JP2014230511A - Method of detecting bordetella pertussis - Google Patents
Method of detecting bordetella pertussis Download PDFInfo
- Publication number
- JP2014230511A JP2014230511A JP2013112859A JP2013112859A JP2014230511A JP 2014230511 A JP2014230511 A JP 2014230511A JP 2013112859 A JP2013112859 A JP 2013112859A JP 2013112859 A JP2013112859 A JP 2013112859A JP 2014230511 A JP2014230511 A JP 2014230511A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- nucleic acid
- bordetella pertussis
- probe
- parapertussis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 title claims abstract description 113
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 94
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 103
- 241000588780 Bordetella parapertussis Species 0.000 claims abstract description 50
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 115
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 110
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 107
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 103
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 103
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 53
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 48
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 48
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 21
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 claims description 17
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 claims description 17
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 13
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 7
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 6
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 abstract description 7
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 abstract description 7
- 101100048413 Escherichia coli (strain K12) ulaC gene Proteins 0.000 abstract description 4
- 101150112048 apxIIIA gene Proteins 0.000 abstract description 4
- 101150103042 ptxA gene Proteins 0.000 abstract description 4
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 109
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 84
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 83
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 67
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 50
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 47
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 44
- 238000011880 melting curve analysis Methods 0.000 description 44
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 25
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 22
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 22
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 22
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 19
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 14
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 description 7
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 7
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 7
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- -1 DNA or RNA Chemical class 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 5
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N acridine Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N pyrene Chemical compound C1=CC=C2C=CC3=CC=CC4=CC=C1C2=C43 BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 4
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- WGTODYJZXSJIAG-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine chloride Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O WGTODYJZXSJIAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- GLNDAGDHSLMOKX-UHFFFAOYSA-N coumarin 120 Chemical compound C1=C(N)C=CC2=C1OC(=O)C=C2C GLNDAGDHSLMOKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 3
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 3
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- PXBFMLJZNCDSMP-UHFFFAOYSA-N 2-Aminobenzamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CC=C1N PXBFMLJZNCDSMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OBYNJKLOYWCXEP-UHFFFAOYSA-N 2-[3-(dimethylamino)-6-dimethylazaniumylidenexanthen-9-yl]-4-isothiocyanatobenzoate Chemical compound C=12C=CC(=[N+](C)C)C=C2OC2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC(N=C=S)=CC=C1C([O-])=O OBYNJKLOYWCXEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QCPFFGGFHNZBEP-UHFFFAOYSA-N 4,5,6,7-tetrachloro-3',6'-dihydroxyspiro[2-benzofuran-3,9'-xanthene]-1-one Chemical compound O1C(=O)C(C(=C(Cl)C(Cl)=C2Cl)Cl)=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 QCPFFGGFHNZBEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 4-[[4-(dimethylamino)phenyl]diazenyl]benzoic acid Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 4-methylumbelliferone Chemical compound C1=C(O)C=CC2=C1OC(=O)C=C2C HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JBNOVHJXQSHGRL-UHFFFAOYSA-N 7-amino-4-(trifluoromethyl)coumarin Chemical compound FC(F)(F)C1=CC(=O)OC2=CC(N)=CC=C21 JBNOVHJXQSHGRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- XPDXVDYUQZHFPV-UHFFFAOYSA-N Dansyl Chloride Chemical compound C1=CC=C2C(N(C)C)=CC=CC2=C1S(Cl)(=O)=O XPDXVDYUQZHFPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091006149 Electron carriers Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N Iron oxide Chemical compound [Fe]=O UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 2
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 2
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N coumarin Chemical compound C1=CC=C2OC(=O)C=CC2=C1 ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 2
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VYXSBFYARXAAKO-UHFFFAOYSA-N ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate;hydron;chloride Chemical compound [Cl-].C1=2C=C(C)C(NCC)=CC=2OC2=CC(=[NH+]CC)C(C)=CC2=C1C1=CC=CC=C1C(=O)OCC VYXSBFYARXAAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GVEPBJHOBDJJJI-UHFFFAOYSA-N fluoranthrene Natural products C1=CC(C2=CC=CC=C22)=C3C2=CC=CC3=C1 GVEPBJHOBDJJJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 2
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 2
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 229940043267 rhodamine b Drugs 0.000 description 2
- FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J sodium diphosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 2
- 229940048086 sodium pyrophosphate Drugs 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- YBBRCQOCSYXUOC-UHFFFAOYSA-N sulfuryl dichloride Chemical compound ClS(Cl)(=O)=O YBBRCQOCSYXUOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000019818 tetrasodium diphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001577 tetrasodium phosphonato phosphate Substances 0.000 description 2
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 2
- DYMYLBQTHCJHOQ-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) butanoate Chemical compound CCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O DYMYLBQTHCJHOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GIANIJCPTPUNBA-QMMMGPOBSA-N (2s)-3-(4-hydroxyphenyl)-2-nitramidopropanoic acid Chemical compound [O-][N+](=O)N[C@H](C(=O)O)CC1=CC=C(O)C=C1 GIANIJCPTPUNBA-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- DUFUXAHBRPMOFG-UHFFFAOYSA-N 1-(4-anilinonaphthalen-1-yl)pyrrole-2,5-dione Chemical compound O=C1C=CC(=O)N1C(C1=CC=CC=C11)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 DUFUXAHBRPMOFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZTTARJIAPRWUHH-UHFFFAOYSA-N 1-isothiocyanatoacridine Chemical compound C1=CC=C2C=C3C(N=C=S)=CC=CC3=NC2=C1 ZTTARJIAPRWUHH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VGIRNWJSIRVFRT-UHFFFAOYSA-N 2',7'-difluorofluorescein Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(F)C(=O)C=C2OC2=CC(O)=C(F)C=C21 VGIRNWJSIRVFRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SGTNSNPWRIOYBX-UHFFFAOYSA-N 2-(3,4-dimethoxyphenyl)-5-{[2-(3,4-dimethoxyphenyl)ethyl](methyl)amino}-2-(propan-2-yl)pentanenitrile Chemical compound C1=C(OC)C(OC)=CC=C1CCN(C)CCCC(C#N)(C(C)C)C1=CC=C(OC)C(OC)=C1 SGTNSNPWRIOYBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AGMNQPKGRCRYQP-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethylamino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCNCCN(CC(O)=O)CC(O)=O AGMNQPKGRCRYQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IOOMXAQUNPWDLL-UHFFFAOYSA-N 2-[6-(diethylamino)-3-(diethyliminiumyl)-3h-xanthen-9-yl]-5-sulfobenzene-1-sulfonate Chemical compound C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1S([O-])(=O)=O IOOMXAQUNPWDLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LAXVMANLDGWYJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-5-(2-aminoethyl)naphthalene-1-sulfonic acid Chemical compound NC1=CC=C2C(CCN)=CC=CC2=C1S(O)(=O)=O LAXVMANLDGWYJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CPBJMKMKNCRKQB-UHFFFAOYSA-N 3,3-bis(4-hydroxy-3-methylphenyl)-2-benzofuran-1-one Chemical compound C1=C(O)C(C)=CC(C2(C3=CC=CC=C3C(=O)O2)C=2C=C(C)C(O)=CC=2)=C1 CPBJMKMKNCRKQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOLORTLGFDVFDW-UHFFFAOYSA-N 3-(1h-benzimidazol-2-yl)-7-(diethylamino)chromen-2-one Chemical compound C1=CC=C2NC(C3=CC4=CC=C(C=C4OC3=O)N(CC)CC)=NC2=C1 GOLORTLGFDVFDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YSCNMFDFYJUPEF-OWOJBTEDSA-N 4,4'-diisothiocyano-trans-stilbene-2,2'-disulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC(N=C=S)=CC=C1\C=C\C1=CC=C(N=C=S)C=C1S(O)(=O)=O YSCNMFDFYJUPEF-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 1
- YJCCSLGGODRWKK-NSCUHMNNSA-N 4-Acetamido-4'-isothiocyanostilbene-2,2'-disulphonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC(NC(=O)C)=CC=C1\C=C\C1=CC=C(N=C=S)C=C1S(O)(=O)=O YJCCSLGGODRWKK-NSCUHMNNSA-N 0.000 description 1
- OSWZKAVBSQAVFI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-isothiocyanatophenyl)diazenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=C(N=C=S)C=C1 OSWZKAVBSQAVFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SJQRQOKXQKVJGJ-UHFFFAOYSA-N 5-(2-aminoethylamino)naphthalene-1-sulfonic acid Chemical compound C1=CC=C2C(NCCN)=CC=CC2=C1S(O)(=O)=O SJQRQOKXQKVJGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZWONWYNZSWOYQC-UHFFFAOYSA-N 5-benzamido-3-[[5-[[4-chloro-6-(4-sulfoanilino)-1,3,5-triazin-2-yl]amino]-2-sulfophenyl]diazenyl]-4-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound OC1=C(N=NC2=CC(NC3=NC(NC4=CC=C(C=C4)S(O)(=O)=O)=NC(Cl)=N3)=CC=C2S(O)(=O)=O)C(=CC2=C1C(NC(=O)C1=CC=CC=C1)=CC(=C2)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O ZWONWYNZSWOYQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NJYVEMPWNAYQQN-UHFFFAOYSA-N 5-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C21OC(=O)C1=CC(C(=O)O)=CC=C21 NJYVEMPWNAYQQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AXGKYURDYTXCAG-UHFFFAOYSA-N 5-isothiocyanato-2-[2-(4-isothiocyanato-2-sulfophenyl)ethyl]benzenesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC(N=C=S)=CC=C1CCC1=CC=C(N=C=S)C=C1S(O)(=O)=O AXGKYURDYTXCAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HWQQCFPHXPNXHC-UHFFFAOYSA-N 6-[(4,6-dichloro-1,3,5-triazin-2-yl)amino]-3',6'-dihydroxyspiro[2-benzofuran-3,9'-xanthene]-1-one Chemical compound C=1C(O)=CC=C2C=1OC1=CC(O)=CC=C1C2(C1=CC=2)OC(=O)C1=CC=2NC1=NC(Cl)=NC(Cl)=N1 HWQQCFPHXPNXHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TXSWURLNYUQATR-UHFFFAOYSA-N 6-amino-2-(3-ethenylsulfonylphenyl)-1,3-dioxobenzo[de]isoquinoline-5,8-disulfonic acid Chemical compound O=C1C(C2=3)=CC(S(O)(=O)=O)=CC=3C(N)=C(S(O)(=O)=O)C=C2C(=O)N1C1=CC=CC(S(=O)(=O)C=C)=C1 TXSWURLNYUQATR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZIDRAQTRIQDX-UHFFFAOYSA-N 6-carboxy-x-rhodamine Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(C([O-])=O)C=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 WQZIDRAQTRIQDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SGAOZXGJGQEBHA-UHFFFAOYSA-N 82344-98-7 Chemical compound C1CCN2CCCC(C=C3C4(OC(C5=CC(=CC=C54)N=C=S)=O)C4=C5)=C2C1=C3OC4=C1CCCN2CCCC5=C12 SGAOZXGJGQEBHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010000239 Aequorin Proteins 0.000 description 1
