓34とを備えた環境セル12と、発光測定モジュール13とを有している。
As shown in FIGS. 2 and 3, the near-field optical observation apparatus 11 according to the embodiment of the present invention has an environment cell 12 and a light emission measurement module 13 and is schematically configured.
The environmental cell 12 includes an environmental cell 12 including a space portion 19 capable of sealing and holding a sample, an incident window 30 provided on one side of the space portion 19, and an exit window 34 provided on the other side of the space portion 19. And the light emission measuring module 13.
環境セル12は、フレーム部35と、フレーム部35の一面側と他面側を連通する孔部35cと、孔部35cのフレーム部35の一面側に設けられた入射窓30と、孔部35cのフレーム部35の他面側に離間して設けられた出射窓34と、を有している。
なお、出射窓34は、図2、3に示すように、フレーム部35の他面側に又は前記他面側に離間して設けられていればよく、フレーム部35の他面に接して配置してもよい。
The environmental cell 12 includes a frame portion 35, a hole portion 35c communicating with one surface side and the other surface side of the frame portion 35, an incident window 30 provided on one surface side of the frame portion 35 of the hole portion 35c, and a hole portion 35c. And an emission window 34 provided separately on the other surface side of the frame portion 35.
As shown in FIGS. 2 and 3, the exit window 34 may be provided on the other surface side of the frame portion 35 or separated from the other surface side, and is disposed in contact with the other surface of the frame portion 35. May be.
図3に示すように、環境セル12は、入射窓30と出射窓34の間に、試料41を密封保持可能な空間部19を備えている。空間部19は、孔部22c1、孔部35c、充填媒体排出用孔部22c2、孔部38Acとから構成されている。空間部19には、試料41と充填媒体42が充填されている。 As shown in FIG. 3, the environmental cell 12 includes a space 19 that can hold the sample 41 hermetically between the entrance window 30 and the exit window 34. The space 19 includes a hole 22c1, a hole 35c, a filling medium discharge hole 22c2, and a hole 38Ac. The space portion 19 is filled with a sample 41 and a filling medium 42.
フレーム部35として、Si、ステンレス、銅、モリブデン、白金、ニッケル、金のいずれかの材料を挙げることができる。これにより、孔部35cの大きさを正確に制御して形成することができ、試料保持状態を正確に制御できる。また、試料や充填媒体と反応させることもない。 As the frame portion 35, any material of Si, stainless steel, copper, molybdenum, platinum, nickel, and gold can be used. Thereby, the size of the hole portion 35c can be accurately controlled, and the sample holding state can be accurately controlled. Moreover, it does not react with the sample or the filling medium.
フレーム部35の一面側と他面側を連通する孔部35cが、入射窓側から出射窓側に向けて広がるよう形成されていることが好ましい。これにより、出射光を発光測定モジュールに効率よく伝えることができる。 It is preferable that a hole 35c that communicates the one surface side and the other surface side of the frame portion 35 is formed so as to expand from the entrance window side toward the exit window side. Thereby, the emitted light can be efficiently transmitted to the light emission measurement module.
孔部35cに面するフレーム部35の壁面が光反射性の高い材料で被覆されていることが好ましい。これにより、出射光を発光測定モジュールにより効率よく伝えることができる。光反射性の高い材料としては、Ag、Al、Au、Ptのいずれかの材料を上げることができる。斜め蒸着法により、必要な壁面部だけにこれらの材料を被覆することが可能である。 It is preferable that the wall surface of the frame part 35 facing the hole part 35c is covered with a highly light-reflective material. Thereby, the emitted light can be efficiently transmitted to the light emission measurement module. As the material having high light reflectivity, any of Ag, Al, Au, and Pt can be used. It is possible to coat these materials only on the required wall surface by the oblique deposition method.
入射窓30は、高強度材料からなる構造層31と、構造層31に積層され、電子線励起により発光可能な発光材料を有している発光層32の2層で構成されている。しかし、これに限られるものではなく、3層以上としてもよい。 The incident window 30 includes two layers: a structural layer 31 made of a high-strength material and a light-emitting layer 32 that is stacked on the structural layer 31 and has a light-emitting material that can emit light by electron beam excitation. However, the present invention is not limited to this, and three or more layers may be used.
発光層32は、それ自体が電子線励起により発光可能な発光材料からなるか、又は、前記発光材料に電子線励起により発光可能な別の発光材料が添加されて形成されている。これにより、発光層32のポリマー材料を光源に利用できる。これにより、発光層32に照射された電子線照射部を近接場光源とすることができる。
発光層32自体が電子線励起により発光可能な発光材料となりうる材料としては、PPV誘導体などのπ共役高分子、ポリイミド、Alqなどの有機EL材料、BC400などのプラスチックシンチレータ,SiN,ZnOの群から選択されるいずれか一の材料を挙げることができる。また、添加され、電子線励起により発光可能な別の発光材料は、Alq、Bbq、Zn−PBO、ルブレン、Ir(ppy)3、クマリンやDCMなどのレーザー色素の群から選択されるいずれか一の発光材料を挙げることができる。具体的には、PVKにクマリンを添加した発光層(クマリン分散PVK)や、ZnSにAgを添加した発光層等を挙げることができる。クマリンとしては、バンドギャップが2.3eVのクマリン6などを挙げることができる。
The light emitting layer 32 itself is made of a light emitting material capable of emitting light by electron beam excitation, or is formed by adding another light emitting material capable of emitting light by electron beam excitation to the light emitting material. Thereby, the polymer material of the light emitting layer 32 can be utilized for a light source. Thereby, the electron beam irradiation part irradiated to the light emitting layer 32 can be used as a near-field light source.
The light emitting layer 32 itself can be a light emitting material that can emit light by electron beam excitation, from a group of π-conjugated polymers such as PPV derivatives, organic EL materials such as polyimide and Alq, plastic scintillators such as BC400, SiN, and ZnO. Any one selected material can be mentioned. In addition, another light emitting material that is added and can emit light by electron beam excitation is any one selected from the group of laser dyes such as Alq, Bbq, Zn-PBO, rubrene, Ir (ppy) 3 , coumarin, and DCM. Can be mentioned. Specifically, the light emitting layer (coumarin dispersion PVK) which added coumarin to PVK, the light emitting layer which added Ag to ZnS, etc. can be mentioned. Examples of coumarin include coumarin 6 having a band gap of 2.3 eV.
構造層31は、高強度材料SiNからなるメンブレンである。構造層31は、SiO2、SiC,Si、ポリイミド、パリレン、カーボン、コロジオン、フォルムバール、トリアセチルセルロースのいずれかの高強度材料からなるメンブレンであってもよい。これらのメンブレンにより、膜厚を薄くしても、強度を保つことができ、環境セルを真空槽内に保持したときでも、入射窓が破れるのを防止できる。 The structural layer 31 is a membrane made of a high-strength material SiN. The structural layer 31 may be a membrane made of a high-strength material such as SiO 2 , SiC, Si, polyimide, parylene, carbon, collodion, form bar, or triacetyl cellulose. These membranes can maintain strength even when the film thickness is reduced, and can prevent the incident window from being broken even when the environmental cell is held in the vacuum chamber.
フレーム部と構造層の組み合わせとしては、例えば、Siのフレーム部にSiN、SiO2、SiC、Siの群から選択されるいずれか一のメンブレンからなる構造層を挙げることができる。
また、別の組み合わせとしては、SUS,Cu、Mo、Pt、Ni、Auの群から選択されるいずれか一の金属からなるフレーム部に、ポリイミド、パリレン、カーボン、コロジオン、フォルムバール、トリアセチルセルロースの群から選択されるいずれか一の有機材料のメンブレンからなる構造層を挙げることができる。
Examples of the combination of the frame portion and the structural layer include a structural layer made of any one membrane selected from the group of SiN, SiO 2 , SiC, and Si in the Si frame portion.
As another combination, a frame portion made of any one metal selected from the group of SUS, Cu, Mo, Pt, Ni, Au, polyimide, parylene, carbon, collodion, formbar, triacetyl cellulose. The structural layer which consists of a membrane of any one organic material selected from the group of these can be mentioned.
フレーム部としては、一の孔部が設けられているものに限られず、複数の孔部が設けられるものを用いてもよい。例えば、3×3=9個の孔部を配列形成してもよい。これにより、メッシュ状の孔部を形成できる。メッシュ状の孔部は、Siのフレーム部又はSUS、Cu、Mo、Pt、Ni、Auなどの金属からなるフレーム部に形成できる。金属のメッシュからなるフレーム部には、ポリイミド、パリレン、カーボン、コロジオン、フォルムバール、トリアセチルセルロースなどの主に有機材料のメンブレンを構造層として貼り付けることができる。 The frame portion is not limited to one provided with one hole portion, and a frame portion provided with a plurality of hole portions may be used. For example, 3 × 3 = 9 holes may be arranged. Thereby, a mesh-shaped hole can be formed. The mesh-shaped hole can be formed in a Si frame or a frame made of a metal such as SUS, Cu, Mo, Pt, Ni, or Au. A membrane made mainly of an organic material such as polyimide, parylene, carbon, collodion, formbar, or triacetylcellulose can be attached as a structural layer to a frame portion made of a metal mesh.
入射窓30の膜厚は、5nm以上500nm以下であることが好ましい。
入射窓30の発光層32の平面視径が、5μm以上1mm以下であることが好ましい。これにより、この範囲で2次元観測することができる。
The film thickness of the entrance window 30 is preferably 5 nm or more and 500 nm or less.
The planar view diameter of the light emitting layer 32 of the entrance window 30 is preferably 5 μm or more and 1 mm or less. Thereby, two-dimensional observation can be performed in this range.
出射窓34として、ガラス、ポリエステル、ポリイミド、SiN、SiO2、SiC,Si、パリレン、カーボン、コロジオン、フォルムバール、トリアセチルセルロースのいずれかの材料を挙げることができる。ガラスとしては石英ガラスが好ましい。
出射窓34の平面視径は、例えば、5μm以上10mm以下とする。
As the exit window 34, any material of glass, polyester, polyimide, SiN, SiO 2 , SiC, Si, parylene, carbon, collodion, form bar, and triacetyl cellulose can be used. As glass, quartz glass is preferable.
The planar view diameter of the emission window 34 is, for example, 5 μm or more and 10 mm or less.
発光測定モジュール13は、環境セル12の出射窓34側に配置されている。発光測定モジュール13は、光電子倍増管を有するモジュールである。これにより、出射光を効率よく捕えることができる。 The luminescence measurement module 13 is disposed on the exit window 34 side of the environmental cell 12. The luminescence measurement module 13 is a module having a photomultiplier tube. Thereby, the emitted light can be captured efficiently.
発光測定モジュール13は、フォトダイオードやアバランシェフォトダイオード等の光検出器を有する構成でも良い。また、多素子光電子増倍管、多素子フォトダイオード、CCD、CMOS等の多素子光検出器を有する構成としてもよい。 The luminescence measurement module 13 may have a configuration including a photodetector such as a photodiode or an avalanche photodiode. Moreover, it is good also as a structure which has multi-element photodetectors, such as a multi-element photomultiplier tube, a multi-element photodiode, CCD, CMOS.
<近接場光学観察装置の原理>
本発明の実施形態である近接場光学観察装置の原理について説明する。
図4は、本発明の実施形態である近接場光学観察装置の原理の一例を示す模式図である。
<Principle of near-field optical observation device>
The principle of the near-field optical observation apparatus according to the embodiment of the present invention will be described.
FIG. 4 is a schematic diagram showing an example of the principle of the near-field optical observation apparatus according to the embodiment of the present invention.
図4に示すように、本発明の実施形態である近接場光学観察装置の環境セルでは、電子銃側から、構造層31及び発光層32がこの順序で積層された入射窓30と、試料41と、充填媒体42と、出射窓34とがこの順序で積層されてなり、環境セル12の電子銃と反対側の面に、発光測定モジュール13が配置されてなる。
充填媒体42は、例えば、液体としてはPBSであり、気体としては空気(Air)である。
As shown in FIG. 4, in the environment cell of the near-field optical observation apparatus according to the embodiment of the present invention, the incident window 30 in which the structural layer 31 and the light emitting layer 32 are laminated in this order from the electron gun side, and the sample 41 The filling medium 42 and the emission window 34 are stacked in this order, and the light emission measurement module 13 is disposed on the surface of the environmental cell 12 opposite to the electron gun.
The filling medium 42 is, for example, PBS as a liquid and air (Air) as a gas.
