JP2015027290A

JP2015027290A - Method for producing cell highly sensitive to stress using nucleic acid

Info

Publication number: JP2015027290A
Application number: JP2014125587A
Authority: JP
Inventors: 英典谷; Hidenori Tani; 鳥村　政基; Masamoto Torimura; 政基鳥村
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2013-06-27
Filing date: 2014-06-18
Publication date: 2015-02-12
Anticipated expiration: 2034-06-18
Also published as: JP6528056B2

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide means for making a cultured cell highly sensitive to environmental stress comprehensively, without using an RNA interference method with problems such as adverse effects, and without individually measuring the presence of specific chemical material for example in a reporter assaying method, to increase sensitivity of an environmental stress evaluating method in which a cultured cell of mammals and the like is used.SOLUTION: The present invention comprises highly expressing GAS5, and/or IDI2-AS1 and SNHG15, which are RNA molecules having the same function as GAS5, in a cultured cell of mammals and the like, so that the cultured cell becomes highly sensitive to environmental stress such as chemical material and ultraviolet rays.

Description

本発明は、生命科学分野，環境分析分野の技術に関し、特に、培養細胞を用いた環境ストレスの生物学的影響の評価方法の技術に関する。 The present invention relates to technologies in the fields of life science and environmental analysis, and in particular, to a technology of a method for evaluating biological effects of environmental stress using cultured cells.

化学物質を代表とする環境ストレスの生物学的影響の評価法(バイオアッセイ)として、マウスなどを用いた動物実験を代替するために、哺乳動物等の培養細胞を用い、細胞増殖率や細胞生存率を測定することで環境ストレスを評価する方法が知られている。しかしながら、この方法では、培養細胞が環境ストレスに応答して、最終的に細胞死などの表現型を示すまでには時間がかかるため、本測定を高感度化することが求められていた。 As an evaluation method (bioassay) of biological stresses of environmental stresses typified by chemical substances, in order to replace animal experiments using mice, etc., cultured cells such as mammals are used. A method of evaluating environmental stress by measuring the rate is known. However, in this method, since it takes time until the cultured cells finally show a phenotype such as cell death in response to environmental stress, it has been required to increase the sensitivity of this measurement.

この問題点を解決する方法として、生体内外の異物の代謝に関与するUGT(UDPグルクロン酸転移酵素)に対して、RNA干渉法を用いてその遺伝子発現を抑制することで、細胞における化学物質の細胞毒性評価の高感度化を実現した方法が報告されている(特許文献１)。しかしながら、RNA干渉法は目的の遺伝子以外の発現をも抑制させてしまう副作用が起こることが知られており、また、使用する2本鎖siRNAは大変高価である。 As a method to solve this problem, UGT (UDP glucuronosyltransferase) involved in the metabolism of foreign substances inside and outside the living body is suppressed by using RNA interference method to suppress the expression of chemical substances in cells. A method has been reported that achieves high sensitivity for cytotoxicity evaluation (Patent Document 1). However, RNA interference is known to cause side effects that suppress the expression of genes other than the target gene, and the double-stranded siRNA used is very expensive.

また、特定の化学物質により発現が誘導されることが知られているタンパク質(例えばリポ多糖により発現が誘導されるHSP90βタンパク質等)のプロモーター配列を利用して、当該プロモーターの下流にルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子を導入した配列を細胞内に導入することで、培養細胞における当該特定の化学物質の存在を鋭敏に検出し、これによって細胞毒性評価の高感度化を実現した方法(レポーターアッセイ法)が多数報告されている(特許文献２、３)。しかしながら、これらの方法は、特定の化学物質に応答する特定のプロモーターの特性を利用し、当該特定の化学物質の存在を個別に測定するためのものであり、様々な種類の環境ストレスの存在を測定するためには、それらのストレスに応答する仕組みを、それぞれ個別に構築する必要がある。 In addition, using a promoter sequence of a protein whose expression is known to be induced by a specific chemical substance (for example, HSP90β protein whose expression is induced by lipopolysaccharide), a reporter such as luciferase is downstream of the promoter. There are many methods (reporter assay methods) that detect the presence of a specific chemical substance in cultured cells by introducing a gene-introduced sequence into the cell, thereby achieving high sensitivity in cytotoxicity evaluation. It has been reported (Patent Documents 2 and 3). However, these methods use the characteristics of a specific promoter that responds to a specific chemical substance to measure the presence of the specific chemical substance individually, and to detect the presence of various types of environmental stresses. In order to measure, it is necessary to individually construct a mechanism that responds to those stresses.

特開2010-265190号JP 2010-265190 国際公開2007/004361号International Publication No. 2007/004361 特開2011-087497号JP 2011-087497

Mourtada-Maarabouni et al., Oncogene 28,195-208, 2009Mourtada-Maarabouni et al., Oncogene 28,195-208, 2009 Kino et al., Sci Signal. 3, ra8, 2010Kino et al., Sci Signal. 3, ra8, 2010 Tani et al., Genome Res. 22, 947-956, 2012Tani et al., Genome Res. 22, 947-956, 2012

本発明は、上記哺乳動物等の培養細胞を用いる環境ストレスの評価法を高感度化するにあたり、上述の副作用などの問題のあるRNA干渉法を使用せず、また、レポーターアッセイ法のようにある特定の化学物質の存在を個別に測定するのではなく、培養細胞を、環境ストレスに対し総合的に高感度化させるための手段を提供することを課題とする。 The present invention does not use problematic RNA interference methods such as the above-mentioned side effects in improving the environmental stress evaluation method using cultured cells of mammals and the like, and is like a reporter assay method. It is an object of the present invention to provide a means for making a cultured cell highly sensitive to environmental stress, instead of individually measuring the presence of a specific chemical substance.

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、哺乳動物等の培養細胞において、GAS5および／またはこれと同様の機能を有するRNA分子を高発現させることにより、培養細胞が、化学物質、紫外線などの環境ストレスに対し高感度化されることを見出し、本発明を完成した。 As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors highly expressed GAS5 and / or an RNA molecule having a function similar to this in cultured cells such as mammals. The present invention has been completed by finding that it is highly sensitive to environmental stresses such as substances and ultraviolet rays.

ヒト培養細胞内において、アポトーシス(細胞死)抑制遺伝子の発現制御に関与するGAS5(Growth arrest-specific 5)遺伝子のRNA発現量を増加させることで、細胞がアポトーシスを起こしやすくなることが報告されている(非特許文献１、２)。
本発明者らは、このことを培養細胞による各種環境ストレスの評価に利用することができるのではないかとの発想の下、検討した結果、哺乳動物の培養細胞においてGAS5のRNA発現量を増加させることにより、Mercury(II)Chloride、Cycloheximideなどの環境ストレスとされる化学物質に対し、培養細胞が、より迅速かつ鋭敏に反応し、高感度化することを見出した(図４)。 It has been reported that increasing the RNA expression level of GAS5 (Growth arrest-specific 5) gene, which is involved in the control of apoptosis (cell death) suppressor gene expression, in human cultured cells makes it easier for cells to undergo apoptosis. (Non-Patent Documents 1 and 2).
As a result of an examination under the idea that this can be used for evaluation of various environmental stresses by cultured cells, the present inventors have increased the expression level of GAS5 RNA in cultured mammalian cells. As a result, it was found that cultured cells react more rapidly and sensitively to chemical substances that are considered environmental stresses such as Mercury (II) Chloride and Cycloheximide (FIG. 4).

また、本発明者らは、先に、哺乳動物の細胞内では、タンパク質をコードしないノンコーディングRNAが多種類、発現しており、これらは細胞内で分解速度が速いものとそうでないものに大別できること、そして、このようなノンコーディングRNAの一つであるGAS5は細胞内で分解速度が速いことを見出している(非特許文献３)。
このようなノンコーディングRNAの多くはその機能が未だ知られていないが、本発明者らは、これらの中には、GAS5と同様の機能を有するものが含まれているのではないかとの発想の下、上記細胞内で分解速度が速いRNAについて、細胞の環境ストレスへの感受性に関しGAS5と同様の機能を有するものを探索した。 In addition, the present inventors have previously expressed many types of non-coding RNAs that do not encode proteins in mammalian cells, and these are largely classified into those that have a high degradation rate and those that do not. It has been found that GAS5, which is one of such non-coding RNAs, has a high degradation rate in cells (Non-patent Document 3).
Many of these non-coding RNAs are not yet known for their functions, but the present inventors have thought that some of them may have the same function as GAS5. Under the above, RNA having a high degradation rate in the cell was searched for having the same function as GAS5 with respect to the sensitivity of the cell to environmental stress.

