JP2014527533A - 病原体用及び物質用トラップ - Google Patents
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Abstract
合成物並びにその合成物を用いる薬学的組成物及び方法が提供される。当該合成物は、少なくとも１つの活性部分と相互作用することが可能な因子の選択的流入を可能にするように構成された足場に囲まれた少なくとも１つの活性部分を含む。【選択図】 図１
Description
本発明は、物質又は病原体を隔離及び結合又は処理するための複合体に関する。
ウイルス感染の有効な管理は、依然として今日の生物医学にとっての最も大きな課題の１つである。現代のブタインフルエンザ及びＨＩＶの世界的流行は、ウイルスの発生を抑制及び処置することが可能な有効な薬剤を、近代科学がまだ考案していないということを説明している。
ウイルス疾患の膨大な数にも関わらず、ほんの少数の特定の抗ウイルス治療が利用可能であるにすぎない。今までのところ、ワクチンがウイルス処置の最も有効な形態と見なされているが、しかしながらワクチンは効果がない場合やかえって症状を悪化させる場合もあり、時にはそれが致命的な結果となる場合もある。ワクチン以外には、典型的にウイルス酵素又は宿主酵素の阻害によってウイルス感染を減じるように設計された、ほんの少数の一連の医薬しかない。こうした小分子阻害剤は、中毒性副作用の危険性を有し、また、ウイルス個体群における急速な変異により、耐性株が形成される場合がある。
したがって、抗ウイルス治療は、典型的には、感染前における免疫系の予防的活性化、又は小分子阻害剤によるウイルス感染細胞の標的化等のいずれかによるものである。ウイルスのそれらの宿主細胞感染の前における不活性化は、ほとんど注目されてこなかった。
１つのそのようなアプローチは、膜結合ウイルス受容体を有するリポソーム、細胞又はプロト細胞（protocell）を用いることによっての宿主細胞擬態（host cell mimicry）によるウイルスの不活性化を含む。そのようなアプローチは、急速なウイルス適応にもかかわらずなお進化的に保存されている、ウイルス−宿主相互作用に依拠している。
受容体を有するリポソーム（プロテオリポソーム）は、可能なウイルス標的であり、しかも進化トラップである。というのは、ウイルスはこの中では繁殖し得ず、したがって、不活性化されるからである。リポソームトラップの概念は、ドイツ特許第３７１１７２４号に最初に記載され、リポソームトラップは、ＨＩＶ不活性化剤として提案された。同様の提案が、スペイン特許第２０８８７５２号及び国際公開第１９９６／０２２７６３号の公報において行われた。米国特許第５，７１８，９１５号は、結合されたウイルスへの損傷を誘導するために、リポソーム膜に触媒酵素を付加することを記載している。薬物送達系としてプロテオリポソームを用いる他の同様の抗ウイルス系もまた、Bronshtein他（2011, Journal of Controlled Release, Vol.51, Issue 2, p.139-148）に記載されており、加えて米国特許第５，７７３，０２７号、米国特許出願公開第２００８／０１３８３５１号、米国特許第６，５４４，９５８号、Tuthill他（2006 doi:10.1128/JVI.80.1.172-180.2006）及びZhukovsky他[2010 PLoSOne,5(10)c13249]にも記載されている。
欧州特許第０２９８２８０号には、ウイルス受容体を提示する非宿主細胞（典型的にはＲＢＣ）をウイルストラップとして使用することが記載された。そのようなアプローチにおいては核のないＲＢＣがトラップの役を果たし、その中では感染性ウイルス粒子は増殖できない。同様のアプローチが米国特許第５，６７７，１７６号、米国特許第７，４６２，４８５号の公報及び「OpenWetWare 20.380 HIV Project」に記載された。
プロト細胞と呼ばれる人工の細胞様粒子もまた、ウイルス特異的受容体を提示するために使用され得る[Porotto他(2011)PLoSOne,6(3):e16874]。
抗ウイルスデンドリマー[Reuter他(1999)Bioconjugate Chem.10(2):271-8]及びタンパク質ナノチューブ[Komatsu他(2011)J Amer Chem Soc.133(10):3246-8]を用いた他の細胞外でのウイルス不活性化のアプローチもまた調査中である。
これらのアプローチは特定のウイルスに対しては有効であり得るが、いずれも広範なウイルス疾患の解決策を提供することはできない。加えてこれらのアプローチは、有害な中毒作用に繋がり得るインビボ細胞／分子との望ましくない相互作用、抗ウイルス剤の貧弱な薬物動態及び不安定性、並びに免疫系及び他の組織による身体からの抗ウイルス剤の迅速なクリアランスによって制約され得る。
したがって、先行技術アプローチの前述の制約のない多様な病原体感染を処置するために使用され得るアプローチに対する必要性が依然としてある。
本発明の１つの態様によれば、少なくとも１つの活性部分と相互作用することが可能な因子の選択的流入を可能にするように構成された足場に囲まれた少なくとも１つの活性部分を含む合成物（composition-of-matter）が提供される。
後述の本発明の好ましい実施形態における更なる特徴によれば、足場は、核酸構造体、ポリマー構造体、及び／又はシリコン構造体を含む。
上記の好ましい実施形態における更なる特徴によれば、核酸構造体は、ＤＮＡ折り紙構造体である。
上記の好ましい実施形態における更なる特徴によれば、構造体は、マイクロ電子機械系（Micro Electro Mechanical System:MEMS）構造体である。
上記の好ましい実施形態における更なる特徴によれば、因子は、物質、微生物又は細胞である。
上記の好ましい実施形態における更なる特徴によれば、微生物は、ウイルス、細菌、真菌、寄生生物、古細菌、藻（algea）及び原生生物からなる群から選択される。
上記の好ましい実施形態における更なる特徴によれば、物質は、ペプチド、ポリペプチド、プリオン、脂質、脂質複合体、核酸、炭水化物、アレルゲン、毒素、ホルモン、抗体、薬物、小分子、汚染物質及び鉱物からなる群から選択される。
上記の好ましい実施形態における更なる特徴によれば、足場は、０．０１〜５０μｍの直径を有する因子の選択的流入を可能にするように構成されている。
上記の好ましい実施形態における更なる特徴によれば、足場は、０．０１〜０．８μｍの直径を有する因子の選択的流入を可能にするように構成されている。
上記の好ましい実施形態における更なる特徴によれば、活性部分は、因子と結合することが可能である。
上記の好ましい実施形態における更なる特徴によれば、活性部分は、抗体、アプタマー、受容体、キレート剤、リガンド、リポソーム、ナノチューブ、デンドリマー、プロト細胞、細胞、ペプチド、タンパク質、酵素、化学物質、洗剤、毒素、薬物及びプロドラッグからなる群から選択される。
上記の好ましい実施形態における更なる特徴によれば、活性部分は、因子を切断又は変形することが可能である。
上記の好ましい実施形態における更なる特徴によれば、活性部分は、酵素、リボザイム、化学物質、酸、塩基及び洗剤からなる群から選択される。
上記の好ましい実施形態における更なる特徴によれば、活性部分は、微生物にとって内因性でない部分によって微生物と結合することが可能である。
上記の好ましい実施形態における更なる特徴によれば、少なくとも１つの活性部分は、足場に結合している。
上記の好ましい実施形態における更なる特徴によれば、少なくとも１つの活性部分は、リンカーを介して足場に結合している。
上記の好ましい実施形態における更なる特徴によれば、少なくとも１つの免疫調節部分が、足場に結合している。
上記の好ましい実施形態における更なる特徴によれば、足場は、脊椎動物において実質的に非免疫原性である。
上記の好ましい実施形態における更なる特徴によれば、足場は、非脂質足場である。
上記の好ましい実施形態における更なる特徴によれば、足場は、ＰＥＧもしくはＰＥＧ誘導体、又はヒアルロン酸を含む。
上記の好ましい実施形態における更なる特徴によれば、足場は、内部内腔を有する粒子を構成している。
上記の好ましい実施形態における更なる特徴によれば、少なくとも１つの活性部分は、内腔内に置かれている。
上記の好ましい実施形態における更なる特徴によれば、少なくとも１つの活性部分は、内腔内で足場に結合している。
上記の好ましい実施形態における更なる特徴によれば、少なくとも１つの活性部分は、内腔内のキャリアに結合しており、そのキャリアは、その大きさによって足場に拘束されている。
上記の好ましい実施形態における更なる特徴によれば、少なくとも１つの活性部分は、因子との相互作用に続いて分子を放出することが可能である。
上記の好ましい実施形態における更なる特徴によれば、分子は、マーカー、毒素、ホルモン、薬物、核酸、タンパク質及び佐剤からなる群から選択される。
上記の好ましい実施形態における更なる特徴によれば、足場は、標的化部分をさらに含む。
上記の好ましい実施形態における更なる特徴によれば、標的化部分は、受容体、抗体、アプタマー、組織特異的部分、微生物特異的部分、リガンド、及び磁石からなる群から選択される。
本発明の別の態様によれば、当該合成物と薬学的に受容可能なキャリアとを含む薬学的組成物が提供される。
上記の好ましい実施形態における更なる特徴によれば、薬学的に受容可能なキャリアは、経口送達、粘膜送達、局所送達又は全身送達に適するものが選択される。
本発明の別の態様によれば、流体から因子を単離する方法であって、少なくとも１つの活性部分と相互作用することが可能な因子の選択的流入を可能にするように構成された足場に囲まれた少なくとも１つの活性部分を含む合成物に流体を曝露し、それにより、流体から因子を単離すること含む、方法が提供される。
上記の好ましい実施形態における更なる特徴によれば、流体は、生物学的流体である。
上記の好ましい実施形態における更なる特徴によれば、合成物に生物学的流体を曝露することは、合成物を被験体に投与することによって実施される。
上記の好ましい実施形態における更なる特徴によれば、流体は、水性流体である。
上記の好ましい実施形態における更なる特徴によれば、合成物は、容器内又は容器上に配置されたフィルタの一部である。
本発明のなお別の態様によれば、配列番号２０９〜４７６で示される配列を含む単離ポリヌクレオチドが提供される。
本発明のなお別の態様によれば、本発明の単離ポリヌクレオチドを含む微粒子が提供される。
本発明のなお別の態様によれば、配列番号４７７〜４８５で示される配列を含む単離ポリペプチドが提供される。
本発明のなお別の態様によれば、本発明の単離ポリペプチドを含む微粒子が提供される。
本発明は、病原体感染を予防又は処置するため並びに生物学的液体及び非生物学的液体から物質を精製するための合成物並びにその使用方法を提供することにより、現在知られている構成の欠点に首尾よく対処する。
別段の定義がない限り、本明細書において使用される技術用語及び科学用語は全て、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似又は等価の方法及び物質が本発明の実施又は試験において使用され得るが、好適な方法及び物質については後述する。矛盾する場合は、定義を含め、本特許明細書が支配することになる。また、材料、方法、及び実施例は、単なる例示に過ぎず、限定することが意図されるものではない。
ここで本発明を添付の図面を参照して、単に一例として説明する。次に特にそれらの図面を詳細に参照するが、示される事項は単に一例としてのものであり、本発明の好ましい実施形態の例示的な考察を目的とするものであるにすぎず、最も有用であると考えられるもの並びに本発明の原理及び概念的態様についての容易に理解される説明を提供するために提示されていることを強調したい。この点に関して、本発明の基本的理解に必要であるよりもさらに詳細に本発明の構成上の詳細を示そうとする試みは行われておらず、これらの図面を伴って行われる説明は、いかにして本発明のいくつかの形態が実際に具現化され得るかを当業者に明らかにするものである。
図面中：
（ａ）は、本発明の教示に従って構築された、エンティティを捕獲するための複合体の１つの実施形態を概略的に図示したものである。（ｂ）は、本発明の教示に従って構築された、エンティティを捕獲するための複合体の１つの実施形態を概略的に図示したものである。（ｃ）は、本発明の教示に従って構築された、エンティティを捕獲するための複合体の別の実施形態を概略的に図示したものである。
図２は、本発明の教示に従って構築された、エンティティを捕獲するための複合体の別の実施形態を概略的に図示したものである。
（ａ）〜（ｃ）は、図１（ｃ）の複合体を用いたウイルス捕獲を概略的に示すものである。大きさを示すために、赤血球が右側に図示されている。
（ａ）は、非多孔質ポリスチレンミクロスフィアの光学顕微鏡画像である。（ｂ）及び（ｃ）は、非多孔質ポリスチレンミクロスフィアの走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像である。
（ａ）及び（ｂ）は、非多孔質ポリスチレンミクロスフィアと多孔質ポリスチレンミクロスフィアとの混合物の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像である。（ｃ）〜（ｆ）は、多孔質ポリスチレンミクロスフィアの走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像である。
（ａ）及び（ｂ）は、多孔質ポリスチレンミクロスフィアのフローサイトメトリーの読み値である。ＦＬ２−Ａの読み値（図６（ａ））は、黄色〜橙色スペクトルでの発光に対応する。ＦＬ４−Ａの読み値（図６（ｂ））は、遠赤色スペクトルでの発光に対応する。
感染していないＳＦ９細胞培養物を図示したものである。倍率×１００。
感染していないＳＦ９細胞培養物を図示したものである。倍率×４００。
バキュロウイルスと共にインキュベートしたＳＦ９細胞培養物を図示したものである。倍率×１００。
バキュロウイルスと共にインキュベートしたＳＦ９細胞培養物を図示したものである。倍率×４００。
バキュロウイルス及び抗ウイルスポリスチレンミクロスフィアと共にインキュベートした、処理されたＳＦ９細胞培養物を図示したものである。倍率×１００。
バキュロウイルス及び抗ウイルスポリスチレンミクロスフィアと共にインキュベートした、処理されたＳＦ９細胞培養物を図示したものである。倍率×４００。ポリスチレンミクロスフィアの試料が、矢印で示されている。
ＧＦＰ関連蛍光により測定した場合の本発明のウイルストラップによるＳｆ９細胞におけるバキュロウイルス関連感染のインビトロ救済（rescue）を図示したグラフである。
ＧＦＰ関連蛍光により測定した場合の本発明のウイルストラップによるＳｆ９細胞におけるバキュロウイルス関連感染のインビトロ救済を図示したグラフである。
本発明のウイルストラップによるブラベルス・クラニイフェルゴキブリの注射を図示したものである。
ＧＦＰ関連蛍光により測定した場合の本発明のウイルストラップによるブラベルス・クラニイフェルゴキブリにおけるバキュロウイルス関連感染のインビボ救済を図示したグラフである。
Tritonで被覆した多孔質ポリスチレンミクロスフィアへのバキュロウイルスビリオンの付着を図示した走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像である。
Tritonで被覆した多孔質ポリスチレンミクロスフィアへのバキュロウイルスビリ）オンの付着を図示した走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像である。
本発明の教示に従って生成されたＤＮＡバッキーボールの透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像である。球形形状は、予想されたバッキーボールサイズ（５００〜８００ｎｍ）を有している。
本発明の自己集合性コネクターＤＮＡにより形成されるバッキーボール形状を概略的に図示したものである。
図１３は、本発明のウイルストラップにおいて足場として使用されるＤＮＡキューブのＤＮＡ折り紙構築された角部（corner）を図示したものである。
図１４は、ビリオンにより提示される宿主特異的タンパク質ヒトＣＤ８１に対するインシリコ（in silico）で生成されたペプチドの予想される相互作用を図示したものである。
本発明は、病原体感染を処置又は予防するため、及び生物学的流体、上水などを解毒又は清浄化するために使用され得るトラップに属する。具体的には、本発明はウイルス粒子を捕捉及び不活性化するために使用され得、そうして宿主又は試料におけるウイルス複製及び感染を防止し得る。
本発明の原理及び実施は、図面及び付随する説明を参照してより良く理解され得る。
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用について、以下の説明において示される又は実施例により例示される詳細に限定されるものではないことが理解されるべきである。本発明は、他の実施形態が可能であるか、又は様々なやり方で実施もしくは実行されることが可能である。また、本明細書において使用される用語及び専門用語は、説明の目的のためのものであり、限定するものと見なされるべきではないことが理解されるべきである。
病原体感染、特に慢性疾患に繋がるウイルス感染は、まだ対処されていない多数の課題をウイルス免疫学者に提起する。
現在使用されている抗ウイルス剤はいくつかあるが、慢性疾患を引き起こすウイルスには有効な予防薬及び処置薬がない。感染した個体に好適な処置を提供しようとする取り組みにおいて、多数の抗ウイルス剤が開発中である。そうした薬剤としては、ウイルス酵素の阻害剤、宿主細胞ウイルス結合の阻害剤、アンチセンス及びＲＮＡ干渉剤、免疫調節剤並びにウイルス成熟阻害剤が挙げられる。こうした抗ウイルス剤は、標的細胞及び組織への非効率的な送達、循環からの迅速なクリアランスによる短い治療ウインドウ、毒性及び免疫原性、並びに薬剤に対するウイルスの適応及び耐性に制約され得る。
流体（例えば、生物学的流体）から因子を精製するためのアプローチは、当該技術分野においてよく知られている。そのようなアプローチを利用して、サイズ排除法又はアフィニティー結合法を用いることにより、生物学的流体中のウイルスを選択的に精製又は捕捉し得る。
ウイルスとのアフィニティー結合が可能な作用物質としては、微生物と結合する受容体を呈するプロテオリポソーム又はプロト細胞、微生物及び不純物と結合するデンドリマー、微生物及び不純物と結合する抗体及び抗体複合体、並びに微生物及び不純物と結合するタンパク質ナノチューブが挙げられる。
そうしたアプローチは、場合によっては被験体の血液から望ましくない因子（例えば、ウイルス）を精製するために使用され得るが、それらはいくつかの不都合（食細胞による血流からの迅速なクリアランス、異物により引き起こされる可能性のある毒性／免疫原性／病理学的副作用、捕獲された因子を不活性化／隔離することができないこと、狭い捕獲可能因子範囲（例えば、エンドサイトーシス機構によって宿主細胞を感染させるウイルスは、先行技術のアプローチによっては不活性化されないであろう）並びに単一の捕捉分子／複合体によって結合され得る因子の数が限られていることを含む）を欠点として有している。
本発明を実施化する間に、本発明者は、流体（例えば、血液）からの例えばインビボアプローチを用いての因子のロバスト且つ効率的な精製には、まず流体から因子を単離／隔離し、次いでそれを捕捉し任意選択で処理するという、２段階の協同プロセスを必要とするということに気が付いた。
そのような機能を可能にするために、本発明者は、まず流体から因子を単離及び隔離し、次いで（例えば、それを結合又は処理することにより）それを捕捉及び不活性化するように特に構成されている精製用組成物（本明細書において「複合体」とも呼ばれる）を設計した。
そのような２段階アプローチは、病原体感染のインビボ予防又は処置に特に有利である。そのような場合、複合体は、病原体をまず（例えば、サイズ排除流入により）隔離し、次いで複合体の内部体積、すなわち免疫保護された体積内で処理するように設計されているので、病原体を結合／不活性化することを担う（そのような内部体積内に配置された）部分は、宿主細胞には提示されず、したがって免疫反応も中毒反応も誘発し得ない。
本発明は、ウイルスの適応耐性に適切に対処していない今日の抗ウイルス処置の制約を克服する。ウイルスは、非常に適応性及び多型性があり、且つそれらのタンパク質ドメイン、特にそれらの酵素活性部位の変更をもたらす実質的な遺伝子変化を受けることが可能であり、これが、これらのタンパク質を標的する抗ウイルス薬に対する耐性に繋がる。さらに、ウイルスはまた、それらのビリオン外観を（例えば、宿主細胞タンパク質に似せることにより）迅速に変更して、巧みに適応免疫系及び特に抗体から逃れる。
例えば、宿主細胞受容体部分（例えば、ＨＩＶウイルスの不活性化のための、ヒト受容体ＣＤ４、ＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４を有するラフト様リポソーム）を含む本発明のウイルストラップにより処理されるウイルスは、適応耐性を発達させることはまずなく、一方、そのような受容体に対して反応性でないウイルスは、反応して宿主細胞を感染させるそれらの能力を阻害することになる変異に向けて選択的に圧力がかけられる。ウイルスにとって内因性でないタンパク質（例えば、宿主細胞タンパク質）と結合する部分を含むウイルストラップで処理されるウイルスは、ウイルスの迅速且つ適応的な多型性によって変化しない。そのような宿主細胞部分（例えば、テトラスパニン、アネキシン）と特異的に結合する活性部分は、多様なウイルスと結合することができる。
これらのウイルス結合性部分を非免疫反応性の足場内に隔離することにより、本発明は、宿主細胞との望ましくない相互作用を制限し、結合したウイルス粒子を宿主細胞と分け、それにより、それらが感染を起こさないようにする。
したがって、本発明の１つの態様によれば、少なくとも１つの活性部分と相互作用することが可能な因子の選択的流入を可能にするように構成された足場に囲まれたその又はそれらの活性成分を含む合成物が提供される。
合成物の足場は、内部体積及びそれと流体連絡する表面細孔を有する粒子状構成を形成する（すなわち、３−Ｄ形状を有する）ことが可能な任意の物質から構築され得る。以下にさらに説明されるように、そのような粒子は、合成ポリマー又は生物ポリマー、脂質、ゼオライト、無機物質（例えば、シリコン）、金属から、よく知られているアプローチ（例えば、高分子化学、ＤＮＡナノテクノロジー（例えば、ＤＮＡ折り紙）及びマイクロ電子機械系（ＭＥＭＳ））を用いて構築され得る。後に続く実施例の項に、いくつかの種類の粒子及びそれらの構築が記載されている。
活性部分は、広範な物質もしくは病原体と相互作用し且つそれらを不活性化することが可能な任意の部分（例えば、タンパク質又は膜の場合は洗剤）又は特定の病原体もしくは物質と相互作用し且つそれらを不活性化することが可能な任意の部分（例えば、抗体又は抗体断片）であり得る。
足場は、隔離のために標的される物質又は病原体に応じて、任意の大きさの任意の数の細孔を含み得る。好ましくは、足場には、少なくとも３つの細孔が備えられている。細孔は、そうした物質又は病原体を受動的又は能動的に隔離するように設計され得る。例えば、１７ｎｍの細孔直径を有する足場は、生真核細胞及び細菌を締め出す一方で、ブタサーコウイルスなどのウイルスの流入を可能にする。４００ｎｍの開口を有する足場は、真核細胞を締め出す一方で、ほとんどのウイルスの流入を可能にする。８００ｎｍの開口を有する足場は、ヒト細胞を締め出す一方で、全てのウイルス及びほとんどのマイコプラズマ細菌細胞の流入を可能にする。４０００ｎｍの開口を有する足場は、複合体の外にヒト細胞を締め出す一方で、ほとんどの細菌の流入を可能にする。また、１０ｎｍの細孔直径を有する足場は、ほとんどのタンパク質並びに全てのウイルス、生真核細胞及び細菌を締め出す一方で、ＰｒＰタンパク質などのプリオンの流入を可能にする。
したがって、１つの特定の実施形態においては、約１０〜８００ｎｍの直径を有する細孔は、ウイルスを捕捉するのに好適であり、０．２〜５μｍの間くらいの直径を有する細孔は、細菌を捕捉するのに好適であり、そして１〜２０μｍの間くらいの直径を有する細孔は、真菌を捕捉するのに好適であろう。
したがって、本発明の複合体の足場は、最低直径が１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５又は１１ｎｍの細孔；及び最大直径が５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０μｍの細孔を有し得る。通常、足場細孔は、５０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍ、６００ｎｍ、７００ｎｍ、８００ｎｍ、９００ｎｍ、１μｍ、１．５μｍ、２μｍ、２．５μｍ、３μｍ、３．５μｍ、４μｍ、４．５μｍ、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０又は５０μｍの直径を有する。
したがって、足場は、サイズ選択によるエンティティの選択的捕獲において機能し、したがって、サイズ排除「フィルタ」として機能する。足場細孔を通過することができるのに十分に小さなエンティティのみが捕獲され、内在化される。
足場の内部内腔内に隔離されると、物質又は病原体は、処理のために活性部分に提示される。したがって、足場は、物質又は病原体を隔離及び分離し、そうして物質又は病原体を身体から遮り、また逆に身体を物質又は病原体から遮ることと、活性部分を宿主細胞から遮り、そうして毒作用を妨げ、且つ特に免疫系の細胞から遮り、そうしてその部分に対する免疫反応を妨げることという、２つの目的にかなう。
活性部分を免疫隔離することは、その半減期を増加させ、したがってインビボでの本発明の複合体の治療有効性を増加させると同時に、さもなければ免疫を生じ且つことによると中毒を起こさせるかもしれない活性部分のインビボでの使用を可能にする。
活性部分（例えば、受容体、酵素）は、免疫原性分子であり得、そういうものであるから、一部の先行技術のウイルストラップの場合がそうであるように、粒子（例えば、リポソーム）又はキャリアの表面でのそのような分子の表示は、トラップへの免疫反応及びそれの部分的又は完全な不活性化の可能性を高め得る。
単離及び捕捉の２段階の本発明の組成物は、中空粒子内に活性部分を隔離することによって先行技術のこの制約を乗り超える。これは、活性部分を被験体の免疫系から遮り、身体における合成物の可能な半減期を増加させる。免疫隔離を捕捉及び任意選択での不活性化と分けることにより、本発明の複合体は、ことによると免疫反応を起こさせるかもしれない分子を被験体の免疫系から遮り、本発明の組成物の循環時間を向上させる。
さらに、先行技術のウイルストラップ（例えば、抗体及びデンドリマー、又は受容体を有するプロテオリポソーム）は、結合されたウイルスが依然として宿主細胞に提示されるので、依然として宿主細胞に感染性／免疫反応性であり得る。本発明の単離アプローチは二方向性であり、これは、ウイルス及びウイルス結合性部分を免疫系から遮蔽するだけでなく、これは、ウイルストラップにより閉じ込められたウイルスから非感染宿主細胞を遮蔽しもする。
本発明の複合体は、生物学的流体（例えば、血液、尿、精液、唾液、粘液、リンパなど）、非生物学的流体（例えば、飲料水、飲料、汚水など）を含む、任意の流体試料における解毒又は感染防止のために、インビボ又はインビトロで使用され得る。