試料41としては、有機化合物又は無機化合物からなるナノ粒子、細胞などの生物試料などを挙げることができる。超解像光学観察のできなかった、液中の無染色の非固定の生物試料にすら適用できる。生物以外の試料としては無機、有機、半導体など様々な組成の粒子を任意の溶液あるいは気体中で観察するということができる。生物試料であっても、無染色、非固定に限らず、染色した細胞、固定した細胞も対象にできる。また、生物試料であっても、バクテリア、ウィルス、細胞壁を有する酵母細胞など、種類によっては、液中ではなく、空気や任意の組成の気体中で観察することができる。 Examples of the sample 41 include biological samples such as nanoparticles and cells made of organic compounds or inorganic compounds. It can even be applied to unstained, non-fixed biological samples in liquids that could not be observed with super-resolution optics. As samples other than living organisms, it can be said that particles of various compositions such as inorganic, organic and semiconductor are observed in an arbitrary solution or gas. Even if it is a biological sample, not only unstained and non-fixed but also stained cells and fixed cells can be targeted. Even a biological sample can be observed in air or a gas of any composition, not in a liquid, depending on the type, such as bacteria, viruses, and yeast cells having cell walls.
電子銃102から出射された電子線91は発光層32の任意の点に照射され、発光層32の任意の点がCLにより光源92として発光する。光源92から出射された光93は近接場に配置された試料41を照射し、試料41との近接場相互作用の結果、透過された光93が発光測定モジュール13の光電面13aで捕捉される。捕捉された光はPCにより分析され、モニターに表示される。 An electron beam 91 emitted from the electron gun 102 is irradiated onto an arbitrary point of the light emitting layer 32, and the arbitrary point of the light emitting layer 32 emits light as a light source 92 by CL. The light 93 emitted from the light source 92 irradiates the sample 41 disposed in the near field, and as a result of the near field interaction with the sample 41, the transmitted light 93 is captured by the photocathode 13 a of the light emission measurement module 13. . The captured light is analyzed by a PC and displayed on a monitor.
電子線91は、例えば矢印91aの方向に走査することにより、試料41の1次元方向情報を得ることができ、走査方向を平行に順次ずらしていくことにより、試料41の2次元面の情報を得ることができる。 The electron beam 91 can obtain the one-dimensional direction information of the sample 41, for example, by scanning in the direction of the arrow 91a, and the information on the two-dimensional surface of the sample 41 can be obtained by sequentially shifting the scanning direction in parallel. Can be obtained.
光源92からの光93は蛍光材料の種類に応じて決まる、可視光を中心とする任意の光(波長200〜2000nm)であるが、光源92の大きさが電子線拡散領域に対応するナノオーダーの大きさであるとともに、光源92から試料41までの距離がナノオーダーと短いため、試料41による透過光のコントラストは近接場相互作用により決まり、可視光の回折限界を超えた分解能を有する近接場光学観察が可能となる。 The light 93 from the light source 92 is arbitrary light (wavelength 200 to 2000 nm) centered on visible light, which is determined according to the type of fluorescent material, but the size of the light source 92 is nano-order corresponding to the electron beam diffusion region. Since the distance from the light source 92 to the sample 41 is as short as nano-order, the contrast of the transmitted light by the sample 41 is determined by the near-field interaction, and the near-field having a resolution exceeding the diffraction limit of visible light. Optical observation is possible.
入射窓30の膜厚30tが5nm以上500nm以下である構成なので、試料41と光源92との距離を短くすることができ、発光層32の電子線照射部を近接場光源として利用することができる。また、入射窓30の強度を十分に保持できる。特に、入射窓30を、機械的強度を保持する構造層と、発光機能を有する発光層に機能分離した2層構造とすることにより、発光機能を高めたうえで、機械的強度も高めることができる。 Since the thickness 30t of the incident window 30 is 5 nm or more and 500 nm or less, the distance between the sample 41 and the light source 92 can be shortened, and the electron beam irradiation part of the light emitting layer 32 can be used as a near-field light source. . Further, the intensity of the incident window 30 can be sufficiently maintained. In particular, by making the incident window 30 into a two-layer structure that is functionally separated into a structural layer that retains mechanical strength and a light-emitting layer having a light-emitting function, the light-emitting function is enhanced and the mechanical strength is also increased. it can.
発光層32の膜厚は、5nm以上500nm以下とする。これにより、試料と光源との距離を短くして、発光層の電子線照射部を近接場光源として利用することができる。
出射窓34の厚さは、5nm以上1mm以下とする。これにより、試料と発光測定モジュールとの距離を短くして、広い角度範囲の光93を効率良く捕捉することができる。
The thickness of the light emitting layer 32 is 5 nm or more and 500 nm or less. Thereby, the distance of a sample and a light source can be shortened, and the electron beam irradiation part of a light emitting layer can be utilized as a near field light source.
The thickness of the exit window 34 is 5 nm or more and 1 mm or less. Thereby, the distance of a sample and the light emission measurement module can be shortened, and the light 93 in a wide angle range can be efficiently captured.
フレーム部35の厚さは、10μm以上1mm以下とする。フレーム部35の厚さは、光路長に影響しないが、出射窓34の位置はフレーム部35の厚さより発光層側に近づくことができない。また、フレーム部35の壁面は反射板として作用するので、孔部35cが、入射窓側から出射窓側に向けて広がるよう形成されていることにより、発光測定モジュール13に入射させる出射光効率を高めることができる。 The thickness of the frame part 35 is 10 μm or more and 1 mm or less. The thickness of the frame portion 35 does not affect the optical path length, but the position of the exit window 34 cannot approach the light emitting layer side from the thickness of the frame portion 35. Moreover, since the wall surface of the frame part 35 acts as a reflector, the hole 35c is formed so as to expand from the incident window side toward the emission window side, thereby increasing the efficiency of the emitted light incident on the light emission measurement module 13. Can do.
<試料含有環境セル作製方法1:試料がナノ粒子である場合>
次に、本発明の実施形態である試料含有環境セル作製方法であって、試料がナノ粒子である場合について説明する。
図5〜12は、本発明の実施形態である試料含有環境セル作製方法の一例を示す工程図である。
本発明の実施形態である試料含有環境セル作製方法は、第1の基板の入射窓への試料付着・充填媒体滴下工程S1と、第2の基板の出射窓への充填媒体滴下工程S2と、第1の基板と第2の基板の重ね合わせ工程S3とを有して、概略構成されている。
<Sample-containing environmental cell preparation method 1: When the sample is nanoparticles>
Next, a sample-containing environmental cell manufacturing method according to an embodiment of the present invention, in which the sample is nanoparticles, will be described.
5 to 12 are process diagrams showing an example of a sample-containing environment cell manufacturing method according to the embodiment of the present invention.
The sample-containing environmental cell manufacturing method according to the embodiment of the present invention includes a sample attachment / filling medium dropping step S1 on the incident window of the first substrate, a filling medium dropping step S2 on the exit window of the second substrate, The first substrate and the second substrate overlap step S3 are schematically configured.
なお、試料付着・充填媒体滴下工程S1の前工程として、高強度材料からなる構造層上に発光層をドロップ・コーティングして、入射窓を形成することが好ましい。これにより、微小面積であっても、均一な膜厚で、蛍光色素を偏らせることなく均一に分散させて、発光層を形成することができ、解像度を高めることができる。 In addition, as a pre-process of the sample attachment / filling medium dropping step S1, it is preferable to drop and coat a light emitting layer on a structural layer made of a high-strength material to form an incident window. Thereby, even if it is a very small area, it is possible to form the light emitting layer by uniformly dispersing the fluorescent dye without biasing the film, and the resolution can be increased.
(第1の基板の入射窓への試料付着・充填媒体滴下工程S1)
この工程では、まず、図5に示す、一面側と他面側を連通する孔部35cを有するフレーム部35の一面側に入射窓30を設けた第1の基板21を用意する。フレーム部35は第1の基板21の孔部21c1に外周側で接着され、固定されている。また、第1の基板21は、基板本体部21Aにねじ用の孔部21c2が備えられている。
入射窓30は、フレーム基板35の一面側に接着された構造層31と、構造層31の他面側に接着された発光層32とから構成されている。
(Sample Attachment to Filling Window of First Substrate / Filling Medium Dropping Step S1)
In this step, first, as shown in FIG. 5, a first substrate 21 having an entrance window 30 provided on one surface side of a frame portion 35 having a hole portion 35c communicating one surface side and the other surface side is prepared. The frame portion 35 is bonded and fixed to the hole portion 21c1 of the first substrate 21 on the outer peripheral side. Further, the first substrate 21 is provided with a screw hole 21c2 in the substrate body 21A.
The incident window 30 includes a structural layer 31 adhered to one surface side of the frame substrate 35 and a light emitting layer 32 adhered to the other surface side of the structural layer 31.
次に、図5に示すように、入射窓30の他面側に試料41を付着させる。
次に、図6に示すように、試料41を覆うように充填媒体42を滴下する。
Next, as shown in FIG. 5, the sample 41 is attached to the other surface side of the incident window 30.
Next, as shown in FIG. 6, the filling medium 42 is dropped so as to cover the sample 41.
次に、図7に示すように、第3の基板23の上に第1の基板21を配置する。第3の基板23は、基板本体部23Aに、孔部23c1と、ねじ用の孔部23c2が形成されてなる。後の工程で、第3の基板23に、第1の基板21及び第2の基板22をねじ止め固定する。 Next, as shown in FIG. 7, the first substrate 21 is disposed on the third substrate 23. The third substrate 23 is formed by forming a hole 23c1 and a screw hole 23c2 in the substrate body 23A. In a later step, the first substrate 21 and the second substrate 22 are fixed to the third substrate 23 with screws.
(第2の基板の出射窓への充填媒体滴下工程S2)
この工程では、出射窓34を有する第2の基板22を用意する。第2の基板22は、基板本体部22Aに、環境セル用の孔部22c1と、充填媒体排出用孔部22c2と、出射光用の孔部22c3と、ねじ用の孔部22c4が形成されてなる。充填媒体排出用孔部22c2には、孔部38Acが設けられた封止シール38Aが貼られている。また、環境セル用の孔部22c1にはOリング37が嵌合されている。Oリング37は、ゴム・パッキングである。
次に、図8に示すように、出射窓34を覆うように、かつ、環境セル用孔部22c1を充填するように、充填媒体42を滴下する。
(Filling medium dropping step S2 on the exit window of the second substrate)
In this step, the second substrate 22 having the exit window 34 is prepared. The second substrate 22 has an environmental cell hole 22c1, a filling medium discharge hole 22c2, an emitted light hole 22c3, and a screw hole 22c4 formed in the substrate body 22A. Become. A sealing seal 38A provided with a hole 38Ac is attached to the filling medium discharge hole 22c2. An O-ring 37 is fitted in the environmental cell hole 22c1. The O-ring 37 is a rubber packing.
Next, as shown in FIG. 8, the filling medium 42 is dropped so as to cover the emission window 34 and to fill the environmental cell hole 22 c 1.
(第1の基板と第2の基板の重ね合わせ工程S3)
この工程では、図9に示すように、第1の基板21と第2の基板22を充填媒体42が混じり合うように重ね合わせる。矢印が重ね合わせる方向である。Oリング37が配置されているので、充填媒体42の漏れは防止される。
(First substrate and second substrate superposition step S3)
In this step, as shown in FIG. 9, the first substrate 21 and the second substrate 22 are overlaid so that the filling medium 42 is mixed. The direction in which the arrows overlap. Since the O-ring 37 is arranged, leakage of the filling medium 42 is prevented.
図10に示すように、第1の基板21と第2の基板22を重ね合わせたときに、第2の基板に設けられた充填媒体排出用孔部22c2及び封止シール38Aの孔部38Acを介して、余分な充填媒体42が排出される。
次に、図11に示すように、排出された充填媒体42を、ろ紙等で除去する。
As shown in FIG. 10, when the first substrate 21 and the second substrate 22 are overlapped, the filling medium discharge hole 22c2 and the hole 38Ac of the sealing seal 38A provided in the second substrate are formed. Accordingly, the excess filling medium 42 is discharged.
Next, as shown in FIG. 11, the discharged filling medium 42 is removed with filter paper or the like.
次に、図12に示すように、封止シール38Aに重ねるようにして、別の封止シール38Bを接着して、環境セル内部を外部から完全に隔離・密閉する。封止シール38A、38Bの材料はポリイミドである。
同じ材質同士であれば短時間に高強度で接着する接着剤が広く存在するので、封止シール同士を重ねて接着することにより、短時間でかつ確実に密閉することができる。
Next, as shown in FIG. 12, another sealing seal 38B is adhered so as to overlap the sealing seal 38A, thereby completely isolating and sealing the inside of the environmental cell from the outside. The material of the sealing seals 38A and 38B is polyimide.
Since there are a wide variety of adhesives that can be bonded with high strength in a short time if they are made of the same material, the sealing seals can be sealed in a short time and reliably by overlapping the sealing seals.
重ね合わせる工程S3後、第1の基板と第2の基板を第3の基板にねじ止め固定することが好ましい。これにより、環境セル12、特に、空間部19を安定保持できる。
以上の工程により、試料含有環境セルを容易に、短時間で作製できる。
試料含有環境セルにより、無機、有機、半導体など様々な組成の粒子を任意の溶液あるいは気体中で観察することができる。
After the superimposing step S3, the first substrate and the second substrate are preferably screwed and fixed to the third substrate. Thereby, the environmental cell 12, especially the space part 19, can be stably held.
