JP2015004540A - 流速測定方法および装置ならびに測定チップおよびプログラム - Google Patents

Abstract

【課題】２つの液を直列的に移送させている流路内で２つの液の接触領域の流速が変化する状態が測定できるようにする。【解決手段】屈折率境界算出部１０２が、屈折率測定部１０１により得られた屈折率指標値配列より屈折率境界を求め、屈折率境界関数算出部１０３が、屈折率境界算出部１０２が求めた屈折率境界より屈折率境界関数を求め、流速関数算出部１０４が、屈折率境界関数算出部１０３が求めた屈折率境界関数から流速関数を求める。【選択図】 図１

Description

本発明は、２つの液を直列的に移送させている流路内で２つの液の接触領域の流速を測定する流速測定方法および装置ならびに測定チップおよびプログラムに関する。

流路内の液体の流速を測定し、測定された流速の圧力依存性から、液体の粘度などの液体の物性値を求めることができる（非特許文献１参照）。流路内を液体が移動する速度（流速）は、流路内面壁での、化学反応，電気化学反応，吸着反応，脱離反応，および触媒反応において反応速度に影響する制御指標である。よって、上述した流速の変化を測定することにより、例えば、順次流路に導入された複数の液体の混合の状態、化学反応の進行状態などを判定（検査）することができる。

このような流路内の液体の流速の測定では、従来より、流路の途中に挿入した流速センサーを用いる方法や、専用の光学機器と試料にマーカーを混入する方法などが知られている（非特許文献２参照）。例えば、マイクロ流路内に、測定対象の液体とともに粒子または、顕微鏡観察で識別できる色素などを混入し、粒子や色素の動きから、画像処理によって流速を測定するＰＩＶ（Particle Image Velocimetry）法が知られている。しかしながら、この方法では、試料の状態を変えず、試料における本来の化学反応に影響を与えることなく測定をすることが容易ではない。

上述した方法に対し、マーカーフリーな流速測定方法として、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance；ＳＰＲ）を用いた流速測定技術がある（特許文献１参照）。この測定技術では、特に、微小体積サンプルの流速測定を、マイクロ流路を用いて行う場合に有用である。この技術では、流路の途中にＳＰＲによる測定面を設けるが、この測定面に垂直な方向の流路の寸法が、４００ｎｍまでは、測定の感度を落とさずに短くできる。これは、ＳＰＲの屈折率感度が測定面に局在しているためである。

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法では、金や銀などの基板表面から数百ｎｍの範囲の屈折率変化を選択的に検出するので、金属薄膜表面に厚さ数百ｎｍの分子認識膜があると、この薄膜の屈折率を選択的に測定できる。また、多重反射法と異なり、特定の反射面の位置で１回の反射で微小体積の測定でもバルク測定と同じ感度で測定でき、位置分解能が高いという利点がある。

ところで、一般に、マイクロ流路中の流れは層流になり、流速分布は断面形状から予想することができる（非特許文献３参照）。また、マイクロ流路は、流れの方向である長手方向に垂直な面の長さ（流路高さ）が短く（小さく）、特にこの面のアスペクト比が大きな場合に、流路高さは典型的には１００μｍ以下である。このようなマイクロ流路を、液体が層流で流れる場合、流路断面の中心では最高線流速になり、壁面では非常に小さな線流速になる。

屈折率の異なる２種類の混ざり合う液体を連続してマイクロ流路に流すと、２種類の液体が層流で流れる場合、２つの液体は流路を通過中に拡散により混合を起こしながら流れる。断面が矩形で直線流路の場合、特許文献１の方法で、上述した２液の接触する領域（屈折率境界）の移動速度から求めた流速は、混合のためＳＰＲで測定される壁面近傍の線流速が（ノイズとの識別が困難になる非常に遅い流速ではなく）中心線流に近い速度になるために、容易に測定が可能で、体積流速に変換することができる。

ＷＯ２００９／０９０９８５ 特開２０１１−２３２１３７号公報

P. A. Longwell著, 大谷寛治訳、「化学技術者のための流れ学」、共立出版、３７頁，１３４頁、１９７０年。 Nam-Trung Nguyen, Steven T. Wereley, "Fundamentals and applications of microfluidics", Artech House, Chapter 8, page 344, Figure 8.1, 2002. Kenneth S. Breuer, "Microscale DiagnosticTechniques", Springer-Verlag Berlin Heidelberg, page 81, 93, 2005.

しかしながら、特許文献１の方法では、屈折率境界の移動時間を計測しているために、マイクロ流路を流れる流速は、測定時間内で一定である必要があり、一定でない場合には誤差が生じる。

さらに、マイクロ流路内で化学反応が進行して粘度が変化する場合、マイクロ流路を流れる間に変化する流速を測定することが重要となる。例えば、血漿の凝固反応では、凝固の進行に伴う流路内の物質の粘性変化のために、流速が変化する。この流速変化から血液凝固能を測定することができるので、血液凝固能を測定するためには、流速変化を測定することが必要となる。

特許文献１では、ＳＰＲ測定で一般的な表面での反応を測定する方法で流れる２液は反応しない条件であるため、流路内の場所によらず相関の高い屈折率変化を対象にしていた。しかしこの場合でも、マイクロ流路の内では拡散が支配的であるために、マイクロ流路内を液体が上流から下流に流れるに従って、屈折率分布が変化していくため、実際には、流路内の屈折率分布は、流路の位置により相関が低くなる。

さらに、マイクロ流路の中で２種類の溶液が反応する場合は、一般には、流路内で不均一に起こるために、屈折率分布は時間的に変化する。

従って、マイクロ流路内の各位置における流速、および測定している時間内で時間的に変化している流速の状態を測定することが、２つの液体の接触領域における物性値を求めるためには非常に重要となる。