探索は、以下のように行った。
すなわち、GAS5は飢餓細胞において発現量が増加することが知られている。そこで、哺乳動物細胞であるHEK293細胞にモデル化学物質の暴露を行い、細胞内で分解速度が速いことが報告されている機能未知のノンコーディングRNAについて、GAS5と同様に発現量が顕著に増加するRNAを特定した(図１および２)。
次いで、特定されたノンコーディングRNAの塩基配列を有するRNAの存在量を細胞内で人工的に増加させることで、細胞が環境ストレスにより細胞死を起こしやすくなることを確認した。
具体的には、組換えDNAの手法により上述の特定のノンコーディングRNAの塩基配列を有する核酸を含んだ発現プラスミドベクターを作製し、核酸導入試薬等の使用により哺乳動物細胞内に発現プラスミドベクターを導入し、一定時間を経ることで、哺乳動物細胞内で当該特定の塩基配列を有する核酸の発現量を通常の細胞よりも数倍以上に増加させた(図３〜５)。その後、これらの特定の塩基配列を有する核酸の存在量が通常の細胞よりも数倍以上に増加した細胞が、通常の培養条件下では、細胞増殖率について通常の細胞と有意の差がないことを確認し(図６)、一方、化学物質をはじめとする各種の環境ストレスを与えることで、総じて、通常の細胞よりも迅速かつ高感度に細胞死を測定することができることを確認した(図７〜１０)。
このような手順により、細胞内で分解速度が速い２つのRNA分子、IDI2-AS1およびSNHG15について、細胞の環境ストレスへの感受性に関し、GAS5と同様の機能を有することが確認できた。
また、これらの特定のRNA分子の複数種を組み合わせてその発現量を増加させた細胞について同様の試験を行うことにより、これらを単独で増加させた場合よりもさらに優れた環境ストレスへの感受性を有する細胞が得られることが確認できた(図１１、１２)。 The search was performed as follows.
That is, it is known that the expression level of GAS5 increases in starved cells. Therefore, exposure of model chemicals to HEK293 cells, which are mammalian cells, increases the expression level of non-coding RNA of unknown function, which has been reported to have a high degradation rate in the cells, as in GAS5. RNA was identified (Figures 1 and 2).
Next, it was confirmed that cells are likely to cause cell death due to environmental stress by artificially increasing the abundance of RNA having the specified non-coding RNA base sequence in the cell.
Specifically, an expression plasmid vector containing a nucleic acid having the above-mentioned specific non-coding RNA base sequence is prepared by a recombinant DNA technique, and the expression plasmid vector is inserted into a mammalian cell by using a nucleic acid introduction reagent or the like. After introduction and a certain time, the expression level of the nucleic acid having the specific base sequence was increased several times more than normal cells in mammalian cells (FIGS. 3 to 5). After that, cells whose abundance of nucleic acids having these specific base sequences has increased several times more than normal cells should not be significantly different from normal cells under normal culture conditions. On the other hand, by applying various environmental stresses including chemical substances, it was confirmed that cell death can generally be measured more rapidly and more sensitively than normal cells (see FIG. 6). 7-10).
By such a procedure, it was confirmed that two RNA molecules, IDI2-AS1 and SNHG15, which have a high degradation rate in the cell, have the same function as GAS5 with respect to the sensitivity of the cell to environmental stress.
In addition, by conducting similar tests on cells in which the expression level is increased by combining multiple types of these specific RNA molecules, the sensitivity to environmental stress is even better than when these are increased alone. It was confirmed that the cells possessed were obtained (FIGS. 11 and 12).

すなわち、この出願は以下の発明を提供するものである。
〈１〉培養細胞において、GAS5、IDI2-AS1およびSNHG15から選ばれた１またはそれ以上のRNA分子を高発現させることにより、培養細胞を環境ストレスに対し高感度化する方法。
〈２〉RNA分子がGAS5であることを特徴とする、〈１〉に記載の方法。
〈３〉RNA分子がIDI2-AS1またはSNHG15であることを特徴とする、〈１〉に記載の方法。
〈４〉RNA分子がGAS5およびIDI2-AS1であることを特徴とする、〈１〉に記載の方法。
〈５〉RNA分子がGAS5およびSNHG15であることを特徴とする、〈１〉に記載の方法。
〈６〉培養細胞が哺乳動物の培養細胞であることを特徴とする、〈１〉〜〈３〉に記載の方法。
〈７〉環境ストレスが化学物質による環境ストレスであることを特徴とする、〈１〉〜〈６〉に記載の方法。
〈８〉環境ストレスが紫外線による環境ストレスであることを特徴とする、〈１〉〜〈６〉に記載の方法。
〈９〉〈１〉〜〈８〉に記載の方法により、環境ストレスに対し高感度化された培養細胞。
〈１０〉〈９〉に記載の培養細胞を用いることを特徴とする、環境ストレスの評価方法。
〈１１〉〈９〉に記載の培養細胞を備えることを特徴とする、環境ストレスの評価装置。
〈１２〉哺乳動物細胞に環境ストレスを加え、哺乳動物細胞内において分解速度が速いノンコーディングRNA分子について、その発現量が増加するRNA分子を同定し、当該RNA分子が環境ストレスに対し細胞を高感度化するか否かを検定することを特徴とする、細胞を環境ストレスに対し高感度化するRNA分子のスクリーニング方法。 That is, this application provides the following inventions.
<1> A method for making a cultured cell highly sensitive to environmental stress by highly expressing one or more RNA molecules selected from GAS5, IDI2-AS1 and SNHG15 in the cultured cell.
<2> The method according to <1>, wherein the RNA molecule is GAS5.
<3> The method according to <1>, wherein the RNA molecule is IDI2-AS1 or SNHG15.
<4> The method according to <1>, wherein the RNA molecules are GAS5 and IDI2-AS1.
<5> The method according to <1>, wherein the RNA molecules are GAS5 and SNHG15.
<6> The method according to <1> to <3>, wherein the cultured cells are cultured mammalian cells.
<7> The method according to <1> to <6>, wherein the environmental stress is an environmental stress caused by a chemical substance.
<8> The method according to <1> to <6>, wherein the environmental stress is an environmental stress caused by ultraviolet rays.
<9> A cultured cell that is highly sensitive to environmental stress by the method according to <1> to <8>.
<10> A method for evaluating environmental stress, wherein the cultured cells according to <9> are used.
<11> An environmental stress evaluation apparatus comprising the cultured cell according to <9>.
<12> An environmental stress is applied to a mammalian cell, and an RNA molecule whose expression level is increased is identified for a non-coding RNA molecule having a high degradation rate in the mammalian cell, and the RNA molecule increases the cell against the environmental stress. A screening method for RNA molecules that makes a cell highly sensitive to environmental stress, comprising testing whether or not the sensitivity is increased.

本発明によれば、培養細胞内で特定のノンコーディングRNAの塩基配列を有するRNAの存在量を人工的に増加させることで、通常の細胞に比べて、環境ストレスに対して高い感受性を有する機能性細胞を作製することができ、これを用いることにより、各種の環境ストレスによる生物学的影響を迅速かつ高感度で測定し、評価することができる。
本発明によれば、レポーターアッセイ法のようにある特定の化学物質の存在を個別に測定するのではなく、哺乳動物細胞に対する環境ストレスの生物学的影響を総合的に高感度化することが可能である。 According to the present invention, by artificially increasing the amount of RNA having a specific non-coding RNA base sequence in cultured cells, it has a higher sensitivity to environmental stress than normal cells. Sexual cells can be produced, and by using this, biological effects caused by various environmental stresses can be measured and evaluated quickly and with high sensitivity.
According to the present invention, it is possible to comprehensively enhance the biological effects of environmental stress on mammalian cells, instead of individually measuring the presence of a specific chemical substance as in the reporter assay method. It is.