Through the above steps, the sample-containing environmental cell can be easily produced in a short time.
With the sample-containing environment cell, particles of various compositions such as inorganic, organic, and semiconductor can be observed in an arbitrary solution or gas.
<試料含有環境セル作製方法2:試料が生きた細胞である場合>
次に、本発明の実施形態である試料含有環境セル作製方法であって、試料が生きた細胞である場合について説明する。
図13〜18は、本発明の実施形態である試料含有環境セル作製方法の一例を示す工程図である。
本発明の実施形態である試料含有環境セル作製方法は、第1の基板の入射窓への試料付着・充填媒体滴下工程S1が異なる。
<Sample-containing environmental cell preparation method 2: When the sample is a living cell>
Next, a sample-containing environmental cell manufacturing method according to an embodiment of the present invention, in which the sample is a living cell, will be described.
13 to 18 are process diagrams showing an example of a sample-containing environment cell manufacturing method according to an embodiment of the present invention.
The sample-containing environmental cell manufacturing method according to the embodiment of the present invention is different in the sample attachment / filling medium dropping step S1 to the entrance window of the first substrate.
まず、一面側と他面側を連通する孔部35cを有するフレーム部35の一面側に入射窓30を設けた第1の基板21を用意する。フレーム部35は第1の基板21の孔部21c1に外周側で接着され、固定されている。また、第1の基板21は、基板本体部21Aにねじ用の孔部21c2が備えられている。入射窓30は、フレーム基板35の一面側に接着された構造層31と構造層31の他面側に接着された発光層32とから構成されている。 First, the 1st board | substrate 21 which provided the entrance window 30 in the one surface side of the flame | frame part 35 which has the hole 35c which connects the one surface side and the other surface side is prepared. The frame portion 35 is bonded and fixed to the hole portion 21c1 of the first substrate 21 on the outer peripheral side. Further, the first substrate 21 is provided with a screw hole 21c2 in the substrate body 21A. The incident window 30 includes a structural layer 31 adhered to one surface side of the frame substrate 35 and a light emitting layer 32 adhered to the other surface side of the structural layer 31.
次に、図13に示すように、第1の基板21上に、シリコーンリング45を配置する。シリコーンリング45は、シリコーン特有の付着力で第1の基板21に密着する。
次に、別のフラスコで培養していた細胞47を培養液46に懸濁させた状態でシリコーンリング45のリング内に滴下する。図14に示すように、シリコーンリング45のリング内に滴下した培養液46中、細胞47は浮遊する。
Next, as shown in FIG. 13, the silicone ring 45 is disposed on the first substrate 21. The silicone ring 45 adheres to the first substrate 21 with an adhesive force unique to silicone.
Next, the cells 47 cultured in another flask are dropped into the ring of the silicone ring 45 while being suspended in the culture solution 46. As shown in FIG. 14, the cells 47 float in the culture solution 46 dropped into the ring of the silicone ring 45.
時間とともに、細胞47は次第に沈降し、図15に示すように、第1の基板21、入射窓30の他面側及びフレーム部35に付着する。細胞47はこれらに付着した状態で成長を始め、正常な状態となる。
次に、図16に示すように、培養液46を充填液体42に交換する。充填液体42中、細胞47は数時間生き続ける。
次に、図17に示すように、シリコーンリング45を取り除く。
As time passes, the cells 47 gradually settle and adhere to the first substrate 21, the other surface side of the entrance window 30, and the frame portion 35 as shown in FIG. 15. The cells 47 start to grow while attached to these cells, and become normal.
Next, as shown in FIG. 16, the culture solution 46 is replaced with the filling liquid 42. In the filling liquid 42, the cells 47 remain alive for several hours.
Next, as shown in FIG. 17, the silicone ring 45 is removed.
図5に示す入射窓30の他面側にナノ粒子の試料を付着させた第1の基板の代わりに、図17に示す細胞の試料を付着させた基板を用いるほかは、ナノ粒子の試料含有環境セル作製方法と同様にして、細胞の試料含有環境セルを容易に、短時間で作製できる。
図18は、生きた細胞の試料含有環境セルの一例を示す図である。
In place of the first substrate with the nanoparticle sample attached to the other surface side of the entrance window 30 shown in FIG. 5, a substrate with the cell sample shown in FIG. 17 is used. In the same manner as the environmental cell manufacturing method, a cell sample-containing environmental cell can be easily manufactured in a short time.
FIG. 18 is a diagram showing an example of a sample-containing environment cell of a living cell.
これにより、これまで超解像光学観察のできなかった、液中の無染色の非固定の生物試料を近接場光学観察できる。
無染色、非固定に限らず、染色した細胞、固定した細胞も対象とすることができる。また、バクテリア、ウィルス、細胞壁を有する酵母細胞などの生物試料を、液中ではなく、空気や任意の組成の気体中で観察することもできる。
This makes it possible to perform near-field optical observation of an unstained, non-fixed biological sample in the liquid, which has not been possible with super-resolution optical observation until now.
Not only unstained and non-fixed but also stained cells and fixed cells can be targeted. In addition, biological samples such as bacteria, viruses, and yeast cells having cell walls can be observed not in liquid but in air or a gas of any composition.
<走査電子光学顕微鏡の使用方法>
本発明の実施形態である走査電子光学顕微鏡の使用方法は、走査電子光学顕微鏡101の使用方法である。
0.8kV以上1.2kV以下のエネルギーの電子線を環境セルの入射窓に照射する。0.8kV以上1.2kV以下のエネルギーは、このエネルギーの電子線は、入射窓を透過できず、空間部内の、液中の、無染色の、非固定の生物試料を痛めたり、破壊することなく、高分解能で光学観察することができる。
<How to use a scanning electron optical microscope>
The usage method of the scanning electron optical microscope according to the embodiment of the present invention is a usage method of the scanning electron optical microscope 101.
An incident beam of an environmental cell is irradiated with an electron beam having an energy of 0.8 kV or more and 1.2 kV or less. When the energy is 0.8 kV or more and 1.2 kV or less, the electron beam of this energy cannot penetrate the incident window, and damages or destroys the unstained, unfixed biological sample in the liquid in the space. And high-resolution optical observation.
(本発明の第2の実施形態)
次に、本発明の第2の実施形態である走査電子光学顕微鏡について説明する。
図19は、本発明の第2の実施形態である走査電子光学顕微鏡の一例を示す模式図である。
図19に示すように、本発明の第2の実施形態である走査電子光学顕微鏡1102は、環境セル12と発光測定モジュール13との間に光路システム1201を有しており、発光測定モジュール13が真空槽の外に配置されている他は本発明の第1の実施形態である走査電子光学顕微鏡101と同様の構成とされている。
近接場光学観察装置1211は、環境セル12と発光測定モジュール13と光路システム1201とから構成されている。
(Second embodiment of the present invention)
Next, a scanning electron optical microscope that is a second embodiment of the present invention will be described.
FIG. 19 is a schematic diagram showing an example of a scanning electron optical microscope according to the second embodiment of the present invention.
As shown in FIG. 19, the scanning electron optical microscope 1102 according to the second embodiment of the present invention has an optical path system 1201 between the environmental cell 12 and the light emission measurement module 13. Other than the arrangement outside the vacuum chamber, the configuration is the same as that of the scanning electron optical microscope 101 according to the first embodiment of the present invention.
The near-field optical observation device 1211 includes an environment cell 12, a light emission measurement module 13, and an optical path system 1201.
環境セル12と発光測定モジュール13は離間して配置されており、発光測定モジュール13は真空槽の外部に配置されている。これにより、発光測定モジュール13として、PMTだけでなく、分光測定システムや多波長発光測定モジュールなどの複雑なモジュールを利用できる。 The environmental cell 12 and the luminescence measurement module 13 are arranged apart from each other, and the luminescence measurement module 13 is arranged outside the vacuum chamber. As a result, not only the PMT but also a complex module such as a spectroscopic measurement system or a multiwavelength light emission measurement module can be used as the light emission measurement module 13.
環境セル12の出射窓側と発光測定モジュール13の光電面とを結ぶ光路システム1201が設けられている。光路システム1201により、出射光は、効率よく発光測定モジュールに伝えられる。 An optical path system 1201 that connects the exit window side of the environmental cell 12 and the photocathode of the light emission measurement module 13 is provided. By the optical path system 1201, the emitted light is efficiently transmitted to the light emission measurement module.
光路システム1201は、レンズと、ミラーと、光ファイバの群から選択される二以上の光部品を組み合わせて形成されている。
具体的には、光路システム1201において、環境セル12から発せられた光は、色収差補正対物レンズ1122にて一度平行光にされ、ミラー1119で向きを変えて再度色収差補正レンズ1123にて光ファイバ1125端面に集光される。光ファイバ1125はフィードスルーを介して真空槽外に接続されており、大気下に置いた発光測定モジュール13に光を入射される。
なお、光路システム1201のうち色収差補正対物レンズ1122、ミラー1119、色収差補正レンズ1123は保持部109に取り付けられている。
The optical path system 1201 is formed by combining two or more optical components selected from the group of a lens, a mirror, and an optical fiber.
Specifically, in the optical path system 1201, the light emitted from the environment cell 12 is once converted into parallel light by the chromatic aberration correction objective lens 1122, changed in direction by the mirror 1119, and again by the chromatic aberration correction lens 1123 by the optical fiber 1125. It is condensed on the end face. The optical fiber 1125 is connected to the outside of the vacuum chamber through a feedthrough, and light is incident on the light emission measurement module 13 placed in the atmosphere.
In the optical path system 1201, the chromatic aberration correction objective lens 1122, the mirror 1119, and the chromatic aberration correction lens 1123 are attached to the holding unit 109.
発光測定モジュール13として分光測定システムを用いると、2次元的な画像情報に加えて、スペクトルの観点からも試料を分析することができる。試料がまったく吸収を示さない場合には、観測されるスペクトルは単に発光層のCLスペクトルとなる。試料が特定の波長を吸収すれば、その波長の強度は減少するので、試料の吸収スペクトル情報を含んだ近接場光学像を取得することができる。 When a spectroscopic measurement system is used as the luminescence measurement module 13, in addition to two-dimensional image information, a sample can be analyzed from the viewpoint of spectrum. If the sample shows no absorption, the observed spectrum is simply the CL spectrum of the light emitting layer. If the sample absorbs a specific wavelength, the intensity of the wavelength decreases, so that a near-field optical image including absorption spectrum information of the sample can be acquired.
発光測定モジュール13として多波長発光測定モジュールを用いると、カラー画像を観察できる。
図20は、多波長発光測定モジュールの一例を示す模式図である。
図20に示すように、光ファイバ1125からの光をレンズ1121で平行光に変換し、ダイクロイックミラー1117、1118で、青、緑、赤の3つの光路に分割する。それぞれの先に、光検出器1113、1114、1115を設けることにより、カラーの近接場光学観察が可能となる。
このような複雑なモジュールを狭隘なSEMの試料室に直接組み込むのは困難であるが、光ファイバ1125を介して光信号を真空槽外に取り出すことにより、発光測定モジュール13のスペースの制約がなくなり、このような自由度を得ることができる。
When a multi-wavelength light emission measurement module is used as the light emission measurement module 13, a color image can be observed.
FIG. 20 is a schematic diagram illustrating an example of a multiwavelength light emission measurement module.
As shown in FIG. 20, light from an optical fiber 1125 is converted into parallel light by a lens 1121, and divided into three optical paths of blue, green, and red by dichroic mirrors 1117 and 1118. Providing the photodetectors 1113, 1114, and 1115 in front of each enables color near-field optical observation.
Although it is difficult to directly incorporate such a complex module into a narrow SEM sample chamber, by taking out an optical signal through the optical fiber 1125 to the outside of the vacuum chamber, there is no restriction on the space of the light emission measurement module 13. Such a degree of freedom can be obtained.
(本発明の第3の実施形態)
次に、本発明の第3の実施形態である走査電子光学顕微鏡について説明する。
図21は、本発明の第3の実施形態である走査電子光学顕微鏡に備えられる環境セルの一例を示す模式図である。本発明の第3の実施形態である走査電子光学顕微鏡は、図21に示す環境セルを備える他は本発明の第1の実施形態である走査電子光学顕微鏡101と同様の構成とされている。
(Third embodiment of the present invention)
Next, a scanning electron optical microscope that is a third embodiment of the present invention will be described.
FIG. 21 is a schematic diagram showing an example of an environmental cell provided in the scanning electron optical microscope according to the third embodiment of the present invention. The scanning electron optical microscope according to the third embodiment of the present invention has the same configuration as that of the scanning electron optical microscope 101 according to the first embodiment of the present invention, except that the environment cell shown in FIG. 21 is provided.