本発明は、以上のような問題点を解消するためになされたものであり、２つの液を直列的に移送させている流路内で２つの液の接触領域の流速が変化する状態が測定できるようにすることを目的とする。

本発明に係る流速測定方法は、流路の延在方向に直列に配列して隣り合う部分が接触して流路を流れる状態に、第１液および第２液をこの順に一定の圧力で流路に導入して流路を流れる状態とする試料導入ステップと、流路を流れる第１液と第２液とが接触する接触領域が、流路内の流路方向に配列された複数の測定箇所を通過する過程で、複数の測定箇所で流路内を通過する液体の屈折率を設定された時間間隔の複数の測定時刻で時系列に測定し、測定箇所毎および測定時刻毎に測定された複数の屈折率値からなる屈折率指標値配列を得る屈折率測定ステップと、得られた屈折率指標値配列より、各々の測定箇所において測定時刻の変位に対応して変化する屈折率値の中より求められる接触領域に対応する屈折率境界時刻、および各々の測定時刻において測定箇所の変化に対応して変化する屈折率の中より求められる接触領域に対応する屈折率境界位置のいずれかを求める屈折率境界算出ステップと、求めた屈折率境界時刻を測定箇所の配列順に並べた配列を連続に接続する屈折率境界時刻関数、および求めた屈折率境界位置を測定時刻の順に並べた配列を連続に接続する屈折率境界位置関数のいずれかを求める屈折率境界関数算出ステップと、求めた屈折率境界時刻関数の時間微分または屈折率境界位置関数の時間微分から、測定時刻における測定時刻流速関数または測定箇所における測定箇所流速関数を求める流速関数算出ステップと、求めた測定時刻流速関数または測定箇所流速関数より、設定した測定時刻における接触領域の速度、および設定した測定箇所における接触領域の速度のいずれかを求める流速算出ステップとを備える。

上記流速測定方法において、屈折率境界算出ステップでは、変化する屈折率の変化速度の極大値を与える測定時刻または測定箇所より屈折率境界時刻または屈折率境界位置を求める最大変化速度検出ステップ、第１液および第２液の中間の屈折率値を与える測定時刻または測定箇所より屈折率境界時刻または屈折率境界位置を求めるレベルクロス検出ステップ、変化する屈折率を示す曲線の曲率の絶対値が最大になる測定時刻または測定箇所より屈折率境界時刻または屈折率境界位置を求める曲率検出ステップのいずれかにより屈折率境界時刻または屈折率境界位置を算出するようにすればよい。

上記流速測定方法において、流路内の流路方向に配列された複数の測定箇所は、表面プラズモン共鳴に基づく屈折率変化を測定する第１測定箇所と全反射測定による屈折率変化を測定する第２測定箇所とが交互に配列され、複数の第１測定箇所および複数の第２測定箇所毎に、屈折率指標値配列を求め、求めた２つの屈折率指標値配列をもとに、設定した測定箇所における接触領域の速度または設定した測定時刻における接触領域の速度を求めるようにしてもよい。

本発明に係る流速測定装置は、流路の延在方向に直列に配列して隣り合う部分が接触して流路を流れる状態に、第１液および第２液をこの順に一定の圧力で流路に導入して流路を流れる状態として第１液と第２液とが接触する接触領域の流速を求める流速測定装置であって、複数の測定箇所で流路内を通過する液体の屈折率を設定された時間間隔の複数の測定時刻で時系列に測定し、測定箇所毎および測定時刻毎に測定された複数の屈折率値からなる屈折率指標値配列を得る屈折率測定手段と、屈折率測定手段により得られた屈折率指標値配列より、各々の測定箇所において測定時刻の変位に対応して変化する屈折率値の中より求められる屈折率境界時刻、および各々の測定時刻において測定箇所の変化に対応して変化する屈折率の中より求められる屈折率境界位置のいずれかを求める屈折率境界算出手段と、屈折率境界算出手段が求めた屈折率境界時刻を測定箇所の配列順に並べた配列を連続に接続する屈折率境界時刻関数、および求めた屈折率境界位置を測定時刻の順に並べた配列を連続に接続する屈折率境界位置関数のいずれかを求める屈折率境界関数算出手段と、屈折率境界関数算出手段が求めた屈折率境界時刻関数の時間微分または屈折率境界位置関数の時間微分から、測定時刻における測定時刻流速関数または測定箇所における測定箇所流速関数を求める流速関数算出手段と、流速関数算出手段が求めた測定時刻流速関数または測定箇所流速関数より、設定した測定時刻における接触領域の速度または設定した測定箇所における接触領域の速度を求める流速算出手段とを備え、屈折率境界算出手段は、変化する屈折率の変化速度の極大値を与える測定時刻または測定箇所より屈折率境界時刻または屈折率境界位置を求める最大変化速度検出手段、第１液および第２液の中間の屈折率値を与える測定時刻または測定箇所より屈折率境界時刻または屈折率境界位置を求めるレベルクロス検出手段、変化する屈折率を示す曲線の曲率の絶対値が最大になる測定時刻または測定箇所より屈折率境界時刻または屈折率境界位置を求める曲率検出手段の少なくとも１つを備える。

また、本発明に係る測定チップは、上記流速測定装置で用いる流路が形成された測定チップであり、流路内の流路方向に配列された複数の測定箇所は、表面プラズモン共鳴に基づく屈折率変化を測定する第１測定箇所と、全反射測定による屈折率変化を測定する第２測定箇所とが交互に配列されている。

また、本発明に係るプログラムは、コンピュータに前述した流速測定方法の各ステップを実行させるためのプログラムである。

以上説明したことにより、本発明によれば、２つの液を直列的に移送させている流路内で２つの液の接触領域の流速が変化する状態が測定できるようになるという優れた効果が得られる。