- HNXXTOFZAPZPBF-UHFFFAOYSA-N C(C)N(C1=CC=C2C(=C(C(OC2=C1)=O)C1=CC=C(C=C1)N=C=O)C)CC Chemical compound C(C)N(C1=CC=C2C(=C(C(OC2=C1)=O)C1=CC=C(C=C1)N=C=O)C)CC HNXXTOFZAPZPBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000606153 Chlamydia trachomatis Species 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O Ethidium cation Chemical compound C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 101100412856 Mus musculus Rhod gene Proteins 0.000 description 1
- 101100208721 Mus musculus Usp5 gene Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 description 1
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010010677 Phosphodiesterase I Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000002151 Pleural effusion Diseases 0.000 description 1
- KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N Ruthenium Chemical compound [Ru] KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229910052771 Terbium Inorganic materials 0.000 description 1
- 101100242191 Tetraodon nigroviridis rho gene Proteins 0.000 description 1
- 241000981880 Thermococcus kodakarensis KOD1 Species 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N Tritium Chemical compound [3H] YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 241000617156 archaeon Species 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000006931 brain damage Effects 0.000 description 1
- 231100000874 brain damage Toxicity 0.000 description 1
- 208000029028 brain injury Diseases 0.000 description 1
- 125000001246 bromo group Chemical group Br* 0.000 description 1
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 229940038705 chlamydia trachomatis Drugs 0.000 description 1
- 229940090961 chromium dioxide Drugs 0.000 description 1
- IAQWMWUKBQPOIY-UHFFFAOYSA-N chromium(4+);oxygen(2-) Chemical compound [O-2].[O-2].[Cr+4] IAQWMWUKBQPOIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYTAKQFHWFYBMA-UHFFFAOYSA-N chromium(IV) oxide Inorganic materials O=[Cr]=O AYTAKQFHWFYBMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 229960000956 coumarin Drugs 0.000 description 1
- 235000001671 coumarin Nutrition 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- KPBGWWXVWRSIAY-UHFFFAOYSA-L disodium;2',4',5',7'-tetraiodo-6-isothiocyanato-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-3',6'-diolate Chemical compound [Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=C(N=C=S)C=C2C21C1=CC(I)=C([O-])C(I)=C1OC1=C(I)C([O-])=C(I)C=C21 KPBGWWXVWRSIAY-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- XHXYXYGSUXANME-UHFFFAOYSA-N eosin 5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC(Br)=C(O)C(Br)=C1OC1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 XHXYXYGSUXANME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IINNWAYUJNWZRM-UHFFFAOYSA-L erythrosin B Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(I)C(=O)C(I)=C2OC2=C(I)C([O-])=C(I)C=C21 IINNWAYUJNWZRM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940011411 erythrosine Drugs 0.000 description 1
- 239000004174 erythrosine Substances 0.000 description 1
- 235000012732 erythrosine Nutrition 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- KTWOOEGAPBSYNW-UHFFFAOYSA-N ferrocene Chemical compound [Fe+2].C=1C=C[CH-]C=1.C=1C=C[CH-]C=1 KTWOOEGAPBSYNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZFKJVJIDPQDDFY-UHFFFAOYSA-N fluorescamine Chemical compound C12=CC=CC=C2C(=O)OC1(C1=O)OC=C1C1=CC=CC=C1 ZFKJVJIDPQDDFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 229910052747 lanthanoid Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002602 lanthanoids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000696 magnetic material Substances 0.000 description 1
- 229940107698 malachite green Drugs 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 210000003928 nasal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 210000001331 nose Anatomy 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- AFAIELJLZYUNPW-UHFFFAOYSA-N pararosaniline free base Chemical compound C1=CC(N)=CC=C1C(C=1C=CC(N)=CC=1)=C1C=CC(=N)C=C1 AFAIELJLZYUNPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N phthalaldehyde Chemical compound O=CC1=CC=CC=C1C=O ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- AJMSJNPWXJCWOK-UHFFFAOYSA-N pyren-1-yl butanoate Chemical compound C1=C2C(OC(=O)CCC)=CC=C(C=C3)C2=C2C3=CC=CC2=C1 AJMSJNPWXJCWOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000012857 radioactive material Substances 0.000 description 1
- 239000000941 radioactive substance Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- MYFATKRONKHHQL-UHFFFAOYSA-N rhodamine 123 Chemical compound [Cl-].COC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=CC(=[NH2+])C=C2OC2=CC(N)=CC=C21 MYFATKRONKHHQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 1
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 1
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 1
- 229910052707 ruthenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012536 storage buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- GZCRRIHWUXGPOV-UHFFFAOYSA-N terbium atom Chemical compound [Tb] GZCRRIHWUXGPOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 229910052722 tritium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
- 229910000859 α-Fe Inorganic materials 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
本発明は，百日咳菌およびまたはパラ百日咳菌を分類して検出する分野に関する。 The present invention relates to the field of classifying and detecting Bordetella pertussis and / or Bordetella parapertussis.
百日咳は，伝染性の強い呼吸系の疾病である。百日咳の症状としては，激しい咳および続く吸入フープ，時には嘔吐等の症状がある。極端な場合には，これらの症状は低酸素症，永久脳障害，さらには死亡につながる。大部分の症例（８０−９８％）は，小さいグラム陰性の細菌である百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）により引き起こされるが，一部（２−２０％）はパラ百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）により引き起こされる（非特許文献１）。パラ百日咳菌により引き起こされる百日咳の症状は，典型的には百日咳菌により引き起こされるものより軽いが，臨床兆候のみに基づく鑑別診断は困難である。さらに本邦においてはワクチン接種が行われているが、パラ百日咳菌に対しては無効である。 Pertussis is a highly contagious respiratory disease. Symptoms of whooping cough include severe cough and subsequent inhalation hoop, sometimes vomiting. In extreme cases, these symptoms can lead to hypoxia, permanent brain damage, and even death. Most cases (80-98%) are caused by a small gram-negative bacterium, Bordetella pertussis, while some (2-20%) are caused by Bordetella parapertussis (non-) Patent Document 1). Pertussis symptoms caused by Parapertussis are typically milder than those caused by Bordetella pertussis, but differential diagnosis based solely on clinical signs is difficult. Furthermore, although vaccination is carried out in Japan, it is ineffective against Parapertussis.
百日咳を初期に診断することは、兆候および症状が他の一般的呼吸器疾患である、風邪、インフルエンザ、または気管支炎と似ているため、非常に困難である。百日咳を決定的に診断するためには培養法が用いられている。患者の鼻および／または喉から粘液を採取し，培養に用いるが、百日咳菌の培養には，診断が得られるまでおよそ１週間を要する。また百日咳菌の培養は、その細菌の性質のため偽陰性の結果が生じやすい。 Early diagnosis of whooping cough is very difficult because the signs and symptoms are similar to other common respiratory illnesses such as cold, flu, or bronchitis. Culture methods are used to decisively diagnose pertussis. Mucus is collected from the patient's nose and / or throat and used for culture, but culture of Bordetella pertussis takes approximately one week before diagnosis is obtained. Also, Bordetella pertussis cultures are prone to false negative results due to the nature of the bacteria.
百日咳抗体あるいは抗原の測定も、百日咳感染を診断するために用いられている。最も一般的には，百日咳菌感染を示すために、百日咳毒素蛋白質の検出が用いられている。これらの抗体に基づくアッセイは良好な感度および特異度を有するが、非侵襲的に採取した粘膜サンプルではなく患者血液のサンプルを必要とし、さらに，感染が初期および／または回復期であることを必要とする。したがって，これらのアッセイは，疾病経過の適切な時に患者サンプルを取得しないと，偽陰性の結果を生じやすい。 Measurement of pertussis antibodies or antigens is also used to diagnose pertussis infection. Most commonly, detection of pertussis toxin protein is used to indicate pertussis infection. These antibody-based assays have good sensitivity and specificity, but require a sample of patient blood rather than a non-invasively collected mucosal sample, and require that the infection be in the early and / or convalescent phase And Therefore, these assays are prone to false negative results if patient samples are not taken at the appropriate time in the course of the disease.
百日咳感染を検出する他の方法には、種々の遺伝子検査法がある。しかしながら、百日咳菌とパラ百日咳菌を同時にかつ区別して検出された報告はなされていない。 Other methods for detecting pertussis infection include various genetic testing methods. However, there has been no report that detects pertussis and parapertussis simultaneously and separately.
本発明は，生物学的サンプルにおいて百日咳菌および／またはパラ百日咳菌の存在または非存在を判定するための組成物および方法を提供する。本発明は，単独で，または臨床症状または他の指標と組み合わせて、百日咳感染を診断するために用いることができる。詳細には，本発明は、百日咳菌またはパラ百日咳菌の同時検出を可能とする。 The present invention provides compositions and methods for determining the presence or absence of B. pertussis and / or B. pertussis in a biological sample. The present invention can be used alone or in combination with clinical symptoms or other indicators to diagnose pertussis infection. Specifically, the present invention allows the simultaneous detection of Bordetella pertussis or Bordetella parapertussis.
本発明者らは上記課題に鑑み鋭意検討した結果、百日咳菌のｐｔｘＡ領域とパラ百日咳菌のｐｔｘ ｐｓｕｅｄｏｇｅｎｅ領域を特異的に増幅する特定のオリゴヌクレオチドプライマー、および、該オリゴヌクレオチドプライマーを用いた核酸増幅法によって増幅される領域を特異的に検出する特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより、短時間で特異的に百日咳菌とパラ百日咳菌をそれぞれ、あるいは、同時に検出できることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は以下のような構成からなる。 As a result of intensive studies in view of the above problems, the present inventors have determined that a specific oligonucleotide primer specifically amplifies the ptxA region of Bordetella pertussis and the ptx pseudogene region of Bordetella pertussis, and nucleic acid amplification using the oligonucleotide primer. By using a specific oligonucleotide probe that specifically detects the region amplified by the method, it is found that pertussis and parapertussis can be detected individually or simultaneously in a short time, and the present invention is completed. It came to. That is, the present invention has the following configuration.