本発明の１つの現在のところの好ましい用途は、生物学的流体（例えば、血液）において病原体（例えば、ウイルス）の感染を予防又は処置することにある。そのような場合においては、本発明の複合体は、治療剤として機能する。
したがって、本発明は、液体媒体（例えば、血液）から、その媒体をことによると有害である又は免疫性がある（immunological）かもしれない化学物質に曝露することなしに、病原体及び物質を排除するための新規のアプローチを提供する。
上に述べたように、本発明の複合体は、形状が三次元であり、そして１つ以上の活性部分が中に配置された内部内腔を含む。
そのような「構造」を提供する複合体の１つの具体的な構成は、直径８００ｎｍの細孔を有する４ミクロンのポリスチレン中空ミクロスフィア（当該足場）及び外側ＰＥＧ被膜（免疫隔離）を含む。このミクロスフィアは、トリトン洗剤（当該部分）で被覆された１ミクロンのポリスチレンミクロスフィアを封入している。代替的な構成は、外側がｍＰＥＧ（免疫隔離）で被覆され且つ内側がサーファクタントプロテインＤ（部分）で被覆された１ミクロンのＤＮＡバッキーボール（足場）を含み得る。
本発明の複合体の足場は、核酸ナノ構造体、ポリマー、又はシリコンウェーハから製作され得る。
核酸（ＤＮＡ／ＲＮＡ）ナノ構造体は、構成単位が核酸、ヌクレオチド又はヌクレオシドである構造体である。核酸ナノテクノロジーは、ワトソン・クリック型塩基対の特異性によって互いに相補的な鎖の部分のみが互いに結合して二重鎖を形成するという事実を利用している。核酸ナノ構造体の構築は、いくつもの刊行物（とりわけ、国際公開第２００８／０３９２５４号、米国特許出願公開第２０１０／０２１６９７８号、国際公開第２０１０／０１４８０８５号、米国特許第５，４６８，８５１号、米国特許第７，８４２，７９３号、Dietz他(2009)[Dietz他(2009)Science,Vol.325,pp.725-730]、Douglas他(2009)[Douglas他(2009)Nature,Vol.459,pp.414]を含む）に記載されている。後に続く実施例の項の実施例６及び実施例９〜１１に、本発明用に好適なＤＮＡ足場を生成するための配列及びアプローチが記載されている。
基本的に、ＤＮＡ又はＲＮＡの天然又は人工の配列は、三次元（３Ｄ）構造を生じるようにプログラムされ得る。通常、ＤＮＡベースのナノ構造体は、相補的なより短いＤＮＡ鎖の結合によって３Ｄコンフォメーションになるように誘導されるＤＮＡの一本鎖を利用している。それに対して、ＲＮＡは、同じ分子内のＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用に基づいて、三次ＲＮＡモチーフを形成することにより３Ｄへと折り畳める。折り畳まれた一本鎖ＤＮＡに基づくナノ構造体もまた実行可能である。ＲＮＡ二重鎖は、ＲＮＡ３Ｄ構造体を生成するための代替手段である。
したがって、本発明の足場の１つの特定の実施形態において、核酸ナノ構造体は、ＤＮＡ折り紙である。ＤＮＡ折り紙は、ナノスケールで人工的に折り畳まれたＤＮＡを生成する方法であり、エンティティを内部に捕捉又は捕獲するための足場として使用され得る任意の三次元形状を生じる。折り紙型のＤＮＡナノ構造体を作製する方法は、例えば米国特許第７，８４２，７９３号に記載されている。ＤＮＡ折り紙では、複数のより小さな「ステープル」鎖により助けられて（例えば）ウイルスＤＮＡの長い一本鎖を折り畳むことになる。これらのより短い鎖は、そのより長い鎖と様々な箇所で結合して、３Ｄ構造体の形成を結果としてもたらす。
本発明の核酸ナノ構造体は、したがって、複数のＤＮＡ折り紙タイルを接合したものからなる構造体であり得、且つ／又は、それは、誘導可能な形状を有し得る。誘導可能な核酸ナノ構造体は、例えば、Andersen他(2009)[Andersen他(2009)Nature,vol.459,pp.73-77]、Dietz他(2009)[Dietz他(2009)Science,Vol.325,pp.725-730]、Voigt他(2010)[Voigt他(2010)Nature Nanotechnology,vol.5,pp.200-203]、及びHan他(2011)[Han他(2011)Science,Vol.332,pp.342-346]に記載されている。核酸ナノ構造体を設計するためのソフトウェアパッケージは、www.cdna.dk/origamiで入手可能である。
本明細書で言及される場合、本発明の複合体の核酸ナノ構造体で使用される核酸は、プリン塩基及びピリミジン塩基、又は他の天然ヌクレオチド塩基、化学的もしくは生化学的に修飾されたヌクレオチド塩基、非天然ヌクレオチド塩基、もしくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含む、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの任意の長さのヌクレオチドの重合形、又はペプチド核酸（ＰＮＡ）をいう。ポリヌクレオチドの主鎖は、ＲＮＡもしくはＤＮＡにおいて典型的に見られ得るような糖及びリン酸基、又は改変もしくは置換された糖もしくはリン酸基を含み得る。ポリヌクレオチドは、改変ヌクレオチド（例えば、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体）を含み得る。したがって、ヌクレオシド、ヌクレオチド、デオキシヌクレオシド及びデオキシヌクレオチドという用語は、概して、類似体（例えば、本明細書に記載されるもの）を包含する。
典型的には核酸は、ホスホジエステル結合を含むものであるが、核酸は、例えばホスホルアミド、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、Ｏ−メチルホスホロアミダイト結合、並びにペプチド核酸主鎖及び結合を含む、改変された主鎖を含んでいてもよい。他の類似体核酸としては、正の主鎖、非イオン主鎖及び非リボース主鎖を有するものが挙げられる。１つ以上の炭素環式糖を含有する核酸もまた、核酸の定義の範囲内に包含される。当業者に理解されるように、これらの核酸類似体の全てが、ヘルパー鎖として又はナノ構造体を生成するために使用されるポリヌクレオチドの一部としての用途を見出し得る。また、天然に存在する核酸と類似体との混合物が作製され得る。ＰＮＡ（ペプチド核酸）には、増大した安定性を有するペプチド核酸類似体が含まれる。
したがって、種々の形態及びコンフォメーションの核酸（右巻きＤＮＡ、右巻きＲＮＡ、ＰＮＡ、ロックド核酸（ＬＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、架橋核酸（ＢＮＡ）、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴ（ＰＭＯ）を含む）並びにヌクレオチド類似体（例えば、非ワトソン・クリック型ヌクレオチドｄＸ、ｄＫ、ｄｄＸ、ｄｄＫ、ｄＰ、ｄＺ、ｄｄＰ、ｄｄＺ）が、ナノ構造体足場を生成するために使用され得る。
一部の実施形態において、ポリヌクレオチドを含む本発明のナノ構造体は、１個以上の異なるポリマー核酸構造体（例えば、少なくとも２０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、又は少なくとも１０００個以上の異なる核酸分子）を含み得る。核酸は、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、又は二本鎖もしくは一本鎖配列の両方の部分を含有してもよい。核酸は、ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡの両方）、ＲＮＡ又はハイブリッドであり得、ここで、核酸は、デオキシリボ核酸とリボ核酸との任意の組み合わせ、及び塩基（ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニンなどを含む）の任意の組み合わせを含有する。そのような核酸は、ヌクレオチド、並びにヌクレオシド類似体及びヌクレオチド類似体、並びに改変ヌクレオシド（例えば、アミノ改変ヌクレオシド）を含む。
本発明のＤＮＡナノ構造体は、所望の形状（通常、直径１００〜５０００ｎｍの間である）へのポリヌクレオチドの長い一本鎖（これは、ＤＮＡナノ構造体の専門用語で足場鎖（scaffold strand）と呼ばれる）の折り畳みを方向付けるために、核酸の多数の短い一本鎖（ヘルパー鎖）（例えば、ＤＮＡ）を利用し得る。したがって、本発明の複合体の核酸足場は、およそ約１００ｎｍ〜５０００ｎｍであり得るが、状況によっては１０、１５又は２０μｍのより大きな足場もまた用いられ得る。
別の実施形態において、本発明の複合体の足場は、ポリマー構造体であり得、ここで、構成単位は、とりわけ、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリＬ−Ｄ−ラクチド−コ−グリコリド（ＰＬＧＡ）、ジメチルアミノエチルメタクリレートメチルメタクリレートコポリマー、PAN[Xiang他,Hazard Mater.2010 Jan 15;173(1-3):243-8]、又はPMMA(Yuan他,Langmuir.2009 Mar 3;25(5):2729-35;Zhang他,Colloid Interface Sci.2009 Aug 1;336(1):235-43;Lin他Langmuir.2008 Dec 2;24(23):13736-41]、ポリ（オルトエステル）(POE)[Heller他(2000)J.Mater.Sci Mater.Med.11(6):345-55]、ポリホスファゼン[Allcock(1994)Biomaterials,15(8):563-9]、ポリ無水物（Shieh他(1994)J.Biomed.Mater REs.28(12):1465-75）、ポリホスホエステル[Richards他(1991)J.Biomed.Mater.Res.25(9):1151-1167]ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリトリメチレンカーボネート（ＰＴＭＣ）、ポリ（Ｌ−乳酸）及びポリ（グリコール酸）（ＰＬＬＡ／ＰＧＡ）、ＰＧＡ、ＰＬＬＡ−ＰＧＳ、１，３−プロパンジオール（ＰＤＯ）、ポリエチレン、ポリケトン（ＰＥＥＫ）、アルギネート、ポリＬ−リジンと合わせたアルギネート（アルギネート／ＰＬＬ）、アルギン酸ナトリウム、アガロース、ヒアルロン酸、ヒドロゲル（例えば、ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、ヒドロキシエチルメタクリレートメチルメタクリレート（ＨＥＭＡ−ＭＭＡ）、メタクリル酸、メタクリル酸メチル、キトサン、コラーゲン、セルロースポリマー）などのポリマーである。これらのポリマーは、半透膜として機能し得、生物学的に安全な膜（biosafe membrane）として知られている。
更なる実施形態において、本発明の複合体の足場は、シリコン微細構造体（例えば、バイオカプセルを構成するシリコンウェーハ）である。シリコンウェーハの作製方法は、例えば、Desai他[Desai他(1998)Biotechnology and Bioengineering,vol.57,no.1,pp.118-120]により記載されている。
別の更なる実施形態において、本発明の足場は、インビボで足場を特定の組織に標的化するための標的化部分をさらに含み得る。そのような標的化部分は、例えば、組織特異的リガンドもしくは受容体、又は他の組織特異的もしくは細胞特異的分子であり得、これらは、例えば、標的組織の細胞外マトリックスに結合し得る。
別の更なる実施形態において、本発明の足場は、複合体が細胞（例えば、食細胞）によって飲み込まれる又は食作用されるという事態において同足場が同細胞を殺すことを可能にする分子（例えば、毒素）をさらに含み得る。
したがって、本発明の足場には、細胞死を促進もしくは誘導する、免疫調節物質部分、又は毒性もしくは細胞毒性部分（例えば、アレンドロネート、クロドロネート、ＡｐｐＣＣｌ２ｐ（クロドロネート代謝産物）、ＤＭＤＰ（メチル−５−デアザプテリジン）、自殺遺伝子の配列又は産物など）が備えられ得る。
本発明の足場は、非免疫原性物質（例えば、PLGA[Lin他Biomaterials.2012 Jul;33(20):5156-65];PVA[Efthimiadou他,Int J Pharm.2012 May 30;428(1-2):134-42]、キトサン[Mu他,Mol Pharm.2012 Jan 1;9(1):91-101;Lu他,Biointerfaces.2011 Apr 1;83(2):254-9]、セルロース[Metaxa他,J.Colloid Interface Sci.2012 May 18]、コラーゲン[Helary他,Acta Biomater.2012 Jun 15.[印刷前に電子出版]]）から製作され得る。あるいは、足場は、非免疫原性物質で被覆され得る。例えば、足場は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はその誘導体で被覆され得る（参考文献：Macromol Biosci.2004 May 17;4(5):512-9）。
足場には、本発明の複合体を特定の組織に標的化するために、標的化部分が備えられ得る。そのような部分は、本発明の複合体を、感染している組織に標的化するために使用され得る。
標的化部分は、組織特異的部分、ウイルス特異的受容体、抗体、リガンド、炭水化物、タンパク質、ペプチド、脂質、又は磁気部分であり得る。
１つの好ましい実施形態によれば、足場には、その外側に肝臓特異的リガンドが備えられており、これにより本発明の複合体を肝臓に方向付ける。同様に、他の組織（例えば、膵臓、心臓、脾臓、腎臓、リンパ節など）が標的となり得る。
活性部分は、物質又は病原体を特異的又は非特異的に結合／処理することが可能な任意の分子又は構造体であり得る。
活性部分は、リポソーム、ナノチューブ、アプタマー、デンドリマー、タンパク質、ペプチド、受容体、酵素、リガンド、抗体、キレート剤、洗剤、毒素、薬物又はプロドラッグであり得る。
リポソームは、標的特異的部分、すなわちエンティティ結合性部分（例えば、リガンド、受容体、抗体、炭水化物、タンパク質又は脂質）を表面に担持し得る、脂質二重層で作られた小胞である。リポソームは、それらの膜の上にウイルス特異的受容体（例えば、ＣＤ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、テトラスパニンＣＤ８１、ヒトスカベンジャー受容体ＳＲ−ＢＩ、クローディン−１、オクルディン、エフリン−Ｂ２、ＣＤ４６、ＣＡＲ、ａｖインテグリン、ＨＡＶＣＲ−１、ＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体）、ＳＬＡＭ、アセチルコリン受容体、ニューロトロフィン受容体、ｐ７５ ＮＴＲ、シアル酸、グリコサミノグリカン、ヘパラン硫酸、ヒアルロナン（ヒアルロン酸）、コラーゲン、ゼラチン、ポリアクリル酸、キトサン）を提示し得る。あるいは、又はさらに、リポソームは、その内腔内に、別の部分（例えば、酵素（例えば、とりわけ、ＤＮアーゼ、ＲＮアーゼ、プロテアーゼ、グリコシダーゼ、又はリパーゼ）、塩基、酸、阻害剤、不可逆的結合剤など）を有し得る。
スカベンジャーとして機能し得る他の活性部分は、タンパク質ナノチューブ（調製方法については、例えばQu and Komatsu(2010)ACS Nano,Vol.4,No.1,pp.563-573を参照されたい）、デンドリマー（調製方法については、例えば米国特許第４，２８９，８７２号；米国特許第４，４１０，６８８号、米国特許第４，５０７，４６６号、同４，５５８，１２０号、米国特許第４，５６８，７３７号、米国特許第４，５８７，３２９号、米国特許第６，１９０，６５０号、国際公開第８８／０１１７８号、国際公開第８８／０１１７９号、及び国際公開第８８／０１１８０号を参照されたい）、アプタマー、タンパク質、酵素、リガンド（例えば、受容体）、抗体、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、プロト細胞、毒素、薬物又はプロドラッグである。
本明細書で言及される場合、「アプタマー」は、種々のタンパク質と高いアビディティで結合する、比較的短い核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ又は両方の組み合わせ）配列である。アプタマーは、概して長さが約２５〜４０ヌクレオチドであり、約１８〜２５ｋＤａの範囲内の分子量を有している。標的に対して高い特異性及び親和性を有するアプタマーは、ＳＥＬＥＸ（systemic evolution of ligands by exponential enrichment：指数関数的富化によるリガンドの系統的進化）と呼ばれる試験管内進化法により得られ得る［例えば、参照によりその全体が本明細書に援用される、Zhang他(2004)Arch.Immunol.Ther.Exp.52:307-315を参照されたい］。
本明細書で言及される場合、「抗体」は、天然由来又は天然産生の抗体に関しており、これらは、ポリクローナル又はモノクローナルであり得る。あるいは、抗体は、例えば化学合成により合成製造され得る、又はそれぞれの抗体産生細胞もしくは細胞株からの特定のｍＲＮＡの単離により組換え製造され得る。組換え製造される抗体を生成するためには、次いで特定のｍＲＮＡが、標準的な分子生物学操作（ｃＤＮＡの入手、発現ベクターへのそのｃＤＮＡの導入など）を受けることになる。こうした技術は、当業者によく知られている。
タンパク質に対するポリクローナル抗体の生成は、当業者によく知られている技術であり、これは、とりわけ、Current Protocols in Immunology,John E.Coligan他(eds.),Wiley and Sons Inc.の第２章に記載されている。
モノクローナル抗体を生成する技術は、多くの論文及び教科書（例えば、前述のCurrent Protocols in Immunologyの第2章、Kohler and Milstein[Kohler and Milstein(1975)Nature 256;495-497]及び米国特許第４，３７６，１１０号）に記載されている。
用語「抗体」はまた、抗原と結合することが可能な、完全な抗体分子及びその断片（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、二重特異性抗体、線状抗体、Ｆ（ａｂ’）２抗原結合性断片など）の両方を含むことが意図される［Wahl他(1983)J.Nucl.Med.24,316-325］。
本発明において有用な抗体のＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２並びに他の断片は、意図された用途に応じて様々なタグでタグ化され得る。これらのタグは、標的を殺すことになる毒性のタグであり得る。
洗剤は、細胞崩壊に適した手段として機能し得る。洗剤の非限定的なリストには、ＣＨＡＰＳ、TritonX 100、ＳＤＳ、Tweenなどが含まれる。洗剤は、必ずしもスカベンジャーとして機能するわけではない。というのは、洗剤は、厳密な意味でのエンティティの「捕捉」又は「捕獲」はせずに、それを代替的又は共同的に分解し得るからである。したがって洗剤は、酵素と同様、エンティティの切断又は分解により機能する。
細胞壁を崩壊させるために使用され得る酵素としては、リゾチーム、リソスタフィン、ザイモラーゼ（zymolase）、セルロース、ムタノリシン（mutanolysin）、グリカナーゼ、プロテアーゼ、マンノースなどが挙げられる。他の例としては、例えば、ヒドロラーゼが挙げられる。上記の洗剤と同様に、酵素は厳密な意味でのエンティティの「捕捉」又は「捕獲」はせずにそれを分解するので、酵素は必ずしもスカベンジャーとして機能するわけではない。
捕獲に続いて、本発明の複合体の活性部分は、分子（例えば、細胞毒、ホルモン、薬物、インジケータ、核酸、タンパク質、佐剤又は化学物質（酸、塩基）など）を放出し得る。この分子又は化学物質は、エンティティを化学的に変更し（例えば、病原体の膜又はタンパク質構造を崩壊させ）得る。
活性部分は、足場内又は足場の内側に置かれた粒子又はキャリアに固定され得る。そのような固定は、共有結合、アフィニティー相互作用（例えば、ビオチン−アビジン／ストレパビジン（strepavidin）相互作用など）を通して、又は任意の他の固定アプローチにより行い得る。他の既知の特定の分子を結合させるためのアンカーとして機能し得る分子の例としては、抗体、フェリチン、ポリヒスチジンタグ、ｃ−ｍｙｃタグ、ヒスチジンタグ、血球凝集素タグなどが挙げられるが、これらに限定されない。
１つの好ましい実施形態によれば、固定分子は、抗体、受容体又はリガンド（例えば、ビオチン−アビジン）である。
１つの好ましい実施形態によれば、キャリアは、ポリスチレンナノスフィアである。
上に述べたように、本発明は、物質又は病原体の隔離及び処理を可能にする。
物質は、生物学的又は非生物学的液体中に存在する元素、化合物又は分子であり得る。例えば、物質は、血液、水、液体消耗品（例えば、ビール又はワイン）などの中に存在する毒素、不純物又は汚染物質であり得る。
病原体は、プリオン、ウイルス、細菌、原生生物、真菌、古細菌（archae）又は他の寄生生物を含む任意の生物であり得る。
被験体（例えば、ヒト）のインビボ又はエキソビボ処置のために使用される場合、本発明は、治療／予防用途を有し、したがって、本発明は、必要としている被験体を、毒素、望ましくない分子／化合物又は感染から保護又は処置するのに有用である。例えば、本発明は、毒素（例えば、リシン、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）又はダイオキシン）、望ましくない分子又は複合体（例えば、ＬＤＬ（低密度リポタンパク質）、グルコース、自己反応性抗体、プリオン、アレルゲン、腫瘍原性因子（例えば、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α））など）又は感染性因子（例えば、ウイルス）を除去するために使用され得る。
本発明の１つの好ましい実施形態によれば、複合体は、微生物（例えば、ウイルス、細菌、真菌、原生生物又は古細菌（archea））を除去、中和又は排除するために使用され得る。
感染性ウイルスの例としては、レトロウイルス科（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、例えば、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶもしくはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶとも呼ばれるＨＩＶ−１、又はＨＩＶ−ＩＩＩ；及び他の分離株、例えば、ＨＩＶ−ＬＰ）；ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；カルシウイルス科（Calciviridae）（例えば、胃腸炎を引き起こす株）；トガウイルス科（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）から；フラビウイルス科（例えば、デング熱ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱ウイルス）；コロナウイルス科（例えば、コロナウイルス）；ラブドウイルス科（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（例えば、エボラウイルス）；パラミクソウイルス科（例えば、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）；オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）；ブンガウイルス科（Bungaviridae）（例えば、ハンタンウイルス、ブンガ（bunga）ウイルス、フレボウイルス及びナイロウイルス）；アレナウイルス科（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（例えば、レオウイルス、オルビウイルス及びロタウイルス）；ビルナウイルス科；ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（パルボウイルス）；パポバウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス科（ほとんどのアデノウイルス）；ヘルペルウイルス科（Herperviridae）（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１型及び２型、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス）；ポキシウイルス科（Poxyiridae）（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；及びイリドウイルス科（例えば、アフリカブタ熱ウイルス）；及び未分類ウイルス（例えば、海綿状脳症の病因因子、デルタ型肝炎の因子（Ｂ型肝炎ウイルスの欠損サテライトと考えられる）、非Ａ非Ｂ型肝炎の因子（クラス１−経口伝染；クラス２−非経口伝染（すなわち、Ｃ型肝炎）；ノーウォークウイルス及び関連ウイルス、並びにアストロウイルス））まで挙がられる。
感染性細菌の例としては、とりわけ、ヘリコバクター・ピロリス（Helicobacter pyloris）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borelia burgdorferi）、レジオネラ・ニューモフィリア（Legionella pneumophilia）、マイコバクテリウム属種（例えば、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・アビウム、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、マイコバクテリウム・カンサイイ（M.kansaii）、マイコバクテリウム・ゴルドネ）、スタフィロコッカス・アウレウス、ナイセリア・ゴノレア、ナイセリア・メニンギティディス、リステリア・モノサイトゲネス、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ａ群レンサ球菌）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｂ群レンサ球菌）、レンサ球菌属（ビリダンス群）、ストレプトコッカス・フェカリス、ストレプトコッカス・ボビス、レンサ球菌属（嫌気性種）、ストレプトコッカス・ニューモニエ、病原性カンピロバクター属種、エンテロコッカス属種、ヘモフィルス・インフルエンザ、バチルス・アントラシス、コリネバクテリウム・ジフテリエ、コリネバクテリウム属種、エリシペロトリックス・ルシオパチエ、クロストリジウム・パーフリンゲルス（Clostridium perfringers）、クロストリジウム・テタニ、エンテロバクター・エロゲネス（Enterobacter erogenes）、クラミジア・トラコマティス、クレブシエラ・ニューモニア（Klebsiella pneumonia）、パスツレラ・ムルティコダ（Pasturella multicoda）、バクテロイデス属種、フゾバクテリウム・ヌクレアツム、ストレプトバチルス・モニリフォルミス、トレポネーマ・パリジウム（Treponema pallidium）、トレポネーマ・パーテヌエ、ヘモフィルス・インフルエンザ、レプトスピラ属、及びアクチノミセス・イスラエリ（Actinomyces israelli）が挙げられる。
