JP2015027288A - ロドトルラ・ムチラギノーザから銅ナノ粒子を得る方法、および廃水のバイオレメディエーション、ならびに銅ナノ粒子の生産におけるロドトルラ・ムチラギノーザの使用 - Google Patents
ロドトルラ・ムチラギノーザから銅ナノ粒子を得る方法、および廃水のバイオレメディエーション、ならびに銅ナノ粒子の生産におけるロドトルラ・ムチラギノーザの使用 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】ロドトルラ・ムチラギノーザから銅ナノ粒子を得る方法。廃水のバイオレメディエーションの実行及び銅ナノ粒子の工業的規模での生産のためのロドトルラ・ムチラギノーザの死菌バイオマスを使用する方法。更に、還元剤として酵母ロドトルラ・ムチラギノーザを使用して、迅速で、低価格で、環境に優しく、容易に規模拡張可能な、銅ナノ粒子を生合成及び除去する合成方法。
【選択図】図1
Description
a.真菌ロドトルラ・ムチラギノーザを単離する工程、
b.工程aの単離真菌の銅耐性を決定する工程、
c.銅ストック溶液を調製する工程、
d.前記単離真菌を、培養培地YEPD液体培地に添加して、生菌バイオマスを生じさせる工程、
e.生菌バイオマスをオートクレーブに供して、死菌バイオマスを生じさせる工程、および
f.該生菌バイオマスおよび死菌バイオマス中の銅ナノ粒子の滞留を決定する工程、
を含んでなる方法に関する。
初期金属濃度、pH、温度、撹拌、および種菌量の関数として、酵母の死菌バイオマスおよび生菌バイオマスへの銅の生物吸着の平衡および動態試験を行った。
ロドトルラ・ムチラギノーザは、カナラン・ドス・カラジャース(Canaa dos Carajas)、パラ(Para)、ブラジルアマゾン地域(南緯06°26’および西経50°4’)に位置するソッセゴ(Sossego)鉱山の銅廃棄物の溜め池から採集した水から単離した。ロドトルラ・ムチラギノーザを、YEPD寒天培地(10g酵母エキスL−1、20gペプトンL−1、20gグルコースL−1、および20g寒天L−1)で維持および活性化し、培地化合物は、オクソイド(イングランド)から入手した(Machado MD, Soares EV, Soares HMVM (2010) Removal of heavy metals using a brewer's yeast strain of Saccharomyces cerevisiae: Chemical Speciation as a tool in the prediction and improving of treatment efficiency of real electroplating effluents. J Hazard Mater 180: 347-353)。
単離した酵母の銅耐性を、スポットプレート法(spot plate method)によって最小発育阻止濃度(MIC)として決定した。さまざまな濃度の銅(50〜3000mg・L−1)を含有するYEPD寒天培地プレートを調製し、試験する酵母の種菌を金属および対照プレート(金属を含まないプレート)上にスポットした。(Ahmad I, Ansari MI, Aqil F (2006) Biosorption of Ni, Cr and Cd by metal tolerante Aspergillus niger and Penicillium sp using single and multi-metal solution. Indian J Exp Biol 44: 73-76)。プレートを、25℃で少なくとも5日間インキュベーションした。MICは、目に見える単離菌の成長を阻害する金属の最低濃度として定義する。
3.1.吸着質溶液の調製
本試験で使用した化学薬品はすべて、分析グレードであり、さらに精製することなく使用した。希釈液はすべて、2回脱イオン水(ミリポアミリQ 伝導率18.2Ωcm−1)で調製した。銅ストック溶液を、CuCl22H20(Carlo Erba、イタリア)を2回脱イオン水に溶解することによって調製した。このストック溶液を希釈することによって、作業溶液を調製した。
真菌バイオマスを、YEPD液体培地(10g酵母エキスL−1、20gペプトンL−1、20gグルコースL−1)で調製し、25℃で5日間、150rpmでインキュベーションした。インキュベーション後、沈渣を採取し、2回脱イオン水で洗浄し、これを生菌バイオマスとした。死菌バイオマスの調製は、適当量の生菌バイオマスをオートクレーブした(Salvadori MR, Ando RA, do Nascimento CAO, Correa B (2014) Intracellular biosynthesis and removal of copper nanoparticles by dead biomass of yeast isolated from the wastewater of a mine in the Brazilian Amazonia. Plos One 9: 1-9)。