［１］試料中の百日咳菌および／またはパラ百日咳菌を検出する方法であって、以下の（Ａ）に示す工程により試料中の百日咳菌および／またはパラ百日咳菌由来の核酸を検出する手段を含むことを特徴とする、百日咳菌および／またはパラ百日咳菌の検出方法。
（Ａ）
（１）配列番号１と９５％以上相同な塩基配列で示される核酸配列のうち一部領域を核酸増幅するための核酸プライマー対であって、以下の（Ｉ）または（ＩＩ）のいずれか１つ以上に該当する核酸プライマー対を用意する工程。
（Ｉ）フォワードプライマーが、配列番号２で示される塩基配列のうち１６塩基以上３６塩基以下の塩基配列からなる核酸プライマーである。
（ＩＩ）リバースプライマーが、配列番号３で示される塩基配列のうち１６塩基以上３６塩基以下の塩基配列からなる核酸プライマーである。
（２）被検核酸および核酸プライマー対を含む反応液によって、被検核酸を増幅する工程。
（３）工程（２）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部と複合体を形成せしめるように設計された核酸プローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる工程。
（４）工程（３）で得られた複合体を検出する工程。
［２］
［１］に記載の百日咳菌および／またはパラ百日咳菌の検出方法において、工程（Ａ）（Ｉ）に記載のフォワードプライマーが配列番号４、５のいずれかで示される塩基配列である［１］に記載の百日咳菌および／またはパラ百日咳菌の検出方法。
［３］
［１］に記載の百日咳菌および／またはパラ百日咳菌の検出方法において、工程（Ａ）（ＩＩ）に記載のリバースプライマーが配列番号６、７のいずれかで示される塩基配列である［１］に記載の百日咳菌および／またはパラ百日咳菌の検出方法。
［４］
［１］〜［３］のいずれかに記載の百日咳菌および／またはパラ百日咳菌の検出方法において、工程（Ａ）に記載の核酸プローブが、配列番号８〜１７のいずれかに示される塩基配列からなる核酸プローブである、［１］〜［３］のいずれかに記載の百日咳菌および／またはパラ百日咳菌の検出方法。
［５］
［１］に記載の百日咳菌および／またはパラ百日咳菌の検出方法において、工程（Ａ）（Ｉ）に記載のフォワードプライマー、工程（Ａ）（ＩＩ）に記載のリバースプライマー、および、工程（Ａ）に記載の核酸プローブが、それぞれ以下の（ａ）〜（ｋ）のいずれかの塩基配列の組合せで示される、［１］に記載の百日咳菌および／またはパラ百日咳菌の検出方法。
（ａ）フォワードプライマーが配列番号４、リバースプライマーが配列番号６、プローブが配列番号８でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
（ｂ）フォワードプライマーが配列番号４、リバースプライマーが配列番号６、プローブが配列番号９でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
（ｃ）フォワードプライマーが配列番号５、リバースプライマーが配列番号７、プローブが配列番号１０でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
（ｄ）フォワードプライマーが配列番号４、リバースプライマーが配列番号６、プローブが配列番号１１でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
（ｅ）フォワードプライマーが配列番号５、リバースプライマーが配列番号７、プローブが配列番号１２でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
（ｆ）フォワードプライマーが配列番号４、リバースプライマーが配列番号６、プローブが配列番号１３でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
（ｇ）フォワードプライマーが配列番号５、リバースプライマーが配列番号７、プローブが配列番号１４でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
（ｈ）フォワードプライマーが配列番号４、リバースプライマーが配列番号６、プローブが配列番号１５でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
（ｉ）フォワードプライマーが配列番号５、リバースプライマーが配列番号７、プローブが配列番号１６でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
（ｊ）フォワードプライマーが配列番号４、リバースプライマーが配列番号６、プローブが配列番号１７でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
（ｋ）フォワードプライマーが配列番号５、リバースプライマーが配列番号７、プローブが配列番号１８でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
［６］
［５］に記載の核酸プローブが、末端のシトシンのうち少なくとも一つが蛍光色素で標識されている核酸プローブを用いることを特徴とする百日咳菌および／またはパラ百日咳菌の検出方法。
［７］
［１］〜［６］のいずれかに記載の百日咳菌および／またはパラ百日咳菌の検出方法において、核酸増幅を、α型ＤＮＡポリメラーゼ、および、α型ＤＮＡポリメラーゼを変異させた変異型、のうち１つ以上を含む系で行うことを特徴とする［１］〜［６］のいずれかに記載の百日咳菌および／またはパラ百日咳菌の検出方法。
［８］
配列番号２で示される塩基配列のうち１６塩基以上３６塩基以下の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号３で示される塩基配列のうち１６塩基以上３６塩基以下の塩基配列からなるリバースプライマーとからなる、１対のプライマー。
［９］
配列番号４、５のいずれかで示される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号６、７のいずれかで示される塩基配列からなるリバースプライマーとからなる、［８］に記載の、１対のプライマー。
［１０］
配列番号８〜１７のいずれかで示される塩基配列からなる、百日咳菌および／またはパラ百日咳菌を検出するためのプローブ。
［１１］
［８］または［９］に示される一対のプライマーと、［１０］に示されるプローブとを組み合わせてなる、百日咳菌および／またはパラ百日咳菌検出用のプライマー・プローブのセット。
［１２］
［６］〜［１１］のいずれかに記載のプライマー対、プローブまたはプライマー・プローブのセットを含む、百日咳菌および／またはパラ百日咳菌検出キット。
[1] A method for detecting Bordetella pertussis and / or Parapertussis in a sample, comprising: a means for detecting a nucleic acid derived from Bordetella pertussis and / or Parapertussis in a sample according to the step (A) below: A method for detecting Bordetella pertussis and / or Parapertussis, characterized by comprising:
(A)
(1) A nucleic acid primer pair for amplifying a partial region of a nucleic acid sequence represented by a nucleotide sequence 95% or more homologous to SEQ ID NO: 1, which is one of the following (I) or (II) Preparing a nucleic acid primer pair corresponding to one or more.
(I) The forward primer is a nucleic acid primer having a base sequence of 16 to 36 bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
(II) The reverse primer is a nucleic acid primer having a base sequence of 16 to 36 bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3.
(2) A step of amplifying a test nucleic acid with a reaction solution containing the test nucleic acid and a nucleic acid primer pair.
(3) A step of hybridizing the nucleic acid amplification product obtained in step (2) with a nucleic acid probe designed to form a complex with a part of the nucleic acid amplification product.
(4) A step of detecting the complex obtained in the step (3).
[2]
In the method for detecting Bordetella pertussis and / or Parapertussis according to [1], the forward primer according to steps (A) and (I) is the base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 4 and 5 [1]. 2. A method for detecting Bordetella pertussis and / or Parapertussis.
[3]
In the method for detecting Bordetella pertussis and / or Bordetella pertussis according to [1], the reverse primer according to step (A) (II) is the base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 6 and 7 [1]. 2. A method for detecting Bordetella pertussis and / or Parapertussis.
[4]
In the method for detecting Bordetella pertussis and / or Bordetella parapertussis according to any one of [1] to [3], the nucleic acid probe according to step (A) is a base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 8 to 17. The method for detecting Bordetella pertussis and / or Parapertussis according to any one of [1] to [3], which is a nucleic acid probe comprising:
[5]
In the method for detecting Bordetella pertussis and / or Bordetella pertussis according to [1], the forward primer according to step (A) (I), the reverse primer according to step (A) (II), and the step (A The method for detecting Bordetella pertussis and / or Parapertussis according to [1], wherein the nucleic acid probes according to (1) are each represented by a combination of any one of the following base sequences (a) to (k):
(A) Combination of nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 4, the forward primer is SEQ ID NO: 6, the probe is SEQ ID NO: 8, and (b) the forward primer is SEQ ID NO: 4, the reverse primer is SEQ ID NO: 6, and the probe is a sequence. Combination of base sequences represented by number 9 (c) Forward primer is SEQ ID NO: 5, reverse primer is SEQ ID NO: 7 and probe is a combination of base sequences represented by SEQ ID NO: 10 (d) Forward primer is SEQ ID NO: 4, Combination of nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 6 for reverse primer and SEQ ID NO: 11 for probe (e) Combination of nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 5 for forward primer, SEQ ID NO: 7 for reverse primer and SEQ ID NO: 12 for probe (F) A forward primer is arranged Combination of base sequences represented by SEQ ID NO: 6, reverse primer is SEQ ID NO: 6, probe is SEQ ID NO: 13 (g) forward primer is SEQ ID NO: 5, reverse primer is SEQ ID NO: 7, probe is SEQ ID NO: 14 Combination of sequences (h) Combination of base sequences represented by SEQ ID NO: 4, forward primer is SEQ ID NO: 6, and probe is SEQ ID NO: 15, respectively (i) Forward primer is SEQ ID NO: 5, reverse primer is SEQ ID NO: 7, Combination of base sequences represented by SEQ ID NO: 16 for the probe (j) Combination of base sequences represented by SEQ ID NO: 4 for the forward primer, SEQ ID NO: 6 for the reverse primer and SEQ ID NO: 17 for the probe (k) Sequence of the forward primer Number 5, reverse primer There SEQ ID NO: 7, a combination of nucleotide sequence to which the probe as shown in SEQ ID NO: 18 [6]
The method for detecting Bordetella pertussis and / or Parapertussis, wherein the nucleic acid probe according to [5] uses a nucleic acid probe in which at least one of cytosines at the end is labeled with a fluorescent dye.
[7]
In the detection method of Bordetella pertussis and / or Bordetella parapertussis according to any one of [1] to [6], nucleic acid amplification may be performed using α-type DNA polymerase and a mutant form obtained by mutating α-type DNA polymerase. The method for detecting Bordetella pertussis and / or Parapertussis according to any one of [1] to [6], wherein the method is performed in a system including one or more.
[8]
A forward primer consisting of a base sequence of 16 to 36 bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and a reverse primer consisting of a base sequence of 16 to 36 bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 A pair of primers.
[9]
The pair of pairs according to [8], comprising a forward primer composed of the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 4 and 5 and a reverse primer composed of the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 6 and 7. Primer.
[10]
A probe for detecting Bordetella pertussis and / or Parapertussis, comprising the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 8 to 17.
[11]
A set of primers and probes for detecting Bordetella pertussis and / or Bordetella parapertussis, which is a combination of the pair of primers shown in [8] or [9] and the probe shown in [10].
[12]
A kit for detecting Bordetella pertussis and / or Bordetella parapertussis comprising the primer pair, probe or primer-probe set according to any one of [6] to [11].
本発明によれば、百日咳菌および／またはパラ百日咳菌の検出を迅速、正確、安価に行うことができる。 According to the present invention, detection of Bordetella pertussis and / or Bordetella parapertussis can be performed quickly, accurately, and inexpensively.
本発明は百日咳菌および／またはパラ百日咳菌を検出するためのオリゴヌクレオチドプライマー（プライマー）およびオリゴヌクレオチドプローブ（プローブ）、ならびにこれらを用いて百日咳菌および／またはパラ百日咳菌を検出する方法、該方法を実施するためのキットに係る。 The present invention relates to oligonucleotide primers (primers) and oligonucleotide probes (probes) for detecting Bordetella pertussis and / or Parapertussis, and methods for detecting Bordetella pertussis and / or Parapertussis using these, and the method It relates to a kit for carrying out.
本発明では百日咳菌のｐｔｘＡ領域および／またはパラ百日咳菌のｐｔｘ ｐｓｅｕｄｏｇｅｎｅ領域を検出対象としている。百日咳菌のｐｔｘＡ領域の塩基配列を配列番号１に示す。 In the present invention, the ptxA region of Bordetella pertussis and / or the ptx pseudogene region of Bordetella pertussis is targeted for detection. The base sequence of the ptxA region of Bordetella pertussis is shown in SEQ ID NO: 1.
［プライマー］
本発明の百日咳菌および／またはパラ百日咳菌検出方法で用いるオリゴヌクレオチドプライマーとしては、配列番号１と９５％以上相同な塩基配列で示される核酸配列のうち一部領域を核酸増幅するための核酸プライマー対であって、以下の（Ｉ）または（ＩＩ）のいずれか１つ以上に該当する核酸プライマー対が例示される。
（Ｉ）フォワードプライマーが、配列番号２で示される塩基配列のうち１６塩基以上３６塩基以下の塩基配列からなる核酸プライマー。
（ＩＩ）リバースプライマーが、配列番号３で示される塩基配列のうち１６塩基以上３６塩基以下の塩基配列からなる核酸プライマー。
[Primer]
As an oligonucleotide primer used in the method for detecting Bordetella pertussis and / or Bordetella pertussis according to the present invention, a nucleic acid primer for amplifying a partial region of a nucleic acid sequence represented by a base sequence that is 95% or more homologous to SEQ ID NO: 1 A pair of nucleic acid primers corresponding to any one or more of the following (I) or (II) is exemplified.
(I) A nucleic acid primer whose forward primer has a base sequence of 16 to 36 bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
(II) A nucleic acid primer in which the reverse primer has a base sequence of 16 to 36 bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3.
上記の配列番号２は配列番号１で示される塩基配列の一部分である。また、配列番号３は配列番号１で示される塩基配列の相補配列の一部分である。 The above SEQ ID NO: 2 is a part of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 3 is a part of a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
上記（Ｉ）のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号２で示される塩基配列の中の連続する１６〜３６塩基のいずれかで示されるオリゴヌクレオチドプライマーであれば特に制限されない。好ましくは、配列番号４、５のいずれかで示される塩基配列からなる核酸プライマーが例示できる。上記より長い配列では検出対象の核酸配列が異なるため検出感度および特異性が低下する。 The oligonucleotide primer (I) is not particularly limited as long as it is an oligonucleotide primer represented by any of 16 to 36 bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2. Preferably, the nucleic acid primer which consists of a base sequence shown by either sequence number 4, 5 can be illustrated. For longer sequences, the nucleic acid sequence to be detected is different, so that detection sensitivity and specificity are lowered.
上記（ＩＩ）のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号３で示される塩基配列の中の連続する１６〜３６塩基のいずれかで示されるオリゴヌクレオチドプライマーであれば特に制限されない。好ましくは、配列番号６、７のいずれかで示される塩基配列からなる核酸プライマーが例示できる。上記より長い配列では検出対象の核酸配列が異なるため検出感度および特異性が低下する。 The oligonucleotide primer (II) is not particularly limited as long as it is an oligonucleotide primer represented by any one of 16 to 36 bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3. Preferably, the nucleic acid primer which consists of a base sequence shown by either sequence number 6 or 7 can be illustrated. For longer sequences, the nucleic acid sequence to be detected is different, so that detection sensitivity and specificity are lowered.
