JP2014502503A - 多孔質担体を含む滅菌インジケータと方法 - Google Patents

Abstract

独自の多孔質担体を含む滅菌インジケータあって、活性が微生物の残存と相関する活性酵素の活性を測定することによって滅菌手順の有効性を試験するために有用なインジケータ。

Description

（関連出願の相互参照）
本願は、２０１０年１２月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／４２６，２７６号に関する利益を請求する。

滅菌インジケータ（また、生物学的インジケータと呼ばれる）は、病院内で外科用器具を滅菌するために使用されるものなどの滅菌するマシンが適切に機能して、滅菌手順中に滅菌チャンバ内に存在する微生物を殺菌しているかを判定するための手段を提供する。

滅菌インジケータは、滅菌手順の有効性を試験するための正確で精密な手段を提供するものとして当該技術分野において認知されている。従来の滅菌インジケータは、自然の汚染物の近くに通常存在する大抵の生物よりも滅菌処理に何倍も耐性のある、滅菌インジケータ内に収容される試験微生物の残存を監視することによって滅菌手順の有効性を計測する。滅菌インジケータは、滅菌サイクルに曝露されてから、残存している試験微生物の増殖を促進する条件下でインキュベートされる。滅菌サイクルが失敗すると、滅菌インジケータは、生物学的試料が残存したことを表示する検出可能なシグナルを発生させる。検出可能なシグナルは、通常、色彩の変更又は発光若しくは蛍光シグナルの発射のような表示である。

よく知られた型の滅菌インジケータのうちの１つは、滅菌手順の有効性を試験するために滅菌に非常に耐性のある細菌又は菌類からの芽胞を利用する。典型的な滅菌インジケータは、圧縮性のプラスチック材料で作製される外側容器（例えば、チューブ、スリーブ、又はアンプル）と、ガラスのような易破壊性の材料で作製される封止された内側容器（例えば、チューブ、スリーブ、又はアンプル）と、を有する。外側容器上の細菌不浸透性でガス透過性の被覆は、滅菌剤が滅菌手順中に外側容器に入ることを可能にする。担体の部品上の生きた芽胞は、外側容器及び内側容器の壁部の間に位置する。内側容器は、生きた芽胞の増殖を刺激する増殖培地を収容する。滅菌手順中に、滅菌剤は、キャップを介して外側容器に入り、担体内で芽胞に接触する。滅菌手順後に、内側容器は、外側容器を圧縮することによって粉砕され、増殖培地を放出して担体内で芽胞と接触させる。インジケータは、その後、芽胞増殖を刺激する条件下でインキュベートされる。滅菌手順が無効である場合は、残存している芽胞は成長して増殖培地中のｐＨインジケータの色彩を変更させ、滅菌サイクルが微生物の試験個体群を殺菌することができず、滅菌器装填内に存在する汚染性微生物を殺菌することができなかった可能性があることを表示する。芽胞の増殖に頼る滅菌インジケータは正確であるが、遅く、通常、最終結果を提供するために１〜７日を要する。

芽胞増殖のみを測定する滅菌インジケータとは対照的に、酵素インジケータは、しばしば数時間のうちに急速な応答を提供する。そのようなインジケータは、活性が滅菌手順中の汚染性微生物の破壊と相関する酵素の活性を測定することによって滅菌手順の有効性を測定する。インジケータは、圧縮性の外側容器と、易破壊性の内側容器と、細菌不浸透性であるがガス透過性であるキャップと、を有する。活性酵素は、外側及び内側容器の壁部の間に位置する担体に含侵され、活性酵素と反応する基質は、封止された内側容器内に収容される。滅菌手順中、滅菌剤は、外側容器に入り、担体内で活性酵素に接触する。滅菌手順後、内側のバイアル瓶は、粉砕されて、酵素ストリップは、基質へ曝露されてインキュベートされる。滅菌手順が適切に機能すると、酵素は、手順中に不活性化され、インキュベート後の検出可能な変更はなくなる。しかし、滅菌手順が無効である場合、酵素は不活性化されず、検出可能な生成物を形成するように基質と反応する。酵素−基質生成物は、例えば、色彩の変更又は蛍光若しくは発光シグナルとして検出可能である。

二重急速読出インジケータは、滅菌手順への曝露後の酵素活性及び芽胞増殖の両方を測定することによって滅菌手順の有効性を試験する滅菌インジケータである。酵素方式は、滅菌サイクルの有効性を急速に表示するが、これは、その後、時間のより長い周期に渡る芽胞成長の測定によって確認される。二重急速読出インジケータでは、インジケータの芽胞成長部で利用される生きた芽胞は、また、アッセイの酵素活性部のための活性酵素の源として機能することもできる。急速酵素試験は、芽胞と関連付けられている酵素の活性を測定し、芽胞自身は、その後、滅菌手順で残存したいずれかの芽胞の成長を助長するようにインキュベートされる。３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）から入手可能な３Ｍ ＡＴＴＥＳＴ １２９１及び１２９２急速読出生物学的インジケータは、インジケータ内でゲオバチルスステロサーモフィラス（正式にはバチルスステロサーモフィラスとして既知）の芽胞に関連付けられている酵素の活性及び芽胞自体の残存の両方を測定することによって、滅菌サイクルの有効性を試験する二重急速読出インジケータである。

本開示は、滅菌手順の有効性を試験するための滅菌インジケータ及び使用の方法に関する。本開示の滅菌インジケータは、芽胞増殖を試験するインジケータ（本明細書では芽胞成長インジケータと呼ばれる）、酵素活性を測定して急速応答を提供するインジケータ（本明細書では酵素系インジケータと呼ばれる）、又は滅菌手順への曝露後の酵素活性及び芽胞増殖の両方を測定することによって滅菌手順の有効性を試験するインジケータ（また、本明細書では酵素系インジケータ、より具体的には、酵素系／芽胞成長インジケータと呼ばれる）になり得る。

１つの実施形態では、本開示は、インジケータが滅菌手順中に滅菌剤が中に入ることを可能にする少なくとも１つの開口部を有する容器と、容器内に収容され、容器の容積の少なくとも５％を占める多孔質担体と、多孔質担体内に分布する生物学的材料であって、生物学的材料が有効な滅菌手順の結果として不活性化され、無効な滅菌手順の結果として検出可能な表示を提供する、滅菌手順の有効性を監視するために通常使用される少なくとも１つの試験微生物の残存と相関する、生物学的材料と、滅菌手順の失敗の検出可能な表示を形成するための手段（例えば、１つ以上のコンポーネンツ）と、を含む、滅菌手順の有効性を試験するための滅菌インジケータを提供する。

これは、（生物学的材料が芽胞を含み、検出可能な表示がｐＨ表示である）芽胞成長インジケータになり得る。あるいは、（生物学的材料が活性酵素の源を含み、検出可能な表示が検出可能な蛍光、発光、及び／又は色素生成表示を含む）酵素系インジケータになり得る。酵素系インジケータは、（生物学的材料が芽胞成長試験のためにも好適な活性酵素の源を含み、検出可能な表示が検出可能な蛍光、発光、及び／又はｐＨ表示に伴う色素生成表示を含む）二重酵素系／芽胞成長インジケータになり得る。

別の実施形態では、本開示は、インジケータが滅菌手順中に滅菌剤が中に入ることを可能にする少なくとも１つの開口部を有する容器と、容器内に収容され、容器の容積の少なくとも５％を占める多孔質担体と、活性酵素の源が多孔質担体内に分布し、活性酵素が滅菌手順の有効性を監視するために通常使用される少なくとも１つの試験微生物の残存に相関する酵素活性を有し、活性酵素の源が試験微生物に致死性である滅菌手順によって不活性化されるが、活性酵素の源が試験微生物に亜致死性である滅菌手順によって不活性化されない、活性酵素の源を含む生物学的材料と、滅菌手順の失敗の検出可能な表示を提供する酵素変性された生成物を形成するための手段と、を含む、滅菌手順の有効性を試験するための滅菌インジケータを提供する。

別の実施形態では、本開示は、滅菌手順の有効性を試験するための滅菌インジケータであって、滅菌手順中に滅菌剤が外側容器へ入ることを可能にする少なくとも１つの開口部を有する外側容器と、外側容器内に収容され、外側容器の容積の少なくとも５％を占める多孔質担体と、活性酵素の源が多孔質担体内に分布し、活性酵素が滅菌手順の有効性を監視するために通常使用される少なくとも１つの試験微生物の残存に相関する酵素活性を有し、活性酵素の源が試験微生物に致死性である滅菌手順によって不活性化されるが、活性酵素の源が試験微生物に亜致死性である滅菌手順によって不活性化されない、活性酵素の源を含む生物学的材料と、内側容器が滅菌手順で使用される滅菌剤に不浸透性であり、酵素基質を含み、酵素基質が活性酵素と反応することを可能にするように破壊されて、滅菌手順の失敗の検出可能な表示を提供する酵素変性された生成物を形成することができるように適合される、外側容器内の易破壊性の内側容器と、を含むインジケータを提供する。

別の実施形態では、本開示は、インジケータが滅菌手順中に過酸化水素滅菌剤が中に入ることを可能にする少なくとも１つの開口部を有する外側容器と、外側容器内に収容され、外側容器の容積の少なくとも５％を占める多孔質担体と、活性酵素の源が多孔質担体内に分布し、活性酵素が滅菌手順の有効性を監視するために通常使用される少なくとも１つの試験微生物の残存に相関する酵素活性を有し、活性酵素の源が試験微生物に致死性である滅菌手順によって不活性化されるが、活性酵素の源が試験微生物に亜致死性である滅菌手順によって不活性化されない、活性酵素の源を含む生物学的材料と、内側容器が滅菌手順で使用される過酸化水素滅菌剤に不浸透性であり、酵素基質を含み、酵素基質が活性酵素と反応することを可能にするように破壊されて、過酸化水素滅菌手順の失敗の検出可能な表示を提供する酵素変性された生成物を形成することができるように適合される、検出可能な表示が８時間以下以内に形成される、外側容器内の易破壊性の内側容器と、を含む、過酸化水素滅菌手順の有効性を試験するための急速読出過酸化水素滅菌インジケータを提供する。

本開示は、また、使用方法を提供する。１つの実施形態では、本開示は、滅菌手順の有効性を試験するための方法であって、本明細書に記載されるように、滅菌手順中に滅菌剤が中に入ることを可能にする少なくとも１つの開口部を有する容器と、容器内に収容され、容器の容積の少なくとも５％を占める多孔質担体と、多孔質担体内に分布する生物学的材料であって、生物学的材料が有効な滅菌手順の結果として不活性化され、無効な滅菌手順の結果として検出可能な表示を提供する、滅菌手順の有効性を監視するために通常使用される少なくとも１つの試験微生物の残存に相関する生物学的材料と、滅菌手順の失敗の検出可能な表示を形成し、生物学的材料を含む滅菌インジケータを滅菌手順に供し、滅菌に続いて、滅菌インジケータを検出可能な表示が存在するか、不在かを判定するための展開手順に供し、検出可能な表示の存在を滅菌手順の失敗と、及び検出可能な表示の不在を滅菌手順の成功と相関させるための手段と、を含む、滅菌インジケータを準備することを含む方法を提供する。

例示の芽胞成長滅菌インジケータを使用して、滅菌手順の有効性を試験するための方法は、滅菌手順中に滅菌剤が中に入ることを可能とする少なくとも１つの開口部を有する容器と、容器内に収容され、容器の容積の少なくとも５％を占める多孔質担体と、多孔質担体内に分布する芽胞を含む生物学的材料であって、生物学的材料が有効な滅菌手順の結果として不活性化され、無効な滅菌手順の結果として検出可能な表示を提供する、滅菌手順の有効性を監視するために通常使用される少なくとも１つの試験微生物の残存に相関する生物学的材料と、を含む、滅菌インジケータを準備することと、生物学的材料を含む滅菌インジケータを滅菌手順に供することと、滅菌に続いて、ｐＨインジケータを含む増殖培地と生物学的材料を組み合わせて、芽胞増殖を刺激する条件下で生物学的材料及び増殖培地の混合物をインキュベートすることと、検出可能なｐＨシグナルを有する残存している芽胞が生物学的材料内で存在するか、不在かを判定することと、検出可能なシグナルの存在を滅菌手順の失敗と、及び検出可能なシグナルの不在を滅菌手順の成功と、相関させることと、を含む。

例示の酵素系滅菌インジケータを使用して、滅菌手順の有効性を試験するための方法は、滅菌手順中に滅菌剤が中に入ることを可能にする少なくとも１つの開口部を有する容器と、容器内に収容され、容器の容積の少なくとも５％を占める多孔質担体と、活性酵素の源が多孔質担体内に分布し、活性酵素が滅菌手順の有効性を監視するために通常使用される少なくとも１つの試験微生物の残存に相関する酵素活性を有し、活性酵素の源が試験微生物に致死性である滅菌手順によって不活性化されるが、活性酵素の源が試験微生物に亜致死性である滅菌手順によって不活性化される、活性酵素の源を含む生物学的材料と、滅菌手順の失敗の際に、活性酵素と反応して、検出可能なシグナルを有する酵素変性された生成物を形成する酵素基質と、を含む、滅菌インジケータを準備することと、活性酵素の源を滅菌手順に供することと、酵素と基質とを合わせて酵素変性された生成物を形成することと、検出可能なシグナルを有する酵素変性された生成物が存在するか、不在かを判定することと、検出可能なシグナルの存在を滅菌手順の失敗と、及び検出可能なシグナルの不在を滅菌手順の成功と、相関させることと、を含む。特に好ましい実施形態では、滅菌インジケータは、二重急速読出インジケータであり、活性酵素の源は、酵素活性試験のための活性酵素の源及び芽胞成長試験のための試験微生物の両方として機能する微生物の芽胞を含む。