銅の除去について、pH(2〜6)、温度(20〜60℃)、接触時間(5〜360分)、初期銅濃度(25〜600mg・L−1)、および攪拌速度(50〜250rpm)を解析した。そのような実験を、プラスチックフラスコ中で、100mg L−1のCu(II)テスト試験溶液を45mL用いて所望のpH、温度、金属濃度、接触時間、攪拌速度、および生物吸着剤投与量(0.05〜0.75g)に最適化した。
R=(Ci−Ce)/Ci.100
(式中、CiおよびCeはそれぞれ、初期および平衡金属濃度である。)
金属取り込み能、qe、を以下の方程式を用いて算出した。
qe=V(Ci−Ce)/M
(式中、qe(mg・g−1)は任意の時間における生物吸着剤の生物吸着能、M(g)はバイオマス投与量、およびV(L)は溶液の量である。)
生物吸着は、次の吸着剤濃度、25〜600mg・L−1を用いてバッチ平衡法により分析した。フロイントリッヒおよびラングミュア等温式モデルを用いて、平衡データを当てはめた(Volesky B (2003) Biosorption process simulation tools. Hydrometallurgy 71: 179-190)。線形化ラングミュア等温式モデルは、
Ce/qe=1/(qm・b)+Ce/qm
であり、式中、qmは吸着剤の単分子層吸着能(mg・g−1)、bはラングミュア吸着定数(L・mg−1)である。線形化フロイントリッヒ等温式モデルは、
lnqe=lnKF+1/n.lnCe
であり、式中、KFは生物吸着能に関連する定数、1/nは吸着剤の吸着強度に関する。
Cu(II)生物吸着の速度動態の結果を、擬1次モデルおよび擬2次モデルを用いて解析した。線形擬1次モデルは、以下の方程式によって表わすことができる(Lagergren S (1898) About the theory of so called adsorption of soluble substances. Kung Sven Veten Hand 24: 1-39)。
log(qe−qt)=logqe−K1/2.303.t
(式中、qe(mg・g−1)およびqt(mg・g−1)はそれぞれ、平衡時間および任意の時間tおける吸着剤に吸着される金属の量であり、K1(分−1)は擬1次吸着プロセスの速度定数である。)
線形擬2次モデルは、以下の方程式によって表わすことができる(Ho YS, Mckay G (1999) Pseudo-second-order model for sorption process. Process Biochem 34: 451-465)。
t/qt=1/K2.qe 2+t/qe
(式中、K2(g・mg−1・分−1)は、擬2次の平衡速度定数である。)
生菌バイオマスと比較して、高い銅金属イオン吸着能を示したロドトルラ・ムチラギノーザの死菌バイオマスのみを、この試験では使用した。銅(II)溶液が100mg・L−1の濃度における平衡モデルデータを使用して、ロドトルラ・ムチラギノーザの死菌バイオマスによる銅ナノ粒子の生合成を調べた。
サイズ、形状、および生物吸着剤上の銅ナノ粒子を位置を決定するために、透過電子顕微鏡法(TEM)による解析を用い、検体の超薄切片を透過型電子顕微鏡(JEOL−1010)で観察した。
銅ナノ粒子の形成前後の生体材料小さい断片の分析をピンスタブ上で行ない、次いで真空下で金でコーティングし、エネルギー分散型分光計(EDS)を備えたJEOL 6460 LVでSEMによって試験した。
赤外振動分光法(FTIR)を使用して、バイオマスに存在する官能基を同定し、銅ナノ粒子の存在によって引き起こされるスペクトル変動を評価した。赤外吸収スペクトルを、ブルカーモデルALPHA干渉分光計で得た。試料を、単一反射の全反射測定法アクセサリー(白金−結晶ダイヤモンドを用いたATR)を使用して、試料コンパートメントに直接置いた。4cm−1のスペクトル分析能を用いて、試料各々について80スペクトルを蓄積した。
本試験は、バイオマス投与量、pH、温度、接触時間、撹拌速度、および金属イオン濃度などの物理化学的因子もよって、ロドトルラ・ムチラギノーザバイオマスによる銅除去が影響されることを示した。生物吸着剤投与量は、金属の所与の初期濃度に対する生物吸着剤の容量・能力を決定するため、重要なパラメーターである。
ラングミュアおよびフロイントリッヒ等温式モデルを使用して、生物吸着データを当てはめ、生物吸着能を決定した。2種類のロドトルラ・ムチラギノーザバイオマスから得られたCu(II)生物吸着に関するラングミュア等温式を図2Aおよび図2Bに示す。等温式定数、ラングミュアおよびフロイントリッヒモデルによって推定される最大積載能力、回帰係数を、表1に示す。ラングミュアモデルは、フロイントリッヒモデルと比べて、より良くCu(II)生物吸着等温式を説明した。