化学物質の暴露により発現量が顕著に増加するノンコーディングRNAのスクリーニング結果を示す図。The figure which shows the screening result of the non-coding RNA whose expression level increases markedly by chemical substance exposure. 化学物質の暴露により発現量が顕著に増加するノンコーディングRNAの発現量と化学物質濃度との相関関係を示す図。The figure which shows the correlation with the expression level of a non-coding RNA and expression level of a chemical substance which expression level increases remarkably by chemical substance exposure. GAS5を組み込んだ発現ベクターによるGAS5の過剰発現を示す図。The figure which shows the overexpression of GAS5 by the expression vector incorporating GAS5. IDI2-AS1を組み込んだ発現ベクターによるIDI2-AS1の過剰発現を示す図。The figure which shows the overexpression of IDI2-AS1 by the expression vector incorporating IDI2-AS1. SNHG15を組み込んだ発現ベクターによるSNHG15の過剰発現を示す図。The figure which shows the overexpression of SNHG15 by the expression vector incorporating SNHG15. GAS5、IDI2-AS1、SNHG15の発現量増加による細胞増殖率への影響を示す図。The figure which shows the influence on the cell growth rate by the expression level increase of GAS5, IDI2-AS1, and SNHG15. GAS5、IDI2-AS1、SNHG15をそれぞれ過剰発現させた細胞におけるシクロヘキシミドの作用を示す図。The figure which shows the effect | action of a cycloheximide in the cell which overexpressed GAS5, IDI2-AS1, and SNHG15, respectively. GAS5、IDI2-AS1、SNHG15をそれぞれ過剰発現させた細胞における塩化水銀の作用を示す図。The figure which shows the effect | action of mercury chloride in the cell which overexpressed GAS5, IDI2-AS1, and SNHG15, respectively. GAS5、IDI2-AS1、SNHG15をそれぞれ過剰発現させた細胞における過酸化水素水の作用を示す図。The figure which shows the effect | action of the hydrogen-peroxide solution in the cell which overexpressed GAS5, IDI2-AS1, and SNHG15, respectively. GAS5、IDI2-AS1、SNHG15をそれぞれ過剰発現させた細胞における紫外線の作用を示す図。The figure which shows the effect | action of the ultraviolet-ray in the cell which overexpressed GAS5, IDI2-AS1, and SNHG15, respectively. GAS5、GAS5およびIDI2-AS1、GAS5およびSNHG15をそれぞれ過剰発現させた細胞における紫外線の作用を示す図。The figure which shows the effect | action of the ultraviolet-ray in the cell which overexpressed GAS5, GAS5 and IDI2-AS1, GAS5, and SNHG15, respectively. GAS5、GAS5およびIDI2-AS1、GAS5およびSNHG15をそれぞれ過剰発現させた細胞における紫外線の照射後経過時間とその作用の関係を示す図。The figure which shows the relationship between the time after irradiation of the ultraviolet-ray in the cell which overexpressed GAS5, GAS5 and IDI2-AS1, GAS5, and SNHG15, respectively, and its effect | action.

次に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Next, although an Example demonstrates this invention further more concretely, this invention is not limited to these Examples.