図１は、本発明の実施の形態における流速測定装置の構成を示す構成図である。 図２は、本発明の実施の形態における流速測定流速測定方法を説明するフローチャートである。 図３は、測定チップの構成を示す構成図である。 図４は、実施例１で得られた屈折率指標値配列を示す説明図である。 図５は、図４に示す屈折率指標値配列を時間方向に微分した結果得られた配列を示す説明図である。 図６は、実施例１で得られた屈折率境界配列の状態を示す説明図である。 図７は、実施例１で得られた屈折率境界時刻関数を示す説明図である。 図８は、実施例１で得られた測定時刻流速関数を示す説明図である。 図９は、流路内のＰ層の上にあるバルク層の屈折率が変化する場合の反射率の入射角度依存性を計算してＰ偏光反射率を等高線で表示した斜視図である。 図１０は、バルク層の屈折率変化に伴って変化するＰ層の臨界角度変化を示した斜視図である。 図１１は、流路内の２００ｎｍのＰ層の屈折率が変化してバルク層の屈折率が変化しない場合のＳＰＲ角度変化を示す斜視図である。 図１２は、流路内の２００ｎｍのＰ層の屈折率が変化してバルク層の屈折率が変化しない場合の臨界角度の状態を示す斜視図である。 図１３は、実施例２で得られた屈折率指標値配列を示す説明図である。 図１４は、図１３に示す屈折率指標値配列を時間方向に微分した結果得られた配列を示す説明図である。 図１５は、実施例２で得られた測定時刻流速関数を示す説明図である 図１６は、実施例３における屈折率境界の検出について説明するための説明図である。 図１７は、実施例４における測定チップの構成を示す平面図である。 図１８は、実施例４における測定の状態を説明する説明図である。

以下、本発明の実施の形態について図を参照して説明する。図１は、本発明の実施の形態における流速測定装置の構成を示す構成図である。この装置は、流路の延在方向に直列に配列して隣り合う部分が接触して流路を流れる状態に、第１液および第２液をこの順に一定の圧力で流路に導入して流路を流れる状態として第１液と第２液とが接触する接触領域の流速を求める流速測定装置であり、屈折率測定部１０１，屈折率境界算出部１０２，屈折率境界関数算出部１０３，流速関数算出部１０４，流速算出部１０５，およびフィルター部１０６を備える。

屈折率測定部１０１は、複数の測定箇所で流路内を通過する液体の屈折率を設定された時間間隔の複数の測定時刻で時系列に測定し、測定箇所毎および測定時刻毎に測定された複数の屈折率値からなる屈折率指標値配列を得る。

屈折率境界算出部１０２は、屈折率測定部１０１により得られた屈折率指標値配列より、各々の測定箇所において測定時刻の変位に対応して変化する屈折率値の中より求められる屈折率境界時刻、および各々の測定時刻において測定箇所の変化に対応して変化する屈折率の中より求められる屈折率境界位置のいずれかを求める。

屈折率境界関数算出部１０３は、屈折率境界算出部１０２が求めた屈折率境界時刻を測定箇所の配列順に並べた配列を連続に接続する屈折率境界時刻関数、および求めた屈折率境界位置を測定時刻の順に並べた配列を連続に接続する屈折率境界位置関数のいずれかを求める。

流速関数算出部１０４は、屈折率境界関数算出部１０３が求めた屈折率境界時刻関数の時間微分または屈折率境界位置関数の時間微分から、測定時刻における測定時刻流速関数または測定箇所における測定箇所流速関数を求める。

流速算出部１０５は、流速関数算出部１０４が求めた測定時刻流速関数または測定箇所流速関数より、設定した測定時刻における接触領域の速度または設定した測定箇所における接触領域の速度を求める。

また、屈折率境界算出部１０２は、最大変化速度検出部１２１，レベルクロス検出部１２２，曲率検出部１２３を備える。例えば、屈折率測定部１０１の測定により得られた屈折率指標値の特性により、屈折率境界算出部１０２では、最大変化速度検出部１２１，レベルクロス検出部１２２，曲率検出部１２３のいずれかを選択し、屈折率境界時刻または屈折率境界位置を算出する。

最大変化速度検出部１２１は、変化する屈折率の変化速度の極大値を与える測定時刻または測定箇所より屈折率境界時刻または屈折率境界位置を求める。レベルクロス検出部１２２は、第１液および第２液の中間の屈折率値を与える測定時刻または測定箇所より屈折率境界時刻または屈折率境界位置を求める。曲率検出部１２３は、変化する屈折率を示す曲線の曲率の絶対値が最大になる測定時刻または測定箇所より屈折率境界時刻または屈折率境界位置を求める。

なお、フィルター部１０６は、屈折率測定部１０１の測定により得られた屈折率指標値配列をフィルター処理し、ノイズを除去する。フィルター部１０６は、例えば、フーリエフィルター、多項式フィルターなどにより、屈折率指標値配列よりノイズを除去する。

次に、本発明の実施の形態における流速測定装置の動作（流速測定方法）について、図２のフローチャートを用いて説明する。

まず、ステップＳ２０１で、流路の延在方向に直列に配列して隣り合う部分が接触して流路を流れる状態に、第１液および第２液をこの順に一定の圧力で流路に導入して流路を流れる状態とする（試料導入ステップ）。

次に、ステップＳ２０２で、屈折率測定部１０１が、流路を流れる第１液と第２液とが接触する接触領域が、流路内の流路方向に配列された複数の測定箇所を通過する過程で、複数の測定箇所で流路内を通過する液体の屈折率を設定された時間間隔の複数の測定時刻で時系列に測定し、測定箇所毎および測定時刻毎に測定された複数の屈折率値からなる屈折率指標値配列を得る（屈折率測定ステップ）。

