JP2014238338A - Protein measuring method in biological material using mass spectrometer - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、生体試料中に含まれる蛋白質を測定する方法に関する。 The present invention relates to a method for measuring a protein contained in a biological sample.
バソプレシン（ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ；ＶＰ）は、ヒトを含む多くの動物で見られる、９個のアミノ酸から構成されるペプチドホルモンである。ＶＰは、１番目と６番目のシステインがジスルフィド結合した環状構造をとる。ヒトをはじめとした大部分の哺乳類では８番目のアミノ酸がアルギニンであるため、ＶＰは、アルギニンバソプレシン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ；ＡＶＰ）とも称される。 Vasopressin (VP) is a peptide hormone composed of nine amino acids found in many animals including humans. VP has a cyclic structure in which the first and sixth cysteines are disulfide bonded. In most mammals, including humans, VP is also referred to as arginine vasopressin (AVP) because the 8th amino acid is arginine.
ＡＶＰの主な機能としては、腎尿細管における水の再吸収を促進し、尿量を調節する抗利尿作用や、血管を収縮させて血圧を上げる血圧上昇作用が知られており、その作用から、ＡＶＰは、抗利尿ホルモン（Ａｎｔｉｄｉｕｒｅｔｉｃ ｈｏｒｍｏｎｅ；ＡＤＨ）や血圧上昇ホルモン（ｖａｓｏｐｒｅｓｓｏｒ ｈｏｒｍｏｎｅ）などとも称される。 The main functions of AVP are known to have an antidiuretic effect that promotes reabsorption of water in renal tubules and regulates urine volume, and a blood pressure raising effect that increases blood pressure by constricting blood vessels. AVP is also referred to as antidiuretic hormone (ADH), vasopressor hormone, and the like.
ＡＶＰが過剰に分泌されその抗利尿作用により体内水分量が増加すると、血清ナトリウム濃度が低下し、抗利尿ホルモン不適合分泌症候群（ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｏｆ ｉｎａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｄｉｕｒｅｔｉｃ ｈｏｒｍｏｎｅ；ＳＩＡＤＨ）と呼ばれる低ナトリウム血症を引き起こす。一方、ＡＶＰが欠乏すると、多渇症や多尿をきたし、1日の尿量が３〜１５リットルにも達する中枢性尿崩症（
ｃｅｎｔｒａｌ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｉｎｓｉｐｉｄｕｓ；ＣＤＩ）が引き起こされ、高ナトリウム血症などの症状を呈する場合がある。
When AVP is secreted excessively and its body water content increases due to its antidiuretic effect, serum sodium concentration decreases, causing hyponatremia called antidiauretic hormone incompatible secretion syndrome (SIADH) . On the other hand, when AVP is deficient, central diabetes insipidus (which leads to polyhiria and polyuria, and the daily urine volume reaches 3 to 15 liters)
central diabets insipidus (CDI), which may cause symptoms such as hypernatremia.
デスモプレシン（１−デスアミノ−８−Ｄ−アルギニンバソプレシン、ｄＤＡＶＰ（登録商標））は、バソプレシンの類似体である。ｄＤＡＶＰは、ＡＶＰと比べて抗利尿活性が高く、かつ、血圧上昇活性が低い。すなわち、ｄＤＡＶＰは、ＡＶＰとは異なり、血圧調節に有害な効果を及ぼさない。この薬理学的特性から、ｄＤＡＶＰは、血圧の有意な上昇を起こさない抗利尿剤として臨床的に使用されており、数ある適応症の中でも、中枢性尿崩症を含む、排尿延期、失禁、一次性夜間遺尿症（Ｐｒｉｍａｒｙ ｎｏｃｔｕｒｎａｌ ｅｎｕｒｅｓｉｓ；ＰＮＥ）、及び夜間頻尿症に対して一般的に処方される。 Desmopressin (1-desamino-8-D-arginine vasopressin, dDAVP®) is an analog of vasopressin. dDAVP has higher antidiuretic activity and lower blood pressure raising activity than AVP. That is, dDAVP, unlike AVP, does not have a deleterious effect on blood pressure regulation. Because of this pharmacological property, dDAVP has been used clinically as an antidiuretic that does not cause a significant increase in blood pressure, and among other indications, including urinary withdrawal, incontinence, It is generally prescribed for primary nocturnal enuresis (PNE) and nocturia.
通常、脳視床下部の神経細胞で合成されたＡＶＰは、神経繊維を通じて脳下垂体後葉に貯蔵され、血圧または血液の浸透圧のわずかな変化や血液量の減少などの刺激に応じて、血液中への分泌が調節される。 Normally, AVP synthesized in neurons in the hypothalamus is stored in the posterior pituitary gland through nerve fibers, and in the blood in response to stimuli such as slight changes in blood pressure or blood osmotic pressure or decrease in blood volume. Secretion is regulated.
ＡＶＰの血液中への分泌量は非常に僅かであるため、高感度にＡＶＰ濃度を測定することが求められている。また、ＡＶＰの測定に当たっては、血漿浸透圧の上昇、水制限、立位等、変動要因が多様であることから、その正確な濃度測定が必要とされている。 Since the amount of AVP secreted into the blood is very small, it is required to measure the AVP concentration with high sensitivity. In addition, when measuring AVP, since there are various variable factors such as an increase in plasma osmotic pressure, water restriction, and standing, it is necessary to accurately measure the concentration.
これまでに知られているＡＶＰおよびｄＤＡＶＰの測定方法としては、ＡＶＰ特異的抗体を使用し、放射性物質で標識したＡＶＰを競合させてＥＬＩＳＡ等の免疫測定を実施するラジオイムノアッセイ法（非特許文献１）や、質量分析計を使用して測定する方法（非特許文献２）などが挙げられる。 As a known method for measuring AVP and dDAVP, a radioimmunoassay method using an AVP-specific antibody and competing with AVP labeled with a radioactive substance to perform immunoassay such as ELISA (Non-patent Document 1) ) And a method of measuring using a mass spectrometer (Non-Patent Document 2).
ｄＤＡＶＰの投与はＣＤＩ及びＰＮＥ等の治療に有効ではあるが、標準的なｄＤＡＶＰ投与量が、高発生率の低ナトリウム血症を含む望ましくない副作用を引き起こすことがわかっている。しかし、より低い投与量で同一の所望する効果を生じさせられることが好ましいにも関わらず、現在の治療方針では、治療目的に対してｄＤＡＶＰの投与量をより多くする趨勢である。 While administration of dDAVP is effective for treatments such as CDI and PNE, standard dDAVP doses have been found to cause undesirable side effects including high incidence of hyponatremia. However, despite the fact that it is preferable to produce the same desired effect at lower doses, current treatment strategies tend to increase the dose of dDAVP for therapeutic purposes.
ｄＤＡＶＰの適切な投与量を決定するためには、血中（例えば、血漿または血清中）におけるＡＶＰの濃度およびｄＤＡＶＰの濃度をそれぞれ正確に把握する事が重要である。 In order to determine an appropriate dose of dDAVP, it is important to accurately grasp the concentration of AVP and the concentration of dDAVP in blood (for example, plasma or serum).
ヒト血漿中のＡＶＰの現行測定技術としては、抗体を用いたラジオイムノアッセイ法が主流である。しかしながら、同方法は、ｄＤＡＶＰが血漿中に共存する場合には、その定量性に著しい影響を与える。また、同方法には、測定に適した抗血清を得ることが困難な場合があることや、得られた抗血清の特性によっては血漿中のＡＶＰをクロマトグラフィーなどで濃縮する工程が必要となる場合があることなど、煩雑さを伴うという問題もあった（非特許文献１）。 As the current measurement technique of AVP in human plasma, a radioimmunoassay method using an antibody is the mainstream. However, this method significantly affects the quantitativeness of dDAVP when it coexists in plasma. In addition, in this method, it may be difficult to obtain an antiserum suitable for measurement, and depending on the properties of the obtained antiserum, a step of concentrating AVP in plasma by chromatography or the like is required. There was also a problem that it was complicated, for example (Non-patent Document 1).
また、近年では、測定機器や技術の発達に伴い、質量分析計を使用したＡＶＰとｄＤＡＶＰの測定系などが報告されている。例えば、非特許文献２では、酢酸、トリフルオロ酢酸、及びアセトニトリルを組み合わせて分離溶液として使用した液体クロマトグラフィーにより血漿試料を分離し、次いで、質量分析計によるｄＤＡＶＰの検出を行っている。しかしながら、ＡＶＰやｄＤＡＶＰの臨床上の一般的な指標となる生体内の濃度は０．８−６．３ｐｇ／ｍＬとされているのに対し、同測定系による検出限界は５０ｐｇ／ｍＬである。よって、同測定系は、血中に微量しか含まれないＡＶＰ等の検出に臨床的に利用するには感度が不十分である。また、本発明者らによる試験の結果、上記分離溶液を使用した液体クロマトグラフィー及び質量分析による測定では、ＡＶＰとｄＤＡＶＰを分別して同時に測定することができなかった。以上の通り、同測定系は、ＡＶＰ及びｄＤＡＶＰの正確な血中濃度の把握という要求を満たすことができなかった。 In recent years, with the development of measuring instruments and technology, AVP and dDAVP measurement systems using a mass spectrometer have been reported. For example, in Non-Patent Document 2, a plasma sample is separated by liquid chromatography using a combination of acetic acid, trifluoroacetic acid, and acetonitrile as a separation solution, and then dDAVP is detected by a mass spectrometer. However, the concentration in vivo, which is a general clinical index of AVP and dDAVP, is 0.8-6.3 pg / mL, whereas the detection limit by the same measurement system is 50 pg / mL. Therefore, this measurement system is insufficient in sensitivity to be clinically used for detecting AVP or the like that is contained in blood in only a trace amount. In addition, as a result of tests by the present inventors, it was not possible to separate and measure AVP and dDAVP at the same time by liquid chromatography and mass spectrometry using the separation solution. As described above, the measurement system could not satisfy the requirement for accurate blood concentration of AVP and dDAVP.
本発明は、生体試料中の微量な蛋白質を測定する方法、特に、複数の蛋白質を分別して測定する方法、を提供することを課題とする。本発明は、具体的には、例えば、血中に存在するＡＶＰの量を測定するのに十分な感度を有し、かつ、ＡＶＰとｄＤＡＶＰを互いに区別して測定することを可能とする蛋白質の測定方法、を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a method for measuring a minute amount of protein in a biological sample, particularly a method for measuring a plurality of proteins by separating them. Specifically, the present invention specifically measures a protein that has sufficient sensitivity to measure the amount of AVP present in the blood and that can measure AVP and dDAVP separately from each other. It is an object to provide a method.