感染性真菌の例としては、とりわけ、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ヒストプラスマ・カプスラーツム、コクシジオイデス・イミティス、ブラストミセス・デルマティティディス、及びカンジダ・アルビカンスが挙げられる。
病原体としての原生生物の例には、とりわけ、マラリアを引き起こすプラスモジウム・ファルシパルム、トキソプラズマ・ゴンディイ（トキソプラズマ症）、及びリーシュマニア・ドノバニ（リーシュマニア症）がある。
インフルエンザウイルス粒子を結合させるために使用され得るペプチド部分の例は、後に続く実施例の項で提供されている。微生物と結合するための部分として利用され得るリガンド（例えば、インフルエンザウイルスタンパク質ノイラミニダーゼ、又はビリオンもしくは他の微生物に組み込まれている宿主タンパク質（例えば、ヒトタンパク質ＣＤ８１））は、「Cellular proteins in influenza virus particles」[Shaw他,PLoS Pathog.2008 Jun 6;4(6):e1000085]に記載されている。
本発明の１つの好ましい実施形態によれば、複合体は、微生物（例えば、ウイルス、細菌、真菌、原生生物又は古細菌（archea））を感染した場合に除去、中和又は排除することにより、生物戦薬剤（biowarefare agent）によって起こる可能性のある感染に対して、又は世界的流行病に対して、予防的に使用され得る。
生物戦（biowarefare）において使用されるウイルスの例には、とりわけ、ポックスウイルス（例えば、痘瘡天然痘、サル痘）、脳炎ウイルス（例えば、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス）、アレナウイルス科（例えば、ラッサ出血熱、アルゼンチン出血熱、ボリビア出血熱、ブラジル出血熱、ベネズエラ出血熱）、ブンヤウイルス科（例えば、リフトバレー、クリミア−コンゴ、ハンターン）、及びフィロウイルス科（例えば、マールブルグ、エボラ）、フラビウイルス科（例えば、黄熱（yellow HF）、デング出血熱、キャサヌール森林出血熱、オムスク出血熱）がある。
同様に、被験体は、必ずしも病原体ではない、病状、生理学的障害又は中毒の原因であり得る何らかの他のエンティティ又は物質（例えば、核酸、小分子、プリオン、タンパク質、炭水化物、脂質、毒素、毒液、薬物、毒、アレルゲン、金属、又は汚染物質；すなわち、任意の物質であって系からそれを一掃する又は取り除く必要性又は要望があり得るもの）を排除、除去又は中和することを必要とし得る。エンティティ又は物質は、以下でさらに定義される。
この文脈において、核酸とは、多様なヌクレオチド、すなわち、リン酸基に結合し、且つ置換ピリミジン（例えば、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ））又は置換プリン（例えば、アデニン（Ａ）又はグアニン（Ｇ））のいずれかである交換可能な有機塩基に結合した糖（例えば、リボース又はデオキシリボース）を含む分子をいう。本明細書で使用される場合、この用語は、リボヌクレオチド及びオリゴデオキシリボヌクレオチドをいう。この用語はまた、ポリヌクレオチド（すなわち、ポリヌクレオチドのリン酸基のないもの）及び任意の他の有機塩基含有ポリマーも包含するものとする。核酸分子は、天然供給源（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ）由来であってもよいし、組換え又は合成供給源由来（例えば、オリゴヌクレオチド合成により製造したもの）であってもよい。
小分子は、定義上ポリマーではない低分子量有機化合物である。小分子という用語は、特に薬理学分野の範囲内においては、通常、バイオポリマー（例えば、タンパク質、核酸、又は多糖）と高い親和性で結合しさらにそのバイオポリマーの活性又は機能を変更しもする分子に限定される。小分子の分子量の上限は、それらが細胞内作用部位に到達し得るように細胞膜を横切って速やかに拡散する可能性を許容する、およそ８００ダルトンである。非常に小さなオリゴマー（例えば、ジヌクレオチド、ペプチド（例えば、抗酸化剤グルタチオン）及び二糖（例えば、スクロース））もまた、通常、小分子と見なされる。
プリオンは、誤って折り畳まれた形態のタンパク質からなる感染性因子である。プリオンは、種々の哺乳動物における伝染性海綿状脳症（ウシにおけるウシ海綿状脳症（ＢＳＥ、「狂牛病」としても知られる）及びヒトにおけるクロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）を含む）の原因である。全ての既知のプリオン疾患が、脳又は他の神経組織の構造に影響を及ぼし、且つ、現在のところ、全てが治療不可能であり、例外なく致命的である。
本明細書で言及される場合、「炭水化物」又は「糖」は、単糖、二糖（例えば、グルコース、スクロース又はラクトース）、オリゴ糖、又は多糖（例えば、デンプン、セルロース、又は複合炭水化物（例えば、グリコサミノグリカン））であり得る。
本明細書で言及される場合、用語「タンパク質」及び「タンパク質（複数）」は、任意長のアミノ酸残基のあらゆるポリマーを包含すると解釈されるものとし、したがって、この用語は、ポリペプチドのサブセットである従来からタンパク質と呼ばれているもののみならずポリペプチドを包含し、且つアミド結合によって連結されたαアミノ酸でできたより短い構成単位ポリマーであるペプチドをも包含する。タンパク質は、概して、配列の一次構造及び二次構造がより高いレベルの三次構造及び／又は四次構造を生じるのに十分である、任意のアミノ酸配列を含む。タンパク質は、ペプチドにはそのような三次構造及び／又は四次構造を形成する能力がない点で、ペプチドと異なる。タンパク質は、典型的に、少なくとも約１５キロダルトンの分子量を有する。本明細書の文脈において、タンパク質は、アミノ酸のＬ−光学異性体又はＤ−光学異性体を含み得、且つ合成アミノ酸も含み得ることが理解されるであろう。タンパク質は、他の鎖（例えば、炭水化物（糖タンパク質）、脂質（リポタンパク質）、リン（リン酸化タンパク質）、硫黄など）をそれに結合させることによってさらに修飾され得る。本発明の複合体により捕捉又は捕獲され得るタンパク質としては、抗体、酵素、サイトカイン、ホルモンなどが挙げられる。本発明の複合体で捕獲するのに望ましくあり得るタンパク質の１つの具体例は、アミロイドβである。他の分子（例えば、非タンパク質細胞伝達分子又は神経伝達物質（例えば、ｃＡＭＰ、ドーパミン、セロトニン、エピネフリンなど））もまた、被験体の循環から低減又は排除されるべき標的であり得る。
本明細書で言及される場合、「脂質」は、脂肪、ステロール、脂溶性ビタミン（例えば、ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ及びＫ）、モノグリセリド、ジグリセリド、リン脂質、その他を包含する。本発明の複合体によって捕獲することが望ましくあり得る脂質の１つの具体例は、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）である。
本明細書で言及される場合、「毒素」は、生細胞又は生物によって産生される毒物であり、血液毒、フォトトキシン、シアノトキシン、壊死毒、神経毒（例えば、ブレボトキシン）、細胞毒、アピトキシン及びマイコトキシンを包含する。毒液は、ある特定の種類の動物によって用いられるあらゆる種類の毒素を指す一般的な用語であり、それらの動物は、噛むこと又は刺すことによってこれをそれらの餌食に注入する。毒液を産生する動物の非網羅的なリストには、とりわけ、クモ、サソリ、ヘビ、魚類、タコ、クラゲ、ハチ、スズメバチ、アリ、トガリネズミ、モグラが含まれる。
本明細書で言及される場合、「アレルゲン」は、アレルギーを引き起こし得るあらゆる物質である。アレルゲンの典型的な例としては、花粉、チリダニ、ペットのフケ、堅果、香料、海産食品、ラッカセイ、木の実、卵、ミルク、貝類・甲殻類、魚類、コムギ及びその誘導体、並びにダイズ及びその誘導体が挙げられ、加えて、１０ｐｐｍ以上の亜硫酸塩（化学物質ベースであり、食品中の調味料及び着色料でしばしば認められる）、ヒアリ、ウルシ、ハチ刺し傷、薬物（例えば、ペニシリン）、及びラテックスも挙げられる。真菌由来のアレルゲンとしては、担子胞子、プレウロトゥス・オストレアトゥス、クラドスポリウム、カルウァティア・キュアティフォルミス、アスペルギルス及びアルテルナリア−ペニシリンファミリー、フォメス・ペクティナティスが挙げられる。アレルゲンのリストは膨大であり、昆虫毒液、動物チリダニ、真菌胞子なども含み得る。天然アレルゲン、動物アレルゲン及び植物アレルゲンの例としては、以下の属に特有のタンパク質が挙げられる：イヌ属（カニス・ファミリアリス）、ヒョウダニ属（例えば、デルマトパゴイデス・ファリナエ）；ネコ属（フェリス・ドメスティクス）；ブタクサ属（アンブロシア・アルテミイスフォリア）；ドクムギ属（例えば、ロリウム・ペレンネ又はロリウム・ムルティフロルム）；スギ属（クリュプトメリア・ヤポニカ）；アルテルナリア属（アルテルナリア・アルテルナタ）；ハンノキ類（Alder）；ハンノキ属（アルヌス・グルティノサ）；カバノキ属（ベトゥラ・ウェルコサ）；カシ属（クゥエルクス・アルバ）；オリーブ属（オレア・エウロパ）；ヨモギ属（アルテミシア・ウルガリス）；オオバコ属（例えば、プランタゴ・ランケオラタ）；ヒカゲミズ属（例えば、パリエタリア・オフィキナリス又はパリエタリア・ユダイカ）；チャバネゴキブリ属（例えば、ブラッテッラ・ゲルマニカ）；ミツバチ属（例えば、アピス・ムルティフロルム）；イトスギ属（例えば、クプレッスス・センペルウィレンス、クプレッスス・アリゾニカ及びクプレッスス・マクロカルパ）；ビャクシン属（例えば、ユニペルス・サビノイデス、ユニペルス・ウィルギニアナ、ユニペルス・コンムニス及びユニペルス・アシェイ）；クロベ属（例えば、トゥヤ・オリエンタリス）、ヒノキ属（例えば、カマエキュパリス・オブトゥサ）；ゴキブリ属（例えば、ペリプラネタ・アメリカナ）；カモジグサ属（例えば、アグロピュロン・レペンス）；ライムギ属（例えば、セカレ・ケレアレ）；コムギ属（例えば、トリティクム・アエスティウム）；カモガヤ属（例えば、ダクテュリス・グロメラタ）；ウシノケグサ属（例えば、フェストゥカ・エラティオル）；イチゴツナギ属（例えば、ポア・プラテンシス又はポア・コンプレッサ）；カラスムギ属（例えば、アウェナ・サティウァ）；シラゲガヤ属（例えば、ホルクス・ラナトゥス）；ハルガヤ属（例えば、アントクサントゥム・オドラトゥム）；オオカニツリ属（例えば、アレナテルム・エラティウス）；コヌカグサ属（例えば、アグロスティス・アルバ）；アワガエリ属（例えば、フレウム・プラテンセ）；クサヨシ属（例えば、ファラリス・アルンディナケア）；スズメノヒエ属（例えば、パスパルム・ノタトゥム）；モロコシ属（例えば、ソルグム・ハレペンシス）及びスズメノチャヒキ属（例えば、ブロムス・イネルミス）。
本明細書で言及される場合、「薬物」は、医用薬物に関するか、又は薬物は、娯楽薬（例えば、アヘン薬、アルコール又はニコチン）の意味で理解され得る。
医用薬物は、当該分野において医薬品又は医薬とも呼ばれ、解熱薬、鎮痛薬（痛み止め）、抗生物質、消毒薬などを包含する。異なる種類の医薬品が、処置されるべき系に特異的であり、医薬品の非網羅的リストには、制酸薬、逆流抑制薬、抗膨満薬、抗ドーパミン作動薬、プロトンポンプ阻害薬（ＰＰＩ）、Ｈ２−受容体アンタゴニスト、細胞保護薬、プロスタグランジン類似体、緩下薬、鎮痙薬、下痢止め薬、胆汁酸封鎖剤、オピオイド、ｂ−ロッカー受容体（b-locker receptor）、カルシウムチャネル遮断薬、利尿薬、強心配糖体、抗不整脈薬、硝酸薬（nitrate）、抗狭心症薬、血管収縮薬、血管拡張薬、末梢活性化剤（peripheral activator）、抗高血圧薬、ＡＣＥ阻害薬、アンギオテンシン受容体遮断薬、α遮断薬、抗凝固薬、ヘパリン、抗血小板薬、フィブリン溶解薬（fibrinolytic）、抗血友病因子、止血薬、アテローム性動脈硬化／コレステロール阻害薬、抗高脂血症剤、スタチン、抗精神病薬、抗鬱薬、制吐薬、抗痙攣薬／抗癲癇薬（antiepiletic）、抗不安薬、バルビツレート、運動障害薬、興奮薬、ベンゾジアゼピン、シクロピロロン、ドーパミンアンタゴニスト、抗ヒスタミン薬、コリン作動薬、抗コリン作動薬、カンナビノイド、ＮＳＡＩＤ、パラセタモール、三環系抗鬱薬、筋弛緩薬、アンドロゲン、抗アンドロゲン薬、ゴナドトロピン、コルチコステロイド、バソプレシン類似体が含まれる。
したがって、本発明の複合体は、薬剤又は娯楽薬によって引き起こされる過剰摂取に対する治療として使用され得る。
本明細書で言及される場合、用語「プロドラッグ」は、トリガーによって活性（又はより活性）になる化合物をいう。プロドラッグは、ある化合物の構造的に改変された形態であり、これは、生理的条件下において容易に化学変化を越し、該化合物は利用可能且つ活性になる。多種多様なプロドラッグ誘導体（例えば、プロドラッグの加水分解切断又は酸化的活性化に依拠するもの）が、当該技術分野において知られている。プロドラッグの一例を挙げるとすれば、これに限定されないが、エステル（当該「プロドラッグ」）であるが次いで活性エンティティであるカルボン酸に代謝により加水分解される化合物である。更なる例としては、ある化合物のペプチジル誘導体などが挙げられる。
本明細書で言及される場合、「毒」は、とりわけ、化学兵器（例えば、マスタードガス）、リシン、シアン化物、殺虫剤、除草剤であり得る。
金属中毒は、深刻な健康上の懸念であり、したがって、被験体の循環又はヒト消費用液体のどちらにおいても望ましくない量の金属を排除する手段が大いに必要とされている。
したがって、本発明の複合体はまた、過剰量が摂取され且つ／又は被験体において蓄積した場合に中毒を引き起こし得る金属、及び汚染物質を、捕捉又は捕獲するためにも使用され得る。金属としては、例えば、鉛、水銀、カドミウム、アルミニウム、ビスマス、金、ガリウム、リチウム、銀、バリウム塩、ポロニウム、コバルト、マンガン、ヒ素、クロム、コバルト、銅、鉄、ニッケル、セレン、タリウム、及び亜鉛が挙げられる。汚染物質としては、有毒な廃棄物（例えば、ダイオキシン及びその誘導体）が挙げられる。
図１（ａ）〜（ｃ）及び図２は、本明細書において複合体１０として言及される本発明の複合体のいくつかの実施形態を図示している。
複合体１０は、内部内腔１４を有する三次元粒子として構成されている多孔質足場１２を含む。内腔１４は、内腔１４内に配置され且つその大きさによって拘束されているキャリア１８（例えば、粒子）（図１）に、又は足場１２の内面２０（図２）に結合している活性部分１６を含む。
足場１２は、捕捉のために標的されるエンティティに応じて選択された特定の直径範囲を有する細孔２２を含む。例えば、インフルエンザウイルスを捕捉するように設計された足場１０は、直径が１００〜８００ｎｍの細孔２２を有し得る。
図１に示される足場１０は、後に続く実施例の項の実施例１〜２に記載されるように、ポリスチレンのマイクロ／ナノ粒子から構築され得る。図２に示される足場１０は、実施例９〜１０に記載されるようにＤＮＡを用いて、及び特に実施例４及び実施例１１に記載されるＤＮＡ折り紙技術によって構築され得る。
図３（ａ）〜（ｃ）は、図１（ｃ）の足場１０を用いたウイルス捕捉を図示したものである。図３（ａ）は、複合体の足場の外側にあるビリオンを図示しており、図３（ｂ）は、複合体の多孔質足場を通ってのそのビリオンの選択的流入を図示しており、そして、図３（ｃ）は、ビリオンと活性部分（例えば、抗体）との相互作用を図示している。尺度を示すために、赤血球が右側に図示されている。
上に述べたように、本発明の複合体は、生物学的流体のインビトロもしくはインビボでの処理（例えば、解毒又は感染の予防もしくは処置）において、又は非生物学的流体の処理（例えば、浄水）において有用であり得る。
したがって、本発明の別の態様によれば、液体から物質又は病原体を除去する方法が提供される。
本発明の方法の１つの好ましい適用は、病原体感染を患っている又は病原体感染に罹り易い被験体の処置である。
そのような処置は、病原体を捕捉することが可能な本発明の複合体を被験体に投与することによって行われる。本明細書で使用される場合、用語「被験体」は、動物、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒト）をいう。
本発明の複合体は、それ自体が被験体に投与され得るか、又はそれを好適なキャリアもしくは賦形剤と混合した薬学的組成物として被験体に投与され得る。
本明細書で使用される場合、「薬学的組成物」は、本明細書に記載される有効成分の１種以上と他の化学成分（例えば、生理的に好適なキャリア及び賦形剤）との調製物をいう。薬学的組成物の目的は、生物への化合物の投与を容易にすることである。
本明細書で使用される場合、用語「有効成分」は、意図される生物学的効果について責任を負う複合体をいう。
以下、語句「生理学的に受容可能なキャリア」及び「薬学的に受容可能なキャリア」は、相互交換可能に使用され得、生体への著しい刺激を引き起こさず、且つ投与される化合物の生物学的活性及び特性を妨げない、キャリア又は希釈剤をいう。佐剤は、これらの語句の下に包含される。
本明細書において、用語「賦形剤」は、有効成分の投与をさらに容易にするために、薬学的組成物に添加される不活性な物質をいう。賦形剤の例としては、これらに限定されないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖及びデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、並びにポリエチレングリコールが挙げられる。
薬物の製剤化及び投与の技術は、参照により本明細書に完全に援用される「Remington’s Pharmaceutical Sciences」Mack Publishing Co.,Easton,PAの最新版に見出され得る。
好適な投与経路としては、例えば、経口送達、直腸送達、経粘膜送達、特に経鼻送達、腸管送達、又は腸管外送達（筋肉内注射、皮下注射、及び髄内注射を含む）が挙げられ得、さらに髄腔内注射、直接脳室内注射、静脈内注射、腹腔内（inrtaperitoneal）注射、鼻腔内注射、又は眼内注射が挙げられ得る。
あるいは、薬学的組成物は、例えば患者の組織領域内への直接的な薬学的組成物の注射により、全身的ではなく局所的に投与され得る。
本発明の薬学的組成物は、当該技術分野においてよく知られている方法によって、例えば、従来の混合法、溶解法、造粒法、糖衣錠作製法、研和法、乳化法、カプセル封入法、封入法、又は冷凍乾燥法によって、製造され得る。
したがって、本発明に従う使用のための薬学的組成物は、薬学的に使用され得る調製物への有効成分の加工を容易にする賦形剤及び助剤を含む、１種以上の生理学的に受容可能なキャリアを用いて従来のやり方で製剤化され得る。適切な製剤化は、選択される投与経路によって決まる。
注射のためには、薬学的組成物の有効成分は、水溶液中、好ましくは生理学的に適合性の緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンガー溶液、又は生理食塩緩衝液）中で製剤化され得る。経粘膜投与のためには、透過されるべき障壁に合った浸透剤が、製剤中に使用される。そのような浸透剤は、当該技術分野において一般に知られている。
経口投与のためには、薬学的組成物は、活性化合物と当該技術分野においてよく知られている薬学的に受容可能なキャリアとを組み合わせることによって、容易に製剤化され得る。そのようなキャリアは、薬学的組成物を、患者による経口摂取用に、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液体、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁剤などとして製剤化することを可能にする。経口使用のための薬理学的調製物は、固体賦形剤を用いて作製され得、任意選択で結果として生じる混合物を粉砕し、所望により好適な助剤を添加した後に、その顆粒混合物を錠剤又は糖衣錠コアが得られように加工し得る。好適な賦形剤は、特に、充填剤（例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、又はソルビトールを含む糖）；セルロース調製物（例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガガントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及びカルボキシメチルセルロースナトリウム（sodium carbomethylcellulose）など）；及び／又は生理学的に受容可能なポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ））である。所望される場合は、崩壊剤（例えば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、又はアルギン酸もしくはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウム））が添加され得る。
糖衣錠コアには、好適な被膜が与えられる。この目的のためには、濃厚な糖溶液が使用され得、これは、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液、及び好適な有機溶媒又は溶媒混合物を、任意選択で含有し得る。染料又は顔料が、識別のため、又は活性化合物用量の異なる組み合わせを特徴付けるために、錠剤又は糖衣錠被膜に添加され得る。
経口により使用され得る薬学的組成物には、ゼラチンでできた押込嵌めカプセルに加えて、ゼラチンと可塑剤（例えば、グリセロール又はソルビトール）とでできた軟質密封カプセルも含まれる。押込嵌めカプセルは、有効成分を、充填剤（例えば、ラクトース）、結合剤（例えば、デンプン）、滑沢剤（例えば、タルク又はステアリン酸マグネシウム）、及び任意選択で安定剤と混合して含有し得る。軟質カプセルにおいては、有効成分は、好適な液体（例えば、脂肪油、流動パラフィン、又は液体ポリエチレングリコール）中に溶解又は懸濁され得る。さらに、安定剤が添加され得る。経口投与のための全ての製剤は、その選択された投与経路に適した投与量であるべきである。
口腔粘膜投与のためには、組成物は、従来のやり方で製剤化された錠剤又はロゼンジの形態を取り得る。
吸入による投与のためには、本発明に従う使用のための有効成分は、好適なプロペラント（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、又は二酸化炭素）を使った加圧パック又はネブライザからのエアロゾルスプレー表出の形態で、好都合に送達される。加圧エアロゾルの場合においては、投与量は、計量された量を送り出す弁を設けることによって定められ得る。ディスペンサーにおける使用のための例えばゼラチンのカプセル及びカートリッジが、化合物と好適な粉末基剤（例えば、ラクトース又はデンプン）との粉末混合物を含有して製剤化され得る。
本明細書に記載される薬学的組成物は、例えばボーラス注射又は持続注入による、腸管外投与用に製剤化され得る。注射用製剤は、単位剤形として（例えば、アンプル剤として）、又は保存剤を任意選択で添加した複数回分の服用量を含む容器に入れて提供され得る。組成物は、油性又は水性のビヒクル中の懸濁液、溶液、又は乳濁液であり得、且つ製剤化剤（formulatory agent）（例えば、懸濁化剤、安定剤、及び／又は分散剤）を含有し得る。
腸管外投与用の薬学的組成物には、水溶性形態の活性調製物の水溶液が含まれる。さらに、有効成分の懸濁液が、適切な油性又は水性の注射懸濁液として調製され得る。好適な親油性の溶媒又はビヒクルとしては、脂肪油（例えば、ゴマ油）、又は合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチル、トリグリセリド）、又はリポソームが挙げられる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を高める物質（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、又はデキストラン）を含有し得る。任意選択で、懸濁液はまた、高濃度溶液の調製を可能にするために、好適な安定剤、又は有効成分の溶解性を増大する薬剤も含有し得る。
あるいは、有効成分は、使用前に好適なビヒクル（例えば、滅菌された、発熱物質を含まない、水性溶液）を用いて構成するための粉末形態であり得る。
徐放性（sustained-release：ＳＲ）、長期放出性（extended-release：ＥＲ、ＸＲ、又はＸＬ）、時限放出性（time-release又はtimed-release）、制御放出性（controlled-release：ＣＲ）、又は持続放出性（continuous-release：ＣＲ又はＣｏｎｔｉｎ）錠剤は、ゆっくり溶解して経時的に薬物を放出するように製剤化された錠剤又はカプセル剤である。徐放性錠剤は、有効成分が不溶性物質（例えば、アクリル樹脂、多糖など）のマトリックス中に包埋されるように製剤化され、その結果、溶解した薬物がマトリックス中の孔を通って外に拡散することになる。一部のＳＲ製剤において、マトリックスは、物理的に膨張してゲルを形成するものであり、したがって、薬物はまずマトリックスに溶解し、次いでその外表面を通って出て行く必要がある。
制御放出と徐放との相違は、制御放出が完全にゼロ次放出である、すなわち、薬物が濃度に関係なく経時的に放出されるということである。これに対して、徐放は、ある時間にわたる薬物のゆっくりとした放出を含意する。これは、制御放出であってもよいし、制御放出でなくてもよい。
本発明の文脈における使用に好適な薬学的組成物としては、意図される目的を達成するのに有効な量で有効成分が含まれている組成物が挙げられる。より具体的には、「治療有効量」は、障害の症状を予防、軽減、もしくは改善するのに、又は処置される被験体の生存を引き延ばすのに有効な有効成分量を意味する。
治療有効量の決定は、とりわけ本明細書において提供される詳細な開示を踏まえれば、十分に当業者の能力の範囲内にある。
本発明の方法において使用されるいかなる調製物についても、投与量又は治療有効量は、インビトロアッセイ及び細胞培養アッセイから最初に推定され得る。例えば、所望の濃度又は力価を達成するように動物モデルにおいて用量が策定され得る。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。
本明細書に記載される有効成分の毒性及び治療有効性は、インビトロ、細胞培養物又は実験動物において、標準的な薬学的手順により決定され得る。これらのインビトロ及び細胞培養アッセイ並びに動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投与量範囲を策定する際に使用され得る。投与量は、使用される剤形及び利用される投与経路によって変わり得る。正確な処方、投与経路、及び投与量は、個々の医師によって、患者の状態を考慮して選択され得る。（例えば、Fingl,E.他(1975),「The Pharmacological Basis of Therapeutics」Ch.1,p.1を参照されたい。）