本開示は、多孔質担体を有し、本明細書に記載される滅菌インジケータを作製する方法を提供する。１つの実施形態では、方法は、滅菌手順中に滅菌剤が中に入ることを可能にする少なくとも１つの開口部を有する容器を準備することと、多孔質担体（例えば、シート形状で不織布材料を準備し、三次元構造体を形成するようにシートを配合すること）を準備することと、容器の容積の少なくとも５％を占めるに十分な量で多孔質担体を容器の中へ配置することと、多孔質担体内の生物学的材料であって、生物学的材料が有効な滅菌手順の結果として不活性化される、滅菌手順の有効性を監視するために一般に使用される少なくとも１つの試験微生物の残存に相関する生物学的材料を多孔質担体内に分布するように配置することと、無効な滅菌手順の結果として検出可能な表示を提供することと、容器内の滅菌手順の失敗の検出可能な表示を形成するための手段（つまり、１つ以上のコンポーネンツ）を必要に応じて配置することと、滅菌インジケータを形成する構成で容器、多孔質担体、生物学的材料、及び他の選択的コンポーネンツ（検出可能な表示、障壁等を形成するためのコンポーネンツ）を組み立てることと、を含む。

本明細書では、「多孔質」担体は、滅菌剤が滅菌の標準の条件下で（そのような条件は、特定の滅菌手順によって定義される）多孔質担体を通過し得ることを意味する。「三次元」多孔質担体は、中に位置する容器（例えば、２つの容器装置の外側容器）の容積の少なくとも５％を占めるものである。本明細書では、「多孔質担体」及び「三次元多孔質担体」は、互換的に使用される。

本明細書で、多孔質担体「内に分布する」は、生物学的材料が多孔質担体の容積の少なくとも一部を通して（つまり、表面上だけでなく）均一又は不均一に分布することができることを意味する。「内に分布する」は、多孔質担体の全容積の至る所に分布する（及び至る所に均一に分布する）ことを含む。

本明細書で、「生物学的材料」は、少なくとも１つの試験微生物の残存に相関し、検出可能なシグナルの形成に貢献する多孔質担体内に分布する部材を指す。つまり、生物学的材料は、有効な滅菌手順の結果として不活性化され（例えば、殺菌され）、無効な滅菌手順の結果として検出可能な表示を提供する。生物学的材料は、活性酵素の源として機能する芽胞又は他の微生物となり得る。活性酵素の源は、また、単離された酵素になり得る。

本明細書で、「試験微生物」は、ゲオバチルスステロサーモフィラスのように滅菌手順の有効性を監視するために通常使用される微生物を指す。

本明細書で、多孔質担体が作製される部材の文脈で、用語「親水性」はゼロの接触角を有することを意味する（つまり、水によって濡れる）。この疎水性材料は、無機、有機、又はこれらの組み合わせであり得る。

本明細書で、多孔質担体が作製される材料の文脈で、用語「疎水性」は、Ｅ．Ｓｈａｒｆｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６４（５）：５１９〜５２４（１９６０）に記載されるように、ノンゼロの接触角によって測定可能な水の撃退を意味する。この疎水性材料は、無機、有機、又はこれらの組み合わせであり得る。

「含む」なる用語及びその変化形は、これらの用語が説明文及び「特許請求の範囲」において用いられている場合に限定的な意味を有するものではない。

「好ましい」及び「好ましくは」なる語は、特定の状況下で、特定の効果をもたらし得る本開示の実施形態のことを指す。しかしながら、同じ又は他の状況下においては他の実施形態が好ましい場合もある。更に、１以上の好ましい実施形態の説明は、他の実施形態が有用ではないことを示唆するものではなく、本開示の範囲から他の実施形態を除外することを目的としたものではない。

本明細書で使用するところの「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、「少なくとも１つの」及び「１以上の」は、互換可能に使用される。

本明細書で使用するところの用語「又は」は、内容が明確に他を指示しない限り、概ね、「及び／又は」を含む普通の意で利用される。用語「及び／又は」は、列挙された要素のうちの１つ若しくはすべて、又は列挙された要素のうちのいずれか２つ以上の組み合わせを意味する（例えば、病気を予防及び／又は処置することは、病気を予防し、処置し、又は更に処置及び予防することの両方を意味する）。

すべての数字は、本明細書では、用語「約」及び好ましくは用語「ちょうど（exactly）」によって修正されることを想定している。本明細書で測定された量に関して使用されるところの用語「約」は、測定をし、測定の対象物及び使用された測定装置の精度と同等の水準の注意を行使した当事者によって期待される測定された量における変動を指す。終点による数値範囲の詳細説明は、範囲内に包摂されるすべての数字を含む（例えば、１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４及び５を含む）。本明細書に引用するすべての部は、下記の実施例セクション中のものを含め、特に指示がない限り重量による。

本開示の上記の「課題を解決するための手段」は本開示の開示される各実施形態又はすべての実施を説明しようとするものではない。以下の説明は、実例となる実施形態をより詳細に例示するものである。本明細書にわたっていくつかの箇所で、実施例の一覧を通してガイダンスを提供するが、実施例は様々な組み合わせにおいて使用できる。それぞれの場合において記載される一覧はあくまで代表的な群として与えられるものであって、排他的な羅列として解釈されるべきものではない。

本開示の滅菌インジケータの好ましい実施形態の分解図。 図１に示す装置の断面図。 本開示の滅菌インジケータの代替の好ましい実施形態の分解図。 図３に示す装置の断面図。 本開示の三次元多孔質担体を作製し、多孔質担体内に分布するように生物学的材料（例えば、芽胞）を多孔質担体に付加するための例示の方法の流れ図。 多孔質担体内に分布する芽胞を有する三次元多孔質担体の分解図。 本開示の滅菌インジケータの代替の好ましい実施形態の分解図。 図６に示す装置の斜視図。

滅菌インジケータが独自の多孔質担体を含む、滅菌手順の有効性を試験するための滅菌インジケータが提供される。この多孔質担体は、生物学的材料（例えば、活性酵素の源）が多孔質担体内に分布することを可能にする。

概ね、本明細書では、滅菌手順の有効性を試験するための滅菌インジケータは、滅菌手順中に滅菌剤が中に入ることを可能にする少なくとも１つの開口部を有する容器（例えば、チューブ、スリーブ、又はアンプル）と、容器内に収容される多孔質担体と、多孔質担体内に分布する生物学的材料であって、滅菌手順の有効性を監視するために通常使用される少なくとも１つの試験微生物の残存と相関する生物学的材料と、滅菌手順の失敗の検出可能な表示を形成するための手段と、を含む。本明細書に記載される多孔質担体が中に配置され得る滅菌インジケータの実施例は、米国特許第５，４８６，４５９号（Ｂｕｒｎｈａｍら）（本開示の多孔質担体は、図７に示す支持体ディスク１５の代わりに使用され得る）又は米国特許第６，８９７，０５９号（Ｆｏｌｔｚら）（本開示の多孔質担体は、担体ストリップの代わりに使用され得る）に記載されたものが挙げられる。

本開示の滅菌インジケータは、滅菌手順への曝露後に、芽胞増殖のみ、酵素活性のみ、又は酵素活性と芽胞増殖との両方を測定し得る。好ましい滅菌インジケータは、活性が試験微生物の残存に相関する活性酵素の活性を測定する。

多孔質担体内に分布する生物学的材料は、試験微生物に致死性である滅菌手順によって不活性化される（例えば、殺菌される）ように選択されるが、生物学的材料は、試験微生物に亜致死性である滅菌手順によって不活性化されない。つまり、生物学的材料は、有効な滅菌手順の結果として不活性化され、無効な滅菌手順の結果として検出可能な表示を提供する。

酵素系滅菌インジケータに対して、生物学的材料は、活性酵素の源であり、活性酵素の源が試験微生物に致死性である滅菌手順によって不活性化されるが、活性酵素の源が試験微生物に亜致死性である滅菌手順によって不活性化されない、滅菌手順の有効性を監視するために通常使用される少なくとも１つの試験微生物の残存に相関する酵素活性を有する酵素であるのが好ましい。

芽胞成長インジケータで有用な生物学的材料は、芽胞又は植物状態の細菌又は菌類である。酵素系滅菌インジケータに対して、生物学的材料は、（１）適切な微生物に由来する精製、単離された酵素、（２）酵素が自生又は遺伝子工学によって付加された微生物、又は（３）酵素が芽胞形成又は増殖中に付加された微生物である場合がある活性酵素の源を含む。本開示の滅菌インジケータでは、生物学的材料（酵素、微生物、又は芽胞であっても）は、試験微生物に致死性である滅菌手順によって不活性化されるが、生物学的材料が試験微生物に亜致死性である滅菌手順によって不活性化され得ないように選択される。

生物学的材料のための多孔質担体は、疎水性又は親水性である材料で作製され得る。そのような材料は、無機、有機、又はこれらの組み合わせであり得る。疎水性材料を含む（又はそれから調整された）多孔質担体は、いずれのインジケータにも使用され得るが、親水性材料を含む（又はそれから調整された）多孔質担体は、過酸化水素の蒸気相を使用する滅菌手順を監視するために使用されるのが好ましい。好適な疎水性材料の例には、ポリプロピレン、ポリウレタン、ナイロン、これらのポリマーのうちの１つ以上を含有する（例えば、他の疎水性ポリマーとの）ポリマー配合物、又はこれらの組み合わせが挙げられる。好適な親水性材料の例には、ガラス、レーヨン、セルロース、これらのポリマーのうちの１つ以上を含有する（例えば、他の親水性ポリマーとの）ポリマー配合物、又はこれらの組み合わせが挙げられる。

本開示の滅菌インジケータは、蒸気、過酸化水素蒸気相（過酸化水素プラズマを含んでも含まなくてもよい）、エチレンオキシドガス、乾燥した熱、プロピレンオキシドガス、メチルブロマイド、二酸化塩素、ホルムアルデヒド及び過酢酸（単独又は別の材料の蒸気相と）、オゾン、及びこれらの組み合わせを使用する滅菌手順を含む、１つ以上の型の滅菌手順の有効性を監視するために好適に使用され得る。例えば、本開示の滅菌インジケータは、例えば、米国特許第４，６４３，８７６号（Ｊａｃｏｂｓら）及び米国特許第４，７５６，８８２号（Ｊａｃｏｂｓら）に記載される手順を含む、当該技術分野において既知の任意の過酸化水素プラズマ滅菌手順の有効性を監視するために使用され得る。滅菌インジケータは、酸化滅菌剤を使用する蒸気相滅菌手順の有効性を監視するために使用され得るのが好ましい。滅菌インジケータは、過酸化水素蒸気相滅菌手順の有効性を監視するために使用され得るのがより好ましい。

水性過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）は、滅菌剤として長い使用の歴史を有し、蒸気相過酸化水素（ＶＰＨＰ）滅菌のコンセプトは過去１０年以内に開発された。この処理は、病院で滅菌サイクルの有効性を評価及び確認するために呼掛け生物として通常使用される細菌由来の内生胞子形成細菌を含む広範囲の微生物を殺菌する、低温の滅菌処理である。過酸化水素の主要な利点は、短い曝露サイクル時間（数分）である。更に、過酸化水素滅菌処理終了時には、空気及び水のみがチャンバ内に残る。これらの利点にも拘わらず、過酸化水素滅菌処理監視のための内蔵型急速読出滅菌インジケータは、現在、市場で入手できない。有意にも、本明細書に記載される滅菌インジケータの新規な特徴は、急速読出過酸化水素滅菌インジケータの開発の可能性を与える。

本開示の滅菌インジケータでは、生物学的材料（例えば、活性酵素の源）は、多孔質担体内（好ましくは、均一に全容積の至る所に）に分布する。本開示の滅菌インジケータは、生物学的材料（例えば、活性酵素の源）が多孔質担体内に分布することを可能にする、独自の三次元多孔質構成の多孔質担体が使用される。この文脈で、三次元多孔質担体「内に分布する」は、生物学的材料（例えば、活性酵素の源）が、三次元多孔質担体の容積の少なくとも一部の至る所に（ちょうど表面に対向するように）均一又は不均一に分布することを意味する。生物学的材料は、より良好な結果のために、三次元多孔質担体の全容積の至る所に分布する（より好ましくは、均一に分布する）のが好ましい。これは、例えば、三次元多孔質構成を形成するようにシート材料を（例えば、実験室の配合機で）配合し、配合前、配合中、又は配合後に生物学的材料（例えば、活性酵素の源）を組み合わせることによって達成することが可能である。

本明細書に記載される多孔質担体は、有意にも、滅菌インジケータに使用される従来の担体より容積が大きい。これは、多孔質担体材料が従来の担体よりも大きい三次元空間を占め、故に三次元多孔質担体と呼ばれることを意味する。比較して、紙で作製され、例えば、米国特許第６，８９７，０５９号（Ｆｏｌｔｚら）で開示されるフラット担体ストリップは、二次元担体と見なされる。典型的には、本明細書に記載される三次元多孔質担体は、中に位置する容器（例えば、２つの容器の装置の外側容器）の容積の少なくとも５％を占める。一定の実施形態では、三次元多孔質担体は、中に位置する容器（例えば、２つの容器の装置の外側容器）の容積の少なくとも１０％、又は少なくとも１５％、又は少なくとも２０％を占める。典型的には、三次元多孔質担体は、中に位置する容器（例えば、２つの容器の装置の外側容器）の容積の５０％以下、又は４０％以下、又は３０％以下を占める。

典型的には、従来の二次元及び／又は非多孔質担体に配置される生物学的材料の量と比較すると、同量の生物学的材料が本開示の多孔質担体内に分布する。これは、生物学的材料（例えば、芽胞）のよりむらのない分布をもたらし、それによって滅菌剤がより徹底して多孔質担体の中へ透過することを可能にし、従来の担体でより高密度に詰められ、密集した生物学的材料と比較すると、生物学的材料とのより均一な接触を有することができる。したがって、本明細書に記載される多孔質担体は、次の利点、より早い非活性化（例えば、殺菌）、より高い再現性、より高い確度、及びより鋭い終点、のうちの１つ以上を提供し得る。より少ない多孔質及び／又は従来の二次元担体では、生物学的材料は凝集塊を形成し得、滅菌剤が凝集塊の中心に透過することを妨げ得る。結果として、鋭い終点がない場合があり、滅菌失敗の誤った表示に至り得る。したがって、多孔質担体として使用される材料の物理的形状（例えば、容積が大きい三次元構成）は、蒸気相滅菌処理の速さ及び確度を改良する能力を有する。これは、過酸化水素蒸気処理で特に有用である。