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、酢酸とメタノールを含有する移動相を用いた液体クロマトグラフィーによりサンプルを分離し、分離したサンプルを質量分析計で分析することにより、ＡＶＰとｄＤＡＶＰを互いに区別して高感度かつ正確に定量できることを見出し、本発明を完成させた。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors separated a sample by liquid chromatography using a mobile phase containing acetic acid and methanol, and analyzed the separated sample with a mass spectrometer. It was found that AVP and dDAVP can be distinguished from each other with high sensitivity and accuracy, and the present invention has been completed.
すなわち、本発明は以下の通り例示できる。
［１］
蛋白質を測定する方法であって、
（ｉ）酢酸およびメタノールを含有する移動相を用いた液体クロマトグラフィーにより生体試料に含まれる蛋白質を分離する工程、
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で分離された蛋白質を質量分析計で分析する工程、
を含む方法。
［２］
前記工程（ｉ）が、移動相中でのメタノールの濃度を増大させる工程を含む、前記方法。
［３］
前記工程（ｉ）が、移動相中でのメタノールの濃度を第１のメタノール濃度から第２のメタノール濃度まで増大させる工程を含み、
前記第１のメタノール濃度が０％〜１０％であり、
前記第２のメタノール濃度が４０〜６０％である、
前記方法。
［４］
前記工程（ｉ）が、移動相中での酢酸の濃度を減少させる工程を含む、前記方法。
［５］
前記工程（ｉ）が、移動相中での酢酸の濃度を第１の酢酸濃度から第２の酢酸濃度まで減少させる工程を含み、
前記第１の酢酸濃度が０．００４８％〜０．０４％であり、
前記第２の酢酸濃度が０．００２３％〜０．０２２％であり、
前記第２の酢酸濃度は前記第１の酢酸濃度より小さい、
前記方法。
［６］
前記生体試料が、前記工程（ｉ）の前に固相抽出により前処理される、前記方法。
［７］
前記質量分析計が、四重極型、四重極タンデム型、イオントラップ型、イオントラップ四重極ハイブリッド型、セクター型、飛行時間型、および四重極飛行時間ハイブリッド型からなる群より選択されるいずれかのタイプである、前記方法。
［８］
検出された蛋白質のピーク面積値を内部標準物質のピーク面積値で除したピーク面積比に基づいて、前記蛋白質を定量する、前記方法。
［９］
前記蛋白質の分子量が６０００以下である、前記方法。
［１０］
前記蛋白質が、バソプレシン、デスモプレシン、ＧＬＰ−１（１−３７）、ＧＬＰ−１（７−３７）、ＧＬＰ−１（７−３６）、ＧＬＰ−１（７−３６）Ａｍｉｄｅ、オクトレオチド、ゴセレリン、アンジオテンシンＩ、およびアンジオテンシンＩＩからなる群より選択される、前記方法。
［１１］
２種またはそれ以上の蛋白質が同時に測定される、前記方法。
That is, the present invention can be exemplified as follows.
[1]
A method for measuring protein, comprising:
(I) a step of separating a protein contained in a biological sample by liquid chromatography using a mobile phase containing acetic acid and methanol;
(Ii) a step of analyzing the protein separated in the step (i) with a mass spectrometer,
Including methods.
[2]
The method, wherein step (i) comprises increasing the concentration of methanol in the mobile phase.
[3]
Said step (i) comprises increasing the concentration of methanol in the mobile phase from a first methanol concentration to a second methanol concentration;
The first methanol concentration is 0% to 10%;
The second methanol concentration is 40-60%;
Said method.
[4]
The method, wherein step (i) comprises reducing the concentration of acetic acid in the mobile phase.
[5]
Said step (i) comprises reducing the concentration of acetic acid in the mobile phase from a first acetic acid concentration to a second acetic acid concentration;
The first acetic acid concentration is 0.0048% to 0.04%;
The second acetic acid concentration is 0.0023% to 0.022%;
The second acetic acid concentration is less than the first acetic acid concentration;
Said method.
[6]
The method, wherein the biological sample is pretreated by solid phase extraction prior to the step (i).
[7]
The mass spectrometer is selected from the group consisting of a quadrupole type, a quadrupole tandem type, an ion trap type, an ion trap quadrupole hybrid type, a sector type, a time of flight type, and a quadrupole time of flight hybrid type. The method of any of the above.
[8]
The said method quantifies the said protein based on the peak area ratio which remove | divided the peak area value of the detected protein by the peak area value of the internal standard substance.
[9]
The method, wherein the molecular weight of the protein is 6000 or less.
[10]
The protein is vasopressin, desmopressin, GLP-1 (1-37), GLP-1 (7-37), GLP-1 (7-36), GLP-1 (7-36) Amide, octreotide, goserelin, angiotensin I. and said method selected from the group consisting of angiotensin II.
[11]
Said method wherein two or more proteins are measured simultaneously.
本発明によれば、生体試料中の微量の蛋白質を測定できる。本発明によれば、特に、生体試料中の複数の蛋白質を分別して測定できる。例えば、本発明の一実施形態によれば、血中に微量しか含まれないＡＶＰを、ＡＶＰとｄＤＡＶＰとを互いに区別して高感度かつ正確に定量することができ、ＡＶＰ及びｄＤＡＶＰの正確な血中濃度を把握することができる。また、本発明によれば、生体試料の取得から蛋白質の測定までに要する日数が大幅に短縮され、よって、本発明は、検査センター等で大量の検体を分析するのに有効である。従って、本発明は、例えば、種々の疾患について、的確な治療方針の選択材料及び治療薬の効果判定材料を迅速に提供することができる。 According to the present invention, a trace amount of protein in a biological sample can be measured. According to the present invention, in particular, a plurality of proteins in a biological sample can be fractionated and measured. For example, according to an embodiment of the present invention, AVP containing only a trace amount in blood can be quantified with high sensitivity and accuracy by distinguishing AVP and dDAVP from each other. The concentration can be grasped. Further, according to the present invention, the number of days required from the acquisition of a biological sample to the measurement of a protein is greatly shortened. Therefore, the present invention is effective for analyzing a large amount of specimens at a test center or the like. Therefore, the present invention can quickly provide, for example, a material for selecting an appropriate treatment policy and a material for determining the effect of a therapeutic agent for various diseases.
以下において、本発明の実施形態について適宜図面を参照しながら詳細に説明するが、本発明はこれらの実施形態に限定されるものではない。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the drawings as appropriate, but the present invention is not limited to these embodiments.
なお、本発明において、濃度を表す「％」は、特記しない限り、「％（ｖ／ｖ）」を意味する。 In the present invention, “%” representing the concentration means “% (v / v)” unless otherwise specified.
本発明の方法は、生体試料中に含まれる微量の蛋白質を測定する方法である。本発明の方法は、（ｉ）酢酸およびメタノールを含有する移動相を用いた液体クロマトグラフィーにより生体試料に含まれる蛋白質を分離する工程、および（ｉｉ）前記工程で分離された蛋白質を質量分析計で分析する工程、を含む。工程（ｉ）を、以下、「分離工程」ともいう。工程（ｉｉ）を、以下、「分析工程」ともいう。なお、本発明においては、「（蛋白質の）分析」、「（蛋白質の）測定」、および「（蛋白質の）定量」は、互いに同義であってよい。 The method of the present invention is a method for measuring a trace amount of protein contained in a biological sample. The method of the present invention comprises (i) a step of separating a protein contained in a biological sample by liquid chromatography using a mobile phase containing acetic acid and methanol, and (ii) a mass spectrometer for separating the protein separated in the above step Analyzing. Hereinafter, the step (i) is also referred to as a “separation step”. Hereinafter, the step (ii) is also referred to as “analysis step”. In the present invention, “(protein) analysis”, “(protein) measurement”, and “(protein) determination” may be synonymous with each other.
本発明における「生体試料」とは、生体に由来する成分を含む試料をいう。生体試料としては、例えば、全血、血漿、血清、尿、便、唾液、喀痰、精液、涙、鼻汁；膣、鼻、直腸、咽頭、および尿道のスワブ、排出物、および分泌物；ならびにバイオプシー組織試料が挙げられる。 The “biological sample” in the present invention refers to a sample containing components derived from a living body. Biological samples include, for example, whole blood, plasma, serum, urine, feces, saliva, sputum, semen, tears, nasal discharge; vagina, nasal, rectal, pharyngeal, and urethral swabs, discharges, and secretions; and biopsy Examples include tissue samples.
本発明においては、上記のような生体試料中に含まれる蛋白質を測定する。測定される蛋白質は特に制限されない。なお、ここにいう「蛋白質」には、ペプチド、オリゴペプチド、あるいはポリペプチドと呼ばれる態様も包含される。蛋白質の分子量は、例えば、好ましくは１０，０００以下であってよく、より好ましくは６，０００以下であってよい。蛋白質は、生体由来の蛋白質であってもよく、生体外由来の蛋白質であってもよい。生体外由来の蛋白質としては、例えば、生体に投与された医薬品に含有される蛋白質成分やその代謝物が挙げられる。蛋白質はいずれの局在様式を示すものであってもよく、例えば、膜由来の蛋白質であってもよく、細胞質由来の蛋白質であってもよい。蛋白質として、具体的には、例えば、ＡＶＰ、ｄＤＡＶＰ、インクレチン関連ペプチド、オクトレオチド（Ｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ）、ゴセレリン（Ｇｏｓｅｒｅｌｉｎ）、アンジオテンシン（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ）Ｉ及びＩＩが挙げられる。インクレチン関連ペプチドとして、具体的には、例えば、ＧＬＰ−１（１−３７）、ＧＬＰ−１（７−３７）、ＧＬＰ−１（７−３６）、ＧＬＰ−１（７−３６）Ａｍｉｄｅが挙げられる。蛋白質は、単独で測定されてもよく、２種またはそれ以上が同時に測定されてもよい。 In the present invention, the protein contained in the biological sample as described above is measured. The protein to be measured is not particularly limited. The term “protein” as used herein includes embodiments called peptides, oligopeptides or polypeptides. The molecular weight of the protein may be, for example, preferably 10,000 or less, and more preferably 6,000 or less. The protein may be a protein derived from a living body or a protein derived from an in vitro body. Examples of proteins derived from in vitro include protein components and metabolites contained in pharmaceuticals administered to living bodies. The protein may be any type of localization, for example, it may be a membrane-derived protein or a cytoplasm-derived protein. Specific examples of the protein include AVP, dDAVP, incretin-related peptide, octreotide, Goserelin, and angiotensin I and II. Specific examples of the incretin-related peptide include GLP-1 (1-37), GLP-1 (7-37), GLP-1 (7-36), and GLP-1 (7-36) Amide. Can be mentioned. Proteins may be measured alone or two or more may be measured simultaneously.