（実施例１）化学物質の暴露により発現量が顕著に増加するノンコーディングRNAのスクリーニング(その１)
ヒト細胞株であるHEK293細胞(2×10⁵ cells/12 well plate)に対して、細胞培液に、Cycloheximide(Wako)を0または100μMを添加した系を準備した。それぞれの試薬はDMSOで希釈した。
この状態で、37℃、5％CO₂条件下で24時間インキュベートした後、RNAiso plus(TaKaRa)を用いて、細胞回収及びtotal RNA抽出を行った。
得られたtotal RNA 500ngについて、PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)を用いて逆転写反応を行い、THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix(TOYOBO)を用いてリアルタイムPCRを行うことで、先行研究により細胞内で分解速度が速いことが報告されている、機能既知および機能未知を含むノンコーディングRNA ２４種類、並びにGAPDHの発現量を測定し、それぞれのノンコーディングRNAの定量値をGAPDH遺伝子の定量値でノーマライズした(図１)。
その結果、化学物質添加時に、GAS5、IDI2-AS1、SNHG15の３種類のRNAの発現量が、化学物質を添加していないときに比べて8倍以上増加していることがわかった。
なお、リアルタイムPCRで用いたプライマーは以下の通りである。
CDKN2B-AS1 forward primer: 5’- TTGTTAGAAACCAGGCTGCAC -3’
CDKN2B-AS1 reverse primer: 5’- TTCTCTCTTTCTGTGGTTTCTCAAT -3’
HOTAIR forward primer: 5’- CAGTGGGGAACTCTGACTCG -3’
HOTAIR reverse primer: 5’- GTGCCTGGTGCTCTCTTACC -3’
TUG1 forward primer: 5’- CCAGACCCTCAGTGCAAACT -3’
TUG1 reverse primer: 5’- AATCAGGAGGCACAGGACA -3’
GAS5 forward primer: 5’- CTTGCCTGGACCAGCTTAAT -3’
GAS5 reverse primer: 5’- CAAGCCGACTCTCCATACCT -3’
MIR22HG forward primer: 5’- CGGACGCAGTGATTTGCT -3’
MIR22HG reverse primer: 5’- GCTTTAGCTGGGTCAGGACA -3’
FLJ43663 forward primer: 5’- GGGATAATTTGCCATCTGGA -3’
FLJ43663 reverse primer: 5’- CCGTTTCTTCCATTTTCCTCT -3’
LOC100216545 forward primer: 5’- CAGCCAAAATCTGGCCTACT -3’
LOC100216545 reverse primer: 5’- GTCCAGCAATCATTTTCTCGT -3’
LINC00667 forward primer: 5’- AGTTTGCGCCTTTTGGTCT -3’
LINC00667 reverse primer: 5’- GGCCATGTGCAAAGGATTT -3’
HCG18 forward primer: 5’- CTGCCTTCTAGGGGCTCACT -3’
HCG18 reverse primer: 5’- ACATGCTCCACCAACTTTCA -3’
LOC550112 forward primer: 5’- CTGAAATCAGAGCCTGCACA -3’
LOC550112 reverse primer: 5’- TCAAGGACCTGGAAATGACC -3’
LINC00662 forward primer: 5’- GTTTGATTTCTCGCAGACCAG -3’
LINC00662 reverse primer: 5’- GCGAGGTCTAACCCAGGTG -3’
GABPB1-AS1 forward primer: 5’- AGGGAAAGAAAATATGCCATTTCTA -3’
GABPB1-AS1 reverse primer: 5’- ATCATTCCGCCGCTTTCT -3’
FLJ33630 forward primer: 5’- GCAATTATCACGGGAAACCTAT -3’
FLJ33630 reverse primer: 5’- AAATCTTATCTGCTTCCCTATTTGTAA -3’
TTN-AS1 forward primer: 5’- TCCTTAGGCATCACCTAGCC -3’
TTN-AS1 reverse primer: 5’- GATGGAGGAAGTAGAGTCATTGG -3’
LOC728431 forward primer: 5’- CACTCCCTAACCCGTGTCC -3’
LOC728431 reverse primer: 5’- TCCATCAAAGCAGCCAGAC -3’
LINC00473_v1 forward primer: 5’- TATGCGCGTCAGCATACTTT -3’
LINC00473_v1 reverse primer: 5’- TGTCCTGTGCCTCCCTGT -3’
LINC00473_v2 forward primer: 5’- TATGCGCGTCAGCATACTTT -3’
LINC00473_v2 reverse primer: 5’- TCTCCCAAAGCACAACGAG -3’
FAM222A-AS1 forward primer: 5’- CAACATGGAAATGGAGACCA -3’
FAM222A-AS1 reverse primer: 5’- CTTCCGGGATCCCAGTGT -3’
LINC00152 forward primer: 5’- GAGCCACCAGCCTCTCCT -3’
LINC00152 reverse primer: 5’- AAAAACGATCTTGCCGACAC -3’
LINC0541471_v1 forward primer: 5’- CAGATCTTCACAGCACAGTTCC -3’
LINC0541471_v1 reverse primer: 5’- TGCTGATCCACTTTGCTTGT -3’
LINC0541471_v2 forward primer: 5’- CACCAGCCTCTCCCTGAA -3’
LINC0541471_v2 reverse primer: 5’- TTCGATCAAGTGTGTCATAGAGC -3’
IDI2-AS1 forward primer: 5’- GTGTTAAACAAGACAACGCTGAA -3’
IDI2-AS1 reverse primer: 5’- AAGAGCGCTGGAAAAACCTT -3’
SNHG15 forward primer: 5’- GCAACTCCTTTGCAAGATGC -3’
SNHG15 reverse primer: 5’- CTCAAGGAGGGACCTCAGC -3’
ZFP91-CNTF forward primer: 5’- TTGTTCATACTTGGCGGTGA -3’
ZFP91-CNTF reverse primer: 5’- GGCGGGCCTAATCATTTT -3’
GAPDH forward primer: 5’- GCACCGTCAAGGCTGAGAAC -3’
GAPDH reverse primer: 5’- TGGTGAAGACGCCAGTGGA -3’ (Example 1) Screening of non-coding RNA whose expression level is markedly increased by chemical exposure (Part 1)
A system was prepared by adding 0 or 100 μM of cycloheximide (Wako) to the cell culture medium for HEK293 cells (2 × 10 ⁵ cells / 12 well plate) which is a human cell line. Each reagent was diluted with DMSO.
In this state, the cells were incubated at 37 ° C. under 5% CO ₂ for 24 hours, and then cell recovery and total RNA extraction were performed using RNAiso plus (TaKaRa).
500 ng of the total RNA obtained was subjected to reverse transcription using PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) and real-time PCR using THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix (TOYOBO). Twenty-four types of non-coding RNAs with known and unknown functions, which are reported to be fast, and the expression level of GAPDH were measured, and the quantitative values of each non-coding RNA were normalized with the quantitative values of the GAPDH gene ( (Fig. 1).
As a result, it was found that the expression levels of three kinds of RNAs, GAS5, IDI2-AS1, and SNHG15, increased by 8 times or more when a chemical substance was added compared to when no chemical substance was added.
The primers used in real-time PCR are as follows.
CDKN2B-AS1 forward primer: 5'- TTGTTAGAAACCAGGCTGCAC -3 '
CDKN2B-AS1 reverse primer: 5'- TTCTCTCTTTCTGTGGTTTCTCAAT -3 '
HOTAIR forward primer: 5'- CAGTGGGGAACTCTGACTCG -3 '
HOTAIR reverse primer: 5'- GTGCCTGGTGCTCTCTTACC -3 '
TUG1 forward primer: 5'- CCAGACCCTCAGTGCAAACT -3 '
TUG1 reverse primer: 5'- AATCAGGAGGCACAGGACA -3 '
GAS5 forward primer: 5'- CTTGCCTGGACCAGCTTAAT -3 '
GAS5 reverse primer: 5'- CAAGCCGACTCTCCATACCT -3 '
MIR22HG forward primer: 5'- CGGACGCAGTGATTTGCT -3 '
MIR22HG reverse primer: 5'- GCTTTAGCTGGGTCAGGACA -3 '
FLJ43663 forward primer: 5'- GGGATAATTTGCCATCTGGA -3 '
FLJ43663 reverse primer: 5'- CCGTTTCTTCCATTTTCCTCT -3 '
LOC100216545 forward primer: 5'- CAGCCAAAATCTGGCCTACT -3 '
LOC100216545 reverse primer: 5'- GTCCAGCAATCATTTTCTCGT -3 '
LINC00667 forward primer: 5'- AGTTTGCGCCTTTTGGTCT -3 '
LINC00667 reverse primer: 5'- GGCCATGTGCAAAGGATTT -3 '
HCG18 forward primer: 5'- CTGCCTTCTAGGGGCTCACT -3 '
HCG18 reverse primer: 5'- ACATGCTCCACCAACTTTCA -3 '
LOC550112 forward primer: 5'- CTGAAATCAGAGCCTGCACA -3 '
LOC550112 reverse primer: 5'- TCAAGGACCTGGAAATGACC -3 '
LINC00662 forward primer: 5'- GTTTGATTTCTCGCAGACCAG -3 '
LINC00662 reverse primer: 5'- GCGAGGTCTAACCCAGGTG -3 '
GABPB1-AS1 forward primer: 5'- AGGGAAAGAAAATATGCCATTTCTA -3 '
GABPB1-AS1 reverse primer: 5'- ATCATTCCGCCGCTTTCT -3 '
FLJ33630 forward primer: 5'- GCAATTATCACGGGAAACCTAT -3 '
FLJ33630 reverse primer: 5'- AAATCTTATCTGCTTCCCTATTTGTAA -3 '
TTN-AS1 forward primer: 5'- TCCTTAGGCATCACCTAGCC -3 '
TTN-AS1 reverse primer: 5'- GATGGAGGAAGTAGAGTCATTGG -3 '
LOC728431 forward primer: 5'- CACTCCCTAACCCGTGTCC -3 '
LOC728431 reverse primer: 5'- TCCATCAAAGCAGCCAGAC -3 '
LINC00473_v1 forward primer: 5'- TATGCGCGTCAGCATACTTT -3 '
LINC00473_v1 reverse primer: 5'- TGTCCTGTGCCTCCCTGT -3 '
LINC00473_v2 forward primer: 5'- TATGCGCGTCAGCATACTTT -3 '
LINC00473_v2 reverse primer: 5'- TCTCCCAAAGCACAACGAG -3 '
FAM222A-AS1 forward primer: 5'- CAACATGGAAATGGAGACCA -3 '
FAM222A-AS1 reverse primer: 5'- CTTCCGGGATCCCAGTGT -3 '
LINC00152 forward primer: 5'- GAGCCACCAGCCTCTCCT -3 '
LINC00152 reverse primer: 5'- AAAAACGATCTTGCCGACAC -3 '
LINC0541471_v1 forward primer: 5'- CAGATCTTCACAGCACAGTTCC -3 '
LINC0541471_v1 reverse primer: 5'- TGCTGATCCACTTTGCTTGT -3 '
LINC0541471_v2 forward primer: 5'- CACCAGCCTCTCCCTGAA -3 '
LINC0541471_v2 reverse primer: 5'- TTCGATCAAGTGTGTCATAGAGC -3 '
IDI2-AS1 forward primer: 5'- GTGTTAAACAAGACAACGCTGAA -3 '
IDI2-AS1 reverse primer: 5'- AAGAGCGCTGGAAAAACCTT -3 '
SNHG15 forward primer: 5'- GCAACTCCTTTGCAAGATGC -3 '
SNHG15 reverse primer: 5'- CTCAAGGAGGGACCTCAGC -3 '
ZFP91-CNTF forward primer: 5'- TTGTTCATACTTGGCGGTGA -3 '
ZFP91-CNTF reverse primer: 5'- GGCGGGCCTAATCATTTT -3 '
GAPDH forward primer: 5'- GCACCGTCAAGGCTGAGAAC -3 '
GAPDH reverse primer: 5'- TGGTGAAGACGCCAGTGGA -3 '