一定の実施形態では、三次元多孔質担体は、５％を超える、１０％を超える、１５％を超える、２０％を超える、２５％を超える、３０％を超える、又は３５％を超えるソリディティを（実施例セクションに定義されるように）有する。一定の実施形態では、三次元多孔質担体は、５０％以下、４５％以下、４０％以下のソリディティを有する。

一定の実施形態では、三次元多孔質担体の材料の有効繊維直径は（実施例セクションに定義されるように）１０マイクロメートルを超え、１５マイクロメートルを超え、２０マイクロメートルを超え、２５マイクロメートルを超え、３０マイクロメートルを超え、３５マイクロメートルを超え、４０マイクロメートルを超え、４５マイクロメートルを超え、又は５０マイクロメートルを超える。一定の実施形態では、三次元多孔質担体の材料の有効繊維直径は、１００マイクロメートル以下、９０マイクロメートル以下、又は８０マイクロメートル以下である。

多孔質担体は、多様な仕方で調整され得る。１つの例示の方法では、実施例セクションでより詳細に記載され、図５ａに例示されるように、不織布シート材料は、より容積の大きい構造（例えば、綿の玉のそれに類似の三次元構造体）を得るように実験室の配合機で配合することによって三次元構造体に（工程１で）転換される。あるいは、調整する不織布材料のための標準的技術を使用して、刻まれ、溶解吹込みされ、又は調整され得る。この多孔質担体は、その後、配合機から取り除かれ（工程２）、容器（例えば、図１及び２に示す外側容器）の中に配置され（工程３）、所望の生物学的材料（例えば、芽胞）が多孔質担体に適用される（工程４）。容器は、その後、多孔質担体内に分布する生物学的材料（滅菌剤の流れを示す矢印で図５ｂに示されるように）を提供するために、生物学的材料（例えば、５８℃で１６時間（一晩中）インキュベートされる）に応じて所望なように、（例えば、単に圧搾することによって）混錬に、そして更なる処理（工程５）に供される。滅菌インジケータは、当該技術分野においてよく知られているように、その後、障壁、例えば、酵素基質又は生物学培地を収容する内側のアンプル、及び穿孔キャップのようなコンポーネンツを使用することによって組立てられ得る（工程６）。

したがって、本開示は、多孔質担体を有し、本明細書に記載される滅菌インジケータを作製する方法を提供する。１つの実施形態では、方法は、滅菌手順中に滅菌剤が中に入ることを可能にする少なくとも１つの開口部を有する容器を準備することと、（例えば、シート形状で不織布材料を準備し、三次元構造体を形成するようにシートを配合する）多孔質担体を準備することと、容器の容積の少なくとも５％を占めるために十分な量で多孔質担体を容器の中へ配置することと、多孔質担体内の生物学的材料（例えば、芽胞）であって、生物学的材料が有効な滅菌手順の結果として不活性化され、無効な滅菌手順の結果として検出可能な表示を提供する、滅菌手順の有効性を監視するために一般に使用される少なくとも１つの試験微生物の残存に相関する生物学的材料を多孔質担体内に分布するように配置することと、容器内での滅菌手順の失敗の検出可能な表示を形成するための手段（つまり、１つ以上のコンポーネンツ）を必要に応じて配置することと、滅菌インジケータ（例えば、穿孔キャップを使用するように、滅菌インジケータの形成を完了する他の工程を含む）を形成する構成で容器、多孔質担体、生物学的材料、及び他の選択的コンポーネンツ（検出可能な表示、障壁等を形成するためのコンポーネンツ）を組立てることと、を含む。

本開示の滅菌インジケータは、滅菌手順の失敗の検出可能な表示を形成するための手段を含む。例えば、本開示の滅菌インジケータは、滅菌手順の失敗の検出可能な表示を提供する（例えば、活性酵素との酵素基質の反応から生成された）酵素変性された生成物を形成するための手段を含み得る。これは、典型的には、酵素活性試験と呼ばれる。この滅菌手順の失敗の検出可能な表示は、検出可能な蛍光、発光、及び／又は色素生成表示を含むことが好ましい。これらの表示は、急速読出滅菌インジケータ内での素早い酵素応答のために使用されることが好ましい。この文脈で、「急速読出」は、検出可能なシグナルが２４時間未満で、好ましくは８時間以下以内に展開されることを意味する。

本開示の滅菌インジケータの一定の実施形態（例えば、芽胞増殖のみに基づく二重読み出し滅菌インジケータ及び生物学的インジケータ）では、滅菌手順の失敗の検出可能な表示は、検出可能なｐＨ表示を含む。ｐＨ表示の使用は、典型的には２４時間後、及びしばしば７日後の増殖芽胞の際に生じる。二重読出滅菌インジケータでは、これは、急速読出の信頼性を検証するためのメカニズムを提供する。概ね、ｐＨインジケータは、ブロモクレゾールパープルのような酸形成の識別のために好適なものである。これは、蛍光、発光、及び／又は色素生成表示から得られた読出しの安定性及び／又は信頼性の根拠を提供し、素早い酵素応答のために使用される。これは、芽胞成長試験と呼ばれる。

（例えば、芽胞成長インジケータで）芽胞成長が評価されるそのような実施形態では、滅菌手順後に、芽胞が増殖培地（例えば、ダイズカゼイン消化物が必要に応じてｐＨインジケータ）と接触する。例えば、増殖培地を収容する内側容器は、外側容器を圧縮することによって粉砕され、増殖培地を放出して外側容器内の多孔質担体内で芽胞と接触させる。インジケータは、その後、芽胞増殖を刺激する条件下でインキュベートされる。滅菌手順が無効である場合、残存している芽胞は、成長して増殖培地中のｐＨインジケータに（例えば、芽胞を増殖させることから形成される酸性副生成物の結果として）色彩を変更させる。これは、滅菌サイクルが微生物の試験個体群を殺菌することができなかったことと、滅菌器装填内に存在する汚染性微生物を殺菌することができなかった可能性があることと、を示す。芽胞の増殖に頼る生物学的インジケータは正確であるが、遅く、通常、最終結果を提供するために１〜７日を要する。

以上に議論された滅菌インジケータを作製する方法の一定の実施形態では、容器内の滅菌手順の失敗の検出可能な表示を形成するための１つ以上のコンポーネンツを配置する工程は、生きた芽胞の増殖を刺激する増殖培地及びｐＨインジケータを含む内側容器を配置することを含む。

以上に議論された滅菌インジケータを作製する方法の一定の実施形態では、容器内の滅菌手順の失敗の検出可能な表示を形成するための１つ以上のコンポーネンツを配置する工程は、活性酵素と反応して、検出可能な酵素−基質生成物を形成する酵素基質を含む内側容器を配置することを含む。

一定の実施形態では、滅菌インジケータは、滅菌手順中に滅菌剤が中に入ることを可能にする少なくとも１つの開口部を有する容器と、容器内に収容され、容器の容積の少なくとも５％を占める多孔質担体と、多孔質担体内に分布する生物学的材料であって、生物学的材料が有効な滅菌手順の結果として不活性化され、無効な滅菌手順の結果として検出可能な表示を提供する、滅菌手順の有効性を監視するために一般に使用される少なくとも１つの試験微生物の残存に相関する生物学的材料と、滅菌手順の失敗の検出可能な表示を形成するための手段と、を含む。

一定の実施形態では、滅菌インジケータは、滅菌手順中に滅菌剤が中に入ることを可能にする少なくとも１つの開口部を有する容器と、容器内に収容され、容器の容積の少なくとも５％を占める多孔質担体と、活性酵素の源が多孔質担体内に分布し、活性酵素が滅菌手順の有効性を監視するために通常使用される少なくとも１つの試験微生物の残存と相関する酵素活性を有し、活性酵素の源が試験微生物に致死性である滅菌手順によって不活性化されるが、活性酵素の源が試験微生物に亜致死性である滅菌手順によって不活性化しない、活性酵素の源を含む生物学的材料と、滅菌手順の失敗の検出可能な表示を提供する酵素変性された生成物を形成するための手段と、を含む。

一定の実施形態では、滅菌インジケータは、また、滅菌手順で使用される滅菌剤に不浸透性である外側容器内に易破壊性の内側容器（例えば、チューブ、スリーブ、又はアンプル）を含む。芽胞成長のみに基づくインジケータのために、この内側容器は、生きた芽胞の増殖を刺激する増殖培地を含む。滅菌手順後に、内側容器は、増殖培地と芽胞との間で接触を可能とするために破壊され得るように適合される。酵素系インジケータのために、この内側容器は、酵素基質が活性酵素と反応することを可能にするように破壊されて、滅菌手順の失敗の検出可能な表示を提供する酵素変性された生成物を形成することができるように適合される、基質を含む。そのような実施形態では、好ましくは、外側容器は、圧縮性であり、内側容器は、外側容器を圧縮することによって破壊されるように適合される。あるいは、外側容器は、圧縮性であっても、なくてもよく、内側容器は、尖った先端を有する部品（例えば、スリーブ）に対して内側容器を圧縮するようにキャップを押下げることによって破壊されて、内側容器が尖った先端の中に押されると壊れ得るように適合される。

本開示の例示の滅菌インジケータは、図１及び２に示される。滅菌インジケータ１０は、滅菌サイクルが完了する後までシステムの様々なコンポーネンツを互いから分離する入れ子の容器を含む。滅菌インジケータ１０は、（当業者によって理解されるような他の型の容器が使用され得るが、ここにはチューブ又はアンプル形状で示される）外側容器１２と、（当業者によって理解されるような他の型の封止された容器が使用され得るが、ここには封止されたチューブ又はアンプル形状で示される）封止された内側容器１８と、ベントされたキャップ２６と、を含む。外側容器１２は、圧縮性プラスチックで作製されるのが好ましい。内側容器１８は、ガラス又はいくつかの他の脆い材料で作製される。閉鎖部材２２は、好ましくは、外側容器１２の開放端部１４上に嵌合する細菌不浸透性でガス透過性の障壁である。多孔質担体１６は、生物学的材料（例えば、活性酵素の源）を含み、内側容器１８と外側容器１２との間に配置される。酵素系滅菌インジケータのために、内側容器１８は、多孔質担体１６内で活性酵素と反応する酵素基質を収容し、滅菌手順が無効である場合に検出可能なシグナルを生成する。芽胞成長滅菌インジケータのために、内側容器１８は、滅菌手順が無効である場合に検出可能なシグナルを生成する生物学的材料（例えば、芽胞）のための増殖培地を収容する。

図３及び４は、滅菌インジケータ３０が容器の閉鎖端部付近の外側容器１２内に位置する多孔質担体３６を含む代替の実施形態を示し、障壁３８は、多孔質担体３６と内側容器１８との間に位置する。図１及び２の実施形態に記載されるように、酵素系滅菌インジケータのために、内側容器１８は、多孔質担体３６内で活性酵素と反応する酵素基質を収容し、滅菌手順が無効である場合に検出可能なシグナルを生成する。芽胞成長滅菌インジケータのために、内側容器１８は、滅菌手順が無効である場合に検出可能なシグナルを生成する生物学的材料（例えば、芽胞）のための増殖培地を含む。

あるいは、一定の実施形態では、本明細書に記載される多孔質担体３６は、有利なことには、障壁３８がなくとも使用され得る。例えば、疎水性材料を含む多孔質担体は、担体及び障壁の両方として機能し得る。

障壁３８は、内側容器１８から多孔質担体３６を分離するように機能する。障壁３８は、好ましくは、酵素変性された生成物が、例えば、多孔質担体の周りに集中して、障壁の反対面にある容器の区域の中へ急速に拡散しないように、疎水性材料から作製される。インジケータの下部で酵素変性された生成物のより高い濃度を維持することは、例えば、発光又は色付きであっても、酵素変性された生成物が、多孔質担体３６が内側容器１８の全内容物と反応した場合よりも短い周期後に検出されることを可能にする。障壁３８を組込む好ましい装置は、約１０分以内で滅菌効果に関する信頼できる情報を提供する。

障壁３８と共に図３及び４に示される構成は、しばしば、過酸化水素蒸気滅菌手順で使用される。障壁は、好ましくは、２００ｇ／平方メートルの重量を有し、商業上、３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）から「ＴＨＩＮＳＵＬＡＴＥ ２００−ＢブランドのＴｈｅｒｍａｌ Ｉｎｓｕｌａｔｉｏｎ」として入手可能な、ポリプロピレン吹込み超極細繊維材料のディスクである。しかしながら、更に、多孔質担体が本明細書に記載されるように疎水性材料である場合、障壁は、過酸化水素滅菌手順においてさえも必要とされない。また、インジケータが過酸化水素手順（図１及び２又は図３及び４に示される実施形態を使用するかどうか）を監視するために使用される場合、閉鎖部材２２は、好ましくは、商業上、Ｅ．Ｉ．ｄｕ Ｐｏｎｔ ｄｅ ＮｅＭｏｕｒｓ及びＣｏ．（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）から入手可能なＴＹＶＥＫ高密度ポリエチレン繊維材料のような高密度繊維材料から作製される。

再び図１及び２を参照すると、典型的な滅菌手順中に、滅菌剤は、キャップ２６上のベント２８を通って外側容器１２の中に入り、多孔質担体１６内の生物学的材料（例えば、活性酵素の源）と接触するが、封止された内側容器１８内の内容物（例えば、基質溶液及び／又は増殖培地）と接触しない。滅菌サイクル後に、外側容器１２の面は、圧縮され、内側容器１８を壊して、内側容器１８の内容物と多孔質担体１６内の生物学的材料とを互いに接触させる。滅菌インジケータは、その後、検出可能な表示を形成するように、残っているいずれの生物学的材料（例えば、活性酵素又は生きた芽胞）にも十分な期間の間インキュベートされる。例えば、生物学的材料が活性酵素である場合、インキュベートは、発光、蛍光、又は色彩変更のように、検出可能なシグナルを生成する酵素変性された生成物を形成するように、それが基質と反応するために十分な時間の間、生じて、滅菌手順が無効である場合があることを表示する。