生体試料は、本発明の方法による測定前に、適宜前処理に供されてもよい。前処理としては、例えば、希釈、濃縮、凍結、融解、加熱、乾燥、破砕、懸濁、滅菌、固形分の除去、固相抽出が挙げられる。前処理は、測定対象の蛋白質の種類や夾雑物の種類等の諸条件に応じて適宜選択できる。これらの前処理は、単独で行ってもよく、適宜組み合わせて行ってもよい。 The biological sample may be appropriately subjected to pretreatment before measurement by the method of the present invention. Examples of the pretreatment include dilution, concentration, freezing, thawing, heating, drying, crushing, suspension, sterilization, solid content removal, and solid phase extraction. The pretreatment can be appropriately selected according to various conditions such as the type of protein to be measured and the type of impurities. These pretreatments may be performed alone or in appropriate combination.
これらの中では、固相抽出を行うのが好ましい。固相抽出に用いられる、樹脂（固相）の種類や洗浄用および溶出用溶媒の組成は、測定対象の蛋白質の種類や夾雑物の種類等の諸条件に応じて適宜選択できる。固相としては、例えば、Ｏａｓｉｓ（登録商標） ＷＣＸ μＥｌｕｔｉｏｎ ｐｌａｔｅ（Ｗａｔｅｒｓ社製）などの市販されている固相抽出キットが挙げられる。固相への吸着後、例えば、１％酢酸を含む５％アセトニトリル溶液
、及び４％リン酸水溶液と５％アンモニア水溶液で順に洗浄し、次いで１％蟻酸を含む７５％アセトニトリルで溶出を行う。溶出された溶液を、そのまま、あるいは適宜濃縮等して、生体試料として分析に供することができる。
Among these, it is preferable to perform solid phase extraction. The type of resin (solid phase) used for solid phase extraction and the composition of the solvent for washing and elution can be appropriately selected according to various conditions such as the type of protein to be measured and the type of contaminants. Examples of the solid phase include commercially available solid phase extraction kits such as Oasis (registered trademark) WCX μElution plate (manufactured by Waters). After the adsorption to the solid phase, for example, it is sequentially washed with a 5% acetonitrile solution containing 1% acetic acid, a 4% phosphoric acid aqueous solution and a 5% ammonia aqueous solution, and then eluted with 75% acetonitrile containing 1% formic acid. The eluted solution can be subjected to analysis as a biological sample as it is or after being appropriately concentrated.
生体試料を溶媒に溶解させる場合、生体試料に含まれる測定対象の蛋白質がポリプロピレン等へ吸着するのを防止できる組成の溶媒を用いるのが好ましい。測定対象の蛋白質の標準物質を溶媒に溶解させる場合も同様である。そのような溶媒組成は、測定対象の蛋白質の種類等の諸条件に応じて適宜選択できる。溶媒としては、例えば、酸を含有するアセトニトリル水溶液が挙げられる。酸としては、酢酸やギ酸が挙げられる。溶媒中の酸の濃度は、例えば、０．１％〜５％であってよく、具体的には１％であってよい。溶媒中のアセトニトリル濃度は、例えば、１〜７５％、好ましくは５〜５０％であってよい。具体的には、例えば、測定対象の蛋白質がＡＶＰやｄＤＡＶＰである場合は、溶媒として、１％酢酸含有５％アセトニトリル水溶液等を使用することができる。また、例えば、測定対象の蛋白質が糖尿病のマーカーであるインクレチン関連ペプチドである場合は、溶媒として、１％ギ酸含有５０％アセトニトリル水溶液等を使用することができる。 When the biological sample is dissolved in the solvent, it is preferable to use a solvent having a composition that can prevent the protein to be measured contained in the biological sample from adsorbing to polypropylene or the like. The same applies when the standard substance of the protein to be measured is dissolved in a solvent. Such a solvent composition can be appropriately selected according to various conditions such as the type of protein to be measured. Examples of the solvent include an acetonitrile aqueous solution containing an acid. Examples of the acid include acetic acid and formic acid. The concentration of the acid in the solvent may be, for example, 0.1% to 5%, specifically 1%. The acetonitrile concentration in the solvent may be, for example, 1 to 75%, preferably 5 to 50%. Specifically, for example, when the protein to be measured is AVP or dDAVP, a 1% acetic acid-containing 5% acetonitrile aqueous solution or the like can be used as a solvent. For example, when the protein to be measured is an incretin-related peptide that is a marker for diabetes, a 1% formic acid-containing 50% acetonitrile aqueous solution or the like can be used as a solvent.
本発明の方法は、液体クロマトグラフ（ＬＣ）装置と質量分析計（ＭＳ）を利用して実施することができる。液体クロマトグラフ装置と質量分析計は、互いに直列に接続されていてもよいし、それぞれ独立した装置であってもよい。本発明の方法に用いられる装置を、「本発明の装置」ともいう。本発明の装置としては、例えば、液体クロマトグラフ装置と質量分析計を直列につないで構成された、ＬＣ−ＭＳシステムを用いることができる。ＬＣ−ＭＳシステムの一態様を図１に示す。ＬＣ−ＭＳシステムを用いることにより、液体クロマトグラフィーにより分離された成分を、続けて質量分析することができる。 The method of the present invention can be carried out using a liquid chromatograph (LC) apparatus and a mass spectrometer (MS). The liquid chromatograph device and the mass spectrometer may be connected in series with each other, or may be independent devices. The apparatus used in the method of the present invention is also referred to as “the apparatus of the present invention”. As the apparatus of the present invention, for example, an LC-MS system configured by connecting a liquid chromatograph apparatus and a mass spectrometer in series can be used. One embodiment of the LC-MS system is shown in FIG. By using the LC-MS system, components separated by liquid chromatography can be subsequently subjected to mass spectrometry.
液体クロマトグラフ装置は、生体試料に含まれる蛋白質を液体クロマトグラフィーにより分離できる装置であれば特に制限されないが、通常は、ＨＰＬＣ装置であるのが好ましい。ＨＰＬＣ装置は、分離カラム、および分離溶液を分離カラムに送り込むポンプを備える。ＨＰＬＣ装置は、それ以外の要素、例えば、オートサンプラー、ヒーター、分離された成分を検出する検出器等、を備えていてもよい。検出器としては、例えば、ＵＶ検出器や示差屈折率計が挙げられる。例えば、図１においては、検出器は、カラムとイオン源（イオン化部）の間に接続することができる。 The liquid chromatograph device is not particularly limited as long as it can separate proteins contained in a biological sample by liquid chromatography, but an HPLC device is usually preferable. The HPLC apparatus includes a separation column and a pump that feeds the separation solution to the separation column. The HPLC apparatus may include other elements such as an autosampler, a heater, and a detector that detects separated components. Examples of the detector include a UV detector and a differential refractometer. For example, in FIG. 1, the detector can be connected between a column and an ion source (ionization section).
液体クロマトグラフィーに用いられる分離溶液（移動相）は、酢酸およびメタノールを含有する溶液、例えば水溶液、である。酢酸を利用することにより、適度に、液体クロマトグラフィーによる蛋白質の分離を向上させつつ、質量分析の際の蛋白質のイオン化を促進できる。また、メタノールを利用することにより、液体クロマトグラフィーにおける蛋白質の溶出時間を調節でき、且つ、質量分析による蛋白質の検出感度を向上できる。分離溶液は、測定対象の蛋白質を測定できる限り、他の成分を含有していてもよい。 The separation solution (mobile phase) used for liquid chromatography is a solution containing acetic acid and methanol, for example, an aqueous solution. By using acetic acid, protein ionization during mass spectrometry can be promoted while appropriately improving the separation of proteins by liquid chromatography. Moreover, by using methanol, the elution time of the protein in liquid chromatography can be adjusted, and the protein detection sensitivity by mass spectrometry can be improved. The separation solution may contain other components as long as the protein to be measured can be measured.
分離工程においては、生体試料中に含有される測定対象の蛋白質が他の成分と分離され、且つ、測定対象の蛋白質がカラムから溶出されるように、分離溶液の組成を適宜変化させることができる。すなわち、分離工程においては、分離溶液中の酢酸および／またはメタノールの濃度を変化させることができる。酢酸およびメタノールは、分離工程の全期間において分離溶液に含有されていてもよく、そうでなくてもよい。変化は、連続的な変化（グラジエント）であってもよく、断続的な変化（ステップワイズ）であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。グラジエントやステップワイズの条件は、測定対象の蛋白質の種類や夾雑物の種類等の諸条件に応じて適宜設定できる。具体的なグラジエントの条件としては、例えば、後述する実施例３に記載の条件が挙げられる。同条件は、特に、ＡＶＰおよび／またはｄＤＡＶＰの測定に好適に用いることができる。なお、以下のグラジエントに関する説明は、ステップワイズにも準用できる。 In the separation step, the composition of the separation solution can be appropriately changed so that the protein to be measured contained in the biological sample is separated from other components and the protein to be measured is eluted from the column. . That is, in the separation step, the concentration of acetic acid and / or methanol in the separation solution can be changed. Acetic acid and methanol may or may not be contained in the separation solution during the entire separation step. The change may be a continuous change (gradient), an intermittent change (stepwise), or a combination thereof. Gradient and stepwise conditions can be appropriately set according to various conditions such as the type of protein to be measured and the type of contaminants. Specific gradient conditions include, for example, conditions described in Example 3 described later. The same conditions can be suitably used particularly for measurement of AVP and / or dDAVP. Note that the following description regarding the gradient can be applied to stepwise.
なお、分離工程における分離は、質量分析により測定対象の蛋白質が測定できる程度に行われればよい。すなわち、単一の蛋白質を測定する場合には、分離工程においては、続く質量分析により当該蛋白質が測定できる程度に、当該蛋白質と夾雑物間で分離が行われればよい。また、複数の蛋白質を分別測定する場合には、分離工程においては、続く質量分析により当該複数の蛋白質が測定できる程度に、当該複数の蛋白質と夾雑物間で、および、当該複数の蛋白質同士で、分離が行われればよい。すなわち、例えば、複数の蛋白質が共存していても質量分析により分別測定できるのであれば、分離工程において当該複数の蛋白質同士が分離されなくてもよい。 The separation in the separation step may be performed to such an extent that the protein to be measured can be measured by mass spectrometry. That is, when measuring a single protein, it is sufficient that separation is performed between the protein and contaminants to such an extent that the protein can be measured by subsequent mass spectrometry. In addition, when fractionally measuring a plurality of proteins, in the separation step, the plurality of proteins and contaminants and between the plurality of proteins to such an extent that the plurality of proteins can be measured by subsequent mass spectrometry. Separation may be performed. That is, for example, if a plurality of proteins can coexist and can be measured by mass spectrometry, the plurality of proteins do not have to be separated in the separation step.