上記（Ｉ）および（ＩＩ）のプライマーの組合せ（セット）は、上記で説明した範囲内であれば、原則、任意であり特に限定されるものではないが、好ましいセットとして、フォワードプライマーが配列番号４で示される塩基配列であり、リバースプライマーが配列番号６で示される塩基配列である、一対のプライマー、または、フォワードプライマーが配列番号５で示される塩基配列であり、リバースプライマーが配列番号７で示される塩基配列である、一対のプライマーが例示できる。 The combinations (sets) of the primers (I) and (II) are in principle arbitrary and not particularly limited as long as they are within the range described above. 4 is a base sequence represented by SEQ ID NO: 6, a pair of primers or a forward primer is a base sequence represented by SEQ ID NO: 5, and a reverse primer is SEQ ID NO: 7. A pair of primers which are the base sequences shown can be illustrated.
［プローブ］
本発明の百日咳菌および／またはパラ百日咳菌検出方法で用いるオリゴヌクレオチドプローブ（プローブ）は、特に限定されないが、百日咳菌および／またはパラ百日咳菌の相同性が比較的高い領域が望ましい。望ましくは８０％以上、特に９０％以上の相同性を有する配列が望ましい。
[probe]
The oligonucleotide probe (probe) used in the method for detecting Bordetella pertussis and / or Parapertussis according to the present invention is not particularly limited, but a region having relatively high homology between Bordetella pertussis and / or Parapertussis is desirable. A sequence having a homology of 80% or more, particularly 90% or more is desirable.
上記のオリゴヌクレオチドプローブは、核酸が標識されていてもされていなくてもよい。標識される場合、標識される核酸の数に特に制限は無い。好ましくはオリゴヌクレオチドプローブの末端の核酸が標識されている形態であり、より好ましくは末端の核酸のうちどちらか片方のみが標識されている形態である。標識物質にも特に制限はないが、蛍光物質であることがより好ましい。蛍光標識としては特に標的核酸とのハイブリダイゼーション時に消光を生じる蛍光物質が好ましく、具体的には、フルオロセインまたはその誘導体（例えばフルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ））、ＢＯＤＩＰＹ（商標）シリーズ、ローダミンまたはその誘導体（例えば５−カルボキシローダミン６Ｇ（ＧＲ６Ｇ）やテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ））が例示できる。 The oligonucleotide probe described above may or may not be labeled with a nucleic acid. In the case of labeling, the number of nucleic acids to be labeled is not particularly limited. Preferably, the nucleic acid at the end of the oligonucleotide probe is labeled, and more preferably, only one of the terminal nucleic acids is labeled. The labeling substance is not particularly limited, but a fluorescent substance is more preferable. As the fluorescent label, a fluorescent substance that causes quenching upon hybridization with a target nucleic acid is particularly preferable. Specifically, fluorescein or a derivative thereof (for example, fluorescein isothiocyanate (FITC)), BODIPY (trademark) series, rhodamine or the like Derivatives (for example, 5-carboxyrhodamine 6G (GR6G) and tetramethylrhodamine (TAMRA)) can be exemplified.
［検出方法］
本発明の百日咳菌および／またはパラ百日咳菌検出方法において、試料中の百日咳菌および／またはパラ百日咳菌由来の核酸を検出する方法としては、以下の（１）〜（４）の工程を例示することができる。
（１）配列番号１と９５％以上相同な塩基配列で示される核酸配列のうち一部領域を核酸増幅するための核酸プライマー対であって、以下の（Ｉ）または（ＩＩ）のいずれか１つ以上に該当する核酸プライマー対を用意する工程。
（Ｉ）フォワードプライマーが、配列番号２で示される塩基配列のうち１６塩基以上３６塩基以下の塩基配列からなる核酸プライマーである。
（ＩＩ）リバースプライマーが、配列番号３で示される塩基配列のうち１６塩基以上３６塩基以下の塩基配列からなる核酸プライマーである。
（２）被検核酸および核酸プライマー対を含む反応液によって、被検核酸を増幅する工程。
（３）工程（２）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部と複合体を形成せしめるように設計された核酸プローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる工程。
（４）工程（３）で得られた複合体を検出する工程。
[Detection method]
In the method for detecting Bordetella pertussis and / or Bordetella pertussis according to the present invention, examples of the method for detecting nucleic acid derived from Bordetella pertussis and / or Bordetella parapertussis in a sample include the following steps (1) to (4). be able to.
(1) A nucleic acid primer pair for amplifying a partial region of a nucleic acid sequence represented by a nucleotide sequence 95% or more homologous to SEQ ID NO: 1, which is one of the following (I) or (II) Preparing a nucleic acid primer pair corresponding to one or more.
(I) The forward primer is a nucleic acid primer having a base sequence of 16 to 36 bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
(II) The reverse primer is a nucleic acid primer having a base sequence of 16 to 36 bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3.
(2) A step of amplifying a test nucleic acid with a reaction solution containing the test nucleic acid and a nucleic acid primer pair.
(3) A step of hybridizing the nucleic acid amplification product obtained in step (2) with a nucleic acid probe designed to form a complex with a part of the nucleic acid amplification product.
(4) A step of detecting the complex obtained in the step (3).
［被検核酸の増幅］
本発明における被検核酸は、例えば、一本鎖でもよいし、二本鎖でもよい。二本鎖の場合は、例えば、被検核酸とプローブとをハイブリダイズさせてハイブリッド体を形成するために、加熱により前記二本鎖を一本鎖に解離させる工程を含むことが好ましい。
[Amplification of test nucleic acid]
The test nucleic acid in the present invention may be, for example, a single strand or a double strand. In the case of a double strand, for example, it is preferable to include a step of dissociating the double strand into a single strand by heating in order to hybridize a test nucleic acid and a probe to form a hybrid.
前記被検核酸の種類としては、特に制限されないが、例えば、ＤＮＡや、トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ等があげられる。また、前記被検核酸は、例えば、クラミジアトラコマチスを寄生させた細胞培養試料や生体試料等の試料に含まれる核酸が挙げられる。 The type of the test nucleic acid is not particularly limited, and examples thereof include DNA, RNA such as total RNA and mRNA, and the like. Examples of the test nucleic acid include nucleic acids contained in a sample such as a cell culture sample or a biological sample in which Chlamydia trachomatis is parasitized.
前記生体試料としては、特に制限されないが、例えば、膿、胸水、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、血液などが挙げられる。試料の採取方法、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸の調製方法等は、制限されず、従来公知の方法が採用できる。 Although it does not restrict | limit especially as said biological sample, For example, pus, pleural effusion, throat wiping liquid, nasal cavity wiping liquid, blood etc. are mentioned. A method for collecting a sample, a method for preparing a nucleic acid such as DNA or RNA, and the like are not limited, and a conventionally known method can be employed.
続いて、単離したゲノムＤＮＡを鋳型として、上述のプライマー対を用いて、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって、検出目的の塩基部位を含む配列を増幅させる。なお、ＰＣＲ等の条件は、特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。 Subsequently, the isolated genomic DNA is used as a template to amplify a sequence including a base site to be detected by a nucleic acid amplification method such as PCR using the above-described primer pair. In addition, conditions, such as PCR, are not specifically limited, It can carry out by a conventionally well-known method.
本発明の百日咳菌および／またはパラ百日咳菌の検出方法における核酸の増幅工程に用いられる具体的な核酸増幅方法としては特に限定されず、適宜公知の方法を用いることができる。例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等があげられるが、ＰＣＲ法を用いることが好ましい。なお、これらの各方法において、増幅反応の条件は特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。核酸増幅方法としては、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ；Ｎａｔｕｒｅ 第３５０巻、第９１頁（１９９１年））、ＬＣＲ（国際公開８９／１２６９６号公報、特開平２−２９３４号公報）、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｓｅａｒｃｈ 第２０巻、第１６９１頁（１９９２年））、ＲＣＡ（国際公開９０／１０６９号公報）、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． 第３１巻、第３２７０頁（１９９３年））、ＬＡＭＰ（ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ：Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． 第４２巻：第１，９５６頁（２００４年））、ＩＣＡＮ（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ：Ｋｅｋｋａｋｕ． 第７８巻、第５３３頁（２００３年））などが挙げられる。 The specific nucleic acid amplification method used in the nucleic acid amplification step in the method for detecting Bordetella pertussis and / or Bordetella pertussis according to the present invention is not particularly limited, and a known method can be used as appropriate. For example, a PCR (Polymerase Chain Reaction) method, a NASBA (Nucleic acid sequence based amplification) method, a TMA (Transcribion-Mediated Amplification) method, a SDA (Strand Displacement Amplification) method, and a SDA (Strand Displacement Amplification method) are preferred. In each of these methods, the conditions for the amplification reaction are not particularly limited, and can be performed by a conventionally known method. Examples of nucleic acid amplification methods include PCR, NASBA (Nucleic acid sequence-based amplification method; Nature Vol. 350, page 91 (1991)), LCR (International Publication No. 89/12696, JP-A-2-2934), SDA (Strand Displacement Amplification: Nucleic acid research, Vol. 20, p. 1691 (1992)), RCA (International Publication No. 90/1069), TMA (Transcribion mediated amplification method. 3270 (1993)), LAMP (loop-mediated isot) Hermetic amplification method: J Clin Microbiol.Volume 42: 1,956 (2004)), ICAN (isothermal and primed primer of nucleic acid, Vol.3, 33) Etc.
なかでもＰＣＲ法は、試料核酸、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、一対のプライマー及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変性、アニーリング、伸長の３工程からなるサイクルを繰り返すことにより、上記一対のプライマーで挟まれる試料核酸の領域を指数関数的に増幅させる方法である。すなわち、変性工程で試料の核酸を変性し、続くアニーリング工程において各プライマーと、それぞれに相補的な一本鎖試料核酸上の領域とをハイブリダイズさせ、続く伸長工程で、各プライマーを起点としてＤＮＡポリメラーゼの働きにより鋳型となる各一本鎖試料核酸に相補的なＤＮＡ鎖を伸長させ、二本鎖ＤＮＡとする。この１サイクルにより、１本の二本鎖ＤＮＡが２本の二本鎖ＤＮＡに増幅される。従って、このサイクルをｎ回繰り返せば、理論上上記一対のプライマーで挟まれた試料ＤＮＡの領域は２ｎ倍に増幅される。増幅されたＤＮＡ領域は大量に存在するので、電気泳動等の方法により容易に検出できる。よって、遺伝子増幅法を用いれば、従来では検出不可能であった、極めて微量（１分子でも可）の試料核酸をも検出することが可能であり、最近非常に広く用いられている技術である。
増幅反応としては、最初の熱変形工程が８０〜１００℃で１０秒〜１５分、繰り返しの熱変形工程が８０〜１００℃で１〜３００秒、アニーリンクが４０〜８０℃で１〜３００秒、伸長反応工程が６０〜８５℃で１〜３００秒程度行い、この繰り返しを３０〜７０回繰り返しすことが好ましい。
In particular, the PCR method repeats a cycle consisting of three steps of denaturation, annealing, and extension in the presence of a sample nucleic acid, four types of deoxynucleoside triphosphates, a pair of primers, and a heat-resistant DNA polymerase. In this method, the region of the sample nucleic acid sandwiched between the primers is exponentially amplified. That is, the sample nucleic acid is denatured in the denaturation step, each primer is hybridized with a region on the single-stranded sample nucleic acid complementary to each in the subsequent annealing step, and DNA is started from each primer in the subsequent extension step. A DNA strand complementary to each single-stranded sample nucleic acid serving as a template is extended by the action of the polymerase to form double-stranded DNA. By this one cycle, one double-stranded DNA is amplified into two double-stranded DNAs. Therefore, if this cycle is repeated n times, the region of the sample DNA sandwiched between the pair of primers is theoretically amplified 2n times. Since the amplified DNA region exists in a large amount, it can be easily detected by a method such as electrophoresis. Therefore, if a gene amplification method is used, it is possible to detect even a very small amount of sample nucleic acid that could not be detected in the past (one molecule is acceptable), which is a very widely used technique recently. .
