JP2014512804A - 組換え流行性耳下腺炎ワクチン - Google Patents

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Abstract

本発明は、流行性ムンプスウイルス（ＭｕＶ）株ＭｕＶIowa/US/06の完全ゲノム配列を提供する。更に、逆遺伝学システムを構築し、ＭｕＶIowa/US/06及びＪＬワクチンウイルスと比較して弱毒化されている組換えウイルスコンストラクトをレスキューするために使用した。そのようなコンストラクトには、ＳＨ遺伝子の翻訳領域（ＯＲＦ）を欠き（ｒＭｕＶΔＳＨ）かつ／またはＶタンパク質を発現することができない（ｒＭｕＶΔＶ）ウイルスコンストラクトが含まれる。

Description

継続出願データ
本出願は、２０１１年２月２５日に出願された米国仮特許出願第６１／４４６，６１９号明細書及び２０１１年９月１日に出願された米国仮特許出願第６１／５２９，９８１号明細書の利益を主張するものであり、これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれるものとする。
政府資金
本発明は、国立衛生研究所からの助成金第Ｋ０２ＡＩ０６５７９５号の下で、政府の支援によりなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
パラミクソウイルスであるムンプスウイルス（Ｍｕｍｐｓ ｖｉｒｕｓ：ＭｕＶ）は、唾液腺の片側性または両側性の腫張を特徴とする急性耳下腺炎をヒトに引き起こす。ＭｕＶはまた、軽度の髄膜炎から重篤な、時には致死的な脳炎に及ぶいくつかの中枢神経系（ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ：ＣＮＳ）症状の原因となる、高度に神経向性で神経毒性のある病原体としても注目されている。ムンプスウイルス感染は、流行性耳下腺炎ワクチンの集団予防接種の登場まで、ウイルス性髄膜炎及び脳炎の最も一般的な原因であった。流行性耳下腺炎及びその合併症の発生率は、１９７１年の麻疹、流行性耳下腺炎、風疹（ｍｕｍｐｓ， ｍｅａｓｌｅｓ ａｎｄ ｒｕｂｅｌｌａ：ＭＭＲ）のワクチンの導入後、劇的に軽減した。ＭｕＶの弱毒化された株であるＪｅｒｙｌ Ｌｙｎｎ（ＪＬ）株を含有するＭＭＲワクチンは、高度に効果的であり、有害反応をほとんど生じない。現在、流行性耳下腺炎ワクチン接種は、米国で１歳及び５歳の小児に投与される、２回接種のＭＭＲ（流行性耳下腺炎、麻疹、及び風疹）ワクチンレジメンの一部である。
最近、ＭｕＶは、高度にワクチン接種を受けた集団の中に流行を引き起こした。２００６年には、ほぼ２０年で最大の流行性耳下腺炎の流行を米国は経験した（Ｍａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｖａｃｃｉｎｅ；２６（２９−３０）：３６０１−３６０７）。集団発生は、アイオワの大学で始まり、他の１１州に広がった。それまでの１０年間における、平均で約２５０症例／年と比較すると、５０００を超える流行性耳下腺炎の症例が２００６年に報告された。２００９年〜２０１０年には、流行性耳下腺炎の集団発生が、米国のニューヨーク州及びニュージャージー州で起こったが、そこでは患者の８８％は、流行性耳下腺炎ワクチンを１回接種されており、患者の７５％はワクチンを２回接種されていた（ＭＭＷＲ Ｍｏｒｂ Ｍｏｒｔａｌ Ｗｋｌｙ Ｒｅｐ；５９（５）：１２５−１２９，２０１０年）。
これらの最近の集団発生の決定的な原因は知られていないが、これらの集団発生の可能な理由（相互に排他的ではない）としては、免疫の減弱、感染の高速化、及び新しいムンプスウイルス株の出現によるワクチンの無効が挙げられる。例えば、（Ｃｒｏｗｌｅｙ ａｎｄ Ａｆｚａｌ，２００２年，Ｃｏｍｍｕｎ Ｄｉｓ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ；５（４）：３１１−３１３；Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００３年，Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ；７０（２）：２８７−２９２；Ｏｔｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１０年，Ｅｕｒｏ Ｓｕｒｖｅｉｌｌ；１５（５０）；Ｓｔｒｏｈｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６年，Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ；１４１（３−４）：７３３−７４１；Ｕｔｚ ｅｔ ａｌ．，２００４年，Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ；７３（１）：９１−９６；及びＷｈｅｌａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０年，Ｅｕｒｏ Ｓｕｒｖｅｉｌｌ；１５（１７）を参照されたい。ＣＤＣによる、ムンプスウイルスに対する２回接種ＭＭＲの有効性を検討する大規模研究の結果により、抗ＭｕＶの力価が、ＭＭＲの２回目接種の１２年後（１７歳）には、２回目投薬接種前のレベルに劇的に低下していたことが示されている。更に、中和抗体力価が成人では低く、ＥＬＩＳＡを使用すると、試験された１０１の血清のうち７４が陽性であり、１つのみが１：８を超える中和抗体力価であった。これは、２００６年の集団発生で、最も冒された集団が１８〜２４歳であったという事実と一致している。２０１０年の集団発生では、最も冒された患者は１３〜１４歳であった。最近の集団発生は両方とも、高密度集団（大学キャンパス及び神学校）で起こった。高速度感染（例えば、密接な接触により次から次へと伝染する大量の感染性ビリオン）が、最近の集団発生では、抗ＭｕＶ免疫を圧倒した可能性がある。
現在流通のワクチンであるＪｅｒｙｌ Ｌｙｎｎ（ＪＬ）は、ＭｕＶの遺伝子型Ａに基づくが、最近の集団発生は、遺伝子型Ｇを原因としていた。Ａ株に対する免疫を生み出すワクチンは、Ｇ株の感染の予防には効果がなく、集団発生をもたらす。ワクチン接種を受けた集団でも、ムンプスウイルスの集団発生が再出現するため、ムンプスウイルスは、国立アレルギー感染病研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）により、優先度の高い病原体として収載されている（ワールドワイドウェブ上のｎｉａｉｄ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｔｏｐｉｃｓ／ｅｍｅｒｇｉｎｇ／ｌｉｓｔ．ｈｔｍにある「Ｅｍｅｒｇｉｎｇ ａｎｄ Ｒｅ−ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ」を参照のこと）。現在、弱毒化ＭｕＶ生ワクチンは、胚の卵及び細胞における連続継代によって得られる。これは、時間のかかる方法であり、安全なワクチンを生成するにあたって効率の悪い方法である。
従って、遺伝子型Ｇに向けたワクチンの開発を含む、新規の改良された流行性耳下腺炎ワクチンの必要性、及び流行性耳下腺炎ワクチンを開発するための新規の改善された方法に対する必要性がある。
本発明は、ムンプスウイルスの完全長ＲＮＡゲノムをコードするｃＤＮＡ配列を含む単離ヌクレオチド配列であって、低分子疎水性（ｓｍａｌｌ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ：ＳＨ）タンパク質産物を発現することができず、かつ／またはＶタンパク質産物を発現することができないムンプスウイルスをコードする単離ヌクレオチド配列、並びにその断片及び派生体を含む。
一部の態様では、低分子疎水性（ＳＨ）タンパク質産物を発現することができないムンプスウイルスの完全長ＲＮＡゲノムをコードするｃＤＮＡ配列を含む単離ヌクレオチド配列は、ＳＨタンパク質をコードする翻訳領域（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ：ＯＲＦ）の欠失、開始コドンを停止コドンに変換する変異、またはＳＨ遺伝子の転写を破壊する、Ｆタンパク質ＯＲＦとＳＨタンパク質ＯＲＦとの間の領域にある変異を含む。一部の態様では、ＳＨタンパク質をコードする翻訳領域（ＯＲＦ）の欠失は、ＳＨタンパク質をコードするＯＲＦの１５６ヌクレオチドの欠失を含む。
一部の態様では、Ｖタンパク質産物を発現することができないムンプスウイルスの完全長ＲＮＡゲノムをコードするｃＤＮＡ配列を含む単離ヌクレオチド配列は、Ｖタンパク質の発現を抑止する、Ｖ／Ｉ／Ｐ遺伝子に対する１つまたは複数の変異を含む。一部の態様では、Ｖタンパク質の発現を抑止する、Ｖ／Ｉ／Ｐ遺伝子に対する１つまたは複数の変異は、Ｐ／Ｖ遺伝子内の編集部位にヌクレオチド配列ＧＡＧＧＡＧＧＧを含む。
一部の態様では、ムンプスウイルスの完全長ＲＮＡゲノムをコードするｃＤＮＡ配列を含む単離ヌクレオチド配列は、ＳＨタンパク質をコードする翻訳領域（ＯＲＦ）の欠失または開始コドンを停止コドンに変換する変異を含み、かつＶタンパク質の発現を抑止する、Ｖ／Ｉ／Ｐ遺伝子に対する１つまたは複数の変異を含む。一部の態様では、Ｖタンパク質の発現を抑止する、Ｖ／Ｉ／Ｐ遺伝子に対するこの１つまたは複数の変異は、Ｐ／Ｖ遺伝子内の編集部位にヌクレオチド配列ＧＡＧＧＡＧＧＧを含む。
本発明はまた、１つまたは複数の更なる変異及び／または欠失を含む、本明細書に記載する、ムンプスウイルスの完全長ＲＮＡゲノムをコードするｃＤＮＡ配列を含む単離ヌクレオチド配列を含む。一部の態様では、更なる変異または欠失は、Ｐタンパク質のリン酸化をもたらす変異または欠失を含み得る。一部の態様では、Ｐタンパク質のリン酸化をもたらす更なる変異または欠失は、Ｐタンパク質のＴ１４７及び／またはＳ３０７の変異または欠失を含み得る。
本発明はまた、Ｉタンパク質産物の発現を更に含み、かつ／またはＬタンパク質産物の変異を更に含む、本明細書に記載する、ムンプスウイルスの完全長ＲＮＡゲノムをコードするｃＤＮＡ配列を含む単離ヌクレオチド配列を含む。
本発明はまた、本明細書に記載する、ムンプスウイルスの完全長ＲＮＡゲノムをコードするｃＤＮＡ配列を含む単離ヌクレオチド配列であって、このムンプスゲノムが異種のポリペプチドを更にコードする単離ヌクレオチドを含む。
一部の態様では、ムンプスウイルスの完全長ＲＮＡゲノムをコードするｃＤＮＡ配列を含む単離ヌクレオチド配列は、遺伝子型Ｇに属する。
一部の態様では、ムンプスウイルスの完全長ＲＮＡゲノムをコードするｃＤＮＡ配列を含む単離ヌクレオチド配列は、ＭｕＶ／ＩｏｗａＵＳ／２００６（ＭｕＶ−ＩＡ）である。一部の態様では、ＭｕＶ／ＩｏｗａＵＳ／２００６（ＭｕＶ−ＩＡ）は配列番号１を含む。
本発明は、ムンプスウイルスのＭＵＶ／ＩｏｗａＵＳ／２００６（ＭｕＶ−ＩＡ）株の完全長ＲＮＡゲノムをコードするｃＤＮＡ配列を含む単離ヌクレオチド配列並びにその断片及び派生体を含む。一部の態様では、ヌクレオチド配列は配列番号１を含む。
本発明は、本明細書に記載する、ムンプスウイルスの完全長ＲＮＡゲノムをコードするｃＤＮＡ配列を含む単離ヌクレオチド酸配列を有する組換えムンプスウイルス（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｕｍｐｓ ｖｉｒｕｓ：ｒＭｕＶ）またはその断片若しくは派生体を含む。
本発明は、本明細書に記載する、ムンプスウイルスの完全長ＲＮＡゲノムをコードするｃＤＮＡ配列を含む麻疹ウイルスゲノムをコードするプラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｍｅ：ｐＭｕＶ）またはその断片若しくは派生体を含む。
本発明は、本明細書に記載する、ムンプスウイルスの完全長ＲＮＡゲノムをコードするｃＤＮＡ配列を含む単離ヌクレオチド配列を含むウイルス発現ベクターまたはその断片若しくは派生体を含む。
本発明は、本明細書に記載する単離ヌクレオチド配列またはプラスミドを含む感染性ウイルス粒子を含む。
本発明は、本明細書に記載する単離ヌクレオチド配列、プラスミド、ｐＭｕＶ、ｒＭｕＶ、または感染性ウイルス粒子を含む組成物を含む。一部の実施形態では、組成物は、風疹及び／または麻疹の抗原決定基を更に含む。一部の実施形態では、組成物は、鼻腔内、経口、皮内、または筋肉内の投与用に製剤化される。
本発明は、ムンプスウイルスに対する免疫応答を被験体に誘導する方法であって、この方法が、本明細書に記載する単離ヌクレオチド配列、プラスミド、ｐＭｕＶ、ｒＭｕＶ、ウイルス粒子、または組成物の有効量を、被験体に投与することを含む方法を含む。一部の実施形態では、投与は、鼻腔内、経口、皮内、または筋肉内の投与を含む。
本発明は、流行性耳下腺炎に対するワクチン接種を被験体に行う方法であって、この方法が、本明細書に記載する単離ヌクレオチド配列プラスミド、ｐＭｕＶ、ｒＭｕＶ、ウイルス粒子、または組成物の有効量を、被験体に投与することを含む方法を含む。一部の実施形態では、投与は、鼻腔内、経口、または筋肉内の投与を含む。
用語「及び／または」は、記載された要素の１つ若しくはすべてを、または記載された要素の任意の２つ以上の組合せを意味する。
単語「好ましい」及び「好ましくは」は、特定の状況下で特定の有益性を与えうる本発明の実施形態を指す。しかしながら、他の実施形態もまた、同じかまたは他の状況下で好ましいことがある。更に、１つまたは複数の好ましい実施形態の記述は、他の実施形態が有用でないことを意味するものではなく、本発明の範囲から他の実施形態を除外するように意図するものでもない。
用語「含む」及びその変化形は、これらの用語が本明細書及び特許請求の範囲に現れる場合、限定する意味を有するものではない。
特に明記されない限り、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、及び「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」は、互換的に使用され、１つというよりも１つまたは複数を意味する。
本明細書ではまた、端点による数値範囲の記述は、その範囲内に包含されるすべての数を含む（例えば、１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５等を含む）。
本発明の上記の概要は、本発明の開示された実施形態のそれぞれをまたは実施のすべてを記載するように意図したものではない。「より具体的には」に続く記載は、実例的な実施形態を例示する。本出願の全体を通じていくつかの箇所で、実施例の記載を通して案内がなされ、それらの実施例は種々の組合せで使用することができる。それぞれの実施例では、列挙されたリストは、代表的なグループとしてのみ役立ち、排他的なリストとして解釈されるべきではない。
ＭｕＶ−ＩＡゲノムの分析を示す図である。図１Ａは、ＳＨタンパク質のアライメントを示す図である。３つの株、Ｇｌｏｕｃ１／ＵＫ９６（配列番号４）、ＵＫ０１−２２（配列番号５）、及びＭｕＶ−ＩＡ（配列番号６）のＳＨタンパク質配列を示す。ＭｕＶ−ＩＡは、Ｇｌｏｕｃ１／ＵＫ９６＊及びＵＫ０１−２２とは、それぞれ５ヌクレオチド及び２アミノ酸のみ異なる。長方形の枠内で示すムンプスウイルスＳＨタンパク質の膜貫通ドメインは、ＴＭＨＭＭｓｅｒｖｅｒ ｖ．２．０（ＣＢＳ；Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して予測した。 ＭｕＶ−ＩＡゲノムの分析を示す図である。図１Ｂは、種々のムンプスウイルスの配列比較を示す図である。３２株のムンプスウイルスのゲノム配列は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋから入手し、ＭＥＧＡ４バージョン４．０．２を使用してＭｕＶ−ＩＡのゲノム配列とアライメントした。３２のＭｕＶ株は以下のとおりであった（登録番号は括弧内に示す）：８７−１００４（ＡＦ３１４５６０）、ＳＩＰＡＲ ０２（ＡＦ３１４５５８）、Ｂｉｋｅｎ（ＡＦ３１４５６１）、８７−１００５（ＡＦ３１４５６２）、ＭｕＶ（２００１年）（ＡＦ３１４５５９）、Ｕｒａｂｅ １００４−１０／２（ＦＪ３７５１７７）、Ｕｒａｂｅ Ｇｗ７（ＦＪ３７５１７８）、Ｈｏｓｈｉｎｏ（ＡＢ４７０４８６）、Ｍｉｙａｈａｒａ（１９９２年）（ＮＣ＿００２２００）、ＭｕＶ Ｍｉｙａｈａｒａ（１９９２年）（２）（ＡＢ０４０８７４）、Ｙ２１３（ＡＢ５７６７６４）、Ｄｇ１０６２／Ｋｏｒｅａ／９８（３２１７２４６４）、Ｌ３／Ｒｕｓｓｉａ／Ｖｅｃｔｏｒ（ＡＹ５０８９９５）、Ｌ−Ｚａｇｒｅｂマスター種（ＡＹ６８５９２１）、Ｌ−Ｚａｇｒｅｂワクチン株（ＡＹ６８５９２０）、９２１８／Ｚｇ９８（２９９７６６３５５）、Ｎｏｖｏｓｂｒｉｓｋ遺伝子型Ｃ（５０４０４１６４）、ＰｅｔｒｏＮｏｖ遺伝子型Ｈ（ＡＹ６８１４９５）、８８−１９６１（ＡＦ４６７７６７）、Ｇｌｏｕｃ１／ＵＫ９６（ＡＦ２８０７９９）、Ｄｕ／ＣＲＯ０５（ＥＵ３７０２０７）、ＳＰ−Ａ（ＦＪ５５６８９６）、ＳＰ（ＥＵ８８４４１３）、ＳＰ（２００６）（ＤＱ６４９４７８）、ＪＬ２（ＡＦ３４５２９０１）、Ｊｅｒｙｌ Ｌｙｎｎ亜株（ＦＮ３１９８５）、Ｅｎｄｅｒｓ（ＧＵ９８００５２１）、Ｊｅｒｙｌ Ｌｙｎｎ主要成分（ＡＦ３３８１０６）、ＭｕＶ（２０００年）（ＡＦ２０１４７３）、ＪＬ１（ＦＪ２１１５８６）、ＲＩＴ４３８５（ＦＪ２１１５８５）、ＲＩＴ４３８５（２）（ＦＪ２１１５８４）。 ＭｕＶ−ＩＡゲノムの分析を示す図である。図１Ｃは、ＭｕＶ−ＩＡとＪｅｒｙｌ Ｌｙｎｎ（ＪＬ）株（主要成分）の間の配列比較を示す図である。ＭｕＶ−ＩＡ及びＪｅｒｙｌ Ｌｙｎｎ生ワクチン主要成分のＮＰ、Ｐ／Ｖ（Ｐタンパク質及びＶタンパク質をコードする）、Ｍ、Ｆ、ＳＨ、ＨＮ、及びＬの遺伝子及びタンパク質の配列をＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴプログラムを使用してアライメントした。ヌクレオチド同一性及びアミノ酸同一性を上記に示した。＊ＳＨ遺伝子は、ＭＥＧＡ ４．０．２を使用してアライメントした。 ｒＭｕＶ、ｒＭｕＶ−ＥＧＦＰ、及びｒＭｕＶ−ＲＬの分析を示す図である。図２Ａは、ｒＭｕＶの増殖速度を示すグラフである。ｒＭｕＶは、ｐＭｕＶ−ＩＡ、ｐＣＡＧＧＳ−ＮＰ、ｐＣＡＧＧＳ−Ｐ、及びｐＣＡＧＧＳ−ＬをＢＳＲＴ−７細胞に形質移入することにより得られた。ｒＭｕＶ（白抜き四角）及びＭｕＶ−ＩＡ（黒三角）の増殖速度を比較した。 ｒＭｕＶ、ｒＭｕＶ−ＥＧＦＰ、及びｒＭｕＶ−ＲＬの分析を示す図である。図２Ｂは、ｒＭｕＶ及びＭｕＶ−ＩＡのウイルスタンパク質発現レベルを示す写真である。６ウェルプレートのＶｅｒｏ細胞に、模擬、ｒＭｕＶ、またはＭｕＶ−ＩＡを０．５のＭＯＩで感染させた。細胞溶解物を、抗ＮＰ、抗Ｐ、または抗Ｖによる免疫ブロッティングに供した。 ｒＭｕＶ、ｒＭｕＶ−ＥＧＦＰ、及びｒＭｕＶ−ＲＬの分析を示す図である。図２Ｃは、ｒＭｕＶ−ＥＧＦＰのレスキューを示す写真である。ｒＭｕＶについて記載された方法と同様の方法で、ｒＭｕＶ−ＥＧＦＰをレスキューした。６ウェルプレートのＶｅｒｏ細胞に、模擬またはｒＭｕＶ−ＥＧＦＰを０．０５のＭＯＩで感染させ、２ｄｐｉに撮影した。 ｒＭｕＶ、ｒＭｕＶ−ＥＧＦＰ、及びｒＭｕＶ−ＲＬの分析を示す図である。図２Ｄは、ｒＭｕＶ−ＲＬのレスキューを示すグラフである。ｒＭｕＶ−ＲＬを、ｒＭｕＶについて記載されたように、クローン化ＤＮＡから回収した。２４ウェルプレートのＶｅｒｏ細胞に、模擬またはｒＭｕＶ−ＲＬを０．１のＭＯＩで感染させた。２ｄｐｉに、細胞について、ウミシイタケ（ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ活性をアッセイした。 ＳＨを欠くＭｕＶ（ｒＭｕＶΔＳＨ）の生成を示す図である。図３Ａは、ｒＭｕＶΔＳＨの作製を示す概略図である。ＳＨ ＯＲＦ（配列番号７）を、Ｎｈｅ Ｉ部位を含有する５アミノ酸コード配列で置換した（配列番号８；制限部位に下線を付す）。 ＳＨを欠くＭｕＶ（ｒＭｕＶΔＳＨ）の生成を示す図である。図３Ｂは、ＲＴ−ＰＣＲによるｒＭｕＶΔＳＨの確認を示す写真である。プラーク精製後に、ウイルスＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲに供した。ＳＨ遺伝子を挟む２つのプライマーを使用してＰＣＲを実施し、欠失を確認した。レーン１及びレーン６はそれぞれ、１００ｂｐ及び１ｋｂのＤＮＡラダーである；レーン２は陰性対照−ポリメラーゼなしのＰＣＲである。レーン３、４、及び５はそれぞれ、ｒＭｕＶΔＳＨ、ｒＭｕＶ、及びｗｔＭｕＶの感染細胞に由来するＰＣＲ産物である。 ＳＨを欠くＭｕＶ（ｒＭｕＶΔＳＨ）の生成を示す図である。図３Ｃは、配列決定によるｒＭｕＶΔＳＨの確認を示す図である。ＰＣＲ産物を配列決定した（配列番号９）。挿入配列に下線を付した。 ＳＨを欠くＭｕＶ（ｒＭｕＶΔＳＨ）の生成を示す図である。図３Ｄは、ＭｕＶ−ＩＡ、ｒＭｕＶ、及びｒＭｕＶΔＳＨの感染細胞でのＳＨの発現を示す写真である。Ｖｅｒｏ細胞に模擬感染、またはＭｕＶ−ＩＡ、ｒＭｕＶ、若しくはｒＭｕＶΔＳＨを感染させた。細胞溶解物を抗ＮＰ、抗Ｐ、または抗ＳＨによる免疫ブロッティングに供した。 ｒＭｕＶΔＳＨ及びｒＭｕＶの増殖速度及びウイルスタンパク質発現を示す図である。図４Ａは、ｒＭｕＶΔＳＨ及びｒＭｕＶの増殖速度を示すグラフである。Ｖｅｒｏ細胞に、ｒＭｕＶΔＳＨ（黒菱形）及びｒＭｕＶ（白抜き四角）を０．０１のＭＯＩで感染させた。上清をプラークアッセイに使用した。 ｒＭｕＶΔＳＨ及びｒＭｕＶの増殖速度及びウイルスタンパク質発現を示す図である。図４Ｂは、ｒＭｕＶΔＳＨ及びｒＭｕＶ感染細胞におけるウイルスタンパク質発現レベルを示す写真である。Ｖｅｒｏ細胞に模擬感染、またはｒＭｕＶΔＳＨ若しくはｒＭｕＶを０．５のＭＯＩで感染させた。 ｒＭｕＶΔＳＨ及びｒＭｕＶの増殖速度及びウイルスタンパク質発現を示す図である。図４Ｃは、ｒＭｕＶΔＳＨ及びｒＭｕＶ感染細胞におけるＨＮ発現レベルを示すグラフである。Ｖｅｒｏ細胞に模擬感染、またはｒＭｕＶΔＳＨ若しくはｒＭｕＶを０．５のＭＯＩで感染させた。細胞を２４ｈｐｉに回収し、全ＨＮ及びＮＰの発現レベルを、フローサイトメトリーを使用して調べた。ＨＮ及びＮＰの平均蛍光強度（ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ：ＭＦＩ）を算出した。Ｙ軸は、ＮＰのＭＦＩにより規準化されたＨＮのＭＦＩの相対比を表わす。 ｒＭｕＶΔＳＨ及びｒＭｕＶの増殖速度及びウイルスタンパク質発現を示す図である。図４Ｄは、ｒＭｕＶΔＳＨまたはｒＭｕＶ感染Ｖｅｒｏ細胞のＨＮ ｍＲＮＡレベルを示すグラフである。ウイルスＲＮＡをｒＭｕＶΔＳＨまたはｒＭｕＶ感染Ｖｅｒｏ細胞から抽出し、オリゴｄＴと共に逆転写して、リアルタイムＰＣＲに使用した。ＨＮ及びＦのｍＲＮＡレベルを算出し、ＨＮ ｍＲＮＡレベルをＦ ｍＲＮＡレベルにより規準化した。Ｙ軸は、ＨＮ ｍＲＮＡ対Ｆ ｍＲＮＡの比を表す。 ｒＭｕＶΔＳＨによる細胞死の誘導を示す図である。図５Ａは、組織細胞培養株におけるｒＭｕＶΔＳＨの細胞変性効果を示す写真である。Ｖｅｒｏ細胞、ＭＤＢＫ細胞、またはＨｅＬａ細胞に模擬感染、またはｒＭｕＶΔＳＨ若しくはｒＭｕＶを０．０１のＭＯＩで感染させ、１ｄｐｉに撮影した。 ｒＭｕＶΔＳＨによる細胞死の誘導を示す図である。図５Ｂは、Ｌ９２９細胞におけるｒＭｕＶΔＳＨ感染の細胞変性効果を示す写真である。Ｌ９２９細胞に模擬感染、またはｒＭｕＶΔＳＨ若しくはｒＭｕＶを３のＭＯＩで感染させ、１ｄｐｉ及び２ｄｐｉに撮影した。 ｒＭｕＶΔＳＨによる細胞死の誘導を示す図である。図５Ｃは、Ｌ９２９細胞におけるｒＭｕＶΔＳＨ感染誘導アポトーシスを示すグラフである。図５Ｂのように、Ｌ９２９細胞に感染させた。１ｄｐｉに、浮遊細胞及び付着細胞を回収し、固定して透過性にし、ＴＵＮＥＬアッセイに使用した。 ｒＭｕＶΔＳＨ媒介細胞死におけるＴＮＦ−αの役割を示す図である。図６Ａは、ｒＭｕＶΔＳＨ感染がＬ９２９細胞のＰ６５を活性化したことを示す写真である。ガラスカバースリップ上のＬ９２９細胞に、１０のＭＯＩで、模擬、ｒＭｕＶΔＳＨ、またはｒＭｕＶを感染させた。１ｄｐｉに、カバースリップ上のＬ９２９細胞を抗Ｐ６５で染色した。 ｒＭｕＶΔＳＨ媒介細胞死におけるＴＮＦ−αの役割を示す図である。図６Ｂは、Ｌ９２９細胞のｒＭｕＶΔＳＨ感染がＴＮＦ−α産生を誘導したことを示すグラフである。Ｌ９２９細胞に模擬感染、またはｒＭｕＶΔＳＨ若しくはｒＭｕＶを５のＭＯＩで感染させた。ＥＬＩＳＡを使用して、培地中のＴＮＦ−αを測定した。 ｒＭｕＶΔＳＨ媒介細胞死におけるＴＮＦ−αの役割を示す図である。図６Ｃは、抗ＴＮＦ−α抗体により処理すると、ｒＭｕＶΔＳＨ感染したＬ９２９細胞のＣＰＥが低下したことを示す写真である。Ｌ９２９細胞に模擬感染、またはｒＭｕＶΔＳＨ若しくはｒＭｕＶを５のＭＯＩで感染させた。ＴＮＦ−α中和抗体または対照抗体を含有する培地中で細胞を培養し、１ｄｐｉに撮影した。 ｒＭｕＶΔＳＨ媒介細胞死におけるＴＮＦ−αの役割を示す図である。図６Ｄは、ＴＮＦ−α抗体処理により、ｒＭｕＶΔＳＨ感染したＬ９２９細胞のアポトーシスが阻害されたことを示すグラフである。図６Ｃのように、６ウェルプレート中のＬ９２９細胞を感染させ処理した。感染後１日目及び２日目に、細胞を回収し、ＴＵＮＥＬアッセイに使用した。 図７Ａは、ＭｕＶ−ＩＡ ＳＨがＮＦ−κＢのＴＮＦ−α活性化を阻害したことを示すグラフである。