投与量及び投与間隔は、生物学的効果を誘導又は抑制するのに十分な、有効成分の血漿レベル又は脳レベル（すなわち、最小有効濃度、ＭＥＣ）を提供するように個々に調整され得る。ＭＥＣは、調製物ごとに異なるものであるが、インビトロデータから推定され得る。ＭＥＣを達成するのに必要な投与量は、個々の特性及び投与経路によって決まるものである。検出アッセイが、血漿濃度を決定するために使用され得る。
処置されるべき状態の重症度及び応答性に応じて、投薬は、単回投与又は複数回投与のものであり得、処置期間は、数日〜数週間又は治癒がもたらされるかもしくは病状の軽減が達成されるまで続き得る。
投与されるべき組成物の量は、当然、処置される被験体、病気の重症度、投与様式、処方する医師の判断などによって決まることになる。
本発明の組成物は、所望される場合は、有効成分を含有する１つ以上の単位剤形を含有し得る、パック又はディスペンサーデバイス（例えば、ＦＤＡ承認キット）に入れて提供され得る。パックは、例えば、金属又はプラスチック箔を含み得る（例えば、ブリスターパック）。パック又はディスペンサーデバイスは、投与のための説明書を添付し得る。パック又はディスペンサーデバイスは、医薬の製造、使用、又は販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知も伴い得、この通知は、当該組成物の、ヒト投与又は獣医学的投与のための形態についての当該機関による承認を反映したものとなる。そのような通知には、例えば、処方薬についての米国食品医薬品局により承認されたラベル表示か、又は承認された製品インサートのものが含まれ得る。上でさらに詳述したように、薬学的に受容可能なキャリア中で製剤化された本発明の調製物を含む組成物もまた調製され、適切な容器に入れられ、適応状態の処置についてラベル表示され得る。
被験体に投与されると、足場は、生物学的流体を「濾過」し、活性部分が、標的化されている様式又は標的化されていない様式で、足場内においてエンティティを捕捉又は処理することになる。明らかに、必ずしも生物学的流体中に存在する全ての成分が足場の細孔を通過するわけではなく、例えば、赤血球は、細孔を通るには大きすぎ、したがって、足場の細孔を通過しない。
インビボで利用される場合、本発明の複合体は、例えば食細胞により又は腎臓を通して、自然に被験体から一掃されることになる。身体からのクリアランスは、本発明の複合体が免疫原性を最小限に抑えるように構成される場合においては、恐らく緩慢になるであろう。
本発明の複合体はまた、身体脈管内に配置可能なデバイスの一部を構成し得る。例えば、複合体は、容器（例えば、バイオカプセル（例えば、Theracyte（登録商標）免疫隔離デバイス））中に組み込まれ得る。バイオカプセルの更なる説明については、米国特許出願公開第２０１０／００２８３９８号、又は米国特許出願公開第２０１１／００９２９４９号を参照されたい。
そのようなカプセルは、濾過デバイスとして構成され得、且つ主要血管又は器官に入れられ（固定され）得るであろう。これは、特定の器官（例えば、脾臓、肝臓、心臓、腎臓、リンパ節など）に移植された又は埋め込まれたフィルタのような機能を果たし得る。さらに、容器は、生物学的流体（例えば、胃腸流体又は血液循環）中をよどみなく流れ（free flowing）得る。
本発明の複合体は、ウイルスを捕獲するための部分をさらに含み得る。そのような部分は、本明細書において上で定義したようなウイルス特異的受容体、抗体、リガンド、受容体などであり得る。先に述べたように、ウイルス特異的であるように機能する受容体の非網羅的なリストには、ＣＤ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、テトラスパニンＣＤ８１、ヒトスカベンジャー受容体ＳＲ−ＢＩ、クローディン−１、オクルディン、エフリン−Ｂ２、ＣＤ４６、ＣＡＲ、ａｖインテグリン、ＨＡＶＣＲ−１、ＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体）、ＳＬＡＭ、アセチルコリン受容体、ニューロトロフィン受容体、ｐ７５ ＮＴＲ、シアル酸、グリコサミノグリカン及びヘパラン硫酸が含まれる。
本発明の複合体は、微生物を捕獲するための部分をさらに含み得る。そのような部分は、寄生微生物により組み込まれる宿主特異的部分（例えば、タンパク質、炭水化物、脂質、抗体、リガンド、受容体など）であり得る。寄生微生物によって組み込まれる宿主特異的部分として機能するタンパク質の非網羅的なリストには、アネキシン（例えば、アネキシンＡ１、アネキシンＡ２、アネキシンＡ４、アネキシンＡ５、アネキシンＡ１１）、テトラスパニン（例えば、ＣＤ８１、ＣＤ９）、ＣＤ５９、サイクロフィリン、βチューブリン、コフィリン１、エノラーゼ１、脂肪酸シンターゼ、γ−グルタミルトランスフェラーゼ１、グリピカン４、ホスホグリセリン酸キナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ１１、トポミオシン（topomyosin）１、トランスゲリン（transgelin）が含まれ得る。
本発明の複合体はまた、生物学的試料から病原体又は物質を除去するためにも使用され得る。例えば、（緩衝液中に懸濁した）血液試料又は組織試料が、本発明の複合体を含有するデバイスに通され得る。病原体又は物質は、複合体によって「濾過」され、そして活性部分により捕捉され、不活性化されることになる。
上に述べたように、本発明の複合体はまた、物質（例えば、不純物、毒素など）を除去して非生物学的流体を清浄にするためにも使用され得る。そのような流体は、あらゆる供給源の水、飲料、液体培養培地、汚水、血液試料、液体廃棄物などであり得る。
本明細書で使用される場合、用語「不純物」は、懸濁粒子、寄生生物、細菌、藻、ウイルス、真菌、古細菌、原生生物、有機堆積物、金属、核酸、小分子、プリオン、プロト細胞、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、毒素、毒液、薬物、毒、アレルゲン、又は汚染物質をいう。
エキソビボで、特に非生物系において適用される場合、本発明の複合体は、任意選択で、遠心分離によって、沈殿によって、クロマトグラフィーを用いて、磁力により引きつけられて、電気泳動により分離されてなどして一掃され得る。磁気分離を促進するために、足場は、Yabin他[European Polymer Journal Volume 43,Issue 3,March 2007,Pages 767-772]又はLiua他[Journal of Colloid and Interface Science,Volume 375,Issue 1,1 June 2012,Pages 70-77]により記載されたアプローチを用いて改変され得る。
したがって、本発明の複合体は、例えばＦＡＣＳ、磁気選別機などによる、液体からの複合体の精製を可能にするために、タグ（例えば、磁気タグ、蛍光タグ又は発光タグ）をさらに含み得る。
本発明の複合体は（バイアル中の）粉末又は懸濁液として提供される複合体と、複合体を投与するための付属の試薬（例えば、緩衝液など）と、投与デバイス（例えば、注射器）と、使用説明書とを含むキットとして包装され得る。
ＨＩＶ又はインフルエンザに感染したヒト被験体を処置するための例示的プロトコルが、以下に提供される。
抗ＨＩＶ複合体によるＨＩＶ感染被験体の処置
ＤＮＡ折り紙を用いて直径１μｍの中空のミクロスフィア形状の足場を構築することにより、抗ＨＩＶ複合体を生成する（更なる詳細については実施例の項を参照されたい）。ＤＮＡミクロスフィアの外面は、３００ｎｍの細孔を有し且つＰＥＧ化されており、ＣＤ４受容体及びＣＣＲ５受容体を有する５００ｎｍ（直径）のリポソームが、そのミクロスフィア内に捕捉されている。このリポソームは、抗体を介して核酸足場に結合されている。
ＤＮＡ折り紙を用いて直径１μｍの中空のミクロスフィア形状の足場を構築することにより、抗ＨＩＶ複合体を生成する（更なる詳細については実施例の項を参照されたい）。ＤＮＡミクロスフィアの外面は、３００ｎｍの細孔を有し且つＰＥＧ化されており、ＣＤ４受容体及びＣＣＲ５受容体を有する５００ｎｍ（直径）のリポソームが、そのミクロスフィア内に捕捉されている。このリポソームは、抗体を介して核酸足場に結合されている。
処置プロトコル：
生理食塩水キャリア中に２５，０００，０００単位の抗ＨＩＶ複合体を含有する用量を、緩徐点滴注入（ＩＶ）によって患者に送達し、ウイルス負荷量に基づき用量を繰り返すか又は調整する。
生理食塩水キャリア中に２５，０００，０００単位の抗ＨＩＶ複合体を含有する用量を、緩徐点滴注入（ＩＶ）によって患者に送達し、ウイルス負荷量に基づき用量を繰り返すか又は調整する。
インフルエンザ感染被験体の処置
ポリスチレン、結晶シリコン、ＰＬＧＡ又はキトサンから形成された足場内にシアル酸分子の抗ウイルスデンドリマーを構築することにより、抗インフルエンザ複合体を生成する。足場は、各面に４００ｎｍの細孔を有し且つＰＥＧ化されている。
ポリスチレン、結晶シリコン、ＰＬＧＡ又はキトサンから形成された足場内にシアル酸分子の抗ウイルスデンドリマーを構築することにより、抗インフルエンザ複合体を生成する。足場は、各面に４００ｎｍの細孔を有し且つＰＥＧ化されている。
処置プロトコル：
１ｍＬ用量当たり１０，０００，０００個のトラップ単位を含む鼻内噴霧薬が、感染の予防薬として、又は感染の処置のために使用される。
１ｍＬ用量当たり１０，０００，０００個のトラップ単位を含む鼻内噴霧薬が、感染の予防薬として、又は感染の処置のために使用される。
本発明のアプローチが、植物及び他の多細胞生物の病原体感染を処置するためにも使用され得るということが理解されるであろう。例えば、ウイルストラップは、樹木中に（樹幹注入により）直接注入されて、樹木全体にわたって全身的に分布し得る。注入は、樹木の根元１８インチのところにおいて、およそ６インチずつ間隔をあけて行われる。注入の深さは、樹木中５／８インチ〜１ ５／８インチの間までである。１０インチ直径の樹木であれば、およそ１．５オンスの注入を受けることになるであろう。
本明細書で使用される場合、用語「約」は、±１０％をいう。
本発明の更なる目的、利点、及び新規の特徴は、以下の実施例を検討することにより、当業者に明らかになるであろう。これらの実施例は、限定することが意図されるものではない。さらに、上に詳細が説明された、そして以下の特許請求の範囲の項に記載される本発明の種々の実施形態及び態様の各々は、以下の実施例において実験による裏付けを得る。
次に以下の実施例を参照する。これらの実施例は、上記の記載と共に、本発明を非限定的に説明するものである。
実施例１
ポリスチレンミクロスフィアトラップ
ポリスチレン（ＰＳ）ミクロスフィアの集団を生成し、粒度分布及び細孔径範囲に関して定性化した。
ポリスチレンミクロスフィアトラップ
ポリスチレン（ＰＳ）ミクロスフィアの集団を生成し、粒度分布及び細孔径範囲に関して定性化した。
材料及び方法
非多孔質ミクロスフィア
５００ｍＬ三つ口丸底フラスコを使用して、３．７５ｇのポリビニルピロリドンを、１５０ｍＬのエタノールと６２．５ｍＬのメトキシ−エタノールとの混合物に溶解させた。このフラスコに、冷却器及びメカニカルスターラーを取り付けた。この系に窒素を通気させながら、混合物の温度を油浴によって７３℃までゆっくりと上昇させた。
非多孔質ミクロスフィア
５００ｍＬ三つ口丸底フラスコを使用して、３．７５ｇのポリビニルピロリドンを、１５０ｍＬのエタノールと６２．５ｍＬのメトキシ−エタノールとの混合物に溶解させた。このフラスコに、冷却器及びメカニカルスターラーを取り付けた。この系に窒素を通気させながら、混合物の温度を油浴によって７３℃までゆっくりと上昇させた。
別途、１００ｍＬ丸底フラスコを使用して、１．５ｇの過酸化ベンジルを３７．５ｍＬのスチレンに溶解させ、結果として生じた溶液を、マグネチックスターラーによって窒素下で撹拌した。温度を安定させた後、この１００ｍＬフラスコの内容物を上記の５００ｍＬ三つ口丸底フラスコに注入し、反応物を一晩放置した。
洗浄の前に、ミクロスフィアを光学顕微鏡下で可視化して、その大きさ及び相同性（homogeny）を評価した。
この反応混合物を、１２個の５０ｍＬバイアル中に均等に分配し、エタノールで６回洗浄してスチレン残基を除去し、続いて水中５０％エタノールで１回洗浄し、水で２回洗浄した。洗浄は、バイアルを遠心分離機中で５５００ｒｐｍにて８分間回転させ、上清をゆっくりと注ぎ出すことにより行った。洗浄に続いて、試料を一晩凍結乾燥した。
多孔質ミクロスフィア
Omer-Mizrahi及びMargel[Polymer Volume 51,Issue 6,2010,Pages 1222-1230]により記載された手順を改変することにより、多孔質ミクロスフィアを調製した。手短に言えば、１グラムの凍結乾燥ＰＳミクロスフィアを５０ｍＬの水及び１ｍＬのエタノールに懸濁させた。次いで、この懸濁液を、８分間超音波処理し（３５％振幅）、続いてマグネチックスターラーを取り付けた１００ｍＬ丸底フラスコ中で、２０分間オゾン分解した。
Omer-Mizrahi及びMargel[Polymer Volume 51,Issue 6,2010,Pages 1222-1230]により記載された手順を改変することにより、多孔質ミクロスフィアを調製した。手短に言えば、１グラムの凍結乾燥ＰＳミクロスフィアを５０ｍＬの水及び１ｍＬのエタノールに懸濁させた。次いで、この懸濁液を、８分間超音波処理し（３５％振幅）、続いてマグネチックスターラーを取り付けた１００ｍＬ丸底フラスコ中で、２０分間オゾン分解した。
結果として生じた試料を、ヨウ化ナトリウムを添加した時の色の変化によって判定した場合にオゾンが上清中に残らなくなるまで、水で洗浄した（８分間５５００ｒｐｍ）。
洗浄した試料ペレットを、９ｍＬの水に懸濁させ、９個の２０ｍＬシンチレーションバイアル中に均等に分配した。各バイアルは、約１００ｍｇのＰＳに相当する１ｍＬの水を含有した。７ｍＬの１．４３％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を添加し、続いてメタクリル酸グリシジル（ＧＭＡ）を、様々な量（０．１ｍＬ×２、０．２ｍＬ×２、０．２５ｍＬ、０．３ｍＬ×２、０．３５ｍＬ×２）で添加した。１４ｍｇの亜硫酸水素ナトリウムの添加に続いて、各バイアルを、室温にて一晩撹拌した。次いで、試料を、水中３０％エタノールで２回、エタノールで２回、そして２０％エタノールで１回洗浄した。洗浄は、各回とも、５５００ｒｐｍにて８分間実施した。
結果
非多孔質ミクロスフィア
光学顕微鏡下で可視化すると、このポリスチレンミクロスフィア集団は均一であるように見え、ミクロスフィアの直径は、２．１〜２．２μｍの間の範囲であった（図４（ａ））。走査電子顕微鏡下で可視化した場合、ほとんどのミクロスフィアが、乾燥時には直径が約１．７μｍであり、水和時には２．２μｍであった（図４（ｂ）〜（ｃ））。
非多孔質ミクロスフィア
光学顕微鏡下で可視化すると、このポリスチレンミクロスフィア集団は均一であるように見え、ミクロスフィアの直径は、２．１〜２．２μｍの間の範囲であった（図４（ａ））。走査電子顕微鏡下で可視化した場合、ほとんどのミクロスフィアが、乾燥時には直径が約１．７μｍであり、水和時には２．２μｍであった（図４（ｂ）〜（ｃ））。
多孔質ミクロスフィア
ＧＭＡとの反応により、均一な集団の多孔質ミクロスフィアが生成された。この多孔質ミクロスフィアは、細孔形成（poration）の結果として大きさが大きくなって、直径が３．５〜４．１μｍの間の範囲になり、細孔直径は０．３〜１．０μｍの間の範囲になった（図５（ｃ）〜（ｆ））。ＧＭＡの量が少ないとき（０．５ｍＬ）は、ミクロスフィアに対する効果はなく、ＧＭＡ量を０．５ｍＬから１．５ｍＬに増加させると、均一な集団の中空半球及び分解したビーズが生成された。オゾン分解時間を４０分まで増加させても、同様な結果が生じた。
ＧＭＡとの反応により、均一な集団の多孔質ミクロスフィアが生成された。この多孔質ミクロスフィアは、細孔形成（poration）の結果として大きさが大きくなって、直径が３．５〜４．１μｍの間の範囲になり、細孔直径は０．３〜１．０μｍの間の範囲になった（図５（ｃ）〜（ｆ））。ＧＭＡの量が少ないとき（０．５ｍＬ）は、ミクロスフィアに対する効果はなく、ＧＭＡ量を０．５ｍＬから１．５ｍＬに増加させると、均一な集団の中空半球及び分解したビーズが生成された。オゾン分解時間を４０分まで増加させても、同様な結果が生じた。
考察
本明細書に記載される方法論により、均一な集団のポリスチレンミクロスフィアが生成された。オゾン分解とＧＭＡ重合とを合わせたアプローチを用いた細孔生成は、直径が５０〜２５０ｎｍの間の範囲であるバキュロウイルスに対するトラップとしてのミクロスフィアの使用を可能にするであろう狭い細孔直径範囲を結果としてもたらした。
本明細書に記載される方法論により、均一な集団のポリスチレンミクロスフィアが生成された。オゾン分解とＧＭＡ重合とを合わせたアプローチを用いた細孔生成は、直径が５０〜２５０ｎｍの間の範囲であるバキュロウイルスに対するトラップとしてのミクロスフィアの使用を可能にするであろう狭い細孔直径範囲を結果としてもたらした。
実施例２
ポリスチレンナノスフィアキャリア
ポリスチレン（ＰＳ）ナノスフィアの集団を生成し、粒度分布及び細孔径範囲に関して定性化した。
ポリスチレンナノスフィアキャリア
ポリスチレン（ＰＳ）ナノスフィアの集団を生成し、粒度分布及び細孔径範囲に関して定性化した。
材料及び方法
６００ｎｍポリスチレンビーズ
方法論は、Goodwin他[COLLOID & POLYMER SCIENCE Volume 252,Number 6(1974),464-471]を適合させた。手短に言えば、１ｍＬのスチレンを、８．５ｍＬの２．５×１０−３Ｍ塩化ナトリウム溶液に添加し、続いて０．５ｍＬの０．０５Ｍ過硫酸カリウム溶液を添加した。結果として生じた混合物を、２０ｍＬシンチレーションバイアル中で７３℃にて一晩撹拌し、続いて水で２回、エタノールで２回、そして水で２回洗浄した。洗浄は、バイアルを遠心分離機中で回転させ（１２分間１００００ｒｐｍ）、上清をゆっくりと注ぎ出すことにより行った。
６００ｎｍポリスチレンビーズ
方法論は、Goodwin他[COLLOID & POLYMER SCIENCE Volume 252,Number 6(1974),464-471]を適合させた。手短に言えば、１ｍＬのスチレンを、８．５ｍＬの２．５×１０−３Ｍ塩化ナトリウム溶液に添加し、続いて０．５ｍＬの０．０５Ｍ過硫酸カリウム溶液を添加した。結果として生じた混合物を、２０ｍＬシンチレーションバイアル中で７３℃にて一晩撹拌し、続いて水で２回、エタノールで２回、そして水で２回洗浄した。洗浄は、バイアルを遠心分離機中で回転させ（１２分間１００００ｒｐｍ）、上清をゆっくりと注ぎ出すことにより行った。
２５０ｎｍポリスチレンビーズ
２０ｍＬシンチレーションバイアル中で、５ｍＬの１×１０−３Ｍドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を、５ｍＬの７．１×１０−３Ｍ ４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）と混合した。ＮａＯＨでｐＨを７．８に調整し、０．７５ｍＬのスチレンを添加し、続いて７３℃にて一晩撹拌した。試料を、遠心分離機で回転させ（２０分間１１０００ｒｐｍ）、上清をゆっくりと注ぎ出すことにより洗浄した。
２０ｍＬシンチレーションバイアル中で、５ｍＬの１×１０−３Ｍドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を、５ｍＬの７．１×１０−３Ｍ ４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）と混合した。ＮａＯＨでｐＨを７．８に調整し、０．７５ｍＬのスチレンを添加し、続いて７３℃にて一晩撹拌した。試料を、遠心分離機で回転させ（２０分間１１０００ｒｐｍ）、上清をゆっくりと注ぎ出すことにより洗浄した。
結果
６００ｎｍポリスチレンビーズ
動的光散乱（ＤＬＳ／Ｎａｎｏｐｈｏｘ）を用いてポリスチレンビーズを大きさについて分析すると、結果として得られた直径は、５９１±７７ｎｍであった。
６００ｎｍポリスチレンビーズ
動的光散乱（ＤＬＳ／Ｎａｎｏｐｈｏｘ）を用いてポリスチレンビーズを大きさについて分析すると、結果として得られた直径は、５９１±７７ｎｍであった。
２５０ｎｍポリスチレンビーズ
動的光散乱（ＤＬＳ／Ｎａｎｏｐｈｏｘ）を用いてポリスチレンビーズを大きさについて分析すると、結果として得られた直径は、２３１±３１ｎｍであった。スチレン量を０．３ｍＬまで減少させても、同じ大きさのビーズが生成された。
動的光散乱（ＤＬＳ／Ｎａｎｏｐｈｏｘ）を用いてポリスチレンビーズを大きさについて分析すると、結果として得られた直径は、２３１±３１ｎｍであった。スチレン量を０．３ｍＬまで減少させても、同じ大きさのビーズが生成された。
考察
５９０ｎｍ又は２３０ｎｍの平均直径を有するナノスフィアの２つの集団を生成した。両集団は、３００ｎｍ〜１０００ｎｍの間の範囲の細孔直径を有する実施例１に記載した４ミクロンのポリスチレンミクロスフィア内へ拡散することが可能である。活性薬剤（例えば、ウイルス結合性部分など）でナノスフィアを被覆し、そのナノスフィアをミクロスフィア内に隔離することにより、免疫免除されている（immuno-privileged）抗ウイルストラップを生成し得る。
５９０ｎｍ又は２３０ｎｍの平均直径を有するナノスフィアの２つの集団を生成した。両集団は、３００ｎｍ〜１０００ｎｍの間の範囲の細孔直径を有する実施例１に記載した４ミクロンのポリスチレンミクロスフィア内へ拡散することが可能である。活性薬剤（例えば、ウイルス結合性部分など）でナノスフィアを被覆し、そのナノスフィアをミクロスフィア内に隔離することにより、免疫免除されている（immuno-privileged）抗ウイルストラップを生成し得る。
ポリスチレン多孔質ミクロスフィアは、体内免疫系に対して不活性なトラップの外面を構成し、一方、ミクロスフィアの内部に捕捉された被覆ナノスフィアは、免疫系から遮られており、ミクロスフィアの細孔を通ってトラップに入るウイルスを結合して固定化することが可能である。
実施例３
バキュロウイルスインビトロ実験
Ｓｆ９培養系を利用して、バキュロウイルスビリオンを結合及び／又は不活性化することが可能な種々の表面活性薬剤で被覆した４μｍポリスチレン微粒子の有効性を試験した。
バキュロウイルスインビトロ実験
Ｓｆ９培養系を利用して、バキュロウイルスビリオンを結合及び／又は不活性化することが可能な種々の表面活性薬剤で被覆した４μｍポリスチレン微粒子の有効性を試験した。
材料及び方法
トラップ
Cremophore、ポリリジン、アンホテリシン、Tween、Triton 100-X、カテプシン、サーファクタントプロテインＤ又は抗ｇｐ６４（バキュロウイルスエンベロープタンパク質に向けられた特異的抗体）を多孔質ポリスチレンミクロスフィア上に結合させて、それによりウイルストラップを生成するために、ビオチン−ストレプトアビジン結合を用いた。
トラップ
Cremophore、ポリリジン、アンホテリシン、Tween、Triton 100-X、カテプシン、サーファクタントプロテインＤ又は抗ｇｐ６４（バキュロウイルスエンベロープタンパク質に向けられた特異的抗体）を多孔質ポリスチレンミクロスフィア上に結合させて、それによりウイルストラップを生成するために、ビオチン−ストレプトアビジン結合を用いた。
適切な結合を確認するためのコントロールとして、ローダミンＢを使用した。ウシ血清アルブミン（Bovine Serum Albomine：ＢＳＡ）及び抗ＩＬ１３を、ネガティブコントロールとして使用した。というのは、これらはウイルス感染を妨げるとは考えられないからである。
活性薬剤へのビオチンの結合
Thermo ScientificのEZ-link TFPA-PEG3-Biotinキット（製品番号２１３０３、Ｍｗ＝６６４ｇ／ｍｏｌ）を、共有結合のために使用した。ＴＦＰＡ−ビオチン試薬は、ＵＶ光によって活性化され、活性薬剤化合物中に存在するＣ−Ｈ結合へのビオチンの結合を促進する。各活性薬剤を、１．５１×１０−４ｍｍｏｌに相当する０．１ｍｇのビオチン試薬と共にインキュベートした。キットプロトコルで特定されているように、１０：１のビオチン試薬：活性薬剤のモル比がビオチン化に最適である。したがって、１．５１×１０−５の各活性薬剤を、ビオチン結合に使用した。
Thermo ScientificのEZ-link TFPA-PEG3-Biotinキット（製品番号２１３０３、Ｍｗ＝６６４ｇ／ｍｏｌ）を、共有結合のために使用した。ＴＦＰＡ−ビオチン試薬は、ＵＶ光によって活性化され、活性薬剤化合物中に存在するＣ−Ｈ結合へのビオチンの結合を促進する。各活性薬剤を、１．５１×１０−４ｍｍｏｌに相当する０．１ｍｇのビオチン試薬と共にインキュベートした。キットプロトコルで特定されているように、１０：１のビオチン試薬：活性薬剤のモル比がビオチン化に最適である。したがって、１．５１×１０−５の各活性薬剤を、ビオチン結合に使用した。
以下の量の各活性薬剤を、この反応において使用した。
・０．３４ｍｇのポリリジン：平均Ｍｗ＝２２，５００ｇ／ｍｏｌ。
・０．０１４ｍｇのアンホテリシン：Ｍｗ＝９２４ｇ／ｍｏｌ。
・０．０１８５ｍｇのTween：Ｍｗ＝１２２７．５ｇ／ｍｏｌ（密度は１ｇ／ｍＬと想定される）。
・９．８μｇのTriton 100-X：Ｍｗ＝６４７ｇ／ｍｏｌ（密度は１ｇ／ｍＬと想定される）。
・２μｇのカテプシン：Ｍｗ＝２８，９００ｇ／ｍｏｌ−６．９×１０−５μｍｏｌに相当。ビオチン試薬：活性薬剤の比を１０：１で一定に保つために、０．４６μｇのビオチン試薬を使用した。
・０．０４５ｍｇのCremophore：平均Ｍｗ＝３０００ｇ／ｍｏｌ（密度は１ｇ／ｍＬと想定される）。
・０．０４５ｍｇのサーファクタントプロテインＤ：Ｍｗ＝６５，０００ｇ／ｍｏｌ−３．１×１０−５μｍｏｌに相当。ビオチン試薬：活性薬剤の比を１０：１で一定に保つために、０．２１μｇのビオチン試薬を使用した。
・７．２μｇのローダミンＢ：Ｍｗ＝４７９ｇ／ｍｏｌ。
・０．３４ｍｇのポリリジン：平均Ｍｗ＝２２，５００ｇ／ｍｏｌ。
・０．０１４ｍｇのアンホテリシン：Ｍｗ＝９２４ｇ／ｍｏｌ。
・０．０１８５ｍｇのTween：Ｍｗ＝１２２７．５ｇ／ｍｏｌ（密度は１ｇ／ｍＬと想定される）。
・９．８μｇのTriton 100-X：Ｍｗ＝６４７ｇ／ｍｏｌ（密度は１ｇ／ｍＬと想定される）。
・２μｇのカテプシン：Ｍｗ＝２８，９００ｇ／ｍｏｌ−６．９×１０−５μｍｏｌに相当。ビオチン試薬：活性薬剤の比を１０：１で一定に保つために、０．４６μｇのビオチン試薬を使用した。
・０．０４５ｍｇのCremophore：平均Ｍｗ＝３０００ｇ／ｍｏｌ（密度は１ｇ／ｍＬと想定される）。
・０．０４５ｍｇのサーファクタントプロテインＤ：Ｍｗ＝６５，０００ｇ／ｍｏｌ−３．１×１０−５μｍｏｌに相当。ビオチン試薬：活性薬剤の比を１０：１で一定に保つために、０．２１μｇのビオチン試薬を使用した。
・７．２μｇのローダミンＢ：Ｍｗ＝４７９ｇ／ｍｏｌ。
ＴＦＰＡ−ビオチン試薬を、活性薬剤と、最終体積が１５０μＬになるようにＰＢＳ中で混合し、２分間暗所でインキュベートし、それに続いて溶液を、３６５ｎｍＵＶランプ（２３０Ｖ、０．１７Ａｍｐ、３９Ｗ）から５ｃｍ下のところで１０分間インキュベートした。コントロール薬剤は、Thermo ScientificのEZ-link sulfo-NHS-Biotinキット（製品番号２１２１７、Ｍｗ＝４５４．５ｇ／ｍｏｌ）を介してビオチンに共有結合された。この試薬は、あらゆる第一級アミン含有分子と迅速に反応して、安定なアミド結合を介してビオチン標識を結合させる。キットのプロトコルで特定されているように、１０：１のビオチン試薬：活性薬剤のモル比がビオチン結合に最適である。