次に、ステップＳ２０３で、屈折率境界算出部１０２が、屈折率測定部１０１で測定されてフィルター部１０６によりノイズ除去された屈折率指標値配列より、各々の測定箇所において測定時刻の変位に対応して変化する屈折率値の中より求められる接触領域に対応する屈折率境界時刻、および各々の測定時刻において測定箇所の変化に対応して変化する屈折率の中より求められる接触領域に対応する屈折率境界位置のいずれかを求める（屈折率境界算出ステップ）。

次に、ステップＳ２０４で、屈折率境界関数算出部１０３が、屈折率境界算出部１０２で求めた屈折率境界時刻を測定箇所の配列順に並べた配列を連続に接続する屈折率境界時刻関数、および求めた屈折率境界位置を測定時刻の順に並べた配列を連続に接続する屈折率境界位置関数のいずれかを求める（屈折率境界関数算出ステップ）。

次に、ステップＳ２０５で、流速関数算出部１０４が、屈折率境界関数算出部１０３で求めた屈折率境界時刻関数の時間微分または屈折率境界位置関数の時間微分から、測定時刻における測定時刻流速関数または測定箇所における測定箇所流速関数を求める（流速関数算出ステップ）。屈折率境界位置関数の時間微分は、流速に比例し、屈折率境界時刻関数の時間微分は、この逆数が流速に比例する。

次に、ステップＳ２０６で、流速算出部１０５が、流速関数算出部１０４で求めた測定箇所流速関数または測定時刻流速関数より、設定した測定箇所における接触領域の速度または設定した測定時刻における接触領域の速度を求める（流速算出ステップ）。

ここで、ステップＳ２０３では、最大変化速度検出ステップ，レベルクロス検出ステップ，曲率検出ステップのいずれかにより、屈折率境界時刻または屈折率境界位置を算出する。最大変化速度検出ステップでは、変化する屈折率の変化速度の極大値を与える測定時刻または測定箇所より、屈折率境界時刻または屈折率境界位置を求める。レベルクロス検出ステップでは、第１液および第２液の中間の屈折率値を与える測定時刻または測定箇所より、屈折率境界時刻または屈折率境界位置を求める。曲率検出ステップでは、変化する屈折率を示す曲線の曲率の絶対値が最大になる測定時刻または測定箇所より、屈折率境界時刻または屈折率境界位置を求める。

ここで、屈折率境界算出部１０２における屈折率境界算出について説明する。前述したように、屈折率境界算出では、最大変化速度の検出，レベルクロスの検出，曲率の検出のいずれかにより屈折率境界時刻または屈折率境界位置を算出する。

最大変化速度の検出は、屈折率変化が微小で多段階の場合であっても屈折率境界時刻および屈折率境界を計算することができるが、そのノイズは比較的大きい。

レベルクロスの検出は、屈折率変化が１段階である場合にはノイズの少ない良好なデータを与えるが、２つの液の屈折率が接近している場合には不適である。

曲率の検出は、２つの液の接触領域における反応の進行状況によらず、後から送流した液の到達の検出には有効であるが、接触領域における混合が速く、屈折率変化が急峻に始まらない場合や、拡散で変化が緩やかになる下流ではノイズが増大する。

従って、得られた屈折率指標値の状態により、上述した各検出手段の特性を考慮していずれかを選択して屈折率境界時刻または屈折率境界位置を算出する。

ところで、同一の測定箇所で、屈折率境界が複数の時刻（時間）で存在する場合には、屈折率境界が連続するように選択する。このようにすることで、流路中で複数の化学反応または、化学反応ステップがあっても、各化学反応，各化学感応ステップを分離して測定できる。

一方、特定の時刻での流路中の屈折率境界は、流路中での混合と化学反応の条件によって特徴的な形状になる（特願２０１３−１０８９４７，特願２０１３−１０８９４９）。前述したように、屈折率境界の算出アルゴリズムによっては、複数の境界を検出する。例えば、複数のピークまたはバレーのある屈折率境界の形状の場合、前述した各々の屈折率境界計算法では、ピークまたはバレーの前縁と後縁部分を境界として検出する。このように検出された境界位置または時刻は、特徴量として、反応に関与する物質の濃度に関連づけることができる。

屈折率境界関数は、多項式または区分的多項式、あるいは関数が予測される場合は、この予測を記述するパラメーターを含む任意の関数を用いることができる。多項式は、流路内で粘度の１段階の変化など、単純な反応が進行する場合に適する。区分的多項式は、流路内で多段階の化学反応が進行する場合、例えば血液の凝固反応が起こる場合に適する。

屈折率境界は、値の変化が小さい場合や緩慢な変化では、ノイズが大きくなる。また、流路の汚染、光路に入ったごみなどにより、局所的なグリッジが入ることがある。屈折率境界関数は、大域的なノイズや局所的に入ったグリッジに対して、あらかじめ流路内の反応をモデル化し、少ないパラメーターで表現できる関数を選択することによって、ノイズの影響を受けにくい測定ができる。

例えば、粘度の異なる液体を順次流路に流し、これら液体の間には流れに垂直な境界面が形成され、流路内の２種類の液体の体積分率に比例する流速で流れる場合、単調に変化する関数になる。従って、この場合の屈折率境界関数は、３個程度のパラメーターで記述できる。また、例えば、凝固試薬と血漿とを、流路の両端を一定の圧力にして流す場合には、複雑な境界形状になるが、３次程度の多項式で近似でき、４個のパラメーターで記述できる。このようなパラメーターを用いると、反応に関与する濃度と、液体の粘度とを分離して測定することができる（特願２０１３−１０４７３６）。

マイクロ流路を流れるなかで化学反応するサンプルは、拡散しながら流れる。このため、反応に関与する分子の濃度分布は、反応速度と拡散係数によって異なる。反応が、多反応、多段階反応の場合には、上記濃度分布から、どの反応に関与する分子の移動を観測しているかに関する情報を得ることができる。