Ｌ９２９細胞を、レポータープラスミド（ｐκＢ−ＴＡＴＡ−ＦＬ）及びｐＣＡＧＧＳ−ＭｕＶ ＳＨ、ｐＣＡＧＧＳ−ＰＩＶ５ ＳＨ、またはｐＣＡＧＧＳＭｕＶ−ＮＰで形質移入した。形質移入後１日目に、細胞を１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αで４時間処理し、次いでホタルルシフェラーゼ活性をアッセイした。 図７Ｂは、ＭｕＶ−ＩＡ ＳＨがＮＦ−κＢのＴＮＦ−α活性化を阻害したことを示すグラフである。同様に、ＳＨ ＯＲＦ配列の影響を、ＳＨ ＯＲＦの開始コドンの下流にインフレームで停止コドンを挿入することによりＳＨポリペプチドを発現しないＳＨ ＯＲＦ配列をコードするプラスミドを使用して調べた。 インビボでのＭｕＶΔＳＨの神経毒性を示すグラフである。新生ラットにｒＭｕＶまたはｒＭｕＶΔＳＨを脳内に感染させた。感染後３０日目に動物を屠殺した。材料及び方法に記載のように、動物の脳を切片にして染色し、相対脳水腫スコアに基づいて神経毒性スコアを算出した。 Ｖタンパク質を欠くＭｕＶIowa/US/06（ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ）の生成を示す図である。図９Ａは、ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶの概略図である。ＭｕＶIowa/US/06のＰ／Ｖ遺伝子内のＧＧＧＧＧＧ（配列番号１４のヌクレオチド１〜６）編集部位を、Ｖタンパク質の発現を消失させるために、ＧＡＧＧＡＧＧＧ（配列番号１５のヌクレオチド１〜８）に変化させた。ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶのゲノム長を６の倍数に維持するために、４つの塩基対（ｂｐ）をＰ／Ｖ遺伝子の３’ＵＴＲに付加した（配列番号１６）。 Ｖタンパク質を欠くＭｕＶIowa/US/06（ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ）の生成を示す図である。図９Ｂは、ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶのレスキューの確認を示す写真である。ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ感染細胞及びｒＭｕＶIowa/US/06感染細胞から抽出したウイルスＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した後、Ｐ／Ｖ遺伝子を挟む２つのプライマーを使用して逆転写（ＲＴ）ＰＣＲを実施した。レーン１は１００ｂｐのＤＮＡラダーであり；レーン２は陰性対照（ポリメラーゼなしのＰＣＲ）であり；レーン３及び４はそれぞれ、ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ感染細胞及びｒＭｕＶIowa/US/06感染細胞に由来するＰＣＲ産物である。 Ｖタンパク質を欠くＭｕＶIowa/US/06（ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ）の生成を示す図である。図９Ｃは、ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶの確認を示す図である。図９Ｂに示されたＰＣＲ産物を配列決定した（配列番号１７）。 Ｖタンパク質を欠くＭｕＶIowa/US/06（ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ）の生成を示す図である。図９Ｄは、ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ感染細胞及びｒＭｕＶIowa/US/06感染細胞におけるＶタンパク質の発現を示す写真である。Ｖｅｒｏ細胞に模擬感染、またはｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ若しくはｒＭｕＶIowa/US/06を感染させた。細胞溶解物を抗ＮＰ、抗Ｐ、または抗Ｖを使用して免疫ブロッティングした。 レスキューされたｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶの全ゲノムの配列決定を示す図である。図１０Ａは、レスキューされたｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶで見出された変化の概要を示す表である。左端の欄は、８つの成功したウイルスレスキューに由来する個々のｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ株の名前を示す。 レスキューされたｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶの全ゲノムの配列決定を示す図である。図１０Ｂは、ＮＰ ＧＥ領域及びＰ／Ｖ ＧＳ領域に生じた変化の概略図である。ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶのウイルスレスキューの間に生じた変化を、太字のイタリック体として示す。プラスミド内のＮＰ ＧＥ配列及びＰ／Ｖ ＧＳ配列を示す（配列番号１８）。ＮＰ ＧＥ及びＰ／Ｖ ＧＳの変異した配列を以下のウイルス株について示す：ＰＸ２−ＳＰ−４８（配列番号１９）、ＰＸ２−ｓｐ−５１（配列番号２０）、ＰＸ２−ｓｐ−６１（配列番号２１）、ＰＸ２−ｓｐ−８１（配列番号２２）、ＰＸ２−ｓｐ−９１（配列番号２３）、ＰＸ２−ｓｐ−１０１（配列番号２４）、及びＰＸ２−ｓｐ−１０６（配列番号２５）。配列アラインメントの中央の「ＴＴ」は、ＭｕＶIowa/US/06におけるＮＰ遺伝子とＰ／Ｖ遺伝子の間の遺伝子結合配列である。 ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ、ｒＭｕＶIowa/US/06、及びＭｕＶIowa/US/06の増殖速度及びウイルスタンパク質発現を示す図である。図１１Ａは、Ｖｅｒｏ細胞におけるｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ及びｒＭｕＶIowa/US/06の増殖速度を示すグラフである。Ｖｅｒｏ細胞に模擬感染、またはｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ若しくはｒＭｕＶIowa/US/06を０．０１のＭＯＩで感染させた。上清をプラークアッセイのために回収した。 ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ、ｒＭｕＶIowa/US/06、及びＭｕＶIowa/US/06の増殖速度及びウイルスタンパク質発現を示す図である。図１１Ｂは、Ｖｅｒｏ細胞におけるｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ及びｒＭｕＶIowa/US/06のプラークを示す写真である。ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶまたはｒＭｕＶIowa/US/06をＶｅｒｏ細胞上に播種した。６ｄｐｉにプラークをギムザ染色した。 ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ、ｒＭｕＶIowa/US/06、及びＭｕＶIowa/US/06の増殖速度及びウイルスタンパク質発現を示す図である。図１１Ｃは、Ｖｅｒｏ細胞におけるｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ及びｒＭｕＶIowa/US/06のウイルスタンパク質発現を示す写真である。図１１Ａのように、Ｖｅｒｏ細胞に感染させた。ウイルスタンパク質レベルを、抗ＮＰ及び抗Ｐによる免疫ブロッティングにより検討した。負荷対照としてβ−アクチンを使用した。 ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ、ｒＭｕＶIowa/US/06、及びＭｕＶIowa/US/06の増殖速度及びウイルスタンパク質発現を示す図である。図１１Ｄは、ＨｅＬａ細胞におけるｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ及びｒＭｕＶIowa/US/06の増殖速度を示すグラフである。図１１Ａのように、ＨｅＬａ細胞に感染させた。 ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ、ｒＭｕＶIowa/US/06、及びＭｕＶIowa/US/06の増殖速度及びウイルスタンパク質発現を示す図である。図１１Ｅは、２９３Ｔ細胞におけるｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ及びｒＭｕＶIowa/US/06の増殖速度を示すグラフである。２９３Ｔ細胞に模擬感染、またはｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ若しくはｒＭｕＶIowa/US/06を０．５のＭＯＩで感染させた。上清をプラークアッセイのために回収した。 ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ感染細胞におけるＮＰとＰの比を示す図である。図１２Ａは、感染後の初期時点における、ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ及びｒＭｕＶIowa/US/06の感染Ｖｅｒｏ細胞におけるＮＰ及びＰの発現レベルを示すグラフである。Ｖｅｒｏ細胞に模擬感染、またはｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ若しくはｒＭｕＶIowa/US/06を０．５のＭＯＩで感染させた。Ｖｅｒｏ細胞を回収し、フローサイトメトリーを使用してＮＰ及びＰの発現を調べた。Ｐ対ＮＰの平均蛍光強度（ＭＦＩ）比を示す。ｒＭｕＶIowa/US/06対ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶのＰ値を、スチューデントｔ検定を使用して算出した。このＰ値は０．０５未満である。 ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ感染細胞におけるＮＰとＰの比を示す図である。図１２Ｂは、感染後の後期時点における、ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ及びｒＭｕＶIowa/US/06の感染Ｖｅｒｏ細胞におけるＮＰ及びＰの発現レベルを示すグラフである。図１２Ａのように、感染後の複数時点でのＰ対ＮＰのＭＦＩ比を調べた。２４及び４８ｈｐｉにおける、ｒＭｕＶIowa/US/06対ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶのＰ値は０．０５未満である。 ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ感染細胞におけるＮＰとＰの比を示す図である。図１２Ｃは、ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ（Ｐ ＧＳ）のＮＰとＰの発現比を示すグラフである。０．５のＭＯＩでのｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ（Ｐ ＧＳ）感染Ｖｅｒｏ細胞におけるＰ対ＮＰのＭＦＩ比を２４ｈｐｉにて調べた。ｒＭｕＶIowa/US/06対ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ（Ｐ ＧＳ）のＰ値は０．０５未満である。 ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ感染細胞におけるＮＰとＰの比を示す図である。図１２Ｄは、ｒＭｕＶIowa/US/06（Ｌ遺伝子）のＮＰとＰの発現比を示すグラフである。０．５のＭＯＩでのｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ（Ｌ遺伝子）感染Ｖｅｒｏ細胞におけるＰ対ＮＰのＭＦＩ比を２４ｈｐｉにて調べた。ｒＭｕＶIowa/US/06対ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ（Ｌ遺伝子）のＰ値は０．０５未満である。 ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶにおけるＨＮ発現レベルを示すグラフである。Ｖｅｒｏ細胞に模擬感染、またはｒＭｕＶΔＶ若しくはｒＭｕＶを０．５のＭＯＩで感染させた。細胞を２４ｈｐｉにて回収し、フローサイトメトリーを使用してＨＮを染色した。 ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶによる細胞死の誘導を示す図である。図１４Ａは、ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶが、細胞株により大きな細胞変性効果を誘導したことを示す写真である。ＨｅＬａ細胞、ＭＤＢＫ細胞、若しくはＶｅｒｏ細胞に模擬感染、またはｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ若しくはｒＭｕＶIowa/US/06を０．５のＭＯＩで感染させ、７２ｈｐｉに撮影した。 ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶによる細胞死の誘導を示す図である。図１４Ｂは、ＨｅＬａ細胞における、ｒＭｕＶΔＶによるアポトーシス誘導を示すグラフである。図１４Ａのように、ＨｅＬａ細胞に感染させた。２４ｈｐｉにて、ＴＵＮＥＬアッセイのために細胞を回収した。全細胞のうちのＴＵＮＥＬ陽性細胞のパーセントを示す。ｒＭｕＶIowa/US/06対ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶＰのＰ値は０．０５未満である。 ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶによる細胞死の誘導を示す図である。図１４Ｃは、Ｖｅｒｏ細胞におけるアポトーシス誘導を示すグラフである。図１４Ｂのように、Ｖｅｒｏ細胞に０．５のＭＯＩでウイルスを感染させ、ＴＵＮＥＬアッセイのために処理した。野生型とｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶの間のＰ値は、０．０５未満である。 図１５Ａは、ＭｕＶIowa/US/06感染細胞における、ＳＴＡＴ１の分解を示す写真である。図１５Ａに示すように、ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶはＶｅｒｏ細胞においてＳＴＡＴ１を分解しなかった。Ｖｅｒｏ細胞に０．５のＭＯＩで感染させた。細胞溶解物を、抗ＮＰ、抗Ｐ、抗Ｖ、及び両方のＳＴＡＴ１アイソフォーム（ＳＴＡＴ１α及びＳＴＡＴ１β）を認識する抗ＳＴＡＴ１でイムノブロッティングした。負荷対照としてβ−アクチンを使用した。 図１５Ｂは、ＭｕＶIowa/US/06感染細胞における、ＳＴＡＴ３の分解を示す写真である。図１５Ｂに示すように、ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶはＶｅｒｏ細胞においてＳＴＡＴ３を分解しなかった。細胞溶解物を、抗ＮＰ、抗Ｐ、抗Ｖ、抗ＳＴＡＴ３、及び抗ＳＴＡＴ２でイムノブロットした。 ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶによる、ＩＦＮ−β及びＩＬ−６の誘導を示す図である。図１６Ａは、ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶウイルスによる、ＩＦＮ−β産生の誘導を示すグラフである。２９３Ｔ細胞に、野生型ＰＩＶ５、ｒＰＩＶ５Ｖ Ｃ、ｒＭｕＶIowa/US/06、若しくはｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶを感染、または模擬感染させた。細胞上清を２４及び４８ｈｐｉに回収し、ＥＬＩＳＡによりＩＦＮ−β産生を分析した。グラフは、３つの独立した実験の平均を示し、エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を表わす。２４及び４８ｈｐｉにおける、ｒＭｕＶIowa/US/06対ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶのＰ値は０．０５未満である。 ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶによる、ＩＦＮ−β及びＩＬ−６の誘導を示す図である。図１６Ｂは、ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶウイルスによる、ＩＬ−６産生の誘導を示すグラフである。ＨｅＬａ細胞に、野生型ＰＩＶ５、ｒＰＩＶ５Ｖ Ｃ、ｒＭｕＶIowa/US/06、若しくはｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶを感染、または模擬感染させた。細胞上清を２４及び４８ｈｐｉに回収し、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−６産生を分析した。検査試料をキット中に用意された試料希釈剤で１：１０に希釈した。グラフは、２つの独立した実験の平均を示し、エラーバーはＳＤを表わす。２４及び４８ｈｐｉにおける、ｒＭｕＶIowa/US/06対ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶのＰ値は０．０５未満である。 インビボでのｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶの神経毒性を示すグラフである。実施例２に記載のように、ｒＭｕＶIowa/US/06またはｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶを接種されたラットの脳水腫の重症度を測定した。ｒＭｕＶΔＶ−１は、ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶレスキュー＃４（ＰＸ２−ＳＰ−４８）であり、ｒＭｕＶΔＶ−２は、ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶレスキュー＃５（ＰＸ２−ＳＰ−５１）である；図１０に記載のとおりである）。ｒＭｕＶ対ｒＭｕＶΔＶ−１またはｒＭｕＶΔＶ−２のＰ値は、０．０５未満である。ｒＪＬ対ｒＭｕＶΔＶ１のＰ値は０．０５未満である。ＭｕＶについてはｎ＝３６、ｒＭｕＶΔＶ−１についてはｎ＝１６、そしてｒＭｕＶΔＶ−２についてはｎ＝１８である。 ＥＬＩＳＡを使用して血清中の抗ＭｕＶ抗体の力価を測定した結果を示す図である。図１８Ａは、血清を段階希釈して測定した力価を示すグラフである。 ＥＬＩＳＡを使用して血清中の抗ＭｕＶ抗体の力価を測定した結果を示す図である。図１８Ｂは、１：１０２４希釈における力価を示すグラフである。 ＭｕＶ−Ｆ及びＦ−ＭｕＶの概略図である。ＲＳＶ ＦをＦとＳＨの間に挿入して、ＭｕＶ−Ｆを生じさせることができ、リーダー配列とＮＰの間に挿入して、Ｆ−ＭｕＶを生じさせることができる。挿入図は、Ｆ挿入のより詳細な図表である。ウイルスｍＲＮＡ合成の開始及び終結にとって重要である、遺伝子開始（ＧＳ）、遺伝子間領域（Ｉ）、及び遺伝子終結（ＧＥ）の配列を示す。
２００６年には、およそ２０年で最大の流行性耳下腺炎の流行を米国は経験した（Ｍａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００８年，Ｖａｃｃｉｎｅ；２６（２９−３０）：３６０１−３６０７）。集団発生は、アイオワの大学で始まり、他の１１州に広がった。本発明により、アイオワの流行性耳下腺炎の流行に由来する臨床野生型分離株の完全なゲノム配列が決定された。ＭｕＶ−ＩＡ、ｒＭｕＶIowa/US/06、ＭｕＶ Ｉｏｗａ／ＵＳ／０６、ＭｕＶ−Ｉｏｗａ／ＵＳ／０６、またはＭｕＶ（Ｉｏｗａ／ＵＳ／０６）として本明細書で言及されるＩｏｗａ株であるこの分離株はまた、遺伝子型Ｇのメンバーであり、広範囲に使用されるＪｅｒｙｌ Ｌｙｎｎ（ＪＬ）流行性耳下腺炎ワクチンの遺伝子型Ａではない。逆遺伝学システムをこのムンプスウイルスについて作製し、その逆遺伝学システムを使用して、これらに限定されないが、ウイルスタンパク質ＳＨ（ｒＭｕＶΔＳＨ）及び／またはＶ（ｒＭｕＶΔＶ）の発現を欠く組換えＭｕＶを含む、種々の組換えＭｕＶコンストラクトを作製した。これらの組換えウイルスは、ワクチン産生のためにＷＨＯから承認された細胞株であるＶｅｒｏ細胞などの組織培養細胞中でよく増殖するが、動物モデルにおいて弱毒化しており、ＪＬワクチンと比べても少ない神経毒性を示す。これらの組換えウイルス及びそれらの派生体は、新世代のＭｕＶワクチンに適している。
パラミクソウイルス科ファミリーのメンバーであるムンプスウイルス（ＭｕＶ）は、１５，３８４ヌクレオチドのゲノムを有するマイナス鎖非分節ＲＮＡウイルスである。ウイルスゲノムには７つの遺伝子があるが、９つの既知ウイルスタンパク質がコードされている。ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）、リンタンパク質（Ｐ）、及び大型ＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ）タンパク質は、ウイルスＲＮＡゲノムの転写及び複製にとって重要である（Ｅｌａｎｇｏ ｅｔ ａｌ．，１９８８年，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ；６９（Ｐｔ １１）：２８９３−２９００；Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９２年，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；１８８：９２６−９３０；及びＲｉｍａ ｅｔ ａｌ．，１９８０年，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ；４６（２）：５０１−５０５）。Ｖ／Ｐ遺伝子は３つのタンパク質、Ｉ、Ｖ、及びＰをコードする（Ｐａｔｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌａｍｂ，１９９０，Ｊ Ｖｉｒｏｌ；６４：４１３７−４１４５）。Ｐ遺伝子内の変異は、ムンプスウイルスの病原性の増大と関連している（Ｓａｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９６年，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ；４０（４）：２７１−２７５）。Ｖタンパク質は、感染細胞におけるインターフェロンシグナル伝達の阻害に重要な役割を果たす（Ｋｕｂｏｔａ ｅｔ ａｌ．，２００２年，Ｊ Ｖｉｒｏｌ；７６（２４）：１２６７６−１２６８２；Ｔａｋｅｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９０年，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；１７８：２４７−２５３；Ｕｌａｎｅ ｅｔ ａｌ．，２００３年，Ｊ Ｖｉｒｏｌ；７７（１１）：６３８５−６３９３；及びＹｏｋｏｓａｗａ ｅｔ ａｌ．，２００２年，Ｊ Ｖｉｒｏｌ；７６（２４）：１２６８３−１２６９０）。糖タンパク質である融合（Ｆ）タンパク質は、細胞へのウイルス侵入にとって不可欠である細胞間融合及び細胞ウイルス融合の両方を、ｐＨに依存しない方法で媒介する（Ｗａｘｈａｍ ｅｔ ａｌ．，１９８７年，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；１５９：３８１−３８８）。別のウイルス糖タンパク質であるヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）もまたウイルス侵入に関与し（Ｔａｎａｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９２年，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；１８７：８０１−８０４）、ＨＮ遺伝子の変異は、ムンプスウイルスの病原性に関係している（Ｃｕｓｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８年，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ；３６（１２）：３７４３−３７４４）。マトリックス（Ｍ）タンパク質は、ウイルス構築に重要な役割を果たす（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，１９８２年，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ；２６（４）：２８５−３２０）。低分子疎水性（ＳＨ）タンパク質は、５７残基のＩ型疎水性内在性膜タンパク質である（Ｅｌａｎｇｏ ｅｔ ａｌ．，１９８８年，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ；６９（Ｐｔ １１）：２８９３−２９００）。