本開示の滅菌インジケータ１０の好ましい実施形態では、多孔質担体１６内の生物学的材料は、活性酵素の源である。好ましくは、活性酵素の源は、細菌由来又は菌類の芽胞のような生きた微生物である。最も好ましい実施形態では、芽胞は、活性酵素の源であり、滅菌インジケータ１０は、酵素活性及び芽胞成長の両方を測定することによって滅菌手順の有効性を監視する二重急速読出インジケータである。この実施形態では、内側容器１８は、芽胞増殖培地及び酵素基質を収容する。滅菌サイクルが完了した後、内側容器１８は破壊され、多孔質担体１６は内容物に曝露されてインキュベートされる。酵素試験は数時間以内に可視の結果を生成し、生きた微生物の増殖試験は７日以内にこれらの結果を確認する。

酵素インジケータの操作の根底にある理論は、酵素の不活性化がインジケータ内の試験微生物の死と相関するということである。滅菌インジケータ内で使用するために選択された酵素は、少なくとも、汚染物質として存在しがちな微生物と同程度に滅菌手順に耐性があり、好ましくは、そのような微生物よりも耐性がなければならない。酵素は、汚染性微生物を殺菌することができない滅菌サイクル後に検出可能な酵素−基質生成物を形成するに十分に活性なままであるべきであるが、汚染性微生物を殺菌する滅菌サイクルによって不活性化される。

上記のように、活性酵素の源は、（１）適切な微生物由来の精製され、単離された酵素、（２）酵素が自生又は遺伝子工学によって付加された微生物、又は（３）酵素が微生物、例えば、芽胞と合体している、芽胞形成中に芽胞に付加された酵素と合体し、又は関連付けられるように酵素が芽胞形成又は増殖中に付加された微生物、であってもよい。

本開示の滅菌インジケータで使用するための好適な酵素は、米国特許第５，２５２，４８４号（Ｍａｔｎｅｒら）及び米国特許第５，０７３，４８８（Ｍａｔｎｅｒら）に記載される。好適な酵素は、ゲオバチルスステロサーモフィラス及びバチルスアトロファエウス（以前はバチルスズブチルスとして既知）のような芽胞形成微生物由来の酵素を含む。本開示の滅菌インジケータにおいて有用な芽胞形成微生物からの酵素としては、芽胞形成微生物由来のベータ−Ｄ−グルコシダーゼ、アルファ−Ｄ−グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、ブチラートエステラーゼ、カプリレートエステラーゼリパーゼ、ミリステートリパーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、バリンアミノペプチダーゼ、キモトリプシン、ホスホヒドロラーゼ、アルファ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、チロシンアミノペプチダーゼ、フェニルアラニンアミノペプチダーゼ、ベータ−Ｄ−グルクロニダーゼ、アルファ−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、Ｎ−アセチル−Ｂ−グルコサミニダーゼ、ベータ−Ｄ−セロビオシダーゼ、アラニンアミノペプチダーゼ、プロリンアミノペプチダーゼ、及び脂肪酸エステラーゼが挙げられる。

微生物が活性酵素の源として使用される場合、本開示の方法は、滅菌サイクルの完了後に水性栄養素培地で生存可能なままである、いずれの微生物もインキュベートする工程を含んでもよい。この工程を含めることは、従来技術によって滅菌条件がインジケータ内のすべての微生物を殺菌するために十分であったかを確認し、滅菌条件が滅菌器内のすべての項目を滅菌するために十分であったことを示す。微生物の増殖が酵素試験の結果を確認するために従来のやり方で使用される場合、微生物は、滅菌条件を監視するために、従来使用されるものであるべきである。これらの従来使用される微生物は、概ね、自然の汚染物で遭遇するほとんどの生物よりも利用される滅菌処理に数倍耐性がある。

これら好ましい微生物は、活性酵素の源として、又は芽胞成長インジケータにおいて有用な生物学的材料として利用されてもよく、芽胞又は植物状態の細菌又は菌類である。細菌由来の芽胞は、微生物の生命の最も耐性のある形態として認識されている。それは、装置、化学物質、及び工程の滅菌効果を判定するためのすべての試験において選択する生命形態である。特に好ましい酵素の源としては、バチルス、クロストリジウム、ニューロスポラ、及びカンジダ種の微生物が挙げられる。バチルス及びクロストリジウム種からの芽胞は、飽和蒸気、乾燥熱、ガンマ照射、及びエチレンオキシドを利用する滅菌処理を監視するために最もよく使用される。

滅菌条件を監視するために通常使用される、特に好ましい微生物としては、ゲオバチルスステロサーモフィラス及びバチルスアトロファエウスが挙げられる。ゲオバチルスステロサーモフィラスは、滅菌条件下で滅菌を監視するために特に有用である。酵素ベータ−Ｄ−グルコシダーゼは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から「ＡＴＣＣ ７９５３」として商業上、入手可能なものなど、ゲオバチルスステロサーモフィラスの芽胞内で同定された。バチルスアトロファエウスは、特に、ガス及び乾燥熱滅菌の条件を監視するために有用である。酵素ベータ−Ｄ−グルコシダーゼは、（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから「ＡＴＣＣ ９３７２」として商業上、入手可能な）バチルスアトロファエウスの中で発見された。

二重急速読出インジケータが使用されるところでは、これらの微生物は、急速酵素試験の活性酵素の源及び芽胞成長試験のための試験微生物の両方として機能することも可能である。ゲオバチルスステロサーモフィラスは、水蒸気及び過酸化水素プラズマ滅菌手順の両方を監視するために特に好ましい。バチルスアトロファエウスは、エチレンオキシド滅菌手順を監視するために特に好ましく、過酸化水素プラズマ滅菌手順を監視するために使用されてもよい。

あるいは、単離された酵素が利用され、又は酵素の源として使用される微生物が自然の汚染物質よりも滅菌に耐性がない場合、滅菌条件を監視するために通常使用される別の微生物が酵素の源と共に滅菌サイクルに曝露され得る。更に、そのような場合、本開示の方法は、滅菌効果を確認するために、滅菌サイクル後に残っているいずれの生存可能な微生物も水性栄養素培地でインキュベートする工程を含んでもよい。

本開示は、主として単一の酵素及び／又は微生物種の観点から本明細書に記載されているが、複数の酵素及び／又は微生物種の使用もまた参照するものと理解されるべきである。例えば、単一の無菌製インジケータは、３つの型の単離された酵素（３つの型の微生物由来であってもよい）を収容してもよく、１つの酵素は、熱に耐性があり、第２の酵素は、ガス状滅菌培地に耐性があり、第３の酵素は、放射、例えば、ガンマ及びベータ照射に耐性がある。同様に、単一の無菌性インジケータは、３つの種の微生物を収容し、１つの種は、熱に耐性があり、第２の種は、ガス状滅菌培地に耐性があり、第３の種は、放射に耐性がある。

本開示の滅菌インジケータで使用するために好適な酵素基質は、米国特許第５，２５２，４８４（Ｍａｔｎｅｒら）及び米国特許第５，０７３，４８８（Ｍａｔｎｅｒら）に記載される。検出可能な生成物を形成するように酵素と反応し、本開示の滅菌インジケータで使用するために好適である、色素生成及び蛍光発生性基質は、当該技術分野において周知である。（Ｍ．Ｒｏｔｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｖｏｌ．１７，Ｄ．Ｂｌｏｃｋ，Ｅｄ．，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９６９，ｐ．８９、Ｓ．Ｕｄｅｎｆｒｉｅｎｄ，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｓｓａｙ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９６２，ｐ．３１２、Ｄ．Ｊ．Ｒ．Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｉｓｔ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４，Ｓ．Ｐ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ．Ｏ．Ｋａｐｌａｎ，Ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９５７，ｐ．１７４）。これらの基質は、視覚的に検出可能なシグナルを生成させるやり方に基づいて２つの群に分類することが可能である。第１の群の基質は、自身が色素生成又は蛍光剤である酵素変性された生成物を形成するように酵素と反応する。第２の群の基質は、色彩又は蛍光シグナルを生成するように付加的化合物と更に反応しなければならない、酵素変性された生成物を形成する。

本開示は、また、使用の方法を提供する。広くは、本開示は、滅菌手順の有効性を試験するための方法であって、本明細書に記載されるように滅菌インジケータを準備することと、滅菌手順に生物学的材料を含む滅菌インジケータを供することと、滅菌に続いて、滅菌インジケータを検出可能な表示が存在するか、不在かを判定するための展開手順に供することと、検出可能な表示の存在を滅菌手順の失敗と、そして検出可能な表示の不在を滅菌手順の成功と相関させることと、を含む、方法を提供する。

例示の芽胞成長滅菌インジケータを使用して、滅菌手順の有効性を試験するための方法は、滅菌手順中に滅菌剤が中に入ることを可能にする少なくとも１つの開口部を有する容器と、容器内に収容され、容器の容積の少なくとも５％を占める多孔質担体と、多孔質担体内に分布する芽胞を含む生物学的材料であって、生物学的材料が有効な滅菌手順の結果として不活性化され、無効な滅菌手順の結果として検出可能な表示を提供する、滅菌手順の有効性を監視するために一般に使用される少なくとも１つの試験微生物の残存に相関する生物学的材料と、を含む、滅菌インジケータを準備することと、滅菌手順に生物学的材料を含む滅菌インジケータを供することと、滅菌に続いて、ｐＨインジケータを含む増殖培地と生物学的材料を組み合わせて、芽胞増殖を刺激する条件下で生物学的材料及び増殖培地の混合物をインキュベートすることと、検出可能なｐＨシグナルを有する残存している芽胞が生物学的材料内で存在するか、不在かを判定することと、検出可能なシグナルの存在を滅菌手順の失敗と、及び検出可能なシグナルの不在を滅菌手順の成功と、相関させることと、を含む。

例示の酵素系滅菌インジケータを使用して、滅菌手順の有効性を試験するための方法は、滅菌手順中に滅菌剤が中に入ることを可能にする少なくとも１つの開口部を有する容器と、容器内に収容され、容器の容積の少なくとも５％を占める多孔質担体と、活性酵素の源が多孔質担体内に分布し、活性酵素が滅菌手順の有効性を監視するために通常使用される少なくとも１つの試験微生物の残存と相関する酵素活性を有し、活性酵素の源が試験微生物に致死性である滅菌手順によって不活性化されるが、活性酵素の源が試験微生物に亜致死性である滅菌手順によって不活性化しない、活性酵素の源を含む生物学的材料と、活性酵素と反応して、検出可能なシグナルを有する酵素変性された生成物を生成する酵素基質と、を含む、滅菌インジケータを準備することと、活性酵素の源を滅菌手順に供することと、酵素と基質とを合わせて酵素変性された生成物を形成することと、検出可能なシグナルを有する酵素変性された生成物が存在するか、不在かを判定することと、検出可能なシグナルの存在を滅菌手順の失敗と、及び検出可能なシグナルの不在を滅菌手順の成功と、相関させることと、を含む。

特に好ましい実施形態では、滅菌インジケータは、二重急速読出インジケータであり、活性酵素の源は、酵素活性試験のための活性酵素の源及び芽胞成長試験のための試験微生物の両方として機能する微生物の芽胞を含む。好適な微生物としては、ゲオバチルスステロサーモフィラス及びバチルスアトロファエウスが挙げられる。最も好ましい実施形態では、ゲオバチルスステロサーモフィラス芽胞がインジケータに使用される。

生物学的材料が芽胞を含む例示の使用での図１及び２を参照すると、滅菌インジケータ１０は、滅菌チャンバ内に配置され、過酸化水素蒸気滅菌手順に曝露される。滅菌剤は、ベント２８及び閉鎖部材２２を介してインジケータ１０の中に入り、多孔質担体１６内に位置する芽胞と接触する。手順が完了した後、インジケータ１０は、滅菌チャンバから取り除され、外側容器１２の側面は圧縮され、多孔質担体１６内の芽胞に接触することが可能なように脆い内側容器１８を壊してｐＨインジケータを含む増殖培地を放出する。滅菌インジケータ１０は、その後、増殖してｐＨインジケータ内の色彩変更を引起すようにインジケータ内に残っている、いずれの残存している芽胞にも十分な期間中インキュベートされ、滅菌手順の失敗の検出可能な表示を提供する。滅菌手順が有効であり、すべての芽胞が不活性化された場合、その後、インキュベートの際に色彩の変更は生成されない。

生物学的材料が活性酵素の源を含む例示の使用での図１及び２を参照すると、滅菌インジケータ１０は、滅菌チャンバ内に配置され、過酸化水素蒸気滅菌手順に曝露される。滅菌剤は、ベント２８及び閉鎖部材２２を介してインジケータ１０の中に入り、多孔質担体１６内に位置する活性酵素の源と接触する。手順が完了した後、インジケータ１０は、滅菌チャンバから取り除かれ、外側容器１２の側面は圧縮され、多孔質担体１６内の活性酵素の源に接触することが可能なように脆い内側容器１８を壊して酵素基質を放出する。滅菌インジケータ１０は、その後、基質と反応し、酵素変性された生成物を形成するようにインジケータ内に残っているいずれの活性酵素にも十分な期間中インキュベートされ、滅菌手順の失敗の検出可能な表示を提供する。酵素変性された生成物は、蛍光、発光、又は色彩変更として検出可能にしてもよい。滅菌手順が有効であり、すべての活性酵素が不活性化された場合、検出可能なシグナルは、インキュベートの際に生成されない。