以下の量の各コントロール薬剤を、この反応において使用した。
・０．００３ｇのウシ血清アルブミン：Ｍｗ＝６６，５００ｇ／ｍｏｌ。Ｎ＝０．５μｍｏｌ。２．３ｍｇのビオチン試薬を使用した。
・１０μｇの抗ｇｐ６４抗体：Ｍｗ＝１５０，０００ｇ／ｍｏｌ。Ｎ＝６．６７×１０−５μｍｏｌ。０．３μｇのビオチン試薬を使用した。
・１０μｇの抗ＩＬ１３抗体：Ｍｗ＝１５０，０００ｇ／ｍｏｌ。Ｎ＝６．６７×１０−５μｍｏｌ。０．３μｇのビオチン試薬を使用した。
・０．００３ｇのウシ血清アルブミン：Ｍｗ＝６６，５００ｇ／ｍｏｌ。Ｎ＝０．５μｍｏｌ。２．３ｍｇのビオチン試薬を使用した。
・１０μｇの抗ｇｐ６４抗体：Ｍｗ＝１５０，０００ｇ／ｍｏｌ。Ｎ＝６．６７×１０−５μｍｏｌ。０．３μｇのビオチン試薬を使用した。
・１０μｇの抗ＩＬ１３抗体：Ｍｗ＝１５０，０００ｇ／ｍｏｌ。Ｎ＝６．６７×１０−５μｍｏｌ。０．３μｇのビオチン試薬を使用した。
多孔質ＰＳミクロスフィアのアロフィコシアニン−ストレプトアビジン（ＡＰＣ−アビジン）被覆
総数５０００万個の多孔質ポリスチレンミクロスフィアを、アビジン被覆に使用した。ビーズを、炭酸塩／炭酸水素塩ｐＨ＝９．６の５０ｍＭ緩衝液で３回洗浄し、３．３３×１０−４μｍｏｌに相当する２０μｇのＡＰＣ−アビジン（Ｍｗ＝６０，０００ｇ／ｍｏｌ、製品番号４０５２０７、BioLegend）と共に、５００μＬの炭酸塩／炭酸水素塩緩衝液中で、室温にて３０分間、振盪機を用いてインキュベートした。次いで、ビーズをＰＢＳで３回洗浄した。Accuri C6フローサイトメーターによってビーズの濃度を測定し、４００万個のビーズからなるアリコートを調製した。
総数５０００万個の多孔質ポリスチレンミクロスフィアを、アビジン被覆に使用した。ビーズを、炭酸塩／炭酸水素塩ｐＨ＝９．６の５０ｍＭ緩衝液で３回洗浄し、３．３３×１０−４μｍｏｌに相当する２０μｇのＡＰＣ−アビジン（Ｍｗ＝６０，０００ｇ／ｍｏｌ、製品番号４０５２０７、BioLegend）と共に、５００μＬの炭酸塩／炭酸水素塩緩衝液中で、室温にて３０分間、振盪機を用いてインキュベートした。次いで、ビーズをＰＢＳで３回洗浄した。Accuri C6フローサイトメーターによってビーズの濃度を測定し、４００万個のビーズからなるアリコートを調製した。
ＡＰＣ−アビジン被覆多孔質ポリスチレンミクロスフィアへのビオチン化活性薬剤の結合
ＡＰＣ−アビジン被覆多孔質ポリスチレンミクロスフィアの各アリコートを、活性薬剤ビオチン化反応混合物と混合し、室温にて３０分間、振盪機を用いてインキュベートした。続いて、各アリコートを、ＰＢＳで４回洗浄した。ビーズ濃度を、Accuri C6フローサイトメーターを用いて測定した。
ＡＰＣ−アビジン被覆多孔質ポリスチレンミクロスフィアの各アリコートを、活性薬剤ビオチン化反応混合物と混合し、室温にて３０分間、振盪機を用いてインキュベートした。続いて、各アリコートを、ＰＢＳで４回洗浄した。ビーズ濃度を、Accuri C6フローサイトメーターを用いて測定した。
結果
多孔質ポリスチレンミクロスフィアのフローサイトメトリー読み値（Accuri C6）を、図６（ａ）〜（ｂ）に示す。ＦＬ２−Ａの読み値（図６（ａ））は、黄色〜橙色スペクトルでの発光に対応し、一方、ＦＬ４−Ａの読み値（図６（ｂ））は、遠赤色スペクトルでの発光に対応する。ローダミンＢは、ＦＬ２−Ａでの読み値に対応する６２５ｎｍでの最大発光を有する。アロフィコシアニン（ＡＰＣ）は、ＦＬ４−Ａでの読み値に対応する６６１ｎｍでの最大発光を有する。図６（ａ）〜（ｂ）は、ポリスチレンビーズ（黒）、ＡＰＣ−アビジンで被覆されたポリスチレン（赤）及びローダミンＢに結合したＡＰＣ−アビジンで被覆されたポリスチレン（青）のＦＬ２−Ａ読み値及びＦＬ４−Ａ読み値を示す。ポリスチレンビーズ（黒）は、ＦＬ２及びＦＬ４の両方において低強度読み値を有する。ＡＰＣ−アビジンで被覆したポリスチレンビーズ（赤）は、ＦＬ２においては低強度読み値を有するが、ＦＬ４においては高強度読み値を有する。ローダミンｂに結合したＡＰＣ−アビジンで被覆されたポリスチレンビーズ（青）は、ＦＬ２及びＦＬ４の両方において高強度読み値を有する。
多孔質ポリスチレンミクロスフィアのフローサイトメトリー読み値（Accuri C6）を、図６（ａ）〜（ｂ）に示す。ＦＬ２−Ａの読み値（図６（ａ））は、黄色〜橙色スペクトルでの発光に対応し、一方、ＦＬ４−Ａの読み値（図６（ｂ））は、遠赤色スペクトルでの発光に対応する。ローダミンＢは、ＦＬ２−Ａでの読み値に対応する６２５ｎｍでの最大発光を有する。アロフィコシアニン（ＡＰＣ）は、ＦＬ４−Ａでの読み値に対応する６６１ｎｍでの最大発光を有する。図６（ａ）〜（ｂ）は、ポリスチレンビーズ（黒）、ＡＰＣ−アビジンで被覆されたポリスチレン（赤）及びローダミンＢに結合したＡＰＣ−アビジンで被覆されたポリスチレン（青）のＦＬ２−Ａ読み値及びＦＬ４−Ａ読み値を示す。ポリスチレンビーズ（黒）は、ＦＬ２及びＦＬ４の両方において低強度読み値を有する。ＡＰＣ−アビジンで被覆したポリスチレンビーズ（赤）は、ＦＬ２においては低強度読み値を有するが、ＦＬ４においては高強度読み値を有する。ローダミンｂに結合したＡＰＣ−アビジンで被覆されたポリスチレンビーズ（青）は、ＦＬ２及びＦＬ４の両方において高強度読み値を有する。
これらのフローサイトメーター読み値は、ローダミンＢのビオチン化により示されるように、多孔質ポリスチレンミクロスフィアのＡＰＣ−アビジン被覆及び活性薬剤のビオチン化が成功したことを示している。
細胞
Ｓｆ９細胞を、ＳＦＭ９２１無血清昆虫細胞培養培地（Expression Systems）中で、２７℃にて増殖させた。１２ウェルプレートにおいて単層としてか、又は１３０ｒｐｍで撹拌した振盪機フラスコにおいて懸濁状態で、Ｓｆ９細胞を培養した。
Ｓｆ９細胞を、ＳＦＭ９２１無血清昆虫細胞培養培地（Expression Systems）中で、２７℃にて増殖させた。１２ウェルプレートにおいて単層としてか、又は１３０ｒｐｍで撹拌した振盪機フラスコにおいて懸濁状態で、Ｓｆ９細胞を培養した。
バクミド（バキュロウイルスシャトルベクタープラスミド）とヘルパープラスミドとを含有するコンピテントE.coli DH10BAC細胞を使用して、製造業者のプロトコル（Invitrogen）に従って、組換えバクミドを生成した。バクミドへの遺伝子（ＧＦＰ）の挿入は、ＰＣＲによって確認した。６ウェルプレートにおいて、ＥＳＣＯＲＴトランスフェクション試薬（Sigma-Aldrich）を用いてＳｆ９細胞に組換えバクミドＤＮＡをトランスフェクトした。細胞を、２７℃にて５時間インキュベートし、すすぎ、さらに７２時間インキュベートした。培地を採取し、遠心分離し、ウイルスを含有する上清を用いて２〜３回連続感染を行った結果、ビリオンが増幅した。
Ｓｆ９細胞（２×１０５細胞／ｍＬ）を、１２ウェルプレート上に１ｍＬ／ウェルで播種した。細胞の感染を、プレインキュベーション及び予防の２つの異なるプロトコルにおいて、１０の感染多重度（Multiplicity Of Infection：ＭＯＩ）で行った。プレインキュベーションモードでは、ウイルスを、種々のトラップと共に別個に３０分間インキュベートし、５０００ｇで３分間遠心分離し、上清を細胞に添加した。予防モードでは、トラップを細胞に添加し、その次に初めてビリオンも添加した。２７℃で置かれた加湿チャンバーに４８時間プレートを入れ、ウェルの内容物を激しくピペット操作することにより採取し、ＦＡＣＳ（C6 accuri）によりＧＦＰ蛍光について分析した。
結果及び考察
ウイルスは、それらが感染宿主生物に与える損傷でよく知られている。現在のところ、抗生物質の有効性又はマルチスペクトルの適用性を示す抗ウイルス剤はない。
ウイルスは、それらが感染宿主生物に与える損傷でよく知られている。現在のところ、抗生物質の有効性又はマルチスペクトルの適用性を示す抗ウイルス剤はない。
本発明は、ウイルスなどの感染因子を、物理的及び化学的に不活性化することが可能なウイルストラップを提供することにより、ウイルス感染を防ぐための新しいアプローチを提供する。本発明はまた、種々のウイルストラップ構成の抗ウイルス活性を観察且つ定量化するためのモデル系も提供する。
細胞培養実験から、感染したＳｆ９細胞（図８（ａ）及び図８（ｂ））と比較した健康な非処理のＳｆ９細胞（図７（ａ）及び図７（ｂ））の活力において、著しい差異があることが分かる。ウイルス及び多孔質ポリスチレントラップの両方でのＳｆ９細胞の同時処理（co-treatment）（図９（ａ）及び図９（ｂ）−トラップを矢印で示す）は、Ｓｆ９のほとんどによる感染の著しい救済を結果としてもたらし、このＳｆ９細胞は、感染細胞よりも健康な非処理の細胞の方に定性的に類似している。
バキュロウイルス関連感染の救済を、さらに定量的に評価した。図９（ｃ）及び図９（ｄ）に示されるように、最も高い感染阻害率は、ＰＳのみ、Tween、ポリリジン、サーファクタントプロテインＤ及びTritonによって達成される。
実施例４
バキュロウイルスインビボ実験
「デスヘッド」ゴキブリとしても知られるブラベルス・クラニイフェルゴキブリを、多孔質ポリスチレンミクロスフィアトラップの有効性及び毒性を評価するためのインビボモデルとして使用した。
バキュロウイルスインビボ実験
「デスヘッド」ゴキブリとしても知られるブラベルス・クラニイフェルゴキブリを、多孔質ポリスチレンミクロスフィアトラップの有効性及び毒性を評価するためのインビボモデルとして使用した。
材料及び方法
多孔質ポリスチレンミクロスフィアトラップをバキュロウイルスと混合し、直ちに、針が腹部第３節腹板と腹部第４節腹板との間の外側縁に近いところに入るようにしてゴキブリの腹部血体腔に注射した（図１０（ａ））。１μＬのバキュロウイルスと、ゴキブリ１匹当たり総数１６５，０００個のトラップ粒子として適切な量のトラップとを含む、総量１０μＬを各ゴキブリに注射した。注射の前に、ゴキブリを、これを麻痺させるために、−２０℃にて７分間維持した。
多孔質ポリスチレンミクロスフィアトラップをバキュロウイルスと混合し、直ちに、針が腹部第３節腹板と腹部第４節腹板との間の外側縁に近いところに入るようにしてゴキブリの腹部血体腔に注射した（図１０（ａ））。１μＬのバキュロウイルスと、ゴキブリ１匹当たり総数１６５，０００個のトラップ粒子として適切な量のトラップとを含む、総量１０μＬを各ゴキブリに注射した。注射の前に、ゴキブリを、これを麻痺させるために、−２０℃にて７分間維持した。
この注射実験で使用したトラップは、Triton、ポリリジン、サーファクタントプロテインＤ、抗ＧＰ６４抗体、又はウシ血清アルブミン（Bovine Serum Albomine：ＢＳＡ）で覆われたポリスチレン粒子である。裸のポリスチレン粒子をコントロールとして使用した。二重反復試験として２匹のゴキブリに同じトラップを注射し、さらに、ポジティブコントロールとして、２匹のゴキブリにバキュロウイルスのみを注射し、ネガティブコントロールとして、２匹のゴキブリに何も注射しなかった。
注射の５日後に、後胸脚の基部において膜に穴を開け、穏やかに血リンパを放出するようにゴキブリを穏やかに圧縮することにより、血リンパ細胞を採取した。２５μＬの血リンパを、２５μＬの氷冷した抗凝固緩衝液（３０ｍＭクエン酸、３０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＥＤＴＡ、０．０２％アジ化ナトリウム）を既に含有しているマイクロピペッター先端によって迅速に収集し、５０μＬの氷冷した抗凝固緩衝液を含有しているエッペンドルフ中で懸濁させた。細胞を計数し、Accuri C6フローサイトメーターを用いてそれらの相対ＧＦＰ蛍光を評価した。
結果：
この実験で使用したバキュロウイルスはサイトゾルＧＦＰマーカーを発現するので、血リンパ細胞の相対ＧＦＰ蛍光は、ウイルス感染の直接測定となる。相対ＧＦＰ蛍光を、バキュロウイルスのみを注射したゴキブリの相対ＧＦＰ蛍光と比較した。
この実験で使用したバキュロウイルスはサイトゾルＧＦＰマーカーを発現するので、血リンパ細胞の相対ＧＦＰ蛍光は、ウイルス感染の直接測定となる。相対ＧＦＰ蛍光を、バキュロウイルスのみを注射したゴキブリの相対ＧＦＰ蛍光と比較した。
考察：
トラップは、ゴキブリに明らかな中毒作用を何ら生じさせなかった。さらに、注射されたトラップは、感染に関連したＧＦＰ蛍光を減少させた（図１０（ｂ））。Triton又はポリリジンのいずれかで被覆したトラップは、非感染試料の結果に匹敵する結果をもたらした。これは、感染の完全な救済を示唆している。
トラップは、ゴキブリに明らかな中毒作用を何ら生じさせなかった。さらに、注射されたトラップは、感染に関連したＧＦＰ蛍光を減少させた（図１０（ｂ））。Triton又はポリリジンのいずれかで被覆したトラップは、非感染試料の結果に匹敵する結果をもたらした。これは、感染の完全な救済を示唆している。
実施例５
トラップへのバキュロウイルス付着
トラップを、バキュロウイルスのウイルス粒子を固定化しそれによりそのウイルス粒子の阻害を促進するそのトラップの能力を示すために、ウイルスと共にインキュベートした。
トラップへのバキュロウイルス付着
トラップを、バキュロウイルスのウイルス粒子を固定化しそれによりそのウイルス粒子の阻害を促進するそのトラップの能力を示すために、ウイルスと共にインキュベートした。
材料及び方法
各活性薬剤からの４００，０００個のトラップを、１０μＬのウイルスと、２分間にわたって穏やかに混合した。次いで、各試料を、１ｍＬのＰＢＳで洗浄し、５ｇで８分間遠心分離した。上清の除去後、１ｍＬのＰＢＳを添加し、試料を８分間穏やかに混合し、続いて５ｇで８分間遠心分離した。９００μＬの上清を除去し、ペレットを残りの１００μＬに懸濁させた。
各活性薬剤からの４００，０００個のトラップを、１０μＬのウイルスと、２分間にわたって穏やかに混合した。次いで、各試料を、１ｍＬのＰＢＳで洗浄し、５ｇで８分間遠心分離した。上清の除去後、１ｍＬのＰＢＳを添加し、試料を８分間穏やかに混合し、続いて５ｇで８分間遠心分離した。９００μＬの上清を除去し、ペレットを残りの１００μＬに懸濁させた。
このトラップは、以下の活性薬剤、すなわち、Tween、Triton、アンホテリシン、サーファクタントプロテインＤを有していた。コントロールとして、裸の多孔質ミクロスフィア及びアビジンで被覆した多孔質ミクロスフィアの両方を使用した。
結果
コントロールトラップ、すなわち、裸の多孔質ミクロスフィア及びアビジンで被覆した多孔質ミクロスフィアは、その表面へのウイルス粒子の極めて僅かな結合しか示さないのに対して、Triton（図１１（ａ）〜（ｂ））、Tween及びアンホテリシンを含有するトラップは、ＳＥＭから明らかなように、ウイルス粒子の適度な結合を示した。
コントロールトラップ、すなわち、裸の多孔質ミクロスフィア及びアビジンで被覆した多孔質ミクロスフィアは、その表面へのウイルス粒子の極めて僅かな結合しか示さないのに対して、Triton（図１１（ａ）〜（ｂ））、Tween及びアンホテリシンを含有するトラップは、ＳＥＭから明らかなように、ウイルス粒子の適度な結合を示した。
ＳＥＭは、ガラス表面に炭素被覆を用いて実施した。加速電圧は３ｋＶであった。作動距離は２．６〜２．９ｍｍであった。尺度図（bar）が、それぞれの写真について示されている。トラップの表面に付着している粒子は、バキュロウイルスビリオンの予想されたサイズ範囲５０〜３００ｎｍにある。
実施例６
ＤＮＡ折り紙足場
ハニカムプリーツ型（honeycomb-pleated）折り紙設計の生成を支援するために作成された、グラフィカルインターフェースに基づくコンピュータ支援デザイン環境である、caDNAno[Douglas他(2009)Nucleic Acids Research，最初にオンラインで公開doi:10.1093/nar/gkp436]の助けを借りて、本発明のＤＮＡ折り紙ベースの足場の設計を行った。
ＤＮＡ折り紙足場
ハニカムプリーツ型（honeycomb-pleated）折り紙設計の生成を支援するために作成された、グラフィカルインターフェースに基づくコンピュータ支援デザイン環境である、caDNAno[Douglas他(2009)Nucleic Acids Research，最初にオンラインで公開doi:10.1093/nar/gkp436]の助けを借りて、本発明のＤＮＡ折り紙ベースの足場の設計を行った。
２０ｎＭ足場ＤＮＡを、１００ｎＭの各ステープルオリゴヌクレオチド、緩衝液及び塩（５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（２０℃にてｐＨ７．９）、及び２２ｍＭ又は１５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む）と組み合わせることによって、ＤＮＡ折り紙ベースの足場を調製する。迅速な熱変性、それに続く、８０分間かけての８０℃から６１℃への、それから１７３時間かけての６０℃から２４℃へのゆっくりとした冷却により、折り畳みを実施する。結果として生じた生成物を可視化するために、氷水浴中、２％アガロースゲル（０．５Ｘ ＴＢＥ、１１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍｇ／ｍＬの臭化エチジウム）上で、７０Ｖにて４時間、試料を電気泳動にかける。
実質的に、あらゆる精製された、任意且つ高複雑性（反復なし）のｓｓＤＮＡが、折り紙ＤＮＡのための足場となり得るであろう。使用され得る配列の例には、M13mpl8（配列番号１）、p7308（配列番号２）、p7560（配列番号３）、p7560old（配列番号４）、p7560lab（配列番号５）、p7560antisense（配列番号６）、p7704（配列番号７）、p7704lab（配列番号８）、p8064（配列番号９）、p8064lab（配列番号１０）、p8100（配列番号１１）、p8100a（配列番号１２）、p8100b（配列番号１３）、p8100c（配列番号１４）、p8634（配列番号１５）、pEGFP（配列番号１６）がある。
ステープルとして使用されるＤＮＡ配列は、例えば、ｃａＤＮＡｎｏギャラリーウェブサイト[http://cadnano.org./gallery.html]、及び下記表１において示されるとおりであり得る。
実施例７
リポソーム活性部分
リポソームを、押出法によって調製する。コレステロール（Ｃｈｏｌ）及び１，２−ジステオロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）を、エタノールを含まないクロロホルムにおよそ１０ｍｇ／ｍＬとなるように溶解させる。試料がゲル状になるまで、窒素ガス流れ下で試料をパージしながらクロロホルムを除去する。続いて試料を高真空下に置くのであるが、そこでこの脂質試料は「膨張した」フィルムを形成する。このフィルムを、あらゆる残留クロロホルムを除去するために、真空下で２〜３時間維持する。この試料を、それの相転移温度（Ｔｍ）より高い温度にて、水和状態で保存する。
リポソーム活性部分
リポソームを、押出法によって調製する。コレステロール（Ｃｈｏｌ）及び１，２−ジステオロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）を、エタノールを含まないクロロホルムにおよそ１０ｍｇ／ｍＬとなるように溶解させる。試料がゲル状になるまで、窒素ガス流れ下で試料をパージしながらクロロホルムを除去する。続いて試料を高真空下に置くのであるが、そこでこの脂質試料は「膨張した」フィルムを形成する。このフィルムを、あらゆる残留クロロホルムを除去するために、真空下で２〜３時間維持する。この試料を、それの相転移温度（Ｔｍ）より高い温度にて、水和状態で保存する。
乾燥させた脂質を、２０ｍＭの最終脂質濃度が得られるように、１２０ｍＭリン酸緩衝生理的食塩水ｐＨ７．４（又は同様のイオン強度及びｐＨを有する他の緩衝液）に穏やかに再懸濁させる。
脂質懸濁液を、３０分間振盪し、次いで浴槽型超音波発生装置において２分間超音波処理する。リポソームの水和を、激しく振盪又は混合しながら１時間行う。
この脂質懸濁液を、押出装置（Avestin又はAvanti Polar Lipids,Inc.から入手可能）を用いて、５０ｎｍポリカーボネートフィルタに少なくとも１５回通す。単層小胞が得られる。
この脂質懸濁液を、１００，０００ｇ（例えば、Beckman TL-100超遠心分離機で７２，０００ｒｐｍ）での１５℃における３０分間の超遠心分離により精製する。平均直径２５ｎｍの精製された小型の単層小胞が、懸濁液の上層にあるであろう。パスツールピペットを用いてこの脂質層を新しい試験管に移し、Ｎ２（気）下において４℃で保存する。
実施例８
プロト細胞活性部分
メソポーラスシリカ粒子コアを単層脂質小胞と融合させることにより、プロト細胞を調製する。
プロト細胞活性部分
メソポーラスシリカ粒子コアを単層脂質小胞と融合させることにより、プロト細胞を調製する。
非イオン界面活性剤Brij-58(CH3(CH2)15-(OCH2CH2)20-OH、Aldrich)を酸性シリカゾル(A2**)に添加することにより、前駆体溶液を合成する。オルトケイ酸テトラエチル（TEOS,Aldrich）、エタノール、脱イオン水、及び希ＨＣｌ（モル比１：３．８：１：０．０００５）を６０℃にて９０分間還流させ、原ゾル（stock sol）を得る。次いで、１０ｍＬの原ゾルをエタノールで希釈し、続いて水、希ＨＣｌ、及び界面活性剤水溶液（１．５ｇの界面活性剤を２０ｍＬの水に溶解させたもの）を添加し、１：２２：５５：０．００５３：０．０６というＴＥＯＳ／エタノール／Ｈ２Ｏ／ＨＣｌ／界面活性剤の最終の全体モル比を得る。このゾルを約１０分間撹拌した後に、粉末合成作業を始める。
振動オリフィスエアロゾル発生器（ＴＳＩ型式３４５０）を用いて単分散液滴を発生させる。溶液を、シリンジポンプによって、およそ８×１０−４ｃｍ／秒（４．７×１０−３ｃｍ３／秒）のシリンジ速度で、小さなオリフィス（２０μｍ直径）に押し通す。この送達速度は、３４０〜４２０ｋＰａの安定した動作圧力を与えるように調整される。液体流れを、４０〜２００ｋＨｚの周波数範囲を使用し、最終設定を衛星液滴を排除するように調整して、振動オリフィスによって均一な液滴の状態へと分散させる。その際、液滴を分散させ凝固を防ぐために、液滴を、乱流エアジェットの中心に沿って軸方向に注入する。分散させた液滴とそれよりもはるかに多量の濾過された乾燥空気との混合に続いて、液滴を含んだガス流れは、２．５ｃｍ直径の石英管を通って、５００℃（Ａ２＊＊作業）又は４２０℃（ＴＥＯＳ溶液作業）に維持した３ゾーン炉（０．９ｍの加熱長）内へと流れた。この粒子を、加熱テープによっておよそ８０℃に維持したフィルタ上に回収する。回収した粒子を、空気中４００〜４５０℃で４時間焼成して界面活性剤鋳型を除去する。更なる実験での使用の前に、この多孔質ビーズを脱イオン水中で洗浄する。
単層脂質小胞
ガラスバイアル中で、クロロホルムに（１０ｍｇ／ｍＬになるように）溶解させたパルミトイル−オレオイル−ホスファチジル−コリンを、５％の１ｍｇ／ｍＬの１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−｛［Ｎ（５−アミノ−１−カルボキシペンチル）イミノ二酢酸］（DOGS-NTA-Ni,Avanti Polar Lipids,Alabaster,AL）と混合する。溶媒を、乾燥するまで窒素流れを用いて蒸発させ、バイアルを、１時間〜２時間真空下で維持して残留溶媒を除去する。この脂質フィルムを、脱イオン（ＤＩ）水を用いて４℃で一晩水和させる。最終脂質濃度は２ｍｇ／ｍＬである。水和した脂質を数分間ボルテックスにかけ、０．１ｍｍポリカーボネート膜フィルタ（Whatman,Inc., Newton,MA）を備えた小型押出機（Avanti Polar Lipids）を用いて押出す。脂質溶液を、この押出機に少なくとも１９回通し、ＰＢＳで１ｍｇ／ｍＬになるように希釈する。
ガラスバイアル中で、クロロホルムに（１０ｍｇ／ｍＬになるように）溶解させたパルミトイル−オレオイル−ホスファチジル−コリンを、５％の１ｍｇ／ｍＬの１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−｛［Ｎ（５−アミノ−１−カルボキシペンチル）イミノ二酢酸］（DOGS-NTA-Ni,Avanti Polar Lipids,Alabaster,AL）と混合する。溶媒を、乾燥するまで窒素流れを用いて蒸発させ、バイアルを、１時間〜２時間真空下で維持して残留溶媒を除去する。この脂質フィルムを、脱イオン（ＤＩ）水を用いて４℃で一晩水和させる。最終脂質濃度は２ｍｇ／ｍＬである。水和した脂質を数分間ボルテックスにかけ、０．１ｍｍポリカーボネート膜フィルタ（Whatman,Inc., Newton,MA）を備えた小型押出機（Avanti Polar Lipids）を用いて押出す。脂質溶液を、この押出機に少なくとも１９回通し、ＰＢＳで１ｍｇ／ｍＬになるように希釈する。
プロト細胞の脂質被覆
シリカ粒子懸濁液の１ｍＬアリコートを遠心分離し、上清を除去し、１ｍＬの新しく調製した小型単層小胞溶液を加え、振盪しながら４５分間インキュベートして、シリカ粒子担持脂質二重層を得る。この最終混合物を繰り返し遠心分離し、希ＰＢＳ中で洗浄して過剰の脂質を除去する。
シリカ粒子懸濁液の１ｍＬアリコートを遠心分離し、上清を除去し、１ｍＬの新しく調製した小型単層小胞溶液を加え、振盪しながら４５分間インキュベートして、シリカ粒子担持脂質二重層を得る。この最終混合物を繰り返し遠心分離し、希ＰＢＳ中で洗浄して過剰の脂質を除去する。
実施例９
ＤＮＡバッキーボール足場
ＤＮＡで作製したバッキーボールトラップを、He他(Nature 452,198-201,2008,Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedral)の手順を適合させることにより構築した。バッキーボール構造は、多面体の頂点を構成する「コネクター」ＤＮＡアセンブリー、及び多面体の辺を構成する「バー」ＤＮＡアセンブリーに基づく。コネクター配列は一定である一方で、バー配列は、１００ｎｍのバーサイズがもたらされるか又は２００ｎｍのバーサイズがもたらされるように変えられる。１００ｎｍのバーを用いれば、適切に折り畳まれていれば、このＤＮＡバッキーボールは、予想される直径が５００〜８００ｎｍの多面体形状を示すはずである。２００ｎｍのバーを用いれば、粒子の直径は１〜１．４μｍになると予想される。
ＤＮＡバッキーボール足場
ＤＮＡで作製したバッキーボールトラップを、He他(Nature 452,198-201,2008,Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedral)の手順を適合させることにより構築した。バッキーボール構造は、多面体の頂点を構成する「コネクター」ＤＮＡアセンブリー、及び多面体の辺を構成する「バー」ＤＮＡアセンブリーに基づく。コネクター配列は一定である一方で、バー配列は、１００ｎｍのバーサイズがもたらされるか又は２００ｎｍのバーサイズがもたらされるように変えられる。１００ｎｍのバーを用いれば、適切に折り畳まれていれば、このＤＮＡバッキーボールは、予想される直径が５００〜８００ｎｍの多面体形状を示すはずである。２００ｎｍのバーを用いれば、粒子の直径は１〜１．４μｍになると予想される。
以下のコネクター配列を、アセンブリーのために使用した（５’から３’）。
S': atactcgctctcgttaccgtgtggttgcatagttttctcgtcac（配列番号２０９）
DaoM: tagcaacctgcctggcaagcctacgatggacacggtaacgcc（配列番号２１０）