図21に示すように、環境セル2012は、電子線側から、メッシュ状のフレーム部2035、入射窓2030、スペーサー2055、出射窓2034、支持基板2051が積層されて構成されている。
入射窓2030は、帯電防止層2053、発光層2052とから構成されている。
空間部2019内では、試料2041は発光層側に配置されており、充填媒体2042が充填されている。
図21では、スペーサーと出射窓との間は接着剤で接合しているが、スペーサーと出射窓との間にOリングを挟みこんだ状態で、先に記載のねじ止めにより、固定してもよい。
As shown in FIG. 21, the environmental cell 2012 is configured by laminating a mesh-shaped frame portion 2035, an incident window 2030, a spacer 2055, an emission window 2034, and a support substrate 2051 from the electron beam side.
The incident window 2030 includes an antistatic layer 2053 and a light emitting layer 2052.
In the space 2019, the sample 2041 is arranged on the light emitting layer side and is filled with a filling medium 2042.
In FIG. 21, the spacer and the exit window are joined with an adhesive. However, even if the O-ring is sandwiched between the spacer and the exit window, the spacer and the exit window may be fixed by screwing as described above. Good.
メッシュ状のフレーム部2035の材料としては、ステンレスを挙げることができる。膜厚は1〜100μmとする。開口は、例えば、正方形とし、1辺100〜1000μmとする。
発光層2052の材料としては、ポリイミドメンブレンを挙げることができる。膜厚は100〜1000nmとする。電子線照射により、ポリイミドは、ピーク波長550nmの蛍光を発するので、これを光源にできる。
出射窓の材料としては、PETフィルムを挙げることができる。膜厚は1〜10μmとする。
帯電防止層2053の材料としては、カーボンを挙げることができる。膜厚は1〜100nmとする。これにより、ポリイミドの帯電を防止できる。
スペーサー2055はリング状の部品であり、スペーサー2055の材料としては、ポリスチレン、SUS、Al、Cuを挙げることができる。これにより、環境セルの空間部を気密性を保ちつつ機械的に安定に維持できる。
充填媒体2042としては、空気を挙げることができる。
As a material of the mesh-shaped frame portion 2035, stainless steel can be used. The film thickness is 1 to 100 μm. The opening is, for example, a square and has a side of 100 to 1000 μm.
As a material of the light emitting layer 2052, a polyimide membrane can be given. The film thickness is 100 to 1000 nm. Since polyimide emits fluorescence having a peak wavelength of 550 nm by electron beam irradiation, it can be used as a light source.
An example of the material of the exit window is a PET film. The film thickness is 1 to 10 μm.
An example of the material for the antistatic layer 2053 is carbon. The film thickness is 1 to 100 nm. Thereby, charging of polyimide can be prevented.
The spacer 2055 is a ring-shaped component, and examples of the material of the spacer 2055 include polystyrene, SUS, Al, and Cu. Thereby, the space part of an environmental cell can be maintained mechanically stably, maintaining airtightness.
An example of the filling medium 2042 is air.
以上の構成により、1.0〜5.0kVの低電子線エネルギーの電子線を入射窓に照射し、入射窓で電子線励起発光させた光源の光を、試料の中を透過させ、出射窓側からPMT等の発光測定モジュールにより近接場光学観察をすることができる。 With the above configuration, the incident window is irradiated with an electron beam having a low electron beam energy of 1.0 to 5.0 kV, the light of the light source excited and emitted by the incident window is transmitted through the sample, and the emission window side. The near-field optical observation can be performed by a light emission measuring module such as PMT.
(本発明の第4〜8の実施形態)
次に、本発明の第4〜8の実施形態である走査電子光学顕微鏡について説明する。
図22(b)〜(e)は、本発明の第4〜8の実施形態である走査電子光学顕微鏡に備えられる環境セルの一例を示す模式図である。本発明の第4〜8の実施形態である走査電子光学顕微鏡は、図22(b)〜(e)に示す環境セルを備える他は本発明の第1の実施形態である走査電子光学顕微鏡101と同様の構成とされている。なお、比較のため、図22(a)に、本発明の第1の実施形態である走査電子光学顕微鏡101の環境セルを示している。
(Fourth to eighth embodiments of the present invention)
Next, scanning electron optical microscopes according to fourth to eighth embodiments of the present invention will be described.
FIGS. 22B to 22E are schematic views showing an example of an environmental cell provided in a scanning electron optical microscope that is the fourth to eighth embodiments of the present invention. A scanning electron optical microscope 101 according to the fourth to eighth embodiments of the present invention is provided with the environmental cell shown in FIGS. 22B to 22E, and the scanning electron optical microscope 101 according to the first embodiment of the present invention. It is set as the same structure. For comparison, FIG. 22A shows an environmental cell of the scanning electron optical microscope 101 according to the first embodiment of the present invention.
図22(b)は、本発明の第4の実施形態である走査電子光学顕微鏡に備えられる環境セルの一例を示す模式図である。本発明の第4の実施形態である走査電子光学顕微鏡の環境セル12Dは、構造層と発光層の積層順序が逆の他は本発明の第1の実施形態である走査電子光学顕微鏡101の環境セル12と同様の構成とされている。 FIG. 22B is a schematic diagram illustrating an example of an environmental cell provided in the scanning electron optical microscope according to the fourth embodiment of the present invention. The environment cell 12D of the scanning electron optical microscope according to the fourth embodiment of the present invention is the environment of the scanning electron optical microscope 101 according to the first embodiment of the present invention except that the stacking order of the structural layer and the light emitting layer is reversed. The configuration is the same as that of the cell 12.
図22(c)は、本発明の第5の実施形態である走査電子光学顕微鏡に備えられる環境セルの一例を示す模式図である。本発明の第5の実施形態である走査電子光学顕微鏡の環境セル12Eは、構造層と発光層の代わりに、発光層を兼ねる構造層が備えられている他は本発明の第1の実施形態である走査電子光学顕微鏡101の環境セル12と同様の構成とされている。 FIG. 22C is a schematic diagram illustrating an example of an environmental cell provided in a scanning electron optical microscope according to the fifth embodiment of the present invention. The environmental cell 12E of the scanning electron optical microscope according to the fifth embodiment of the present invention is provided with a structural layer that also serves as a light emitting layer instead of the structural layer and the light emitting layer. It is set as the structure similar to the environmental cell 12 of the scanning electron optical microscope 101 which is.
図22(d)は、本発明の第6の実施形態である走査電子光学顕微鏡に備えられる環境セルの一例を示す模式図である。本発明の第6の実施形態である走査電子光学顕微鏡の環境セル12Fは、構造層の一面側にフレーム部が設けられている他は本発明の第1の実施形態である走査電子光学顕微鏡101の環境セル12と同様の構成とされている。 FIG. 22D is a schematic diagram showing an example of an environmental cell provided in the scanning electron optical microscope according to the sixth embodiment of the present invention. An environmental cell 12F of a scanning electron optical microscope according to the sixth embodiment of the present invention has a scanning electron optical microscope 101 according to the first embodiment of the present invention, except that a frame portion is provided on one surface side of the structural layer. The environmental cell 12 has the same configuration.
図22(e)は、本発明の第7の実施形態である走査電子光学顕微鏡に備えられる環境セルの一例を示す模式図である。本発明の第7の実施形態である走査電子光学顕微鏡の環境セル12Gは、構造層と発光層の積層順序が逆の他は本発明の第6の実施形態である走査電子光学顕微鏡の環境セル12Fと同様の構成とされている。 FIG. 22E is a schematic diagram showing an example of an environmental cell provided in the scanning electron optical microscope according to the seventh embodiment of the present invention. The environmental cell 12G of the scanning electron optical microscope according to the seventh embodiment of the present invention is the environmental cell of the scanning electron optical microscope according to the sixth embodiment of the present invention except that the stacking order of the structural layer and the light emitting layer is reversed. The configuration is the same as 12F.
図22(e)は、本発明の第8の実施形態である走査電子光学顕微鏡に備えられる環境セルの一例を示す模式図である。本発明の第8の実施形態である走査電子光学顕微鏡の環境セル12Hは、構造層と発光層の代わりに、発光層を兼ねる構造層が備えられている他は本発明の第7の実施形態である走査電子光学顕微鏡の環境セル12Gと同様の構成とされている。 FIG. 22E is a schematic view showing an example of an environmental cell provided in the scanning electron optical microscope according to the eighth embodiment of the present invention. The environmental cell 12H of the scanning electron optical microscope according to the eighth embodiment of the present invention is provided with a structural layer that also serves as a light emitting layer instead of the structural layer and the light emitting layer, and is the seventh embodiment of the present invention. It is set as the structure similar to the environment cell 12G of the scanning electron optical microscope which is.
(本発明の第9、10の実施形態)
次に、本発明の第9、10の実施形態である走査電子光学顕微鏡について説明する。
図23(d)〜(f)、(g)〜(i)は、本発明の第9、10の実施形態である走査電子光学顕微鏡に備えられる環境セルの構造層とフレーム部の組み合わせの一例を示す模式図である。本発明の第9、10の実施形態である走査電子光学顕微鏡は、図23(d)〜(f)、(g)〜(i)に示す環境セルの構造層とフレーム部の組み合わせを備える他は本発明の第1の実施形態である走査電子光学顕微鏡101と同様の構成とされている。 なお、比較のため、図23(a)〜(c)に、本発明の第1の実施形態である走査電子光学顕微鏡101の環境セルの構造層とフレーム部の組み合わせを示している。
なお、図23(a)、(d)、(g)が平面図であり、図23(b)、(e)、(h)が平面図(a)、(d)、(g)の背面図であり、図23(c)、(f)、(i)が平面図(a)、(d)、(g)の一点鎖線における断面図である。
(Ninth and Tenth Embodiments of the Present Invention)
Next, scanning electron optical microscopes according to ninth and tenth embodiments of the present invention will be described.
23 (d) to (f) and (g) to (i) are examples of a combination of a structural layer and a frame portion of an environmental cell included in a scanning electron optical microscope according to the ninth and tenth embodiments of the present invention. It is a schematic diagram which shows. The scanning electron optical microscope according to the ninth and tenth embodiments of the present invention includes a combination of the structural layer and the frame portion of the environmental cell shown in FIGS. 23 (d) to (f) and (g) to (i). Is configured similarly to the scanning electron optical microscope 101 according to the first embodiment of the present invention. For comparison, FIGS. 23A to 23C show a combination of the structural layer and the frame portion of the environmental cell of the scanning electron optical microscope 101 according to the first embodiment of the present invention.
23 (a), (d), and (g) are plan views, and FIGS. 23 (b), (e), and (h) are rear views of the plan views (a), (d), and (g). 23 (c), (f), and (i) are cross-sectional views taken along one-dot chain lines in plan views (a), (d), and (g).
図23(d)〜(f)は、本発明の第9の実施形態である走査電子光学顕微鏡に備えられる環境セルの構造層とフレーム部の組み合わせの一例を示す模式図である。本発明の第9の実施形態である走査電子光学顕微鏡の環境セルの構造層とフレーム部の組み合わせはフレーム部に孔部が3×3で形成されている他は本発明の第1の実施形態である走査電子光学顕微鏡の環境セルの構造層とフレーム部の組み合わせと同様の構成とされている。 FIGS. 23D to 23F are schematic views showing an example of a combination of a structural layer and a frame portion of an environmental cell provided in a scanning electron optical microscope according to the ninth embodiment of the present invention. The combination of the structural layer and the frame part of the environmental cell of the scanning electron optical microscope according to the ninth embodiment of the present invention is the same as that of the first embodiment of the present invention except that the hole is formed by 3 × 3 in the frame part. The configuration is the same as the combination of the structural layer and the frame portion of the environmental cell of the scanning electron optical microscope.
図23(g)〜(i)は、本発明の第10の実施形態である走査電子光学顕微鏡に備えられる環境セルの構造層とフレーム部の組み合わせの一例を示す模式図である。本発明の第10の実施形態である走査電子光学顕微鏡の環境セルの構造層とフレーム部の組み合わせは、帯電防止層が省略されている他は本発明の第3の実施形態である走査電子光学顕微鏡の環境セルの構造層とフレーム部の組み合わせと同様の構成とされている。 FIGS. 23G to 23I are schematic views showing an example of a combination of a structural layer and a frame portion of an environmental cell provided in a scanning electron optical microscope according to the tenth embodiment of the present invention. The scanning electron optical microscope according to the third embodiment of the present invention is the same as the combination of the structural layer and the frame portion of the environmental cell of the scanning electron optical microscope according to the tenth embodiment of the present invention except that the antistatic layer is omitted. The structure is the same as the combination of the structural layer and the frame part of the environmental cell of the microscope.