本実施の形態における流速測定装置は、例えば、ＣＰＵ（Central Processing Unit；中央演算処理装置）と主記憶装置と外部記憶装置とネットワーク接続装置となどを備えたコンピュータ機器であり、主記憶装置に展開されたプログラムによりＣＰＵが動作することで、上述した各機能が実現される。また、各機能は、複数のコンピュータ機器に分散させるようにしてもよい。

以下、実施例を用いてより詳細に説明する。

［実施例１］
実施例１では、表面プラズモン共鳴に基づく屈折率変化を測定する場合を例に説明する。

まず、用いる測定チップについて説明する。図３の（ａ），（ｂ），（ｃ）に示すように、測定チップ３０１は、ＢＫ７ガラスからなる基板３１１の上に、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）からなる流路基板３１２を備える。また、流路基板３１２に形成した溝により、マイクロ流路３１３が形成されている。また、マイクロ流路３１３の一端には、導入口３１４が接続し、マイクロ流路３１３の他端には、排出口３１５が接続している。導入口３１４および排出口３１５は、流路基板３１２に形成された貫通穴である。

また、マイクロ流路３１３の途中における基板３１１の表面上には、表面をＡｕ層とした金属層３１６が形成されている。また、測定チップ３０１は、ハウジング３０２に収容されている。また、排出口３１５には、廃液チューブ３０３が接続されている。

上述した測定チップ３０１の製造について簡単に説明する。まず、ＢＫ７ガラスからなる基板３１１を用意する。用意した基板３１１の主表面に、上述した金属層３１６を形成する領域を露出させ、他の領域を覆い隠すようにマスキングテープを貼り付ける。この状態で、スパッタ法により、まず、Ｔｉを堆積し、引き続いてＡｕを堆積する。この後、マスキングテープを剥離する。これにより、表面をＡｕ層とする金属層３１６が形成される。

次に、化薬マイクロケム株式会社製の「ＳＵ−８」などのネガ型のフォトレジストを用い、Ｓｉ基板の上に流路型などを備える鋳型を形成する。この鋳型に、東レダウコーニング社製ＰＤＭＳのモノマーを注入して硬化させ、これを離型することで、流路基板３１２とする。流路基板３１２は、流路長さ６ｍｍで、幅１ｍｍ，高さ７５μｍの断面矩形のマイクロ流路３１３となる溝部を備える。また、流路基板３１２に、貫通穴を形成することで、溝部の一端に接続する導入口３１４および溝部の他端に接続する排出口３１５を形成する。これらの貫通穴は、カイインダストリーズ社製生研トレパンを用いて加工した。

次に、アネルバ社製ＲＩＥ装置ＤＥＭ４５１を用い、基板３１１の主表面および流路基板３１２の溝形成面にプラズマを照射して活性化させ、これらの面を当接して接着する。この結果、基板３１１と流路基板３１２との間に、流路長さ６ｍｍで、幅１ｍｍ，高さ７５μｍの断面矩形のマイクロ流路３１３が形成された状態となる。また、排出口３１５には、内径１／１６インチ（約１ｍｍ）のＦＥＰチューブ（アップチャーチ製）からなる廃液チューブ３０３を挿入した。

上述した測定チップ３０１は、図３の（ｄ）に示すＮＴＴＡＴ社製スマートＳＰＲ（ＳＰＲ装置）に固定して用いる。また、廃液チューブ３０３を介した吸引を行う定圧ポンプには、「Ｆｌｕｉｇｅｎｔ」社製の「ＭＦＣＳ−ＶＡＣ」を用いた。定圧ポンプ「ＭＦＣＳ−ＶＡＣ」は、設定した大気圧よりも低い圧力に気液分離装置内の圧力を一定にすることができる。廃液チューブ３０３は、定圧ポンプ「ＭＦＣＳ−ＶＡＣ」に付属の流路計に接続し、気液分離装置を経て、定圧ポンプ「ＭＦＣＳ−ＶＡＣ」に接続した。

上述した装置構成において、定圧ポンプの動作条件を大気圧下１０ｍｂａｒに設定し、マイクロ流路３１３に、導入口３１４から水およびグルコース水溶液を順次送液した。この状態で、金属層３１６が形成されている測定領域における屈折率を、上述した特許文献１と同様のＳＰＲ装置で測定した。なお、ＳＰＲ装置の受光部を構成しているＣＣＤイメージセンサーのフレームレートは１５０ＦＰＳとした。

マイクロ流路３１３に２種類の粘度の異なる液体が順次流れる場合、粘度が高い方が流速は遅くなるので、マイクロ流路３１３中を、上述した２液が混合しながら流れる場合、流れている間に流速が変化する。

実施例１では、マイクロ流路３１３をまず水で満たし、この後、濃度を調節したグルコース溶液を流す。流れ始めは、水の粘度で決まる流速で流れる。また、マイクロ流路３１３の内部がグルコース溶液で置換されると、グルコース溶液の粘度で決まる流速で流れる。この間の時間では、流速が徐々に遅くなる。

上述したＳＰＲ測定の結果、ＳＰＲ装置から、図４に示す屈折率指標値配列（ＳＰＲ角度）を得た。屈折率指標値配列は、変化が濃淡で示される屈折率値（屈折率指標値）が、流路長手方向の位置と時間（時刻）との２次元に配列されている。この配列に対し、プログラミング言語「ｏｃｔａｖｅ」と、このライブラリーを用いて以下の操作を行った。

まず、得られた屈折率指標値配列の各場所で、時間方向に「Ｓａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ」の方法で数値微分する。これにより、図５に示す配列が得られる。図５に示す配列は、濃淡で示される屈折率値の時間微分値が、流路長手方向の位置と時刻との２次元に配列されている。次いで、図５に示した配列の各場所で、微分値の絶対値が最小の配列インデックスの前後を、１次関数でフィッティングし、この値が０になる時刻を求め、屈折率境界時刻とする（屈折率境界算出ステップ）。