As the amplification reaction, the first heat deformation step is 80 to 100 ° C. for 10 seconds to 15 minutes, the repeated heat deformation step is 80 to 100 ° C. for 1 to 300 seconds, and the annealing link is 40 to 80 ° C. for 1 to 300 seconds. The elongation reaction step is preferably performed at 60 to 85 ° C. for about 1 to 300 seconds, and this repetition is preferably repeated 30 to 70 times.
核酸増幅にＰＣＲ法を用いる場合、ＤＮＡポリメラーゼには、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。その理由を以下に説明する。 When the PCR method is used for nucleic acid amplification, α-type DNA polymerase is preferably used as the DNA polymerase. The reason will be described below.
本発明のプローブが含まれる反応系で百日咳菌および／またはパラ百日咳菌の核酸配列を増幅する場合、核酸増幅工程中に該核酸プローブが試料の百日咳菌および／またはパラ百日咳菌核酸配列またはそれらの増幅産物と結合しうる。核酸増幅工程中に百日咳菌および／またはパラ百日咳菌の核酸配列と結合した該核酸プローブは、核酸プライマーとＤＮＡポリメラーゼによる核酸増幅反応を阻害する。 When a nucleic acid sequence of Bordetella pertussis and / or Parapertussis is amplified in a reaction system including the probe of the present invention, the nucleic acid probe may be used as a nucleic acid sequence of Bordetella pertussis and / or Parapertussis in a sample during the nucleic acid amplification step Can bind to amplified product. The nucleic acid probe bound to the nucleic acid sequence of Bordetella pertussis and / or Parapertussis during the nucleic acid amplification step inhibits the nucleic acid amplification reaction by the nucleic acid primer and the DNA polymerase.
Ｔａｑ ＤＮＡ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅなどＰｏｌＩ型のＤＮＡポリメラーゼは５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を持つことが知られている。この活性のため、核酸増幅反応中に鋳型となる百日咳菌および／またはパラ百日咳菌核酸配列と結合した核酸がある場合、該結合核酸はエキソヌクレアーゼ活性によって分解されてしまう。このため、反応系中の該核酸プローブが減少し核酸検出工程に問題が生じる可能性がある。従って、ＰｏｌＩ型ＤＮＡポリメラーゼを用いて本発明を実施することは好ましくない。 PolI type DNA polymerases such as Taq DNA Polymerase are known to have 5'-3 'exonuclease activity. Because of this activity, if there is a nucleic acid bound to a pertussis and / or parapertussis nucleic acid sequence as a template during the nucleic acid amplification reaction, the bound nucleic acid is degraded by exonuclease activity. For this reason, the nucleic acid probe in the reaction system may be reduced, causing a problem in the nucleic acid detection process. Therefore, it is not preferable to carry out the present invention using PolI type DNA polymerase.
他方、ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（超好熱始原菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１由来）などα型のＤＮＡポリメラーゼは５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を持たず、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を持つ。従って、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いれば上記問題を解決できるのみならず、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性により核酸増幅工程において高い正確性が発揮される。 On the other hand, α-type DNA polymerases such as KOD DNA Polymerase (derived from the hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakaraensis KOD1) do not have 5'-3 'exonuclease activity but have 3'-5' exonuclease activity. Therefore, the use of α-type DNA polymerase not only solves the above problem, but also exhibits high accuracy in the nucleic acid amplification step due to the 3′-5 ′ exonuclease activity.
通常、α型ＤＮＡポリメラーゼは３’→ ５’エキソヌクレアーゼ活性のため、核酸増幅速度はＰｏｌＩ型酵素と比較して低い傾向がある。しかし、ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅはα型ＤＮＡポリメラーゼでありながらＤＮＡ合成活性が高く１００塩基／秒以上のＤＮＡ合成速度を有し伸長効率が優れている。従って、本発明の実施にはα型ＤＮＡポリメラーゼの中でも、ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡製、商標）を用いることが好ましい。 Usually, α-type DNA polymerase has a 3 ′ → 5 ′ exonuclease activity, and therefore the nucleic acid amplification rate tends to be lower than that of PolI-type enzyme. However, although KOD DNA Polymerase is an α-type DNA polymerase, it has high DNA synthesis activity, has a DNA synthesis rate of 100 bases / second or more, and has excellent elongation efficiency. Therefore, it is preferable to use KOD DNA Polymerase (trade name, manufactured by Toyobo Co., Ltd.) among the α-type DNA polymerases for carrying out the present invention.
さらに、α型ＤＮＡポリメラーゼを変異させて１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を達成させた変異型、あるいは、野生型および／または変異型の組み合わせにより当該性能を達成させたＤＮＡポリメラーゼ組成物も、本発明の実施に適したＤＮＡポリメラーゼとして用いることができる。
例えば、上記ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ以外に、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ製、登録商標）、ＰｆｕＴｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ（アジレント・テクノロジー）なども利用できる。
In addition, a mutant type in which α-type DNA polymerase is mutated to achieve a deoxyribonucleic acid synthesis rate of 100 bases / second or more, or a DNA polymerase composition in which the performance is achieved by a combination of wild type and / or mutant type Can be used as a DNA polymerase suitable for the practice of the present invention.
For example, in addition to the above KOD DNA Polymerase, PrimeSTAR HS DNA polymerase (manufactured by Takara Bio Inc., registered trademark), PfuTurbo DNA polymerase (Agilent Technology) and the like can also be used.
［ＤＮＡ合成活性］
本明細書において、ＤＮＡ合成活性とは鋳型ＤＮＡにアニールされたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基にデオキシリボヌクレオシド５’−トリホスフェートのα−ホスフェートを共有結合せしめることにより、デオキシリボ核酸にデオキシリボヌクレオシド５’−モノホスフェートを鋳型依存的に導入する反応を触媒する活性をいう。
[DNA synthesis activity]
In this specification, DNA synthesis activity refers to deoxyribonucleic acid bound to deoxyribonucleic acid by covalently binding the deoxyribonucleoside 5′-triphosphate α-phosphate to the 3′-hydroxyl group of the oligonucleotide or polynucleotide annealed to the template DNA. The activity that catalyzes a reaction for introducing a nucleoside 5′-monophosphate in a template-dependent manner.
その活性測定法は、酵素活性が高い場合には、保存緩衝液でサンプルを希釈して測定を行う。本発明では、下記Ａ液２５μｌ、Ｂ液およびＣ液各５μｌおよび滅菌水１０μｌをエッペンドルフチューブに加えて攪拌混合した後、上記酵素液５μｌを加えて７５℃で１０分間反応する。その後、氷冷し、Ｅ液５０μｌ、Ｄ液１００μｌを加えて、攪拌後、さらに１０分間氷冷する。この液をガラスフィルター（ワットマンＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、Ｄ液及びエタノールで充分洗浄し、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、鋳型ＤＮＡへのヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性の１単位はこの条件下で３０分あたり１０ｎモルのヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量とする。
Ａ： ４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
１６ｍＭ 塩化マグネシウム
１５ｍＭ ジチオスレイトール
１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ
Ｂ： ２μｇ／μｌ 活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
Ｃ： １．５ｍＭ ｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ〔３Ｈ〕ｄＴＴＰ）
Ｄ： ２０％ トリクロロ酢酸（２ｍＭピロリン酸ナトリウム）
Ｅ： １μｇ／μｌ キャリアーＤＮＡ
When the enzyme activity is high, the activity is measured by diluting the sample with a storage buffer. In the present invention, 25 μl of the following A solution, 5 μl of each of B solution and C solution, and 10 μl of sterilized water are added to an Eppendorf tube and mixed with stirring. Then, 5 μl of the enzyme solution is added and reacted at 75 ° C. for 10 minutes. Thereafter, the mixture is ice-cooled, 50 μl of E solution and 100 μl of D solution are added, and after stirring, the mixture is further ice-cooled for 10 minutes. This solution is filtered through a glass filter (Whatman GF / C filter), thoroughly washed with solution D and ethanol, and the radioactivity of the filter is measured with a liquid scintillation counter (manufactured by Packard) to incorporate nucleotides into the template DNA. taking measurement. One unit of enzyme activity is the amount of enzyme that incorporates 10 nmol nucleotides per 30 minutes into the acid-insoluble fraction under these conditions.
A: 40 mM Tris-HCl (pH 7.5)
16 mM magnesium chloride 15 mM dithiothreitol 100 μg / ml BSA
B: 2 μg / μl activated calf thymus DNA
C: 1.5 mM dNTP (250 cpm / pmol [3H] dTTP)
D: 20% trichloroacetic acid (2 mM sodium pyrophosphate)
E: 1 μg / μl carrier DNA
［３’−５’エキソヌクレアーゼ活性］
本発明において、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性とは、ＤＮＡの３’末端領域を切除し、５’−モノヌクレオチドを遊離する活性をいう。
その活性測定法は、５０μｌの反応液（１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８ ａｔ ２５℃）， １０ｍＭ ＫＣｌ， ６ｍＭ 硫酸アンモニウム，１ｍＭ ＭｇＣｌ２， ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００， ０．００１％ ＢＳＡ，５ μｇ トリチウムラベルされた大腸菌ＤＮＡ）を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに分注し、ＤＮＡポリメラーゼを加える。７５℃で１０分間反応させた後、氷冷によって反応を停止し、次にキャリアーとして、０．１％のＢＳＡを５０μｌ加え、さらに１０％のトリクロロ酢酸、２％ピロリン酸ナトリウム溶液を１００μｌ加え混合する。氷上で１５分放置した後、１２，０００回転で１０分間遠心し沈殿を分離する。上清１００μｌの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、酸可溶性画分に遊離したヌクレオチド量を測定する。
[3′-5 ′ exonuclease activity]
In the present invention, the 3′-5 ′ exonuclease activity refers to the activity of excising the 3 ′ terminal region of DNA and releasing 5′-mononucleotide.
The activity was measured using 50 μl of a reaction solution (120 mM Tris-HCl (pH 8.8 at 25 ° C.), 10 mM KCl, 6 mM ammonium sulfate, 1 mM MgCl 2 , 0.1% Triton X-100, 0.001% BSA, 5 μg tritium-labeled E. coli DNA) is dispensed into a 1.5 ml Eppendorf tube and DNA polymerase is added. After reacting at 75 ° C. for 10 minutes, the reaction was stopped by cooling with ice, and then 50 μl of 0.1% BSA was added as a carrier, and then 100 μl of 10% trichloroacetic acid and 2% sodium pyrophosphate solution were added and mixed. To do. After leaving on ice for 15 minutes, the precipitate is separated by centrifugation at 12,000 rpm for 10 minutes. The radioactivity of 100 μl of the supernatant is measured with a liquid scintillation counter (manufactured by Packard), and the amount of nucleotide released in the acid-soluble fraction is measured.
［核酸増幅産物とプローブとの複合体形成］
本発明の百日咳菌および／またはパラ百日咳菌検出方法においては、上記で説明した被検核酸の増幅によって得られた増幅産物と、該核酸増幅産物の一部と複合体を形成せしめるように設計されたオリゴヌクレオチドプローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる。
[Complex formation of nucleic acid amplification product and probe]
The pertussis and / or parapertussis detection method of the present invention is designed to form a complex with the amplification product obtained by the amplification of the test nucleic acid described above and a part of the nucleic acid amplification product. The oligonucleotide probe is hybridized to form a complex.
核酸増幅産物を含む試料に核酸プローブを添加するタイミングは、特に制限されず、例えば、前述の核酸増幅反応前、核酸増幅反応途中および核酸増幅反応後のいずれに、増幅反応の反応系に添加してもよい。
中でも、増幅反応と、後述の検出反応とを連続的に行うことができるため、増幅反応前に添加することが好ましい。このように核酸増幅反応の前に前記プローブを添加する場合は、例えば、後述のように、その３’末端に、蛍光色素を付加したり、リン酸基を付加したりすることが好ましい。
The timing of adding a nucleic acid probe to a sample containing a nucleic acid amplification product is not particularly limited. For example, it may be added to the reaction system of the amplification reaction before, during or after the nucleic acid amplification reaction. May be.
Especially, since an amplification reaction and a detection reaction described later can be performed continuously, it is preferable to add them before the amplification reaction. Thus, when the probe is added before the nucleic acid amplification reaction, for example, as described later, it is preferable to add a fluorescent dye or a phosphate group to the 3 ′ end.