本発明の実施形態である近接場光学観察装置11は、試料を密封保持可能な空間部19と、空間部19の一方に設けられた入射窓30と、空間部19の他方に設けられた出射窓34とを備えた環境セル12と、発光測定モジュールとを有し、前記入射窓が電子線励起により発光可能な発光材料を有している構成なので、環境セルに保持することにより、真空槽内でも液中の、無染色の、非固定の生物試料を測定対象とすることができ、環境セルの窓内の蛍光材料のカソードルミネッセンス光を近接場光源として利用することにより、高分解能で光学観察することができる。 A near-field optical observation apparatus 11 according to an embodiment of the present invention includes a space 19 that can hold a sample in a sealed state, an incident window 30 provided in one of the spaces 19, and an exit provided in the other of the spaces 19. Since the environment cell 12 including the window 34 and the light emission measurement module are included, and the incident window has a light emitting material capable of emitting light by electron beam excitation, the vacuum chamber is obtained by holding the environment cell. It is possible to measure non-stained, non-fixed biological samples in the liquid, and use high-resolution optics by using the cathodoluminescence light of the fluorescent material in the window of the environmental cell as a near-field light source. Can be observed.
本発明の実施形態である近接場光学観察装置11は、入射窓30に接するようにフレーム部35が設けられている構成なので、閉じた環境セル内であって、入射窓と出射窓の間に、液中の、無染色の、非固定の生物試料を保持することができ、高分解能で光学観察することができる。 The near-field optical observation apparatus 11 according to the embodiment of the present invention has a configuration in which the frame portion 35 is provided so as to be in contact with the entrance window 30, so that it is in a closed environmental cell and between the entrance window and the exit window. It is possible to hold an unstained, non-fixed biological sample in the liquid and optically observe with high resolution.
本発明の実施形態である近接場光学観察装置11は、フレーム部35に一面側と他面側を連通するように孔部35cが形成されている構成なので、閉じた環境セル内であって、入射窓と出射窓の間に、液中の、無染色の、非固定の生物試料を保持することができ、高分解能で光学観察することができる。 Since the near-field optical observation apparatus 11 according to the embodiment of the present invention is configured so that the hole 35c is formed in the frame portion 35 so as to communicate the one surface side and the other surface side, An unstained, non-fixed biological sample in the liquid can be held between the entrance window and the exit window, and optical observation can be performed with high resolution.
本発明の実施形態である近接場光学観察装置11は、フレーム部35の一面側に入射窓30が設けられている構成なので、閉じた環境セル内であって、入射窓と出射窓の間に、液中の、無染色の、非固定の生物試料を保持することができ、高分解能で光学観察することができる。 Since the near-field optical observation apparatus 11 according to the embodiment of the present invention has a configuration in which the incident window 30 is provided on one surface side of the frame portion 35, the near-field optical observation apparatus 11 is in a closed environment cell and between the incident window and the emission window. It is possible to hold an unstained, non-fixed biological sample in the liquid and optically observe with high resolution.
本発明の実施形態である近接場光学観察装置11は、孔部35が空間部19の一部である構成なので、閉じた環境セル内であって、入射窓と出射窓の間に、液中の、無染色の、非固定の生物試料を保持することができ、高分解能で光学観察することができる。 The near-field optical observation apparatus 11 according to the embodiment of the present invention has a configuration in which the hole portion 35 is a part of the space portion 19, so that it is in a closed environmental cell and is in a liquid between the entrance window and the exit window. Thus, an unstained, non-fixed biological sample can be held and optically observed with high resolution.
本発明の実施形態である近接場光学観察装置は、フレーム部2035の他面側に入射窓2030が設けられている構成なので、閉じた環境セル内であって、入射窓と出射窓の間に、液中の、無染色の、非固定の生物試料を保持することができ、高分解能で光学観察することができる。 Since the near-field optical observation apparatus according to the embodiment of the present invention has a configuration in which the incident window 2030 is provided on the other surface side of the frame portion 2035, it is in a closed environment cell and between the incident window and the emission window. It is possible to hold an unstained, non-fixed biological sample in the liquid and optically observe with high resolution.
本発明の実施形態である近接場光学観察装置11は、前記フレーム部の他面側に又は前記他面側に離間して出射窓が設けられている構成なので、閉じた環境セル内であって、入射窓と出射窓の間に、液中の、無染色の、非固定の生物試料を保持することができ、高分解能で光学観察することができる。 The near-field optical observation device 11 according to an embodiment of the present invention is configured to have an exit window provided on the other surface side of the frame portion or spaced apart from the other surface side. The unstained, non-fixed biological sample in the liquid can be held between the entrance window and the exit window, and optical observation can be performed with high resolution.
本発明の実施形態である近接場光学観察装置11は、フレーム部12の一面側と他面側を連通する前記孔部が、入射窓側から出射窓側に向けて広がるよう形成されている構成なので、近接場光源から試料を透過して出射される光を効率よくとらえて、液中の、無染色の、非固定の生物試料を高分解能で光学観察することができる。 The near-field optical observation device 11 according to the embodiment of the present invention has a configuration in which the hole portion that communicates the one surface side and the other surface side of the frame portion 12 is formed so as to spread from the entrance window side toward the exit window side. By efficiently capturing light emitted from the near-field light source through the sample, an unstained, non-fixed biological sample in the liquid can be optically observed with high resolution.
本発明の実施形態である近接場光学観察装置11は、孔部35cに面する前記フレーム部の壁面が光反射性の高い材料で被覆されている構成なので、環境セル内の試料に影響を与えず、液中の、無染色の、非固定の生物試料を高分解能で光学観察することができる。 The near-field optical observation apparatus 11 according to the embodiment of the present invention has a configuration in which the wall surface of the frame portion facing the hole portion 35c is covered with a highly light-reflective material, and thus affects the sample in the environmental cell. First, an unstained, non-fixed biological sample in the liquid can be optically observed with high resolution.
本発明の実施形態である近接場光学観察装置11は、入射窓30が、2層以上で形成されており、高強度材料からなる構造層31と、前記構造層に積層され、電子線励起により発光可能な発光材料を有している発光層32と、を有している構成なので、構造層により環境セルの強度を確保する一方、発光層内で近接場光源を形成して、液中の、無染色の、非固定の生物試料を高分解能で光学観察することができる。 In the near-field optical observation apparatus 11 according to an embodiment of the present invention, the entrance window 30 is formed of two or more layers, and is laminated on the structural layer 31 made of a high-strength material and excited by electron beam. And a light emitting layer 32 having a light emitting material capable of emitting light, so that the strength of the environmental cell is secured by the structural layer, while a near-field light source is formed in the light emitting layer, An unstained, non-fixed biological sample can be optically observed with high resolution.
本発明の実施形態である近接場光学観察装置は、発光層2052自体が、電子線励起により発光可能な発光材料からなる構成なので、環境セル内の試料に影響を与えず、液中の、無染色の、非固定の生物試料を高分解能で光学観察することができる。 In the near-field optical observation apparatus according to the embodiment of the present invention, the light-emitting layer 2052 itself is made of a light-emitting material that can emit light by electron beam excitation. Stained, non-fixed biological samples can be optically observed with high resolution.
本発明の実施形態である近接場光学観察装置11は、発光層32が、前記発光材料に電子線励起により発光可能な別の発光材料が添加されて形成されている構成なので、環境セル内の試料に影響を与えず、液中の、無染色の、非固定の生物試料を高分解能で光学観察することができる。 The near-field optical observation apparatus 11 according to the embodiment of the present invention has a configuration in which the light emitting layer 32 is formed by adding another light emitting material capable of emitting light by electron beam excitation to the light emitting material. An unstained, non-fixed biological sample in the liquid can be optically observed with high resolution without affecting the sample.
本発明の実施形態である近接場光学観察装置11は、構造層31が、SiN、SiO2、SiC,Si、ポリイミド、パリレン、カーボン、コロジオン、フォルムバール、トリアセチルセルロースのいずれかの高強度材料からなるメンブレンである構成なので、環境セルの強度を確保でき、真空中でも環境セルを破裂させることなく、安定して、無染色の、非固定の生物試料を高分解能で光学観察することができる。 In the near-field optical observation apparatus 11 according to the embodiment of the present invention, the structural layer 31 is a high-strength material of any one of SiN, SiO 2 , SiC, Si, polyimide, parylene, carbon, collodion, formval, and triacetylcellulose. Therefore, the strength of the environmental cell can be secured, and a stable, unstained, non-fixed biological sample can be optically observed with high resolution without rupturing the environmental cell even in a vacuum.
本発明の実施形態である近接場光学観察装置11は、入射窓39の膜厚30tが、5nm以上500nm以下である構成なので、環境セル内の近接場光源から発光測定モジュールまでの距離を短くして、液中の、無染色の、非固定の生物試料を高分解能で光学観察することができる。 The near-field optical observation apparatus 11 according to the embodiment of the present invention has a configuration in which the film thickness 30t of the incident window 39 is 5 nm or more and 500 nm or less, so the distance from the near-field light source in the environmental cell to the luminescence measurement module is shortened. Thus, an unstained, non-fixed biological sample in the liquid can be optically observed with high resolution.
本発明の実施形態である近接場光学観察装置11は、出射窓34が、ガラス、ポリエステル、ポリイミド、SiN、SiO2、SiC,Si、パリレン、カーボン、コロジオン、フォルムバール、トリアセチルセルロースのいずれかの材料からなる構成なので、近接場光源からの出射光を効率よく発光測定モジュールに伝え、液中の、無染色の、非固定の生物試料を高分解能で光学観察することができる。 In the near-field optical observation apparatus 11 according to the embodiment of the present invention, the exit window 34 is any one of glass, polyester, polyimide, SiN, SiO 2 , SiC, Si, parylene, carbon, collodion, formbar, and triacetyl cellulose. Therefore, the emitted light from the near-field light source can be efficiently transmitted to the luminescence measurement module, and an unstained, non-fixed biological sample in the liquid can be optically observed with high resolution.
本発明の実施形態である近接場光学観察装置は、入射窓が複数設けられている構成なので、近接場光源からの出射光を効率よく発光測定モジュールに伝え、液中の、無染色の、非固定の生物試料を高分解能で光学観察することができる。 Since the near-field optical observation apparatus according to the embodiment of the present invention has a configuration in which a plurality of entrance windows are provided, the light emitted from the near-field light source is efficiently transmitted to the luminescence measurement module, and the non-stained, non-stained liquid is obtained. A fixed biological sample can be optically observed with high resolution.
本発明の実施形態である近接場光学観察装置11は、発光測定モジュール13が、前記環境セルの出射窓側に配置されている構成なので、液中の、無染色の、非固定の生物試料を高分解能で光学観察することができる。 The near-field optical observation apparatus 11 according to the embodiment of the present invention has a configuration in which the luminescence measurement module 13 is disposed on the exit window side of the environmental cell, so that an unstained, non-fixed biological sample in the liquid is high. Optical observation with resolution is possible.
本発明の実施形態である近接場光学観察装置1211は、発光測定モジュール13が、環境セル12と離間して配置されており、前記環境セルの出射窓側と前記発光測定モジュールの光電面とを結ぶ光路システム1202が設けられている構成なので、液中の、無染色の、非固定の生物試料を高分解能で光学観察することができる。 In the near-field optical observation device 1211 according to the embodiment of the present invention, the luminescence measurement module 13 is disposed away from the environment cell 12 and connects the exit window side of the environment cell and the photocathode of the luminescence measurement module. Since the optical path system 1202 is provided, an unstained, non-fixed biological sample in the liquid can be optically observed with high resolution.
本発明の実施形態である近接場光学観察装置1211は、光路システム1201が、レンズ1122、1123と、ミラー1119と、光ファイバ1125の群から選択される二以上の光部品を組み合わせて形成されている構成なので、液中の、無染色の、非固定の生物試料を高分解能で光学観察することができる。 In the near-field optical observation apparatus 1211 according to the embodiment of the present invention, the optical path system 1201 is formed by combining two or more optical components selected from the group of lenses 1122 and 1123, a mirror 1119, and an optical fiber 1125. Therefore, an unstained, non-fixed biological sample in the liquid can be optically observed with high resolution.
本発明の実施形態である近接場光学観察装置11、1211は、発光測定モジュール13が光電子倍増管を有するモジュール、分光測定システム、多波長発光測定モジュールのいずれかである構成なので、光電子倍増管を有するモジュールの場合には、近接場光源からの出射光を効率よく発光測定モジュールでとらえて、液中の、無染色の、非固定の生物試料を高分解能で光学観察することができ、2次元的な画像情報に加えて、スペクトルの観点からも試料を分析することができ、カラーの近接場光学観察が可能となる。 The near-field optical observation apparatuses 11 and 1211 according to the embodiments of the present invention have a configuration in which the light emission measurement module 13 is any one of a module having a photomultiplier tube, a spectroscopic measurement system, and a multiwavelength light emission measurement module. In the case of a module having a light source, the light emitted from the near-field light source can be efficiently captured by the light emission measurement module, and an unstained, non-fixed biological sample in the liquid can be optically observed with high resolution. In addition to typical image information, the sample can be analyzed from the viewpoint of spectrum, and color near-field optical observation becomes possible.