本発明は、本明細書に記載するムンプスウイルスゲノムを表わす単離ポリヌクレオチド配列並びにその断片及び派生体を含む。そのようなムンプスウイルスゲノムは、これらに限定されないが、野生型ＭｕＶ−ＩＡゲノムまたはウイルスタンパク質ＳＨ（ｒＭｕＶΔＳＨ）及び／若しくはＶ（ｒＭｕＶΔＶ）の発現を欠くムンプスウイルスゲノム、並びにそれらの派生体及び断片を含む。パラミクソウイルス科ファミリーのメンバーとしてのＭｕＶは、マイナス鎖非分節ＲＮＡゲノムを有する。従って、好ましい実施形態では、ＭｕＶ−ＩＡゲノムをコードする単離ポリヌクレオチド配列は、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）である。そのようなｃＤＮＡ配列の１つは配列番号１で示される。ＭｕＶ−ＩＡウイルスの遺伝子配列及びそれぞれのコード化タンパク質のアミノ酸配列は、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＰＩ）のウェブサイト（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｈｉｈ．ｇｏｖのワールドワイドウェブ上で利用可能である）上で、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＮ０１２２４２；バージョンＪＮ０１２２４２．１（ＧＩ：３３８７８４２４６）の下で知ることができ、その内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、ＭｕＶ−ＩＡゲノムを表わす単離ポリヌクレオチドはＲＮＡ分子である。ＭｕＶ−ＩＡゲノムを表わす単離ポリヌクレオチドは、ゲノムであってもアンチゲノムＲＮＡであってもｃＤＮＡであってもよい。ＭｕＶ−ＩＡゲノムを表わす単離ポリヌクレオチドは、アンチゲノムとも呼ばれる、複製中間体ＲＮＡに対応するＭｕＶゲノムのプラスセンスバージョンであってもよい。
更に、本明細書に記載する単離ポリヌクレオチドの派生体が本発明に含まれる。一部の実施形態では、その派生体は、本明細書に記載するポリヌクレオチド配列と、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有しうる。例えば、その派生体は、配列番号１またはその断片と、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有しうる。一部の実施形態では、その派生体は、本明細書に記載するアミノ酸配列または本明細書に記載するムンプスウイルスゲノムにコードされたアミノ酸配列と、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードしうる。例えば、その派生体は、配列番号１によってコードされたポリペプチド配列と、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチド配列をコードしうる。２つのポリヌクレオチド配列は、Ｔａｔｕｓｏｖａ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ，１９９９年，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ；１７４：２４７−２５０）に記載され、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｂｌ２．ｈｔｍｌのワールドワイドウェブ上で利用可能である、ＢＬＡＳＴ２探索アルゴリズムのＢｌａｓｔｎプログラムを使用して比較することができる。好ましくは、マッチに対する報酬＝１、ミスマッチに対するペナルティ＝−２、オープンギャップペナルティ＝５、伸長ギャップペナルティ＝２、ギャップｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ＝５０、期待値＝１０、ワードサイズ＝１１、フィルターｏｎを含む、すべてのＢＬＡＳＴ２探索パラメーターについてデフォルト値が使用される。
一部の実施形態では、その派生体は、本明細書で「高ストリンジェンシー条件」とも呼ばれる「ストリンジェントな条件」下で、本明細書に記載するポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする。例えば、その派生体は、ストリンジェントな条件下で配列番号１とハイブリダイズする。そのようなその派生体は、更に、本明細書に記載する種々の機能的な形質の１つまたは複数を示しうる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーは、当業者により容易に決定可能であり、一般に、プローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に応じて経験的に算定される。一般に、適切なアニーリングのためには、より長いプローブはより高い温度を必要とし、より短いプローブはより低い温度を必要とする。ハイブリダイゼーションは、一般に、相補鎖がそれらの融解温度を下回る環境下にあるときに変性ＤＮＡがリアニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能な配列との間の所望の相同性の程度が高いほど、使用することができる相対温度は高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をよりストリンジェントにする傾向があり、より低い温度は、ストリンジェントを弱める傾向がある。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの更なる詳細及び説明については、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，（１９９５）を参照されたい。本明細書で定義される「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー条件」は、以下のことにより確認することができる：（１）洗浄のための低イオン強度及び高温の使用、例えば、５０℃で０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムの使用；（２）ハイブリダイゼーション中のホルムアミドなどの変性剤の使用、例えば、４２℃で、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）と５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドの使用；または（３）４２℃での、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ及び１０％硫酸デキストランの使用、４２℃での０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）及び５５℃での５０％ホルムアミドによる洗浄、次いで、５５℃での、ＥＤＴＡを含有する０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄。
一部の態様では、その派生体は、派生体ヌクレオチド配列が「６の規則」に従うように、ヌクレオチド配列の欠失及び／または付加を含む。例えば、Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，１９９８年，Ｊ Ｖｉｒｏｌ；７２：８９１−８９９を参照されたい。
更に、単離ポリヌクレオチドの断片及びその派生体が本発明に含まれる。そのような断片は、例えば、９つのムンプスウイルスタンパク質の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つのみをコードする、ＭｕＶゲノムの一部のみを含むことができる。一部の態様では、断片はプライマーまたはプローブとして有用となりうる。
その断片は、表１または表２に記載のプライマー対の何れかにより決定されたムンプスウイルスゲノムの断片を含むことができる。例えば、ＰＣＲ反応において、プライマー対として、ＰＸ１Ｆ、ＰＸ３Ｆ、ＰＸ５Ｆ、ＰＸ７Ｆ、ＰＸ９Ｆ、ＰＸ１１Ｆ、ＰＸ１３Ｆ、ＰＸ１５Ｆ、ＰＸ１７Ｆ、ＰＸ１９Ｆ、ＰＸ２１Ｆ、ＰＸ２３Ｆ、ＰＸ２５Ｆ、ＰＸ２７Ｆ、ＰＸ２９Ｆ、ＰＸ３１Ｆ、またはＰＸ３３の何れか１つと、ＰＸ２Ｒ、ＰＸ４Ｒ、ＰＸ６Ｒ、ＰＸ８Ｒ、ＰＸ１０Ｒ、ＰＸ１２Ｒ、ＰＸ１４Ｒ、ＰＸ１６Ｒ、ＰＸ１８Ｒ、ＰＸ２０Ｒ、ＰＸ２２Ｒ、ＰＸ２４Ｒ、ＰＸ２６Ｒ、ＰＸ２８Ｒ、ＰＸ３０Ｒ、ＰＸ３２Ｒ、またはＰＸ３４Ｒの何れか１つとの対を、そして鋳型として本明細書に記載するポリヌクレオチド配列を使用して決定された断片。例えば、本発明の断片は、配列番号１上で、またはこれらに限定されないが、本明細書に記載するいずれのものも含む、別のムンプスウイルスゲノム上で、ＰＸ１Ｆ、ＰＸ３Ｆ、ＰＸ５Ｆ、ＰＸ７Ｆ、ＰＸ９Ｆ、ＰＸ１１Ｆ、ＰＸ１３Ｆ、ＰＸ１５Ｆ、ＰＸ１７Ｆ、ＰＸ１９Ｆ、ＰＸ２１Ｆ、ＰＸ２３Ｆ、ＰＸ２５Ｆ、ＰＸ２７Ｆ、ＰＸ２９Ｆ、ＰＸ３１Ｆ、またはＰＸ３３Ｆの何れか１つを順方向プライマーとして使用し、ＰＸ２Ｒ、ＰＸ４Ｒ、ＰＸ６Ｒ、ＰＸ８Ｒ、ＰＸ１０Ｒ、ＰＸ１２Ｒ、ＰＸ１４Ｒ、ＰＸ１６Ｒ、ＰＸ１８Ｒ、ＰＸ２０Ｒ、ＰＸ２２Ｒ、ＰＸ２４Ｒ、ＰＸ２６Ｒ、ＰＸ２８Ｒ、ＰＸ３０Ｒ、ＰＸ３２Ｒ、またはＰＸ３４Ｒの何れか１つを逆方向プライマーとして使用する場合に得られるＰＣＲ産物を表わしてもよい。
単離ポリヌクレオチド、派生体、またはそれらの断片は、ムンプス起源でない更なる配列を含むことができる。そのような異種配列は、例えば、プロモーター配列、転写開始配列、及び／または終止配列など、更なる抗原決定基または他の更なる成分をコードすることができる。
ＭｕＶ−ＩＡまたはその派生体若しくは断片など、ムンプスウイルスゲノムをコードする単離ポリヌクレオチド配列を組み込むベクター及び他のコンストラクトが本発明に含まれる。そのようなベクターは発現ベクターであってもよい。そのようなベクターコンストラクトの１つは、ＭｕＶ−ＩＡなど、ＭｕＶの完全なゲノムをコードするポリヌクレオチド配列を含むプラスミドである。そのようなプラスミドは、本明細書では「ｐＭｕＶ」と呼ばれる。本発明は、本明細書に記載するムンプスゲノムの何れかを含むｐＭｕＶを含む。一部の実施形態では、ゲノム配列はｃＤＮＡ配列であってもよい。
本発明は、ＭｕＶ−ＩＡ遺伝子配列、またはその変異体若しくは派生体など、本明細書に記載するムンプスウイルスを含む逆遺伝学システムを含む。逆遺伝学システムは、本明細書に含まれる実施例に詳細に記載されるように、インビトロ感染性ウイルス粒子を生成するために使用することができる。Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７年，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；２３７（２）：２４９−６０、及びＴｏｍｐｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００７年，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；３６２（１）：１３９−５０も参照されたい。そのような感染性ウイルス粒子は、本明細書で組換えＭｕＶと呼ばれ、また本明細書でｒＭｕＶとも呼ばれる。ｒＭｕＶは、組換え手段により作製され、従って天然には存在しない。ｒＭｕＶは、感染性ウイルス粒子として機能することができる。本明細書に記載するムンプスウイルスゲノムの何れかを発現するｒＭｕＶは、本発明に含まれる。例えば、これらに限定されないが、本明細書に記載するｒＭｕＶΔＳＨ、ｒＭｕＶΔＶ、またはｒＭｕＶΔＳＨΔＶコンストラクトを含む、低分子疎水性（ＳＨ）タンパク質産物を発現することができず、かつ／またはＶタンパク質産物を発現することができないムンプスウイルスゲノム。
本明細書に記載するムンプスウイルスゲノムは、Ｇ血清型またはＡ血清型に属しうる。ムンプスウイルスゲノムは、例えば、ムンプスウイルス株ＭｕＶ−ＩＡ、Ｇｌｏｕｃ１／ＵＫ９６（ＡＦ２８０７９９）、ＵＫ０１−２２、８７−１００４（ＡＦ３１４５６０）、ＳＩＰＡＲ ０２（ＡＦ３１４５５８）、Ｂｉｋｅｎ（ＡＦ３１４５６１）、８７−１００５（ＡＦ３１４５６２）、ＭｕＶ（２００１年）（ＡＦ３１４５５９）、Ｕｒａｂｅ １００４−１０／２（ＦＪ３７５１７７）、Ｕｒａｂｅ Ｇｗ７（ＦＪ３７５１７８）、Ｈｏｓｈｉｎｏ（ＡＢ４７０４８６）、Ｍｉｙａｈａｒａ（１９９２年）（ＮＣ＿００２２００）、ＭｕＶ Ｍｉｙａｈａｒａ（１９９２年）（２）（ＡＢ０４０８７４）、Ｙ２１３（ＡＢ５７６７６４）、Ｄｇ１０６２／Ｋｏｒｅａ／９８（３２１７２４６４）、Ｌ３／Ｒｕｓｓｉａ／Ｖｅｃｔｏｒ（ＡＹ５０８９９５）、Ｌ−Ｚａｇｒｅｂマスター種（ＡＹ６８５９２１）、Ｌ−Ｚａｇｒｅｂワクチン株（ＡＹ６８５９２０）、９２１８／Ｚｇ９８（２９９７６６３５５）、Ｎｏｖｏｓｂｒｉｓｋ遺伝子型Ｃ（５０４０４１６４）、ＰｅｔｒｏＮｏｖ遺伝子型Ｈ（ＡＹ６８１４９５）、８８−１９６１（ＡＦ４６７７６７）、Ｄｕ／ＣＲＯ０５（ＥＵ３７０２０７）、ＳＰ−Ａ（ＦＪ５５６８９６）、ＳＰ（ＥＵ８８４４１３）、ＳＰ（２００６）（ＤＱ６４９４７８）、ＪＬ２（ＡＦ３４５２９０１）、Ｊｅｒｙｌ Ｌｙｎｎ亜株（ＦＮ３１９８５）、Ｅｎｄｅｒｓ（ＧＵ９８００５２１）、Ｊｅｒｙｌ Ｌｙｎｎ主要成分（ＡＦ３３８１０６）、ＭｕＶ（２０００）（ＡＦ２０１４７３）、ＪＬ１（ＦＪ２１１５８６）、ＲＩＴ４３８５（ＦＪ２１１５８５）、またはＲＩＴ４３８５（２）（ＦＪ２１１５８４）であってもよい。一部の好ましい実施形態では、ムンプスウイルスゲノムはＭｕＶ−ＩＡである。
低分子疎水性（ＳＨ）タンパク質産物を発現することができないムンプスウイルスゲノムは、ＳＨタンパク質をコードする翻訳領域（ＯＲＦ）の欠失または開始コドンを停止コドンに変換する変異を含み得る。例えば、ＳＨタンパク質をコードする翻訳領域（ＯＲＦ）の欠失は、ＳＨタンパク質をコードするＯＲＦの約１５６ヌクレオチドの欠失を含み得る。
Ｖタンパク質産物を発現することができないムンプスウイルスゲノムは、Ｖタンパク質の発現を抑止する、Ｖ／Ｉ／Ｐ遺伝子に対する１つまたは複数の変異を含み得る。一部の態様では、Ｖタンパク質の発現を抑止する、Ｖ／Ｉ／Ｐ遺伝子に対する１つまたは複数の変異は、Ｐ／Ｖ遺伝子中の編集部位にヌクレオチド配列ＧＡＧＧＡＧＧＧを含み得る。
本発明のムンプスウイルスのゲノムは、１つまたは複数の更なる変異及び／または欠失を含み得る。一部の態様では、更なる変異または欠失は、Ｐタンパク質のリン酸化をもたらす変異または欠失を含み得る。一部の態様では、Ｐタンパク質のリン酸化をもたらす更なる変異または欠失は、Ｐタンパク質のＴ１４７及び／またはＳ３０７の変異または欠失を含み得る。更に、Ｉタンパク質産物の発現を可能にする配列を更に含む、本明細書に記載するムンプスウイルスゲノムは、本発明に含まれる。一部の態様では、更なる変異または欠失は、Ｌ遺伝子の変異または欠失を含み得る。一部の態様では、更なる欠失及び／または変異は、当業者に公知の任意のものから選択することができる。
本発明はまた、異種ポリペプチドを更にコードする、本明細書に記載するムンプスウイルスゲノムを含む。そのような異種ポリペプチドは、例えば、非ムンプス起源の抗原性ポリペプチドであっても、例えばＧＦＰ若しくはルシフェラーゼなどの検出可能マーカーであってもよい。
更に、本明細書に記載する単離ポリヌクレオチ配列、ｐＭｕＶ、ｒＭｕＶ、ベクターコンストラクト、ウイルス感染性粒子、及び／またはウイルスコンストラクトの１つまたは複数を含む組成物も、本明細書に含まれる。そのような組成物は、薬学的に許容可能な担体を含んでもよい。使用される場合、医薬として許容される担体は、ヒトまたは他の脊椎動物への投与に適した、１つまたは複数の適合する固体充填剤若しくは液体充填剤、希釈剤、または被包物質を指す。担体は、例えば、安定剤、防腐剤、及び緩衝剤を含む。適切な安定剤としては、例えば、ＳＰＧＡ、炭水化物（ソルビトール、マンニトール、デンプン、スクロース、デキストラン、グルタメート、若しくはグルコースなど）、タンパク質（乾燥乳清、アルブミン、若しくはカゼインなど）、またはそれらの分解産物が挙げられる。適切な緩衝剤としては、例えば、アルカリ金属リン酸塩が挙げられる。適切な防腐剤としては、例えば、チメロサール、メルチオレート、及びゲンタマイシンが挙げられる。希釈剤としては、これらに限定されないが、水、水性緩衝剤（緩衝食塩水など）、アルコール、及びポリオール（グリセロールなど）が挙げられる。そのような組成物及び／または担体は、パイロジェンフリーであってもよい。
本発明の組成物は、これらに限定されないが、水酸化アルミニウム；リン酸アルミニウム；ＱＳ−２１スティミュロン（Ｓｔｉｍｕｌｏｎ）；３−Ｏ−脱アセチル化モノホスホリルリピドＡ；ＩＬ−１２；Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）；Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ １１６３７、ｎｏｒ−ＭＤＰと呼ばれる）；Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ １９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと呼ばれる）；コレラ毒素；及びそのＢサブユニットを含むコレラ毒素の無毒誘導体；プロコレラゲノイド（ｐｒｏｃｈｏｌｅｒａｇｅｎｏｉｄ）、並びに真菌多糖を含む、アジュバントを含むことができる。
本発明の組成物は、他の病原性種に対する他の免疫学的に活性な抗原を含む、更なる活性免疫原を含むことができる。他の免疫学的に活性な抗原は、複製型作用物質であっても、非複製型作用物質であってもよい。複製型作用物質としては、例えば、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス（ｖａｒｉｓｃｅｌｌａ ｚｏｓｔｅｒ ｖｉｒｕｓ：ＶＺＶ）、パラインフルエンザウイルス（Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ：ＰＩＶ）、及び呼吸器合胞体ウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ：ＲＳＶ）の弱毒化形態が挙げられる。そのような更なる作用物質は、麻疹−流行性耳下腺炎−風疹（ｍｅａｓｌｅｓ−ｍｕｍｐｓ−ｒｕｂｅｌｌａ：ＭＭＲ）及び麻疹−流行性耳下腺炎−風疹−水痘（ｍｅａｓｌｅｓ−ｍｕｍｐｓ−ｒｕｂｅｌｌａ−ｖａｒｉｃｅｌｌａ：ＭＭＲＶ）の組合せワクチンの中で現在使用されているものの１つまたは複数であってもよい。そのような組成物の製剤は、当技術分野で周知である。
本発明はまた、本明細書に記載するウイルスベクター及び組成物を作製及び使用する方法を含む。本開示の組成物は、選択された投与経路に適合した種々の形態で、医薬品に製剤化することができる。当業者は、組成物が投与様式及び投与量単位に応じて異なるものになることを理解するであろう。本発明の作用物質は、これらに限定されないが、静脈内、局所的、経口、鼻腔内、皮下、腹腔内、筋肉内、及び腫瘍内送達を含む、種々の方法で投与するために製剤化することができる。一部の態様では、組成物は、粘膜への無針投与のために、例えば、上気道への鼻腔内投与のために製剤化される。哺乳動物被験体に医薬組成物を粘膜投与すると、被験体の全身性免疫応答の生成に加えて、投与部位から離れた粘膜組織を含む粘膜組織中で免疫応答が刺激されることになると予想される。
本発明はまた、本明細書に記載する単離ポリヌクレオチド配列、ｐＭｕＶ、ｒＭｕＶ、ベクターコンストラクト、感染性ウイルス粒子、ウイルスコンストラクト、または組成物を被験体に投与することにより被験体に免疫応答を誘導する方法を含む。免疫応答が防御免疫を付与しても、付与しなくてもよい。免疫応答は、例えば、体液性応答及び／または細胞性応答を含んでもよい。そのような免疫応答は、体液性免疫反応であっても、細胞性免疫応答であっても、及び／または粘膜性免疫応答であってもよい。体液性免疫応答は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及び／またはＩｇＥの応答を含み得る。体液性、細胞性、または粘膜性の免疫応答の判定は、これらに限定されないが、本明細書に記載するいずれの方法も含めて、種々の方法のいずれによっても確定することができる。免疫応答の誘導は、感染因子による将来の攻撃に向けた免疫系のプライミング及び／または刺激を含むことができ、将来の感染に対する免疫を準備する。そのような免疫応答の誘導は、防御応答として役立ち、一般に症状を軽減させる。この免疫応答は、自然免疫応答及び／または適応免疫応答を増強することができる。免疫原性は、これらに限定されないが、マウス、フェレット、及び／または非ヒト霊長類のモデル系を含む、種々の動物モデルのいずれでもアッセイすることができる。
本発明の単離ポリヌクレオチド配列、ｐＭｕＶ、ｒＭｕＶ、ベクターコンストラクト、感染性ウイルス粒子、ウイルスコンストラクト、または組成物は、被験体に投与されたとき、例えばＪＬワクチンなど、現在使用されている流行性耳下腺炎ワクチンと比較して、低下した神経毒性を示すことができる。神経毒性は、これらに限定されないが、通常使用される方法、及び新生ラットへの脳内接種を含めた神経毒性試験を含む、本明細書に記載するいずれの方法も含めた、種々の方法のいずれによってもアッセイすることができる（Ｒｕｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０００年，Ｊ Ｖｉｒｏｌ；７４：５３８２−５３８４）。
本発明はまた、本明細書に記載する単離ポリヌクレオチド配列、ｐＭｕＶ、ｒＭｕＶ、ベクターコンストラクト、感染性ウイルス粒子、ウイルスコンストラクト、または組成物を被験体に投与することにより被験体にワクチン接種する方法を含む。そのようなワクチン接種は、将来の感染による症状の軽減または緩和をもたらすことができ、将来の感染を予防することができる。好ましくは、これらの組成物には、流行性耳下腺炎感染の予防及び／または寛解において、免疫原性組成物として治療及び予防の用途がある。そのような用途では、本発明の少なくとも１つの弱毒化した組換えムンプスウイルスは、免疫学的に有効な量で、通常の流行性耳下腺炎感染の経過中に大幅な軽減を引き起こすような量で使用される。再び、免疫原性は、これらに限定されないが、マウス、フェレット、及び／または非ヒト霊長類のモデル系を含む、種々の動物モデルのいずれでもアッセイすることができる。本発明の単離ポリヌクレオチド配列、ｐＭｕＶ、ｒＭｕＶ、ベクターコンストラクト、感染性ウイルス粒子、ウイルスコンストラクト、または組成物は、被験体に投与されたとき、例えばＪＬワクチンなど、現在使用されている流行性耳下腺炎ワクチンと比較して、低下した神経毒性を示すことができる。神経毒性は、これらに限定されないが、通常使用される方法、及び新生ラットへの脳内接種を含めた神経毒性試験を含む、本明細書に記載のいずれの方法も含めた、種々の方法のいずれによってもアッセイすることができる（Ｒｕｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０００年，Ｊ Ｖｉｒｏｌ；７４：５３８２−５３８４）。
本発明の方法に関しては、種々の投与方法のいずれでも使用することができる。例えば、投与は、静脈内、局所的、経口、鼻腔内、皮下、腹腔内、筋肉内、または腫瘍内であってもよい。一部の態様では、投与は、例えば、噴霧、液滴、またはエアロゾルによって上気道に鼻腔内投与することによる、粘膜への無針投与である。
本開示の作用物質は、１回で投与しても、いくつかの複数回投与に分けて、ある時間間隔で投与してもよい。例えば、本発明の作用物質は、反復して、例えば、少なくとも２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、若しくはそれ以上の回数投与しても、または持続注入で投与してもよい。治療の正確な投与量及び期間は、治療される疾患の関数であり、公知の試験プロトコールを使用して経験的に、またはインビボもしくインビトロの試験データから外挿して決定することができることを理解されたい。濃度及び投与量はまた、緩和すべき症状の重症度に応じて異なりうることも留意されたい。任意の特定の被験体について、特定の投与レジメンを、個々の必要性及び組成物の投与を管理または監督する人の専門的な判断に従って時間経過とともに調整するべきであること、及び本明細書に記載のいかなる濃度範囲も単に例示的なものであり、特許請求の範囲の組成物及び方法の範囲または実施を限定するように意図するものではないことを更に理解されたい。