本発明において用いられる標識としては磁性体、電子伝達体、酵素、ビオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射性物質および発光団などがある。磁性体としては、酸化鉄、二酸化クロム、コバルト、フェライトなどが挙げられる。電子伝達体としては、フェロセン、ＰＱＱ、レドックス化合物が挙げられる。酵素としては、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。蛍光物質としては、例えば，Ｃｙ５（登録商標），Ｃｙ３（登録商標），ＦＩＴＣ，ローダミン，ランタニド蛍光体，テキサスレッド，ＦＡＭ，ＪＯＥ，Ｃａｌ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０（登録商標），Ｑｕａｓａｒ ６７０（登録商標）、放射性同位体（例えば，３２Ｐ，３５Ｓ，３Ｈ，１４Ｃ，１２５Ｉ，１３１Ｉ），高電子密度試薬（例えば金），酵素（例えば，西洋ワサビペルオキシダーゼ，ベータ−ガラクトシダーゼ，ルシフェラーゼ，アルカリホスファターゼ），比色標識（例えば金コロイド），磁気標識（例えば，Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）），ビオチン，ジゴキシゲニン，または抗血清またはモノクローナル抗体が利用可能なハプテンおよび蛋白質が挙げられる。他の標識としては，それぞれ対応するレセプターまたはオリゴヌクレオチド相補体と複合体を形成しうるリガンドまたはオリゴヌクレオチドが挙げられる。標識は，検出すべき核酸中に直接取り込ませてもよく，または検出すべき核酸にハイブリダイズまたは結合するプローブ（例えばオリゴヌクレオチド）または抗体に結合させてもよい。
好ましい検出可能な標識は蛍光標識である。本明細書において用いる場合，“蛍光標識”とは，特定の波長（励起周波数）の光を吸収し，次により長い波長（放射周波数）の光を放出する分子を表す。本明細書において用いる場合，“ドナー蛍光団”との用語は，消光剤成分と近接している場合に，放出エネルギーを消光剤に供与ないし移動させる蛍光団を意味する。消光剤成分にエネルギーを供与した結果，ドナー蛍光団それ自体は，近接して配置された消光剤成分が存在しない場合よりも少ない特定の放出周波数の光を放出する。
Examples of labels used in the present invention include magnetic substances, electron carriers, enzymes, biotin, fluorescent substances, haptens, antigens, antibodies, radioactive substances, and luminophores. Examples of the magnetic material include iron oxide, chromium dioxide, cobalt, and ferrite. Examples of electron carriers include ferrocene, PQQ, and redox compounds. Examples of the enzyme include alkaline phosphatase and peroxidase. Examples of the fluorescent substance include Cy5 (registered trademark), Cy3 (registered trademark), FITC, rhodamine, lanthanide phosphor, Texas Red, FAM, JOE, Cal Fluor Red 610 (registered trademark), Quasar 670 (registered trademark), Radioisotopes (eg 32P, 35S, 3H, 14C, 125I, 131I), high electron density reagents (eg gold), enzymes (eg horseradish peroxidase, beta-galactosidase, luciferase, alkaline phosphatase), colorimetric labels ( Examples include gold colloids), magnetic labels (eg, Dynabeads ™), biotin, digoxigenin, or haptens and proteins for which antisera or monoclonal antibodies are available. Other labels include ligands or oligonucleotides that can form complexes with the corresponding receptor or oligonucleotide complement, respectively. The label may be incorporated directly into the nucleic acid to be detected or may be bound to a probe (eg, oligonucleotide) or antibody that hybridizes or binds to the nucleic acid to be detected.
A preferred detectable label is a fluorescent label. As used herein, “fluorescent label” refers to a molecule that absorbs light of a specific wavelength (excitation frequency) and then emits light of a longer wavelength (radiation frequency). As used herein, the term “donor fluorophore” refers to a fluorophore that donates or transfers emitted energy to a quencher when in close proximity to the quencher component. As a result of providing energy to the quencher component, the donor fluorophore itself emits light at a specific emission frequency that is less than in the absence of a closely placed quencher component.
本明細書において用いる場合，“消光剤成分”との用語は，ドナー蛍光団の近傍に位置して，ドナーにより生成された放出エネルギーを取り込み，エネルギーを熱またはドナーの放出波長より長い波長の光として消散させる分子を意味する。後者の場合，消光剤はアクセプター蛍光団であると考えられる。消光成分は，近接（すなわち衝突）クエンチングにより，または蛍光共鳴エネルギー移動（“ＦＲＥＴ”）により作用する。 As used herein, the term “quencher component” is located in the vicinity of a donor fluorophore and captures the emission energy generated by the donor, which is heat or light with a wavelength longer than the emission wavelength of the donor. Means the molecule to dissipate as In the latter case, the quencher is considered to be an acceptor fluorophore. The quenching component works by proximity (ie collision) quenching or by fluorescence resonance energy transfer (“FRET”).
好適な蛍光成分としては，当該技術分野において知られる下記の蛍光団が挙げられる：４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸，アクリジンおよび誘導体（アクリジン，アクリジンイソチオシアネート），Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ），５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ），４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホネート（Ｌｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ ＶＳ），Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド，アントラニルアミド，ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）Ｒ−６Ｇ，ＢＯＰＩＰＹ（登録商標）５３０／５５０，ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ，ブリリアントイエロー，クマリンおよび誘導体（クマリン，７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ，クマリン１２０），７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（クマリン１５１）），Ｃｙ２（登録商標），Ｃｙ３（登録商標），Ｃｙ３．５（登録商標），Ｃｙ５（登録商標），Ｃｙ５．５（登録商標），シアノシン，４’，６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ），５’，５''−ジブロモピロガロール−スルホネフタレイン（Ｂｒｏｍｏｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ Ｒｅｄ），７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソシアナトフェニル）−４−メチルクマリン，ジエチレントリアミン四酢酸，４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸，４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸，塩化５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニル（ＤＮＳ，塩化ダンシル），４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ），４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ），Ｅｃｌｉｐｓｅ（商標）（Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．），エオシンおよび誘導体（エオシン，エオシンイソチオシアネート），エリスロシンおよび誘導体（エリスロシンＢ，エリスロシンイソチオシアネート），エチジウム，フルオレセインおよび誘導体（５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ），５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ），２’，７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ），フルオレセイン，フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ），ヘキサクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＨＥＸ），ＱＦＩＴＣ（ＸＲＩＴＣ），テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）），フルオレスカミン，ＩＲ１４４，ＩＲ１４４６，マラカイトグリーンイソチオシアネート，４−メチルウンベリフェロン，オルトクレゾールフタレイン，ニトロチロシン，パラローザニリン，フェノールレッド，Ｂ−フィコエリスリン，Ｒ−フィコエリスリン，ｏ−フタルジアルデヒド，Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（登録商標），ヨウ化プロピジウム，ピレンおよび誘導体（ピレン，酪酸ピレン，酪酸スクシンイミジル１−ピレン），ＱＳＹ（登録商標）７，ＱＳＹ（登録商標）９，ＱＳＹ（登録商標）２１，ＱＳＹ（登録商標）３５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ），リアクティブレッド４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ（登録商標）ブリリアントレッド３Ｂ−Ａ），ローダミンおよび誘導体（６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ），６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ），リサミンローダミンＢ塩化スルホニル，ローダミン（Ｒｈｏｄ），ローダミンＢ，ローダミン１２３，ローダミングリーン，ローダミンＸイソチオシアネート，スルホローダミンＢ，スルホローダミン１０１，スルホローダミン１０１の塩化スルホニル誘導体（テキサスレッド）），Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ），テトラメチルローダミン，テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ），リボフラビン，ロゾール酸，テルビウムキレート誘導体。 Suitable fluorescent components include the following fluorophores known in the art: 4-acetamido-4′-isothiocyanatostilbene-2,2′-disulfonic acid, acridine and derivatives (acridine, acridine isothiocyanate) ), Alexa Fluor (registered trademark) 350, Alexa Fluor (registered trademark) 488, Alexa Fluor (registered trademark) 546, Alexa Fluor (registered trademark) 555, Alexa Fluor (registered trademark) 568, Alexa Fluor (registered trademark) 594. Alexa Fluor® 647 (Molecular Probe), 5- (2′-aminoethyl) aminonaphthalene-1-sulfonic acid (EDANS), 4-amino-N- [3-vinylsulfonyl) phenyl ] Naphthalimide-3,5 disulfonate (Lucifer Yellow VS), N- (4-anilino-1-naphthyl) maleimide, anthranilamide, BODIPY (registered trademark) R-6G, BOPIPY (registered trademark) 530/550, BODIPY (Registered trademark) FL, brilliant yellow, coumarin and derivatives (coumarin, 7-amino-4-methylcoumarin (AMC, coumarin 120), 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin (coumarin 151)), Cy2 (registered trademark) ), Cy3 (registered trademark), Cy3.5 (registered trademark), Cy5 (registered trademark), Cy5.5 (registered trademark), cyanocin, 4 ', 6-diaminidino-2-phenylindole (DAPI), 5', 5 ″ -Dibromopyrogallol-sulfonephthalein (Bromo) chlorogal Red), 7-diethylamino-3- (4′-isocyanatophenyl) -4-methylcoumarin, diethylenetriaminetetraacetic acid, 4,4′-diisothiocyanatodihydro-stilbene-2,2′-disulfonic acid, 4 , 4′-Diisothiocyanatostilbene-2,2′-disulfonic acid, 5- [dimethylamino] naphthalene-1-sulfonyl chloride (DNS, dansyl chloride), 4- (4′-dimethylaminophenylazo) benzoic acid (DABCYL), 4-dimethylaminophenylazophenyl-4′-isothiocyanate (DABITC), Eclipse ™ (Epoch Biosciences Inc.), eosin and derivatives (eosin, eosin isothiocyanate), erythrosine and derivatives (erythro) B, erythrosine isothiocyanate), ethidium, fluorescein and derivatives (5-carboxyfluorescein (FAM), 5- (4,6-dichlorotriazin-2-yl) aminofluorescein (DTAF), 2 ', 7'-dimethoxy- 4'5'-dichloro-6-carboxyfluorescein (JOE), fluorescein, fluorescein isothiocyanate (FITC), hexachloro-6-carboxyfluorescein (HEX), QFITC (XRITC), tetrachlorofluorescein (TET)), fluorescamine , IR144, IR1446, malachite green isothiocyanate, 4-methylumbelliferone, orthocresolphthalein, nitrotyrosine, pararosaniline, phenol red, B-Phycoe Lithrin, R-phycoerythrin, o-phthaldialdehyde, Oregon Green (registered trademark), propidium iodide, pyrene and derivatives (pyrene, pyrene butyrate, succinimidyl butyrate 1-pyrene), QSY (registered trademark) 7, QSY ( (Registered trademark) 9, QSY (registered trademark) 21, QSY (registered trademark) 35 (Molecular Probe), Reactive Red 4 (Cibacron (registered trademark) Brilliant Red 3B-A), rhodamine and derivatives (6-carboxy-X- Rhodamine (ROX), 6-carboxyrhodamine (R6G), Lisamin rhodamine B sulfonyl chloride, rhodamine (Rhod), rhodamine B, rhodamine 123, rhodamine green, rhodamine X isothiocyanate, sulforhodamine B, sulfolo -Damine 101, sulfonyl chloride derivative of sulforhodamine 101 (Texas Red)), N, N, N ′, N′-tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA), tetramethylrhodamine, tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC), Riboflavin, rosoleic acid, terbium chelate derivatives.
適当な消光剤は，特定の蛍光団の蛍光スペクトルに基づいて選択する。有用な消光剤としては，例えば，ｔｈｅ Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ（商標）消光剤であるＢＨＱ−１，ＢＨＱ−２，およびＢＨＱ−３（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．），およびＡＴＴＯシリーズの消光剤（ＡＴＴＯ５４０Ｑ，ＡＴＴＯ５８０Ｑ，およびＡＴＴＯ６１２Ｑ；Ａｔｔｏ−ＴｅｃＧｍｂＨ）が挙げられる。 A suitable quencher is selected based on the fluorescence spectrum of the particular fluorophore. Useful quenchers include, for example, the Black Hole ™ quenchers BHQ-1, BHQ-2, and BHQ-3 (Biosearch Technologies, Inc.), and ATTO series quenchers (ATTO540Q, ATTO580Q, And ATTO612Q; Atto-TecGmbH).