次に、得られた各位置での屈折率境界時刻を並べ、図６に示す屈折率境界配列とする。次いで、求めた屈折率境界配列を３次の多項式で近似し、図７に示す状態となる屈折率境界時刻関数とする（屈折率境界関数算出ステップ）。なお、この例では、後述するように、２液を順次流す単純な例を示しており、屈折率境界配列と屈折率境界時刻関数とが同様の状態となる。

次に、算出した屈折率境界時刻関数の微分の逆数を取って、図８に示す状態となる測定時刻流速関数とする（流速関数算出ステップ）。図８に示す状態は、マイクロ流路３１３の両端に一定の圧力がかかっている状態で、粘度の低い水から、粘度の高いグルコース溶液にマイクロ流路３１３の内部が置き換わる過程で、流速が次第に低下することを示している。

上述したように、実施例１によれば、流路内で変化する流速を測定することができた。この場合、水およびグルコース溶液の２液を順次流す単純な場合であり、屈折率境界関数とこの傾きの逆数である流速関数は、ほぼ単調な曲線になった。また、屈折率境界時刻（位置）を計算する方法によらず、ほぼ同様の傾向を示した。なお、上述では、屈折率境界時刻，屈折率境界時刻関数，測定時刻流速関数を求める例を示したが、屈折率境界位置，屈折率境界位置関数，測定箇所流速関数を求めるようにしても同様である。この場合、屈折率境界位置関数の微分を取れば、測定箇所流速関数となる。

［実施例２］
次に、実施例２について説明する。実施例２では、全反射測定で屈折率変化を測定する場合を例に説明する。上述したＳＰＲ測定で用いた測定チップで金属層が形成されていない場合、マイクロ流路の下面となるガラスからなる透明な基板で全反射が起きる。全反射が起きる入射角度（臨界角）を屈折率指標値とすることができる。この測定は、ＳＰＲを実現する光学系およびマイクロ流路の形状を変更することなく行うことができる。

ここで、ＳＰＲによる屈折率（ＳＰＲ角度）の測定と、全反射測定による屈折率（臨界角度）の測定との比較について説明する。

ＳＰＲ角度と臨界角度では、屈折率変化を検出できる感度の反射面（流路内測定面）からの距離依存性が異なる。ＳＰＲ角度の場合、Ａｕからなる金属層の上に２μｍの屈折率の変化しないＰ層があり、Ｐ層の上にバルク層がある。バルク層の屈折率が変化する場合の反射率の入射角度依存性を計算し、Ｐ偏光反射率を等高線で表示すると、図９に示す状態となる。

バルク層は金属層表面から２μｍ離れているために、バルク層の屈折率が変化しても、ＳＰＲの効果がおよばない。このため、反射率の谷の入射角度であるＳＰＲ角度は、バルク層における屈折率の変化が検出できない。一方、直接屈折率の変化しないＰ層が２μｍ形成された場合は、バルク層の屈折率変化に伴って、図１０に示すように臨界角度が変化する。このように、反射面から２μｍ離れている流路中の屈折率指標値は、臨界角度を用いると変化を検出できるが、ＳＰＲ角度では検出されない。言い換えると、反射面から２μｍ離れている流路中の屈折率指標値は、臨界角度を用いると変化を検出できるが、ＳＰＲ角度では検出されない。

逆に、反射面（検出面）から２００ｎｍのＰ層の屈折率が変化し、バルク層の屈折率が変化しない場合、図１１に示すようにＳＰＲ角度は変化するが、臨界角度は、図１２に示されているように変化しない。従って、ＳＰＲ角度と臨界角では、検出できる屈折率変化の流路の壁面からの距離依存性が異なる。

上述した違いを確認するために、実施例２では、全反射測定で屈折率変化を測定する。実施例２では、実施例１で用いた測定チップ３０１において、金属層３１６を形成しない構成の測定チップを用いた。

はじめに、前述した実施例１と同様に、測定チップのマイクロ流路をより薄い濃度のグルコース溶液で満たし、この後、より高い濃度のグルコース溶液を流す。流れ始めは、低濃度のグルコース溶液の粘度で決まる流速で流れる。また、マイクロ流路の内部が高濃度グルコース溶液で置換されると、高濃度グルコース溶液の粘度で決まる流速で流れる。この間の時間では、流速が徐々に遅くなる。実施例２では、上述したように、濃度の異なる２つのグルコース溶液を流した。ＳＰＲ角度に比べて臨界角度は小さな入射角度になるので、２つの液の屈折率を上げ、実施例１の場合と同じ光学系（測定装置）で測定できるように設定した。

実施例２では、まず、図１３に示すように屈折率指標値配列（臨界角度）が得られる。屈折率指標値配列は、濃淡で示される屈折率値（屈折率指標値）が、流路長手方向の位置と時間との２次元に配列されている。この配列より、図１４に示す配列を得る。図１４に示す配列では、濃淡で示される屈折率値の時間微分値が、流路長手方向の位置と時間との２次元に配列されている

次に、図１４に示した配列の各場所で、微分値の絶対値が最小の配列インデックスの前後を、１次関数でフィッティングし、この値が０になる時間を求め、屈折率境界時刻とする。次いで、得られた各位置での屈折率境界時刻を並べ、図１５の（ａ）に示す屈折率境界配列とする。次いで、求めた屈折率境界配列を３次の多項式で近似し、図１５の（ｂ）に示す状態となる屈折率境界関数とする。この例においても、２液を順次流す単純な例を示しており、屈折率境界配列と屈折率境界時刻関数とが同様の状態となる。

実施例２においても、濃度が異なる２つのグルコース溶液を順次流す単純な場合であり、屈折率境界関数とこの傾きの逆数である流速関数は、ほぼ単調な曲線になる。また、屈折率境界時刻（位置）を計算する方法によらず、ほぼ同様の傾向を示した。