（実施例２）化学物質の暴露により発現量が顕著に増加するノンコーディングRNAのスクリーニング(その２)
実施例１において化学物質添加時にRNAの発現量が顕著に増加した、GAS5、IDI2-AS1、SNHG15の3種について、それらの発現量と化学物質の添加量との相関性をさらに詳細に調べた。
ヒト細胞であるHEK293細胞(2×10⁵ cells/12 well plate)に対して、細胞培液に、Cycloheximide(Wako)を0、1、10、または100μM添加した系を、それぞれ準備した。それぞれの試薬はDMSOで希釈した。
この状態で、37℃、5％CO₂条件下で24時間インキュベートした後、RNAiso plus(TaKaRa)を用いて、細胞回収及びtotal RNA抽出を行った。得られたtotal RNA 500ngを、PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)を用いて逆転写反応を行い、THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix(TOYOBO)を用いてリアルタイムPCRを行うことで、機能既知のノンコーディングRNAであるGAS5、機能未知のノンコーディングRNAであるIDI2-AS1およびSNHG15、並びにGAPDHの発現量を測定し、それぞれのノンコーディングRNAの定量値をGAPDH遺伝子の定量値でノーマライズした(図２)。
その結果、上記のGAS5、IDI2-AS1、SNHG15の３種類のRNAの発現量は、それぞれ化学物質濃度依存的に増加していることがわかった。
さらに、これらのRNAの配列の共通性を探索した結果、RNAの不安定性に寄与するとされているAU-rich element(AUUUAモチーフ)を、GAS5は１つ、IDI2-AS1は１つ、SNHG15は２つ、3’側に有している事を見出した。従って、これらのRNAは配列に共通性を有する。 (Example 2) Screening of non-coding RNA whose expression level is markedly increased by chemical exposure (Part 2)
In Example 1, the expression level of RNA was remarkably increased at the time of chemical substance addition, and the correlation between the expression level and the chemical substance addition amount was examined in more detail for three types of GAS5, IDI2-AS1, and SNHG15. .
For HEK293 cells (2 × 10 ⁵ cells / 12 well plate), which are human cells, systems were prepared by adding 0, 1, 10, or 100 μM of cycloheximide (Wako) to the cell culture medium. Each reagent was diluted with DMSO.
In this state, the cells were incubated at 37 ° C. under 5% CO ₂ for 24 hours, and then cell recovery and total RNA extraction were performed using RNAiso plus (TaKaRa). 500 ng of the total RNA obtained was subjected to reverse transcription using PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) and real-time PCR using THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix (TOYOBO). The expression levels of certain GAS5, noncoding RNAs with unknown functions, IDI2-AS1 and SNHG15, and GAPDH were measured, and the quantitative values of each noncoding RNA were normalized with the quantitative values of the GAPDH gene (FIG. 2).
As a result, it was found that the expression levels of the above three types of RNAs, GAS5, IDI2-AS1, and SNHG15, increased depending on the chemical concentration.
Furthermore, as a result of searching for the commonality of the sequences of these RNAs, GAS5 is one, IDI2-AS1 is one, and SNHG15 is two AU-rich elements (AUUUA motif) that are considered to contribute to RNA instability. I found it on the 3 'side. Therefore, these RNAs have sequence commonality.

（実施例３）GAS5を組み込んだ発現ベクターによるGAS5の過剰発現
哺乳動物細胞用発現ベクターであるpcDNA3.1(+)(Invitrogen)を用いて、T7プロモーター直下にヒトのGAS5の塩基配列(NCBI番号：NR_002578の1塩基目から631塩基目まで)を組み込んだベクターを作製した。
GAS5が挿入されたベクターおよびGAS5が挿入されていないベクター(Mockベクター)2.5μgを、Lipofectamine 2000 Reagent(Invitrogen)を用いてHEK293細胞(10⁶ cells/60 mm dish)にそれぞれ導入し、37℃、5％CO₂条件下で48時間インキュベートした後、RNAiso plus(TaKaRa)を用いて、細胞回収及びtotal RNA抽出を行った。
得られたtotal RNA 500ngについて、PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)を用いて逆転写反応を行い、THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix(TOYOBO)を用いてリアルタイムPCRを行うことで、GAS5およびGAPDHの発現量を測定し、GAS5の定量値をGAPDHの定量値でノーマライズした(図３)。
その結果、GAS5が挿入されていないベクターを導入したものに比べ、GAS5が挿入されたベクターを導入したものでは、GAS5が約66倍高く発現していることがわかった。 (Example 3) Overexpression of GAS5 with expression vector incorporating GAS5 Using pcDNA3.1 (+) (Invitrogen), which is an expression vector for mammalian cells, the base sequence of human GAS5 (NCBI number) directly under the T7 promoter : From NR_002578 from the 1st base to the 631th base).
GAS5 inserted vector and GAS5 non-inserted vector (Mock vector) 2.5 μg were introduced into HEK293 cells (10 ⁶ cells / 60 mm dish) using Lipofectamine 2000 Reagent (Invitrogen), 37 ° C, After incubation for 48 hours under 5% CO ₂ conditions, cell recovery and total RNA extraction were performed using RNAiso plus (TaKaRa).
About 500 ng of the total RNA obtained, reverse transcription reaction using PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time), and real-time PCR using THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix (TOYOBO), the expression level of GAS5 and GAPDH The GAS5 quantitative value was normalized with the GAPDH quantitative value (FIG. 3).
As a result, it was found that GAS5 was expressed approximately 66 times higher in the vector into which GAS5 was inserted than in the vector into which GAS5 was not inserted.

（実施例４）IDI2-AS1を組み込んだ発現ベクターによるIDI2-AS1の過剰発現
哺乳動物細胞用発現ベクターであるpcDNA3.1(+)(Invitrogen)を用いて、T7プロモーター直下にヒトのIDI2-AS1の塩基配列(NCBI番号：NR_024628の1塩基目から1088塩基目まで)を組み込んだベクターを作製した。
IDI2-AS1が挿入されたベクターおよびIDI2-AS1が挿入されていないベクター(Mockベクター)2.5μgを、Lipofectamine 2000 Reagent(Invitrogen)を用いてHEK293細胞(10⁶ cells/60 mm dish)にそれぞれ導入し、37℃、5％CO₂条件下で48時間インキュベートした後、RNAiso plus(TaKaRa)を用いて、細胞回収及びtotal RNA抽出を行った。
得られたtotal RNA 500ngについて、PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)を用いて逆転写反応を行い、THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix(TOYOBO)を用いてリアルタイムPCRを行うことで、IDI2-AS1およびGAPDHの発現量を測定し、IDI2-AS1の定量値をGAPDHの定量値でノーマライズした(図４)。
その結果、IDI2-AS1が挿入されていないベクターを導入したものに比べ、IDI2-AS1が挿入されたベクターを導入したものでは、IDI2-AS1が約41497倍高く発現していることがわかった。 Example 4 Overexpression of IDI2-AS1 with an expression vector incorporating IDI2-AS1 Using pcDNA3.1 (+) (Invitrogen), an expression vector for mammalian cells, human IDI2-AS1 is directly under the T7 promoter. A vector in which the nucleotide sequence (NCBI number: NR_024628 from the 1st base to the 1088th base) was incorporated was prepared.
Introduce 2.5 μg of IDI2-AS1 and non-IDI2-AS1 vectors (Mock vector) into HEK293 cells (10 ⁶ cells / 60 mm dish) using Lipofectamine 2000 Reagent (Invitrogen). After incubating at 37 ° C. and 5% CO ₂ for 48 hours, cell recovery and total RNA extraction were performed using RNAiso plus (TaKaRa).
About 500 ng of the total RNA obtained, reverse transcription reaction using PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) and real-time PCR using THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix (TOYOBO) allow expression of IDI2-AS1 and GAPDH The amount was measured, and the quantitative value of IDI2-AS1 was normalized with the quantitative value of GAPDH (FIG. 4).
As a result, it was found that IDI2-AS1 was expressed approximately 41497 times higher in the vector into which IDI2-AS1 was inserted than in the vector into which IDI2-AS1 was not inserted.