本発明の実施形態である試料含有環境セル作製方法は、一面側と他面側を連通する孔部を有するフレーム部の一面側または他面側に入射窓を設けた第1の基板を用意し、前記入射窓の他面側に試料を付着させてから、前記試料を覆うように充填媒体を滴下する工程S1と、出射窓を有する第2の基板を用意し、前記出射窓を覆うように充填媒体を滴下する工程S2と、前記第1の基板と前記第2の基板を充填媒体が混じり合うように重ね合わせる工程S3とを有する構成なので、入射窓に試料を付着させ、充填媒体で環境セル内を充填して、内部を閉じた系として、液中の、無染色の、非固定の生物試料を含有する環境セルを容易に作製できる。 In the sample-containing environmental cell manufacturing method according to the embodiment of the present invention, a first substrate provided with an entrance window on one side or the other side of a frame portion having a hole communicating with one side and the other side is prepared. A step S1 of dropping a filling medium so as to cover the sample after the sample is attached to the other surface side of the entrance window and a second substrate having an exit window are prepared, and the exit window is covered. Since the configuration includes the step S2 of dropping the filling medium and the step S3 of superimposing the first substrate and the second substrate so that the filling medium is mixed, the sample is attached to the incident window and the environment is filled with the filling medium. An environmental cell containing an unstained, non-fixed biological sample in a liquid can be easily prepared as a system in which the inside of the cell is filled and the inside is closed.
本発明の実施形態である試料含有環境セル作製方法は、充填媒体を滴下する工程S1の前工程として、高強度材料からなる構造層上に発光層をドロップ・コーティングして、入射窓を形成する構成なので、平滑で、均一な発光層を形成でき、液中の、無染色の、非固定の生物試料を高分解能で光学観察することができる。 In the sample-containing environmental cell manufacturing method according to the embodiment of the present invention, as a pre-process of the step S1 of dropping the filling medium, a light emitting layer is dropped and coated on a structural layer made of a high-strength material to form an incident window. Since it is configured, a smooth and uniform light emitting layer can be formed, and an unstained, non-fixed biological sample in the liquid can be optically observed with high resolution.
本発明の実施形態である試料含有環境セル作製方法は、重ね合わせる工程S3で、第1の基板又は第2の基板に設けられた充填媒体排出用孔部から、余分な充填媒体を排出・除去してから、前記充填媒体排出用孔部の充填媒体排出側に設けられた封止シールに別の封止シールを重ねて接着する構成なので、充填媒体で環境セル内を完全に充填した、液中の、無染色の、非固定の生物試料を含有する環境セルを容易に作製できる。 In the sample-containing environmental cell manufacturing method according to the embodiment of the present invention, the excess filling medium is discharged / removed from the filling medium discharging hole provided in the first substrate or the second substrate in the overlapping step S3. Then, another sealing seal is overlapped and adhered to the sealing seal provided on the filling medium discharge side of the filling medium discharge hole, so that the environment cell is completely filled with the filling medium. An environmental cell containing an unstained, non-fixed biological sample can be easily produced.
本発明の実施形態である試料含有環境セル作製方法は、重ね合わせる工程S3後、第1の基板と第2の基板を第3の基板にねじ止め固定する構成なので、内部を閉じた系として、真空槽内で破裂させることない、液中の、無染色の、非固定の生物試料を含有する環境セルを容易に作製できる。 Since the sample-containing environmental cell manufacturing method according to the embodiment of the present invention is configured to screw and fix the first substrate and the second substrate to the third substrate after the superimposing step S3, An environmental cell containing an unstained, non-fixed biological sample in a liquid that is not ruptured in a vacuum chamber can be easily produced.
本発明の実施形態である走査電子光学顕微鏡101、1102は、近接場光学観察装置11、1211と、電子顕微鏡とを有する構成なので、液中の、無染色の、非固定の生物試料を含有する環境セルが電子顕微鏡の真空槽内に配置され、液中の、無染色の、非固定の生物試料を高分解能で光学観察することができる。 Since the scanning electron optical microscopes 101 and 1102 according to the embodiment of the present invention include the near-field optical observation apparatuses 11 and 1211 and the electron microscope, they contain an unstained, non-fixed biological sample in the liquid. An environmental cell is placed in a vacuum chamber of an electron microscope, and an unstained, non-fixed biological sample in the liquid can be optically observed with high resolution.
本発明の実施形態である走査電子光学顕微鏡101は、近接場光学観察装置11が、電子顕微鏡の真空槽内に配置されている構成なので、液中の、無染色の、非固定の生物試料を高分解能で光学観察することができる。 Since the scanning electron optical microscope 101 which is an embodiment of the present invention has a configuration in which the near-field optical observation device 11 is disposed in a vacuum chamber of an electron microscope, an unstained, non-fixed biological sample in liquid is used. Optical observation can be performed with high resolution.
本発明の実施形態である走査電子光学顕微鏡101は、近接場光学観察装置11の環境セル12が、環境セル保持部110に保持されており、近接場光学観察装置11の発光測定モジュール13が、保持部109に保持されており、前記保持部に対して前記環境セル保持部の位置合わせ移動機構が備えられている構成なので、環境セル保持部を交換して、容易に試料交換ができる。 In the scanning electron optical microscope 101 according to the embodiment of the present invention, the environment cell 12 of the near-field optical observation apparatus 11 is held by the environment cell holding unit 110, and the light emission measurement module 13 of the near-field optical observation apparatus 11 is Since it is held by the holding unit 109 and is provided with a mechanism for aligning and moving the environmental cell holding unit with respect to the holding unit, the environmental cell holding unit can be replaced to easily change the sample.
本発明の実施形態である走査電子光学顕微鏡101は、前記位置合わせ移動機構により、前記保持部から前記環境セル保持部を取り外して、電子顕微鏡の真空槽103に接続された別の真空槽105に移動可能である構成なので、環境セル保持部を交換して、容易に試料交換ができる。 The scanning electron optical microscope 101 according to the embodiment of the present invention removes the environmental cell holding unit from the holding unit by the positioning movement mechanism and puts it in another vacuum chamber 105 connected to the vacuum chamber 103 of the electron microscope. Since the structure is movable, the sample can be easily exchanged by exchanging the environmental cell holder.
本発明の実施形態である走査電子光学顕微鏡の使用方法は、先に記載の走査電子光学顕微鏡の使用方法であって、環境セルの入射窓の電子線透過率が1%以下となるエネルギーの電子線を環境セルの入射窓に照射する構成なので、液中の、無染色の、非固定の生物試料を含有する環境セルを電子顕微鏡の真空槽内が配置され、液中の、無染色の、非固定の生物試料を痛めたり、破壊することなく、高分解能で光学観察することができる。 The method of using the scanning electron optical microscope according to the embodiment of the present invention is the method of using the scanning electron optical microscope described above, and electrons having an energy such that the electron beam transmittance of the incident window of the environmental cell is 1% or less. Since the configuration is such that the line is irradiated to the entrance window of the environmental cell, the environmental cell containing an unstained, non-fixed biological sample in the liquid is placed in the vacuum chamber of the electron microscope, and in the liquid, the unstained, Optical observation can be performed with high resolution without damaging or destroying a non-fixed biological sample.
本発明の実施形態である走査電子光学顕微鏡の使用方法は、先に記載の走査電子光学顕微鏡の使用方法であって、0.8kV以上1.2kV以下のエネルギーの電子線を環境セルの入射窓に照射する構成なので、液中の、無染色の、非固定の生物試料を含有する環境セルを電子顕微鏡の真空槽内が配置され、液中の、無染色の、非固定の生物試料を痛めたり、破壊することなく、高分解能で光学観察することができる。 The method for using a scanning electron optical microscope according to an embodiment of the present invention is the above-described method for using a scanning electron optical microscope, in which an electron beam having an energy of 0.8 kV to 1.2 kV is applied to an incident window of an environmental cell. The environment cell containing the unstained, non-fixed biological sample in the liquid is placed in the vacuum chamber of the electron microscope, and the non-stained, non-fixed biological sample in the liquid is damaged. Or can be optically observed with high resolution without destruction.
本発明の実施形態である近接場光学観察装置、試料含有環境セル作製方法,走査電子光学顕微鏡及び走査電子光学顕微鏡の使用方法は、上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の技術的思想の範囲内で、種々変更して実施することができる。本実施形態の具体例を以下の実施例で示す。しかし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 The near-field optical observation apparatus, the sample-containing environment cell manufacturing method, the scanning electron optical microscope, and the method of using the scanning electron optical microscope, which are embodiments of the present invention, are not limited to the above-described embodiments, but are technical in the present invention. Various modifications can be made within the scope of the idea. Specific examples of this embodiment are shown in the following examples. However, the present invention is not limited to these examples.
(試験例1)
近接場光学観察装置の光取り出し効率を高めるために、空間部を規定するフレーム部の傾斜面の光反射効果をシミュレーションした。
図24は、傾斜角度の光反射効果の評価結果の一例を示す図である。
入射窓(Entrance window)中の光源からの発光は、空間部の中で、フレーム部の傾斜面で反射され、出射窓(Exit window)へ出射される。
出射窓中で、一部の光は一面側界面と他面側界面で複数回反射され、側壁方向から放射される。
大部分の光は他面側からPMT方向に出射され、PMTの接地窓(Shield window)を通過して、PMTに取り込まれる。
傾斜面の角度を鉛直方向から35.3度とすることにより、側壁部へ出射される光の割合を小さくして、PMTに取り込まれる光の割合を大きくし、感度を高めることができた。
(Test Example 1)
In order to increase the light extraction efficiency of the near-field optical observation device, the light reflection effect of the inclined surface of the frame portion that defines the space portion was simulated.
FIG. 24 is a diagram illustrating an example of an evaluation result of a light reflection effect at an inclination angle.
Light emitted from the light source in the entrance window is reflected by the inclined surface of the frame portion in the space portion and is emitted to the exit window.
In the exit window, part of the light is reflected a plurality of times at the one-side interface and the other-side interface, and is emitted from the side wall direction.
Most of the light is emitted in the PMT direction from the other surface side, passes through the PMT ground window, and is taken into the PMT.
By setting the angle of the inclined surface to 35.3 degrees from the vertical direction, the ratio of the light emitted to the side wall portion was reduced, the ratio of the light taken into the PMT was increased, and the sensitivity could be increased.
(試験例2)
図25は、入射窓中での電子線拡散領域のシミュレーション結果の一例を示す図である。
tmは構造層の厚さであり、teは発光層の厚さである。
図25では、構造層の厚さtmを20nm、発光層の厚さteを0nm、30nm、60nmとした場合に、それぞれ、電子線エネルギー0.6kV、0.9kV、1.0kVで入射した場合の電子線の拡散領域を示している。この領域が光源92となる。図25の結果は、入射窓の厚さに応じて、適切なエネルギーの電子線を入射すれば、電子線は入射窓を透過せずに内部で停止し、直径数10nmの近接場光源を形成することを示している。
(Test Example 2)
FIG. 25 is a diagram illustrating an example of a simulation result of the electron beam diffusion region in the incident window.
tm is the thickness of the structural layer, and te is the thickness of the light emitting layer.
In FIG. 25, when the thickness tm of the structural layer is 20 nm and the thickness te of the light emitting layer is 0 nm, 30 nm, and 60 nm, the electron beam energy is 0.6 kV, 0.9 kV, and 1.0 kV, respectively. The electron beam diffusion region is shown. This area becomes the light source 92. The result of FIG. 25 shows that if an electron beam with an appropriate energy is incident according to the thickness of the incident window, the electron beam stops inside without passing through the incident window to form a near-field light source having a diameter of several tens of nm. It shows that
(試験例3)
均一で平滑な膜からなる発光層の作製方法の検討を行った。
まず、有機蛍光材料の分散液として、クマリン6(1wt%)分散PVKの溶液を調製した。溶媒はクロロホルムにo−ジクロロベンゼンを0.1〜1%混合した液を用い、クマリン6(1wt%)分散PVKを10〜100μg/mlの濃度とした。
次に、この分散液を用いて、ドロップ・コーティング法により、メンブレン上に発光層を形成した。マイクロインジェクション量は約0.05μlとした。
図26は、ドロップ・コーティングの外観写真(a)及びドロップ・コーティングに用いるピペット先端部の拡大写真(b)である。
図27は、ドロップ・コーティングの操作写真(a)及びドロップ・コーティング面の平滑性評価写真(b)である。
膜厚分布をFTIRで測定することにより、均一で平滑な膜が得られたことを確認した。
なお、クマリン6の濃度は0.1〜10wt%の範囲では、1wt%の膜が最も発光強度が高かった。
(Test Example 3)
A method for manufacturing a light-emitting layer composed of a uniform and smooth film was studied.