一定の状況では、滅菌インジケータ（例えば、生物学的材料の担体、容器の壁部）の１つ以上のコンポーネンツは、残留酸化滅菌剤を保持してもよい。これは、オゾン及び過酢酸のような他の蒸気滅菌剤と同様に過酸化水素蒸気についても発生し得る。例えば、一定の担体材料、特に、ゼロの接触角（つまり、ガラス繊維及びセルロース系材料のように親水性である）を有するそれらは、残留酸化滅菌剤、特に、過酸化水素を保持し得る。この文脈で、「残留」は、小さい数の芽胞残存物の増殖を阻害する、保持される滅菌剤の量を意味する。典型的には、これは、マイクログラムの担体毎に保持される１０マイクログラムを超える滅菌剤を意味する。一定の状況では、残留滅菌剤の量は、ミリリットルの増殖培地毎で４０マイクログラムを超える滅菌剤になり得る。比較として、担体材料が９０°を超える接触角を有する場合、それは疎水性であり、概ね、マイクログラムの担体毎に保持される１０マイクログラム以下の滅菌剤がある。したがって、滅菌インジケータの１つ以上のコンポーネンツと関連付けられている、残留酸化滅菌剤を中和することは、中和剤（例えば、溶解及び／又は中に浮遊させた中和剤を含有する溶液）を滅菌インジケータの１つ以上のコンポーネンツ（例えば、生物学的材料の担体、容器の壁部）と接触させることを含む。

そのような滅菌インジケータでは、１つ以上の中和剤は、（米国特許第５，５５２，３２０号（Ｓｍｉｔｈ）に定義されるように）酵素ではなく、金属触媒ではなく、滅菌インジケータ内に配置される。本開示の中和剤は、米国特許仮出願第６１／４２６，２９１号に記載されており、全体として参照することにより本明細書に組み入れられる。中和剤は、残留滅菌剤、例えば、過酸化水素と反応して、その効果を中和する物質（例えば、化学化合物）であり、酵素ではなく、金属触媒でもない。酵素中和剤は、典型的には、高い温度では好適ではなく、したがって所望ではない。

中和剤の好適な例としては、メチオニン、Ｌ−システイン、Ｄ−エチオニン、Ｓ−メチル−Ｌ−システイン、Ｓ−ベンジル−Ｌ−システイン、チオ硫酸ナトリウム、グルタチオニン（glutathionine）、Ｌ−シスタチオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、カルボキシメチルシステイン、Ｄ，Ｌ−ホモシステイン、Ｄ，Ｌ−ホモシステイン−チオラクトン、ナトリウムチオグリコール酸、重亜硫酸ナトリウム、及びチオジプロピオン酸のような物質を含有する硫黄、並びにイソアスコルビン酸、フェリシアン化カリウム、塩化第一鉄、及びピルビン酸ナトリウムのような物質を含有するノン−硫黄が挙げられる。そのような中和剤の様々な組み合わせが使用され得る。好ましい中和剤としては、メチオニン、Ｌ−システイン、Ｄ−エチオニン、Ｓ−メチル−Ｌ−システイン、Ｓ−ベンジル−Ｌ−システイン、チオ硫酸ナトリウム、チオジプロピオン酸、イソアスコルビン酸、フェリシアン化カリウム、ピルビン酸ナトリウム、ナトリウムチオグリコール酸、塩化第一鉄、及びこれらの組み合わせが挙げられる。

１つ以上のそのような中和剤は、プロセスの滅菌ステージ中に滅菌剤の直接の作用から保護されている限り、滅菌インジケータ内の様々な位置に配置され得る。例えば、１つ以上の中和剤は、点眼器内（米国特許第５，４８６，４５９号（Ｂｕｒｎｈａｍら）に示されるような）、又は内側容器（例えば、アンプル）内（米国特許第６，８９７，０５９号（Ｆｏｌｔｚら）及び本明細書に示されるような）に位置し得える。好ましくは、１つ以上の中和剤は、プロセスの滅菌ステージ中に滅菌剤から隔離されるが、その後、プロセスの展開ステージ中（つまり、検出可能な表示の形成中）に残留滅菌剤とも接触することが可能となる。好ましくは、１つ以上の中和剤は、内側容器（例えば、アンプル）内に位置させることによって滅菌処理から隔離される。

本開示の別の例示の滅菌インジケータが図６〜７に示される。生物学的滅菌インジケータ２００は、ハウジング２０２を含み、内蔵型の生物学的滅菌インジケータを提供するように一緒に連結される第１部分２０４（例えば、中空のチューブ）及び第２部分２０６（例えば、キャップ）を収容する。キャップは、およそ長さ２１ｍｍ×直径１４ｍｍの概寸法を有する成形ポリプロピレンであってもよい。第１部分２０４（中空のチューブ）は、長さ約５２ｍｍ、トップの直径１２ｍｍの概寸法を有し、図１０〜１１に示される形状を有する、成形ポリカーボネートであってもよい。第１部分２０４（例えば、中空のチューブ）の全容積は、およそ３ｍＬである。

ハウジング２０２は、第１部分２０４の壁部２０８及び／又は第２部分２０６の壁部２１０のような少なくとも１つの液体不浸透性の壁部によって画定され得る。一部品の単一ハウジング２０２が利用されてもよく、第１及び第２部分２０４及び２０６は、本開示の趣旨及び範囲を逸脱することなく、他の形状、寸法、又は相対的構造を採り得る。ハウジング２０２（例えば、壁部２０８及び２１０）のために好適な材料としては、ガラス、金属（例えば、箔）、ポリマー（例えば、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリフェニレン（ＰＰＥ）、ポリテン（polythyene）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリエステル（例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ））、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ又はアクリル）、アクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、シクロオレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、ポリスルホン（ＰＳＵ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ））、セラミック、磁器、又はこれらの組み合わせが挙げられ得るが、これらに限定されない。

ハウジング２０２の第２部分（キャップ）２０６は、６つの口又は開口部２０７を含んでもよく、ハウジング２０２の内側（例えば、収容容器２０３）とアンビエンスとの間の流体連通を提供する。障壁としての役割を果たす濾紙材料（図示せず）は、口２０７上の滅菌剤経路内に位置付けられ、感圧性接着剤に支持された紙ラベルで適所に保持される。濾紙材料は、蒸気滅菌器（３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）から入手可能）のために現在入手可能な３Ｍ ＡＴＴＥＳＴ １２９１急速読出生物学的インジケータのキャップに存在する同じ材料である。

生物学的滅菌インジケータ２００は、更に、液体増殖培地２２２を収容する脆い容器２２０を含む。脆い容器２２０は、ボロシリケートガラスで作製され、芽胞増殖培地を収容する。培地は、ｐＨインジケータのブロモクレゾールパープルを含有する変性されたトリプチケースソイブロス（ＴＳＢ）及び蛍光酵素基質の４−メチルウンベリフェリル−アルファ−Ｄ−グルコシドからなる。アンプルは、およそ長さ４０ｍｍ×直径約４ｍｍであり、およそ５００μＬの培地液体を保持した。好適な液体増殖培地２２２の実施例は、蒸気滅菌器のための３Ｍ ＡＴＴＥＳＴ １２９２急速読出生物学的インジケータとして３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙから現在入手可能な生成物で使用される培地である。

液体培地容器２２０は、インサート２３０によって生物学的滅菌インジケータ２００内の適所に保持されてもよい。インサート（また、ブレーカとも呼ばれる）２３０は、容器２２０を適所に保持することと、容器２２０の制御された破損を容易にすることの両方に機能する。制御された破損は、第２部分（キャップ）２０６が液体培地容器２２０を壊すように下に押される、ＢＩの活性化工程中に発生する。インサート２３０は、長さ２２ｍｍ×幅９ｍｍのおよその寸法を有する成形ポリカーボネート構造であってもよい。

第２部分２０６は、活性化後に生物学的滅菌インジケータ２００を閉じ、又は封止する（例えば、気密的に封止する）ための第１部分２０４の開上端部で、第１部分２０４の第１の端部２０１に接触するように位置付けられた封止を有する。

生物学的滅菌インジケータ２００は、更に、第１部分２０４との流体連通に位置付けられたＧ．ステロサーモフィラス芽胞（ＡＴＣＣ ７９５３）３００のような好適な滅菌剤耐性のある芽胞を含む。芽胞３００は、芽胞担体１１６上に配置される。

ハウジング２０２は、（特に、少なくとも部分的に第１のチャンバ２０９を画定する）下部２１４と、（少なくとも部分的に第２のチャンバ２１１を画定する）上部２１６と、を含み、第１のチャンバ２０９と第２のチャンバ２１１との間に流体連通を提供する開口部２１７が形成される、内側の部分壁部又は出っ張り２１８によって部分的に分離される。第２のチャンバ２１１は、芽胞担体１１６を収納するように適合される。第１のチャンバ２０９は、特に、活性化前に脆い容器２２０を収納するように適合される。壁部２１８は、ハウジング２０２の長手方向Ｄ_Ｌについて、ノンゼロ及び非直角で角度を付けられるか、又は傾斜する。

第２のチャンバ２１１は、また、「芽胞増殖チャンバ」又は「検出チャンバ」と呼ばれ得、滅菌処理の効果を判定するように芽胞の生存能力について調べる容積を有する。

液体培地容器２２０は、第１のチャンバ２０９内のインサート２３０によって適所に位置付けられ、保持される。芽胞３００は、芽胞担体１１６上に位置付けられ、滅菌中に第２のチャンバ２１１内及びアンビエンスとの流体連通内に収納される。滅菌剤は、滅菌中、（例えば、第１のチャンバ１０９を介して）第２のチャンバ２１１の中に移動する。滅菌サイクル後、ＢＩは、容器２２０が断裂され、液体２２２がハウジング２０２の内部に放出されると、意図的に活性化され、液体培地２２２は、（例えば、第１のチャンバ２０９から）第２のチャンバ２１１の中へ移動する。

第１のチャンバ２０９は、約２８００マイクロリットルの容積を有する（すべての内部のコンポーネンツは空）。壁部２１８の直ぐ上部の第１のチャンバ２０９の断面積は、およそ５０ｍｍ^２である。第２のチャンバ２１１は、約２１０マイクロリットルの容積を有する。壁部２１８の直ぐ下部の第２のチャンバ２１１の断面積は、およそ２０ｍｍ^２である。

ハウジング２０２は、ハウジング２０２の断面積が、概ね、第１部分２０４の第１の端部２０１からハウジング２０２の閉鎖端部２０５へ長手方向Ｄ_Ｌに沿って減少するように、テーパ形状（例えば、テーパ形状部分２４６を参照）である。

本開示の滅菌インジケータのいずれも、試験パックの一部として使用されてもよい。本開示の１つの実施形態では、本開示の非呼掛け試験パックは、滅菌インジケータのみの抵抗以上に滅菌手順への付加的抵抗を提供しない。非呼掛け試験パックは、滅菌手順中、単一の位置に滅菌インジケータを確実に保持する点で、試験パックなしのインジケータの使用以上の利点を提供する。したがって、非呼掛け試験パックは、典型的には小さく、転がり回る傾向にある滅菌インジケータが滅菌手順中の材料の充填で置換されて、置き間違われるときに発生する問題を緩和する。代替の試験パックは、ルーメン呼掛け試験パックと呼ばれ、定義される断面積及び長さを有するルーメン内に配置されると、インジケータが経験する抵抗に等価である、滅菌インジケータに対する付加的抵抗を提供する。ルーメン呼掛け試験パックは、滅菌手順がチューブ状器具の内部深くに位置する場合がある微生物を殺菌する際に有効であるかどうかを判定する正確な方法を提供する。例示の非呼掛け及びルーメン呼掛け滅菌試験パックは、米国特許第６，８９７，０５９号（Ｆｏｌｔｚら）に記載される。

本開示の運用は、以下の詳細な実施形態及び実施例に関連して、更に記載される。これらの実施形態及び実施例は、種々の具体的なかつ好ましい実施形態及び技術を更に例示するために提供するものである。しかしながら、本開示の範囲内で多くの変更及び修正がなされてもよいことが理解されるべきである。

発明の例示の実施形態
１．滅菌手順の有効性を試験するための滅菌インジケータであって、
滅菌手順中に滅菌剤が中に入ることを可能にする少なくとも１つの開口部を有する容器と、
容器内に収容され、容器の容積の少なくとも５％を占める多孔質担体と、
多孔質担体内に分布する生物学的材料であって、生物学的材料が有効な滅菌手順の結果として不活性化され、無効な滅菌手順の結果として検出可能な表示を提供する、滅菌手順の有効性を監視するために通常使用される少なくとも１つの試験微生物の残存と相関する、生物学的材料と、
滅菌手順の失敗の検出可能な表示を形成するための手段と、を含む、滅菌インジケータ。

２．滅菌手順の有効性を試験するための滅菌インジケータであって、
滅菌手順中に滅菌剤が中に入ることを可能にする少なくとも１つの開口部を有する容器と、
容器内に収容され、容器の容積の少なくとも５％を占める多孔質担体と、
活性酵素の源が多孔質担体内に分布し、活性酵素が滅菌手順の有効性を監視するために通常使用される少なくとも１つの試験微生物の残存と相関する酵素活性を有し、活性酵素の源が試験微生物に致死性である滅菌手順によって不活性化されるが、活性酵素の源が試験微生物に亜致死性である滅菌手順によって不活性化しない、活性酵素の源を含む生物学的材料と、
滅菌手順の失敗の検出可能な表示を提供する酵素変性された生成物を形成するための手段と、を含む、滅菌インジケータ。

３．滅菌手順の有効性を試験するための滅菌インジケータであって、
滅菌手順中に滅菌剤が中に入ることを可能にする少なくとも１つの開口部を有する外側容器と、
外側容器内に収容され、外側容器の容積の少なくとも５％を占める多孔質担体と、
活性酵素の源が多孔質担体内に分布し、活性酵素が滅菌手順の有効性を監視するために通常使用される少なくとも１つの試験微生物の残存と相関する酵素活性を有し、活性酵素の源が試験微生物に致死性である滅菌手順によって不活性化されるが、活性酵素の源が試験微生物に亜致死性である滅菌手順によって不活性化しない、活性酵素の源を含む生物学的材料と、
内側容器が
滅菌手順で使用される滅菌剤に不浸透性であり、
酵素基質を含み、
酵素基質が活性酵素と反応することを可能にするように破壊されて、滅菌手順の失敗の検出可能な表示を提供する酵素変性された生成物を形成することができるように適合される、外側容器内の易破壊性の内側容器。