（実施例５）SNHG15を組み込んだ発現ベクターによるSNHG15の過剰発現
哺乳動物細胞用発現ベクターであるpcDNA3.1(+)(Invitrogen)を用いて、T7プロモーター直下にヒトのSNHG15の塩基配列(NCBI番号：NR_003697の1塩基目から808塩基目まで)を組み込んだベクターを作製した。
SNHG15が挿入されたベクターおよびSNHG15が挿入されていないベクター(Mockベクター)2.5μgを、Lipofectamine 2000 Reagent(Invitrogen)を用いてHEK293細胞(10⁶ cells/60 mm dish)にそれぞれ導入し、37℃、5％CO₂条件下で48時間インキュベートした後、RNAiso plus(TaKaRa)を用いて、細胞回収及びtotal RNA抽出を行った。
得られたtotal RNA 500ngについて、PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)を用いて逆転写反応を行い、THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix(TOYOBO)を用いてリアルタイムPCRを行うことで、SNHG15およびGAPDHの発現量を測定し、SNHG15の定量値をGAPDHの定量値でノーマライズした(図５)。
その結果、SNHG15が挿入されていないベクターを導入したものに比べ、SNHG15が挿入されたベクターを導入したものでは、SNHG15が約56倍高く発現していることがわかった。 (Example 5) SNHG15 overexpression using an expression vector incorporating SNHG15 Using pcDNA3.1 (+) (Invitrogen), an expression vector for mammalian cells, the nucleotide sequence of human SNHG15 (NCBI number) directly under the T7 promoter : From NR_003697 to the 808th base).
2.5 μg of SNHG15 inserted vector and SNHG15 non-inserted vector (Mock vector) were introduced into HEK293 cells (10 ⁶ cells / 60 mm dish) using Lipofectamine 2000 Reagent (Invitrogen), 37 ° C, After incubation for 48 hours under 5% CO ₂ conditions, cell recovery and total RNA extraction were performed using RNAiso plus (TaKaRa).
About 500 ng of the obtained total RNA, reverse transcription reaction using PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time), and real-time PCR using THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix (TOYOBO), the expression levels of SNHG15 and GAPDH Measured, and the quantitative value of SNHG15 was normalized with the quantitative value of GAPDH (FIG. 5).
As a result, it was found that SNHG15 was expressed approximately 56 times higher in the vector into which SNHG15 was inserted than in the vector into which SNHG15 was not inserted.

（実施例６）GAS5、IDI2-AS1、SNHG15の発現量増加による細胞増殖率への影響
実施例３、４、５で用いたGAS5、IDI2-AS1またはSNHG15が挿入されたベクターおよび空ベクター2.5μgを、Lipofectamine 2000 Reagent(Invitrogen)を用いてHEK293細胞(10⁶ cells/60 mm dish)にそれぞれ導入し、37℃、5％CO2条件下で4時間インキュベートした後、細胞を60mm dishから96 well plateに植え替えた。
また、実施例３で用いたGAS5が挿入されたベクター2.5μg、実施例３で用いたGAS5が挿入されたベクター2.5μgおよび実施例４で用いたIGIDI2-AS1が挿入されたベクター2.5μg、実施例３で用いたGAS5が挿入されたベクター2.5μgおよび実施例４で用いたSNHG15が挿入されたベクター2.5μg、および空ベクター2.5μgを、Lipofectamine 2000 Reagent(Invitrogen)を用いてHEK293細胞(10⁶ cells/60 mm dish)にそれぞれ導入し、37℃、5％CO2条件下で4時間インキュベートした後、細胞を60mm dishから96 well plateに植え替えた。
続いて、37℃、5％CO₂条件下で0、24、48、または72時間インキュベートした後、Cell Counting Kit-8(Dojindo)を用いて生細胞カウントを行った(図６Ａおよび図６Ｂ)。n=4で実験を行った。
その結果、GAS5、IDI2-AS1またはSNHG15が挿入されたベクターを導入したもの、及びGAS5、GAS5およびIDI2-AS1、GAS5およびSNHG15が挿入されたベクターを導入したものは、空ベクターを導入したものに比べて、いずれも細胞増殖率に統計的に有意な差はみられなかった(t-test：p>0.01)。 (Example 6) Effect on cell proliferation rate by increasing expression levels of GAS5, IDI2-AS1, and SNHG15 Vector and empty vector 2.5 μg inserted with GAS5, IDI2-AS1, or SNHG15 used in Examples 3, 4, and 5 Were introduced into HEK293 cells (10 ⁶ cells / 60 mm dish) using Lipofectamine 2000 Reagent (Invitrogen) and incubated at 37 ° C under 5% CO2 for 4 hours, and then the cells were transferred from a 60 mm dish to a 96 well plate. I replanted it.
In addition, 2.5 μg of the vector inserted with GAS5 used in Example 3, 2.5 μg of the vector inserted with GAS5 used in Example 3, and 2.5 μg of the vector inserted with IGIDI2-AS1 used in Example 4, 2.5 μg of the vector inserted with GAS5 used in Example 3, 2.5 μg of the vector inserted with SNHG15 used in Example 4 and 2.5 μg of the empty vector were mixed with HEK293 cells (10 ⁶ ) using Lipofectamine 2000 Reagent (Invitrogen). cells / 60 mm dish) and incubated at 37 ° C. under 5% CO 2 for 4 hours, and then the cells were replanted from the 60 mm dish to a 96 well plate.
Subsequently, after incubation for 0, 24, 48, or 72 hours at 37 ° C. and 5% CO ₂ , live cell count was performed using Cell Counting Kit-8 (Dojindo) (FIGS. 6A and 6B). . Experiments were performed at n = 4.
As a result, GAS5, IDI2-AS1 or SNHG15 inserted vector, and GAS5, GAS5 and IDI2-AS1, GAS5 and SNHG15 inserted vector were introduced with an empty vector. In comparison, there was no statistically significant difference in cell growth rate (t-test: p> 0.01).

（実施例７）GAS5、IDI2-AS1、SNHG15をそれぞれ過剰発現させた細胞におけるシクロヘキシミドの作用
実施例３、４、５で用いたGAS5、IDI2-AS1またはSNHG15が挿入されたベクターおよび空ベクター2.5μgを、Lipofectamine 2000 Reagent(Invitrogen)を用いてHEK293細胞(10⁶ cells/60 mm dish)にそれぞれ導入し、37℃、5％CO₂条件下で4時間インキュベートした後、細胞を60mm dishから96 well plateに植え替えた。
続いて、37℃、5％CO₂条件下で20時間インキュベートした後、細胞培液にシクロヘキシミド(Wako)を0、1、10または100μM添加した。それぞれの試薬はDMSOで希釈した。その後、37℃、5％CO₂条件下で24時間インキュベートした後、Cell Counting Kit-8(Dojindo)を用いて生細胞カウントを行った(図７)。n=4で実験を行った。
その結果、GAS5、IDI2-AS1またはSNHG15が挿入されたベクターを導入したものについて、それぞれ、空ベクターを導入したものに比べ、生細胞の数の減少が見られ、特にGAS5が挿入されたベクターを導入したものでは、シクロヘキシミドの添加量が1μMにおいてすでに生細胞の数が統計的に有意に減少していることがわかった(t-test：p<0.01)。 (Example 7) Action of cycloheximide in cells overexpressing GAS5, IDI2-AS1 and SNHG15, respectively Vectors inserted with GAS5, IDI2-AS1 or SNHG15 used in Examples 3, 4 and 5 and empty vector 2.5 μg Were introduced into HEK293 cells (10 ⁶ cells / 60 mm dish) using Lipofectamine 2000 Reagent (Invitrogen) and incubated at 37 ° C. under 5% CO ₂ for 4 hours. Replanted to plate.
Subsequently, after 20 hours of incubation at 37 ° C. and 5% CO ₂ , 0, 1, 10 or 100 μM of cycloheximide (Wako) was added to the cell culture medium. Each reagent was diluted with DMSO. Thereafter, the cells were incubated for 24 hours under conditions of 37 ° C. and 5% CO ₂ , and then viable cell count was performed using Cell Counting Kit-8 (Dojindo) (FIG. 7). Experiments were performed at n = 4.
As a result, there was a decrease in the number of viable cells compared to those introduced with the empty vector for the vector into which GAS5, IDI2-AS1 or SNHG15 was introduced, respectively. It was found that the number of viable cells had already been statistically significantly reduced when the amount of cycloheximide added was 1 μM (t-test: p <0.01).