具体的には、分離工程は、分離溶液中のメタノール濃度を増大させる工程を含んでいてよい。すなわち、例えば、分離溶液中のメタノール濃度（ｖ／ｖ）が第１の濃度（Ｍ１）から第２の濃度（Ｍ２）まで徐々に増大するよう、メタノール濃度にグラジエントをかけることができる。Ｍ１およびＭ２は、測定対象の蛋白質の種類や夾雑物の種類等の諸条件に応じて適宜設定できる。Ｍ１は、例えば、０％以上、１％以上、または３％以上であってよく、１０％以下または７％以下であってよい。Ｍ２は、例えば、４０％以上または４５％以上であってよく、６０％以下または５５％以下であってよい。具体的には、例えば、分離溶液中のメタノール濃度（ｖ／ｖ）が５％から５０％まで徐々に上昇するよう、メタノール濃度にグラジエントをかけてよい。メタノール濃度の変化速度は、一定であってもよく、そうでなくてもよい。メタノール濃度は、Ｍ１からＭ２に変化するまでに、増減を繰り返してもよい。メタノール濃度は、Ｍ２に到達した後、さらに変化してもよい。例えば、メタノール濃度は、Ｍ２に到達した後、さらに増大してもよく、減少してもよく、増減を繰り返してもよい。例えば、メタノール濃度は、Ｍ２に到達した後、１００％まで増大してもよい。 Specifically, the separation step may include a step of increasing the methanol concentration in the separation solution. That is, for example, the methanol concentration can be gradient so that the methanol concentration (v / v) in the separation solution gradually increases from the first concentration (M1) to the second concentration (M2). M1 and M2 can be appropriately set according to various conditions such as the type of protein to be measured and the type of impurities. M1 may be, for example, 0% or more, 1% or more, or 3% or more, and may be 10% or less or 7% or less. For example, M2 may be 40% or more or 45% or more, and may be 60% or less or 55% or less. Specifically, for example, the methanol concentration may be gradient so that the methanol concentration (v / v) in the separation solution gradually increases from 5% to 50%. The rate of change in methanol concentration may or may not be constant. The methanol concentration may be repeatedly increased and decreased until it changes from M1 to M2. The methanol concentration may further change after reaching M2. For example, the methanol concentration may further increase, decrease, or repeatedly increase and decrease after reaching M2. For example, the methanol concentration may increase to 100% after reaching M2.
また、具体的には、分離工程は、分離溶液中の酢酸濃度を減少させる工程を含んでいてよい。すなわち、例えば、分離溶液中の酢酸濃度（ｖ／ｖ）がＡ１からＡ２まで徐々に減少するよう、酢酸濃度にグラジエントをかけることができる。Ａ１およびＡ２は、測定対象の蛋白質の種類や夾雑物の種類等の諸条件に応じて適宜設定できる。Ａ１は、例えば、０．００４８％以上または０．００９５％以上であってよく、０．０４％以下、または０．０２％以下であってよい。Ａ２は、例えば、０．００２３％以上または０．００４５％以上であってよく、０．０２２％以下または０．０１１％以下であってよい（ただし、Ａ１＞Ａ２）。具体的には、例えば、分離溶液中の酢酸濃度（ｖ／ｖ）が０．０１１％から０．００４５％まで徐々に減少するよう、酢酸濃度にグラジエントをかけてよい。酢酸濃度の変化速度は、一定であってもよく、そうでなくてもよい。酢酸濃度は、Ａ１からＡ２に変化するまでに、増減を繰り返してもよい。酢酸濃度は、Ａ２に到達した後、さらに変化してもよい。例えば、酢酸濃度は、Ａ２に到達した後、さらに減少してもよく、増大してもよく、増減を繰り返してもよい。例えば、酢酸濃度は、Ｍ２に到達した後、０％まで減少してもよい。 Specifically, the separation step may include a step of reducing the acetic acid concentration in the separation solution. That is, for example, the acetic acid concentration can be gradient so that the acetic acid concentration (v / v) in the separation solution gradually decreases from A1 to A2. A1 and A2 can be appropriately set according to various conditions such as the type of protein to be measured and the type of impurities. A1 may be, for example, 0.0048% or more or 0.0095% or more, and 0.04% or less, or 0.02% or less. A2 may be, for example, 0.0023% or more or 0.0045% or more, and may be 0.022% or less or 0.011% or less (where A1> A2). Specifically, for example, a gradient may be applied to the acetic acid concentration so that the acetic acid concentration (v / v) in the separation solution gradually decreases from 0.011% to 0.0045%. The rate of change of the acetic acid concentration may or may not be constant. The acetic acid concentration may be repeatedly increased or decreased before it changes from A1 to A2. The acetic acid concentration may further change after reaching A2. For example, the acetic acid concentration may be further decreased, increased, or repeatedly increased and decreased after reaching A2. For example, the acetic acid concentration may decrease to 0% after reaching M2.
濃度のグラジエントは、組成の異なる２種またはそれ以上の溶液を、混合比率を変化させながら混合することで、形成することができる。溶液の組み合わせは、所望のグラジエントが形成されるよう、適宜選択することができる。 The concentration gradient can be formed by mixing two or more solutions having different compositions while changing the mixing ratio. The combination of the solutions can be appropriately selected so that a desired gradient is formed.
グラジエントは、酢酸およびメタノールの濃度にまとめてかけてよい。例えば、酢酸を含有しメタノールを含有しない第１の溶液と、メタノールを含有し酢酸を含有しない第２の溶液とを、混合比率を変化させながら混合することで、酢酸およびメタノールの両濃度にグラジエントをかけることができる。第１の溶液としては、例えば、酢酸そのものや酢酸含有水溶液が挙げられる。第２の溶液としては、メタノールそのものやメタノール含有水溶液が挙げられる。 The gradient may be summed to a concentration of acetic acid and methanol. For example, the first solution containing acetic acid and not containing methanol is mixed with the second solution containing methanol and not containing acetic acid while changing the mixing ratio, so that both the concentration of acetic acid and methanol are gradient. Can be applied. Examples of the first solution include acetic acid itself and an acetic acid-containing aqueous solution. Examples of the second solution include methanol itself and a methanol-containing aqueous solution.
酢酸含有水溶液とメタノールとを混合して分離溶液として用いる場合の、望ましい操作の一例を以下に示す。すなわち、例えば、酢酸含有水溶液を９５％〜１００％、メタノールを０％〜５％の比率で混合して、３分間、ＨＰＬＣの分離カラムに通液を行い、ＡＶＰやｄＤＡＶＰ等の測定対象の蛋白質を分離カラムに保持させることが望ましい。この時の酢酸濃度は、０．００９５％〜０．０２％であることが望ましい。３分間の保持後、メタノール濃度を、４５％〜５５％となるまで徐々に増加させ、測定対象の蛋白質を溶出させることが望ましい。この時の酢酸濃度は、０．００４５％〜０．０１１％であることが望ましい。測定対象の蛋白質が溶出した後、メタノール濃度を速やかに１００％とし酢酸濃度は０％とすることが望ましい。 An example of a desirable operation in the case where an acetic acid-containing aqueous solution and methanol are mixed and used as a separation solution is shown below. That is, for example, an acetic acid-containing aqueous solution is mixed at a ratio of 95% to 100% and methanol is mixed at a ratio of 0% to 5%, and the mixture is passed through an HPLC separation column for 3 minutes to measure a protein to be measured such as AVP or dDAVP. Is preferably retained in a separation column. The acetic acid concentration at this time is preferably 0.0095% to 0.02%. After holding for 3 minutes, it is desirable to gradually increase the methanol concentration until it reaches 45% to 55% to elute the protein to be measured. The acetic acid concentration at this time is preferably 0.0045% to 0.011%. After elution of the protein to be measured, it is desirable that the methanol concentration is quickly set to 100% and the acetic acid concentration is set to 0%.
２種またはそれ以上の溶液を混合して分離溶液を調製する場合、当該２種またはそれ以上の溶液中の酢酸およびメタノールの濃度は、混合後の分離溶液中の酢酸およびメタノールの濃度が上記例示した分離溶液中の酢酸およびメタノールの濃度となるよう、混合比率に応じて適宜設定することができる。例えば、酢酸含有水溶液とメタノールとを混合して分離溶液として用いる場合、酢酸含有水溶液中の酢酸濃度（ｖ／ｖ）は、０．００５％以上または０．０１％以上であってよく、０．０４％以下または０．０２％以下であってよい。同場合の酢酸含有水溶液中の酢酸濃度（ｖ／ｖ）は、具体的には、例えば、０．０１％〜０．０２％であってよい。 When preparing a separation solution by mixing two or more solutions, the concentration of acetic acid and methanol in the two or more solutions is exemplified by the concentration of acetic acid and methanol in the separation solution after mixing. The concentration can be appropriately set according to the mixing ratio so as to be the concentration of acetic acid and methanol in the separated solution. For example, when an acetic acid-containing aqueous solution and methanol are mixed and used as a separation solution, the acetic acid concentration (v / v) in the acetic acid-containing aqueous solution may be 0.005% or more or 0.01% or more. It may be 04% or less or 0.02% or less. Specifically, the acetic acid concentration (v / v) in the acetic acid-containing aqueous solution in this case may be, for example, 0.01% to 0.02%.
分離溶液のｐＨは、測定対象の蛋白質の種類や夾雑物の種類等の諸条件に応じて適宜設定できる。分離溶液のｐＨは、例えば、好ましくは４〜６．５、より好ましくは５〜６であってよい。 The pH of the separation solution can be appropriately set according to various conditions such as the type of protein to be measured and the type of impurities. The pH of the separation solution may be, for example, preferably 4 to 6.5, more preferably 5 to 6.
分離溶液の組成及びｐＨの好ましい範囲は、液体クロマトグラフィーに続いて実施される質量分析において測定対象の蛋白質のイオン化効率が高くなるように設定することができる。すなわち、具体的には、測定対象の蛋白質がカラムから溶出される時点の分離溶液の組成及びｐＨが、質量分析において測定対象の蛋白質のイオン化効率が高くなるように設定されるのが好ましい。イオン化効率は、例えば、イオン化された割合を示すイオンカウントを使用して評価することができる。具体的には、例えば、１００ｎｍｏｌ／Ｌの蛋白質をイオン化した場合にイオンカウントが２×１０6カウント／秒以上となるように、
分離溶液の組成及びｐＨを設定することができる。
The preferable range of the composition and pH of the separation solution can be set so that the ionization efficiency of the protein to be measured is increased in mass spectrometry performed following liquid chromatography. Specifically, the composition and pH of the separation solution at the time when the protein to be measured is eluted from the column are preferably set so that the ionization efficiency of the protein to be measured is high in mass spectrometry. The ionization efficiency can be evaluated, for example, using an ion count indicating the proportion of ionization. Specifically, for example, when 100 nmol / L of protein is ionized, the ion count is 2 × 10 6 counts / second or more.