４．過酸化水素滅菌手順の有効性を試験するための急速読出過酸化水素滅菌インジケータであって、
滅菌手順中に過酸化水素滅菌剤が中に入ることを可能にする少なくとも１つの開口部を有する外側容器と、
外側容器内に収容され、外側容器の容積の少なくとも５％を占める多孔質担体と、
活性酵素の源が多孔質担体内に分布し、活性酵素が滅菌手順の有効性を監視するために通常使用される少なくとも１つの試験微生物の残存に相関する酵素活性を有し、活性酵素の源が試験微生物に致死性である滅菌手順によって不活性化されるが、活性酵素の源が試験微生物に亜致死性である滅菌手順によって不活性化しない、活性酵素の源を含む生物学的材料と、
内側容器が、
滅菌手順で使用される過酸化水素滅菌剤に不浸透性であり、
酵素基質を含み、
過酸化水素滅菌手順の失敗の検出可能な表示を提供する酵素変性された生成物を形成するために、酵素基質が活性酵素と反応することを可能にするように、破壊されるように適合され、検出可能な表示が８時間以下以内に形成される、外側容器内の易破壊性の内側容器と、を含む、インジケータ。

５．生物学的材料が多孔質担体の全容積を通して均一に分布する、実施形態１〜４のいずれか一項に記載の滅菌インジケータ。

６．多孔質担体が容器の容積の５０％以下を占める、実施形態１〜５のいずれか一項に記載の滅菌インジケータ。

７．多孔質担体が５％を超えるソリディティを有する、実施形態１〜６のいずれか一項に記載の滅菌インジケータ。

８．多孔質担体が１０マイクロメートルを超える有効繊維直径を有する、実施形態１〜７のいずれか一項に記載の滅菌インジケータ。

９．多孔質担体が疎水性材料を含む、実施形態１〜８のいずれか一項に記載の滅菌インジケータ。

１０．疎水性部材がポリプロピレン、ポリウレタン、ナイロン、これらのポリマーのうちの１つ以上を含有する配合物、又はこれらの組み合わせを含む、実施形態９に記載の滅菌インジケータ。

１１．多孔質担体が親水性材料を含む、実施形態１〜１０のいずれか一項に記載の滅菌インジケータ。

１２．親水性材料がガラス、レーヨン、セルロース、これらのポリマーのうちの１つ以上を含有する配合物、又はこれらの組み合わせを含む、実施形態１１に記載の滅菌インジケータ。

１３．滅菌手順の失敗の検出可能な表示が検出可能な蛍光、発光、及び／又は色素生成表示を含む、実施形態１〜１２のいずれか一項に記載の滅菌インジケータ。

１４．滅菌手順の失敗の検出可能な表示が、検出可能なｐＨ表示を含む、実施形態１〜１３のいずれか一項に記載の滅菌インジケータ。

１５．生物学的材料が微生物を含む、実施形態１〜１４のいずれか一項に記載の滅菌インジケータ。

１６．生物学的材料が単離された酵素を含む、実施形態１〜１４のいずれか一項に記載の滅菌インジケータ。

１７．生物学的材料が芽胞を含み、検出可能な表示がｐＨ表示を含む、実施形態１に依存し、芽胞成長インジケータである、実施形態１及び実施形態５〜１１に記載の滅菌インジケータ。

１８．生物学的材料が活性酵素の源を含み、検出可能な表示が検出可能な蛍光、発光、及び／又は色素生成表示を含む、実施形態１に依存し、酵素系インジケータである、実施形態１及び実施形態５〜１１に記載の滅菌インジケータ。

１９．生物学的材料が芽胞成長試験のためにも好適である活性酵素の源を含み、検出可能な表示が検出可能な蛍光、発光、及び／又はｐＨ表示に続く色素生成表示を含む、二重酵素系／芽胞成長インジケータである、実施形態１８に記載の滅菌インジケータ。

２０．滅菌剤が酸化滅菌剤である、実施形態１〜１９のいずれか一項に記載の滅菌インジケータ。

２１．残留酸化滅菌剤を中和するために有効な量でインジケータ内に配置される中和剤を更に含み、中和剤が酵素ではなく、金属触媒ではない、実施形態１〜２０のいずれか一項に記載の滅菌インジケータ。

２２．中和剤が硫黄含有化合物である、実施形態２１に記載の滅菌インジケータ。

２３．硫黄含有化合物がメチオニン、Ｌ−システイン、Ｄ−エチオニン、Ｓ−メチル−Ｌ−システイン、Ｓ−ベンジル−Ｌ−システイン、チオ硫酸ナトリウム、グルタチオニン、Ｌ−シスタチオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、カルボキシメチルシステイン、Ｄ，Ｌ−ホモシステイン、Ｄ，Ｌ−ホモシステイン−チオラクトン、チオジプロピオン酸、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態２２に記載の滅菌インジケータ。

２４．中和剤が非硫黄含有化合物である、実施形態２１に記載の滅菌インジケータ。

２５．非硫黄含有化合物がイソアスコルビン酸、フェリシアン化カリウム、ピルビン酸ナトリウム、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態２４に記載の滅菌インジケータ。

２６．中和剤が滅菌中に滅菌剤から隔離される、実施形態２１〜２５のいずれか一項に記載の滅菌インジケータ。

２７．滅菌手順の有効性を試験するための方法であって、
滅菌手順中に滅菌剤が中に入ることを可能にする少なくとも１つの開口部を有する容器と、
容器内に収容され、容器の容積の少なくとも５％を占める多孔質担体と、
多孔質担体内に分布する生物学的材料であって、生物学的材料が有効な滅菌手順の結果として不活性化され、無効な滅菌手順の結果として検出可能な表示を提供する、滅菌手順の有効性を監視するために通常使用される少なくとも１つの試験微生物の残存と相関する、生物学的材料と、を含む、滅菌インジケータを準備することと、
滅菌手順の失敗の検出可能な表示を形成し、
生物学的材料を含む滅菌インジケータを滅菌手順に供し、
滅菌に続いて、検出可能な表示が存在するか、不在かを判定するための展開手順に滅菌インジケータを供し、
検出可能な表示の存在を滅菌手順の失敗と、及び検出可能な表示の不在を滅菌手順の成功と、相関させるための手段と、を含む、方法。

２８．滅菌手順の有効性を試験するための方法であって、
滅菌手順中に滅菌剤が中に入ることを可能にする少なくとも１つの開口部を有する容器と、
容器内に収容され、容器の容積の少なくとも５％を占める多孔質担体と、
多孔質担体内に分布する芽胞を含む生物学的材料であって、生物学的材料が有効な滅菌手順の結果として不活性化され、無効な滅菌手順の結果として検出可能な表示を提供する、滅菌手順の有効性を監視するために通常使用される少なくとも１つの試験微生物の残存と相関する、生物学的材料と、を含む、滅菌インジケータを準備することと、
生物学的材料を含む滅菌インジケータを滅菌手順に供することと、
滅菌に続いて、ｐＨインジケータを含む増殖培地と生物学的材料を組み合わせて、芽胞増殖を刺激する条件下で生物学的材料及び増殖培地の混合物をインキュベートすることと、
検出可能なｐＨシグナルを有する残存している芽胞が生物学的材料内で存在するか、不在かを判定することと、
検出可能なシグナルの存在を滅菌手順の失敗と、及び検出可能なシグナルの不在を滅菌手順の成功と、相関させることと、を含む、方法。

２９．滅菌手順の有効性を試験するための方法であって、
滅菌手順中に滅菌剤が中に入ることを可能にする少なくとも１つの開口部を有する容器と、
容器内に収容され、容器の容積の少なくとも５％を占める多孔質担体と、
活性酵素の源が多孔質担体内に分布し、活性酵素が滅菌手順の有効性を監視するために通常使用される少なくとも１つの試験微生物の残存と相関する酵素活性を有し、活性酵素の源が試験微生物に致死性である滅菌手順によって不活性化されるが、活性酵素の源が試験微生物に亜致死性である滅菌手順によって不活性化しない、活性酵素の源を含む生物学的材料と、
滅菌手順の失敗の際に、活性酵素と反応して、検出可能なシグナルを有する酵素変性された生成物を生成する酵素基質と、を含む、滅菌インジケータを準備することと、
活性酵素の源を滅菌手順に供することと、
酵素と基質とを合わせて酵素変性された生成物を形成することと、
検出可能なシグナルを有する酵素変性された生成物が存在するか、不在かを判定することと、
検出可能なシグナルの存在を滅菌手順の失敗と、及び検出可能なシグナルの不在を滅菌手順の成功と、相関させることと、を含む、方法。

３０．滅菌インジケータが二重急速読出インジケータであり、活性酵素の源が酵素活性試験のための活性酵素の源及び芽胞成長試験のための試験微生物の両方として機能する、微生物の芽胞を含む、実施形態２９に記載の方法。

３１．滅菌剤が酸化滅菌剤である、実施形態２７〜３０のいずれか一項に記載の方法。

３２．滅菌手順が過酸化水素蒸気を使用する、実施形態２７〜３０のいずれか一項に記載の方法。

３３．
中和剤が酵素でなく、金属触媒でない、滅菌インジケータ内で残留酸化滅菌剤を中和するために有効な量の中和剤を提供することと、
滅菌手順に活性酵素の源を供した後、多孔質担体及び中和剤を有する生物学的材料に接触することと、を更に含む、実施形態２７〜３２のいずれか一項に記載の方法。

３４．滅菌手順の有効性を試験するための滅菌インジケータを作製する方法であって、
滅菌手順中に滅菌剤が中に入ることを可能にする少なくとも１つの開口部を有する容器を準備することと、
多孔質担体を準備することと、
容器の容積の少なくとも５％を占めるのに十分な量で多孔質担体を容器の中に配置することと、
多孔質担体内の生物学的材料であって、生物学的材料が有効な滅菌手順の結果として不活性化され、無効な滅菌手順の結果として検出可能な表示を提供する、滅菌手順の有効性を監視するために通常使用される少なくとも１つの試験微生物の残存と相関する生物学的材料を多孔質担体内に分布するように配置することと、
容器内の滅菌手順の失敗の検出可能な表示を形成するための１つ以上のコンポーネンツを配置することと、を含む、方法。

３５．容器内の滅菌手順の失敗の検出可能な表示を形成するための１つ以上のコンポーネンツを配置することが、生きた芽胞の増殖及びｐＨインジケータを刺激する増殖培地を含む内側容器を配置することを含む、実施形態３４に記載の方法。

３６．容器内の滅菌手順の失敗の検出可能な表示を形成するための１つ以上のコンポーネンツを配置することが、活性酵素と反応して、検出可能な酵素−基質生成物を形成する酵素基質を含む内側容器を配置することを含む、実施形態３４に記載の方法。

３７．多孔質担体を準備することが、シート形状で不織布材料を準備し、三次元構造体を形成するようにシートを配合することを含む、実施形態３４〜実施形態３６に記載の方法。

本発明の目的及び利点を、以下の実施例によって更に例示するが、これらの実施例において列挙される特定の材料及びその量、並びに他の諸条件及び詳細によって、本開示を不当に制限するものではないと解釈すべきである。

材料及び方法
芽胞調整
すべての実施例で使用されるゲオバチルスステロサーモフィラス（ＡＴＣＣ ７９５３）芽胞は、ＴＳＡ寒天平板培地で生成された。芽胞は、収穫され、ペレットは、４℃の脱イオン化Ｈ_２Ｏで３回洗浄された。芽胞懸濁液を８０００毎分回転数（ｒｐｍ）で１５分（ｍｉｎ）間遠心分離し、きれいなクロップの容積は、無菌の脱イオン化Ｈ_２Ｏを付加することによって８００ミリリットル（ｍＬ）に至った。芽胞懸濁液の透過率の百分率が測定及び記録された（λ＝６２５ナノメートル（ｎｍ））。

芽胞担体材料
１４個の異なる芽胞担体材料が試験された。これらの芽胞担体材料は、すべて不織布サンプルであった。すべての不織布材料は、化学的性質及び／又は加工プロセスで異なっていた。

３Ｄ多孔質担体を得るための芽胞担体材料の処理
過酸化水素浸透及び除去を容易にするために、それぞれの不織布サンプルは、三次元（３Ｄ）多孔質担体を得るように実験室の配合機（Ｗａｒｉｎｇ Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ，ＣＮ）で配合された。約１．６立方センチメートル（ｃｍ^３）の三次元多孔質担体がポリプロピレンスリーブ（直径＝０．８ｃｍ）の底面部を満たすために使用された。すべての不織布サンプルを三次元多孔質担体材料に変態させるプロセスは、図５ａに例示される。

芽胞コーティングプロセス及び生物学的インジケータの組立て
ゲオバチルスステロサーモフィラス芽胞懸濁液の７２％の透過率を得るために希釈された。コーティングプロセスを改良するために、３６０マイクロリットル（μＬ）の３０倍に希釈された芽胞懸濁液が三次元多孔質担体１．６ｃｍ^３に適用された。スリーブは、液体吸着効果を改良し、滑らかな芽胞コーティングを可能とするように圧搾された。配合された３Ｄ多孔質担体材料内に分布するコーティングされた芽胞を収容するスリーブは、５８℃で１６時間（一晩中）インキュベートされた。生物学的インジケータは、以上にリストされた芽胞コーティングされた多孔質担体が、紙芽胞ストリップの代わりに使用されたことを除き、３Ｍ ＡＴＴＥＳＴ １２９２生物学的インジケータ（３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）から入手可能）のコンポーネンツを使用することによって組立てられた。１２９２培地アンプル、障壁、及び穿孔のキャップのような他のコンポーネンツが、また、使用された。