First, a solution of coumarin 6 (1 wt%)-dispersed PVK was prepared as a dispersion of organic fluorescent material. As the solvent, a mixture of chloroform and 0.1 to 1% o-dichlorobenzene was used, and coumarin 6 (1 wt%)-dispersed PVK was adjusted to a concentration of 10 to 100 μg / ml.
Next, using this dispersion, a light emitting layer was formed on the membrane by a drop coating method. The microinjection amount was about 0.05 μl.
FIG. 26 is an appearance photograph (a) of the drop coating and an enlarged photograph (b) of the tip of the pipette used for the drop coating.
FIG. 27 is an operation photograph (a) of drop coating and a smoothness evaluation photograph (b) of the drop coating surface.
It was confirmed that a uniform and smooth film was obtained by measuring the film thickness distribution by FTIR.
When the concentration of coumarin 6 was in the range of 0.1 to 10 wt%, the 1 wt% film had the highest emission intensity.
(試験例4)
構造層の厚さtmを20nm、発光層の厚さteを0nm、30nm、60nmとした場合の、電子線エネルギーと電子線の透過率との関係を調べた。
図28は、その結果を示すグラフである。
発光層の厚さteの増加とともに、透過開始エネルギー値は大きくなった。つまり、発光層の厚さteを厚くするに従い、電子線は貫通しなくなることが分かった。これにより、電子線エネルギー値と、発光層の厚さteを制御することにより、電子線照射による試料の損傷を回避できることが明らかとなった。より具体的には、試料の損傷は、電子線透過率が1%を超えると顕著になるので、電子線エネルギーをそれよりも小さな値と設定すればよい。
図28には、teが60nmまでの範囲では、電子線エネルギーを1.2kV以下とすれば良いことが示唆されている。一方、te=0nm(構造層のみ)の結果から、電子線エネルギーが0.7kVでは電子線は構造層をほとんど透過せず、発光層には到達していないので、電子線エネルギーが0.8〜1.2kVの時に、発光が得られ、かつ、試料に1%を超える電子線が照射されない実用領域と求められる。
(Test Example 4)
When the thickness tm of the structural layer was 20 nm and the thickness te of the light emitting layer was 0 nm, 30 nm, and 60 nm, the relationship between the electron beam energy and the electron beam transmittance was examined.
FIG. 28 is a graph showing the results.
As the thickness te of the light emitting layer increased, the transmission initiation energy value increased. That is, it was found that the electron beam does not penetrate as the thickness te of the light emitting layer is increased. Thereby, it became clear that the damage of the sample by electron beam irradiation can be avoided by controlling the electron beam energy value and the thickness te of the light emitting layer. More specifically, since the damage to the sample becomes significant when the electron beam transmittance exceeds 1%, the electron beam energy may be set to a value smaller than that.
FIG. 28 suggests that the electron beam energy should be 1.2 kV or less in the range of te up to 60 nm. On the other hand, from the result of te = 0 nm (only the structural layer), when the electron beam energy is 0.7 kV, the electron beam hardly transmits through the structural layer and does not reach the light emitting layer. It is calculated | required that it is a practical area | region where light emission is obtained at the time of -1.2kV, and an electron beam exceeding 1% is not irradiated to a sample.
(試験例5)
試験例1〜4の結果を利用し、表1に示す設計条件で、実施形態で示した構成の近接場光学観察装置を作製した。第1、2基板本体はステンレス製、第3基板本体はアルミニウム製とした。
(Test Example 5)
Using the results of Test Examples 1 to 4, a near-field optical observation apparatus having the configuration shown in the embodiment was manufactured under the design conditions shown in Table 1. The first and second substrate bodies were made of stainless steel, and the third substrate body was made of aluminum.
図29は、作製した第1〜第3の基板及び細胞培養用シリコーンリングの写真(a)と、第1〜第3の基板の組み合わせ写真(b)、第1〜第3の基板の説明写真(c)である。 FIG. 29 is a photograph (a) of the produced first to third substrates and a silicone ring for cell culture, a combined photograph (b) of the first to third substrates, and an explanatory photograph of the first to third substrates. (C).
図30は、電子顕微鏡の電気/光フィードスルー端子の写真(a)及び真空槽内部の写真(b)である。
図31は 、環境セル保持部の写真(a)及びその拡大写真(b)である。
図32は、引き出した環境セル保持部の写真(a)及びその拡大写真(b)である。
図33は、保持部及び環境セル保持部の写真である。
FIG. 30 is a photograph (a) of the electric / optical feedthrough terminal of the electron microscope and a photograph (b) of the inside of the vacuum chamber.
FIG. 31 is a photograph (a) of the environmental cell holding unit and an enlarged photograph (b) thereof.
FIG. 32 is a photograph (a) and an enlarged photograph (b) of the extracted environmental cell holding unit.
FIG. 33 is a photograph of the holding unit and the environmental cell holding unit.
(試験例6)
次に、これに、実施形態で示した生きた細胞の試料含有環境セル作製方法を用いて、表2に示す条件で、生きた細胞の試料含有環境セルを作製した。
(Test Example 6)
Next, a living cell sample-containing environment cell was prepared under the conditions shown in Table 2 by using the living cell sample-containing environment cell preparation method described in the embodiment.
図34は、第1の基板に細胞培養用シリコーンリングを取り付けてシャーレに配置した写真である。このシリコーンリング内に細胞と培養液を充填し、細胞を培養した。表3は、用いた試料と培養液である。 FIG. 34 is a photograph in which a cell culture silicone ring is attached to a first substrate and placed in a petri dish. The silicone ring was filled with cells and a culture solution, and the cells were cultured. Table 3 shows the samples and culture solutions used.
以上の工程により、発光層上に細胞培養した試料含有環境セルを作製できた。 Through the above steps, a sample-containing environmental cell in which cells were cultured on the light emitting layer could be produced.
次に、試験例5の近接場観察装置の発光測定モジュールを電子顕微鏡の所定の位置に設置した。
次に、位置合わせ可能な移動機構を操作して、保持部から環境セル保持部を、試料交換用チャンバー内に引き出した。
次に、この試料含有環境セルを環境セル保持部に保持してから、電子顕微鏡の真空槽内部の所定の位置に正確に環境セル保持部を移動した。
次に、表4に示す条件で、電子線を照射し、発光測定を行った。
Next, the light emission measurement module of the near-field observation apparatus of Test Example 5 was installed at a predetermined position of the electron microscope.
Next, the movable mechanism capable of alignment was operated, and the environmental cell holder was pulled out from the holder into the sample exchange chamber.
Next, after holding this sample-containing environmental cell in the environmental cell holding part, the environmental cell holding part was accurately moved to a predetermined position inside the vacuum chamber of the electron microscope.
Next, emission measurement was performed by irradiating with an electron beam under the conditions shown in Table 4.
図35に示す結果が得られた。
図35(a)は、真空槽内に配置した環境セル中の、液中の、無染色の、非固定のヒト肺表皮細胞を本顕微鏡で観察した画像であり、(b)はその説明図である。図35のスケールバーは10μmである。
細胞の発光層表面に密着した領域が周囲よりも明るく観察された。これは双極子放射増強現象により、発光膜の微小光源近傍にある物体、すなわち細胞が周囲の媒質よりも屈折率が高いため、光源からの発光強度が増大し、明るく観察されたと考えられる。また、細胞内の明るさは均一ではなく、わずかではあるが輝度の分布を示した。
The result shown in FIG. 35 was obtained.
FIG. 35 (a) is an image obtained by observing an unstained, non-fixed human lung epidermal cell in a liquid in an environmental cell arranged in a vacuum chamber, and (b) is an explanatory diagram thereof. It is. The scale bar in FIG. 35 is 10 μm.
A region in close contact with the light emitting layer surface of the cells was observed brighter than the surroundings. This is considered to be due to the dipole radiation enhancement phenomenon, because the object in the vicinity of the minute light source of the light-emitting film, that is, the cell, has a higher refractive index than the surrounding medium, the light emission intensity from the light source increases, and it is considered that the light was observed brightly. In addition, the intracellular brightness was not uniform, but showed a slight distribution of brightness.
画像フィルタリングを施し、主要な構造を抽出した結果を図35(b)に示した。破線で示した核の輪郭や、微細な顆粒、細胞内部を縦横に走る繊維状の構造が観察された。この繊維状の構造は細胞骨格が観察されたものと推定される。
双極子放射増強現象が起こるのは、表面から波長の10分の1程度、すなわち、50nm程度までなので、このような骨格構造が、細胞の発光層との付着界面近傍に存在すると考えられる。
FIG. 35B shows the result of image filtering and extraction of main structures. The outline of the nucleus indicated by the broken line, fine granules, and a fibrous structure running vertically and horizontally inside the cell were observed. This fibrous structure is presumed to have a cytoskeleton observed.
Since the dipole radiation enhancement phenomenon occurs from the surface to about one-tenth of the wavelength, that is, about 50 nm, it is considered that such a skeletal structure exists in the vicinity of the adhesion interface with the light emitting layer of the cell.
なお、細胞骨格は直径数10nmであり、これまで染色して蛍光顕微鏡にて観察された事例は多数あるが、回折限界に比べて微細な構造のため、無染色では位相差顕微鏡を用いても観察されていなかった。また、光ファイバプローブを用いるSNOMでも、無染色では観察されていなかった。 The cytoskeleton has a diameter of several tens of nanometers, and there are many cases that have been stained and observed with a fluorescence microscope. However, because of the fine structure compared to the diffraction limit, a phase contrast microscope can be used without staining. It was not observed. Also, SNOM using an optical fiber probe was not observed without staining.
この観察後に、環境セルを真空槽から取り出し、分解し、二重染色法を施すことにより、この細胞が生きたままであることを確認した。 After this observation, the environmental cell was removed from the vacuum chamber, disassembled, and subjected to double staining to confirm that the cell remained alive.
図36(a)は、高分解能性観察を実証する結果である。図36(a)は本顕微鏡で得られた画像、図36(b)は、従来の位相差顕微鏡による画像である。従来の位相差顕微鏡による画像は、高強度照明が可能なためにシグナルノイズ比が高く鮮明となった。しかし、回折限界の影響を受けるために、分解能は必ずしも高くなかった。 FIG. 36A shows the results demonstrating high-resolution observation. FIG. 36A is an image obtained with this microscope, and FIG. 36B is an image obtained with a conventional phase contrast microscope. A conventional phase contrast microscope image has a high signal-to-noise ratio and is clear because high-intensity illumination is possible. However, the resolution is not always high due to the influence of the diffraction limit.
図36(a)では細胞質顆粒が明るい点として観察された。図36(b)では、細胞質顆粒は暗く見える顆粒として観察された。これらは、よく対応した。 In FIG. 36 (a), cytoplasmic granules were observed as bright spots. In FIG. 36 (b), cytoplasmic granules were observed as dark-looking granules. These corresponded well.
図36(c)は、図36(a)、(b)の顆粒のうち特に小さなもの(図中A)の輝度プロファイルである。図36(a)、(b)のスケールバーは10μmであり、図36(c)のグラフの縦軸は画像の輝度であり、横軸は位置である。
図36(c)に示すように、従来顕微鏡の位相差像では顆粒は数μmにぼやけて観察され、プロファイルは半値幅としてどこを評価すればよいかわからないほどなだらかであった。
対して、本発明の走査電子光学顕微鏡では回折限界を超える半値幅205nmの明瞭な輝点として観察できた。
FIG. 36 (c) is a luminance profile of a particularly small granule (A in the figure) among the granules of FIGS. 36 (a) and (b). The scale bar in FIGS. 36A and 36B is 10 μm, the vertical axis of the graph in FIG. 36C is the luminance of the image, and the horizontal axis is the position.
As shown in FIG. 36 (c), in the phase contrast image of the conventional microscope, the granule was observed to be blurred to several μm, and the profile was so gentle that it was not understood where to evaluate as the half-value width.
On the other hand, in the scanning electron optical microscope of the present invention, it was possible to observe as a clear bright spot having a half width of 205 nm exceeding the diffraction limit.
このように、液中の、無染色の、非固定の生物試料を、真空槽内に配置した環境セルに保持して、高分解能で光学観察することができた。これにより、走査電子光学顕微鏡(SEOM)として利用できることを明らかにした。 In this way, an unstained, non-fixed biological sample in the liquid could be held in the environmental cell placed in the vacuum chamber and optically observed with high resolution. Thereby, it was clarified that it can be used as a scanning electron optical microscope (SEOM).
(試験例7)
環境セルと発光測定モジュール(分光測定システム)との間に光路システムを配置して、本発明の第2の実施形態に示す走査電子光学顕微鏡を作製した。発光層の材料としてはクマリンを分散させたPVKを用いた。
(Test Example 7)
An optical path system was arranged between the environmental cell and the luminescence measurement module (spectral measurement system) to produce a scanning electron optical microscope shown in the second embodiment of the present invention. PVK in which coumarin was dispersed was used as the material of the light emitting layer.