L: aggcaccatcgtaggtttcttgccaggcaccatcgtaggtttcttgccaggcaccatcgtaggtttcttgcc（配列番号２１１）
S': atactcgctctcgttaccgtgtggttgcatagttttctcgtcac（配列番号２０９）
DaoM: tagcaacctgcctggcaagcctacgatggacacggtaacgcc（配列番号２１０）
L: aggcaccatcgtaggtttcttgccaggcaccatcgtaggtttcttgccaggcaccatcgtaggtttcttgcc（配列番号２１１）
コネクターを生成するために、１μΜのＬ配列、３μΜのＳ配列及び３μΜのＤａｏＭ配列を、１２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する１ｘＴＡＥ緩衝液中で、１００μＬの最終体積混合物として混合した。次いで、この反応混合物を９５℃に加熱し、続いて４８時間かけて温度を室温まで徐々に下げた。
以下のバー配列を、アセンブリーのために使用した（５’から３’）。
H1: agagcgagtatggagtcagatggcttacttacctatcgcgctat（配列番号２１２）
H2: ttctatacaatttgcgacttatttataccaagtctttattagac（配列番号２１３）
H3: gtgtacagaaactcactgcgtcttaagaatggaacgttgtccat（配列番号２１４）
H4: ttcataagtagtagcacctatgcggcatcgcatttgagtagataggc（配列番号２１５）
H5: acacgtatcggatgtctctgtaggttgtgcagatatagataata（配列番号２１６）
H6: cagttttttagaagcgaagctggaccatgagaagttattcccg（配列番号２１７）
H7: cgatgtcagcgaacacatgtcgatgtatttaaagtgacgagaaa（配列番号２１８）
G1: tttaaatacatcgacatgtgttggtaagtaagccatctgactcc（配列番号２１９）
G2: cgctgacatcgcgggaaataacattgtatagaaatagcgcgata（配列番号２２０）
G3: ttctcatggtccagcttcgcttacttggtataaataagtcgcaa（配列番号２２１）
G4: ctaaaaaactgtattatctatatttctgtacacgtctaataaag（配列番号２２２）
G5: tctgcacaacctacagagacattccattcttaagacgcagtgag（配列番号２２３）
G6: ccgatacgtgtgcctatctactctacttatgaaatggacaacgt（配列番号２２４）
G7: caaatgcgatgccgcataggtgcaaatgcgatgccgcataggtg（配列番号２２５）
G8: ctacttatgaaatggacaacgtccgatacgtgtgcctatctact（配列番号２２６）
G9: tccattcttaagacgcagtgagtctgcacaacctacagagacat（配列番号２２７）
G10: tttctgtacacgtctaataaagctaaaaaactgtattatctata（配列番号２２８）
G11: acttggtataaataagtcgcaattctcatggtccagcttcgctt（配列番号２２９）
G12: attgtatagaaatagcgcgatacgctgacatcgcgggaaataac（配列番号２３０）
G13: ggtaagtaagccatctgactcctttaaatacatcgacatgtgtt（配列番号２３１）
H1: agagcgagtatggagtcagatggcttacttacctatcgcgctat（配列番号２１２）
H2: ttctatacaatttgcgacttatttataccaagtctttattagac（配列番号２１３）
H3: gtgtacagaaactcactgcgtcttaagaatggaacgttgtccat（配列番号２１４）
H4: ttcataagtagtagcacctatgcggcatcgcatttgagtagataggc（配列番号２１５）
H5: acacgtatcggatgtctctgtaggttgtgcagatatagataata（配列番号２１６）
H6: cagttttttagaagcgaagctggaccatgagaagttattcccg（配列番号２１７）
H7: cgatgtcagcgaacacatgtcgatgtatttaaagtgacgagaaa（配列番号２１８）
G1: tttaaatacatcgacatgtgttggtaagtaagccatctgactcc（配列番号２１９）
G2: cgctgacatcgcgggaaataacattgtatagaaatagcgcgata（配列番号２２０）
G3: ttctcatggtccagcttcgcttacttggtataaataagtcgcaa（配列番号２２１）
G4: ctaaaaaactgtattatctatatttctgtacacgtctaataaag（配列番号２２２）
G5: tctgcacaacctacagagacattccattcttaagacgcagtgag（配列番号２２３）
G6: ccgatacgtgtgcctatctactctacttatgaaatggacaacgt（配列番号２２４）
G7: caaatgcgatgccgcataggtgcaaatgcgatgccgcataggtg（配列番号２２５）
G8: ctacttatgaaatggacaacgtccgatacgtgtgcctatctact（配列番号２２６）
G9: tccattcttaagacgcagtgagtctgcacaacctacagagacat（配列番号２２７）
G10: tttctgtacacgtctaataaagctaaaaaactgtattatctata（配列番号２２８）
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G12: attgtatagaaatagcgcgatacgctgacatcgcgggaaataac（配列番号２３０）
G13: ggtaagtaagccatctgactcctttaaatacatcgacatgtgtt（配列番号２３１）
２００ｎｍバーを生成するために使用した配列：
G14: tggcgatacaatgcattccgcaggtaagtaagccatctgactcc（配列番号２３２）
G15: cgctgacatcggttctaatgcc（配列番号２３３）
H8: agagcgagtattgcggaatgcattgtatcgccaggcattagaac（配列番号２３４）
G14: tggcgatacaatgcattccgcaggtaagtaagccatctgactcc（配列番号２３２）
G15: cgctgacatcggttctaatgcc（配列番号２３３）
H8: agagcgagtattgcggaatgcattgtatcgccaggcattagaac（配列番号２３４）
２００ｎｍバーを生成するために使用した配列：
G14: tggcgatacaatgcattccgcaggtaagtaagccatctgactcc（配列番号４７４）
G15: cgctgacatcggttctaatgcc（配列番号４７５）
H8: agagcgagtattgcggaatgcattgtatcgccaggcattagaac（配列番号４７６）
G14: tggcgatacaatgcattccgcaggtaagtaagccatctgactcc（配列番号４７４）
G15: cgctgacatcggttctaatgcc（配列番号４７５）
H8: agagcgagtattgcggaatgcattgtatcgccaggcattagaac（配列番号４７６）
１００ｎｍバーを生成するために、１μΜの各Ｈ１〜Ｈ７の配列及び１μΜの各Ｇ１〜Ｇ１３の配列を、１２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する１ｘＴＡＥ緩衝液中で、１００μＬの最終体積反応混合物として混合した。次いで、反応混合物を９５℃に加熱し、続いて４８時間かけて温度を室温まで徐々に下げた。
２００ｎｍバーの生成のためには、２μΜの各Ｈ２〜Ｈ７の配列並びに１μΜの各Ｇ１〜Ｇ１２、並びに１μΜのＨ１、Ｈ８、Ｇ１４及びＧ１５の配列を、１２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する１ｘＴＡＥ緩衝液中で、１００μＬの最終体積反応混合物として混合した。次いで、反応混合物を９５℃に加熱し、続いて４８時間かけて温度を室温まで徐々に下げた。
折り畳みに続いて、バー及びコネクターを、１２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する１ｘＴＡＥ緩衝液中で、３：１のバーとコネクターとの体積比で混合した。
結果
１００ｎｍバーを用いて生成されたＤＮＡバッキーボール試料について、ＴＥＭ顕微鏡観察を行った（図１２（ａ））。写真は、バッキーボールの予想されたサイズ範囲（５００〜８００ｎｍ）の球形形状を示している。
１００ｎｍバーを用いて生成されたＤＮＡバッキーボール試料について、ＴＥＭ顕微鏡観察を行った（図１２（ａ））。写真は、バッキーボールの予想されたサイズ範囲（５００〜８００ｎｍ）の球形形状を示している。
図１２（ｂ）は、ＤＮＡバッキーボール足場を含むＤＮＡ配列の構造及び相互作用を図示している。
実施例１０
ＤＮＡ球形足場
ＤＮＡ−ナノテクノロジー技術を用いて球形のＤＮＡ形状を構築した。特異的なＤＮＡ配列の混合物から各々構築された２つの半球を繋ぐことにより、この球形形状を生成した。
ＤＮＡ球形足場
ＤＮＡ−ナノテクノロジー技術を用いて球形のＤＮＡ形状を構築した。特異的なＤＮＡ配列の混合物から各々構築された２つの半球を繋ぐことにより、この球形形状を生成した。
半球を構築するために使用した配列には以下が含まれた。
1 : ACCCCCATTGTGTTGCGTTACCGTGTGGTTGCATAGTTTTTTATGCATATCACTTCT（配列番号２３５）
2: 5'Phos-CTAGCAATATCTATGT（配列番号２３６）
3: ACTACGTCCCCCCATCGTACGATCAGGCGAGGACTCTGACCAGTCTCCAACA（配列番号２３７）
4: CAACACAATGGGGGTACATAGATATTG（配列番号２３８）
6: CCACGAGTTCCTTATCCGTAGGGCTATATTGACACTGTTTTTAGAGATGAAATCTGT（配列番号２３９）
7: CCACGAGTTCCTTATCCGTAGGGCTATATTGACACTGTTTTTAGAGATGAAATCTGT（配列番号２４０）
9: ATAAGGAACTCGTGGACATAGATATTG（配列番号２４１）
10: TGCTTCGTGTGCGACAGAGCTTATCCATTGGCTGGGAGCGGGTCATTGACCC（配列番号２４２）
12: GTCGCACACGAAGCAACATAGATATTG（配列番号２４３）
13: GACAACAAACCTGAAAGAGCTTATCCATTGGCTGGGAGGTGTTGCTCCTGCC（配列番号２４４）
14: GCGGTTGCGTGAACGCAATATCTATGT（配列番号２４５）
15: 5'Phos-CATGACATAGATATTG（配列番号２４６）
16: GACAACAAACCTGAAAGAGCTTATCCATTGGCTGGGAGGTGTTGCTCCTGCC（配列番号２４７）
17: TTCAGGTTTGTTGTCCAATATCTATGT（配列番号２４８）
19: TGCTGCAGGCGCAAGCGTACGATCAGGCGAGGACTCTCCCAACACATAAAGA（配列番号２４９）
20: 5'Phos-CTAGACATAGATATTG（配列番号２５０）
21: CTTGCGCCTGCAGCACAATATCTATGT（配列番号２５１）
22: TATTTCGGCGTTAACCCGTAGGGCTATATTGACACTGTTTTTTGTCAGGGCGTAGCA（配列番号２５２）
23 : ATCGTTGTATGCTAGCCGTAGGGCTATATTGACACTGTTTTTATAGACTAGAACCTT（配列番号２５３）
24: AGCCATGATTACATTCGTTACCGTGTGGTTGCATAGTTTTTTGTTACGCGCAAATTT（配列番号２５４）
25: AATGTAATCATGGCTCAATATCTATGT（配列番号２５５）
27: TCACGCGAAGAGGCTAGAGCTTATCCATTGGCTGGGACCGACATGCTAAAAG（配列番号２５６）
28: AGCCTCTTCGCGTGACAATATCTATGT（配列番号２５７）
30: CTGCGACGCTGAGGCCGTACGATCAGGCGAGGACTCTTAACAGGATGCAAAT（配列番号２５８）
31: 5 'Phos-CTAGACATAGATATTG（配列番号２５９）
32: GCCTCAGCGTCGCAGCAATATCTATGT（配列番号２６０）
33 : ATCGGCATTACGCTTCCGTAGGGCTATATTGACACTGTTTTTATCGGCATTACGCTT（配列番号２６１）
34: AAGCGTAATGCCGATCCGTAGGGCTATATTGACACTGTTTTTTATAACGGGACAACG（配列番号２６２）
35: TCGGGGAGTACCTCTCGTTACCGTGTGGTTGCATAGTTTTTTGTTTTTATTATAGAA（配列番号２６３）
36: AGAGGTACTCCCCGACAATATCTATGT（配列番号２６４）
38: GCGGCTTGATTATATCGTACGATCAGGCGAGGACTCTCCGACGGGCACATAC（配列番号２６５）
40: ATATAATCAAGCCGCCAATATCTATGT（配列番号２６６）
41: ATTCCGCATGAGCGAAGAGCTTATCCATTGGCTGGGATTTGGAGCAGTCCCA（配列番号２６７）
42: TCGCTCATGCGGAATCAATATCTATGT（配列番号２６８）
44: CTAGCATACAACGATCCGTAGGGCTATATTGACACTGTTTTTGGTCGCATGCATCGT（配列番号２６９）
45: GTTAACGCCGAAATACCGTAGGGCTATATTGACACTGTTTTTTGTTCAGCTCCTCCG（配列番号２７０）
46: CAAGTCTGTCGATAACGTTACCGTGTGGTTGCATAGTTTTTTTCTGTAGAGCGGAAT（配列番号２７１）
47: TTATCGACAGACTTGCAATATCTATGT（配列番号２７２）
49: AGTGGCGCTTGCTTACGTACGATCAGGCGAGGACTCTTCTGGCCATCGATAA（配列番号２７３）
51: TAAGCAAGCGCCACTCAATATCTATGT（配列番号２７４）
52: AGACGCCGTGTTGACAGAGCTTATCCATTGGCTGGGAAAAGGCGACAGCATT（配列番号２７５）
53: GTCAACACGGCGTCTCAATATCTATGT（配列番号２７６）
55: GAGTGAAGTAAGAGCCCGTAGGGCTATATTGACACTGTTTTTTGGCGCACATAACTA（配列番号２７７）
56: GCTCTTACTTCACTCCCGTAGGGCTATATTGACACTGTTTTTTGTTCATTTTGGAAT（配列番号２７８）
60: AAAAAACTATGCAACCTGCCTGGCAAGCCTACGATGGGGATAAGCTCT（配列番号２７９）
61: TCCCAGCCAATTGCCTGGCAAGCCTACGATGGTAGCCCTACGG（配列番号２８０）
62: AAAAACAGTGTCAATATGCCTGGCAAGCCTACGATGGCTGATCGTACG（配列番号２８１）
63: AGAGTCCTCGCTGCCTGGCAAGCCTACGATGGACACGGTAACG（配列番号２８２）
64: AGGCACCATCGTAGGTTTCTTGCCAGGCACCATCGTAGGTTTCTTGCCAGGCACCATC GTAGGTTTCTTGCCAGGCACCATCGTAGGTTTCTTGCC（配列番号２８３）
1 : ACCCCCATTGTGTTGCGTTACCGTGTGGTTGCATAGTTTTTTATGCATATCACTTCT（配列番号２３５）
2: 5'Phos-CTAGCAATATCTATGT（配列番号２３６）
3: ACTACGTCCCCCCATCGTACGATCAGGCGAGGACTCTGACCAGTCTCCAACA（配列番号２３７）
4: CAACACAATGGGGGTACATAGATATTG（配列番号２３８）
6: CCACGAGTTCCTTATCCGTAGGGCTATATTGACACTGTTTTTAGAGATGAAATCTGT（配列番号２３９）
7: CCACGAGTTCCTTATCCGTAGGGCTATATTGACACTGTTTTTAGAGATGAAATCTGT（配列番号２４０）
9: ATAAGGAACTCGTGGACATAGATATTG（配列番号２４１）
10: TGCTTCGTGTGCGACAGAGCTTATCCATTGGCTGGGAGCGGGTCATTGACCC（配列番号２４２）
12: GTCGCACACGAAGCAACATAGATATTG（配列番号２４３）
13: GACAACAAACCTGAAAGAGCTTATCCATTGGCTGGGAGGTGTTGCTCCTGCC（配列番号２４４）
14: GCGGTTGCGTGAACGCAATATCTATGT（配列番号２４５）
15: 5'Phos-CATGACATAGATATTG（配列番号２４６）
16: GACAACAAACCTGAAAGAGCTTATCCATTGGCTGGGAGGTGTTGCTCCTGCC（配列番号２４７）
17: TTCAGGTTTGTTGTCCAATATCTATGT（配列番号２４８）
19: TGCTGCAGGCGCAAGCGTACGATCAGGCGAGGACTCTCCCAACACATAAAGA（配列番号２４９）
20: 5'Phos-CTAGACATAGATATTG（配列番号２５０）
21: CTTGCGCCTGCAGCACAATATCTATGT（配列番号２５１）
22: TATTTCGGCGTTAACCCGTAGGGCTATATTGACACTGTTTTTTGTCAGGGCGTAGCA（配列番号２５２）
23 : ATCGTTGTATGCTAGCCGTAGGGCTATATTGACACTGTTTTTATAGACTAGAACCTT（配列番号２５３）
24: AGCCATGATTACATTCGTTACCGTGTGGTTGCATAGTTTTTTGTTACGCGCAAATTT（配列番号２５４）
25: AATGTAATCATGGCTCAATATCTATGT（配列番号２５５）
27: TCACGCGAAGAGGCTAGAGCTTATCCATTGGCTGGGACCGACATGCTAAAAG（配列番号２５６）
28: AGCCTCTTCGCGTGACAATATCTATGT（配列番号２５７）
30: CTGCGACGCTGAGGCCGTACGATCAGGCGAGGACTCTTAACAGGATGCAAAT（配列番号２５８）
31: 5 'Phos-CTAGACATAGATATTG（配列番号２５９）
32: GCCTCAGCGTCGCAGCAATATCTATGT（配列番号２６０）
33 : ATCGGCATTACGCTTCCGTAGGGCTATATTGACACTGTTTTTATCGGCATTACGCTT（配列番号２６１）
34: AAGCGTAATGCCGATCCGTAGGGCTATATTGACACTGTTTTTTATAACGGGACAACG（配列番号２６２）
35: TCGGGGAGTACCTCTCGTTACCGTGTGGTTGCATAGTTTTTTGTTTTTATTATAGAA（配列番号２６３）
36: AGAGGTACTCCCCGACAATATCTATGT（配列番号２６４）
38: GCGGCTTGATTATATCGTACGATCAGGCGAGGACTCTCCGACGGGCACATAC（配列番号２６５）
40: ATATAATCAAGCCGCCAATATCTATGT（配列番号２６６）
41: ATTCCGCATGAGCGAAGAGCTTATCCATTGGCTGGGATTTGGAGCAGTCCCA（配列番号２６７）
42: TCGCTCATGCGGAATCAATATCTATGT（配列番号２６８）
44: CTAGCATACAACGATCCGTAGGGCTATATTGACACTGTTTTTGGTCGCATGCATCGT（配列番号２６９）
45: GTTAACGCCGAAATACCGTAGGGCTATATTGACACTGTTTTTTGTTCAGCTCCTCCG（配列番号２７０）
46: CAAGTCTGTCGATAACGTTACCGTGTGGTTGCATAGTTTTTTTCTGTAGAGCGGAAT（配列番号２７１）
47: TTATCGACAGACTTGCAATATCTATGT（配列番号２７２）
49: AGTGGCGCTTGCTTACGTACGATCAGGCGAGGACTCTTCTGGCCATCGATAA（配列番号２７３）
51: TAAGCAAGCGCCACTCAATATCTATGT（配列番号２７４）
52: AGACGCCGTGTTGACAGAGCTTATCCATTGGCTGGGAAAAGGCGACAGCATT（配列番号２７５）
53: GTCAACACGGCGTCTCAATATCTATGT（配列番号２７６）
55: GAGTGAAGTAAGAGCCCGTAGGGCTATATTGACACTGTTTTTTGGCGCACATAACTA（配列番号２７７）
56: GCTCTTACTTCACTCCCGTAGGGCTATATTGACACTGTTTTTTGTTCATTTTGGAAT（配列番号２７８）
60: AAAAAACTATGCAACCTGCCTGGCAAGCCTACGATGGGGATAAGCTCT（配列番号２７９）
61: TCCCAGCCAATTGCCTGGCAAGCCTACGATGGTAGCCCTACGG（配列番号２８０）
62: AAAAACAGTGTCAATATGCCTGGCAAGCCTACGATGGCTGATCGTACG（配列番号２８１）
63: AGAGTCCTCGCTGCCTGGCAAGCCTACGATGGACACGGTAACG（配列番号２８２）
64: AGGCACCATCGTAGGTTTCTTGCCAGGCACCATCGTAGGTTTCTTGCCAGGCACCATC GTAGGTTTCTTGCCAGGCACCATCGTAGGTTTCTTGCC（配列番号２８３）
各半球は、８個のバーと、これらのバーを互いに連結する５個のプラス形状のコネクター、すなわち、１個の極コネクター及び４個の赤道コネクターとを含む。コネクターは８個のカスタムメードの合成ＤＮＡ配列を含むのに対し、バーは制限酵素によってλファージＤＮＡから切断されたＤＮＡ断片である。ＤＮＡ球のサイズは、使用されるλＤＮＡのバー断片のサイズの直接的な結果であり、使用されるλＤＮＡのバー断片のサイズは使用される制限酵素によって決まる。片方の半球の４個の赤道コネクターは、もう一方の半球にあるそれぞれのコネクターパートナーに結合するように設計される。
本明細書において、コネクターは、極、南アメリカ、南大西洋、南アジア、南太平洋、北アメリカ、北大西洋、北アジア、北太平洋と称される。
片方の半球の８個の赤道コネクターは、もう一方の半球にあるそれぞれのコネクターパートナーに結合するよう設計され、したがって、コネクター北アメリカはコネクター南アジアに結合し、コネクター北アジアはコネクター南アメリカに結合し、コネクター北太平洋はコネクター南太平洋に結合し、そしてコネクター北大西洋はコネクター南太平洋に結合する。
以下の配列を、コネクターを生成するために使用した。
極コネクター：1, 4, 7, 10, 60, 61, 62, 63, 64
北アメリカコネクター：13, 16, 19, 22, 60, 61, 62, 63, 64
南アメリカコネクター：13, 16, 19, 23, 60, 61, 62, 63, 64
北大西洋コネクター：24, 27, 30, 33, 60, 61, 62, 63, 64
南大西洋コネクター：24, 27, 30, 33, 60, 61, 62, 63, 64
北アジアコネクター：35, 38, 41, 44, 60, 61, 62, 63, 64
南アジアコネクター：35, 38, 41, 45, 60, 61, 62, 63, 64
北太平洋コネクター：46, 49, 52, 55, 60, 61, 62, 63, 64
南太平洋コネクター：46, 49, 52, 56, 60, 61, 62, 63, 64
極コネクター：1, 4, 7, 10, 60, 61, 62, 63, 64
北アメリカコネクター：13, 16, 19, 22, 60, 61, 62, 63, 64
南アメリカコネクター：13, 16, 19, 23, 60, 61, 62, 63, 64
北大西洋コネクター：24, 27, 30, 33, 60, 61, 62, 63, 64
南大西洋コネクター：24, 27, 30, 33, 60, 61, 62, 63, 64
北アジアコネクター：35, 38, 41, 44, 60, 61, 62, 63, 64
南アジアコネクター：35, 38, 41, 45, 60, 61, 62, 63, 64
北太平洋コネクター：46, 49, 52, 55, 60, 61, 62, 63, 64
南太平洋コネクター：46, 49, 52, 56, 60, 61, 62, 63, 64
コネクターを生成するために、１μΜの各コネクター配列を、１２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する１ｘＴＡＥ緩衝液中で、１００μＬの最終体積混合物として混合した。次いで、反応混合物を９５℃に加熱し、続いて４８時間かけて温度を室温まで徐々に下げた。
最初の概念実証のために、４７１６ｂｐのλＤＮＡ断片をバーとして使用した。１００μｇのλファージＤＮＡ（New England BioLabs）を、緩衝液２（New England BioLabs）中、１００μＬの最終体積において、５μｇのＢＳＡと共に１００ＵのＮｈｅＩ（New England BioLabs）及び１５０ＵのＰｃｉＩ（New England BioLabs）を用いて切断した。反応物を３７℃にて１時間インキュベートした。１％アガロース中でのゲル電気泳動に続いて、ＤＮＡ断片をゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Qiagen）を用いて抽出した。
バーがコネクターに連結され得るように、特異的なカスタムメードの合成ＤＮＡ配列を、アダプターとして機能するようにバーに結合させた。以下の配列を使用してアダプターを生成した。
バーを極コネクターに結合するためのアダプターを生成するために使用した配列：
PolAm: 2, 3
PolAt: 2, 6
PolAs: 2, 9
PolPa: 2, 12
PolAm: 2, 3
PolAt: 2, 6
PolAs: 2, 9
PolPa: 2, 12
バーをアメリカコネクターに結合するためのアダプターを生成するために使用した配列：
AmPol: 14, 15
AmAt: 17, 15
AmPa: 2, 21