The composition and pH of the separation solution can be set.
液体クロマトグラフィーにおける分離溶液の流速は、分離カラムの内径等の諸条件に応じて適宜選択できる。分離溶液の流速は、分離工程を通じて一定であってもよく、そうでなくてもよい。分離溶液の流速は、例えば、０．２〜０．６ｍＬ／ｍｉｎであってよい。また、液体クロマトグラフィーにおけるカラム温度は、測定対象の蛋白質の種類等の諸条件に応じて適宜選択できる。カラム温度は、例えば、４０〜７０℃であってよく、具体的には５５℃であってよい。 The flow rate of the separation solution in liquid chromatography can be appropriately selected according to various conditions such as the inner diameter of the separation column. The flow rate of the separation solution may or may not be constant throughout the separation process. The flow rate of the separation solution may be 0.2 to 0.6 mL / min, for example. The column temperature in liquid chromatography can be appropriately selected according to various conditions such as the type of protein to be measured. The column temperature may be, for example, 40 to 70 ° C., specifically 55 ° C.
液体クロマトグラフィーに用いられる分離カラムは、特に制限されず、測定対象の蛋白質の種類や夾雑物の種類等の諸条件に応じて適宜選択できる。分離カラムとしては、逆相カラムを用いることができる。逆相カラムとしては、例えば、オクタデシルシリル化シリカゲル充填剤を充填したカラム（ＯＤＳカラム）、Ｃ８カラム、Ｃ２カラム、これらにイオン交換樹脂を配合したカラムが挙げられる。これらの中では、ＯＤＳカラムが好ましい。 The separation column used for liquid chromatography is not particularly limited, and can be appropriately selected according to various conditions such as the type of protein to be measured and the type of impurities. As the separation column, a reverse phase column can be used. Examples of the reverse phase column include a column (ODS column) packed with an octadecyl silylated silica gel filler, a C8 column, a C2 column, and a column in which an ion exchange resin is blended. Of these, ODS columns are preferred.
質量分析計は、公知の質量分析計が使用できるが、特にＬＣ装置に直列に接続することが可能なものは簡便に使用できるので好ましい。用いられる質量分析計は、１つであってもよく、２つまたはそれ以上であってもよい。２つまたはそれ以上の質量分析計は、直列
に接続して用いることができる。すなわち、ＬＣ−ＭＳシステムは、例えば、直列に接続された２つまたはそれ以上の質量分析計を備える、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳやＬＣ−ＭＳ／ＭＳ／ＭＳであってよい。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳとして、具体的には、例えば、ＱＴＲＡＰ５５００（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社製）が挙げられる。
As the mass spectrometer, a known mass spectrometer can be used, but a mass spectrometer that can be connected in series to the LC apparatus is particularly preferable because it can be used easily. One mass spectrometer may be used, or two or more mass spectrometers may be used. Two or more mass spectrometers can be used connected in series. That is, the LC-MS system may be, for example, an LC-MS / MS or an LC-MS / MS / MS that includes two or more mass spectrometers connected in series. Specifically as LC-MS / MS, QTRAP5500 (made by AB Sciex) is mentioned, for example.
質量分析計における検出方式としては、例えば、イオントラップ型、四重極型、四重極タンデム型、イオントラップ四重極ハイブリッド型、セクター型、飛行時間型、および四重極飛行時間ハイブリッド型が挙げられる。質量分析計におけるイオン化法としては、エレクトロスプレー法（ＥＳＩ）、大気圧化学イオン化法（ＡＰＣＩ）、高速原子衝撃法（ＦＡＢ）、光イオン化法（ＡＰＰＩ）、および音速イオン化法（ＳＳＩ）が挙げられる。検出方式やイオン化法は、測定対象の蛋白質の種類等の諸条件に応じて適宜選択できる。 Examples of detection methods in the mass spectrometer include ion trap type, quadrupole type, quadrupole tandem type, ion trap quadrupole hybrid type, sector type, time of flight type, and quadrupole time of flight hybrid type. Can be mentioned. Examples of ionization methods in the mass spectrometer include electrospray method (ESI), atmospheric pressure chemical ionization method (APCI), fast atom bombardment method (FAB), photoionization method (APPI), and sonic ionization method (SSI). . The detection method and ionization method can be appropriately selected according to various conditions such as the type of protein to be measured.
タンデム四重極型質量分析計（ＭＳ／ＭＳ、ＭＳ／ＭＳ／ＭＳなど）は、マスフィルターとして機能する四重極（Ｑ１）、衝突（コリジョン）セルとして機能する四重極（Ｑ２）、およびマスフィルターとして機能する四重極（Ｑ３）を直列に配置した質量分析計である。タンデム四重極型質量分析計によれば、診断検査に必要な感度を得るため、イオン透過の最適化を行うこともできる。すなわち、Ｑ１およびＱ３は、高周波電圧と直流電圧をかけることでマスフィルター（質量分離器）として機能し、電圧および振動数を調節することで、特定の質量範囲にあるイオンだけを通過させることができる。 Tandem quadrupole mass spectrometers (MS / MS, MS / MS / MS, etc.) include a quadrupole (Q1) that functions as a mass filter, a quadrupole (Q2) that functions as a collision cell, and This is a mass spectrometer in which quadrupoles (Q3) functioning as mass filters are arranged in series. According to the tandem quadrupole mass spectrometer, ion permeation can be optimized in order to obtain the sensitivity necessary for the diagnostic examination. That is, Q1 and Q3 function as a mass filter (mass separator) by applying a high-frequency voltage and a DC voltage, and only ions in a specific mass range can pass through by adjusting the voltage and frequency. it can.
具体的には、例えば、四重極（Ｑ１）において、イオン化により生じた複数のイオンから、イオンの質量電荷比（ｍ／ｚ）に基づいて、必要とする感度に到達可能な特定の親イオン（プリカーサーイオン）を選択する。次いで、選択された親イオン（プリカーサーイオン）を、コリジョンセル（Ｑ２）内でアルゴン等の不活性ガスと衝突させることで、娘イオン（プロダクトイオン）を生成させる（衝突誘起解離：ＣＩＤ）。次いで、特定の質量電荷比（ｍ／ｚ）を有する娘イオン（プロダクトイオン）を、四重極（Ｑ３）で選択的に検出する。検出されたプロダクトイオンとプリカーサーイオンとの質量の差等から分析対象の構造情報を引き出すことができる。 Specifically, for example, in the quadrupole (Q1), a specific parent ion that can reach the required sensitivity from a plurality of ions generated by ionization based on the mass-to-charge ratio (m / z) of the ions. Select (Precursor ion). Next, daughter ions (product ions) are generated by colliding the selected parent ions (precursor ions) with an inert gas such as argon in the collision cell (Q2) (collision-induced dissociation: CID). Next, daughter ions (product ions) having a specific mass-to-charge ratio (m / z) are selectively detected by the quadrupole (Q3). The structural information of the analysis object can be extracted from the difference in mass between the detected product ion and the precursor ion.
従って、タンデム四重極型質量分析計を使用する場合、プリカーサーイオンならびにプロダクトイオンの選択を繰り返すことにより、生体試料中に含まれる夾雑物と測定対象の蛋白質を分離しつつ、測定対象の蛋白質を高感度に測定することができる。 Therefore, when using a tandem quadrupole mass spectrometer, by repeating the selection of precursor ions and product ions, the protein to be measured is separated while separating the impurities contained in the biological sample from the protein to be measured. It can be measured with high sensitivity.
また、ＭＳ／ＭＳ／ＭＳのようなタイプの質量分析計を使用する場合、選択したプロダクトイオンがさらに開裂して生成する二次開裂イオン（セカンドプロダクトイオン）を選択的に検出することにより、測定対象物質をさらに絞り込み、測定感度を向上させることもできる。 In addition, when a mass spectrometer such as MS / MS / MS is used, measurement is performed by selectively detecting secondary cleavage ions (second product ions) generated by further cleavage of the selected product ions. The target substance can be further narrowed down to improve the measurement sensitivity.
質量分析により得られるイオンの検出比率（イオン比）は物質固有の値であるため、標準品の分析により得られたイオン比と生体試料の分析により得られたイオン比を比較して、生体試料に含まれる蛋白質を同定することができる。 Since the detection ratio (ion ratio) of ions obtained by mass spectrometry is a substance-specific value, the ion ratio obtained by analyzing the standard product and the ion ratio obtained by analyzing the biological sample are compared, and the biological sample Can be identified.
また、Ｑ１および／またはＱ３において、２種またはそれ以上のイオンを別チャンネルで選択して通過させることにより、生体試料中に含まれる２種またはそれ以上の蛋白質をまとめて分析することができる。具体的には、例えば、コリジョンセル（Ｑ２）内で生成した２種またはそれ以上のプロダクトイオンをＱ３にて別チャンネルで選択的に検出することにより、ＡＶＰとｄＤＡＶＰのような、イオン化の際に同一の質量電荷比（ｍ／ｚ）のプリカーサーイオンを生成する２種またはそれ以上の蛋白質をまとめて分析することができる。 Further, in Q1 and / or Q3, two or more kinds of ions contained in a biological sample can be analyzed together by selecting and passing two or more kinds of ions through another channel. Specifically, for example, when two or more product ions generated in the collision cell (Q2) are selectively detected by another channel in Q3, ionization such as AVP and dDAVP is performed. Two or more proteins that produce precursor ions with the same mass-to-charge ratio (m / z) can be analyzed together.
質量分析の結果に基づき、測定対象の蛋白質を定量することができる。蛋白質の定量は、常法により行うことができる。具体的には、例えば、検出された測定対象の蛋白質のピーク面積値を濃度既知の内部標準物質のピーク面積値で除したピーク面積比に基づいて、測定対象の蛋白質を定量することができる。 Based on the results of mass spectrometry, the protein to be measured can be quantified. Protein quantification can be performed by conventional methods. Specifically, for example, the protein to be measured can be quantified based on the peak area ratio obtained by dividing the detected peak area value of the protein to be measured by the peak area value of the internal standard substance having a known concentration.