「治療有効量」で、所望の治療効果を得るために適用可能な妥当なベネフィット／リスク比で被験体を治療するために十分な量の化合物を意味する。しかしながら、本発明の化合物及び組成物の合計１日使用量は、健全な医療判断の範囲内で主治医により決定されることになることを理解されたい。いずれの特定の患者についても、特定の治療有効用量レベルは、例えば、治療される障害及び障害の重症度、使用される特定化合物の活性、使用される特定組成物、患者の年齢、体重、健康状態、性別、及び食事、使用される特定化合物の投与回数、投与経路、及び排泄速度、治療期間、使用される特定化合物と併用してまたは同時に使用される薬物、及び医療技術分野で周知の同様の因子を含む、種々の因子に依存することになる。
一部の治療実施形態では、作用物質の「有効量」は、少なくとも１つの病理学的パラメーターの軽減をもたらす量である。従って、例えば、本開示の一部の態様では、有効量は、作用物質で治療されない個体におけるパラメーターの予想される軽減と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、または少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の軽減を達成するのに効果的な量である。
本明細書で使用される場合、用語「被験体」は、これらに限定されないが、ヒト及び非ヒト脊椎動物を含む。好ましい実施形態では、被験体は哺乳動物、具体的にはヒトである。被験体は、個体であってもよい。被験体は、「個体」、「患者」、または「宿主」であってもよい。非ヒト脊椎動物は、家畜動物、伴侶動物、及び実験動物を含む。非ヒト被験体はまた、非ヒト霊長類、及びこれらに限定されないが、ラットまたはマウスなどの齧歯類を含む。非ヒト被験体はまた、限定はされないが、ニワトリ、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、フェレット、ミンク、及びウサギを含む。
本明細書で使用される場合、「インビトロ」は、細胞培養であり、「インビボ」は、被験体の体内である。本明細書で使用される場合、「単離」は、その天然環境（例えば、それが天然に存在するならば、その天然環境）から取り出されたか、組換え手法を使用して産生されたか、または化学的または酵素的に合成されたもので、従って、その天然状態から「人の手により」改変されている物質を指す。
本明細書で使用される場合、「単離」物質は、その天然環境から取り出されたか、組換え手法を使用して産生されたか、または化学的または酵素的に合成された物質である。例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または細胞は単離することができる。好ましくは、物質は精製される、即ち、天然において関係している他の成分から、少なくとも６０％フリー、好ましくは少なくとも７５％フリー、そして最も好ましくは少なくとも９０％フリーである。
本明細書で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、任意の長さのヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドの何れか）のポリマー形態を指し、二本鎖及び一本鎖のＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む。ポリヌクレオチドは、天然供給源から直接得ることができるか、または組換え手法、酵素的手法、または化学的手法の支援を受けて調製することができる。ポリヌクレオチドは、トポロジーが直鎖状であっても、環状であってもよい。ポリヌクレオチドは、例えば、発現ベクター若しくはクローニングベクターなどのベクターの一部または断片であってもよい。ポリヌクレオチドは、例えばコード領域及び調節領域などの非コード領域を含む、異なる機能を有するヌクレオチド配列を含んでもよい。
用語「及び／または」は、記載された要素の１つ若しくはすべてを、または記載された要素の任意の２つ以上の組合せを意味する。
単語「好ましい」及び「好ましくは」は、特定の状況下で特定の有益性を与えうる本発明の実施形態を指す。しかしながら、他の実施形態もまた、同じかまたは他の状況下で好ましいことがある。更に、１つまたは複数の好ましい実施形態の記述は、他の実施形態が有用でないことを意味するものではなく、本発明の範囲から他の実施形態を除外するように意図するものでもない。
用語「含む」及びその変化形は、これらの用語が本明細書及び特許請求の範囲に現れる場合、限定する意味を有するものではない。
特に明記されない限り、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、及び「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」は、互換的に使用され、１つまたは２つ以上を意味する。
特に指示されない限り、本明細書及び特許請求の範囲で使用される、成分量、分子量等を表現するあらゆる数字は、すべての場合に、用語「約」で修飾されているものとして理解されるべきである。従って、これに反する指示がない限り、本明細書及び特許請求の範囲に記載の数値パラメーターは、本発明により得ようと努める所望の特性に応じて異なりうる近似値である。最低限でも、そして特許請求の範囲の均等論を制限する試みとしてではなく、各数値パラメーターは、少なくとも、報告された有効桁の数字を考慮して、通常の丸め手法を適用することによって解釈されるべきである。
本発明の幅広い範囲を記載する数値範囲及び数値パラメーターは近似値であるが、具体例に記載の数値は、可能な限り正確に報告されている。しかしながら、すべての数値は、それぞれの試験測定で見出される標準偏差から必然的に得られる範囲を本質的に含有する。
本明細書は、説明的な実施形態を例示する。本出願の全体にわたりいくつかの箇所で、例の記載を通して案内がなされ、それらの例は種々の組合せで使用することができる。それぞれの実例では、列挙されたリストは、代表的なグループとしてのみ役立ち、排他的なリストとして解釈されるべきではない。
すべての標題は、読者の便宜のためであり、そのように明記されない限り、標題に続く本文の意味を限定するために使用されるべきものではない。
以下の実施例によって本発明を詳細に説明する。特定の実施例、材料、量、及び手順は、本明細書に記載の本発明の範囲及び精神に従って、幅広く解釈されるべきであることを理解されたい。
実施例１
最近の集団発生に関連した株に由来する野生型ムンプスウイルスのレスキューは、ムンプスウイルスの病変形成におけるＳＨ ＯＲＦの役割を明らかにする。
本実施例により、流行に由来する代表的な株（ＭｕＶ−ＩＡ）の完全なゲノムを配列決定した。ＭｕＶ−ＩＡは、遺伝子型Ｇのメンバーであり、２００４〜２００５年における英国での集団発生に関連したＭｕＶと同じ遺伝子型である。逆遺伝学システムを、ＭｕＶ−ＩＡ（ｒＭｕＶ−ＩＡ）のために構築し、ＳＨ遺伝子の翻訳領域（ＯＲＦ）を欠くウイルス（ｒＭｕＶΔＳＨ）をレスキューするために使用した。Ｌ９２９細胞のｒＭｕＶΔＳＨ感染は、ｒＭｕＶ−ＩＡと比較して、ＮＦ−κＢ活性化、ＴＮＦ−α産生、及びアポトーシスの増加を誘導した。ｒＭｕＶΔＳＨは、動物モデルにおいて弱毒化していた。これらの結果から、ウイルス感染の間における、ＴＮＦ−αシグナル伝達の妨害及びウイルス病変形成に、ＭｕＶのＳＨ ＯＲＦが重要な役割を果たすことが示された。
結果
ＭｕＶ−ＩＡの完全なゲノム配列。米国での最近の集団発生に関連したウイルスの遺伝子特性をよりよく理解するために、アイオワ州の集団発生に由来する代表的な分離株の完全なゲノム配列を決定した。これは、ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＪＮ０１２２４２として入手可能である。Ｊｅｒｙｌ Ｌｙｎｎ、Ｕｒａｂｅ、８８．１９６１、及びＰｅｔｒｏＮｏｖのゲノム配列の比較から得られたコンセンサス配列に基づいて、一連のプライマーを設計した。これらのプライマーを表１に示す。ランダムヘキサマーを使用してＭｕＶ−ＩＡのウイルスＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、次いで、プライマーのセットを使用してＰＣＲ反応を行い、対応するプライマーを使用してその産物を配列決定した。次いで、配列決定の結果に基づいた第２セットのプライマーを使用して、ＲＴ−ＰＣＲを実施し、第１回の配列決定断片の産物と重複する産物をこのプライマーを使用して配列決定した。この第２セットのプライマーを表２に示す。リーダー配列及びトレーラー配列は、５’／３’ＲＡＣＥを実施することにより決定した。
Figure 2014512804
Figure 2014512804
ＭｕＶ−ＩＡのＳＨタンパク質配列を遺伝子型Ｇのムンプスウイルスの他の株と比較すると、ＳＨタンパク質の推定上の膜貫通ドメイン内に１つの保存的変化が存在するだけであり（図１Ａ）、ＭｕＶ−ＩＡが遺伝子型Ｇに属することが確認された（Ｒｏｔａ ｅｔ ａｌ．，２００９年，Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ；８１（１０）：１８１９−１８２５）。ＭｕＶ−ＩＡのゲノム分岐を更に研究するために、ＭｕＶ−ＩＡのゲノム配列及びＧｅｎｂａｎｋからの３２の完全長ゲノム配列を使用して、系統樹を作製した（図１Ｂ）。系統発生解析から、ＭｕＶ−ＩＡが、２００５年にクロアチアで単離された、遺伝子型ＧのウイルスであるＭｕＶ Ｄｕ／ＣＲＯ０５の配列（Ｓａｎｔａｋ ｅｔ ａｌ．，２００６年，Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ；７８（５）：６３８−６４３）と最も近縁であることが示された。ＭｕＶ−ＩＡとＪｅｒｙｌ Ｌｙｎｎワクチン（主要成分）とのタンパク質コード領域間の予測アミノ酸配列の比較から、ＮＰ、Ｍ、及びＬのタンパク質配列は、９８％超の同一性で高度に保存されているが、Ｖ、Ｐ、Ｆ、ＳＨ、及びＨＮのタンパク質の間には、より大きな分岐があることがわかった（図１Ｃ）。予測ＳＨタンパク質配列の同一性は、８５％にすぎなかった。
ＭｕＶ−ＩＡに対する感染性ｃＤＮＡクローンの生成。ＭｕＶ−ＩＡの病変形成を研究するために、逆遺伝学システムを導入した。ＲＮＡウイルスは疑似種として存在するので、ゲノムのコンセンサス配列を組換えＭｕＶに対するベースとして使用した。ＰＩＶ５ミニゲノム発現プラスミドに類似した、ムンプスウイルスのためのルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ：Ｌｕｃ）レポーター遺伝子を有するミニゲノムを含有するプラスミド（ｐＴ７−ＭｕＶ−Ｍｉｎｉ−Ｌｕｃ）を、ｒＭｕＶ−ＩＡのトレーラー配列及びリーダー配列を使用して構築した（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００５年，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；３３８（２）：２７０−２８０）。加えて、ｐＣＡＧＧＳベクター内のＮＰ、Ｐ、及びＬをコードするプラスミドを入手して、配列決定により確認した。プラスミドの機能性を試験するために、ＢＳＲＴ７細胞にプラスミドを形質移入した。２ｄｐｉに、細胞を回収し、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）アッセイを実施した。ＰまたはＬを欠くプラスミドではない、すべてのプラスミドで形質移入された細胞で、Ｌｕｃ活性が検出され、プラスミドが機能的なＰ及びＬのタンパク質を発現することが示された。ＲＴ−ＰＣＲを行って、完全なゲノムを表わすＤＮＡ断片を増幅し、個々のプラスミドベクターに挿入して、完全長ゲノムに組み立てた。Ｔ７（ｐＭｕＶ−ＩＡ）プロモーターの制御下で発現されるＭｕＶ−ＩＡの完全長ゲノムを有するプラスミド（ｐＭｕＶ−ＩＡ）は、感染性ＰＩＶ５を生成するために使用されたプラスミドに類似していた（Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７年，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；２３７：２４９−２６０）。ＭｕＶ−ＩＡのコンセンサス配列と比較すると、ｐＭｕＶ−ＩＡでは、Ｌ ＯＲＦ内で、１１８６３（ＴからＣに）及び１２０２８（ＣからＴに）の位置にある２つのヌクレオチドが変化していた。しかしながら、これらのヌクレオチド変化はいずれも、予測Ｌタンパク質配列に変化をもたらすものではなかった。組換えＭｕＶ（ｒＭｕＶ−ＩＡ）を、ＭｕＶＩＡの完全長ゲノムを含有するプラスミドを使用してレスキューした。ＢＳＲＴ−７細胞に、ｐＭｕＶ−ＩＡ及びウイルスＲＮＡポリメラーゼ成分を発現するプラスミドを同時形質移入した。個々のプラークを選択してＶｅｒｏ細胞中で増幅した。レスキューされたウイルスの全ゲノムを配列決定し、入力ｃＤＮＡゲノム配列と一致することを見出した。
ｒＭｕＶ及びＭｕＶ−ＩＡの増殖の時間経過を比較するために、マルチサイクル増殖アッセイを実施した（図２Ａ）。両方のウイルスとも、Ｖｅｒｏ細胞において同様のピーク力価まで増殖した。感染細胞の上清中のウイルス力価は、感染後の最初の２日間で指数関数的に増加し、４８ｈｐｉに１０7ｐｆｕ／ｍｌの力価に到達した。ＨｅＬａ細胞（ヒト細胞株）、ＭＤＢＫ細胞（ウシ細胞株）、及びＬ９２９細胞（マウス細胞株）での両ウイルスの増殖も比較し、これら２つのウイルス間に明白な差を観察しなかった。更に、ウエスタンブロットを使用して、細胞におけるウイルスタンパク質発現レベルを検討した（図２Ｂ）。タンパク質レベルが感染後の様々な時点で同様であり、組織培養細胞において、ｒＭｕＶの複製がＭｕＶ−ＩＡと類似していることが示された。
加えて、追加の遺伝子としてＥＧＦＰまたはウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｅｎｉｌａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ：ＲＬ）タンパク質の何れかを発現する感染性組換えウイルスをレスキューした。ｐＭｕＶ−ＩＡにおいて、Ｆ遺伝子とＳＨ遺伝子の間に、ＳＨの遺伝子開始（ｇｅｎｅ ｓｔａｒｔ：ＧＳ）とＮＰの遺伝子終結（ｇｅｎｅ ｅｎｄ：ＧＥ）によって挟まれたＥＧＦＰ遺伝子を挿入することによって、ｐＭｕＶＥＧＦＰを構築し、ｐＭｕＶ−ＥＧＦＰにおいて、ＥＧＥＰのコード配列をウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬ）のコード配列で置換することにより、ｐＭｕＶ−ＲＬを構築した。感染Ｖｅｒｏ細胞におけるＥＧＦＰまたはＲＬの発現を検出した（図２Ｃ及び２Ｄ）。
ＳＨ ＯＲＦを欠く組換えムンプスウイルスのレスキュー。ＭｕＶのＳＨタンパク質の機能を研究するために、ＳＨ遺伝子のＳＨ遺伝子翻訳領域（ＯＲＦ）内の１５６ヌクレオチドを、ｐＭｕＶ−ＩＡから欠失させた。短縮ＳＨ ＯＲＦは、オリジナルＳＨ ＯＲＦの開始及び遺伝子終結によって挟まれた５アミノ酸残基をコードする短いＯＲＦを含有した（ｐＭｕＶ−ＩＡΔＳＨ、図３Ａ）。ＳＨ ＯＲＦを欠く感染性ＭｕＶをレスキューし（ｒＭｕＶΔＳＨ）（図３Ｂ及び３Ｃ）、そのゲノムを配列決定した。その配列は入力ｃＤＮＡ配列と一致した。ｒＭｕＶΔＳＨゲノムのサイズは、１５，２２８ｎｔからなり、「６の規則」に従っていた（Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，１９９８年，Ｊ Ｖｉｒｏｌ；７２：８９１−８９９）。ｗｔＭｕＶ及びｒＭｕＶはＳＨタンパク質を発現し、ｒＭｕＶΔＳＨは発現しないことを確認するために、感染Ｖｅｒｏ細胞の細胞溶解物を、抗ＳＨ並びに抗ＮＰ及び抗Ｐによる免疫ブロッティングにより調べた（図３Ｄ）。ＳＨは、ＭｕＶ−ＩＡ及びｒＭｕＶの感染細胞で検出されたが、ｒＭｕＶΔＳＨ感染細胞では検出されず、ｒＭｕＶΔＳＨ感染細胞ではＳＨタンパク質発現の欠如が確認された。
ｒＭｕＶ及びｒＭｕＶΔＳＨの分析。ｒＭｕＶΔＳＨの増殖速度を検討するために、複数サイクルの増殖曲線及びタンパク質発現レベルをＶｅｒｏ細胞で調べた。ｒＭｕＶΔＳＨ感染Ｖｅｒｏ細胞から放出されたウイルスの力価は、すべての時点でｒＭｕＶ感染Ｖｅｒｏ細胞と同様のままであった（図４Ａ）。感染細胞を溶解し、ウエスタンブロットを使用してウイルスタンパク質発現レベルを比較すると、ｒＭｕＶΔＳＨ感染細胞及びｒＭｕＶ感染細胞における、ＮＰ及びＰのタンパク質レベルは同様であり（図４Ｂ）、ＳＨ ＯＲＦがＶｅｒｏ細胞におけるウイルス遺伝子発現またはウイルス放出にとって必須ではないことが示された。これは以前の発見と一致している。ＨＮ遺伝子はＳＨ遺伝子の下流にある。ＨＮの発現レベルに対してＳＨ ＯＲＦの欠失が何らかの重要な影響を及ぼすか否かを調べるために、フローサイトメトリーを使用して感染細胞のＨＮ及びＮＰの発現レベルを調べた。図４Ｃに示すように、ｒＭｕＶ感染細胞及びｒＭｕＶΔＳＨ感染細胞におけるＨＮの相対発現レベルは同様であり、ＳＨ ＯＲＦ配列の欠失がＨＮタンパク質の発現に影響を及ぼさないことが示唆された。更に、ＨＮのｍＲＮＡ発現レベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用して調べた。ｒＭｕＶとｒＭｕＶΔＳＨの間で顕著な差は観察されなかった（図４Ｄ）。興味深いことには、ｒＭｕＶＳＨは、ｒＭｕＶと比較して、Ｖｅｒｏ細胞でより大きなプラークを形成した（図４Ａ）。
ｒＭｕＶΔＳＨは、Ｌ９２９細胞に細胞変性効果を誘導した。我々は、ｒＭｕＶΔＳＨ及びｒＭｕＶによるＶｅｒｏ、ＭＤＢＫ、及びＨｅＬａ細胞の感染を比較した。感染後１日目には、ｒＭｕＶΔＳＨ感染またはｒＭｕＶ感染のＶｅｒｏ細胞及びＭＤＢＫ細胞に観察可能な差はなかった。我々の研究室の以前の研究では、ＰＩＶ５及びＲＳＶのＳＨ ＯＲＦがＴＮＦ−αシグナル伝達の遮断にある役割を果たすことが示された。ムンプスウイルスＳＨ ＯＲＦがＴＮＦ−αシグナル伝達経路の調節にある役割を有するという仮説を試験するために、ＴＮＦ−α処理後にアポトーシスを受けるＬ９２９細胞でのｒＭｕＶΔＳＨの表現型を検討した。ｒＭｕＶΔＳＨ感染は、ｒＭｕＶまたはｗｔＭｕＶによる感染よりも顕著に多くの細胞死をもたらした。表現型は感染後２日目に明らかになった（図５Ｂ）。ｒＭｕＶΔＳＨ感染Ｌ９２９細胞に観察された細胞変性効果（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ：ＣＰＥ）がアポトーシスにより引き起こされたものか否かを検討するために、ＴＵＮＥＬアッセイを実施した。１ｄｐｉにおいて、ｒＭｕＶΔＳＨによる感染は、ｒＭｕＶよりもアポトーシスの感染細胞をより高い割合でもたらし（図５Ｃ）、ＳＨの欠如が感染細胞にアポトーシスの増加をもたらすことが示された。
ＴＮＦ−αは、ｒＭｕＶΔＳＨ誘導アポトーシスに重要な役割を果たした。ｒＭｕＶΔＳＨ感染Ｌ９２９細胞のアポトーシスが上昇したＴＮＦ−αに起因するものか否かを試験するために、ｒＭｕＶΔＳＨ感染Ｌ９２９細胞におけるＮＦ−κＢの活性化を、ＮＦ−κＢのキーサブユニットであるｐ６５の核移行を調べることにより検討した。ＮＦ−κＢ因子は細胞質の中に局在化する。例えばＴＮＦ−α刺激によって活性化すると、ｐ６５が核に移行する（Ｂａｕｄ ａｎｄ Ｋａｒｉｎ，２００１年，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ；１１（９）：３７２−３７７）。より高レベルのｐ６５核局在化がｒＭｕＶΔＳＨ感染Ｌ９２９細胞に観察され（図６Ａ）、ＮＦ−κＢの活性化が示された。ＴＮＦ−α産生がｒＭｕＶΔＳＨ感染細胞で増加するか否かを検討するために、感染細胞の上清を回収し、ＥＬＩＳＡを使用してＴＮＦ−αレベルを測定した。ＴＮＦ−α産生レベルは、ｒＭｕＶΔＳＨ感染細胞で上方制御されていた（図６Ｂ）。ＴＮＦ−αの増加がｒＭｕＶΔＳＨ感染細胞におけるアポトーシスの増加にある役割を果たすか否かを判定するために、感染細胞をＴＮＦ−αに対する中和抗体で処理した。抗ＴＮＦ−αは、ｒＭｕＶΔＳＨ感染細胞のＣＰＥを減少させたが、対照抗体は効果を示さず（図６Ｃ）、ＴＮＦ−αがｒＭｕＶΔＳＨ誘導細胞死に重要な役割を果たすことが示された。これはＴＵＮＥＬアッセイで確認された（図６Ｄ）。１ｄｐｉに、対照抗体処理では、ｒＭｕＶΔＳＨは、ｒＭｕＶよりもほぼ４倍高いアポトーシス率を誘導した。抗ＴＮＦ−α抗体の処理は、感染細胞の細胞死を効果的に遮断した（図６Ｃ、Ｄ）。
ＭｕＶ−ＩＡのＳＨは、インビトロでのＴＮＦ−αシグナル伝達を遮断した。単独で発現したＭｕＶ−ＩＡ ＳＨがＴＮＦ−αシグナル伝達を遮断しうるか否かを検討するために、ＭｕＶ−ＩＡのＳＨをコードするプラスミドを、ＮＦ−κＢプロモーター−ルシフェラーゼレポーターシステムと共にＬ９２９細胞に同時形質移入した。形質移入後１日目に、細胞をＴＮＦ−αで処理した。ＴＮＦ−αシグナル伝達は、ＭｕＶ−ＩＡのＳＨ及びＰＩＶ５のＳＨにより遮断されたが、ＭｕＶ−ＩＡのＮＰ（図７Ａ）またはＳＨ ＯＲＰの配列（図７Ｂ）によっては遮断されず、ＳＨタンパク質がＴＮＦ−α媒介シグナル伝達を遮断できることが示された。
ｒＭｕＶΔＳＨはインビボでは弱毒化していた。ＭｕＶはヒトウイルスであり、ウイルスの病変形成を研究する理想的な動物モデルは存在しない。新生ラットへのＭｕＶの脳内注入を使用して、ＭｕＶの種々の株の相対的な病原性を比較した（Ｒｕｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００５年）。ウイルスの神経毒性を比較するために、ｒＭｕＶまたはｒＭｕＶΔＳＨを新生ラットの脳に脳内注入した。相対神経毒性スコアを、脳水腫の相対重症度に基づいて算出した。図８に示すように、ｒＭｕＶΔＳＨは、ｒＭｕＶよりも低い神経毒性スコアを示し、ＳＨ ＯＲＦの欠失がインビボでの弱毒化をもたらすことが示された。
考察
ＭｕＶに対する免疫は、米国で１歳及び５歳の小児に投与される、２回接種のＭＭＲ（流行性耳下腺炎、麻疹、及び風疹）ワクチンレジメンの一部である。２回のワクチン接種スケジュールでも、大規模な集団発生がワクチン接種を受けた集団に起こった。本実施例では、米国及び欧州での最近の集団発生に関連した株を代表する野生型ムンプスウイルスのレスキューについて記載されている。本実施例では、ＴＮＦ−αの調節における、ＳＨタンパク質の潜在的な役割が同定され、ＳＨ ＯＲＦの欠失がインビボでの弱毒化をもたらすことが実証され、ＳＨがウイルスの病変形成にある役割を果たすことが示された。インビボでのｒＭｕＶΔＳＨの弱毒化は、ＳＨ ＯＲＦを欠失させることが、弱毒化されたムンプス株を開発するための可能な戦略となりうることを示唆する。ＧＦＰ及びＲＬなどの外来遺伝子を発現する組換えＭｕＶが得られており、興味深いことには、Ｖｅｒｏ細胞におけるｒＭｕＶ−ＲＬのＲＬ発現レベルは、２０継代後にも比較的高いままであり、おそらくＭｕＶをベクターとして使用することができることを示している。
パラミクソウイルスのＳＨタンパク質は、ＰＩＶ５感染細胞で最初に同定された（Ｈｉｅｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９８５年，Ｊ Ｖｉｒｏｌ；５５：７４４−７５１）。同様の遺伝子がＭｕＶのＥｎｄｅｒｓ株の配列分析に基づいて予測された。しかしながら、推定上のＳＨ遺伝子の遺伝子間配列の変異により、Ｅｎｄｅｒｓ株ＭｕＶのＳＨタンパク質は感染細胞に発現されない（Ｔａｋｅｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１年，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；１８１：３６４−３６６）。従って、ＭｕＶのＳＨタンパク質は、ＭｕＶ感染細胞に検出されなかった。Ｗｉｌｓｏｎらは、ＰＩＶ５のゲノム内のＳＨ ＯＲＦをＭｕＶのＥｎｄｅｒｓ株のＳＨ ＯＲＦで置き換え、ＭｕＶ ＳＨがＰＩＶ５のＳＨ ＯＲＦに機能的に置き換わることができることを見出した（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００６年，Ｊ Ｖｉｒｏｌ；８０（４）：１７００−０９）。従って、ＭｕＶ ＳＨの機能は、近縁関係にあるパラミクソウイルスであるＰＩＶ５のＳＨ ＯＲＦの機能と同じであると考えられる。本実施例において、ＳＨの発現が初めてＭｕＶ感染細胞に検出され、ＭｕＶ感染細胞にＳＨタンパク質の存在が確認された。更に、新しい逆遺伝学システムを利用して、ＳＨ ＯＲＦを欠く組換えＭｕＶ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＭｕＶ ｌａｃｋｉｎｇ ｔｈｅ ＳＨ ＯＲＦ：ｒＭｕＶΔＳＨ）が得られ分析された。
興味深い観察の１つは、ｒＭｕＶΔＳＨがより大きなプラークを生成することであった。可能な説明としては、ＳＨ ＯＲＦの欠失が野生型ウイルスよりもよく細胞間融合を促進するウイルスをもたらしたことがある。ＯＲＦの総数にも遺伝子の全体的な順序にも変化がなかったので、我々は、ｒＭｕＶΔＳＨのウイルスｍＲＮＡの相対量及びウイルスタンパク質の発現レベルが野生型ウイルスと同様であるはずであると予想する（図４Ｂ、４Ｃ、及び４Ｄ）。従って、ｒＭｕＶΔＳＨによる大きなプラーク形成が高レベルのウイルスタンパク質発現によるものである可能性は低い。更に、ＭｕＶ ＨＮ及びＦを形質移入された細胞を使用する融合アッセイを、ＭｕＶ ＳＨの存在下または非存在下で実施して、細胞間融合の程度に差がないことを観察し、ＳＨが細胞間融合の促進に役割を有しないことが示唆された。ｒＭｕΔＳＨにより形成されたより大きなプラークがｒＭｕＶΔＳＨによる高レベルの細胞死の誘導による可能性がある。ウイルスは同じ速度で細胞に感染した；しかしながら、ｒＭｕＶΔＳＨが感染した細胞には、ｒＭｕＶよりも多くの細胞死が誘導され、プラークの端でより迅速な細胞死がもたらされた。