AmPol: 14, 15
AmAt: 17, 15
AmPa: 2, 21
バーを大西洋コネクターに結合するためのアダプターを生成するために使用した配列：
AtPol: 25, 15
AtAs: 28, 15
AtAm: 2, 32
AtPol: 25, 15
AtAs: 28, 15
AtAm: 2, 32
バーをアジアコネクターに結合するためのアダプターを生成するために使用した配列：
AsPol: 36, 15
AsAt: 2, 40
AsPa: 42, 15
AsPol: 36, 15
AsAt: 2, 40
AsPa: 42, 15
バーを太平洋コネクターに結合するためのアダプターを生成するために使用した配列：
PaPol: 47, 15
PaAs: 2, 51
PaAm: 53, 15
PaPol: 47, 15
PaAs: 2, 51
PaAm: 53, 15
リン酸化された配列からは１００ｎＭの最終濃度を用い、相補的なリン酸化されていない配列からは２００ｎＭの最終濃度を用いて、１ｘＴＡＥ緩衝液の２５μＬの最終体積において、アダプターを生成した。混合物を、室温にて５分間維持した。
１ｘＴ４リガーゼ緩衝液（biffer）（New England BioLabs）において１０００ＵのＴ４リガーゼ（New England BioLabs）を含有するライゲーション反応混合物中で、１１３ｎｍｏｌのバーを１１３ｎｍｏｌのアダプターと混合する。反応物を、室温にて１０分間インキュベートした。１％アガロース中でのゲル電気泳動に続いて、ＤＮＡ断片をゲルから切り出し、QIAquickゲル抽出キット（Qiagen）を用いて抽出した。
各ライゲーション反応物は、バーを以下のアダプターと共に含有する。
Bar1: PolAm, AmPol
Bar2: PolAt, AtPol
Bar3: PolAs, AsPol
Bar4: PolPa, PaPol
Bar5: AmAt, AtAm
Bar6: AmPa, PaAm
Bar7: AtAs, AsAt
Bar8: AsPa, PaAs
Bar1: PolAm, AmPol
Bar2: PolAt, AtPol
Bar3: PolAs, AsPol
Bar4: PolPa, PaPol
Bar5: AmAt, AtAm
Bar6: AmPa, PaAm
Bar7: AtAs, AsAt
Bar8: AsPa, PaAs
半球は、１２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する１ｘＴＡＥ緩衝液中で、１．８ｎＭの最終濃度の各バー及び１．８μＬの各コネクターを用いて生成した。反応混合物を、室温にて５時間インキュベートした。
北半球を生成するための反応混合物は以下のものを含んでいた。
極コネクター、北アメリカコネクター、北太平洋コネクター、北アジアコネクター、北大西洋コネクター、Ｂａｒｌ、Ｂａｒ２、Ｂａｒ３、Ｂａｒ４、Ｂａｒ５、Ｂａｒ６、Ｂａｒ７、Ｂａｒ８。
極コネクター、北アメリカコネクター、北太平洋コネクター、北アジアコネクター、北大西洋コネクター、Ｂａｒｌ、Ｂａｒ２、Ｂａｒ３、Ｂａｒ４、Ｂａｒ５、Ｂａｒ６、Ｂａｒ７、Ｂａｒ８。
南半球を生成するための反応混合物は以下のものを含んでいた。
極コネクター、南アメリカコネクター、南太平洋コネクター、南アジアコネクター、南大西洋コネクター、Ｂａｒｌ、Ｂａｒ２、Ｂａｒ３、Ｂａｒ４、Ｂａｒ５、Ｂａｒ６、Ｂａｒ７、Ｂａｒ８。
極コネクター、南アメリカコネクター、南太平洋コネクター、南アジアコネクター、南大西洋コネクター、Ｂａｒｌ、Ｂａｒ２、Ｂａｒ３、Ｂａｒ４、Ｂａｒ５、Ｂａｒ６、Ｂａｒ７、Ｂａｒ８。
等量の北半球及び南半球を混合して全球を作製した。混合物を、室温にて１時間インキュベートした。
プラス形状のコネクターは、湾曲を有して球形状を促進するように設計される。さらに、各コネクターは、球の外側に摂動を起こさせる２つのＤＮＡ配列、及び球の内側に摂動を起こさせる２つのＤＮＡ配列を有する。外側に面した配列は、トラップを方向付ける部分（例えば、組織特異的抗体）を球に結合するために用いられる。内側に面した配列は、活性薬剤を球に結合するために用いられる。４つのＤＮＡ配列が、これらの内側摂動配列に結合し、自己凝集によってＤＮＡメッシュを作り、これにより活性薬剤結合部位の数を増加させるように設計される。
MESH1: CGCTATACGTGTTCACCGCTTGCTAGCAGT（配列番号２８４）
MESH2: CGCTATAGCAAGCGGACTCTGGCCTTCGAT（配列番号２８５）
MESH3: CGCTATAGCCAGAGTGGAAGGCGAGGATCA（配列番号２８６）
MESH4: CGCTATACGCCTTCCTGAACACGGTTACAG（配列番号２８７）
MESH1: CGCTATACGTGTTCACCGCTTGCTAGCAGT（配列番号２８４）
MESH2: CGCTATAGCAAGCGGACTCTGGCCTTCGAT（配列番号２８５）
MESH3: CGCTATAGCCAGAGTGGAAGGCGAGGATCA（配列番号２８６）
MESH4: CGCTATACGCCTTCCTGAACACGGTTACAG（配列番号２８７）
シートの末端配列を、５’末端にアミノ基を有するように改変されたＤＮＡ配列によってキャップして、そのアミノ基のビオチン化によってか、又はそのアミノ基への活性薬剤の直接連結によって、活性薬剤の容易な結合を促進する。
LOL1: 5'-AmMC6-TTTCTGTAAC（配列番号２８８）
LOL2: 5'-AmMC6-TTTACTGCTA（配列番号２８９）
LOL3: 5'-AmMC6-TTTATCGAAG（配列番号２９０）
LOL4: 5'-AmMC6-TTTTGATCCT（配列番号２９１）
LOL1: 5'-AmMC6-TTTCTGTAAC（配列番号２８８）
LOL2: 5'-AmMC6-TTTACTGCTA（配列番号２８９）
LOL3: 5'-AmMC6-TTTATCGAAG（配列番号２９０）
LOL4: 5'-AmMC6-TTTTGATCCT（配列番号２９１）
最初に、メッシュ配列ＭＥＳＨ１〜４を等モル比で加え、続いて室温にて１時間インキュベートした。次いで、５’−アミノ改変配列を等モル比で加え、続いて室温にて３０分間インキュベートした。
実施例１１
ＤＮＡ折り紙足場キューブ
ＤＮＡ折り紙技術を用いて、三次元のＤＮＡキューブを構築した。キューブ形状は、互いに繋がるように設計された４個の３本腕の角部で構成される。この形状は、Ｍ１３ファージ一本鎖ＤＮＡゲノム（Taxonomy ID: 10870）配列、及び１９１個のカスタムメードの一本鎖ＤＮＡステープルで構成される。このキューブを構築するために使用したＤＮＡステープルを列挙する。
2 CCAACGTCAATTCCAGTTCCCTTAAGCA（配列番号２９２）
GGTTCCGAAATCGGCAAAATTGGAACAGGGATACCTCAGAGCCACCACC（配列番号２９３）
6 GTCCACGCTGGTGTTAGCGTA（配列番号２９４）
7 GGCTGGCCCTCTTTTCAGCGC（配列番号２９５）
8 CTGATTGCCCTTCACCGCCGAAAATCATTCCACCAGTACAAACTACAAC（配列番号２９６）
9 GGGCGCCAGGGTACTTTCAAC（配列番号２９７）
10 GGGAGTCGGGTGAGCTATACG（配列番号２９８）
CATTAATGAATCGGCCAACCCAGTGATGTATGGTCCAGACGTTAGTAAA（配列番号２９９）
12 CGCTCACTGCCCAATCTCCAA（配列番号３００）
GCCTGGGGTGCCTAATGAGAAACCTGTAATAATAAGGAACAACTAAAGG（配列番号３０１）
14 CTCACAATTCCAACAGCTTGA（配列番号３０２）
15 AGCTGTTTCCAGGATCCAACG（配列番号３０３）
16 TCGTAATCATGGTCATAGCCGGAAGCCTTTCGATTAATTGTATCGGTTT（配列番号３０４）
17 GCCTGCAGGTCGCTTGCAGGG（配列番号３０５）
18 ACGATTAAGTTTCGCTAAGGT（配列番号３０６）
19 CCCAGTCACGACGTTGTAACCGGGTACGATATAACAACAACCATCGCCC（配列番号３０７）
20 GGGGATGTGCTGCGGCTACAG（配列番号３０８）
21 GGCCTCTGGGTAAGCATCGGTCGTCACCCTCAGCAG（配列番号３０９）
22 GGAAGGGCGAGCGCATCATGTGAGTGTATAAG（配列番号３１０）
23 ATTCAGGCTGGCCAGTTGCCAGCTTGTAAAC（配列番号３１１）
24 ACCAGGCAAAGCAGTATCTTCGCGTAAAATTC（配列番号３１２）
25 TTCCGGCACCGCTTCTCGCACTCTAGGAACTTAAATC（配列番号３１３）
26 GGATTGACCGTACTCCATGTT（配列番号３１４）
27 CACTCGGATTAAGCCCCAAAA（配列番号３１５）
28 CAACCCGGTTGGTGTGTG（配列番号３１６）
29 TCCTGTATGAGGGGGAAA（配列番号３１７）
31 TGATAATCAGAACTCCGTGGGAACAAACGGC（配列番号３１８）
32 ACAAGCATGTCGGTCAAACCAGAAATTACCTTATGC（配列番号３１９）
33 CAAATAATGAACGAACTGACAGGCTTGC（配列番号３２０）
34 AATTTCATCAACATTAAGTAACCGTTGTATCAACGGGTAAAA（配列番号３２１）
35 GTTAATACTGGAGCGACAGATAAGCTGCTCATTCAAAAGAATTATTTCA（配列番号３２２）
36 GCATTAAATCAGGTCCAGGCGATTACCCAAATCAAAATA（配列番号３２３）
38 GCTATTTTTGGCCATCAAAAATAAGGCCTCACCCAGCGAAACGAA（配列番号３２４）
40 TAATGTGTAGGTATGTACCCCGGT（配列番号３２５）
41 CAAAAGGCATATATTAGCATTTTGGGGCATAAAACGAACT（配列番号３２６）
42 GACAGTGATAAAACATACAGG（配列番号３２７）
43 TATGATAAAGCCTTTAGCAAAA（配列番号３２８）
44 ACCTGAGAGTTTTTGTTCTGGCCT（配列番号３２９）
45 AACCCTGTGAGAATAAAACTGGAAGATCGAGTAA（配列番号３３０）
46 ACGCAAGCAAATCAAGAATCGTTTA（配列番号３３１）
47 GTACCAAAAACATTATGACATTAATGAAAG（配列番号３３２）
48 TCAATTCTACTATAAATTGGAAC（配列番号３３３）
49 TAGTTTAAATGCAATGCCTGAG（配列番号３３４）
50 CAAGGCGTGAATACAACTTTCGGAGATTGCATCTCGCAACTGTTG（配列番号３３５）
51 TTAAGCCGTAACAGAACGGTCAAGCGCACGACGACGCCATTCGCC（配列番号３３６）
52 AAGTACTTTTGCGGGAGTTCA（配列番号３３７）
53 CATAAAGATATTCCATAGGCTTTGACCGGAAGATGGTGCCGGAA（配列番号３３８）
54 CTATATTTTCATAACATCCGAGAAACTCATAAGGATA（配列番号３３９）
55 ATTAGATACATTGAAAAGGTGGCA（配列番号３４０）
56 AACCCATATAATGTTTTTACCAGACGACG（配列番号３４１）
57 TCCCAATTCTAACCTGTTTAG（配列番号３４２）
58 GGTGTCTGGAAGAGGTAGAAAAA（配列番号３４３）
59 ATTGAGTAGATTTAGTTTGACC（配列番号３４４）
60 ACACAGTTGAT（配列番号３４５）
61 TAATTGCTGAATCAACTAAAGTAC（配列番号３４６）
62 TGGCTTAGAGCT（配列番号３４７）
63 TTTCTTTAATAACCAGATAAACAGTTCAG（配列番号３４８）
64 TGATAAGAGCA（配列番号３４９）
65 GGTCAGGATTAGGAGGCTTTCAT（配列番号３５０）
66 CGTGCTCCTTT（配列番号３５１）
67 ATATCGCGTTTTCAAACTCCAACA（配列番号３５２）
68 CTTCAATTAAGAGAGCAAAGCGGATTGCA（配列番号３５３）
71 AAAACGAGAATGACCATAAAGTCAGAGAAGCCCGAAAGACTTCAA（配列番号３５４）
73 GTCGGGTAATAGTAAAAATAGCGAAGAGTACTTGCGGA（配列番号３５５）
74 ATAGCGTCCAATACTGCGGAATGCTTCCGGAAGAATTCGAG（配列番号３５６）
75 TTTTGCCAGAGGATAAATATT（配列番号３５７）
76 ATAAAAACCAAATGTTTAGACTGG（配列番号３５８）
77 GCAACACTATTGCAAAAGAAG（配列番号３５９）
78 AACACGAGGCAATACCACATTCAATTATTACTTTC（配列番号３６０）
79 GTTAAATATGATAATGCTGTAGCTGTCA（配列番号３６１）
80 CATAACGCCAAAAGGAATTCCTC（配列番号３６２）
81 TTGAGATTTAGGATAGTAAGA（配列番号３６３）
82 AACGGAACAACACTAATGCAGATA（配列番号３６４）
83 GTTGGGAAGAAGATTCATCAG（配列番号３６５）
84 ATCTTATACCTTTAATCATTGTGACGAGTAGATAG（配列番号３６６）
85 TTAGCGAGCTTCGCAAATGGTCAATGCG（配列番号３６７）
86 GATTTTAAGAACTGGCTCATACG（配列番号３６８）
87 TTTAATTTCAACAGTCAGGAC（配列番号３６９）
88 CCTGACAATAAATATTTTTAG（配列番号３７０）
89 GTAATCTTGACAAGAACCGGCTAAATCGGTT（配列番号３７１）
90 ACTTAGCCGGGCTTGAGATGG（配列番号３７２）
91 GAGCGACCTGATGGGATTTACGCCAGCTGGCGAAAG（配列番号３７３）
92 AGACATTGCCGTTCTAGCTGATAACCTGTAACCTCAGAG（配列番号３７４）
93 CCGGCGCAGACAATCATAAAGATT（配列番号３７５）
94 TCGTTCATGAGGAAGTTAAAGACACGCCAGGGTTTT（配列番号３７６）
95 AATTAGATGGTCGGTGCG（配列番号３７７）
96 CAACACTACGAAGGCACCAACCTAATTATACGTAC（配列番号３７８）
97 AAAACACTCATCTGGCTGAGATCTACCCGGAGAGGGTAGCTA（配列番号３７９）
98 AGGCTTTGAGGACTAAGTAGCAACAAGGCGGCCAGTGCCAAGCTTGCAT（配列番号３８０）
99 TACGTAATGCAGTACAAGAAAGAGAAACAAGCCATCAA（配列番号３８１）
100 AGAGGCAAAAGAATACACT（配列番号３８２）
101 CGTCCATTAATCGCCTGGAACCGGTAATCGAGGCCGGA（配列番号３８３）
102 AGTTAAAGGCCGCTTTGCTGAGGACTCTAGTGTGTGAAATTGTTATCCG（配列番号３８４）
103 GGAAACGAGGAGACTTTAAAT（配列番号３８５）
104 ACGCATAACCCGAGCTCGAAT（配列番号３８６）
105 TACCGATAGTTGCGCCTTCTTAACACAACAACTCACATTAATTGCGTTG（配列番号３８７）
106 AATGACAATGTTCGGTCTGCG（配列番号３８８）
107 ATCAGCTTGATAAAGTGTAAA（配列番号３８９）
108 AAAAAAGGCTCCAAAACGTTGAAGCTTTCCGAGAGGCGGTTTGCGTATT（配列番号３９０）
109 AATTGCGAATCGTGCCAGCTG（配列番号３９１）
110 AGTTTCAGCGGAGTGACTAAACAGGTTTTTGAGAGAGTTGCAGCAAGCG（配列番号３９２）
111 AGATTTTTCAGGAGCCTGGTG（配列番号３９３）
112 TGAATTTTCGACGGGCAACAG（配列番号３９４）
113 ACGATCTAAAGTTTTGCCTCATATTGCCCCTAAATCAAAAGAATAGCCC（配列番号３９５）
114 AGCTCGTCTTGATTTTGGAAT（配列番号３９６）
115 GCCTGTAGCCTGTTTGATGGT（配列番号３９７）
116 ACCGTAACACTGAGTTCAATAGGAGTGTTGAGGGCGAAAAA（配列番号３９８）
117 CTCATTTTCAAGAGTCCACTA（配列番号４００）
118 TTTTTTTTCTCAGAACGT（配列番号４０１）
119 AACCGCCACGCAAGCCTCGTCACAGAC（配列番号４０２）
120 CATTGAATCATCAGGTCTCGCAAGAAAGTCGGGACGAGT（配列番号４０３）
121 CATATTCTGTGTAAACCAGAGTCAAAAAGAAG（配列番号４０４）
122 AGCGACGATCTCGGACCCGCATTACCCTGACTATTATATCAAAACCCCTCAAATC（配列番号４０５）
123 CATTGAATCATCAGGTCTCACGGCAAGATAACTGCGGAT（配列番号４０６）
124 CCTTCCCACCGCCTAGCGAGTTCAAAAAGAAG（配列番号４０７）
125 GTCTAGGAAGTCTTCTACCTGTTACCCTGACTATTATATCAAAACCCCTCAAATC（配列番号４０８）
126 CATTGAATCATCAGGTCTTACTATGGGAGACGTTTCTCC（配列番号４０９）
127 TATAGGGCCGGCTTCATAGAGTCAAAAAGAAG（配列番号４１０）
128 CCTGACTGAAAGTTACTCTTTTTACCCTGACTATTATATCAAAACCCCTCAAATC（配列番号４１１）
129 CATTGAATCATCAGGTCTTTTCTTGTGGACTCTAGACCT（配列番号４１２）
130 ACTTTAGACGCCCCACCTTTATCAAAAAGAAG（配列番号４１３）
131 CAACGCAGCCACGAAGCACTATTACCCTGACTATTATATCAAAACCCCTCAAATC（配列番号４１４）
132 CATTGAATCATCAGGTCTTATCCCTCGGTCAGAGAAACT（配列番号４１５）
133 GATATGGTTCTATTACGCTCATCAAAAAGAAG（配列番号４１６）
134 GCGTCTACGGTAAACATAAGCTTACCCTGACTATTATATCAAAACCCCTCAAATC（配列番号４１７）
135 CATTGAATCATCAGGTCTTCATGCTATCACACCATGTCG（配列番号４１８）
136 GTCGGGCAGAAATATGGATCGTCAAAAAGAAG（配列番号４１９）
137 ACTTCGTGGTGACTGACGGTATTACCCTGACTATTATATCAAAACCCCTCAAATC（配列番号４２０）
138 CATTGAATCATCAGGTCTTGAGGATGTAGTGTTGCTCAC（配列番号４２１）
139 CTCCGTGATTCCTATAGCAGGTCAAAAAGAAG（配列番号４２２）
140 AGCGAAAGCAAGGTGACTTGTTTACCCTGACTATTATATCAAAACCCCTCAAATC（配列番号４２３）
141 CATTGAATCATCAGGTCTATCTCCGCCGAAAAGTTCAGT（配列番号４２４）
142 ACACCCTGGGCAAGTGCCAGCTCAAAAAGAAG（配列番号４２５）
143 GCTCGAATTCGAACCATTCCTTTACCCTGACTATTATATCAAAACCCCTCAAATC（配列番号４２６）
144 AGCTCATTTGTCGCTGGGGTGCTGGCGTCC（配列番号４２７）
145 GTTACGTCTATCTGGGGAGGCTTTAACCAACAGCCAGCT（配列番号４２８）
146 GGTAGTCGCGAACACGCGAAGTTTTTGAGACCTTCATCAAGA（配列番号４２９）
147 AGCTCATTTGTATTTGTATTTGAGGAAAGGCCCTGC（配列番号４３０）
148 ATTATGGGTGTACGGACGCTATTTAACCAACAGCCAGCT（配列番号４３１）
149 GCTCAACCTGCTTTTCTGCTGTTTTTGAGACCTTCATCAAGA（配列番号４３２）
150 AGCTCATTTGCAGGGCCTTTCCTCAAATAC（配列番号４３３）
151 TAGCGTCCGTACACCCATAATTTTAACCAACAGCCAGCT（配列番号４３４）
152 CAGCAGAAAAGCAGGTTGAGCTTTTTGAGACCTTCATCAAGA（配列番号４３５）
153 AGCTCATTTGGACGCCAGCACCCCAGCGAC（配列番号４３６）
154 GCCTCCCCAGATAGACGTAACTTTAACCAACAGCCAGCT（配列番号４３７）
155 CTTCGCGTGTTCGCGACTACCTTTTTGAGACCTTCATCAAGA（配列番号４３８）
156 AGCTCATTTGTTGACGGCGTTCTCACAGAA（配列番号４３９）
157 GATATTTCTCATTTTCTTCACTTTAACCAACAGCCAGCT（配列番号４４０）
158 CTACATGTACTGATAAGTGCTTTTTTGAGACCTTCATCAAGA（配列番号４４１）
159 AGCTCATTTACTGCCTTTACAATATCAATG（配列番号４４２）
160 GATATTTCTCATTTTCTTCACTTTAACCAACAGCCAGCT（配列番号４４３）
161 CCTCAAATGCTCGCACTTTTATTTTTGAGACCTTCATCAAGA（配列番号４４４）
162 AGCTCATTTCATTGATATTGTAAAGGCAGT（配列番号４４５）
163 GTGAAGAAAATGAGAAATATCTTTAACCAACAGCCAGCT（配列番号４４６）
164 TAAAAGTGCGAGCATTTGAGGTTTTTGAGACCTTCATCAAGA（配列番号４４７）
165 AGCTCATTTTTCTGTGAGAACGCCGTCAAC（配列番号４４８）
166 ATAATTAACTGGGTACCTCTATTTAACCAACAGCCAGCT（配列番号４４９）
167 AGCACTTATCAGTACATGTAGTTTTTGAGACCTTCATCAAGA（配列番号４５０）
168 CCGTCTATCAATCCGCAGTTATCTTGCCGTG（配列番号４５１）
169 ACTCGCTAGGCGGTGGGAAGGTTAAAGAACGTGGACT（配列番号４５２）
170 CAGGTAGAAGACTTCCTAGACGAGATAGGGTTGAACCCATCGCCACCCTCAG（配列番号４５３）
171 CCGTCTATCACGACATGGTGTGATAGCATGA（配列番号４５４）
172 CGATCCATATTTCTGCCCGACTTAAAGAACGTGGACT（配列番号４５５）
173 TACCGTCAGTCACCACGAAGTCGAGATAGGGTTGAACCCATCGCCACCCTCAG（配列番号４５６）
174 CCGTCTATCAAGGTCTAGAGTCCACAAGAAA（配列番号４５７）
175 TAAAGGTGGGGCGTCTAAAGTTTAAAGAACGTGGACT（配列番号４５８）
176 TAGTGCTTCGTGGCTGCGTTGGAGATAGGGTTGAACCCATCGCCACCCTCAG（配列番号４５９）
177 CCGTCTATCAACTGAACTTTTCGGCGGAGAT（配列番号４６０）
178 GCTGGCACTTGCCCAGGGTGTTTAAAGAACGTGGACT（配列番号４６１）
179 AGGAATGGTTCGAATTCGAGCGAGATAGGGTTGAACCCATCGCCACCCTCAG（配列番号４６２）
180 CCGTCTATCAACTCGTCCCGACTTTCTTGCG（配列番号４６３）
181 CTCTGGTTTACACAGAATATGTTAAAGAACGTGGACT（配列番号４６４）
182 TGCGGGTCCGAGATCGTCGCTGAGATAGGGTTGAACCCATCGCCACCCTCAG（配列番号４６５）
183 CCGTCTATCAAGTTTCTCTGACCGAGGGATA（配列番号４６６）
184 TGAGCGTAATAGAACCATATCTTAAAGAACGTGGACT（配列番号４６７）
185 GCTTATGTTTACCGTAGACGCGAGATAGGGTTGAACCCATCGCCACCCTCAG（配列番号４６８）
186 CCGTCTATCAGGAGAAACGTCTCCCATAGTA（配列番号４６９）
187 CTCTATGAAGCCGGCCCTATATTAAAGAACGTGGACT（配列番号４７０）
188 AAAGAGTAACTTTCAGTCAGGGAGATAGGGTTGAACCCATCGCCACCCTCAG（配列番号４７１）
189 CCGTCTATCAGTGAGCAACACTACATCCTCA（配列番号４７２）
190 CCTGCTATAGGAATCACGGAGTTAAAGAACGTGGACT（配列番号４７３）
191 ACAAGTCACCTTGCTTTCGCTGAGATAGGGTTGAACCCATCGCCACCCTCAG（配列番号３９９）
ＤＮＡ折り紙足場キューブ
ＤＮＡ折り紙技術を用いて、三次元のＤＮＡキューブを構築した。キューブ形状は、互いに繋がるように設計された４個の３本腕の角部で構成される。この形状は、Ｍ１３ファージ一本鎖ＤＮＡゲノム（Taxonomy ID: 10870）配列、及び１９１個のカスタムメードの一本鎖ＤＮＡステープルで構成される。このキューブを構築するために使用したＤＮＡステープルを列挙する。
2 CCAACGTCAATTCCAGTTCCCTTAAGCA（配列番号２９２）
GGTTCCGAAATCGGCAAAATTGGAACAGGGATACCTCAGAGCCACCACC（配列番号２９３）
6 GTCCACGCTGGTGTTAGCGTA（配列番号２９４）
7 GGCTGGCCCTCTTTTCAGCGC（配列番号２９５）
8 CTGATTGCCCTTCACCGCCGAAAATCATTCCACCAGTACAAACTACAAC（配列番号２９６）
9 GGGCGCCAGGGTACTTTCAAC（配列番号２９７）
10 GGGAGTCGGGTGAGCTATACG（配列番号２９８）
CATTAATGAATCGGCCAACCCAGTGATGTATGGTCCAGACGTTAGTAAA（配列番号２９９）
12 CGCTCACTGCCCAATCTCCAA（配列番号３００）
GCCTGGGGTGCCTAATGAGAAACCTGTAATAATAAGGAACAACTAAAGG（配列番号３０１）
14 CTCACAATTCCAACAGCTTGA（配列番号３０２）
15 AGCTGTTTCCAGGATCCAACG（配列番号３０３）
16 TCGTAATCATGGTCATAGCCGGAAGCCTTTCGATTAATTGTATCGGTTT（配列番号３０４）