検出可能な標識は，核酸中に取り込ませるか，会合させるか，またはコンジュゲートさせることができる。標識は，種々の長さのスペーサーアームにより結合させて，立体傷害または他の有用なまたは望ましい特性に与える影響を低減させることができる。例えば，Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ，９ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ １４５−１５６（１９９５）を参照。
ハプテンとしては、ビオチン、ジゴキシゲニンなどが挙げられる。放射性物質としては、
３２Ｐ、３５Ｓなどが挙げられる。発光団としては、ルテニウム、エクオリンなどが挙げられる。該標識は、核酸検出反応に影響を与えることがなければなにを用いても良い。また反応に影響がなければオリゴヌクレオチドのどの位置に結合させてもよい。好ましくは、３’末端、５’末端部位である。
The detectable label can be incorporated into, associated with, or conjugated to the nucleic acid. The label can be attached by spacer arms of various lengths to reduce the effect on steric injury or other useful or desirable properties. For example, Mansfield, 9 Mol. Cell. See Probes 145-156 (1995).
Examples of haptens include biotin and digoxigenin. As radioactive material,
32 P, 35 S, etc. are mentioned. Examples of luminophores include ruthenium and aequorin. Any label that does not affect the nucleic acid detection reaction may be used. If it does not affect the reaction, it may be bound to any position of the oligonucleotide. The 3 ′ end and 5 ′ end sites are preferred.
前記プローブは、核酸増幅産物を含む液体試料に添加してもよいし、溶媒中で核酸増幅産物と混合してもよい。前記溶媒としては、特に制限されず、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール、有機溶媒等、従来公知のものがあげられる。反応液の調整の方法としては、具体的には、反応液２５μｌあたり、オリゴヌクレオチドが０．５〜５０ｐｍｏｌ、×１０の緩衝液が０．５〜５０μｌ、２ｍＭのｄＮＴＰで０．５〜５０μｌ、塩類が２５ｍＭ濃度液で０．１〜３０μｌ、ＤＮＡポリメラーゼが０．１〜３０ｎｇ程度であることが好ましい。 The probe may be added to a liquid sample containing a nucleic acid amplification product, or may be mixed with a nucleic acid amplification product in a solvent. The solvent is not particularly limited, and examples thereof include conventionally known solvents such as a buffer solution such as Tris-HCl, KCl, MgCl 2 , MgSO 4 , glycerol, and an organic solvent. As a method for preparing the reaction solution, specifically, 0.5 to 50 pmol of oligonucleotide, 0.5 to 50 μl of x10 buffer solution to 0.5 to 50 μl of 2 mM dNTP per 25 μl of reaction solution, It is preferable that the salt is 0.1 to 30 μl in a 25 mM concentration solution and the DNA polymerase is about 0.1 to 30 ng.
検出方法としては、具体例として、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ（例えば、グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発しているが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。他方、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発していないが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光を発するようになる。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。 As a detection method, as a specific example, when a labeled probe (for example, a guanine quenching probe) that shows a signal alone and does not show a signal by hybridization, a single-stranded DNA and the probe are dissociated. In FIG. 1, fluorescence is emitted, but when a hybrid is formed due to a decrease in temperature, the fluorescence is reduced (or quenched). Therefore, for example, the temperature of the reaction solution may be gradually decreased to measure the decrease in fluorescence intensity accompanying the temperature decrease. On the other hand, when a labeled probe that does not show a signal alone and shows a signal by hybridization, it does not emit fluorescence when the single-stranded DNA and the probe are dissociated, but the hybrid is not released due to a decrease in temperature. Once formed, it will fluoresce. Therefore, for example, the temperature of the reaction solution may be gradually lowered and the increase in fluorescence intensity accompanying the temperature drop may be measured.
前記解離工程における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されないが、例えば、８５〜１００℃である。加熱時間も特に制限されないが、通常、１秒〜２０分であり、好ましくは１秒〜１０分である。 The heating temperature in the dissociation step is not particularly limited as long as the amplification product can be dissociated, and is, for example, 85 to 100 ° C. The heating time is not particularly limited, but is usually 1 second to 20 minutes, preferably 1 second to 10 minutes.
また、解離した一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件としては、例えば、３５〜５０℃である。 The dissociated single-stranded DNA and the labeled probe can be hybridized, for example, by lowering the heating temperature in the dissociation step after the dissociation step. As temperature conditions, it is 35-50 degreeC, for example.
ハイブリダイズ工程の反応系（反応系）における各組成の体積や濃度は、特に制限されない。具体例としては、前記反応系において、ＤＮＡの濃度は、例えば、０．０１〜１００μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．１〜１０μｍｏｌ／Ｌ、前記標識化プローブの濃度は、例えば、前記ＤＮＡに対する添加割合を満たす範囲が好ましく、例えば、０．０１〜１００μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．０１〜１０μｍｏｌ／Ｌである。 The volume and concentration of each composition in the reaction system (reaction system) of the hybridization process are not particularly limited. As a specific example, in the reaction system, the concentration of DNA is, for example, 0.01-100 μmol / L, preferably 0.1-10 μmol / L, and the concentration of the labeled probe is, for example, relative to the DNA A range satisfying the addition ratio is preferable, for example, 0.01 to 100 μmol / L, and preferably 0.01 to 10 μmol / L.
蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温〜８５℃であり、好ましくは２５〜７０℃であり、終了温度は、例えば、４０〜１０５℃である。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、０．０５〜２０℃／秒であり、好ましくは０．０８〜１０℃／秒である。 The temperature range for measuring the fluctuation of the fluorescence intensity is not particularly limited. For example, the start temperature is room temperature to 85 ° C, preferably 25 to 70 ° C, and the end temperature is 40 to 105 ° C, for example. is there. Moreover, the rate of temperature increase is not particularly limited, but is, for example, 0.05 to 20 ° C./second, and preferably 0.08 to 10 ° C./second.
また、本発明においては、目的の塩基部位における遺伝子型の決定のために、前記シグナルの変動を解析してＴｍ（ｍｅｌｔｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）値として決定してもよい。 In the present invention, in order to determine the genotype at the target base site, the signal variation may be analyzed and determined as a Tm (melting temperature) value.
プライマー、プローブ、検出キット
本発明はまた、上記で説明した百日咳菌および／またはパラ百日咳菌を検出するための方法において用いるプライマー対、プローブまたは該プライマーと該プローブとを組合せたセットに関する。
Primer, probe, detection kit The present invention also provides a primer pair used in the method for detecting Bordetella pertussis and / or Parapertussis described above, a probe, or a combination of the primer and the probe About.
本発明はさらに、これらのプライマー対、プローブまたはプライマー・プローブのセットを含む、百日咳菌および／またはパラ百日咳菌検出キットに関する。
本発明のキットは、その構成において、プライマー対、プローブまたはプライマー・プローブのセット以外については特に限定されない。たとえばＰＣＲ法など公知の方法において、プライマーおよび／またはプローブとして上記のものを適用すればよい。
The present invention further relates to a Bordetella pertussis and / or Parapertussis detection kit comprising these primer pairs, probes or primer-probe sets.
The kit of the present invention is not particularly limited except for the primer pair, the probe or the primer / probe set. For example, in the known methods such as the PCR method, the above may be applied as primers and / or probes.
以下実施例をもって本発明を具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。 The present invention will be specifically described below with reference to examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
実施例１ 百日咳菌の検出
＜百日咳菌を検出するオリゴヌクレオチドの合成＞
パーキンエルマー社製ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号４、６、８に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ４、６、８と示す）を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で５５℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社ＯＰＣカラムにて実施した。もしくはＤＮＡ合成受託会社（（株）日本バイオサービス、シグマジェノシス（株）等）に依頼した。
オリゴ４はセンス鎖であり、オリゴ６がアンチセンス鎖であり組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。オリゴ８はプローブとして使用され、3’末端は蛍光標識される。
Example 1 Detection of Bordetella pertussis <Synthesis of oligonucleotide detecting Bordetella pertussis>
Oligonucleotides having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 4, 6, and 8 (hereinafter referred to as oligos 4, 6, and 8) were synthesized by the phosphoramidite method using a DNA synthesizer type 392 manufactured by PerkinElmer. The synthesis was carried out according to the manual, and the deprotection of various oligonucleotides was carried out with ammonia water at 55 ° C. overnight. Oligonucleotide purification was carried out on a Perkin Elmer OPC column. Alternatively, it was commissioned to a DNA synthesis contractor (Nippon Bio Service, Sigma Genosys, etc.).
Oligo 4 is a sense strand, and oligo 6 is an antisense strand, which are used in combination as an oligonucleotide for an amplification reaction. Oligo 8 is used as a probe and the 3 ′ end is fluorescently labeled.
百日咳菌の検出
＜ＰＣＲ法による増幅反応＞
百日咳菌より抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件により百日咳菌を検出した。
Detection of Bordetella pertussis
<Amplification reaction by PCR method>
Using a DNA solution extracted from Bordetella pertussis as a sample, the following reagents were added, and Bordetella pertussis was detected under the following conditions.
＜試薬＞
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ ０．５Ｕ
オリゴ４ ５ｐｍｏｌ、
オリゴ６ ５０ ｐｍｏｌ、
オリゴ８（３’末端をＦＩＴＣにより標識） ５ｐｍｏｌ、
×１０緩衝液（ＫＯＤ plus ver.2用） １μｌ、
２ｍＭ ｄＮＴＰ １μｌ、
２５ｍＭ ＭｇＳＯ４ ２μｌ、
抽出ＤＮＡ溶液 １００ｎｇ
<Reagent>
A 10 μl solution containing the following reagents was prepared.
KOD plus DNA polymerase 0.5U
Oligo 4 5 pmol,
Oligo 6 50 pmol,
Oligo 8 (3 ′ end labeled with FITC) 5 pmol,
× 10 buffer (for KOD plus ver.2) 1 μl,
1 μl of 2 mM dNTP,
2 μl of 25 mM MgSO4,
Extracted DNA solution 100ng
＜増幅条件＞
９４℃・３０秒、
９７℃・１秒、
５８℃・３秒、
６３℃・５秒（５０サイクル）
４０℃・３０秒
４０℃から７５℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は０．０９℃／秒
<Amplification conditions>
94 ° C, 30 seconds,
97 ℃ for 1 second,
58 ℃, 3 seconds,
63 ° C for 5 seconds (50 cycles)
Detect fluorescence while increasing the temperature from 40 ° C to 75 ° C for 40 ° C for 30 seconds. Temperature rise rate is 0.09 ° C / sec
＜融解曲線解析による検出＞
融解温度解析の結果、−ｄＦ（蛍光強度変化量）／ｄＴ（温度変化量）の最も大きな値を示す温度（Ｔｍ）は、６５℃付近を示し、その時の蛍光強度変化量は下記表１および図１の通りであった。
<Detection by melting curve analysis>
As a result of the melting temperature analysis, the temperature (Tm) showing the largest value of −dF (fluorescence intensity change amount) / dT (temperature change amount) shows around 65 ° C., and the fluorescence intensity change amount at that time is shown in Table 1 and It was as FIG.
図１のグラフから、百日咳菌ゲノムの存在する場合には、明らかなピークが得られることが確認された。
本検出系において、検出まで要する時間が６０分以内であった。
From the graph of FIG. 1, it was confirmed that a clear peak was obtained when the Bordetella pertussis genome was present.
In this detection system, the time required for detection was within 60 minutes.
実施例２ パラ百日咳菌の検出
＜ＰＣＲ法による増幅反応＞
パラ百日咳菌より抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりパラ百日咳菌を検出した。
Example 2 Detection of Parapertussis <Amplification Reaction by PCR>
Using the DNA solution extracted from Parapertussis as a sample, the following reagents were added, and Parapertussis was detected under the following conditions.