（実施例８）GAS5、IDI2-AS1、SNHG15をそれぞれ過剰発現させた細胞における塩化水銀の作用
実施例３、４、５で用いたGAS5、IDI2-AS1またはSNHG15が挿入されたベクターおよび空ベクター2.5μgを、Lipofectamine 2000 Reagent(Invitrogen)を用いてHEK293細胞(10⁶ cells/60 mm dish)にそれぞれ導入し、37℃、5％CO₂条件下で4時間インキュベートした後、細胞を60mm dishから96 well plateに植え替えた。
続いて、37℃、5％CO₂条件下で20時間インキュベートした後、細胞培液に塩化水銀(Mercury (II) Chloride)を0、0.1、1、または10μg/mL添加した。それぞれの試薬はDMSOで希釈した。その後、37℃、5％CO₂条件下で24時間インキュベートした後、Cell Counting Kit-8(Dojindo)を用いて生細胞カウントを行った(図８)。n=4で実験を行った。
その結果、塩化水銀の添加量1μg/mLにおいて、GAS5、IDI2-AS1またはSNHG15が挿入されたベクターを導入したものについて、それぞれ、空ベクターを導入したものに比べ、生細胞の数が統計的に有意に減少していることがわかった(t-test：p<0.01)。 Example 8 Effect of Mercury Chloride on Cells Overexpressing GAS5, IDI2-AS1, and SNHG15 Respective Vectors Including GAS5, IDI2-AS1, or SNHG15 Used in Examples 3, 4, and 5 and Empty Vector 2.5 μg was introduced into HEK293 cells (10 ⁶ cells / 60 mm dish) using Lipofectamine 2000 Reagent (Invitrogen) and incubated at 37 ° C. under 5% CO ₂ for 4 hours. Replanted into a well plate.
Subsequently, after incubation at 37 ° C. under 5% CO ₂ for 20 hours, 0, 0.1, 1, or 10 μg / mL of mercury chloride (Mercury (II) Chloride) was added to the cell culture medium. Each reagent was diluted with DMSO. Thereafter, the cells were incubated for 24 hours under conditions of 37 ° C. and 5% CO ₂ , and then live cell count was performed using Cell Counting Kit-8 (Dojindo) (FIG. 8). Experiments were performed at n = 4.
As a result, with the addition of mercury chloride at 1 μg / mL, the number of viable cells was statistically greater for the vector into which GAS5, IDI2-AS1 or SNHG15 was introduced compared to the vector into which the empty vector was introduced. It was found that there was a significant decrease (t-test: p <0.01).

（実施例９）GAS5、IDI2-AS1、SNHG15をそれぞれ過剰発現させた細胞における過酸化水素水の作用
実施例３、４、５で用いたGAS5、IDI2-AS1またはSNHG15が挿入されたベクターおよび空ベクター2.5μgを、Lipofectamine 2000 Reagent(Invitrogen)を用いてHEK293細胞(10⁶ cells/60 mm dish)にそれぞれ導入し、37℃、5％CO₂条件下で4時間インキュベートした後、細胞を60mm dishから96 well plateに植え替えた。
続いて、37℃、5％CO₂条件下で20時間インキュベートした後、細胞培液に過酸化水素水(H₂O₂)を0、20、40、60または80μM添加した。それぞれの試薬は水で希釈した。その後、37℃、5％CO₂条件下で24時間インキュベートした後、Cell Counting Kit-8(Dojindo)を用いて生細胞カウントを行った(図９)。n=4で実験を行った。
その結果、GAS5、IDI2-AS1またはSNHG15が挿入されたベクターを導入したものについて、それぞれ、過酸化水素水の添加量が20μMにおいて、すでに、空ベクターを導入したものに比べ、生細胞の数が統計的に有意に減少していることがわかった(t-test：p<0.01)。 (Example 9) Action of hydrogen peroxide solution in cells overexpressing GAS5, IDI2-AS1, and SNHG15, respectively . Vector and empty vector inserted with GAS5, IDI2-AS1, or SNHG15 used in Examples 3, 4, and 5 2.5 μg of vector was introduced into HEK293 cells (10 ⁶ cells / 60 mm dish) using Lipofectamine 2000 Reagent (Invitrogen) and incubated at 37 ° C, 5% CO ₂ for 4 hours. To 96 well plate.
Subsequently, after 20 hours of incubation at 37 ° C. and 5% CO ₂ , hydrogen peroxide water (H ₂ O ₂ ) was added to the cell culture medium at 0, 20, 40, 60, or 80 μM. Each reagent was diluted with water. Thereafter, the cells were incubated for 24 hours under conditions of 37 ° C. and 5% CO ₂ , and then live cell count was performed using Cell Counting Kit-8 (Dojindo) (FIG. 9). Experiments were performed at n = 4.
As a result, the number of viable cells in the vector into which GAS5, IDI2-AS1 or SNHG15 was introduced was higher than that in which the empty vector was already introduced, respectively, when the amount of hydrogen peroxide added was 20 μM. It was found that there was a statistically significant decrease (t-test: p <0.01).

（実施例１０）GAS5、IDI2-AS1、SNHG15をそれぞれ過剰発現させた細胞における紫外線の作用
実施例３、４、５で用いたGAS5、IDI2-AS1またはSNHG15が挿入されたベクターおよび空ベクター2.5μgを、Lipofectamine 2000 Reagent(Invitrogen)を用いてHEK293細胞(10⁶ cells/60 mm dish)にそれぞれ導入し、37℃、5％CO₂条件下で4時間インキュベートした後、細胞を60mm dishから96 well plateに植え替えた。
続いて、37℃、5％CO₂条件下で20時間インキュベートした後、細胞培液に紫外線を0、20,000、40,000、60,000または80,000 μJ/cm²照射した後、培地交換を行った。その後、37℃、5％CO₂条件下で24時間インキュベートした後、Cell Counting Kit-8(Dojindo)を用いて生細胞カウントを行った(図１０)。n=4で実験を行った。
その結果、GAS5またはIDI2-AS1が挿入されたベクターを導入したものについて、それぞれ、空ベクターを導入したものに比べ、生細胞の数の減少が見られ、特にIDI2-AS1が挿入されたベクターを導入したものでは、紫外線強度40,000μJ/cm²において、すでに生細胞の数が統計的に有意に減少していることがわかった(t-test：p<0.01)。 (Example 10) Action of ultraviolet rays on cells overexpressing GAS5, IDI2-AS1, and SNHG15, respectively , Vectors inserted with GAS5, IDI2-AS1, or SNHG15 used in Examples 3, 4, and 5 and empty vector 2.5 μg Were introduced into HEK293 cells (10 ⁶ cells / 60 mm dish) using Lipofectamine 2000 Reagent (Invitrogen) and incubated at 37 ° C. under 5% CO ₂ for 4 hours. Replanted to plate.
Subsequently, after 20 hours of incubation at 37 ° C. and 5% CO ₂ , the cell culture medium was irradiated with ultraviolet rays at 0, 20,000, 40,000, 60,000, or 80,000 μJ / cm ² and then the medium was changed. Thereafter, the cells were incubated for 24 hours under conditions of 37 ° C. and 5% CO ₂ , and then live cell count was performed using Cell Counting Kit-8 (Dojindo) (FIG. 10). Experiments were performed at n = 4.
As a result, the number of viable cells was reduced in each of the vectors into which GAS5 or IDI2-AS1 was inserted, compared to those in which the empty vector was introduced. It was found that the number of viable cells was already statistically significantly decreased at the ultraviolet intensity of 40,000 μJ / cm ² (t-test: p <0.01).