17 GCCTGCAGGTCGCTTGCAGGG（配列番号３０５）
18 ACGATTAAGTTTCGCTAAGGT（配列番号３０６）
19 CCCAGTCACGACGTTGTAACCGGGTACGATATAACAACAACCATCGCCC（配列番号３０７）
20 GGGGATGTGCTGCGGCTACAG（配列番号３０８）
21 GGCCTCTGGGTAAGCATCGGTCGTCACCCTCAGCAG（配列番号３０９）
22 GGAAGGGCGAGCGCATCATGTGAGTGTATAAG（配列番号３１０）
23 ATTCAGGCTGGCCAGTTGCCAGCTTGTAAAC（配列番号３１１）
24 ACCAGGCAAAGCAGTATCTTCGCGTAAAATTC（配列番号３１２）
25 TTCCGGCACCGCTTCTCGCACTCTAGGAACTTAAATC（配列番号３１３）
26 GGATTGACCGTACTCCATGTT（配列番号３１４）
27 CACTCGGATTAAGCCCCAAAA（配列番号３１５）
28 CAACCCGGTTGGTGTGTG（配列番号３１６）
29 TCCTGTATGAGGGGGAAA（配列番号３１７）
31 TGATAATCAGAACTCCGTGGGAACAAACGGC（配列番号３１８）
32 ACAAGCATGTCGGTCAAACCAGAAATTACCTTATGC（配列番号３１９）
33 CAAATAATGAACGAACTGACAGGCTTGC（配列番号３２０）
34 AATTTCATCAACATTAAGTAACCGTTGTATCAACGGGTAAAA（配列番号３２１）
35 GTTAATACTGGAGCGACAGATAAGCTGCTCATTCAAAAGAATTATTTCA（配列番号３２２）
36 GCATTAAATCAGGTCCAGGCGATTACCCAAATCAAAATA（配列番号３２３）
38 GCTATTTTTGGCCATCAAAAATAAGGCCTCACCCAGCGAAACGAA（配列番号３２４）
40 TAATGTGTAGGTATGTACCCCGGT（配列番号３２５）
41 CAAAAGGCATATATTAGCATTTTGGGGCATAAAACGAACT（配列番号３２６）
42 GACAGTGATAAAACATACAGG（配列番号３２７）
43 TATGATAAAGCCTTTAGCAAAA（配列番号３２８）
44 ACCTGAGAGTTTTTGTTCTGGCCT（配列番号３２９）
45 AACCCTGTGAGAATAAAACTGGAAGATCGAGTAA（配列番号３３０）
46 ACGCAAGCAAATCAAGAATCGTTTA（配列番号３３１）
47 GTACCAAAAACATTATGACATTAATGAAAG（配列番号３３２）
48 TCAATTCTACTATAAATTGGAAC（配列番号３３３）
49 TAGTTTAAATGCAATGCCTGAG（配列番号３３４）
50 CAAGGCGTGAATACAACTTTCGGAGATTGCATCTCGCAACTGTTG（配列番号３３５）
51 TTAAGCCGTAACAGAACGGTCAAGCGCACGACGACGCCATTCGCC（配列番号３３６）
52 AAGTACTTTTGCGGGAGTTCA（配列番号３３７）
53 CATAAAGATATTCCATAGGCTTTGACCGGAAGATGGTGCCGGAA（配列番号３３８）
54 CTATATTTTCATAACATCCGAGAAACTCATAAGGATA（配列番号３３９）
55 ATTAGATACATTGAAAAGGTGGCA（配列番号３４０）
56 AACCCATATAATGTTTTTACCAGACGACG（配列番号３４１）
57 TCCCAATTCTAACCTGTTTAG（配列番号３４２）
58 GGTGTCTGGAAGAGGTAGAAAAA（配列番号３４３）
59 ATTGAGTAGATTTAGTTTGACC（配列番号３４４）
60 ACACAGTTGAT（配列番号３４５）
61 TAATTGCTGAATCAACTAAAGTAC（配列番号３４６）
62 TGGCTTAGAGCT（配列番号３４７）
63 TTTCTTTAATAACCAGATAAACAGTTCAG（配列番号３４８）
64 TGATAAGAGCA（配列番号３４９）
65 GGTCAGGATTAGGAGGCTTTCAT（配列番号３５０）
66 CGTGCTCCTTT（配列番号３５１）
67 ATATCGCGTTTTCAAACTCCAACA（配列番号３５２）
68 CTTCAATTAAGAGAGCAAAGCGGATTGCA（配列番号３５３）
71 AAAACGAGAATGACCATAAAGTCAGAGAAGCCCGAAAGACTTCAA（配列番号３５４）
73 GTCGGGTAATAGTAAAAATAGCGAAGAGTACTTGCGGA（配列番号３５５）
74 ATAGCGTCCAATACTGCGGAATGCTTCCGGAAGAATTCGAG（配列番号３５６）
75 TTTTGCCAGAGGATAAATATT（配列番号３５７）
76 ATAAAAACCAAATGTTTAGACTGG（配列番号３５８）
77 GCAACACTATTGCAAAAGAAG（配列番号３５９）
78 AACACGAGGCAATACCACATTCAATTATTACTTTC（配列番号３６０）
79 GTTAAATATGATAATGCTGTAGCTGTCA（配列番号３６１）
80 CATAACGCCAAAAGGAATTCCTC（配列番号３６２）
81 TTGAGATTTAGGATAGTAAGA（配列番号３６３）
82 AACGGAACAACACTAATGCAGATA（配列番号３６４）
83 GTTGGGAAGAAGATTCATCAG（配列番号３６５）
84 ATCTTATACCTTTAATCATTGTGACGAGTAGATAG（配列番号３６６）
85 TTAGCGAGCTTCGCAAATGGTCAATGCG（配列番号３６７）
86 GATTTTAAGAACTGGCTCATACG（配列番号３６８）
87 TTTAATTTCAACAGTCAGGAC（配列番号３６９）
88 CCTGACAATAAATATTTTTAG（配列番号３７０）
89 GTAATCTTGACAAGAACCGGCTAAATCGGTT（配列番号３７１）
90 ACTTAGCCGGGCTTGAGATGG（配列番号３７２）
91 GAGCGACCTGATGGGATTTACGCCAGCTGGCGAAAG（配列番号３７３）
92 AGACATTGCCGTTCTAGCTGATAACCTGTAACCTCAGAG（配列番号３７４）
93 CCGGCGCAGACAATCATAAAGATT（配列番号３７５）
94 TCGTTCATGAGGAAGTTAAAGACACGCCAGGGTTTT（配列番号３７６）
95 AATTAGATGGTCGGTGCG（配列番号３７７）
96 CAACACTACGAAGGCACCAACCTAATTATACGTAC（配列番号３７８）
97 AAAACACTCATCTGGCTGAGATCTACCCGGAGAGGGTAGCTA（配列番号３７９）
98 AGGCTTTGAGGACTAAGTAGCAACAAGGCGGCCAGTGCCAAGCTTGCAT（配列番号３８０）
99 TACGTAATGCAGTACAAGAAAGAGAAACAAGCCATCAA（配列番号３８１）
100 AGAGGCAAAAGAATACACT（配列番号３８２）
101 CGTCCATTAATCGCCTGGAACCGGTAATCGAGGCCGGA（配列番号３８３）
102 AGTTAAAGGCCGCTTTGCTGAGGACTCTAGTGTGTGAAATTGTTATCCG（配列番号３８４）
103 GGAAACGAGGAGACTTTAAAT（配列番号３８５）
104 ACGCATAACCCGAGCTCGAAT（配列番号３８６）
105 TACCGATAGTTGCGCCTTCTTAACACAACAACTCACATTAATTGCGTTG（配列番号３８７）
106 AATGACAATGTTCGGTCTGCG（配列番号３８８）
107 ATCAGCTTGATAAAGTGTAAA（配列番号３８９）
108 AAAAAAGGCTCCAAAACGTTGAAGCTTTCCGAGAGGCGGTTTGCGTATT（配列番号３９０）
109 AATTGCGAATCGTGCCAGCTG（配列番号３９１）
110 AGTTTCAGCGGAGTGACTAAACAGGTTTTTGAGAGAGTTGCAGCAAGCG（配列番号３９２）
111 AGATTTTTCAGGAGCCTGGTG（配列番号３９３）
112 TGAATTTTCGACGGGCAACAG（配列番号３９４）
113 ACGATCTAAAGTTTTGCCTCATATTGCCCCTAAATCAAAAGAATAGCCC（配列番号３９５）
114 AGCTCGTCTTGATTTTGGAAT（配列番号３９６）
115 GCCTGTAGCCTGTTTGATGGT（配列番号３９７）
116 ACCGTAACACTGAGTTCAATAGGAGTGTTGAGGGCGAAAAA（配列番号３９８）
117 CTCATTTTCAAGAGTCCACTA（配列番号４００）
118 TTTTTTTTCTCAGAACGT（配列番号４０１）
119 AACCGCCACGCAAGCCTCGTCACAGAC（配列番号４０２）
120 CATTGAATCATCAGGTCTCGCAAGAAAGTCGGGACGAGT（配列番号４０３）
121 CATATTCTGTGTAAACCAGAGTCAAAAAGAAG（配列番号４０４）
122 AGCGACGATCTCGGACCCGCATTACCCTGACTATTATATCAAAACCCCTCAAATC（配列番号４０５）
123 CATTGAATCATCAGGTCTCACGGCAAGATAACTGCGGAT（配列番号４０６）
124 CCTTCCCACCGCCTAGCGAGTTCAAAAAGAAG（配列番号４０７）
125 GTCTAGGAAGTCTTCTACCTGTTACCCTGACTATTATATCAAAACCCCTCAAATC（配列番号４０８）
126 CATTGAATCATCAGGTCTTACTATGGGAGACGTTTCTCC（配列番号４０９）
127 TATAGGGCCGGCTTCATAGAGTCAAAAAGAAG（配列番号４１０）
128 CCTGACTGAAAGTTACTCTTTTTACCCTGACTATTATATCAAAACCCCTCAAATC（配列番号４１１）
129 CATTGAATCATCAGGTCTTTTCTTGTGGACTCTAGACCT（配列番号４１２）
130 ACTTTAGACGCCCCACCTTTATCAAAAAGAAG（配列番号４１３）
131 CAACGCAGCCACGAAGCACTATTACCCTGACTATTATATCAAAACCCCTCAAATC（配列番号４１４）
132 CATTGAATCATCAGGTCTTATCCCTCGGTCAGAGAAACT（配列番号４１５）
133 GATATGGTTCTATTACGCTCATCAAAAAGAAG（配列番号４１６）
134 GCGTCTACGGTAAACATAAGCTTACCCTGACTATTATATCAAAACCCCTCAAATC（配列番号４１７）
135 CATTGAATCATCAGGTCTTCATGCTATCACACCATGTCG（配列番号４１８）
136 GTCGGGCAGAAATATGGATCGTCAAAAAGAAG（配列番号４１９）
137 ACTTCGTGGTGACTGACGGTATTACCCTGACTATTATATCAAAACCCCTCAAATC（配列番号４２０）
138 CATTGAATCATCAGGTCTTGAGGATGTAGTGTTGCTCAC（配列番号４２１）
139 CTCCGTGATTCCTATAGCAGGTCAAAAAGAAG（配列番号４２２）
140 AGCGAAAGCAAGGTGACTTGTTTACCCTGACTATTATATCAAAACCCCTCAAATC（配列番号４２３）
141 CATTGAATCATCAGGTCTATCTCCGCCGAAAAGTTCAGT（配列番号４２４）
142 ACACCCTGGGCAAGTGCCAGCTCAAAAAGAAG（配列番号４２５）
143 GCTCGAATTCGAACCATTCCTTTACCCTGACTATTATATCAAAACCCCTCAAATC（配列番号４２６）
144 AGCTCATTTGTCGCTGGGGTGCTGGCGTCC（配列番号４２７）
145 GTTACGTCTATCTGGGGAGGCTTTAACCAACAGCCAGCT（配列番号４２８）
146 GGTAGTCGCGAACACGCGAAGTTTTTGAGACCTTCATCAAGA（配列番号４２９）
147 AGCTCATTTGTATTTGTATTTGAGGAAAGGCCCTGC（配列番号４３０）
148 ATTATGGGTGTACGGACGCTATTTAACCAACAGCCAGCT（配列番号４３１）
149 GCTCAACCTGCTTTTCTGCTGTTTTTGAGACCTTCATCAAGA（配列番号４３２）
150 AGCTCATTTGCAGGGCCTTTCCTCAAATAC（配列番号４３３）
151 TAGCGTCCGTACACCCATAATTTTAACCAACAGCCAGCT（配列番号４３４）
152 CAGCAGAAAAGCAGGTTGAGCTTTTTGAGACCTTCATCAAGA（配列番号４３５）
153 AGCTCATTTGGACGCCAGCACCCCAGCGAC（配列番号４３６）
154 GCCTCCCCAGATAGACGTAACTTTAACCAACAGCCAGCT（配列番号４３７）
155 CTTCGCGTGTTCGCGACTACCTTTTTGAGACCTTCATCAAGA（配列番号４３８）
156 AGCTCATTTGTTGACGGCGTTCTCACAGAA（配列番号４３９）
157 GATATTTCTCATTTTCTTCACTTTAACCAACAGCCAGCT（配列番号４４０）
158 CTACATGTACTGATAAGTGCTTTTTTGAGACCTTCATCAAGA（配列番号４４１）
159 AGCTCATTTACTGCCTTTACAATATCAATG（配列番号４４２）
160 GATATTTCTCATTTTCTTCACTTTAACCAACAGCCAGCT（配列番号４４３）
161 CCTCAAATGCTCGCACTTTTATTTTTGAGACCTTCATCAAGA（配列番号４４４）
162 AGCTCATTTCATTGATATTGTAAAGGCAGT（配列番号４４５）
163 GTGAAGAAAATGAGAAATATCTTTAACCAACAGCCAGCT（配列番号４４６）
164 TAAAAGTGCGAGCATTTGAGGTTTTTGAGACCTTCATCAAGA（配列番号４４７）
165 AGCTCATTTTTCTGTGAGAACGCCGTCAAC（配列番号４４８）
166 ATAATTAACTGGGTACCTCTATTTAACCAACAGCCAGCT（配列番号４４９）
167 AGCACTTATCAGTACATGTAGTTTTTGAGACCTTCATCAAGA（配列番号４５０）
168 CCGTCTATCAATCCGCAGTTATCTTGCCGTG（配列番号４５１）
169 ACTCGCTAGGCGGTGGGAAGGTTAAAGAACGTGGACT（配列番号４５２）
170 CAGGTAGAAGACTTCCTAGACGAGATAGGGTTGAACCCATCGCCACCCTCAG（配列番号４５３）
171 CCGTCTATCACGACATGGTGTGATAGCATGA（配列番号４５４）
172 CGATCCATATTTCTGCCCGACTTAAAGAACGTGGACT（配列番号４５５）
173 TACCGTCAGTCACCACGAAGTCGAGATAGGGTTGAACCCATCGCCACCCTCAG（配列番号４５６）
174 CCGTCTATCAAGGTCTAGAGTCCACAAGAAA（配列番号４５７）
175 TAAAGGTGGGGCGTCTAAAGTTTAAAGAACGTGGACT（配列番号４５８）
176 TAGTGCTTCGTGGCTGCGTTGGAGATAGGGTTGAACCCATCGCCACCCTCAG（配列番号４５９）
177 CCGTCTATCAACTGAACTTTTCGGCGGAGAT（配列番号４６０）
178 GCTGGCACTTGCCCAGGGTGTTTAAAGAACGTGGACT（配列番号４６１）
179 AGGAATGGTTCGAATTCGAGCGAGATAGGGTTGAACCCATCGCCACCCTCAG（配列番号４６２）
180 CCGTCTATCAACTCGTCCCGACTTTCTTGCG（配列番号４６３）
181 CTCTGGTTTACACAGAATATGTTAAAGAACGTGGACT（配列番号４６４）
182 TGCGGGTCCGAGATCGTCGCTGAGATAGGGTTGAACCCATCGCCACCCTCAG（配列番号４６５）
183 CCGTCTATCAAGTTTCTCTGACCGAGGGATA（配列番号４６６）
184 TGAGCGTAATAGAACCATATCTTAAAGAACGTGGACT（配列番号４６７）
185 GCTTATGTTTACCGTAGACGCGAGATAGGGTTGAACCCATCGCCACCCTCAG（配列番号４６８）
186 CCGTCTATCAGGAGAAACGTCTCCCATAGTA（配列番号４６９）
187 CTCTATGAAGCCGGCCCTATATTAAAGAACGTGGACT（配列番号４７０）
188 AAAGAGTAACTTTCAGTCAGGGAGATAGGGTTGAACCCATCGCCACCCTCAG（配列番号４７１）
189 CCGTCTATCAGTGAGCAACACTACATCCTCA（配列番号４７２）
190 CCTGCTATAGGAATCACGGAGTTAAAGAACGTGGACT（配列番号４７３）
191 ACAAGTCACCTTGCTTTCGCTGAGATAGGGTTGAACCCATCGCCACCCTCAG（配列番号３９９）
下記表２に従って配列を混合することにより、８個のキューブ角部（図１３）を生成した。
１２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する１ｘＴＡＥ緩衝液中で、１５０μＬの最終体積になるように、４：１のステープルとＭ１３ゲノムとのモル比で配列を混合した。次いで、反応混合物を９５℃に加熱し、続いて４８時間かけて温度を室温まで徐々に下げた。等量の各反応混合物を一緒に混合し、最終キューブを作製した。
実施例１２
宿主特異的及びウイルス特異的ペプチド活性部分
ビリオンは、その外面に、ウイルスゲノム又は宿主細胞のいずれかに由来するタンパク質を発現する。ペプチド活性部分を、インフルエンザウイルス及び他のビリオンの「選択的結合」（「インフルエンザウイルス粒子中の細胞タンパク質」[Shaw他,PLoS Pathog.2008 Jun 6;4(6):el000085]）のために探索した。宿主特異的タンパク質及びウイルス特異的タンパク質への特異的結合のために、インシリコペプチドライブラリーを生成した。
宿主特異的及びウイルス特異的ペプチド活性部分
ビリオンは、その外面に、ウイルスゲノム又は宿主細胞のいずれかに由来するタンパク質を発現する。ペプチド活性部分を、インフルエンザウイルス及び他のビリオンの「選択的結合」（「インフルエンザウイルス粒子中の細胞タンパク質」[Shaw他,PLoS Pathog.2008 Jun 6;4(6):el000085]）のために探索した。宿主特異的タンパク質及びウイルス特異的タンパク質への特異的結合のために、インシリコペプチドライブラリーを生成した。
方法
インフルエンザビリオンの外面に提示されている３つの標的タンパク質、すなわちヒトＣＤ８１（PDB ID:1G8Q）、ヒトアネキシン２（PDB ID:1W7B）及びインフルエンザノイラミニダーゼ（PDB ID: 2BAT）の、解明されている３Ｄ構造に特異的且つ効果的に結合するペプチドを選択するために、Pepticomソフトウェアパッケージを用いて仮想ペプチドのインシリコスクリーニングを実施した。テトラスパニン及びアネキシンは、インフルエンザビリオン上に存在するいくつかの宿主特異的タンパク質を含むタンパク質ファミリーの例であり、それぞれヒトＣＤ８１及びヒトアネキシン２によって例示される。
インフルエンザビリオンの外面に提示されている３つの標的タンパク質、すなわちヒトＣＤ８１（PDB ID:1G8Q）、ヒトアネキシン２（PDB ID:1W7B）及びインフルエンザノイラミニダーゼ（PDB ID: 2BAT）の、解明されている３Ｄ構造に特異的且つ効果的に結合するペプチドを選択するために、Pepticomソフトウェアパッケージを用いて仮想ペプチドのインシリコスクリーニングを実施した。テトラスパニン及びアネキシンは、インフルエンザビリオン上に存在するいくつかの宿主特異的タンパク質を含むタンパク質ファミリーの例であり、それぞれヒトＣＤ８１及びヒトアネキシン２によって例示される。
結果
これらのタンパク質標的の各々について選択的なペプチドの仮想ライブラリーを生成した。標的タンパク質に対して高親和性を有すると予測されるペプチドの例及びそれらの特性を表３に記載する。
これらのタンパク質標的の各々について選択的なペプチドの仮想ライブラリーを生成した。標的タンパク質に対して高親和性を有すると予測されるペプチドの例及びそれらの特性を表３に記載する。
ペプチド番号３（配列番号４８０）とその標的タンパク質ヒトＣＤ８１との相互作用を、図１４にさらに図示する。
分かり易くするために別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴はまた、単一の実施形態において組み合わせても提供され得ることが理解される。逆に、簡潔にするために単一の実施形態の文脈で説明されている本発明の種々の特徴はまた、別個に、又は任意の好適な部分組み合わせでも提供され得る。
本発明をその特定の実施形態に関して説明したが、多くの代替、改変及び変更が当業者に明白であることは明らかである。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲の趣旨及び広い範囲に入る全てのそのような代替、改変及び変更を包含することが意図されている。本明細書において言及された全ての刊行物、特許及び特許出願並びにGenBank登録番号は、各個々の刊行物、特許もしくは特許出願又はGenBank登録番号が具体的に且つ個々に参照により本明細書に援用されることが示されている場合と同じ程度に、参照によりその全体が本明細書に援用される。さらに、本出願におけるあらゆる参考文献の引用又は特定は、そのような参考文献が本発明に対する先行技術として有効であるということを認めるものとして解釈されるべきではない。
Claims (39)
- 少なくとも１つの活性部分と相互作用することが可能な因子の選択的流入を可能にするように構成された足場に囲まれた前記少なくとも１つの活性部分を含む合成物。
- 前記足場が、核酸構造体、ポリマー構造体、及び／又はシリコン構造体を含む、請求項１に記載の合成物。
- 前記核酸構造体が、ＤＮＡ折り紙構造体である、請求項２に記載の合成物。
- 前記因子が、物質、微生物又は細胞である、請求項１に記載の合成物。
- 前記微生物が、ウイルス、細菌、真菌、寄生生物、古細菌、藻（algea）及び原生生物からなる群から選択される、請求項４に記載の合成物。
- 前記物質が、ペプチド、ポリペプチド、プリオン、脂質、脂質複合体、核酸、炭水化物、アレルゲン、毒素、ホルモン、抗体、薬物、小分子、汚染物質及び鉱物からなる群から選択される、請求項４に記載の合成物。
- 前記足場が、０．０１〜５０μｍの直径を有する因子の選択的流入を可能にするように構成されている、請求項１に記載の合成物。
- 足場が、０．０１〜０．８μｍの直径を有する因子の選択的流入を可能にするように構成されている、請求項１に記載の合成物。
- 前記活性部分が、前記因子と結合することが可能である、請求項１に記載の合成物。
- 前記活性部分が、抗体、アプタマー、受容体、キレート剤、リガンド、リポソーム、ナノチューブ、デンドリマー、プロト細胞、細胞、ペプチド、タンパク質、酵素、化学物質、洗剤、毒素、薬物及びプロドラッグからなる群から選択される、請求項９に記載の合成物。
- 前記活性部分が、前記因子を切断又は変形することが可能である、請求項１に記載の合成物。
- 前記活性部分が、酵素、リボザイム、化学物質、酸、塩基及び洗剤からなる群から選択される、請求項１１に記載の合成物。
- 前記少なくとも１つの活性部分が、前記足場に結合している、請求項１に記載の合成物。
- 前記少なくとも１つの活性部分が、リンカーを介して前記足場に結合している、請求項１３に記載の合成物。
- 前記足場が、脊椎動物において実質的に非免疫原性である、請求項１に記載の合成物。
- 前記足場が、非脂質足場である、請求項１に記載の合成物。
- 前記足場が、ＰＥＧもしくはＰＥＧ誘導体、又はヒアルロン酸を含む、請求項１５に記載の合成物。
- 前記足場が、内部内腔を有する粒子を構成している、請求項１に記載の合成物。
- 前記少なくとも１つの活性部分が、前記内腔内に置かれている、請求項１８に記載の合成物。
- 前記少なくとも１つの活性部分が、前記内腔内で前記足場に結合している、請求項１８に記載の合成物。
- 前記少なくとも１つの活性部分が、前記因子との相互作用に続いて分子を放出することが可能である、請求項１に記載の合成物。
- 前記分子が、マーカー、毒素、ホルモン、薬物、核酸、タンパク質及び佐剤からなる群から選択される、請求項２１に記載の合成物。
- 前記足場が、標的化部分をさらに含む、請求項１に記載の合成物。
- 前記標的化部分が、受容体、抗体、アプタマー、組織特異的部分、微生物特異的部分、リガンド、及び磁石からなる群から選択される、請求項２３に記載の合成物。
- 前記少なくとも１つの活性部分が、前記足場内に配置されたキャリアに結合している、請求項１に記載の合成物。
- 前記キャリアが、前記足場内に捕捉されている、請求項２５に記載の合成物。
- 前記構造体が、マイクロ電子機械系（ＭＥＭＳ）構造体である、請求項２に記載の合成物。
- 前記結合性部分が、前記微生物にとって内因性でないリガンドと結合することが可能である、請求項４に記載の合成物。
- 前記足場が、少なくとも１つの免疫調節部分をさらに含む、請求項１に記載の合成物。
- 請求項１に記載の合成物と薬学的に受容可能なキャリアとを含む薬学的組成物。
- 前記薬学的に受容可能なキャリアは、経口送達、粘膜送達、局所送達又は全身送達に適するものが選択される、請求項３０に記載の薬学的組成物。
- 流体から因子を単離する方法であって、少なくとも１つの活性部分と相互作用することが可能な前記因子の選択的流入を可能にするように構成された足場に囲まれた前記少なくとも１つの活性部分を含む合成物に、前記流体を曝露し、それにより、前記流体から前記因子を単離することを含む、方法。
- 前記流体が、生物学的流体である、請求項３２に記載の方法。
- 前記合成物に前記生物学的流体を曝露することが、前記合成物を被験体に投与することによって実施される、請求項３３に記載の方法。
- 前記流体が、水性流体である、請求項３２に記載の方法。
- 配列番号２０９〜４７６で示される配列を含む単離ポリヌクレオチド。
- 請求項３６に記載の単離ポリヌクレオチドを含む微粒子。
- 配列番号４７７〜４８５で示される配列を含む単離ポリペプチド。
- 請求項３８に記載の単離ポリペプチドを含む微粒子。
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