図37は、このシステムで測定したスペクトルである。試料が吸収を示さない場所にて、電子線エネルギーを0.6〜1.5kVまで変えてスペクトルを測定した。
電子線エネルギーが0.6kVの時には、SiNの微弱で波長域の広いCLが観測された。これは、電子線は構造層内部で停止したためと考えられる。
加速電圧を上げると、波長520nmをピークとするクマリンの発光の立ち上がりが観察された。これにより、電子が発光層にまで拡散したことが分かった。
FIG. 37 shows a spectrum measured by this system. The spectrum was measured by changing the electron beam energy from 0.6 to 1.5 kV in a place where the sample showed no absorption.
When the electron beam energy was 0.6 kV, a weak CL of SiN and a wide wavelength range were observed. This is probably because the electron beam stopped inside the structural layer.
When the acceleration voltage was increased, the rise of coumarin emission with a peak at a wavelength of 520 nm was observed. Thereby, it was found that the electrons diffused to the light emitting layer.
2次元的な画像情報に加えて、スペクトルの観点からも試料を分析することができた。
試料がまったく吸収を示さない場合には、観測されるスペクトルは単に発光層のCLスペクトルとなった。試料が特定の波長を吸収すれば、その波長の強度は減少した。
In addition to the two-dimensional image information, the sample could be analyzed from a spectral point of view.
When the sample showed no absorption at all, the observed spectrum was simply the CL spectrum of the light emitting layer. If the sample absorbed a particular wavelength, the intensity at that wavelength decreased.
(試験例8〜15)
表5に示す無機蛍光体やその他の有機蛍光体からなる試料を入射窓の材料として用いた他は試験例7と同様にして、本発明の第2の実施形態に示す走査電子光学顕微鏡により、スペクトル測定を行った。
(Test Examples 8 to 15)
A scanning electron optical microscope shown in the second embodiment of the present invention was used in the same manner as in Test Example 7 except that a sample made of an inorganic phosphor and other organic phosphors shown in Table 5 was used as the material for the entrance window. Spectrum measurement was performed.
図38は、その結果を示すスペクトルであって、全体のスペクトル(a)と拡大スペクトル(b)、(c)である。試験例7の結果も合わせて表示してある。試験例7のスペクトル強度が最も大きく、試験例14のスペクトル強度が最も小さかった。 FIG. 38 is a spectrum showing the result, which is an entire spectrum (a) and expanded spectra (b) and (c). The result of Test Example 7 is also displayed. The spectral intensity of Test Example 7 was the highest, and the spectral intensity of Test Example 14 was the lowest.
(試験例16)
本発明の第3の実施形態の図21に示す環境セルを作製した。
メッシュ2055の材料としては、ステンレスを用い、膜厚は25μmとした。開口は正方形とし、1辺340μmとした。
発光層2052の材料としては、ポリイミドメンブレンを用い、膜厚は200nmとした。
出射窓の材料としては、PETフィルムを用い、膜厚は1.5μmとした。
帯電防止層2053の材料としては、カーボンを用い、膜厚は10nmとした。
充填媒体2042としては、空気を用いた。
試料2041としては直径60nmの金ナノ粒子を用いた。
(Test Example 16)
The environmental cell shown in FIG. 21 of the third embodiment of the present invention was produced.
As the material of the mesh 2055, stainless steel was used, and the film thickness was 25 μm. The opening was a square and 340 μm per side.
As a material for the light emitting layer 2052, a polyimide membrane was used, and the film thickness was 200 nm.
As the material of the exit window, a PET film was used, and the film thickness was 1.5 μm.
As a material for the antistatic layer 2053, carbon was used, and the film thickness was 10 nm.
Air was used as the filling medium 2042.
As the sample 2041, gold nanoparticles having a diameter of 60 nm were used.
以上の構成により、3.0kVの低電子線エネルギーの電子線を入射窓に照射し、入射窓を構成するポリイミドで電子線励起発光させたピーク波長550nmの光源の光を、試料の中を透過させ、出射窓側からPMT等の発光測定モジュールにより近接場光学観察をすることができる。 With the above configuration, an electron beam with a low electron beam energy of 3.0 kV is irradiated on the incident window, and light from a light source having a peak wavelength of 550 nm that is excited by an electron beam with polyimide constituting the incident window is transmitted through the sample. Thus, near-field optical observation can be performed from the exit window side using a light emission measurement module such as PMT.
図39は、本顕微鏡で得られた画像である。図39のスケールバーは1μmである。
金は、青〜緑域にて吸収の大きな材料であるので、この場合には双極子放射増強現象ではなく、エネルギー移動によるCLの消光を起こした。
そのため、周囲に比べて暗く見えた。
この画像では約200nmに見えている。個々の粒子は60nmなので、これは1個の粒子ではなく、数個の粒子のクラスタであると思われる。個々の金ナノ粒子が識別できるほどの分解能はなかった。これは発光層として用いているポリイミドメンブレンの膜厚が200nmで、発光領域の大きさも同程度となるので、分解能が約200nmに制限されたためと考えられる。しかし、200nmというサイズは回折限界を超えており、図39もまた、本顕微鏡で従来の光学顕微鏡を超える解像度が得られることを実証する結果である。
FIG. 39 is an image obtained with this microscope. The scale bar in FIG. 39 is 1 μm.
Since gold is a material having a large absorption in the blue to green region, in this case, the quenching of CL due to energy transfer was caused instead of the dipole radiation enhancement phenomenon.
Therefore, it looked darker than the surroundings.
In this image, it is visible at about 200 nm. Since individual particles are 60 nm, this appears to be a cluster of several particles rather than a single particle. There was not enough resolution to identify individual gold nanoparticles. This is presumably because the film thickness of the polyimide membrane used as the light emitting layer is 200 nm and the size of the light emitting region is about the same, so the resolution is limited to about 200 nm. However, the size of 200 nm exceeds the diffraction limit, and FIG. 39 is also a result demonstrating that this microscope can obtain a resolution exceeding that of a conventional optical microscope.
以上により、液中の生物試料に限らず、様々な環境中の多様な試料を、回折限界の影響を受けずに高分解能で光学観察することができ、走査電子光学顕微鏡として利用できることを明らかにした。
なお、表6に、本明細書で用いた材料名とその略称の関係を示す。
From the above, it is clear that not only biological samples in liquid but also various samples in various environments can be optically observed with high resolution without being affected by the diffraction limit, and can be used as a scanning electron optical microscope. did.
Table 6 shows the relationship between the names of materials used in this specification and their abbreviations.
本発明の近接場光学観察装置、試料含有環境セル作製方法及び走査電子光学顕微鏡は、液中の、無染色の、非固定の生物試料を高分解能で光学観察可能な近接場光学観察装置、その試料含有環境セル作製方法及び走査電子光学顕微鏡に関するものであり、高分解光学顕微鏡産業、生物試料をそのまま高分解で観察可能な光学顕微鏡産業において利用可能性がある。 The near-field optical observation apparatus, the sample-containing environmental cell preparation method and the scanning electron optical microscope of the present invention are a near-field optical observation apparatus capable of optically observing an unstained, non-fixed biological sample in a liquid with high resolution, The present invention relates to a sample-containing environmental cell preparation method and a scanning electron optical microscope, and may be used in a high-resolution optical microscope industry and an optical microscope industry in which a biological sample can be observed with high resolution as it is.
11…近接場光学観察装置、12…環境セル、13…発光測定モジュール、13a…光電面、19…空間部、21…第1基板、21A…第1基板本体、21c1…孔部、21c2…孔部、22…第2基板、22A…第2基板本体、22c1…孔部、22c2…充填媒体排出用孔部、22c3…孔部、22c4…孔部、23A…第3基板本体、23c1…孔部、23c2…孔部、23c3…孔部、23c4…孔部、23…第3基板、23A…第3基板本体、23c1…孔部、23c2…孔部、30…入射窓、30t…入射窓膜厚、31…構造層、32…発光層、34…出射窓、35…フレーム部、35c…孔部、36…ねじ、37…Oリング、38…封止シール、38A…封止シール、38Ac…孔部、38B…封止シール、41…試料、42…充填媒体、45…シリコーンリング、46…培養液、47…細胞、91…電子線、91a…電子線走査方向、92…光源(近接場光源)、93…光、101…走査電子光学顕微鏡(SEOM)、102…電子源(電子銃)、103…真空槽、104…走査コイル、105…真空槽、108…シャッター、109…保持部、110…環境セル保持部、121…電子銃制御回路、122…走査信号制御回路、123…電子線照射制御回路、124…光検出器電源回路、125…光信号整形回路、126…2次電子信号整形回路、127…2次電子検出器、128…制御PC、129…モニター、1102…走査電子光学顕微鏡(SEOM)、1201…光路システム、1113、1114、1115…光検出器、1117、1118…ダイクロイックミラー、1119…ミラー、1121…レンズ、1122…色収差補正対物レンズ、1123…色収差補正レンズ、1125…光ファイバ、2012…環境セル、2019…空間部、2030…入射窓、2035…フレーム部、2034…出射窓、2041…試料、2042…充填媒体、2051…支持基板、2052…発光層、2053…帯電防止層、2055…スペーサー。
DESCRIPTION OF SYMBOLS 11 ... Near-field optical observation apparatus, 12 ... Environmental cell, 13 ... Luminescence measuring module, 13a ... Photocathode, 19 ... Space part, 21 ... 1st board | substrate, 21A ... 1st board | substrate body, 21c1 ... Hole part, 21c2 ... Hole , 22 ... second substrate, 22A ... second substrate body, 22c1 ... hole, 22c2 ... hole for discharging filling medium, 22c3 ... hole, 22c4 ... hole, 23A ... third substrate body, 23c1 ... hole , 23c2 ... hole, 23c3 ... hole, 23c4 ... hole, 23 ... third substrate, 23A ... third substrate body, 23c1 ... hole, 23c2 ... hole, 30 ... incident window, 30t ... incident window thickness 31 ... Structural layer 32 ... Light emitting layer 34 ... Exit window 35 ... Frame portion 35c ... Hole portion 36 ... Screw 37 ... O-ring 38 ... Sealing seal 38A ... Sealing seal 38Ac ... Hole Part, 38B ... sealing seal, 41 ... sample, 42 Filling medium, 45 ... silicone ring, 46 ... culture solution, 47 ... cell, 91 ... electron beam, 91a ... electron beam scanning direction, 92 ... light source (near-field light source), 93 ... light, 101 ... scanning electron optical microscope (SEOM) ), 102 ... Electron source (electron gun), 103 ... Vacuum chamber, 104 ... Scanning coil, 105 ... Vacuum chamber, 108 ... Shutter, 109 ... Holding unit, 110 ... Environmental cell holding unit, 121 ... Electron gun control circuit, 122 DESCRIPTION OF SYMBOLS ... Scanning signal control circuit, 123 ... Electron beam irradiation control circuit, 124 ... Photo detector power supply circuit, 125 ... Optical signal shaping circuit, 126 ... Secondary electron signal shaping circuit, 127 ... Secondary electron detector, 128 ... Control PC DESCRIPTION OF SYMBOLS 129 ... Monitor, 1102 ... Scanning electron optical microscope (SEOM), 1201 ... Optical path system, 1113, 1114, 1115 ... Photo detector, 1117, 1118 ... Dichro 1119 ... Chromatic aberration correction objective lens, 1123 ... Chromatic aberration correction lens, 1125 ... Optical fiber, 2012 ... Environmental cell, 2019 ... Space part, 2030 ... Incoming window, 2035 ... Frame part, 2034 ... Output window, 2041 ... sample, 2042 ... filling medium, 2051 ... support substrate, 2052 ... light emitting layer, 2053 ... antistatic layer, 2055 ... spacer.
Claims (30)
前記入射窓が電子線励起により発光可能な発光材料を有していることを特徴とする近接場光学観察装置。 A space part capable of hermetically holding a sample, an incident window provided in one of the space parts, an environmental cell provided with an exit window provided in the other of the space part, and a luminescence measurement module,
The near-field optical observation apparatus, wherein the incident window has a light emitting material capable of emitting light by electron beam excitation.
出射窓を有する第2の基板を用意し、前記出射窓を覆うように充填媒体を滴下する工程と、
前記第1の基板と前記第2の基板を充填媒体が混じり合うように重ね合わせる工程とを有することを特徴とする試料含有環境セル作製方法。 After preparing a first substrate having an entrance window on one side or the other side of a frame part having a hole communicating with one side and the other side, and attaching a sample to the other side of the entrance window Dropping a filling medium so as to cover the sample;
Preparing a second substrate having an exit window and dropping a filling medium so as to cover the exit window;
A method for producing a sample-containing environment cell, comprising: stacking the first substrate and the second substrate so that a filling medium is mixed.
30. The method of using a scanning electron optical microscope according to claim 29, wherein an electron beam having an energy of 0.8 kV or more and 1.2 kV or less is irradiated to an incident window of an environmental cell.
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