臨界角を用いて屈折率境界を求める場合、ＳＰＲでの測定に比して全反射面から流路中央まで濃度の変化がない必要がある。この測定で得られた流速と体積流速の比は、同じ流路で構成した測定チップを用いた実施例１の方法で得られた流速と体積流速との比と同じであった。従って、実施例２によれば、流路断面方向に、ＳＰＲで測定される感度領域（２００ｎｍ）よりも広い範囲に比較的均一な濃度分布を持つことがわかる。

グルコースの水溶液中での拡散係数は１ｅ^-5ｃｍ²／ｓオーダーなので、実施例２で用いたマイクロ流路の寸法と測定時間（約１秒）では、この時間内での流れによる物質移動に比して拡散が支配的であることと一致する。

［実施例３］
次に、実施例３について説明する。実施例３では、実施例１と同様の装置構成としたＳＰＲによる測定で、２つの液として血漿と凝固試薬とを対象とした。実施例３では、マイクロ流路３１３をまず凝固活性剤で満たし、この後、血漿を流す（特許文献２参照）。

実施例３においても、測定により得られた屈折率指標値配列より屈折率境界（屈折率境界時刻または屈折率境界位置）を求める。ここで、実施例３では、屈折率境界を求める３つの計算方法（最大変化速度検出，レベルクロス検出，曲率検出）で、図１６に示すように、異なる屈折率境界が検出された。図１６において、（ａ）は、最大変化速度検出により算出された屈折率境界、（ｂ）は、レベルクロス検出により算出された屈折率境界、（ｃ）は、曲率検出により算出された屈折率境界を示す。また、これらの結果は、血漿をバッファーで希釈すると、希釈率に従って変化した。

また、算出した屈折率境界関数は、希釈率に従って、検出される時間の平均、および関数の形状が変化した。また、上述した屈折率境界の計算方法によっても、異なる形状の屈折率境界が得られた。さらに凝固開始剤を変えると、屈折率境界の形状が、凝固反応のカスケード経路に依存して変化した。

［実施例４］
次に、本発明の実施例４について説明する。実施例４では、流路内の流路方向に配列された複数の測定箇所が、表面プラズモン共鳴に基づく屈折率変化を測定する第１測定箇所（金属層が形成されている）と、全反射測定による屈折率変化を測定する第２測定箇所（金属層がない）とを交互に配列して構成した測定チップを用いている。例えば、図１７の平面図に示すように、ＢＫ７ガラスからなる基板５１１の上に形成されているマイクロ流路５１３に、所定の間隔を開けて複数の金属層５１６を形成すればよい。他の構成は、図３を用いて説明した測定チップ３０１と同様である。

上述した構成とすることで、図１８の（ａ）に示す金属層５１６の部分では、図１８の（ｂ）に示すようにＳＰＲが観測でき、図１８の（ａ）に示す金属層５１６以外の部分では、図１８の（ｂ）に示すように全反射が観測できる。図１８の（ｂ）では、濃淡で測定値の高低を示している。前述した実施例３と同様に、２種類の液体を順次送液し、同様に測定した。この測定で、ＳＰＲ測定による反射率低下と全反射測定による臨界角が、１つのマイクロ流路５１３で実施できるように、抗体溶液を用いて２種類の液体の屈折率を調整した。なお、前述したように、ＳＰＲ角度に比べて臨界角度は小さな入射角度になるので、両者による測定が可能とする広い範囲の入射角が設定できる測定装置を用いることが重要となる。

上述した測定により、金属層５１６の部分とこれ以外の部分とは、反射率の値から見分けることができた。金属層５１６と、ＢＫ７からなる基板５１１が露出している部分に対し、各々ＳＰＲ角度と臨界角を求め、屈折率指標値配列とした。屈折率指標値配列より上述した実施例と同様に屈折率境界関数を求め、流速を計算することができた。実施例４では、１つのマイクロ流路５１３を用い、同じサンプルに対して、１回の測定でＳＰＲと全反射による流速の測定を行うことができ、屈折率境界関数を２セット得ることができる。

実施例４の測定によって、流れがマイクロ流路の壁近傍に偏在するか、マイクロ流路内でより均一に流れているかを見分けることができるという特別な効果が得られる。この効果は、マイクロ流路中の２種類の液体境界で化学反応が進行する場合に、２セットの屈折率境界関数と、反応条件の相関をあらかじめ求めておくことで、反応に関与する分子の濃度や、活量をより正確に測定できるようになる。

以上に説明したように、本発明では、得られた屈折率指標値配列より屈折率境界（屈折率境界時刻または屈折率境界位置）を求め、求めた屈折率境界時刻をより屈折率境界関数（屈折率境界時刻関数または屈折率境界位置関数）を求め、求めた屈折率境界関数から流速関数（測定箇所流速関数または測定時刻流速関数）を求め、求めた所流速関数より、設定した測定箇所における接触領域の速度または設定した測定時刻における接触領域の速度を求めるようにした。この結果、本発明によれば、２つの液を直列的に移送させている流路内で２つの液の接触領域の流速が変化する状態が測定できるようになる。

なお、本発明は以上に説明した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の技術的思想内で、当分野において通常の知識を有する者により、多くの変形および組み合わせが実施可能であることは明白である。

１０１…屈折率測定部、１０２…屈折率境界算出部、１０３…屈折率境界関数算出部、１０４…流速関数算出部、１０５…流速算出部、１０６…フィルター部、１２１…最大変化速度検出部、１２２…レベルクロス検出部、１２３…曲率検出部。

Claims (6)