ＬＣ装置、質量分析計、それらに備わる各種要素は、上記例示した分析条件を参照して、測定対象の蛋白質の種類や夾雑物の種類等の諸条件に応じて適宜選択できる。 The LC device, the mass spectrometer, and various elements included in them can be appropriately selected according to various conditions such as the type of protein to be measured and the type of impurities with reference to the analysis conditions exemplified above.
次に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、下記実施例は本発明について具体的な認識を得る一助としてのみ挙げたものであり、これによって本発明の範囲が何ら制限されるものではない。 EXAMPLES Next, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, the following examples are given only as an aid for obtaining specific recognition about the present invention, and this limits the scope of the present invention. It is not something.
実施例１；標準溶液の調製
（１）材料
バソプレシン（ＡＶＰ）、デスモプレシン（ｄＤＡＶＰ）は、それぞれ、株式会社ペプチド研究所、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨから購入したものを使用した。また、ＮＨ2−
ＣＹ（Ｆ）*ＱＮＣＰ−（Ｄ−Ａｒｇ）−Ｇ−ＣＯＮＨ2（ｂｉｏ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ社製、以下「3Ｈ10−ＡＶＰ」と略す）をＡＶＰの、ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏｐｉｏｎｙｌ
−Ｙ（Ｆ）*ＱＮＣＰ−（Ｄ−Ａｒｇ）−Ｇ−ＣＯＮＨ2（ｂｉｏ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ社製、以下「3Ｈ10−ｄＤＡＶＰ」と略す）をｄＤＡＶＰの内部標準物質とした。
Example 1; Preparation of Standard Solution (1) Materials Vasopressin (AVP) and desmopressin (dDAVP) were purchased from Peptide Institute, Inc. and SIGMA-ALDRICH, respectively. NH 2 −
CY (F) * QNCP- (D-Arg) -G-CONH 2 (manufactured by bio SYNTHESIS, hereinafter abbreviated as “ 3 H 10 -AVP”) is AVP's mercaptopropionyl.
-Y (F) * QNCP- (D -Arg) -G-CONH 2 (bio SYNTHESIS Co., hereinafter abbreviated as "3 H 10 -dDAVP") was used as the internal standard dDAVP.
（２）溶媒の調製
分離用溶媒の調製には、酢酸（関東化学社製、特級）、ギ酸（関東化学社製、特級）、メタノール（和光純薬工業社製、ＬＣ／ＭＳ用）、アセトニトリル（和光純薬工業社製、ＬＣ／ＭＳ用）を使用した。
（ｉ）０．０１％酢酸水溶液の調製
１０００ｍＬのメスフラスコにＭｉｌｌｉ−Ｑ水を適当量入れ、これに酢酸を０．１ｍＬ加えた後、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で定容した。
（ｉｉ）１％酢酸含有５％アセトニトリル水溶液の調製
アセトニトリルの５ｍＬにＭｉｌｌｉ−Ｑ水を９５ｍＬ加え、５％アセトニトリル水溶液を１００ｍＬ調製した。１００ｍＬのメスフラスコに１ｍＬの酢酸を量り取り、５％アセトニトリル水溶液で定容した。
（ｉｉｉ）１％ギ酸含有７５％アセトニトリル水溶液の調製
アセトニトリルの７５ｍＬにＭｉｌｌｉ−Ｑ水を２５ｍＬ加え、７５％アセトニトリル水溶液を１００ｍＬ調製した。１００ｍＬのメスフラスコに１ｍＬのギ酸を量り取り、７５％アセトニトリル水溶液で定容した。
(2) Solvent preparation For the preparation of the separation solvent, acetic acid (manufactured by Kanto Chemical Co., special grade), formic acid (manufactured by Kanto Chemical Co., special grade), methanol (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., for LC / MS), acetonitrile (Wako Pure Chemical Industries, LC / MS) was used.
(I) Preparation of 0.01% acetic acid aqueous solution An appropriate amount of Milli-Q water was placed in a 1000 mL volumetric flask, 0.1 mL of acetic acid was added thereto, and the volume was adjusted with Milli-Q water.
(Ii) Preparation of 5% acetonitrile aqueous solution containing 1% acetic acid 95 mL of Milli-Q water was added to 5 mL of acetonitrile to prepare 100 mL of 5% acetonitrile aqueous solution. 1 mL of acetic acid was weighed into a 100 mL volumetric flask and the volume was adjusted with 5% acetonitrile aqueous solution.
(Iii) Preparation of 1% formic acid-containing 75% acetonitrile aqueous solution 25 mL of Milli-Q water was added to 75 mL of acetonitrile to prepare 100 mL of 75% acetonitrile aqueous solution. 1 mL of formic acid was weighed into a 100 mL volumetric flask, and the volume was adjusted with a 75% aqueous acetonitrile solution.
（３）標準溶液の調製
ＡＶＰ、ｄＤＡＶＰ、および内部標準物質は、１％酢酸含有５％アセトニトリル水溶液に溶解した。この溶媒組成は、これらの化合物のポリプロピレンへの吸着を防止するために好ましい。
(3) Preparation of standard solution AVP, dDAVP, and internal standard substance were dissolved in 5% acetonitrile aqueous solution containing 1% acetic acid. This solvent composition is preferred in order to prevent adsorption of these compounds to polypropylene.
ＡＶＰをインティジェンス電天秤（ＭＥ２１５Ｓ，ザルトリウス、読取限界０．０１ｍｇ）で正確に０．５ｍｇ量り取り、これに１％酢酸含有５％アセトニトリル水溶液を０．９２ｍＬ加えて完全に溶解し、５００μｍｏｌ／Ｌの濃度に調製し、これをＡＶＰ標準溶液とした。ｄＤＡＶＰについても同様に５００μｍｏｌ／Ｌ濃度に調製し、これをｄＤＡＶＰ標準溶液とした。 AVP is accurately weighed by 0.5 mg with an intelligence electric balance (ME215S, Sartorius, reading limit 0.01 mg), 0.92 mL of 5% acetonitrile aqueous solution containing 1% acetic acid is added to this and completely dissolved, and 500 μmol / L This was used as an AVP standard solution. Similarly, dDAVP was prepared to a concentration of 500 μmol / L, and this was used as a dDAVP standard solution.
上記各標準溶液を、１％酢酸含有５％アセトニトリル水溶液で５倍に希釈し、イオン化
の最適条件の設定および測定するイオンの選択に使用するチューニング溶液とした。
Each of the above standard solutions was diluted five-fold with 1% acetic acid-containing 5% acetonitrile aqueous solution, and used as a tuning solution used for setting optimum ionization conditions and selecting ions to be measured.
上記各標準溶液を、１％酢酸含有５％アセトニトリル水溶液で希釈し、５００ｎｍｏｌ／Ｌ ＡＶＰ希釈液および１０００ｎｍｏｌ／Ｌ ｄＤＡＶＰ希釈液を調製した。ＡＶＰ希釈液１０μＬとｄＤＡＶＰ希釈液５０μＬを合わせ、１％酢酸含有５％アセトニトリル水溶液を９４０μＬ加えて、５ｎｍｏｌ／Ｌ ＡＶＰおよび５０ｎｍｏｌ／Ｌ ｄＤＡＶＰを含有するＡＶＰ・ｄＤＡＶＰ混合液を調製した。この混合液を順次段階希釈し、ＡＶＰの濃度がそれぞれ８００、４００、２００、４０、２０、４、２ｐｍｏｌ／Ｌであり、且つ、ｄＤＡＶＰの濃度がそれぞれ８０００、４０００、２０００、４００、２００、４０、２０ｐｍｏｌ／Ｌである、検量線用混合標準溶液を調製した。 Each of the above standard solutions was diluted with 1% acetic acid-containing 5% acetonitrile aqueous solution to prepare 500 nmol / L AVP dilution and 1000 nmol / L dDAVP dilution. An AVP / dDAVP mixed solution containing 5 nmol / L AVP and 50 nmol / L dDAVP was prepared by combining 10 μL of AVP diluted solution and 50 μL of dDAVP diluted solution and adding 940 μL of 5% acetonitrile aqueous solution containing 1% acetic acid. This mixed solution is serially diluted, and the AVP concentrations are 800, 400, 200, 40, 20, 4, 2 pmol / L, respectively, and the dDAVP concentrations are 8000, 4000, 2000, 400, 200, 40, respectively. , 20 pmol / L, a standard curve mixed standard solution was prepared.
実施例２；質量分析条件の決定（感度の調整）
上記各標準溶液を用いて、高感度にＡＶＰ及びｄＤＡＶＰを測定可能な質量分析条件を、以下の手順で決定した。
Example 2: Determination of mass spectrometric conditions (adjustment of sensitivity)
Using the above standard solutions, mass spectrometric conditions capable of measuring AVP and dDAVP with high sensitivity were determined by the following procedure.
図１のコネクターを二方から三方に切り替え、シリンジポンプを用いて標準溶液をイオン源に導入した。その際、ＨＰＬＣポンプ（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ＬＣ−２０Ａ、島津製作所社製）を用いて混合した移動相を標準溶液と共にイオン源に導入した。 The connector in FIG. 1 was switched from two to three, and a standard solution was introduced into the ion source using a syringe pump. At that time, the mixed mobile phase was introduced into the ion source together with the standard solution using an HPLC pump (Prominence LC-20A, manufactured by Shimadzu Corporation).
定量に使用するプリカーサーイオン（親イオン）を確認しながら、このイオン強度が最高となるように質量分析計（ＱＴＲＡＰ ５５００、ＡＢ ＳＣＩＥＸ）のイオン源（ＥＳＩ、Ｔｕｒｂｏ Ｖ Ｓｐｒａｙ、ＡＢ ＳＣＩＥＸ）の噴霧位置を調整した。 Spray position of ion source (ESI, Turbo V Spray, AB SCIEX) of mass spectrometer (QTRAP 5500, AB SCIEX) so that this ion intensity is maximized while confirming the precursor ion (parent ion) used for quantification Adjusted.
噴霧位置の調整完了後、デクラスタリングポテンシャル（オリフィス電圧；ＤＰ）、イオンを引き込む電圧（ＥＰ）、印加する高電圧（イオンスプレー電圧；ＩＳ）、ＧＳ１及びＧＳ２のガス圧力（ＧＳ１、ＧＳ２）、ならびに温度（ＴＥＭ）を調整した。 After completion of the spray position adjustment, declustering potential (orifice voltage; DP), voltage for drawing ions (EP), high voltage to be applied (ion spray voltage; IS), gas pressures of GS1 and GS2 (GS1, GS2), and The temperature (TEM) was adjusted.