（実施例１１）GAS5、GAS5およびIDI2-AS1、GAS5およびSNHG15をそれぞれ過剰発現させた細胞における紫外線の作用
実施例３で用いたGAS5が挿入されたベクター2.5μg、実施例３で用いたGAS5が挿入されたベクター2.5μgおよび実施例４で用いたIGIDI2-AS1が挿入されたベクター2.5μg、実施例３で用いたGAS5が挿入されたベクター2.5μgおよび実施例４で用いたSNHG15が挿入されたベクター2.5μg、および空ベクター2.5μgを、Lipofectamine 2000 Reagent(Invitrogen)を用いてHEK293細胞(10⁶ cells/60 mm dish)にそれぞれ導入し、37℃、5％CO₂条件下で4時間インキュベートした後、細胞を60mm dishから96 well plateに植え替えた。
続いて、37℃、5％CO₂条件下で20時間インキュベートした後、細胞培液に紫外線を0、20,000、40,000、60,000または80,000μJ/cm²照射した後、培地交換を行った。その後、37℃、5％CO₂条件下で24時間インキュベートした後、Cell Counting Kit-8(Dojindo)を用いて生細胞カウントを行った(図１１)。n=4で実験を行った。
その結果、GAS5が挿入されたベクター、GAS5が挿入されたベクター及びIDI2-AS1が挿入されたベクター、または、GAS5が挿入されたベクター及びSNHG15が挿入されたベクターを導入したものについて、それぞれ、空ベクターを導入したものに比べ、生細胞の数の減少が見られ、特にGAS5が挿入されたベクター及びIDI2-AS1が挿入されたベクター、または、GAS5が挿入されたベクター及びSNHG15が挿入されたベクターを導入したものでは、20,000μJ/cm²から80,000μJ/cm²において、空ベクターやGAS5が挿入されたベクターを導入したものでは生細胞の数が90％以上に対して、それぞれ、生細胞の数が50％以下であり、統計的に有意に減少していることがわかった(t-test：p<0.01)。このように、紫外線については、GAS5が挿入されたベクターを単独導入したものに比べて、GAS5が挿入されたベクター及びIDI2-AS1が挿入されたベクター、または、GAS5が挿入されたベクター及びSNHG15が挿入されたベクターを導入したもので、生細胞の数が顕著に減少していることがわかった。 (Example 11) Action of ultraviolet rays in cells overexpressing GAS5, GAS5 and IDI2-AS1, GAS5 and SNHG15, respectively 2.5 μg of the vector into which GAS5 used in Example 3 was inserted, and GAS5 used in Example 3 2.5 μg of the inserted vector and 2.5 μg of the vector into which IGIDI2-AS1 used in Example 4 was inserted, 2.5 μg of the vector into which GAS5 used in Example 3 was inserted, and SNHG15 used in Example 4 were inserted 2.5 μg of vector and 2.5 μg of empty vector were introduced into HEK293 cells (10 ⁶ cells / 60 mm dish) using Lipofectamine 2000 Reagent (Invitrogen), respectively, and incubated at 37 ° C. and 5% CO ₂ for 4 hours. Thereafter, the cells were replanted from a 60 mm dish to a 96 well plate.
Subsequently, after 20 hours of incubation at 37 ° C. and 5% CO ₂ , the cell culture medium was irradiated with ultraviolet rays at 0, 20,000, 40,000, 60,000, or 80,000 μJ / cm ² and then the medium was changed. Then, after 24 hours of incubation at 37 ° C. and 5% CO ₂ , live cell count was performed using Cell Counting Kit-8 (Dojindo) (FIG. 11). Experiments were performed at n = 4.
As a result, the vector into which GAS5 was inserted, the vector into which GAS5 was inserted, the vector into which IDI2-AS1 was inserted, or the vector into which GAS5 was inserted and the vector into which SNHG15 was inserted were respectively empty. The number of living cells is reduced compared to the vector introduced, in particular, the vector inserted with GAS5 and the vector inserted with IDI2-AS1, or the vector inserted with GAS5 and the vector inserted with SNHG15 In the case of introducing a vector having an empty vector or GAS5 inserted at 20,000 μJ / cm ² to 80,000 μJ / cm ² , the number of viable cells is 90% or more, respectively. It was found that the number was 50% or less and decreased statistically (t-test: p <0.01). Thus, with respect to ultraviolet light, compared to a vector in which GAS5 is inserted alone, a vector in which GAS5 is inserted and a vector in which IDI2-AS1 is inserted, or a vector in which GAS5 is inserted and SNHG15 It was found that the number of viable cells was significantly reduced by introducing the inserted vector.

（実施例１２）GAS5、GAS5およびIDI2-AS1、GAS5およびSNHG15をそれぞれ過剰発現させた細胞における紫外線の照射後経過時間とその作用の関係
実施例１１と同様に、各ベクターをHEK293細胞(10⁶ cells/60 mm dish)にそれぞれ導入し、37℃、5％CO₂条件下で4時間インキュベートした後、細胞を60mm dishから96 well plateに植え替えた。
続いて、37℃、5％CO₂条件下で20時間インキュベートした後、細胞培液に紫外線を80,000 μJ/cm²照射した。その後、37℃、5％CO₂条件下で0、6、24時間インキュベートした後、Cell Counting Kit-8(Dojindo)を用いて生細胞カウントを行った(図１２)。n=4で実験を行った。
その結果、GAS5が挿入されたベクター及びIDI2-AS1が挿入されたベクターを導入したもの、および、GAS5が挿入されたベクター及びSNHG15が挿入されたベクターを導入したものでは、空ベクターを導入したものに比べて、6時間の時点ですでに生細胞の数が統計的に有意に減少していることがわかった(t-test：p<0.01)。 (Example 12) Relationship between the time after irradiation with ultraviolet rays and the action thereof in cells overexpressing GAS5, GAS5 and IDI2-AS1, GAS5 and SNHG15, respectively In the same manner as in Example 11, each vector was transferred to HEK293 cells (10 ⁶ cells / 60 mm dish) and incubated at 37 ° C. under 5% CO ₂ for 4 hours, and then the cells were replanted from the 60 mm dish to a 96 well plate.
Subsequently, after 20 hours of incubation at 37 ° C. and 5% CO ₂ , the cell culture medium was irradiated with ultraviolet rays at 80,000 μJ / cm ² . Thereafter, the cells were incubated for 0, 6, and 24 hours under conditions of 37 ° C. and 5% CO ₂ , and then live cell count was performed using Cell Counting Kit-8 (Dojindo) (FIG. 12). Experiments were performed at n = 4.
As a result, a vector with GAS5 inserted and a vector with IDI2-AS1 inserted, and a vector with GAS5 inserted and a vector with SNHG15 introduced, with an empty vector introduced Compared to the above, it was found that the number of viable cells had already decreased statistically significantly at 6 hours (t-test: p <0.01).

本発明の方法は、環境ストレスが生体に与える影響について迅速かつ高感度で、総合的な知見を得ることができ、環境ストレスについての診断分野、検査分野、研究分野などにおいて使用できる。 The method of the present invention can quickly and highly sensitively obtain comprehensive knowledge about the influence of environmental stress on a living body, and can be used in the diagnostic field, examination field, research field, and the like regarding environmental stress.

Claims

A method for enhancing the sensitivity of a cultured cell to environmental stress by highly expressing one or more RNA molecules selected from GAS5, IDI2-AS1 and SNHG15 in the cultured cell.

The method according to claim 1, wherein the RNA molecule is GAS5.

The method according to claim 1, characterized in that the RNA molecule is IDI2-AS1 or SNHG15.

2. The method according to claim 1, characterized in that the RNA molecules are GAS5 and IDI2-AS1.

The method according to claim 1, characterized in that the RNA molecules are GAS5 and SNHG15.

The method according to any one of claims 1 to 5, wherein the cultured cells are mammalian cultured cells.

The method according to claim 1, wherein the environmental stress is an environmental stress caused by a chemical substance.

The method according to claim 1, wherein the environmental stress is an environmental stress caused by ultraviolet rays.

The cultured cell made highly sensitive to environmental stress by the method according to any one of claims 1 to 8.

A method for evaluating environmental stress, wherein the cultured cell according to claim 9 is used.

An apparatus for evaluating environmental stress, comprising the cultured cell according to claim 9.

Applying environmental stress to mammalian cells, identify RNA molecules that increase the expression level of non-coding RNA molecules that rapidly degrade in mammalian cells, and the RNA molecules make the cells highly sensitive to environmental stress A screening method for RNA molecules which makes cells highly sensitive to environmental stress, characterized by testing whether or not.