この試験で観察されたロドトルラ・ムチラギノーザによるCu(II)の最大吸着率(26.2mg・g−1)は、吸着率がそれぞれ6.2、1.52、15.08、19.0、19.6、15.85、および2.76mg・g−1である、ウスラヒラタケ(Pleurotus pulmonaris)、シゾフィラム・コムーネ(Schizophyllum commune)、ペニシリウム属の複数種(Penicillium spp)、リゾプス・アリズス(Rhizopus arrhizus)、トリコデルマ・ビリデ(Trichoderma viride)、ピキア・スティピティス(Pichia stipitis)、ピクノポラス・サンギネウス(Pycnoporus sanguineus)などの他の公知の生物吸着剤に関して報告されている吸着率と同様かまたは高かった(Veit MT, Tavares CRG, Gomes-da-Costa SM, Guedes TA (2005) Adsorption isotherms of copper (II) for two species of dead fungi biomasses. Process Biochem 40: 3303-3308; Du A, Cao L, Zhang R, Pan R (2009) Effects of a copper-resistant fungus on copper adsorption and chemical forms in soils. Water Air Soil Poll 201: 99-107; Rome L, Gadd DM (1987) Copper adsorption by Rhizopus arrhizus, Cladosporium resinae and Penicillium italicum. Appl Microbiol Biotechnol 26: 84-90; Kumar BN, Seshadri N, Ramana DKV, Seshaiah K, Reddy AVR (2011) Equilibrium, Thermodynamic and Kinetic studies on Trichoderma viride biomass as biosorbent for the removal of Cu (II) from water. Separ Sci Technol 46: 997-1004; Yilmazer P, Saracoglu N (2009) Bioaccumulation and biosorption of copper (II) and chromium (III) from aqueous solutions by Pichia stiptis yeast. J Chem Technol Biot 84: 604-610; Yahaya YA, Matdom M, Bhatia S (2008) Biosorption of copper (II) onto immobilized cells of Pycnoporus sanguineus from aqueous solution: Equilibrium and Kinetic studies. Hazard Mater 161: 189-195)。
生物学的な系によるナノ粒子の形成の複雑な機序を研究することは、さらにより信頼でき、再現可能なその生合成の方法を決定するために重要である。真菌のバイオマスでのナノ粒子の形成の理解に向けて、一部分の死菌バイオマスをTEMによって調査した。ロドトルラ・ムチラギノーザにおけるナノ粒子の位置を調べると、電子顕微鏡像から、ナノ粒子の大部分が細胞内に見られ、対照ではナノ粒子が存在しないことが明らかになり、対照およびオートクレーブプロセスにより銅が浸潤したバイオマスでは、細胞質材料の萎縮などの超微細構造変化が観察された(図3Aおよび図3B)。ナノ粒子の形状およびサイズは、ナノスケール材料の物理的、化学的、光学的、および電子的性質を制御する最も重要な特徴のうちの2つである(Alivisatos AP (1996) Perspectives on the physical chemistry of semiconductor nanocrystals. J Phys Chem 100: 13226-13239; Aizpurua J, Hanarp P, Sutherland DS, KaII M, Bryant GW, et al. (2003) Optical properties of gold nanorings. Phys Rev Lett 90: 57401-57404)。
Claims (5)
- ロドトルラ・ムチラギノーザ(Rhodotorula mucilaginosa)から銅ナノ粒子を得る方法であって、
a.酵母ロドトルラ・ムチラギノーザを単離する工程、
b.工程aの単離真菌の銅耐性を決定する工程、
c.銅ストック溶液を調製する工程、
d.前記単離真菌を、培養培地YEPD液体培地に添加して、生菌バイオマスを生じさせる工程、
e.生菌バイオマスをオートクレーブに供して、死菌バイオマスを生じさせる工程、および
f.該生菌バイオマスおよび死菌バイオマス中の銅ナノ粒子の滞留を決定する工程、
を含んでなる方法 - 廃水のバイオレメディエーションの実行への、ロドトルラ・ムチラギノーザ抽出物から選択される酵母抽出物の使用。
- ロドトルラ・ムチラギノーザ抽出物がロドトルラ・ムチラギノーザの死菌体(dead mass)である、請求項2に記載の使用。
- 銅ナノ粒子の生産用である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の使用。
- ロドトルラ・ムチラギノーザから選択される酵母から、廃水のバイオレメディエーションの間に生産される銅ナノ粒子。
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