1. 流路の延在方向に直列に配列して隣り合う部分が接触して前記流路を流れる状態に、第１液および第２液をこの順に一定の圧力で前記流路に導入して前記流路を流れる状態とする試料導入ステップと、
   前記流路を流れる前記第１液と前記第２液とが接触する接触領域が、前記流路内の流路方向に配列された複数の測定箇所を通過する過程で、複数の前記測定箇所で前記流路内を通過する液体の屈折率を設定された時間間隔の複数の測定時刻で時系列に測定し、測定箇所毎および測定時刻毎に測定された複数の屈折率値からなる屈折率指標値配列を得る屈折率測定ステップと、
   得られた屈折率指標値配列より、各々の前記測定箇所において前記測定時刻の変位に対応して変化する屈折率値の中より求められる前記接触領域に対応する屈折率境界時刻、および各々の前記測定時刻において前記測定箇所の変化に対応して変化する屈折率の中より求められる前記接触領域に対応する屈折率境界位置のいずれかを求める屈折率境界算出ステップと、
   求めた屈折率境界時刻を前記測定箇所の配列順に並べた配列を連続に接続する屈折率境界時刻関数、および求めた屈折率境界位置を前記測定時刻の順に並べた配列を連続に接続する屈折率境界位置関数のいずれかを求める屈折率境界関数算出ステップと、
   求めた屈折率境界時刻関数の時間微分または屈折率境界位置関数の時間微分から、前記測定時刻における測定時刻流速関数または前記測定箇所における測定箇所流速関数を求める流速関数算出ステップと、
   求めた測定時刻流速関数または測定箇所流速関数より、設定した測定時刻における前記接触領域の速度、および設定した測定箇所における前記接触領域の速度のいずれかを求める流速算出ステップと
   を備えることを特徴とする流速測定方法。
2. 請求項１記載の流速測定方法において、
   屈折率境界算出ステップでは、
   変化する屈折率の変化速度の極大値を与える測定時刻または測定箇所より前記屈折率境界時刻または前記屈折率境界位置を求める最大変化速度検出ステップ、
   前記第１液および前記第２液の中間の屈折率値を与える測定時刻または測定箇所より前記屈折率境界時刻または前記屈折率境界位置を求めるレベルクロス検出ステップ、
   変化する屈折率を示す曲線の曲率の絶対値が最大になる測定時刻または測定箇所より前記屈折率境界時刻または前記屈折率境界位置を求める曲率検出ステップ
   のいずれかにより前記屈折率境界時刻または前記屈折率境界位置を算出することを特徴とする流速測定方法。
3. 請求項１または２記載の流速測定方法において、
   前記流路内の流路方向に配列された複数の測定箇所は、表面プラズモン共鳴に基づく屈折率変化を測定する第１測定箇所と全反射測定による屈折率変化を測定する第２測定箇所とが交互に配列され、
   複数の前記第１測定箇所および複数の前記第２測定箇所毎に、前記屈折率指標値配列を求め、求めた２つの前記屈折率指標値配列をもとに、設定した測定箇所における前記接触領域の速度または設定した測定時刻における前記接触領域の速度を求める
   ことを特徴とする流速測定方法。
4. 流路の延在方向に直列に配列して隣り合う部分が接触して前記流路を流れる状態に、第１液および第２液をこの順に一定の圧力で前記流路に導入して前記流路を流れる状態として前記第１液と前記第２液とが接触する接触領域の流速を求める流速測定装置であって、
   複数の測定箇所で前記流路内を通過する液体の屈折率を設定された時間間隔の複数の測定時刻で時系列に測定し、測定箇所毎および測定時刻毎に測定された複数の屈折率値からなる屈折率指標値配列を得る屈折率測定手段と、
   前記屈折率測定手段により得られた屈折率指標値配列より、各々の前記測定箇所において前記測定時刻の変位に対応して変化する屈折率値の中より求められる屈折率境界時刻、および各々の前記測定時刻において前記測定箇所の変化に対応して変化する屈折率の中より求められる屈折率境界位置のいずれかを求める屈折率境界算出手段と、
   前記屈折率境界算出手段が求めた屈折率境界時刻を前記測定箇所の配列順に並べた配列を連続に接続する屈折率境界時刻関数、および求めた屈折率境界位置を前記測定時刻の順に並べた配列を連続に接続する屈折率境界位置関数のいずれかを求める屈折率境界関数算出手段と、
   前記屈折率境界関数算出手段が求めた屈折率境界時刻関数の時間微分または屈折率境界位置関数の時間微分から、前記測定時刻における測定時刻流速関数または前記測定箇所における測定箇所流速関数を求める流速関数算出手段と、
   前記流速関数算出手段が求めた測定時刻流速関数または測定箇所流速関数より、設定した測定時刻における接触領域の速度または設定した測定箇所における前記接触領域の速度を求める流速算出手段と
   を備え、
   屈折率境界算出手段は、
   変化する屈折率の変化速度の極大値を与える測定時刻または測定箇所より前記屈折率境界時刻または前記屈折率境界位置を求める最大変化速度検出手段、
   前記第１液および前記第２液の中間の屈折率値を与える測定時刻または測定箇所より前記屈折率境界時刻または前記屈折率境界位置を求めるレベルクロス検出手段、
   変化する屈折率を示す曲線の曲率の絶対値が最大になる測定時刻または測定箇所より前記屈折率境界時刻または前記屈折率境界位置を求める曲率検出手段
   の少なくとも１つを備えることを特徴とする流速測定装置。
5. 請求項４記載の流速測定装置で用いる前記流路が形成された測定チップであって、
   前記流路内の流路方向に配列された複数の測定箇所は、
   表面プラズモン共鳴に基づく屈折率変化を測定する第１測定箇所と、
   全反射測定による屈折率変化を測定する第２測定箇所と
   が交互に配列されていることを特徴とする測定チップ。
6. コンピュータに請求項１記載の流速測定方法の各ステップを実行させるためのプログラム。