（実施例１）
疎水性接触角測定
不織布シート材料の疎水性は、水接触角測定によって判定された。接触角は、水によるシート形状の芽胞担体材料の濡れの定量的度量である。それは、液体、ガス及び固体が交差する三相境界での液体によって形成される角度として幾何学的に定義される。１８０°の接触角は、完全に疎水性の表面を表す。０°に近い接触角は、親水性の表面を表す。１０〜２０マイクロリットル（μＬ）量の液滴（sessile water droplet）が、それぞれの非配合不織布シート材料に適用された。不織布シート材料の疎水性は、水接触角の測定値によって判定された（表２）。接触角の結果に基づいて、担体材料は、２つの群に分類された。担体材料の第１の群は、ゼロに等しい接触角を有する親水性として特徴付けられた（Ｐａｐｅｒ−５９１、ＣＲＡＮＥＧＬＡＳ、ＳＸ−３１４及びＨＥＦ１４０−１１４）。第２の群は、接触角３０°以上を有する疎水性であった（ＣＥＲＥＸ ＰＢＮ、ＴＯ５０５、ＳＯＦＴＥＸ、４０ＡＡ０、ＳＢ３３９６０１８、ＵＨＦ−５０、ＤＯＯＤＬＥ ＤＵＳＴＥＲ、ＳＲＦ２７３２Ａ−１、ＵＮＩＬＡＹＥＲ、ＵＮＩＰＲＯ １２５）。

（実施例２）
担体材料判定の有効繊維直径（ＥＦＤ）及びソリディティ（％）
圧力低下（ΔＰ）が、差圧流量計（ＴＳＩ Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｐａｕｌ ＭＮ）から入手可能）を使用して、分毎１５リットルの体積測定の空気流量で測定された。それぞれのΔＰ測定値のために、担体材料サンプル（それぞれの材料は上記のように処理／配合されている）の所与の坪量は、高さ４ｍｍの材料のプラグを形成するように、７ｍｍの内径を有するプラスチックチューブの中にパックされた。プラスチックチューブの１つの端部は、大気圧に対して、そしてもう１つの端部は、担体材料のプラグを介して一定の体積測定の空気流量を確立するために使用される真空ポンプに対して開いていた。差圧流量計は、プラスチックチューブを真空ポンプに接続する経路に存在した。大きな開口部を有するスクリム層は、ΔＰの測定中にチューブ内に担体材料を保持するために、ポンプに接続されたプラスチックチューブの端部に蓋をするように使用された。２乗されたメートル毎グラムの坪量（ｇ／ｍ^２）、パーセント（％）でのソリディティ、及び有効繊維直径（ＥＦＤ）は、Ｃ．Ｎ．Ｄａｖｉｅｓ，「Ｔｈｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｉｒｂｏｒｎｅ Ｄｕｓｔ ａｎｄ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ，」Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ １Ｂ，１９５２に明記されるように測定及び計算された。結果を表３に示す。有効繊維直径及びソリディティの両方は、比較のために坪量へ正規化された。親水性材料は、１６〜４１μｍで含まれる正規化された有効繊維直径を示したが、疎水性担体についてのＥＦＤは、３３〜５３μｍであった。正規化されたソリディティの値は、親水性担体については１６〜３３％、疎水性材料については２７〜３６％であった。

（実施例３）
残留過酸化水素の測定
この手順は、担体ストリップ材料によって保持される残留Ｈ_２Ｏ_２の量を判定するために実行された。この手順は、Ｔｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＰＥＲＯＸＯＱＵＡＮＴ定量的過酸化物アッセイキット番号２３２８０を使用する。このアッセイは、キシレノールオレンジの存在下での第一鉄（Ｆｅ^２＋）の第二鉄イオン（Ｆｅ^３＋）への酸化に基づいて、Ｈ_２Ｏ_２を検出する。この複合物は、５６０ナノメートル（ｎｍ）で最高吸光度を有する紫色の生成物をもたらす。１０ミリモル（ｍＭ）のＨ_２Ｏ_２の原液の濃度は、０．２５、０．２、０．１５、０．１、０．０５、及び０．００１ｍＭのＨ_２Ｏ_２を得るように希釈された。基準曲線は、全アッセイ値域上で線状ではなく、基準点を得るために二次又は最適な曲線を使用することが推奨される。５つのフラット担体ストリップが実験で使用された（４つのサンプルと１つの制御）。ストリップをきれいなチューブへ移動させた後、１．５ｍＬを付加する。ストリップは、溶液を試験する前に、４５分〜１時間水に浸された。キュベットでのサンプルと加工試薬との間の滞在時間は、決定的である。担体材料が滅菌中にＨ_２Ｏ_２をどれだけよく吸収するかにより、サンプル溶液の希釈係数は、吸光度の１単位未満のターゲットを得るために、増やしたり、減らしたりしなければならない。これは、材料に存在するＨ_２Ｏ_２の量を判定する際に最大限の正確度を保証する。

ＰＥＲＯＸＯＱＵＡＮＴ定量的過酸化物アッセイキット法によって得られたデータは、表４に表される。これらのデータは、担体の疎水性に基づいて２つのカテゴリに分類される。親水性材料は、１３〜２７３マイクログラム（μｇ）のＨ_２Ｏ_２保持を表したが、疎水性担体は、０．０３〜１６．０９μｇのＨ_２Ｏ_２を保持した。残留過酸化水素の量は、逆に、接触角測定によって評価される担体疎水性に相関する。

（実施例４）
過酸化水素回復試験
本実施例は、芽胞成長で異なる親水性及び疎水性担体によって保持される残留過酸化水素の効果を比較する。３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）から入手可能な３Ｍ ＡＴＴＥＳＴ １２９２生物学的インジケータは、芽胞ストリップが１４個の異なる処理をされた（配合された）多孔質芽胞担体材料と交換されるように変性された（表１）。変性された３Ｍ ＡＴＴＥＳＴ １２９２生物学的インジケータは、存在する芽胞個体群を殺菌するために蒸気滅菌された。蒸気滅菌されたＢＩは、その後、ＳＴＥＲＲＡＤ １００Ｓ過酸化水素／プラズマ滅菌サイクルの後方及び底面のシェルフで曝露された。過酸化水素／プラズマ滅菌後直ぐに、およそ１×１０^２、１×１０^３、又は１×１０^５のゲオバチルスステロサーモフィラス芽胞を含有する芽胞懸濁液が、それぞれのＢＩの担体材料上にピペットで掛けられた。担体材料毎に３つのＢＩがそれぞれの芽胞懸濁液を用いて試験された。それに続いて、増殖培地のアンプルは、それぞれのＢＩで粉砕され、すべてのＢＩは、６０℃（＋／−２℃）でインキュベートされた。２４時間のインキュベート後、それぞれのＢＩは、増殖の表示（つまり、培地中のｐＨインジケータを紫から黄色にするｐＨ変更）について観察された。

ＢＩ性能の残留過酸化水素の効果は、表５に示される。結果は、それぞれの濃度について試験された３つのＢＩのうちの正のＢＩ増殖の数として表現される。データは、２つの群に分類され得る。第１の群は、すべて親水性である担体材料を含有し、この担体材料群は、コーティングされないＢＩがＨ_２Ｏ_２に曝露された後、増殖を示さない（ＣＲＡＮＥＧＬＡＳ、ＳＸ−３１４、ＨＥＦ１４０−１１４、及びＰａｐｅｒ−５９１）。観察された増殖阻害は、残留過酸化水素の存在ゆえである可能性がある。第２の担体材料群は、疎水性材料を含んだ。これらの材料は、過酸化水素への曝露後、芽胞増殖を阻害しなかった（ＣＥＲＥＸ ＰＢＮ、ＴＯ５０５、ＳＯＦＴＥＸ、４０ＡＡ０、ＳＢ３３９６０１８、ＵＨＦ−５０、ＳＲＦ２７３２Ａ−１、ＵＮＩＬＡＹＥＲ、ＵＮＩＰＲＯ １２５）。データは、Ｈ_２Ｏ_２保持と担体材料の親水性との間には関係があることを示唆する。表５に表される疎水性、残留過酸化水素、及びＢＩ性能データは、広くは、疎水性材料が芽胞担体に使用された場合、芽胞増殖の阻害がなかったことを示す。

（実施例５）
生物学的インジケータ性能試験−増殖読出（２４時間）
本実施例は、異なる親水性及び疎水性担体の性能を比較する。透過率７２％を得るために、ゲオバチルスステロサーモフィラス芽胞懸濁液（３×１０^６芽胞／ｍＬ）が希釈された。コーティングプロセスを改良するために、３６０マイクロリットル（μＬ）の３０倍に希釈された芽胞懸濁液が、三次元多孔質担体の約１．６ｃｍ^３をコーティングするために使用された。配合された３Ｄ多孔質担体材料内に分布するコーティングされた芽胞を含有するスリーブは、５８℃で１６時間（一晩中）インキュベートされた。以上にリストされた芽胞コーティングされた多孔質担体が、紙芽胞ストリップの代わりに使用されたことを除き、３Ｍ ＡＴＴＥＳＴ １２９２生物学的インジケータ（３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ ｏｆ Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮから入手可能）のコンポーネンツを使用することによって組立てられた。１２９２培地アンプルのような他のコンポーネンツ及び穿孔のキャップが、また、使用された。

すべての生物学的インジケータ（ＢＩ）は、１００ＧＭＰ ＳＴＥＲＲＡＤ容器（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＣＡ）を使用して試験された。ＢＩ（生物学的インジケータ）サンプルは、１００ＧＭＰ ＳＴＥＲＲＡＤ容器の後方及び底面のシェルフで試験された。これらのＢＩは、１０秒〜８分（半分のサイクル）、過酸化水素蒸気に曝露された。５９％のＨ_２Ｏ_２の１．８ｍＬの容積が、試験されたそれぞれのサイクルのために隔膜を介してＳＴＥＲＲＡＤ容器チャンバ内に入射された。実施例４に記載されるように、生物学的インジケータアンプルは、活性化され（粉砕され）、ＢＩは、その後、インキュベートされて、２４時間の増殖読出しについて観察された。

ＳＴＥＲＲＡＤ容器で異なった回数曝露されたＨ_２Ｏ_２ ＢＩから得られるデータは、表６に表される。結果は、それぞれのサイクルについて試験された５つのＢＩのうちの正のＢＩ増殖の数として表現される。親水性担体材料上でコーティングされる芽胞は、変化する過酸化水素曝露に矛盾する応答を表示した。親水性材料（ＣＲＡＮＥＧＬＡＳ、ＳＸ−３１４及びＨＥＦ１４０−１１４）は、１つ以上の型のサイクル又は異常な傾向（分留サイクル前に殺菌する）（Ｐａｐｅｒ−５９１）を含む。

（実施例６）
増殖読出の信頼性
ＢＩ増殖読出信頼性からのデータは、表７に表される。この試験は、日々の読出信頼性を調査するために実行された。これらのデータは、担体材料の疎水性に関係なく、１日目〜７日目までの信頼性のある増殖応答を示す。

（実施例７）
相関蛍光／増殖
８時間蛍光と２４時間増殖読出との間の相関は、表８に表される。これらの結果は、１０個のうちの８個の疎水性多孔質担体材料が、蛍光と増殖との間の１００％の相関を表示したことを示す。対照的に、多孔質親水性型の材料の中では、４個のうちの２個の担体のみが１００％相関した。

（実施例８）
残留過酸化水素芽胞回復法の改善
サンプルのそれぞれの型のコーティングされていない（芽胞なし）三次元多孔質担体の約１．６ｃｍ^３が、ＢＩ構成で組立てられた。コーティングされていないＢＩは、すべて、１００ＧＭＰ ＳＴＥＲＲＡＤ容器を使用して、８分間、過酸化水素蒸気に曝露された。過酸化水素蒸気への曝露後、ＢＩは分解され、担体材料は、その後、ＢＩ毎に１０^２、１０^３、及び１０^５の芽胞を得るために、異なる希釈係数を使用してコーティングされた。芽胞回復能力を試験するために、１グラム毎リットル（ｇ／Ｌ）のチオ硫酸ナトリウム（Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_３）５０μＬがそれぞれのＢＩに付加された。ＢＩは組立てられ、砕かれて、８時間蛍光及び２４時間増殖読出のためインキュベートされた。

この実験は、「中和剤」（チオ硫酸ナトリウム）を使用する残留過酸化水素の改善を示した。１グラム／Ｌのチオ硫酸ナトリウム５０μＬの付加後、すべての担体材料からのすべてのＢＩは、疎水性に関係なく、正の増殖である。表９の結果は、それぞれの濃度について試験された３つのＢＩのうちの正のＢＩ増殖の数として表現される。結果は、特定された条件で使用されたチオ硫酸ナトリウムが良好な芽胞回復剤であることを示す。これらの結果は、親水性担体材料が過酸化水素滅菌のために設計されたＢＩ内で使用される場合、チオ硫酸ナトリウムのような回復剤が残留過酸化水素を取り除くために使用されるべきことを示唆した。疎水性担体は、残留Ｈ_２Ｏ_２を除去、又はその量を著しく低減することを促進する。

（実施例９）
担体材料の空間的形状及びＢＩ性能への効果
過酸化水素保持及びＢＩ性能への担体の疎水性効果をより良く理解するために、湿潤剤（ＳＩＬＷＥＴ ７７；Ｕｎｉｏｎ Ｃａｒｂｉｄｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｄａｎｂｕｒｙ，ＣＴ））が、表面特性を変更するように使用された。２個の疎水性材料（Ｔ０５０５及びＵＮＩＰＲＯ １２５）が選択され、親水性にされた。Ｔ０５０５及びＵＮＩＰＲＯ １２５担体の両方が２Ｄ（二次元又はシート形状）及び３Ｄ（三次元多孔質形状）で試験された。ＢＩが組立てられ、３つの異なる曝露時間で試験された（表１０）。曝露時間が増大する場合に減少する芽胞抵抗が、３Ｄ多孔質形状の両方の疎水性担体が湿潤剤によって処置されない場合のみに、観察される。これは、疎水性及び担体構成がＢＩ性能において役割を果たすことを示す。

（実施例１０）
担体材料の空間的形状及び残留過酸化水素の効果
表１１は、親水性担体が２Ｄ又は３Ｄ形状で、及び中和剤のチオ硫酸ナトリウム有り又は無しで使用される場合のＢＩ性能データを表す。データは、中和剤がＢＩに付加されると、より多くの正の増殖が検出されることを示す。