一部のＯＲＦに由来するｍＲＮＡが生物機能を有しうる可能性がある。例えば、ＰＩＶ５のＬ ＯＲＦのｍＲＮＡは、ＩＦＮ−β発現を活性化することができる（Ｌｕｔｈｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１１年，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ；１０８（５）：２１１８−２１２３）。本実施例では、ＳＨのＯＲＦが欠失しており、ＳＨ ＯＲＦによりコードされたポリペプチドの機能をＳＨ ｍＲＮＡ自体と識別することができない。ＳＨポリペプチドはＴＮＦ−α媒介シグナル伝達を遮断するために必要であったが、ＳＨ ＯＲＦの配列は必要ではなく、我々は、ムンプスウイルスの病変形成におけるＳＨポリペプチドの重要な役割を支持する；しかしながら、欠失したＳＨ遺伝子から発現される可能性のある小さなｍＲＮＡがｒＭｕＶΔＳＨの表現型に寄与したであろう可能性がある。新生ラットの脳におけるｒＭｕＶΔＳＨの神経毒性の軽減は、ＳＨ ＯＲＦがウイルスの病変形成に重要な役割を果たしていることを示す。我々は、ｒＭｕＶΔＳＨによる感染がより高レベルの炎症促進性サイトカインの発現を誘導して、感染のより迅速な消失をもたらし、それによって、感染した脳の損傷を限定的にすると提案する。
材料及び方法
プラスミド、ウイルス、及び細胞。分子クローニングはすべて、以前に記載された標準手順に従って行った（Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７年，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；２３７：２４９−２６０）。ＭｕＶ−ＩＡ ＮＰ、Ｐ、及びＬ遺伝子は、ｐＣＡＧＧＳ発現ベクターにクローン化した（Ｎｉｗａ ｅｔ ａｌ．，１９９１年，Ｇｅｎｅ；１０８：１９３−２００）。ＭｕＶ−ＩＡ ＳＨ遺伝子は、ｐＣＡＧＧＳ発現ベクターにクローン化した。ＭｕＶ−ＩＡ ＳＨ（停止コドン）は、３つの連続した停止コドン配列を、ＳＨ ＯＲＦの開始コドンの６ヌクレオチド下流に導入することにより構築した。ｐＵＣ１９におけるＭｕＶ−ＩＡの完全長ｃＤＮＡの構築は、ＰＩＶ５の逆遺伝学システムと類似していた（Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７年，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；２３７：２４９−２６０）。ｐＭｕＶΔＳＨを構築するために、４番目〜５７番目のアミノ酸のＳＨ ＯＲＦ領域（１５６ｎｔ）を、サブクローニングを容易にし、ゲノムの長さを６の倍数に維持するように（「６の規則」として知られている）設計された短い６ヌクレオチド配列と置き換えた。ｐＭｕＶ−ＥＧＦＰ及びｐＭｕＶ−ＲＬは、Ｆ遺伝子開始とＳＨ遺伝子終結に挟まれたＥＧＦＰまたはウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子の何れかをＦとＳＨの遺伝子間に挿入することにより構築した。
ｃＤＮＡから感染性ウイルスをレスキューするために、完全長ゲノムまたは変異ＭｕＶゲノムを含有するプラスミド（５μｇ）を、プラスミドｐＣＡＧＧＳ−Ｌ（１μｇ）、ｐＣＡＧＧＳ−ＮＰ（１．５μｇ）、及びｐＣＡＧＧＳ−Ｐ（２００ｎｇ）と共に、ＢＳＲＴ−７細胞に同時形質移入した。通常形質移入後４〜７日目に、形質移入されたＢＳＲＴ−７細胞で融合細胞形成を観察することができた。上清をＶｅｒｏ細胞の中にプラークした。４〜７ｄｐｉにプラークは視覚化することができた。各独立したレスキューに由来する１つまたは２つのプラークをＶｅｒｏ細胞の中で増幅し、それらのゲノムを配列決定した。
Ｖｅｒｏ、ＨｅＬａ、ＭＤＢＫ、及びＬ９２９細胞は、１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ）及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ｈｏｌｕ Ｈｉｌｌ，ＦＬ）を含有するダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ：ＤＭＥＭ）中で維持し、ＢＳＲＴ−７細胞は、１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ、及び１０％トリプトースリン酸ブロス（ｔｒｙｐｔｏｓｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｒｏｔｈ：ＴＰＢ）に加え、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８を添加したＤＭＥＭ中で維持した。細胞を５％ＣＯ2、３７℃で培養し、感染または形質移入の前日に、記録された８０〜９０％のコンフルエンスに翌日なるように適切な希釈比で継代した。ウイルス感染については、１％ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡ）を添加したＤＭＥＭ中で、細胞に０．０１、３、または５のＭＯＩでウイルスを感染させ、５％ＣＯ2、３７℃で１〜２時間インキュベートした。次いで、培地を、２％ＦＢＳ及び１％Ｐ／Ｓを添加したＤＭＥＭと交換した。形質移入については、製造業者提供のプロトコールに従い、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＰＬＵＳ（商標）及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）試薬を使用して、細胞にプラスミドを形質移入した。
ＭｕＶ−ＩＡ（ＭｕＶ／Ｉｏｗａ／ＵＳ／２００６）は、２００６年の集団発生の初期段階に流行性耳下腺炎症例から得られた頬側スワブから、Ｉｏｗａ Ｈｙｇｅｎｉｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにて分離した。遺伝子型分析はＣＤＣで実施し（Ｒｏｔａ ｅｔ ａｌ．，２００９年，Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ；８１（１０）：１８１９−１８２５）、ＳＨ配列の受託番号はＤＱ６６１７４５である。ムンプスウイルスはすべて、Ｖｅｒｏ細胞中で増殖させ、４〜７ｄｐｉに回収した。ウイルス力価は、以前に記載されたように（Ｈｅ ａｎｄ Ｌａｍｂ，１９９９年，Ｊ Ｖｉｒｏｌ；７３：６２２８−６２３４；及びＨｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７年，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；２３７：２４９−２６０）、プラークアッセイ及びその後のギムザ染色によりＶｅｒｏ細胞で測定した。
ウイルスの配列決定。ウイルスＲＮＡは、ＱＩＡＧＥＮ社製のＱＩＡａｍｐＲウイルスＲＮＡ抽出ミニキットを使用し、製造業者のプロトコールに従って、細胞培養上清から抽出した。単離した全ＲＮＡは、ランダムヘキサマーと共にＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＳｕｐｅｒ ＳｃｒｉｐｔＲ ＩＩＩ逆転写酵素を使用して、ｃＤＮＡに逆転写した。次いで、合成されたｃＤＮＡを、ムンプスウイルスゲノム特異的プライマー（表１）及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＴａｑポリメラーゼを使用するＰＣＲのための鋳型として活用した。それぞれ順方向及び逆方向のプライマーを含む１５組のプライマー（表２に示す）を、１５の重複する断片にゲノムを分割するように設計した。これらのプライマーは、ＰＣＲ産物のその後の配列決定のために使用した（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１年，Ｊ Ｖｉｒｏｌ；８５（１）：３２−４２）。リーダー配列及びトレーラー配列は、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅法（Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ）（ＲＡＣＥ）（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１年，Ｊ Ｖｉｒｏｌ；８５（１）：３２−４２）の標準プロトコールに従って配列決定した。
ムンプスのＮＰ、Ｐ、及びＳＨに対するモノクローナル及びポリクローナル抗体の作製。ＭｕＶ−ＩＡに対するモノクローナル抗体を作製するために、ウイルスをＶｅｒｏ細胞中で増殖させた。感染したＶｅｒｏ細胞の培地を回収し、３Ｋ ｒｐｍで１０分間、低速遠心分離して清澄化した。ウイルスを含有する清澄化培地を、２０％スクロース溶液１０ｍｌの上に載せ、４℃、４０Ｋ ｒｐｍで、１．５時間遠心分離した。ペレットを１０×ＰＢＳ ０．５ｍｌ中に再懸濁し、８０％ショ糖溶液１．３ｍｌと混合し、底部から上部に向けて低下するショ糖勾配：５０％ショ糖溶液１．８ｍｌ及び１０％ショ糖溶液０．６ｍｌを重ねた。底部にウイルスを含むショ糖勾配を、４℃、４５Ｋ ｒｐｍで、３時間（ｈ）遠心分離した。１ｍｌ分画を回収し、１×ＴＥＮ緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ｂａｓｅ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）１０ｍｌと混合し、４℃、４０Ｋ ｒｐｍで、１．５時間遠心沈殿させた。ウイルスを含有するペレットを、５０μｌの１×ＴＥＮ緩衝液及び１％ＮＰ−４０の中に懸濁し、マウスハイブリドーマ細胞の生成のために使用した。ＭｕＶ−ＩＡのＮＰ及びＰに対するモノクローナル抗体を産生するマウスハイブリドーマ細胞を、ペンシルベニア州立大学（Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）のコア施設で操作した。このハイブリドーマを、２０％ＦＢＳ及び０．１％ゲンタマイシンに加え、ピルピン酸ナトリウムを添加したＤ−ＭＥＭ中で、５％ＣＯ2、３７℃にて培養した。
ＭｕＶ−ＩＡ ＳＨに対するポリクローナル抗体を作製するために、２つのペプチド（Ｎ末端ＭＰＡＩＱＰＰＬＹＬＴＦＬＬＣ（配列番号１０）及びＣ末端ＣＹＱＲＳＦＦＨＷＳＦＤＨＳＬ（配列番号１１））を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入した。ＭｕＶ−ＩＡ Ｖ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に対するポリクローナル抗体をウサギで作製するために、２つのペプチド（ＱＦＩＫＱＤＥＴＧＤＬＩＥＴＣ（配列番号１２）及びＣＳＲＰＤＮＰＲＧＧＨＲＲＥＷ（配列番号１３））を使用した。
抗ＴＮＦ−αによる感染細胞の処理。６ウェルプレート中のＬ９２９細胞に、ｒＭｕＶΔＳＨまたはｒＭｕＶを５のＭＯＩで感染させ、２％ＦＢＳ及び１％Ｐ／Ｓを添加したＤＭＥＭ中で、５０μｇ／ｍｌの中和抗ＴＮＦ−α抗体または対照抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と共に、１日間または２日間培養した。１日目または２ｄｐｉに、デジタルカメラを装着した顕微鏡で細胞を撮影し、次いで、ＭｕＶ−ＮＰ染色またはＴＵＮＥＬアッセイのために回収した。
フローサイトメトリー及びＴＵＮＥＬアッセイ。フローサイトメトリーを、以前に記載されたように実施した（Ｔｉｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００８年，Ｊ Ｖｉｒｏｌ；８２（１８）：９１２３−９１３３）。６ウェルプレート中のＬ９２９細胞に、ｒＭｕＶΔＳＨ若しくはｒＭｕＶまたは模擬感染を、３または５のＭＯＩで実施した。１または２ｄｐｉに、付着細胞をトリプシン処理し、培地中の浮遊細胞と合わせた。細胞を遠心分離し、リン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）中の０．５％ホルムアルデヒドに４℃で１時間再懸濁した。次いで、固定細胞をＰＢＳで洗浄し、５０％ＦＣＳ−５０％ＤＭＥＭ及び３容量の７０％エタノールの中で一晩透過性にした。透過性になった細胞を、製造業者のプロトコールに準拠する、アポトーシス細胞に対するＴＵＮＥＬ染色または感染率のためのＭｕＶ−ＮＰ染色の何れかに供した。ＮＰ染色のための細胞の場合、モノクローナルＭｕＶ−ＮＰ抗体を１：２００に希釈した後、１：１００の希釈比でＰＥ抗マウス二次抗体染色を行った。
Ｖｅｒｏ細胞に模擬感染、またはｒＭｕＶΔＳＨ若しくはｒＭｕＶを０．５若しくは０．０１のＭＯＩで感染させた。２４または４８ｈｐｉに、付着細胞を浮遊細胞と合わせて回収し、固定した。ＨＮ表面染色については、１：５０の希釈比で抗ＨＮを用いて細胞を直接染色した；ＨＮ及びＮＰ染色の全染色については、固定細胞をＰＢＳ中の０．１％サポニンで透過性にし、１：２００の希釈比で抗ＮＰを用いて、または１：５０の希釈比で抗ＨＮを用いて染色した。
ＮＦ−κＢ活性化の検出アッセイ。６ウェルプレート中のガラスカバースリップ上のＬ９２９細胞に、０．０１のＭＯＩでｒＭｕＶΔＳＨ若しくはｒＭｕＶを感染、または模擬感染させた。２ｄｐｉに、カバースリップをＰＢＳで洗浄し、０．５％ホルムアルデヒドで固定した。０．１％サポニンを加えたＰＢＳで固定細胞を透過性にし、次いで、０．１％サポニン含有ＰＢＳ中でマウス抗Ｐ６５（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と共に、続いてＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウス二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）と共にインキュベートした。デジタルカメラを装着した蛍光顕微鏡を使用して細胞を撮影した。
ＮＦ−κＢレポーターアッセイシステムは、以前に記載されたように実施した（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００６年，Ｊ Ｖｉｒｏｌ；８０（４）：１７００−０９）。Ｌ９２９細胞を２４ウェルプレートに播種し、ｐκＢ−ＴＡＴＡ−Ｌｕｃ（ＮＦ−κＢプロモーター領域とそれに続くＴＡＴＡボックスエンハンサー及びホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有するレポータープラスミド）並びにｐＣＡＧＧＳ−ＲＬ（ウミシイタケルシフェラーゼタンパク質を発現する形質移入対照プラスミド）に加えて、空ベクター、ｐＣＡＧＧＳ−ＭｕＶ ＳＨ、ｐＣＡＧＧＳ−ＭｕＶ ＳＨ（停止）、ｐＣＡＧＧＳ−ＰＩＶ５ ＳＨ、またはｐＣＡＧＧＳ−ＭｕＶ ＮＰの何れかを、ＰＬＵＳ（商標）及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）試薬を使用して形質移入した。形質移入後２日目に、細胞の半分を、Ｏｐｔｉｍａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において、１０ｎｇ／ｍｌ濃度のＴＮＦ−α（Ａｌｅｘｉｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）を用いて、５％ＣＯ2、３７℃で４時間処理し；細胞の半分を、Ｏｐｔｉｍａのみで処理した。次いで、細胞を１×受動溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）１００μｌで溶解し、溶解物１０μｌを、デュアルルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用するデュアルルシフェラーゼアッセイに供した。ＴＮＦ−α刺激細胞対非ＴＮＦ−α刺激細胞の比を、「ルシフェラーゼ活性の誘導」として使用する。
免疫ブロッティング。６ウェルプレート中の約９０％コンフルエンスのＶｅｒｏ細胞に、模擬、ＭｕＶ−ＩＡ、ｒＭｕＶ、またはｒＭｕＶΔＳＨを、０．０５のＭＯＩで感染させた。感染後０時間、２４時間、４８時間、または７２時間に細胞を回収し、以前に記載されたように（Ｌｕｔｈｒａ ｅｔ ａｌ．，２００８年，Ｊ Ｖｉｒｏｌ；８２（２１）：１０８８７−１０８９５）、ＷＣＥＢ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ｐＨ８．０、１２０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ＮＰ−４０、０．０００７６％ＥＧＴＡ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール）０．５ｍｌ中でプロテアーゼ阻害剤の混合物を用いて溶解した。細胞溶解物を短時間遠心分離して細胞片を除去した。細胞溶解物を１０％または１７．５％のポリアクリルアミドゲルに負荷し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。タンパク質を、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−ＦＬ転写膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写し、一次抗体（抗ＭｕＶ ＳＨ １：２５０、抗ＭｕＶ Ｖ １：５００、抗ＭｕＶ ＮＰ １：５０００、抗ＭｕＶ Ｐ １：２０００）及び西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した対応二次抗体と共にインキュベートし、Ａｍｅｒｓｈａｍ ＥＣＬ（商標）ウエスタンブロッティング検出キット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により検出した。
細胞培養におけるｒＭｕＶΔＳＨ、ｒＭｕＶ、及びＭｕＶ−ＩＡ感染の時間経過。６ｃｍプレート中の細胞に、ＭｕＶ−ＩＡ、ｒＭｕＶ、またはｒＭｕＶΔＳＨを０．０１のＭＯＩで感染させた。上清１００μｌを、感染後０時間、２４時間、４８時間、７２時間に回収し、１％ＢＳＡを添加して−８０℃で凍結した。ウイルス力価は、２４ウェルプレート中のＶｅｒｏ細胞を使用して、プラークアッセイを３回繰り返して測定した。ウイルスとの１〜２時間のインキュベーション後に、増殖培地を、２％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ、及び１％低融点アガロースを含有する半固体ＤＭＥＭに交換した。４〜７ｄｐｉに、２４ウェルプレートのＶｅｒｏ細胞をギムザ染色液で染色し、プラークをカウントした。
ＴＮＦ−αの酵素結合免疫吸着測定法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）。６ウェルプレート中のＬ９２９細胞に、模擬、ｒＭｕＶ、またはｒＭｕＶΔＳＨを５のＭＯＩで感染させた。培地を１ｄｐｉ、２ｄｐｉ、及び３ｄｐｉに回収した。培地に分泌されたＴＮＦ−αの量を、以前に記載された手順（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１年，Ｊ Ｖｉｒｏｌ；８５（１）：３２−４２）に従い、マウスＴＮＦ−α検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して測定した。
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ。Ｖｅｒｏ細胞に模擬感染、またはｒＭｕＶΔＳＨ若しくはｒＭｕＶを０．００５のＭＯＩで感染させた。ウイルスＲＮＡをＱＩＡＧＥＮ ＲＮｅａｓｙｍｉｎｉキットを使用して、４ｄｐｉに感染細胞から抽出し、プライマーとしてオリゴｄＴを使用して、ｃＤＮＡに逆転写した。ＭｕＶ Ｆ及びＨＮ ｍＲＮＡ特異的ＦＡＭタグ付きプローブを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標）から購入した。リアルタイムＰＣＲを、製造業者のプロトコールに従い、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｉｘを使用して組み立てた。Δｃｔを使用してＨＮ ｍＲＮＡ対Ｆ ｍＲＮＡ間の比を算出した。
ＭｕＶ神経毒性の検査。ラット神経毒性試験を、以前に記載されたように（Ｒｕｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０００年，Ｊ Ｖｉｒｏｌ；７４：５３８２−５３８４）実施した。新生ラットに、ＥＭＥＭ２０μｌ中のｒＭｕＶ（ｎ＝３６）またはｒＭｕＶΔＳＨ（ｎ＝２４）を１００ｐｆｕ脳内に接種した。注入１か月後に動物を屠殺して脳を摘出し、浸漬固定してパラフィン包埋した。脳の各半球に由来する、解剖学的正中線から一定距離にある１０μｍ矢状切片を１つ選択し、ヘマトキシリン及びエオジンで染色した。神経毒性スコアは、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ画像解析ソフトウェア（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）を使用して、脳（小脳以外）の横断面に基づき、対になった脳に由来する組織切片上の側脳室のパーセントとして算出した。神経毒性スコアは、ラット脳当たり２つの組織切片のそれぞれに関するこれら２つの測定の平均比率（パーセント）として定義した。計画した１か月エンドポイントの前に、疼痛または苦痛の徴候を示したいずれのラットも、直ちに人道的に安楽死させ、分析に含めた。実験動物の管理及び使用のためのＮＩＨガイドライン（ＮＩＨ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）を、全体を通して厳守した。
更に現在、本実施例の結果は、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，”Ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ ｍｕｍｐｓ ｖｉｒｕｓ ｆｒｏｍ ａ ｓｔｒａｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｒｅｃｅｎｔ ｏｕｔｂｒｅａｋｓ ｈｅｌｐｓ ｔｏ ｄｅｆｉｎｅ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ＳＨ ＯＲＦ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｍｕｍｐｓ ｖｉｒｕｓ，”Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；４１７（１）：１２６−３６（２０１１年８月１５日に公表；Ｅｐｕｂ ２０１１年６月１４日）で知ることができる。
実施例２
ムンプスウイルスのＶタンパク質は病変形成に重要な役割を果たす。
ムンプスウイルス（ＭｕＶ）は、耳下腺炎などの比較的軽度の症状から髄膜炎及び脳炎などの重症度の高い合併症に及ぶ多岐にわたる徴候を特徴とするヒトの急性感染症を引き起こす。広く普及したムンプスワクチン接種がムンプス発生率を劇的に低下させた；しかしながら、集団発生は依然としてワクチン接種を受けた集団に起こる。ＭｕＶのＶタンパク質は、細胞培養で発現されると、インターフェロン（ＩＦＮ）の発現及びシグナル伝達並びにインターロイキン６（ＩＬ−６）のシグナル伝達を遮断する。本実施例では、Ｖタンパク質を発現することができない組換えＭｕＶ（ｒＭｕＶΔＶ）を生成した。レスキューされたＭｕＶは、米国における最近の集団発生から取り出された臨床野生型分離株に由来する（ＭｕＶIowa/US/06、Ｇ遺伝子型）。このウイルスの分析により、ＩＦＮの発現及びシグナル伝達並びにＩＬ−６のシグナル伝達の遮断における、Ｖタンパク質の役割が確認された。ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶウイルスがインビトロで高レベルのＩＬ−６発現を誘導することも見出され、ＶがＩＬ−６発現の低下にある役割を果たすことが示唆された。インビボでは、ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶウイルスは高度に弱毒化しており、Ｖタンパク質がウイルスの病原性に不可欠な役割を果たしていることが示された。