次いでプリカーサーイオン（親イオン）からプロダクトイオン（娘イオン）を検索し、そのイオン強度が最大となるように分析管を調整した。調整したパラメーターは、衝突開裂に関与するエネルギー電圧（ＣＥ、ＡＦ２）と衝突するガス量（ＣＡＤ）である。 Next, product ions (daughter ions) were searched from the precursor ions (parent ions), and the analysis tube was adjusted so that the ion intensity was maximized. The adjusted parameter is the amount of gas (CAD) colliding with the energy voltage (CE, AF2) involved in the collision cleavage.
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定（ＭＲＭ）を行う場合の分析条件の設定は、以上で完了とした。 The setting of analysis conditions when performing LC-MS / MS measurement (MRM) was completed.
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ／ＭＳ測定を行う場合は、さらに、選択したプロダクトイオンをプリカーサーイオン（親イオン）として設定し、イオントラップの条件設定を行った。設定したイオントラップの条件は、イオンをトラップフィールド内に留める電圧と時間、およびトラップ内で衝突開裂するためのイオン振幅に関わる電圧である。 When performing LC-MS / MS / MS measurement, the selected product ion was set as a precursor ion (parent ion), and the ion trap conditions were set. The set ion trap conditions are the voltage and time for keeping the ions in the trap field, and the voltage related to the ion amplitude for collisional cleavage in the trap.
以上の操作を選択するイオンのそれぞれについて行い、決定した条件を各イオンの測定条件として質量分析計の制御ＰＣに保存した。このような分析条件の決定は、ＡＶＰ及びｄＤＡＶＰの分析に限られず、インクレチン等の他の蛋白質の分析の際にも同様に行うことができる。 The above operation was performed for each of the ions to be selected, and the determined conditions were stored in the control PC of the mass spectrometer as measurement conditions for each ion. Such determination of analysis conditions is not limited to the analysis of AVP and dDAVP, but can be similarly performed when analyzing other proteins such as incretin.
また、内部標準物質は一定量が添加されるものであり測定結果が大きく変化することが無いため、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（ＭＲＭ）モードでの測定用に測定条件の設定を行った。 Moreover, since a certain amount of the internal standard substance is added and the measurement result does not change greatly, the measurement conditions were set for measurement in the LC-MS / MS (MRM) mode.
上記方法により決定した、質量分析条件を表１〜５に示す。ＡＶＰおよびｄＤＡＶＰに共通のイオン化条件を表１に示す。ＡＶＰ測定の際の、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ／ＭＳの分析条件を表２に、内部標準物質をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（ＭＲＭ）で測定する条件を表３に示した。ｄＤＡＶＰ測定の際の、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ／ＭＳの分析条件を表４に、内部標準物質を
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（ＭＲＭ）で測定する条件を表５に示した。
The mass spectrometry conditions determined by the above method are shown in Tables 1-5. Table 1 shows the ionization conditions common to AVP and dDAVP. Table 2 shows the LC-MS / MS / MS analysis conditions for AVP measurement, and Table 3 shows the conditions for measuring the internal standard substance by LC-MS / MS (MRM). Table 4 shows LC-MS / MS / MS analysis conditions for dDAVP measurement, and Table 5 shows conditions for measuring an internal standard substance by LC-MS / MS (MRM).
実施例３；ＨＰＬＣ条件の設定
実施例１において作製した検量線用混合標準溶液を用いて、ＡＶＰとｄＤＡＶＰを分離できるＨＰＬＣ条件を検討した。
Example 3: Setting of HPLC conditions The HPLC conditions under which AVP and dDAVP could be separated were examined using the calibration standard mixed solution prepared in Example 1.
ＨＰＬＣ装置としては、Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ＬＣ−２０Ａ（株式会社島津製作所社製）を使用し、ＨＰＬＣカラムとしては、ＸＢｒｉｄｇｅ（商標） ＢＥＨ３００ Ｃ１８ ｃｏｌｕｍｎ（粒子径３．５μｍ、内径２．１ｍｍ ｘ長さ５０ｍｍ；Ｗａｔｅｒｓ社製）を使用した。 As the HPLC apparatus, Prominence LC-20A (manufactured by Shimadzu Corporation) is used, and as the HPLC column, XBridge (trademark) BEH300 C18 column (particle diameter 3.5 μm, inner diameter 2.1 mm × length 50 mm; Waters) Used).
分離溶液としては、水系移動相として０．０１％酢酸水溶液を、有機溶媒系移動相とし
てメタノールを、ポンプで混合して使用した。
As the separation solution, a 0.01% aqueous acetic acid solution was used as the aqueous mobile phase, and methanol as the organic solvent mobile phase was mixed by a pump.
ＡＶＰとｄＤＡＶＰを分離できるＨＰＬＣ条件の一例を表６に示した。このようにしてＡＶＰとｄＤＡＶＰを分離することにより、質量分析計においてＡＶＰとｄＤＡＶＰとを区別して測定することができる。 An example of HPLC conditions that can separate AVP and dDAVP is shown in Table 6. By separating AVP and dDAVP in this way, AVP and dDAVP can be distinguished and measured in a mass spectrometer.
実施例４；抽出条件の設定
質量分析計による分析を実施する前に、生体試料を固相抽出による前処理に供した。
Example 4: Setting of extraction conditions Prior to analysis by a mass spectrometer, a biological sample was subjected to pretreatment by solid phase extraction.
検量線用サンプルとしては、コンセーラ（精度管理用凍結乾燥プール血清、日水製薬株式会社）３５０μＬに、検量線用混合標準溶液を３５μＬ、内部標準混合溶液（１４００ｐｍｏｌ／Ｌ 3Ｈ5−ＡＶＰと１４０００ｐｍｏｌ／Ｌ 3Ｈ5−ｄＤＡＶＰの混合液）を１５μＬ添加したものを使用した。対照サンプルとしては、コンセーラ３５０μＬに、１％酢酸含有５％アセトニトリル溶液を３５μＬ、内部標準混合溶液を１５μＬ添加したものを使用した。 As a sample for a calibration curve, 350 μL of a consera (lyophilized pool serum for accuracy control, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), 35 μL of a mixed standard solution for a calibration curve, an internal standard mixed solution (1400 pmol / L 3 H 5 -AVP and 14000 pmol) / L 3 H 5 -dDAVP mixture solution) was used. As a control sample, 35 μL of 5% acetonitrile solution containing 1% acetic acid and 15 μL of an internal standard mixed solution were added to 350 μL of the conseller.
次いで、各サンプルに、４％リン酸水溶液を３５０μＬ加え、毎分１０，０００回転で１０分間、４℃に設定して遠心分離（ＣＦ１６ＲＸII、日立工機）を行った。 Next, 350 μL of 4% phosphoric acid aqueous solution was added to each sample, and centrifugation (CF16RXII, Hitachi Koki) was performed at 10,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C.
次いで、以下の手順で固相抽出を行った。固相抽出にはＯＡＳＩＳ（登録商標） ＷＣＸ μＥｌｕｔｉｏｎ Ｐｌａｔｅ （Ｗａｔｅｒｓ社製）を使用した。ＯＡＳＩＳ（登録商標） ＷＣＸ μＥｌｕｔｉｏｎ Ｐｌａｔｅは、５００μＬのアセトニトリルで洗浄後、同量のＭｉｌｌｉ Ｑ水（ＭｉｌｌｉＱ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、日本ミリポア社製）で平衡化を行った。平衡化後の固相に遠心分離した各サンプルの上清を全量添加した後、５００μＬの５％アンモニア水と５００μＬの７５％アセトニトリル水溶液で洗浄した。洗浄後、２００μＬの１％ギ酸含有７５％アセトニトリル水溶液を用いて固相からＡＶＰおよびｄＤＡＶＰを溶出した。 Subsequently, solid phase extraction was performed according to the following procedure. OASIS (registered trademark) WCX μElution Plate (manufactured by Waters) was used for solid phase extraction. OASIS (registered trademark) WCX μElution Plate was washed with 500 μL of acetonitrile and then equilibrated with the same amount of Milli Q water (MilliQ Synthesis, manufactured by Millipore Japan). After adding the whole supernatant of each sample centrifuged to the solid phase after equilibration, it was washed with 500 μL of 5% ammonia water and 500 μL of 75% acetonitrile aqueous solution. After washing, AVP and dDAVP were eluted from the solid phase using 200 μL of 75% acetonitrile aqueous solution containing 1% formic acid.
溶出液は、遠心エバポレータを用いて、５０℃、９０分間の乾燥を行い、残渣に１％酢酸含有５％アセトニトリル水溶液を１００μＬ加えて溶解し、測定用サンプルとした。 The eluate was dried for 90 minutes at 50 ° C. using a centrifugal evaporator, and 100 μL of 5% acetonitrile aqueous solution containing 1% acetic acid was added to the residue and dissolved to prepare a sample for measurement.
実施例５；検出下限および定量下限の検討
実施例２〜４に従って決定した生体試料の前処理法、ＨＰＬＣの条件、質量分析の条件に従って、本願発明の分析法によるＡＶＰ及びｄＤＡＶＰの検出および定量可能な下限値の検討を行った。
Example 5: Examination of lower limit of detection and lower limit of quantification AVP and dDAVP can be detected and quantified by the analysis method of the present invention according to the pretreatment method, HPLC conditions, and mass spectrometry conditions of the biological sample determined according to Examples 2 to 4. The lower limit was examined.
ＡＶＰを１％酢酸含有５％アセトニトリル水溶液に溶解し、０．２００、０．４００、２．００、４．００、２０．０、４０．０、８０．０ｐｍｏｌ／ＬのＡＶＰ溶液を調製した。なお、０．２００、０．４００、２．００、４．００、２０．０、４０．０、８０．０ｐｍｏｌ／Ｌは、それぞれ、０．２１７、０．４３４、２．１７、４．３４、２１．７、４３．４、８６．７ｐｇ／ｍＬに相当する。 AVP was dissolved in 5% acetonitrile aqueous solution containing 1% acetic acid to prepare 0.200, 0.400, 2.00, 4.00, 20.0, 40.0, 80.0 pmol / L AVP solutions. Note that 0.200, 0.400, 2.00, 4.00, 20.0, 40.0, and 80.0 pmol / L are 0.217, 0.434, 2.17, and 4.34, respectively. 21.7, 43.4, 86.7 pg / mL.
ｄＤＡＶＰを１％酢酸含有５％アセトニトリル水溶液に溶解し、２．００、４．００、２０．０、４０．０、２００、４００、８００ｐｍｏｌ／ＬのｄＤＡＶＰ溶液を調製した。 dDAVP was dissolved in 1% acetic acid-containing 5% acetonitrile aqueous solution to prepare 2.00, 4.00, 20.0, 40.0, 200, 400, and 800 pmol / L dDAVP solutions.