（実施例１１）
蒸気滅菌の適用
芽胞クロップ濃度は、６７％の透過率を得るように調整された。１０％のソルビトールがコーティング溶液に付加された。芽胞は、表１２に示される、選択された多孔質材料上にコーティングされ、インキュベートされた。その後、生物学的インジケータは、これらの芽胞コーティングされた多孔質材料を使用して、上の芽胞コーティングプロセス及び生物学的インジケータの組立セクションに記載されるように組立てられた。各サンプルについて、サイクル毎に４個のＢＩが、１２１℃重力で７、１１、及び１５分間、蒸気に曝露された。ＢＩは、蒸気ＢＩＥＲ容器（Ｊｏｓｌｙｎ Ｍｏｄｅｌ Ｎｏ．ＳＢ−００１ ｓｔｅｒｉｌｉｚｅｒ，Ｊｏｓｌｙｎ Ｓｔｅｒｉｌｉｚｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｆａｒｍｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ））内で試験された。ＢＩは、活性化され（砕かれ）、３時間蛍光読出及び２４時間増殖読出のためにインキュベートされた。

ＢＩは、３Ｍ Ｃｏ．から入手可能な２９０ ＡｕｔｏＲｅａｄｅｒを使用して、商業上入手可能な１２９２蒸気急速読出生物学的インジケータのような条件で試験された。表１２は、ＨＥＦ１４０−１１４、Ｔ０５０５、及びＵｎｉｌａｙｅｒが使用される場合に曝露時間が増大するときの減少する芽胞抵抗を示し、本発明が滅菌剤としての蒸気と一緒に使用され得ることを実証する。

（実施例１２）
エチレンオキシド滅菌への適用
芽胞クロップ濃度は、１５％の透過率を得るように調整された。７％のソルビトールがコーティング溶液に付加された。芽胞は、上の芽胞コーティングセクションに記載されるようにコーティングされ、インキュベートされて、組立てられた。それぞれのサンプルについて、サイクル毎に４個のＢＩが、Ｏｘｙｆｕｍｅサイクルを使用して、１７、２４、及び３０分間、エチレンオキシドガスに曝露された。ＢＩは、エチレンオキシドＢＩＥＲ容器（Ｊｏｓｌｙｎ Ｍｏｄｅｌ Ｎｏ．ＥＢ−００１ ｓｔｅｒｉｌｉｚｅｒ，Ｊｏｓｌｙｎ Ｓｔｅｒｉｌｉｚｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｆａｒｍｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ））内で試験された。ＢＩは、砕かれて、４時間蛍光及び２４時間増殖読出のためにインキュベートされた。

ＢＩは、商業上入手可能な１２９４エチレンオキシド急速読生物学的インジケータのような同様の条件で試験された。表１３は、ＨＥＦ１４０−１１４、Ｔ０５０５、及びＵｎｉｌａｙｅｒが使用される場合に曝露時間が増大するときの減少する芽胞抵抗を示し、本発明が滅菌剤としてのＥＯと使用され得ることを実証する。

（実施例１３）
代替の生物学的インジケータのバイアル瓶形状
いくつかの生物学的滅菌インジケータ（ＢＩ）が、以上の詳述で提供された説明に従い、また図６〜７にしめされるように、小さい形状の生物学的インジケータのバイアル瓶で調整された。実施例１３で使用されるＢＩの詳細は、以下に提供される。

芽胞調整
ゲオバチルスステロサーモフィラス芽胞は、上記の同じやり方で生成され、調整された。

芽胞担体材料
ＵＮＩＬＡＹＥＲポリプロピレン不織布材料は、上記のように「３Ｄ」芽胞担体材料を得るように加工された（実験室の配合機で配合された）。この芽胞担体材料の約１．６ｃｍ^３は、生物学的インジケータのバイアル瓶ハウジング２０２の下部２１４の第２のチャンバ２１１を満たすために使用された。

芽胞コーティングプロセス
ゲオバチルスステロサーモフィラス芽胞懸濁液の異なる百分率の透過率（８％、２０％及び４５％Ｔ）を得るために、芽胞懸濁液の原液の希釈がなされた。コーティングプロセスを改善するために、１０倍に希釈された芽胞懸濁液１２０マイクロリットル（μＬ）が三次元のＵＮＩＬＡＹＥＲポリプロピレン不織布多孔質芽胞担体の約１．６ｃｍ^３に適用された。芽胞コーティングされた芽胞担体材料を含有するスリーブは、５８℃で１６時間（一晩中）インキュベートされた。

小さい容積形状の生物学的インジケータ組立て
小さい容積形状の生物学的インジケータ（図６〜７）は、まず芽胞コーティングされた担体材料を挿入し、その後、インサート（ブレーカ）、増殖培地のアンプル、及びキャップを挿入することによって組立てられた。アンプル培地は、現在入手可能な３Ｍ ＡＴＴＥＳＴ １２９２生物学的インジケータの増殖培地を使用して、配合された。

過酸化水素のＳＴＥＲＲＡＤ容器ＢＩ曝露
多孔質担体材料のすべての小さい容積形状の生物学的インジケータ（図６〜７）は、ＳＴＥＲＲＡＤ ＮＸ容器（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ））を使用して、試験された。小さい容積形状の生物学的インジケータ（図６〜７）のサンプルは、過酸化水素チャンバ写像で実行された以前の実験に基づいて、ＳＴＥＲＲＡＤ ＮＸ容器の中間及び底面のシェルフで、試験された。２０個のＢＩが２分〜７分（半分のサイクル）、過酸化水素蒸気へ曝露された。５９％のＨ_２Ｏ_２、１．８ｍＬが、試験されたそれぞれのサイクルについて、隔膜を介して容器チャンバの中に入射された。生物学的インジケータアンプルは、砕かれ、ＢＩは、その後、８時間蛍光及び２４時間増殖読出のためにインキュベートされた。

小さい形状のＢＩバイアル瓶での結果
小さい容積形状の生物学的インジケータ（図６〜７）内蔵型の多孔質ポリプロピレン芽胞担体にコーティングされた異なる芽胞個体群が試験された。表１４、１５及び１６は、８％、２０％及び４５％の透過率での小さい容積形状のＢＩ性能を表す。表は、それぞれのサイクル毎に試験された４個のＢＩのうちの正のＢＩ蛍光又は増殖の数を提示する。ＢＩは、３０秒〜７分で変化する過酸化水素への曝露（半分のサイクル）の異なったサイクルで試験された。これらのデータは、３つの型のサイクル（残存、分留及び殺菌サイクル）を示す。

４５％の透過率でコーティングされたＢＩは、３０秒での残存、１〜２分での分留、及び５９％の過酸化水素への７分の曝露での殺菌を示す。

２０％の透過率でコーティングされたＢＩは、２〜３分間の分留及び５９％の過酸化水素への４分間の曝露後の滅菌を示す。

８％の透過率でコーティングされたＢＩは、２分での残存、３分での分留、及び５９％の過酸化水素への４分間の曝露後の殺菌を示す。

光の増殖への相関＆増殖読出信頼性（ＲＯＲ）
８時間蛍光と７日間増殖読出との間には、全体として良好な相関があった。加えて、１日目での正のＢＩ増殖の数は、それぞれの芽胞個体群について、２日目、３日目、４日目及び７日目の正の増殖の数と良好な相関を示した。これは良好な増殖の「読出信頼性」（ＲＯＲ）を示した。

蛍光を正に変化させる時間
蛍光を正に変化させる時間に関するデータは、４５％Ｔ、２０％Ｔ、及び８％Ｔの芽胞個体群について、それぞれ、表１７、１８及び１９に要約される。蛍光を正に変化させる時間は、３０分〜４時間で変動する。

本明細書中に引用される特許、特許文献、及び刊行物の完全な開示内容を、あたかもそれぞれが個々に援用されたのと同様にしてそれらの全容を援用するものである。本開示の範囲及び趣旨を逸脱することなく本開示に対する様々な改変及び変更が可能であることは当業者には明らかであろう。本開示は本明細書に記載される説明的実施形態及び実施例によって不要に限定されるものではない点、更にこうした実施例及び実施形態はあくまで一例として示されるものであって本開示の範囲は以下の特許請求の範囲によってのみ限定されるものである点は理解されるはずである。

Claims (20)

1. 滅菌手順の有効性を試験するための滅菌インジケータであって、
   前記滅菌手順中に滅菌剤が中に入ることを可能にする少なくとも１つの開口部を有する容器と、
   前記容器内に収容され、前記容器の容積の少なくとも５％を占める多孔質担体と、
   前記多孔質担体内に分布する生物学的材料であって、前記生物学的材料が有効な滅菌手順の結果として不活性化され、無効な滅菌手順の結果として検出可能な表示を提供する、滅菌手順の有効性を監視するために通常使用される少なくとも１つの試験微生物の残存と相関する、生物学的材料と、
   滅菌手順の失敗の検出可能な表示を形成するための手段と、を含む、滅菌インジケータ。
2. 前記生物学的材料が活性酵素の源を含み、前記活性酵素が滅菌手順の有効性を監視するために通常使用される少なくとも１つの試験微生物の残存に相関する酵素活性を有し、前記活性酵素の前記源が前記試験微生物に致死性である滅菌手順によって不活性化され、前記活性酵素の前記源が前記試験微生物に亜致死性である滅菌手順によって不活性化されず、前記検出可能な表示を形成する前記手段が酵素変性された生成物を形成するための手段を含む、請求項１に記載の滅菌インジケータ。
3. 前記容器が外側容器を画定し、前記検出可能な表示を形成するための前記手段が前記外側容器内に易破壊性の内側容器を備え、前記内側容器が、
   前記滅菌手順で使用される前記滅菌剤に不浸透性であり、
   酵素基質を含み、
   前記酵素基質が前記活性酵素と反応することを可能にするように破壊されて、滅菌手順の失敗の検出可能な表示を提供する酵素変性された生成物を形成することができるように適合される、請求項２に記載の滅菌手順の有効性を試験するための滅菌インジケータ。
4. 前記多孔質担体が前記容器の容積の５０％以下を占める、請求項１〜３のいずれか一項に記載の滅菌インジケータ。
5. 前記多孔質担体が５％を超えるソリディティを有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の滅菌インジケータ。
6. 前記多孔質担体が、１０マイクロメートルを超える有効繊維直径を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の滅菌インジケータ。
7. 前記多孔質担体が疎水性材料を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の滅菌インジケータ。
8. 前記多孔質担体が親水性材料を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の滅菌インジケータ。
9. 前記生物学的材料が微生物を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の滅菌インジケータ。
10. 前記生物学的材料が単離された酵素を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の滅菌インジケータ。
11. 残留酸化滅菌剤を中和するために有効な量で前記インジケータ内に配置される中和剤を更に含み、前記中和剤が酵素でなく、金属触媒でない、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の滅菌インジケータ。
12. 前記中和剤が滅菌中に前記滅菌剤から隔離される、請求項１１に記載の滅菌インジケータ。
13. 滅菌手順の有効性を試験するための方法であって、
    請求項１〜１２のいずれか一項に記載の滅菌インジケータを準備することと、
    生物学的材料を含む前記滅菌インジケータを滅菌手順に供することと、
    滅菌に続いて、検出可能な表示が存在するか、不在かを判定するための展開手順に前記滅菌インジケータを供することと、
    前記検出可能な表示の前記存在を前記滅菌手順の失敗と、及び前記検出可能な表示の前記不在を前記滅菌手順の成功と、相関させることと、を含む、方法。
14. 前記滅菌インジケータを前記展開手順に供することが、前記生物学的材料とｐＨインジケータを含む増殖培地とを含む混合物を形成することと、芽胞増殖を刺激する条件下で前記混合物をインキュベートすることと、を含み、前記検出可能な表示が検出可能なｐＨシグナルを含む、請求項１３に記載の方法。
15. 前記生物学的材料が活性酵素の源を含み、
    前記活性酵素が、滅菌手順の有効性を監視するために通常使用される少なくとも１つの試験微生物の残存と相関する酵素活性を有し、
    前記活性酵素の前記源が、前記試験微生物に致死性の滅菌手順によって不活性化され、
    前記活性酵素の前記源が、前記試験微生物に亜致死性の滅菌手順によって不活性化されず、
    前記検出可能な表示を形成する前記手段が、滅菌手順の失敗の際に、前記活性酵素と反応して、検出可能なシグナルを有する酵素変性された生成物を形成する酵素基質を含み、
    前記滅菌インジケータを前記展開手順に供することが、前記酵素と前記基質とを合わせて酵素変性された生成物を形成することを含み、
    前記検出可能な表示が前記酵素変性された生成物を含む、請求項１３に記載の方法。
16. 前記滅菌インジケータが二重急速読出インジケータであり、活性酵素の前記源が、酵素活性試験のための活性酵素の前記源及び前記芽胞成長試験のための前記試験微生物の両方として機能する微生物の芽胞を含む、請求項１４に記載の方法。
17. 前記滅菌剤が酸化滅菌剤である、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記滅菌手順が過酸化水素蒸気を使用する、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
19. 滅菌手順の有効性を試験するための滅菌インジケータを作製する方法であって、
    前記滅菌手順中に滅菌剤が中に入ることを可能にする少なくとも１つの開口部を有する前記容器を準備することと、
    多孔質担体を準備することと、
    前記容器の容積の少なくとも５％を占めるために十分な量で前記容器の中へ前記多孔質担体を配置することと、
    前記多孔質担体内の生物学的材料であって、前記生物学的材料が有効な滅菌手順の結果として不活性化され、無効な滅菌手順の結果として検出可能な表示を提供する、滅菌手順の有効性を監視するために一般に使用される少なくとも１つの試験微生物の残存に相関する前記生物学的材料を前記多孔質担体内に分布するように配置することと、
    前記容器の中で滅菌手順の失敗の検出可能な表示を形成するための１つ以上のコンポーネンツを必要に応じて配置することと、
    滅菌インジケータを形成する構成で前記容器、多孔質担体、生物学的材料、及び選択的コンポーネンツを組み立てることと、を含む、方法。
20. 多孔質担体を準備することが、シート形状で不織布材料を準備することと、三次元構造体を形成するように前記シートを配合することと、を含む、請求項１９に記載の方法。

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