ＭｕＶのＲＮＡゲノムは、１５，３８４のヌクレオチド長である。それは９つの既知のウイルスタンパク質をコードする。ＭｕＶのＶタンパク質は、２２４のアミノ酸残基を有し、すべてのパラミクソウイルスの間で保存されるシステイン（Ｃｙｓ）リッチのＣ末端を含有する。Ｖタンパク質は、ＩＦＮ活性化遺伝子発現のために重要な転写因子であるＳＴＡＴ１の分解を通してインターフェロン（ＩＦＮ）シグナル伝達経路を妨害する（Ｋｕｂｏｔａ ｅｔ ａｌ．，２００２年，Ｊ Ｖｉｒｏｌ；７６：１２６７６−１２６８２）。ＭｕＶ Ｖタンパク質のＣｙｓリッチのＣ末端内のトリプトファンリッチモチーフは、ＳＴＡＴ１のＮ末端領域を介する（Ｙｏｋｏｓａｗａ ｅｔ ａｌ．，２００２年，Ｊ Ｖｉｒｏｌ；７６：１２６８３−１２６９０）ＳＴＡＴ１のユビキチン化及び分解（Ｋｕｂｏｔａ ｅｔ ａｌ．，２００２年，Ｊ Ｖｉｒｏｌ；７６：１２６７６−１２６８２；Ｋｕｂｏｔａ ｅｔ ａｌ．ａｌ．，２００１年，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ；２８３：２５５−２５９；及びＮｉｓｈｉｏ ｅｔ ａｌ．，２００２年，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；３００：９２）において不可欠である。Ｖタンパク質はまた、Ｔｒｐ−Ａｓｐ（ＷＤ）反復を含有し、かつＩＦＮ受容体とＳＴＡＴ１の間の相互作用を媒介する受容体活性化Ｃキナーゼ（ＲＡＣＫ１）と関連することが実証されている。Ｖ−ＲＡＣＫ１相互作用は、Ｖタンパク質によるＩＦＮシグナル伝達の遮断に寄与する、ＳＴＡＴ１とＲＡＣＫ１の解離をもたらす（Ｋｕｂｏｔａ ｅｔ ａｌ．，２００２年，Ｊ Ｖｉｒｏｌ；７６：１２６７６−１２６８２）。この相互作用は、ＳＴＡＴ１の完全な分解が起こる前に、ＩＦＮシグナル伝達を遮断するために重要となりうる（Ｋｕｂｏｔａ ｅｔ ａｌ．，２００５年，Ｊ Ｖｉｒｏｌ；７９：４４５１−４４５９）。ＭｕＶのＶタンパク質はまた、感染細胞におけるＩＦＮ発現の活性化に重要な役割を果たすＲＮＡヘリカーゼであるＭＤＡ５と相互作用し（Ａｎｄｒｅｊｅｖａ ｅｔ ａｌ．，２００４年，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ；１０１：１７２６４−１７２６９）、ＩＦＮ発現の活性化を遮断する。Ｖタンパク質のＣｙｓリッチＣ末端は、ＭＤＡ５のヘリカーゼＣドメインを介するＭＤＡ５とＶタンパク質の相互作用にとって不可欠である（Ｐａｒｉｓｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００９年，Ｊ Ｖｉｒｏｌ；８３：７２５２−７２６０；Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ ａｎｄ Ｈｏｒｖａｔｈ，２０１０年，Ｊ Ｖｉｒｏｌ；８４：１１１５２−１１１６３）。Ｖタンパク質は、κＢキナーゼε阻害物質（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ κＢ ｋｉｎａｓｅ ε：ＩＫＫｅ）／腫瘍壊死因子受容体関連因子（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ：ＴＲＡＦ）ファミリーメンバー−関連ＮＦ−κＢアクチベーター（ＴＡＮＫ）−結合キナーゼ１（ＴＢＫ１）の基質として働くことができ、インターフェロン調節因子−３（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ ３：ＩＲＦ３）の活性化の阻害をもたらす。Ｖタンパク質とＴＢＫ１／ＩＫＫｅの間の相互作用は、ＩＦＮ発現にとって重要な転写因子であるＩＲＦ３の活性化を阻害し、ＩＦＮ発現の遮断をもたらす（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，２００８年，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ；２８３：１４２６９−１４２７６）。Ｖタンパク質は、インターロイキン６（ＩＬ−６）媒介シグナル伝達及び腫瘍形成にとって重要な転写因子であるＳＴＡＴ３の分解を引き起こす（Ｕｌａｎｅ ｅｔ ａｌ．，２００３年，Ｊ Ｖｉｒｏｌ；７７：６３８５−６３９３）。Ｖタンパク質内の点変異（位置９５でのＥからＤ）により、ＳＴＡＴ３を分解の標的にするその能力は影響を受けることなく、ＳＴＡＴ１の分解が可能になるＶタンパク質が生じる。ＩＦＮシグナル伝達を遮断するＶタンパク質の能力は、ウイルスの病変形成にとって重要であると思われる（Ｒｏｓａｓ−Ｍｕｒｒｉｅｔａ ｅｔ ａｌ．，２０１０年，Ｖｉｒｏｌ Ｊ；７：２６３）。本実施例では、Ｖタンパク質をもはや発現することができない組換えＭｕＶ（ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ）を生成した。レスキューされたＭｕＶは、米国における最近の集団発生に由来する臨床野生型（ＷＴ）分離株から取り出された（ＭｕＶIowa/US/06、Ｇ遺伝子型）。これは、ウイルス感染の文脈における、ＭｕＶのＶタンパク質の機能に関する最初の研究である。
材料及び方法
プラスミド、ウイルス、及び細胞。ＭｕＶ株のＭｕＶIowa/US/06は、米国における２００６年の中西部ムンプス集団発生期間中の患者から得られた。ウイルス（ｐＭｕＶIowa/US/06）の完全長ｃＤＮＡクローンを、実施例１に記載のように構築した（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，２０１１年，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；４１７：１２６−１３６も参照のこと）。このプラスミドは、Ｐ／Ｖ遺伝子の編集部位（ＧＧＧＧＧＧ；配列番号１４のヌクレオチド１〜６）をＧＡＧＧＡＧＧＧ（配列番号１５のヌクレオチド１〜８）に変化させ、「６の規則」に従うように、更に４つの塩基対（ＣＴＡＧ；配列番号１６のヌクレオチド３〜６）を遺伝子の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ；配列番号１６）に付加することにより、Ｖタンパク質を発現しないように改変した（Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，１９９８年，Ｊ Ｖｉｒｏｌ；７２：８９１−８９９）。
感染性ウイルスをレスキューするために、プラスミドｐＭｕＶIowa/US/06（５μｇ）を、プラスミドｐＣＡＧＧＳ−Ｌ、（１μｇ）、ｐＣＡＧＧＳ−ＮＰ（１．５μｇ）、及びｐＣＡＧＧＳ−Ｐ（２００ｎｇ）と共に、ＢＳＲＴ−７細胞に形質移入した。３日後に、形質移入されたＢＳＲＴ−７細胞を、Ｖｅｒｏ細胞と１：１で混合した。１０〜１４日後に、融合細胞形成が観察された場合、ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶを含有する上清を回収し、Ｖｅｒｏ細胞でプラークを精製した。プラーク（感染後［ｄｐｉ］４〜７日発達させる）をＶｅｒｏ細胞で増幅し、それらのゲノムを配列決定した。レスキュー手順を反復して、ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶの独立したストックを生成した。
Ｖｅｒｏ、ＨｅＬａ、ＭＤＢＫ、及びＬ９２９細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）を含有したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持した（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ｈｏｌｕ Ｈｉｌｌ，ＦＬ）。ＢＳＲＴ−７細胞は、１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ、及び１０％トリプトースリン酸ブロス（ＴＰＢ）に加え、４００μｇ／ｍｌジェネテシンＧ４１８抗生物質を添加したＤＭＥＭ中で維持した。細胞を５％ＣＯ2、３７℃で培養し、感染または形質移入の前日に、８０〜９０％のコンフルエンスに翌日なるように適切な希釈比で継代した。ウイルス感染については、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加したＤＭＥＭ中で、細胞に０．０１、３、または５の感染多重度（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：ＭＯＩ）でウイルスを感染させ、５％ＣＯ2、３７℃で１〜２時間インキュベートした。次いで、接種培地を、２％ＦＢＳ及び１％Ｐ／Ｓを添加したＤＭＥＭと交換した。ＰＬＵＳ及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用し、製造業者から提供されたプロトコールに従って、細胞にプラスミドを形質移入した。
ムンプスウイルスはすべて、Ｖｅｒｏ細胞中で増殖させ、４〜７ｄｐｉに回収した。ウイルス力価は、以前に記載されたように（Ｈｅ ａｎｄ Ｌａｍｂ，１９９９年，Ｊ Ｖｉｒｏｌ；７３：６２２８−６２３４；Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７年，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；２３７：２４９−２６０）、プラークアッセイによりＶｅｒｏ細胞で測定した。パラインフルエンザウイルス５（ＰＩＶ５）及びＶタンパク質のＣ末端の発現を欠く組換えＰＩＶ５（ｒＰＩＶ５ＶΔＣ）を、以前に記載されたように増殖させた（Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，２００２年，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；３０３：１５−３２）。
ウイルスの配列決定。ウイルスＲＮＡは、ＱＩＡａｍｐウイルスＲＮＡ抽出ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用し、製造業者のプロトコールに従って、細胞培養上清から抽出した。単離したウイルスＲＮＡは、ランダムヘキサマーと共にＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｃＤＮＡに逆転写した。次いで、合成されたｃＤＮＡは、ムンプスウイルスゲノム特異的プライマー（表１に示す）及びＴａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用するＰＣＲのための鋳型として活用した。それぞれ順方向及び逆方向のプライマーを含む１５組のプライマー（表２に示す）を、１５個の重複する断片にゲノムを分割するように設計した。次いで、これらのプライマーは、ＰＣＲ産物のその後の配列決定のために使用した（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００６年，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；３４６：２１９−２２８）。リーダー配列及びトレーラー配列は、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅法（ＲＡＣＥ）（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１年，Ｊ Ｖｉｒｏｌ；８５：３２−４２）の標準プロトコールに従って配列決定した。
フローサイトメトリー及びＴＵＮＥＬアッセイ。フローサイトメトリーは、以前に記載されたように（３６）実施した。６ウェルプレート中のＨｅＬａ細胞またはＶｅｒｏ細胞に模擬感染、またはｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ、ｒＭｕＶIowa/US/06、若しくはＭｕＶIowa/US/06を０．１若しくは０．５のＭＯＩで感染させた。感染後２４時間（ｈｐｉ）、４８ｈｐｉ、７２ｈｐｉ、または９６ｈｐｉに、付着細胞をトリプシン処理し、培地中の浮遊細胞と合わせた。細胞を遠心分離し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の０．５％パラホルムアルデヒドに４℃で１時間再懸濁した。次いで、固定細胞をＰＢＳで洗浄し、５０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）−５０％ＤＭＥＭ及び３容量の７０％エタノールの中で一晩透過性にした。透過性になった細胞を、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ媒介ｄＵＴＰ−ビオチンニック末端標識（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄＵＴＰ−ｂｉｏｔｉｎ ｎｉｃｋ ｅｎｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ：ＴＵＮＥＬ）染色、またはタンパク質発現レベルのためのＭｕＶIowa/US/06−ＮＰ、ＭｕＶIowa/US/06−Ｐ、若しくはＭｕＶIowa/US/06−ＨＮ染色の何れかに供した。ＮＰ染色については、モノクローナルＭｕＶIowa/US/06−ＮＰ抗体を１：２００に希釈し；Ｐ染色については、モノクローナルＭｕＶIowa/US/06−Ｐ抗体（実施例１に記載のように；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，２０１１年，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；４１７：１２６−１３６も参照のこと）を１：５０に希釈した後、フルオレセインイソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ：ＦＩＴＣ）抗マウス二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）染色を１：１０，０００の希釈で行った。ＨＮ染色については、ポリクローナルＭｕＶIowa/US/06−ＨＮを１：５０に希釈した後、ＦＩＴＣ抗ウサギ二次抗体染色を１：１０，０００の希釈比で行った。ＴＵＮＥＬ染色は、製造業者のプロトコール（Ｒｏｃｈｅ）に従い、以前に記載されたように実施した（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，２００９年，ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ；５：ｅ１０００５２５；Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，２００４年，Ｊ Ｖｉｒｏｌ；７８：５０６８−５０７８）。
免疫ブロッティング。６ウェルプレート中のほぼ９０％コンフルエンスのＶｅｒｏ細胞に模擬感染、またはｒＭｕＶIowa/US/06若しくはｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶを０．０１若しくは０．５のＭＯＩで感染させた。以前に記載されたように（Ｒｕｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１年，Ｖａｃｃｉｎｅ；２９：２８５０−２８５５；Ｒｕｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０００年，Ｊ Ｖｉｒｏｌ；７４：５３８２−５３８４）、感染後の様々な時点で、ＷＣＥＢ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］、１２０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ＮＰ−４０、０．０００７６％ＥＧＴＡ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール）０．５ｍｌ中で、プロテアーゼ阻害剤の混合物を用いて細胞を溶解し回収した。細胞溶解物を短時間遠心分離して細胞片を除去し、１０％または１７．５％のポリアクリルアミドゲル上に負荷し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。タンパク質を、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−ＦＬ転写膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）に転写し、一次抗体（抗ＭｕＶIowa/US/06 Ｖ、１：５００；抗ＭｕＶIowa/US/06 ＮＰ、１：５，０００；抗ＭｕＶIowa/US/06 Ｐ、１：２，０００［４３］、抗ＳＴＡＴ１、１：２００（＃Ｂ２４１０；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）；抗ＳＴＡＴ２、１：２００（＃０７−２２４；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）；抗ＳＴＡＴ３、１：２００（＃Ｆ３００；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）及び西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した対応二次抗体と共にインキュベートし、Ａｍｅｒｓｈａｍ ＥＣＬウエスタンブロッティング検出キット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して検出した。
ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ及びｒＭｕＶIowa/US/06の増殖曲線。６ｃｍプレートまたは６ウェルプレート中の細胞に、ｒＭｕＶΔＶまたはｒＭｕＶを０．０１のＭＯＩで感染させた。感染後０時間、２４時間、４８時間、及び７２時間（ＨｅＬａでは、２４時間、４８時間、７２時間、１２０時間、１６８時間、２１６時間、２６４時間）に、上清を１ｍｌ（６ｃｍプレート）または１００μｌ（６ウェルプレート）回収し、１％ＢＳＡを添加して８０℃で保存した。ウイルス力価は、６ウェルプレート中のＶｅｒｏ細胞を使用して、プラークアッセイを３回繰り返して測定した。ウイルスとの１〜２時間（ｈ）のインキュベーション後に、増殖培地を、２％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓ、及び１％低融点アガロースを含有するＤＭＥＭに交換した。４〜７ｄｐｉに、６ウェルプレートのＶｅｒｏ細胞をギムザ染色液で染色し、プラークをカウントした。
ＩＦＮ−β及びＩＬ−６に対するＥＬＩＳＡ。１２ウェルプレート中で、ＨｅＬａ細胞若しくは２９３Ｔ細胞に、模擬感染、またはＰＩＶ５−ＷＴ（ＭＯＩ ５）、ｒＰＩＶ５−ＶΔＣ（ＭＯＩ−５）、ｒＭｕＶIowa/US/06（ＭＯＩ ０．５）、若しくはｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ（ＭＯＩ ０．５）ウイルスを感染させた。感染後２４時間及び４８時間に上清を回収した。培地中に分泌されたＩＬ−６の量は、ＯｐｔＥＩＡヒトＩＬ−６酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）キット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して測定し、ＩＦＮ−βは、以前に記載されたように（１６、１８）、ＶｅｒｉＫｉｎｅヒトＩＦＮ−β ＥＬＩＳＡキット（ＰＢＬ ＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＳｏｕｒｃｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用し、製造業者の説明書に従って測定した。
神経毒性試験。レスキューしたウイルスの神経毒性表現型は、以前に記載されたように（Ｒｕｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０００年，Ｊ Ｖｉｒｏｌ；７４：５３８２−５３８４）、ラットにおけるＭｕＶ感染の主要な神経病理学的転帰であるＭｕＶ誘導脳水腫の程度を測定することにより評価した。手短に言えば、３リターの８〜１０匹の新生ルイスラットに、プラスミドｐＭｕＶIowa/US/06からレスキューされた２つのウイルスストックのそれぞれ及びプラスミドｐＭｕＶIowa/US/06ΔＶからレスキューされた２つのウイルスストックのそれぞれを１００ＰＦＵ含有するＤＭＥＭ１０μｌを用いて脳内接種した。接種後３０日目に、実験動物の管理及び使用のためのＮＩＨガイドラインに従って、ラットをＣＯ2窒息により人道的に屠殺した。脳を摘出し、１０％中性緩衝ホルマリン中にて４℃で４〜５日間浸漬固定した後、パラフィン包埋した。吻側−尾部正中線の両側に由来する、基準距離で得られた矢状切片をヘマトキシリン−エオジンで染色した。
神経毒性スコアは、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ画像解析ソフトウェア（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐｒｉｎｇ，ＭＤ）を使用して測定した、脳（小脳以外）の横断面と側脳室の横断面（神経毒性のあるＭｕＶ株による感染の後に拡大する）との比を算出することにより決定した。ラット脳当たり２つの組織切片のそれぞれに関するこれら２つの測定の平均比率（パーセントで示す）を、その特定の脳に対する神経毒性スコアとする。各ウイルスの神経毒性スコアは、処置群内のすべての脳に対する平均神経毒性スコアである。ｔ検定または非正規データ（Ｓｈａｐｉｒｏ−Ｗｉｌｋ検定に失敗）、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ順位和検定（α＝０．０５）を使用して、すべての比較がなされた。
結果
Ｖタンパク質の発現を欠く組換えＭｕＶ（ｒＭｕＶΔＶ）の回収。ウイルス感染の文脈の中でウイルスの病変形成におけるＶタンパク質の役割を検討するために、我々は、Ｖタンパク質発現を消失させる変異を含有するＭｕＶIowa/US/06ゲノムのｃＤＮＡを構築した（ｐＭｕＶIowa/US/06ΔＶ）（ＭｕＶIowa/US/06ゲノムの受託番号はＪＮ０１２２４２である）（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；４１７：１２６−１３６）。ゲノム由来のＶタンパク質発現の消失は、Ｐ／Ｖ遺伝子中の編集部位（ＧＧＧＧＧＧ；配列番号１４のヌクレオチド１〜６）をＧＡＧＧＡＧＧＧ（配列番号１５のヌクレオチド１〜８）に変化させることにより達成した。従って、Ｐタンパク質をコードする転写物のみが、Ｐ／Ｖ遺伝子転写から生成する（図９Ａ）。Ｖタンパク質の発現を消失した感染性ウイルス（ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ）を、ＢＳＲＴ−７細胞へのｐＭｕＶIowa/US/06ΔＶの形質移入を介するクローン化ＤＮＡからレスキューした。レスキューされたウイルスは、更にプラーク精製してＶｅｒｏ細胞中で増幅した。レスキューされたウイルスゲノムの中にＶタンパク質発現を遮断する遺伝子変化の存在を確認するために、ウイルスＲＮＡをウイルスストックから抽出し、ｃＤＮＡに逆転写して配列決定した（図９Ｂ及び９Ｃ）。
レスキューされたウイルスゲノムの配列決定により、入力ｃＤＮＡ配列と比較して、ＮＰ遺伝子終結（ＧＥ）配列及びＰ／Ｖ遺伝子開始（ＧＳ）配列にヌクレオチド置換が存在すること並びにＶタンパク質の発現を消失させることになる変化が存在することが示された（図９Ｃ）。ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ感染Ｖｅｒｏ細胞中にＶタンパク質の発現がないことを確認するために、感染細胞の免疫ブロッティングを実施した（図９Ｄ）。更なる検討のために、ｃＤＮＡプラスミドから更に７回ウイルスをレスキューした（図１０Ａ）。合計８つのレスキューされたウイルスのうちの７つのウイルスは、ＮＰ ＧＥ（６つ）またはＰ／Ｖ ＧＳ領域（１つ）の何れかに点変異を含有したが、１つはＬ遺伝子に点変異を含有した（図１０Ｂ）。レスキューされたｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶウイルスはすべて、そのゲノムに少なくとも１つの点変異を含有し、最も頻度の高い点変異はゲノム中の位置１８９９であった；従って、このウイルスを代表的なウイルスとして使用し、特に明記されていない限り、この研究に関してはｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶと命名した。