調製した各溶液をサンプルとして前記条件で３回測定し、得られた定量値から検出及び定量可能な下限値を検討した。測定結果を表７及び８に示す。表に示した通り、ＡＶＰは０．２００〜８０．０ｐｍｏｌ／Ｌの全範囲で、ｄＤＡＶＰは２．００〜８００ｐｍｏｌ／Ｌの全範囲で直線性が保たれ、定量可能であることが示された。また、ＡＶＰの検出および定量下限は０．２００ｐｍｏｌ／Ｌ、ｄＤＡＶＰの検出および定量下限は２．００ｐｍｏｌ／Ｌであった。 Each prepared solution was measured three times under the above conditions as a sample, and the lower limit value that can be detected and quantified was examined from the obtained quantified value. The measurement results are shown in Tables 7 and 8. As shown in the table, it was shown that AVP is linear over the entire range of 0.200 to 80.0 pmol / L, and dDAVP is quantifiable while maintaining linearity over the entire range of 2.00 to 800 pmol / L. . The lower limit of detection and quantification of AVP was 0.200 pmol / L, and the lower limit of detection and quantification of dDAVP was 2.00 pmol / L.
一方、分離溶液の成分として、酢酸に代えてギ酸を用いて同様の実験を行ったところ、酢酸を用いた場合と比較して、検出感度の著しい低下が認められた。また、分離溶液の成分として、メタノールに代えてアセトニトリルを用いて同様の実験を行ったところ、メタノールを用いた場合と比較して、検出感度の著しい低下が認められた。 On the other hand, when a similar experiment was performed using formic acid instead of acetic acid as a component of the separation solution, a significant decrease in detection sensitivity was observed compared to the case where acetic acid was used. In addition, when a similar experiment was performed using acetonitrile instead of methanol as a component of the separation solution, a significant decrease in detection sensitivity was recognized as compared with the case of using methanol.
一般的に、ギ酸は酢酸よりもイオン化し易く、アセトニトリルはメタノールよりも溶解性が高いことが知られている。よって、液体クロマトグラフィーと質量分析を組み合わせた分析方法の分離溶媒として、酢酸とメタノールの組み合わせの方が効果が高いことは意外であった。 Generally, it is known that formic acid is easier to ionize than acetic acid, and acetonitrile is more soluble than methanol. Therefore, it was surprising that the combination of acetic acid and methanol was more effective as a separation solvent for the analysis method combining liquid chromatography and mass spectrometry.
実施例６；実検体を使用したＡＶＰおよびｄＤＡＶＰの測定
実施例１〜４によって決定した生体試料の前処理法、ＨＰＬＣの条件、質量分析の条件を使用して、実検体２５件の血漿中のＡＶＰ及びｄＤＡＶＰの測定を実施した。測定結果を表９に示した。なお、表中、「ＢＬＱ」の表記は、定量範囲以下（Ｂｅｌｏｗ ＬＬＯＱ；ｂｅｌｏｗ ｌｏｗｅｒ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ）であることを示す。
Example 6: Measurement of AVP and dDAVP using real samples Using the biological sample pretreatment method, HPLC conditions, and mass spectrometry conditions determined according to Examples 1 to 4, in the plasma of 25 real samples AVP and dDAVP measurements were performed. The measurement results are shown in Table 9. In the table, the notation of “BLQ” indicates that it is below the quantitative range (Below LLOQ; below lower limit of quantification).
比較例１；抗体を使用したＡＶＰの免疫学的測定
比較例として、従来ＡＶＰの測定に使用されている放射免疫測定（ＲＩＡ）法によるＡＶＰの測定を行った。測定キットとしてアルギニンバソプレッシンキットＡＶＰ ＲＩＡ「ミツビシ」（三菱化学メディエンス社製）を使用した。実施例６において使用した実検体２５件を使用し、前記測定キットに同梱されている説明書に従って血漿中のＡＶＰの測定を実施した。測定結果を表１０に示す。
Comparative Example 1; Immunological measurement of AVP using antibody As a comparative example, AVP was measured by a radioimmunoassay (RIA) method conventionally used for measuring AVP. Arginine vasopressin kit AVP RIA “Mitsubishi” (manufactured by Mitsubishi Chemical Medience) was used as a measurement kit. Using 25 actual specimens used in Example 6, AVP in plasma was measured according to the instructions included in the measurement kit. Table 10 shows the measurement results.
また、実施例６において測定された質量分析計によるＡＶＰ測定結果と比較例１において測定されたＲＩＡ法によるＡＶＰ測定結果との相関図を図２に示した。質量分析計によるＡＶＰ測定結果とＲＩＡ法によるＡＶＰ測定結果は強く相関しており、質量分析計によりＡＶＰが正確に測定できることが明らかとなった。 Moreover, the correlation diagram of the AVP measurement result by the mass spectrometer measured in Example 6 and the AVP measurement result by the RIA method measured in Comparative Example 1 is shown in FIG. The AVP measurement result by the mass spectrometer and the AVP measurement result by the RIA method are strongly correlated, and it became clear that AVP can be measured accurately by the mass spectrometer.
以上の通り、本発明の方法によれば、生体試料中に含まれるＡＶＰとｄＤＡＶＰを同時に且つ高感度に測定することが可能であり、測定に要する時間を大幅に短縮することが可能である。 As described above, according to the method of the present invention, AVP and dDAVP contained in a biological sample can be measured simultaneously and with high sensitivity, and the time required for measurement can be greatly shortened.
実施例７；インクレチン関連ペプチドの測定
本実施例では、インクレチン関連ペプチドであるＧＬＰ−１（１−３７）、ＧＬＰ−１（７−３７）、ＧＬＰ−１（７−３６）、ＧＬＰ−１（７−３６）Ａｍｉｄｅについて、質量分析計による測定を試みた。
Example 7: Measurement of incretin-related peptides In this example, incretin-related peptides GLP-1 (1-37), GLP-1 (7-37), GLP-1 (7-36), GLP- About 1 (7-36) Amide, the measurement by a mass spectrometer was tried.
ＨＰＬＣ装置及びＨＰＬＣカラムには、実施例２〜５と同じものを使用した。分離溶液には、水系移動相として０．０１％酢酸水溶液、有機溶媒系移動相としてメタノールを使用し、実施例３と同様に分離条件を設定した。また、質量分析条件の検討も実施例２〜４と同様にして行った。その結果、本発明の方法によれば、互いに類似した４種類のインクレチン関連ペプチドを分別して同時に測定可能であることが示された。 The same HPLC apparatus and HPLC column as those in Examples 2 to 5 were used. In the separation solution, a 0.01% aqueous acetic acid solution was used as the aqueous mobile phase, and methanol was used as the organic solvent mobile phase, and the separation conditions were set in the same manner as in Example 3. Moreover, examination of mass spectrometry conditions was also performed in the same manner as in Examples 2-4. As a result, according to the method of the present invention, it was shown that four types of incretin-related peptides similar to each other can be fractionated and measured simultaneously.
一方、分離溶液の成分として、酢酸に代えてギ酸を用いて同様の実験を行ったところ、酢酸を用いた場合と比較して、検出感度の著しい低下が認められた。また、分離溶液の成分として、メタノールに代えてアセトニトリルを用いて同様の実験を行ったところ、メタノールを用いた場合と比較して、検出感度の著しい低下が認められた。 On the other hand, when a similar experiment was performed using formic acid instead of acetic acid as a component of the separation solution, a significant decrease in detection sensitivity was observed compared to the case where acetic acid was used. In addition, when a similar experiment was performed using acetonitrile instead of methanol as a component of the separation solution, a significant decrease in detection sensitivity was recognized as compared with the case of using methanol.
本発明によれば、生体試料中の微量の蛋白質を測定できる。本発明によれば、特に、生体試料中の複数の蛋白質を分別して測定できる。例えば、本発明の一実施形態によれば、血中に微量しか含まれないＡＶＰを、ＡＶＰとｄＤＡＶＰとを互いに区別して高感度かつ正確に定量することができ、ＡＶＰ及びｄＤＡＶＰの正確な血中濃度を把握することができる。また、本発明によれば、生体試料の取得から蛋白質の測定までに要する日数が大幅に短縮され、よって、本発明は、検査センター等で大量の検体を分析するのに有効である。従って、本発明は、例えば、種々の疾患について、的確な治療方針の選択材料及び治療薬の効果判定材料を迅速に提供することができる。 According to the present invention, a trace amount of protein in a biological sample can be measured. According to the present invention, in particular, a plurality of proteins in a biological sample can be fractionated and measured. For example, according to an embodiment of the present invention, AVP containing only a trace amount in blood can be quantified with high sensitivity and accuracy by distinguishing AVP and dDAVP from each other. The concentration can be grasped. Further, according to the present invention, the number of days required from the acquisition of a biological sample to the measurement of a protein is greatly shortened. Therefore, the present invention is effective for analyzing a large amount of specimens at a test center or the like. Therefore, the present invention can quickly provide, for example, a material for selecting an appropriate treatment policy and a material for determining the effect of a therapeutic agent for various diseases.
Claims (11)
（ｉ）酢酸およびメタノールを含有する移動相を用いた液体クロマトグラフィーにより生体試料に含まれる蛋白質を分離する工程、
（ｉｉ）前記（ｉ）の工程で分離された蛋白質を質量分析計で分析する工程、
を含む方法。 A method for measuring protein, comprising:
(I) a step of separating a protein contained in a biological sample by liquid chromatography using a mobile phase containing acetic acid and methanol;
(Ii) a step of analyzing the protein separated in the step (i) with a mass spectrometer,
Including methods.
前記第１のメタノール濃度が０％〜１０％であり、
前記第２のメタノール濃度が４０％〜６０％である、
請求項２に記載の方法。 Said step (i) comprises increasing the concentration of methanol in the mobile phase from a first methanol concentration to a second methanol concentration;
The first methanol concentration is 0% to 10%;
The second methanol concentration is 40% to 60%;
The method of claim 2.
前記第１の酢酸濃度が０．００４８％〜０．０４％であり、
前記第２の酢酸濃度が０．００２３％〜０．０２２％であり、
前記第２の酢酸濃度は前記第１の酢酸濃度より小さい、
請求項４に記載の方法。 Said step (i) comprises reducing the concentration of acetic acid in the mobile phase from a first acetic acid concentration to a second acetic acid concentration;
The first acetic acid concentration is 0.0048% to 0.04%;
The second acetic acid concentration is 0.0023% to 0.022%;
The second acetic acid concentration is less than the first acetic acid concentration;
The method of claim 4.
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