組織培養細胞株におけるｒＭｕＶΔＶの分析。細胞株におけるｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶの増殖速度を分析するために、Ｖｅｒｏ細胞またはＨｅＬａ細胞に模擬感染、またはｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ若しくはｒＭｕＶIowa/US/06を０．０１のＭＯＩで感染させ、感染後の複数の時点で培地を回収し、プラークアッセイを使用してウイルス力価を測定した（図１１Ａ）。ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶは、感染後の最初の４８時間（ｈｐｉ）の間、Ｖｅｒｏ細胞において、ｒＭｕＶIowa/US/06Ｖと同等の速度で増殖し、次いで、ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶの増殖は低下し、検討した時間経過全体を通して、ｒＭｕＶIowa/US/06よりもほぼ１ログ少ない力価のままであった（図１１Ａ）。Ｖｅｒｏ細胞におけるｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶのプラークサイズは、ｒＭｕＶIowa/US/06と顕著な差を示さなかった（図１１Ｂ）。ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶまたはｒＭｕＶIowa/US/06の低ＭＯＩ感染Ｖｅｒｏ細胞のタンパク質発現レベルを、抗ＮＰ、抗Ｐ、及び抗Ｖ、または抗β−アクチンによる免疫ブロッティングにより調べた（図１１Ｃ）。時間経過と一致して、ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶのウイルスタンパク質発現レベルは、４８、７２、及び９６ｈｐｉにおいて、ｒＭｕＶIowa/US/06と同様であった（β−アクチンのレベルに対して調整する）。ＨｅＬａ細胞では、ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶの増殖は低下した（図１１Ｄ）。機能的なＶタンパク質が存在しないことにより、ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶのウイルス力価は、ｒＭｕＶIowa/US/06と比較して、７２ｈｐｉ〜１６８ｈｐｉにおいてほぼ２ｌｏｇ10低下していた。それにもかかわらず、両方のウイルスは、その後の時点で同様の力価に到達した。
ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ感染細胞におけるウイルス遺伝子の発現。回収されたｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶウイルスのＮＰ ＧＥまたはＰ／Ｖ ＧＳの何れかにおける変異は、ＮＰとＰの間のウイルスタンパク質発現レベルの調節が、ｃＤＮＡからのｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶの回収にとって重要である可能性を示唆する。ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶにおけるウイルスタンパク質発現パターンを検討するために、高いＭＯＩで感染させたＶｅｒｏ細胞を、感染後の様々な時点でＮＰ及びＰのタンパク質に対して染色し、フローサイトメトリーにより評価した（図１２）。ＮＰ及びＰの発現パターンの起こりうる変化を定量するために、Ｐタンパク質の発現レベルを、対応するＮＰレベルに対して規準化した（図１２Ａ及び１２Ｂ）。ｒＭｕＶΔＶのＰ／ＮＰ比は、１２、１６、２４、及び４８ｈｐｉでｒＭｕＶよりも顕著に高く、ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶウイルスにおけるＰタンパク質発現の増大が示された。この差は、７２ｈｐｉにはもはや明らかではなかった。
このＮＰ及びＰの発現パターンの変化が、このｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ株にユニークなものか否かを検討するために、Ｐ ＧＳ変異を含有するｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ（ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ［ＰＧＳ］）、及びＬ翻訳領域（ＯＲＦ）変異を含有するｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ（ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ［Ｌ遺伝子］）も調べた（図１２Ｃ及び１２Ｄ）。ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶと同様に、ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ（ＰＧＳ）及びｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ（Ｌ遺伝子）は両方ともｒＭｕＶIowa/US/06よりもＰタンパク質発現レベルが高く、このＮＰ及びＰの発現パターンの変化が、回収されたｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶウイルスに典型的であることが示唆された。
下流のウイルスタンパク質の発現がＶタンパク質の欠失またはＮＰ ＧＥにおける点変異の何れかにより影響を受けるか否かを調べるために、フローサイトメトリーを使用してＨＮ発現レベルを調べた。Ｖｅｒｏ細胞に模擬感染、またはｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ若しくはｒＭｕＶIowa/US/06を０．５のＭＯＩで感染させ、次いで、２４ｈｐｉに細胞を回収し、ＮＰ及びＨＮの染色に供した（図１３）。ＨＮ対ＮＰ比に顕著な変化は観察されなかった。
組織培養細胞株におけるｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ誘導のＣＰＥ促進。ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ誘導の細胞変性効果（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ：ＣＰＥ）を、３種の異なる生物に由来する３種の異なる細胞培養株で比較した。ＨｅＬａ（ヒト）、Ｖｅｒｏ（サル）、及びＭＤＢＫ（ウシ）細胞に、ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶまたはｒＭｕＶIowa/US/06を０．５のＭＯＩで感染させ、７２ｈｐｉに細胞を撮影した。ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶは、ＨｅＬａ細胞に最も重度のＣＰＥを引き起こした。より多くかつより大型の融合細胞がｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ感染ＨｅＬａ細胞に観察され、これが細胞死への主要要因である可能性がある（図１４Ａ）。細胞死がアポトーシスを原因とするものか否かを調べるために、ＴＵＮＥＬアッセイを実施した（図１４Ｂ）。ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶを０．５のＭＯＩで感染させたＨｅＬａ細胞では、ｒＭｕＶを感染させた細胞よりも少なくとも２倍高レベルのアポトーシスが示された。同様に、ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶは、Ｖｅｒｏ細胞で、より高レベルのアポトーシスを誘導した（図１４Ｃ）。Ｖの欠失が感染細胞にアポトーシスの増加をもたらしたことは、Ｖタンパク質が感染細胞におけるアポトーシスの誘導の遮断にある役割を果たしうることを示唆する。
ＭｕＶIowa/US/06感染細胞におけるＳＴＡＴタンパク質の状態。以前の研究では、ＳＴＡＴタンパク質を分解の標的にすることによりＩＦＮシグナル伝達経路の遮断にＶタンパク質が関与することが示されている。ＭｕＶIowa/US/06のＶタンパク質がＩＦＮ経路の唯一のウイルスコード化アンタゴニストであるか否かを判定するために、ＳＴＡＴファミリータンパク質レベルを、ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶまたはｒＭｕＶIowa/US/06を感染させたＶｅｒｏ細胞で調べた（図１５Ａ及び１５Ｂ）。以前のインビトロ形質移入研究と一致して、ｒＭｕＶIowa/US/06感染Ｖｅｒｏ細胞では、ＳＴＡＴ２ではなくＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ３が完全に分解されたが、一方Ｖタンパク質の発現を欠くｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶでは、いずれのＳＴＡＴタンパク質も分解の標的となることはなく、Ｖタンパク質がＭｕＶIowa/US/06によるＳＴＡＴタンパク質分解にとって不可欠かつ必要なものである可能性が示唆された。検出可能なＶタンパク質の生成とＳＴＡＴタンパク質の分解との間にタイムラグがあり（図１５Ａ及び１５Ｂ）、ＳＴＡＴの分解がＶタンパク質の蓄積を必要とする可能性が示唆される。
ＭｕＶと近縁関係にあるパラミクソウイルスであるＰＩＶ５は、感染細胞におけるＩＦＮ−βの誘導を妨害するが、Ｖタンパク質の保存的Ｃ末端の発現を欠く組換えＰＩＶ５は妨害しない（Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，２００２年，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；３０３：１５−３２；Ｐｏｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００２年，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；３０３：３３−４６）。ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶとｒＭｕＶIowa/US/06によるＩＦＮ−β誘導を比較するために、ＥＬＩＳＡを使用して感染させた２９３Ｔ細胞の培地中のＩＦＮ−β濃度を測定した。４８ｈｐｉに、ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶは、ｒＭｕＶIowa/US/06による誘導よりも高いＩＦＮ−β産生を誘導し（図１６Ａ）、ＭｕＶIowa/US/06のＶタンパク質がＩＦＮ−β発現の制限にある役割を果たしていることが示された。
ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶは、より高レベルのＩＬ−６誘導をもたらした。ＭｕＶIowa/US/06感染において機能的Ｖタンパク質が存在しないと、他のサイトカインの誘導がもたらされるか否かを検討するために、ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ及びｒＭｕＶIowa/US/06の感染細胞の培地中のＩＬ−６産生レベルを調べた。４８ｈｐｉに、ＨｅＬａ細胞において、ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶは、ｒＭｕＶIowa/US/06よりも高レベルのＩＬ−６産生をもたらし（図１６Ｂ）、ＩＬ−６誘導がＶタンパク質の存在により低下することが示された。興味深いことには、ｒＭｕＶIowa/US/06感染もまた顕著な量のＩＬ−６産生を誘導した。これはＭｕＶが炎症性疾患であることと一致している。
ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶの神経毒性。ウイルス神経毒性に対するＶタンパク質の影響を調べるために、プラスミドｐＭｕＶIowa/US/06ΔＶ（ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ）を使用する２つの独立したレスキューに由来するウイルス（図１０Ａ）を、ｒＭｕＶIowa/US/06及び対照としての高度に弱毒化したＪｅｒｙｌ Ｌｙｎｎ（ＪＬ）ワクチンウイルスと共に、ラットで試験した。図１７に示すように、ΔＶウイルスは、ｒＭｕＶIowa/US/06及びＪＬワクチンウイルスと比較して高度に弱毒化していた。
考察
本実施例の結果により、インビトロ感染の文脈において、Ｖタンパク質の発現を消失した、臨床分離株（遺伝子型Ｇ）に由来する組換えウイルスに関する研究を通してこれらの発見が確認される。
更に、Ｖタンパク質発現が欠如すると、炎症促進性サイトカインであるＩＬ−６のより高レベルの誘導がもたらされ、Ｖタンパク質がＩＬ−６発現の抑制にある役割を果たすことが示唆された。感染細胞でＶタンパク質発現が欠如すると、動物モデルにおいてこの株の弱毒化がもたらされたと思われ、Ｖタンパク質がウイルスの病原性に不可欠な役割を果たすことが示唆された。ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶには、ＩＦＮ作用に反撃する能力がないため、インビボでのウイルス複製が制限され、かつｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶによる、より高レベルのＩＬ−６の誘導によって、単球が誘引されて感染が迅速に排除されるため、インビボでのｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶの弱毒化がもたらされたと考えられる。
遺伝学的にＭｕＶに最も近縁のウイルスはパラインフルエンザウイルス５（ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ５：ＰＩＶ５）である。ＭｕＶ及びＰＩＶ５のＶタンパク質は、ウイルス感染細胞における、ＭＤＡ５を介するＩＦＮ発現の遮断、ＳＴＡＴ１分解を介するＩＦＮシグナル伝達の遮断、及びＩＬ−６発現の阻害を含む、多くの同一の機能を共有する。興味深いことには、Ｖタンパク質全体を欠く組換えＰＩＶ５が、組織培養細胞で得られたことはなくＰＩＶ５のＶタンパク質は、ＭｕＶに対するＶタンパク質よりも、ウイルス複製により重要な役割を果たすことが示唆される（Ｄｉｌｌｏｎ ａｎｄ Ｐａｒｋｓ，２００７年，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８１：１１１１６−１１１２７；Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，２００２年，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；３０３：１５−３２）。ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶに生存能があることにより、ウイルス複製におけるＭｕＶIowa/US/06Ｖタンパク質の役割が少なくとも組織培養細胞では重要でないことが示唆される。
本実施例では、Ｖタンパク質（ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶ）を産生することができない組換えウイルスを、最近の集団発生に由来する臨床分離株をベースとしたＭｕＶに対して逆遺伝学システムを使用して生成した。このウイルスは、ワクチン生産のために使用される細胞株であるＶｅｒｏ細胞、並びに他の細胞型において、野生型ウイルスと同様の力価まで増殖した。最も重要なことは、このウイルスが、ラットに少ない神経毒性を示し、そのためワクチン候補としてこのウイルスが支持されることである。
ＭｕＶのＶ／Ｐ遺伝子は、鋳型にないＧ残基が転写の間に特定の部位でｍＲＮＡに挿入され、３つの異なるＯＲＦに翻訳されうるｍＲＮＡを生成する「ＲＮＡ編集」の過程を介して、３つのタンパク質、Ｖ、Ｉ、及びＰをコードする（Ｓａｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９６年，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ；４０：２７１−２７５）。Ｖタンパク質はｍＲＮＡの「未編集」コピーから、Ｐは２つのＧ残基が挿入されたｍＲＮＡから、そしてＩタンパク質は１つまたは４つのＧ残基が挿入されたｍＲＮＡから翻訳される。これらのタンパク質はすべて、１５５のアミノ酸残基からなる同一のＮ末端を有する。Ｐタンパク質は、３９１のアミノ酸残基を有し、ウイルスＲＮＡ合成に不可欠な役割を果たす。Ｉタンパク質は、１７０のアミノ酸残基を有し、その機能は明らかでない。ＩのｍＲＮＡは、ＲＮＡ編集の副産物であり、なんら重要な機能を有していない可能性も考えられる。ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶを生成するために我々が使用した戦略はまた、Ｉタンパク質の発現を消失させた。Ｉに対するｍＲＮＡは、Ｖ、Ｉ、及びＰの転写物の合計のわずか２％未満を占めるにすぎず、かつその配列は、Ｖ及びＰのＮ末端と極めて類似しているので（Ｉは約１７０のアミノ酸残基を有し、そのうちの１５５はＶ及びＰのＮ末端と同一である）（Ｐａｔｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌａｍｂ，１９９０年，Ｊ Ｖｉｒｏｌ；６４：４１３７−４１４５；Ｔａｋｅｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９０年，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；１７８：２４７−２５３）、ｒＭｕＶIowa/US/06ΔＶの表現型は、Ｖタンパク質の欠如に帰せられる。しかしながら、Ｉタンパク質の役割の可能性を除外することはできない。
Ｌ遺伝子内の変化を除くすべての変化は、ＮＰ遺伝子とＰ／Ｐ遺伝子との間の遺伝子結合で起こり、Ｖタンパク質を発現できない生存可能な感染性ＭｕＶが生成する。Ｌ遺伝子内の変異が、Ｖタンパク質を欠くウイルスのレスキューを可能にできたことは興味深い。Ｌ遺伝子内の変異が偶然に起こったもので、Ｌの機能にとって重要でない可能性を除外することはできないが、特定の変異がＮＰ−ＰとＬとの間の相互作用の調節にある役割を果たしうると推測することができ、レスキューされた他のすべてのウイルスがＮＰ及びＰのレベルを調節する変異を有したと考えられる。ウイルスの更に詳細な分析により、Ｌの機能について、より十分な理解を得ることができる。
本実施例の結果は、現在、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ ｖ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｍｕｍｐｓ ｖｉｒｕｓ ｐｌａｙｓ ａ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｏｌｅ ｉｎ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，”Ｊ Ｖｉｒｏｌ；８６（３）：１７６８−７６（Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１２年；Ｅｐｕｂ ２０１１年 Ｎｏｖ １６）で知ることができる。
実施例３
マウスにおけるＭｕＶΔＳＨ及びＭｕＶΔＶの免疫原性
マウスにおけるｒＭｕＶΔＳＨ及びｒＭｕＶΔＶの免疫原性を判定し、ＭｕＶ特異的免疫応答を測定した。一群１０匹のマウスに、ＰＢＳ、または１０6ｐｆｕのＭｕＶ、ｒＭｕＶΔＶ、若しくはｒＭｕＶΔＳＨを鼻腔内に接種した。接種後２１日目に、マウスから血液試料を採取した。ＥＬＩＳＡを使用して血清中の抗ＭｕＶ抗体の力価を測定した。ＥＬＩＳＡ用の９６ウェルプレートを精製されたＭｕＶビリオンでコーティングした。血清の最大希釈度及び最小希釈度における、ＭｕＶとｒＭｕＶΔＳＨに対するＰ値並びにＭｕＶとＭｕＶΔＶに対するＰ値は、０．０５未満であった。この結果を図１８に示す。
更に、体液性免疫（抗体）分析には、ＭｕＶ特異的ＥＬＩＳＡにより測定される、気管支肺胞洗浄液（ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒ ｌａｖａｇｅ：ＢＡＬ）中の抗ＭｕＶ抗体の測定が含まれる。ＥＬＩＳＡアッセイでは、抗体のアイソタイプ（ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、及びＩｇＧ３）も、適切な二次抗体を使用して決定される。ＭｕＶ特異的抗体の力価もウイルスにより測定される。異種のＪＬまたは同種のＭｕＶ−ＩＡに対する中和アッセイが、血清及びＢＡＬ洗浄試料について実施される。
細胞性免疫（Ｔ細胞）は、抗原特異的ＩＦＮγ産生により測定することができる。具体的には、ＢＡＬ、脾臓、及び／または流入領域リンパ節に由来するリンパ球について、ＭｕＶ感染ＡＰＣを用いる、または温和な界面活性剤で破壊される精製されたＭｕＶビリオンを用いる再刺激によるＭｕＶ特異的Ｔ細胞応答をアッセイする。ＩＦＮ−γ応答は、細胞内サイトカイン染色及び／またはＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定される。
免疫応答の誘導部位により、免疫応答の性質が変化し、予防効果が劇的に影響を受ける可能性があるので、ＭｕＶに対する局所性及び全身性免疫が、免疫後の様々な時点で測定される。鼻腔内（ＩＮ）のＭｕＶ免疫には、ＭｕＶ暴露に対する防御を媒介する、局所のＭｕＶ特異的Ｔ細胞及び免疫グロブリン応答を誘導する可能性がある。局所（即ち肺）のＭｕＶ特異的免疫応答は、免疫または暴露の後の時点で採取されるＢＡＬ試料の分析により評価される。浸潤したリンパ球集団を遠心分離により回収し、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）について粘膜Ｉｇを分析する。全身性応答は、血清抗体及び脾臓または縦隔リンパ節（ｍｅｄｉａｓｔｉｎａｌ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅ：ＭＬＮ）のリンパ球の分析により評価される。
現行のＭＭＲワクチン接種レジメンは、２回の筋肉内（ＩＭ）接種を要請する。同様のレジメンが、ワクチンの効力を評価するためのマウスモデルで使用された（Ｃｕｓｉ ｅｔ ａｌ．，２００１年，Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ；１４６（７）：１２４１−８６２）。最初に、免疫原性をそのような２回接種／ＩＭレジメント（ｒｅｇｉｍｅｎｔ）を使用してアッセイすることができる。マウスに初回用量が注入され、最初の注入の２週間後に注入がなされる。最後の免疫の１か月後に、上記の免疫学的アッセイのためにマウスは屠殺される。この実験により、我々の手にあるＪＬワクチンと共に、ワクチン候補の接種後の免疫応答のベースラインが作製される。
本明細書に記載のｒＭｕＶワクチンコンストラクトの免疫原性は、２回接種／鼻腔内（ＩＮ）プロトコールを使用して調べることができる。体液性及び細胞性免疫応答の両方が測定される。ＩＮ経路が、一部のワクチンに対して、強固な細胞性免疫応答を含む、より良好な免疫応答を生成したことが報告されている。加えて、ＩＮ接種には、粘膜免疫応答及びより高い力価のＩｇＡを生成する利点がある。インフルエンザウイルスワクチン接種のためのＩＮ経路の使用が成功したため、ＩＮ経路が、大規模な人口集団に導入される新しいワクチンのための実行可能な経路になる。
同様の様式で、３回の接種レジメンも試験される。初期第Ｉ相臨床試験の最も可能性の高い対象は、２回のＭＭＲの予防接種をすでに受けた健常個体になるので、ＪＬワクチンによる２回／ＩＭ接種後に３回目接種のＪＬ（対照として）または３回目接種のＭｕＶワクチンを、ＩＭまたはＩＮの何れかで接種した後の免疫応答が調べられる。追加免疫（３回目接種）として使用される、本明細書に記載のＭｕＶワクチンコンストラクトが安全でかつ強固な抗遺伝子型Ｇ免疫応答を生成する場合、このコンストラクトは、ＭＭＲの２回目接種の代わりに使用することができ、最終的には２回接種のＭＭＲにおけるＪＬと入れ替えることができる。
本明細書に記載の任意のｒＭｕＶコンストラクトの免疫原性を、本実施例で記載のように、マウスでアッセイすることができる。同様の免疫原性研究及び有効性研究はまた、これらに限定されないが、フェレット及び非ヒト霊長類モデル系を含む、更なる動物モデル系で試みることができる。
実施例４
ｒＭｕＶΔＳＨΔＶの生成及び分析
ＭｕＶワクチンは、１歳の幼児に使用されるので、新しいワクチンの開発において安全性は最重要の検討課題である。ｒＭｕＶΔＳＨ及びｒＭｕＶΔＶは両方とも、ラットの脳ベースの神経毒性試験において弱毒化を示すが、更に、いかなる潜在的リスクも軽減するために、逆遺伝学システムを使用してＳＨ及びＶの両方を欠く組換えウイルス（ｒＭｕＶΔＳＨΔＶ）を生成した。
手短に言えば、実施例１に詳細に記載したプロトコールに従い（例えば、図３Ａを参照のこと）、ＭｕＶΔＳＨΔＶゲノムからのＳＨタンパク質発現の除去を、ｐＭｕＶ−ＩＡから、ＳＨ遺伝子のＳＨ遺伝子翻訳領域（ＯＲＦ）内の１５６ヌクレオチドを欠失させることにより達成した。また、実施例２に詳細に記載したプロトコールに従い（例えば、図９Ａを参照のこと）、ＭｕＶΔＳＨΔＶゲノムからのＶタンパク質発現の除去を、Ｐ／Ｖ遺伝子内の編集部位（ＧＧＧＧＧＧ）をＧＡＧＧＡＧＧＧに変化させることにより達成した。従って、Ｐタンパク質をコードする転写物のみが、Ｐ／Ｖ遺伝子転写から生成する。ＳＨタンパク質及びＶタンパク質のいずれの発現も消失した感染性ウイルス（ｒＭｕＶΔＳＨΔＶ）を、ｐＭｕＶΔＳＨΔＶのＢＳＲＴ−７細胞への形質移入を介して、クローン化ＤＮＡからレスキューした。レスキューされたウイルスを更にプラーク精製して、Ｖｅｒｏ細胞中で増幅した。レスキューされたウイルスのｒＭｕＶΔＳＨΔＶゲノムにおけるＳＨタンパク質及びＶタンパク質の発現を両方とも遮断する遺伝子変化の存在を確認するために、ウイルスＲＮＡをウイルスストックから抽出し、ｃＤＮＡに逆転写して配列決定した。
実施例１及び実施例２に詳細に記載した手順に従い、感染細胞の免疫ブロッティングを実施して、ｒＭｕＶΔＳＨΔＶ感染細胞中にＳＨタンパク質及びＶタンパク質の発現がないことを確認する。ｒＭｕＶΔＳＨΔＶの発現、機能、免疫原性、及び病原性は、これらに限定されないが、例えば本明細書に含まれる実施例に記載されるものなど、本明細書に記載されるいずれの方法も含む、種々の方法により分析する。研究には、新生ラットの脳におけるｒＭｕＶΔＳＨΔＶの神経毒性の検討及びマウスにおける免疫原性の検討が含まれうる。
実施例５
ワクチン候補としての組換えＭｕＶの改良
本実施例では、所望の位置に変異を導入するために、逆遺伝学システムを使用してｒＭｕＶコンストラクトを更に変異させる。得られるＭｕＶ変異体を組織培養細胞で分析する。神経毒性をラットモデルで評価し、ウイルスの免疫原性をマウス、フェレット、及び霊長類で調べる。Ｖ及びＳＨを欠く上に更なる点変異があるｒＭｕＶは、最も弱毒化されることになり、かつ復帰する可能性が最も低いように思われる。
更なるＭｕＶ変異体の生成及び分析。ＭｕＶに最も近縁のウイルスはパラインフルエンザウイルス５（ＰＩＶ５）である。これら２つのウイルスは、同数の遺伝子及び遺伝子の順序を有する。ＰＩＶ５に関する最近の研究で、ウイルス遺伝子の発現を高めることができ、Ｉ型インターフェロンなどのサイトカインの発現を誘導することができる、ＰＩＶ５タンパク質内の残基が同定された（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，２００９年，ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ；５（７）：ｅ１０００５２５）。ＰＩＶ５のＰタンパク質のＳ１５７残基が宿主キナーゼＰＬＫ１に対する結合部位であり、ＰＩＶ５のＰタンパク質のＳ３０８残基がＰＬＫ１のリン酸化部位であることが見出された。Ｓ１５７またはＳ３０８をアミノ酸残基Ａに変異させると、ウイルス遺伝子の発現及びインターフェロン−βの発現を高めるウイルスがもたらされる。ウイルス遺伝子発現の増加は、抗原量を増加させるので、可能性として免疫応答を増加させ、ＩＦＮ発現の増加は、ＩＦＮの抗ウイルス効果のため、弱毒化を引き起こす可能性がある。ＭｕＶのＰタンパク質内の対応する残基はＴ１４７及びＳ３０７である。これらの残基を変異させて、ウイルス遺伝子の発現及びインターフェロンの誘導に対するこれらの残基の変化の影響を調べる。
Ｉを欠くｒＭｕＶ及びＩを発現するｒＭｕＶΔＶの生成及び分析。ｒＭｕＶΔＶを生成するために、実施例２で使用した戦略は、Ｖの発現以外にＩタンパク質の発現も消失させた。Ｉタンパク質はＶＩ／／Ｐ遺伝子の編集産物である。その機能は知られていない。その発現レベルは、ＶまたはＰに比較して極めて低く、かつその配列は、Ｖ及びＰのＮ末端に極めて類似しているので（Ｉは約１７０のアミノ酸残基を有し、そのうちの１５５はＶ及びＰのＮ末端と同一である）、Ｉタンパク質の欠失の影響は見落とされることが多い。効果的なワクチンを開発する目的のために、Ｖと共にＩを欠失させることは弱毒化にとって有利である可能性がある。しかしながら、Ｉタンパク質がウイルスの病変形成にある役割を有し、ワクチンの有効性に寄与する可能性がある。一般的にはウイルスの生活環における、そして具体的には免疫応答の生成におけるＩタンパク質の役割を検討するために、Ｉタンパク質を欠く組換えウイルスを生成する。ｒＭｕＶΔＶゲノムを、ＰとＭとの間にＶを挿入するための骨格として使用する。編集部位での変異の結果として、ＩもＶもＰ遺伝子から作られないが、Ｖタンパク質は、新たに挿入されたＶから作られる。同様に、ｒＭｕＶΔＶゲノムの骨格において、ＨＮとＬとの間にＩ遺伝子を挿入して、Ｉを発現する組換えｒＭｕＶΔＶ（ｒＭｕＶΔ Ｖ＋Ｉ）を生成する。挿入される２つの遺伝子結合が異なる理由は、Ｖタンパク質の発現レベルは野生型ウイルス感染を反映するほど高くすべきであり、Ｉの発現レベルは野生型ウイルス感染細胞のように低くすべきであるということである。リーダー配列に近い遺伝子結合（Ｐ−Ｍ結合）は、離れたもの（ＨＮ−Ｌ結合）よりも高いウイルス遺伝子発現レベルをもたらすであろう。得られるウイルスコンストラクトを、前の実施例に記載のように分析する。
復帰変異株の生成及び分析。ｒＭｕＶΔＶの場合、Ｖタンパク質欠失表現型を生じさせるために、いくつかの点変異をＭｕＶのゲノムに導入した。時間経過と共に、表現型を復帰させる変異が生成する可能性がありうる。ｒＭｕＶΔＶの復帰変異株は、２０継代にわたり、Ｖｅｒｏ細胞でのウイルス継代後に得られていないが、この実験はインターフェロンコンピテント細胞株で反復されることになる。Ｖｅｒｏ細胞は、ワクチン生産のためにＷＨＯ及びＦＤＡから承認されており、Ｉ型ＩＦＮを産生しない。ｒＭｕＶΔＶがこの細胞株で安定であることは、ワクチンとしてｒＭｕＶΔＶを将来大量生産する場合の励みになる。しかしながら、Ｖｅｒｏ細胞は、ＩＦＮ遺伝子座の欠失によりＩＦＮ産生が欠如している。従って、インターフェロンコンピテント環境中でのｒＭｕＶΔＶの復帰変異株の割合を調べることになる。インターフェロンを産生し、それに応答するヒト肺細胞株であるＡ５４９細胞に、ｒＭｕＶΔＶを０．１のＭＯＩで感染させ、感染後４日目に、感染細胞の培地を回収し、それを使用して新たなＡ５４９に約０．１のＭＯＩで感染させる。予備試験では、ｒＭｕＶΔＶがほぼ１０6ｐｆｕ／ｍｌに達することが観察され、この力価は、粗い評価として我々の実験に使用される。継代ごとに、ｒＭｕＶΔＶ感染Ａ５４９細胞の培地からウイルスを回収し、継代５、１０、１５、及び２０代目に由来するウイルスを最初に配列決定する。同様に、ｒＭｕＶΔＳＨ及びｒＭｕＶ−Ｐ−Ｔ１４７Ａなどの他のＭｕＶ変異体を調べることになる。
ウイルス遺伝子発現の上昇及び／またはインターフェロン誘導の増加を示す組換えウイルスについて、前の実施例に記載のように、神経毒性及び免疫原性を試験する。Ｉ型インターフェロンの誘導におけるそれらの可能性のために、ｒＭｕＶΔＶと同等の弱毒化を達成していない変異についても試験する。Ｉ型インターフェロンは、その抗ウイルス活性が周知であるが、適応免疫の誘導にもポジティブな役割を果たす（Ｉｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００４年，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ；５（１０）：９８７−９５）。それは、記憶Ｔ細胞の増殖を促進し、Ｔ細胞のアポトーシスを防止する。それは、抗原交差提示に重要な役割を果たす。それは、体液性免疫を高めて、樹状細胞を刺激する。ＩＦＮを誘導するこれらのＭｕＶ変異体が、その親よりも強固な免疫応答を生成するか否かは、大いに興味のあるところである。これらの変異が実際により良好な免疫応答を生成する場合、これらの変異はｒＭｕＶゲノムに組み込まれることになる。
ＩのｍＲＮＡは、ＲＮＡ編集の副産物であり、なんら重要な機能を有していない可能性も考えられる。Ｉタンパク質がウイルスの複製及び病変形成に役割を有しているか否かを検討することは、Ｉタンパク質についての潜在的な新規機能を明らかにするだけでなく、ワクチン開発にとっても重要であろう。ｒＭｕＶΔＶが弱毒化しすぎる場合には、ｒＭｕＶΔＶの骨格中でＩを発現させることは、弱毒化が所望のレベルにあるウイルスを設計する助けとなりうる。ヒトＰＩＶ２ワクチンの開発の場合には、Ｖタンパク質を欠失させると、弱毒化しすぎて効果的ではないウイルスが生じる（Ｓｃｈａａｐ−Ｎｕｔｔ ｅｔ ａｌ．，２０１０年，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；３９７（２）：２８５−９８）。従って、ＶまたはＩを再び加えると、より適切に弱毒化したＭｕＶワクチンを得ることができる。
ＰＬＫ１結合及びリン酸化の原因となる、ＭｕＶのＰタンパク質中の残基は、上記に予測したものとは異なっている可能性がありうる。それらを、ＰＩＶ５について使用されたものと類似の手法を使用して検索する：ＭｕＶのＰ内には２つのＰＬＫ１結合モチーフがある。ＭｕＶ中の類似の残基を調べることになる。予備研究では、Ｐタンパク質とＰＬＫ１とが相互作用し、ＰＬＫ１結合部位がＰタンパク質内にあることが示された。加えて、ウイルス遺伝子の発現を促進するその能力を高める、即ち、ウイルス遺伝子発現表現型を増強する、Ｐ内の変異が同定された。Ｐタンパク質を変異させることに加えて、他の遺伝子中の変異も作られる。例えば、ウイルス遺伝子発現を高める、ＰＩＶ５のＬ遺伝子中の変異が同定されている。同じ変異をＭｕＶのＬ遺伝子に組み込むことになる。
実施例６
フェレットにおける組換えムンプスウイルスの免疫原性
本明細書に記載の任意のＭｕＶについてワクチン候補としての免疫原性及び有効性をフェレットで試験する。フェレットは、ＭｕＶ感染の病変形成に関する研究にとっては小型の動物モデル系である。フェレットとヒトの間で肺の生理及び形態について顕著な類似性がある。フェレットは、呼吸系ウイルスによる感染に極めて罹りやすい。フェレットは、他のいくつかの呼吸器系病原体のための動物モデルとして確立されている。最も重要なことには、ＭｕＶが感染したフェレットから分離されており、感染動物の肺の中に病理変化が観察された（Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９５６年，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ；７６（４）：３２８−３３）。研究には、ｒＭｕＶコンストラクトによるフェレットの感染、フェレットにおけるｒＭｕＶコンストラクトの免疫原性の判定、及び暴露後の肺におけるウイルス負荷及び病理変化の軽減におけるそのようなワクチン候補の有効性の検討が含まれる。以前に記載されたように（Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９５６年，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ；７６（４）：３２８−３３）、一群５匹のフェレットに、１０7ｐｆｕの野生型ＭｕＶまたはｒＭｕＶコンストラクトを１ｍｌ容量で感染させる。動物は、感染後の最初の１週間は毎日、次の週は１日置きに熱をモニターする。接種後３、４、５、７、９、及び１１日目に、鼻洗浄液及び血液試料を回収し、プラークアッセイを使用してそれらの中のウイルス力価を測定する。接種後３、４、７、１１、及び１４日目に、フェレットを屠殺し、肺及び鼻甲介を回収して、ウイルス力価を測定する。肺及び鼻甲介における病理変化をＨ＆Ｅ染色を使用して検査する。フェレットにおけるＭｕＶ変異体の免疫原性を、前の実施例に記載のように調べる。ＭｕＶに対する体液性免疫及び細胞性免疫を、ワクチン候補並びにＪＬワクチン及び野生型ＭｕＶによる接種後調べる。２回のＩＮ接種及び３回接種（ＪＬによる２回ＩＭ接種及びその後のワクチン候補の１回ＩＮ接種）を使用することができる。免疫学的検査に加えて、ワクチン接種を受けた動物を、野生型ＭｕＶに曝露する。細胞性免疫応答のアッセイ用の試薬を含む、フェレットにおける免疫学的アッセイ用の試薬を作製する。そのような試薬としては、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、及びＩＬ−８に対するモノクローナル抗体を挙げることができる。
実施例７
呼吸器合胞体ウイルスワクチン開発のためのベクターとしてのムンプスウイルス
呼吸器合胞体ウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ：ＲＳＶ）は、小児のウイルス呼吸器感染症の最も重要な原因であり、幼児並びに免疫無防備状態の被験体及び高齢者の間の罹患率及び死亡率の主要な原因である（Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｐ．Ｌ．，Ｒ．Ｍ．Ｃｈａｎｏｃｋ，ａｎｄ Ｂ．Ｒ．Ｍｕｒｐｈｙ，Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ，ｉｎ Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ ａｎｄ Ｐ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ，Ｅｄｉｔｏｒｓ．２００１年，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ．ｐ．１４４３−１４８５）。加えて、重篤なＲＳＶ感染は、将来、喘鳴及び喘息をもたらすことがある。他の呼吸系ウイルスによる感染と異なり、ＲＳＶは、その後の感染に対する持続的な防御免疫を誘導しない。従って、ほとんどの個体は、一生を通して複数回感染する。現在、エアゾル化されたリバビリン及び予防的免疫グロブリン療法が臨床環境の中で使用されているが、ＲＳＶに対するワクチンも、重篤なＲＳＶ疾患に対する効果的な根治的治療も存在しない。しかしながら、高コストのパリビズマブによる予防処置には、ＲＳＶの季節の間、毎月注入する必要があるため、健康上の利益に対する費用対効果に疑問が提起されている。従って、ＲＳＶに対する安全で効果的なワクチンに対する差し迫った必要性がある。
非分節マイナス鎖ＲＮＡウイルス（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｎｏｎ−ｓｅｇｍｅｎｔｅｄ ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ ｖｉｒｕｓ：ＮＮＳＶ）として、ＭｕＶは、その生活環の中にＤＮＡ（または核）相がないため、組換えまたは挿入による、宿主細胞ＤＮＡの意図しない遺伝子改変結果の可能性が回避されるので、ワクチン開発に対する優れたウイルスベクター候補である。プラス鎖ＲＮＡウイルスに比較して、ＭｕＶのゲノム構造は安定である。従って、プラス鎖ＲＮＡウイルスのゲノムは、再結合して、挿入された外来遺伝子を迅速に欠失することが多いので、ＭｕＶはプラス鎖ＲＮＡウイルスよりもワクチンベクターとしてよく適合している。
ＲＳＶ Ｆを含有するＭｕＶ−Ｆの生成及び分析。ＲＳＶ（Ａ２株）のＦ遺伝子を、ＭｕＶ−ＧＦＰの生成と同じ戦略を使用して、ＭｕＶゲノムのＦとＳＨの間に挿入する（ＭｕＶ−Ｆ）。手短に言えば、Ｆ遺伝子を、４プライマーＰＣＲ手法を使用して、遺伝子終結（ＧＥ）、遺伝子間領域（Ｉ）、及び遺伝子開始（ＧＳ）（これらはウイルスｍＲＮＡ合成にとって重要である）と組み合わせる（Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５年，Ｇｅｎｅ；１６４：７５−７９）。この配列を、ＮＰのＧＳとＮＰ遺伝子のコード配列の間に挿入する。効果的であるためにはウイルスＲＮＡゲノムが６の倍数である必要があるという「６の規則」は、ＭｕＶについては絶対的ではないが、Ｆを有するゲノムの長さを６の倍数になるように維持する。ＭｕＶ−Ｆ感染細胞のＦの発現レベルを、免疫沈降を使用して調べ、ＲＳＶ感染細胞と比較する。高いＭＯＩ及び低いＭＯＩでのウイルスの増殖速度を、ＭｕＶと比較する。
ワクチン候補としての３’−近位Ｆ含有ＭｕＶ−Ｆの生成及び検討。ＭｕＶなどのマイナス鎖ＲＮＡウイルスは、３’末端リーダー配列から転写を開始し、ウイルス遺伝子の転写レベルはリーダー配列へのそれらの距離により影響を受ける。例えば、リーダー配列に最も近い、ＭｕＶのＮＰ遺伝子は、最も多量に転写されるが、リーダー配列から最も離れて位置するＬ遺伝子は、転写が最少である（図１９）。ワクチン候補の有効性は、Ｆタンパク質の発現レベルを増加させることにより、高められると期待される（組換えＲＳＶについて示されるように（Ｋｒｅｍｐｌ ｅｔ ａｌ．，２００２年，Ｊ Ｖｉｒｏｌ；７６（２３）：１１９３１−４２））。Ｆ遺伝子の発現レベルを増加させるために、Ｆ遺伝子をリーダー配列のすぐ下流でＮＰ遺伝子の上流に挿入する（図１９）。
ベクターとしてムンプスウイルスを使用して、ＲＳＶ Ｇタンパク質を、ＲＳＶ Ｆタンパク質と同様に発現させることができる。
本明細書に引用のすべての特許、特許出願、及び刊行物の完全な開示、並びに電子的に入手可能な資料（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑ等における、寄託されたヌクレオチド配列、並びにＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢと、ＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑの注釈付きコード領域に由来する翻訳物等における寄託されたアミノ酸配列を含む）は、参照により組み込まれる。本出願の開示と参照により本明細書に組み込まれる任意の文献の開示との間にいかなる矛盾が存在する場合でも、本出願の開示を優先するものとする。前述の詳細な説明及び実施例は、明快な理解のためにのみ提示されている。不必要な限定をそこから理解すべきではない。本発明は図示され記載された綿密な詳細に限定されるものではない。当業者にとって明白な変形形態は、特許請求の範囲により規定される本発明の範囲内に含まれるからである。
配列表フリーテキスト
配列番号１ Ｖタンパク質をコードするＶ／Ｐ遺伝子及び低分子疎水性タンパク質をコードするＳＨ遺伝子を含むムンプスウイルスゲノム
配列番号２ ムンプスウイルスＶタンパク質
配列番号３ ムンプスウイルス低分子疎水性タンパク質
配列番号４ ムンプスウイルス株Ｇｌｏｕｃ１／ＵＫ９６のＳＨタンパク質配列
配列番号５ ムンプスウイルス株ＵＫ０１−２２のＳＨタンパク質配列
配列番号６ ムンプスウイルス株ＭｕＶ−ＩＡのＳＨタンパク質配列
配列番号７ ＳＨ遺伝子の上流の核酸配列
配列番号８ ＳＨ遺伝子の欠失から得られる組換え核酸配列
配列番号９ ＳＨタンパク質の欠失を確認するために配列決定されたＰＣＲ産物
配列番号１０ 抗体を生成するために使用されたＭｕＶ−ＩＡ ＳＨ Ｎ末端ペプチド配列
配列番号１１ 抗体を生成するために使用されたＭｕＶ−ＩＡ ＳＨ Ｃ末端ペプチド配列
配列番号１２〜１３ 抗体を生成するために使用されたＭｕＶ−ＩＡ Ｖタンパク質ペプチド配列
配列番号１４ Ｐ／Ｖ遺伝子内の核酸編集配列
配列番号１５ Ｖタンパク質発現を消失させる組換え核酸配列
配列番号１６ Ｐ／Ｖ遺伝子の改変から得られる組換え核酸配列
配列番号１７ Ｖタンパク質の欠失を確認するために配列決定されたＰＣＲ産物
配列番号１８ Ｖタンパク質欠失があるムンプスウイルスのＮＰ遺伝子の終結からＰ／Ｖ遺伝子の開始までの核酸配列
配列番号１９〜２５ Ｖタンパク質欠失があるムンプスウイルスのＮＰ遺伝子の終結からＰ／Ｖ遺伝子の開始までのレスキューされた核酸配列
配列番号：２６〜８１ 合成オリゴヌクレオチドプライマー

Claims (30)

  1. ムンプスウイルスの完全長ＲＮＡゲノムをコードするｃＤＮＡ配列を含む単離ヌクレオチド配列であって、低分子疎水性（ＳＨ）タンパク質産物を発現することができず、かつ／またはＶタンパク質産物を発現すことができないムンプスウイルスをコードする、単離ヌクレオチド配列。
  2. 前記ＳＨタンパク質をコードする翻訳領域（ＯＲＦ）の欠失、開始コドンを停止コドンに変換する変異、または前記ＳＨ遺伝子の転写を破壊する、ＦポリペプチドをコードするＯＲＦとＳＨポリペプチドをコードするＯＲＦとの間の領域にある変異を含む、請求項１に記載のムンプスウイルスの完全長ＲＮＡゲノムをコードするｃＤＮＡ配列を含む単離ヌクレオチド配列。
  3. 前記ＳＨタンパク質をコードするＯＲＦの欠失を含む、請求項２に記載のムンプスウイルスの完全長ＲＮＡゲノムをコードするｃＤＮＡ配列を含む単離ヌクレオチド配列。
  4. 前記ＳＨタンパク質をコードするＯＲＦの１５６ヌクレオチドの欠失を含む、請求項３に記載のムンプスウイルスの完全長ＲＮＡゲノムをコードするｃＤＮＡ配列を含む単離ヌクレオチド配列。
  5. 前記Ｖタンパク質の発現を抑止する、Ｖ／Ｉ／Ｐ遺伝子に対する１つまたは複数の変異を含む、請求項１に記載のムンプスウイルスの完全長ＲＮＡゲノムをコードするｃＤＮＡ配列を含む単離ヌクレオチド配列。
  6. 前記Ｖタンパク質の発現を抑止する、Ｖ／Ｉ／Ｐ遺伝子に対する前記１つまたは複数の変異が、Ｐ／Ｖ遺伝子内の編集部位にヌクレオチド配列ＧＡＧＧＡＧＧＧを含む、請求項５に記載のムンプスウイルスの完全長ＲＮＡゲノムをコードするｃＤＮＡ配列を含む単離ヌクレオチド配列。
  7. 前記ＳＨタンパク質をコードする翻訳領域（ＯＲＦ）の欠失、開始コドンを停止コドンに変換する変異、または前記ＳＨ遺伝子の転写を破壊する、ＦポリペプチドをコードするＯＲＦとＳＨポリペプチドをコードするＯＲＦとの間の領域にある変異；及び
    前記Ｖタンパク質の発現を抑止する、Ｖ／Ｉ／Ｐ遺伝子に対する１つまたは複数の変異
    を含む、請求項１に記載のムンプスウイルスの完全長ＲＮＡゲノムをコードするｃＤＮＡ配列を含む単離ヌクレオチド配列。
  8. 前記Ｖタンパク質の発現を抑止する、Ｖ／Ｉ／Ｐ遺伝子に対する前記１つまたは複数の変異が、Ｐ／Ｖ遺伝子内の編集部位にヌクレオチド配列ＧＡＧＧＡＧＧＧを含む、請求項７に記載のムンプスウイルスの完全長ＲＮＡゲノムをコードするｃＤＮＡ配列を含む単離ヌクレオチド配列。
  9. 変異及び／または欠失をさらに含む、請求項１〜８の何れか一項に記載のムンプスウイルスの完全長ＲＮＡゲノムをコードするｃＤＮＡ配列を含む単離ヌクレオチド配列。
  10. 前記Ｐタンパク質のリン酸化をもたらす変異または欠失を含む、請求項９に記載のムンプスウイルスの完全長ＲＮＡゲノムをコードするｃＤＮＡ配列を含む単離ヌクレオチド配列。
  11. 前記Ｐタンパク質のＴ１４７及び／またはＳ３０７における変異を含む、請求項９に記載のムンプスウイルスの完全長ＲＮＡゲノムをコードするｃＤＮＡ配列を含む単離ヌクレオチド配列。
  12. Ｌ遺伝子の変異を更に含む、請求項１〜１１の何れか一項に記載のムンプスウイルスの完全長ＲＮＡゲノムをコードするｃＤＮＡ配列を含む単離ヌクレオチド配列。
  13. Ｉタンパク質産物の発現を更に含む、請求項１〜１２の何れか一項に記載のムンプスウイルスの完全長ＲＮＡゲノムをコードするｃＤＮＡ配列を含む単離ヌクレオチド配列。
  14. 前記ムンプスゲノムが異種のポリペプチドを更にコードする、請求項１に記載のムンプスウイルスの完全長ＲＮＡゲノムをコードするｃＤＮＡ配列を含む単離ヌクレオチド配列。
  15. 前記ムンプスウイルスが遺伝子型Ｇに属する、請求項１に記載のムンプスウイルスの完全長ＲＮＡゲノムをコードするｃＤＮＡ配列を含む単離ヌクレオチド配列。
  16. 前記ムンプスウイルスがＭｕＶ／ＩｏｗａＵＳ／２００６（ＭｕＶ−ＩＡ）である、請求項１に記載のムンプスウイルスの完全長ＲＮＡゲノムをコードするｃＤＮＡ配列を含む単離ヌクレオチド配列。
  17. 前記ムンプスウイルスのＭｕＶ／ＩｏｗａＵＳ／２００６（ＭｕＶ−ＩＡ）株の完全長ＲＮＡゲノムをコードするｃＤＮＡ配列を含む単離ヌクレオチド配列。
  18. 前記ヌクレオチド配列が配列番号１を含む、請求項１７に記載の単離ヌクレオチド配列。
  19. 請求項１〜１８の何れか一項に記載の単離ヌクレオチド配列を含む、組換えムンプスウイルス（ｒＭｕＶ）または麻疹ウイルスゲノムをコードするプラスミド（ｐＭｕＶ）。
  20. 請求項１〜１８の何れか一項に記載の単離ヌクレオチド配列を含むプラスミド、またはその断片。
  21. 請求項１〜１８の何れか一項に記載の単離ヌクレオチド酸配列を含む麻疹ウイルスゲノムをコードするプラスミド（ｐＭｕＶ）。
  22. 請求項１〜１８の何れか一項に記載のムンプスウイルスの完全長ＲＮＡゲノムをコードするｃＤＮＡ配列を含む単離ヌクレオチド配列を含むウイルス発現ベクター、またはその断片。
  23. 請求項１〜２２の何れか一項に記載の単離ヌクレオチド配列またはプラスミドを含む感染性ウイルス粒子。
  24. 請求項１〜２３の何れか一項に記載の単離ヌクレオチド配列、プラスミド、ｐＭｕＶ、ｒＭｕＶ、または感染性ウイルス粒子を含む組成物。
  25. 風疹及び／または麻疹の抗原決定基を更に含む、請求項２４に記載の組成物。
  26. 鼻腔内、経口、皮内、または筋肉内投与のために製剤化された、請求項２４または２５に記載の組成物。
  27. 被験体におけるムンプスウイルスに対する免疫応答を誘導する方法であって、前記方法が、請求項１〜２６の何れか一項に記載の単離ヌクレオチド配列、プラスミド、ｐＭｕＶ、ｒＭｕＶ、ウイルス粒子、または組成物の有効量を、前記被験体に投与することを含む方法。
  28. ムンプスに対するワクチン接種を被験体に行う方法であって、前記方法が、請求項１〜２６の何れか一項に記載の単離ヌクレオチド配列、プラスミド、ｐＭｕＶ、ｒＭｕＶ、ウイルス粒子、または組成物の有効量を、前記被験体に投与することを含む方法。
  29. 鼻腔内、経口、皮内、または筋肉内投与を含む、請求項２７または２８に記載の方法。
  30. 異種のＲＮＡまたはポリペプチドを発現する方法であって、前記方法が請求項１４に記載の単離ヌクレオチド配列を発現することを含む方法。
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