＜試薬＞
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ ０．５Ｕ
オリゴ４ ５ｐｍｏｌ、
オリゴ６ ５０ ｐｍｏｌ、
オリゴ８（３’末端をＦＩＴＣにより標識） ５ｐｍｏｌ、
×１０緩衝液（ＫＯＤ plus ver.2用） １μｌ、
２ｍＭ ｄＮＴＰ １μｌ、
２５ｍＭ ＭｇＳＯ４ ２μｌ、
抽出ＤＮＡ溶液 １００ｎｇ
<Reagent>
A 10 μl solution containing the following reagents was prepared.
KOD plus DNA polymerase 0.5U
Oligo 4 5 pmol,
Oligo 6 50 pmol,
Oligo 8 (3 ′ end labeled with FITC) 5 pmol,
× 10 buffer (for KOD plus ver.2) 1 μl,
1 μl of 2 mM dNTP,
2 μl of 25 mM MgSO4,
Extracted DNA solution 100ng
＜増幅条件＞
９４℃・３０秒、
９７℃・１秒、
５８℃・３秒、
６３℃・５秒（５０サイクル）
４０℃・３０秒
４０℃から７５℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は０．２℃／秒
<Amplification conditions>
94 ° C, 30 seconds,
97 ℃ for 1 second,
58 ℃, 3 seconds,
63 ° C for 5 seconds (50 cycles)
Detect fluorescence while increasing the temperature from 40 ° C to 75 ° C for 40 ° C for 30 seconds. Temperature rise rate is 0.2 ° C / second
＜融解曲線解析による検出＞
融解温度解析の結果、−ｄＦ（蛍光強度変化量）／ｄＴ（温度変化量）の最も大きな値を示す温度（Ｔｍ）は、６５℃付近を示し、その時の蛍光強度変化量は下記表２および図２の通りであった。
<Detection by melting curve analysis>
As a result of the melting temperature analysis, the temperature (Tm) showing the largest value of -dF (fluorescence intensity change amount) / dT (temperature change amount) shows around 65 ° C., and the fluorescence intensity change amount at that time is shown in Table 2 and It was as FIG.
図２のグラフから、パラ百日咳菌ゲノムの存在する場合には、百日咳菌ゲノム検出時とは異なる温度にピークが得られることが確認された。
本検出系において、検出まで要する時間が６０分以内であった。
From the graph of FIG. 2, it was confirmed that when a Bordetella parapertussis genome is present, a peak is obtained at a temperature different from that at the detection of Bordetella pertussis genome.
In this detection system, the time required for detection was within 60 minutes.
実施例３ 百日咳菌の検出
＜百日咳菌を検出するオリゴヌクレオチドの合成＞
パーキンエルマー社製ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号４、６、９に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ４、６、９と示す）を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で５５℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社ＯＰＣカラムにて実施した。もしくはＤＮＡ合成受託会社（（株）日本バイオサービス、シグマジェノシス（株）等）に依頼した。
オリゴ４はセンス鎖であり、オリゴ６がアンチセンス鎖であり組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。オリゴ９はプローブとして使用され、３’末端は蛍光標識される。
Example 3 Detection of Bordetella pertussis <Synthesis of oligonucleotide for detecting Bordetella pertussis>
Oligonucleotides having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 4, 6, and 9 (hereinafter referred to as oligos 4, 6, and 9) were synthesized by a phosphoramidite method using a DNA synthesizer type 392 manufactured by PerkinElmer. The synthesis was carried out according to the manual, and the deprotection of various oligonucleotides was carried out with ammonia water at 55 ° C. overnight. Oligonucleotide purification was carried out on a Perkin Elmer OPC column. Alternatively, it was commissioned to a DNA synthesis contractor (Nippon Bio Service, Sigma Genosys, etc.).
Oligo 4 is a sense strand, and oligo 6 is an antisense strand, which are used in combination as an oligonucleotide for an amplification reaction. Oligo 9 is used as a probe and the 3 ′ end is fluorescently labeled.
（１）百日咳菌に由来する核酸のＰＣＲ法による増幅
＜ＰＣＲ法による増幅反応＞
百日咳菌より抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件により百日咳菌を検出した。
(1) Amplification of nucleic acid derived from Bordetella pertussis by PCR method
<Amplification reaction by PCR method>
Using a DNA solution extracted from Bordetella pertussis as a sample, the following reagents were added, and Bordetella pertussis was detected under the following conditions.
＜試薬＞
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ ０．５Ｕ
オリゴ４ ５ｐｍｏｌ、
オリゴ６ １５ ｐｍｏｌ、
オリゴ９（３’末端をＦＩＴＣにより標識） ５ｐｍｏｌ、
×１０緩衝液（ＫＯＤ plus ver.2用） １μｌ、
２ｍＭ ｄＮＴＰ １μｌ、
２５ｍＭ ＭｇＳＯ４ ２μｌ、
抽出ＤＮＡ溶液 １００ｎｇ（ｏｒ 蒸留水）
<Reagent>
A 10 μl solution containing the following reagents was prepared.
KOD plus DNA polymerase 0.5U
Oligo 4 5 pmol,
Oligo 6 15 pmol,
Oligo 9 (3 ′ end labeled with FITC) 5 pmol,
× 10 buffer (for KOD plus ver.2) 1 μl,
1 μl of 2 mM dNTP,
2 μl of 25 mM MgSO4,
Extracted DNA solution 100ng (or distilled water)
＜増幅条件＞
９４℃・３０秒、
９７℃・１秒、
５８℃・３秒、
６３℃・５秒（５０サイクル）
４０℃・３０秒
４０℃から７５℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は０．２℃／秒
<Amplification conditions>
94 ° C, 30 seconds,
97 ℃ for 1 second,
58 ℃, 3 seconds,
63 ° C for 5 seconds (50 cycles)
Detect fluorescence while increasing the temperature from 40 ° C to 75 ° C for 40 ° C for 30 seconds. Temperature rise rate is 0.2 ° C / second
＜融解曲線解析による検出＞
融解曲線解析結果 抽出ＤＮＡを用いた場合 ６５．１℃付近にピークが認められたが、抽出ＤＮＡがない場合は、ピークは認められなかった。
<Detection by melting curve analysis>
Melting curve analysis results When extracted DNA was used, a peak was observed around 65.1 ° C., but no peak was observed when there was no extracted DNA.
（２）パラ百日咳菌に由来する核酸のＰＣＲ法による増幅
＜ＰＣＲ法による増幅反応＞
パラ百日咳菌より抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりパラ百日咳菌を検出した。
(2) Amplification of nucleic acid derived from Parapertussis by PCR <Amplification reaction by PCR>
Using the DNA solution extracted from Parapertussis as a sample, the following reagents were added, and Parapertussis was detected under the following conditions.
＜試薬＞
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ ０．５Ｕ
オリゴ４ ５ｐｍｏｌ、
オリゴ６ １５ ｐｍｏｌ、
オリゴ９（３’末端をＦＩＴＣにより標識） ５ｐｍｏｌ、
×１０緩衝液（ＫＯＤ plus ver.2用） １μｌ、
２ｍＭ ｄＮＴＰ １μｌ、
２５ｍＭ ＭｇＳＯ４ ２μｌ、
抽出ＤＮＡ溶液 １００ｎｇ（ｏｒ 蒸留水）
<Reagent>
A 10 μl solution containing the following reagents was prepared.
KOD plus DNA polymerase 0.5U
Oligo 4 5 pmol,
Oligo 6 15 pmol,
Oligo 9 (3 ′ end labeled with FITC) 5 pmol,
× 10 buffer (for KOD plus ver.2) 1 μl,
1 μl of 2 mM dNTP,
2 μl of 25 mM MgSO4,
Extracted DNA solution 100ng (or distilled water)
＜増幅条件＞
９４℃・３０秒、
９７℃・１秒、
５８℃・３秒、
６３℃・５秒（５０サイクル）
４０℃・３０秒
４０℃から７５℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は０．２℃／秒
<Amplification conditions>
94 ° C, 30 seconds,
97 ℃ for 1 second,
58 ℃, 3 seconds,
63 ° C for 5 seconds (50 cycles)
Detect fluorescence while increasing the temperature from 40 ° C to 75 ° C for 40 ° C for 30 seconds. Temperature rise rate is 0.2 ° C / second
＜融解曲線解析による検出＞
融解曲線解析結果 抽出ＤＮＡを用いた場合 ５８．℃付近にピークが認められたが、抽出ＤＮＡがない場合は、ピークは認められなかった。
<Detection by melting curve analysis>
Results of melting curve analysis When extracted DNA is used 58. A peak was observed at around 0 ° C., but no peak was observed when there was no extracted DNA.
実施例４
（１）百日咳菌に由来する核酸のＰＣＲ法による増幅
＜ＰＣＲ法による増幅反応＞
百日咳菌より抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件により百日咳菌を検出した。
Example 4
(1) Amplification of nucleic acid derived from Bordetella pertussis by PCR method
<Amplification reaction by PCR method>
Using a DNA solution extracted from Bordetella pertussis as a sample, the following reagents were added, and Bordetella pertussis was detected under the following conditions.
＜試薬＞
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ ０．５Ｕ
オリゴ５ ５ｐｍｏｌ、
オリゴ７ １５ ｐｍｏｌ、
オリゴ１０（３’末端をＦＩＴＣにより標識） ５ｐｍｏｌ、
×１０緩衝液（KOD plus ver.2用） １μｌ、
２ｍＭ ｄＮＴＰ １μｌ、
２５ｍＭ ＭｇＳＯ４ ２μｌ、
抽出ＤＮＡ溶液 １００ｎｇ（ｏｒ 蒸留水）
<Reagent>
A 10 μl solution containing the following reagents was prepared.
KOD plus DNA polymerase 0.5U
Oligo 5 5 pmol,
Oligo 7 15 pmol,
Oligo 10 (3 ′ end labeled with FITC) 5 pmol,
× 10 buffer (for KOD plus ver.2) 1 μl,
1 μl of 2 mM dNTP,
2 μl of 25 mM MgSO4,
Extracted DNA solution 100ng (or distilled water)
＜増幅条件＞
９４℃・３０秒、
９７℃・１秒、
５８℃・３秒、
６３℃・５秒（５０サイクル）
４０℃・３０秒
４０℃から７５℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は０．２℃／秒
<Amplification conditions>
94 ° C, 30 seconds,
97 ℃ for 1 second,
58 ℃, 3 seconds,
63 ° C for 5 seconds (50 cycles)
Detect fluorescence while increasing the temperature from 40 ° C to 75 ° C for 40 ° C for 30 seconds. Temperature rise rate is 0.2 ° C / second
＜融解曲線解析による検出＞
融解曲線解析結果 抽出ＤＮＡを用いた場合 ６４℃付近にピークが認められたが、抽出ＤＮＡがない場合は、ピークは認められなかった。
<Detection by melting curve analysis>
Results of melting curve analysis When extracted DNA was used, a peak was observed at around 64 ° C., but no peak was observed when there was no extracted DNA.
（２）パラ百日咳菌に由来する核酸のＰＣＲ法による増幅
＜ＰＣＲ法による増幅反応＞
パラ百日咳菌より抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりパラ百日咳菌を検出した。
(2) Amplification of nucleic acid derived from Parapertussis by PCR method
<Amplification reaction by PCR method>
Using the DNA solution extracted from Parapertussis as a sample, the following reagents were added, and Parapertussis was detected under the following conditions.
＜試薬＞
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ ０．５Ｕ
オリゴ５ ５ｐｍｏｌ、
オリゴ７ １５ ｐｍｏｌ、
オリゴ１０（３’末端をＦＩＴＣにより標識） ５ｐｍｏｌ、
×１０緩衝液（KOD plus ver.2用） １μｌ、
２ｍＭ ｄＮＴＰ １μｌ、
２５ｍＭ ＭｇＳＯ４ ２μｌ、
抽出ＤＮＡ溶液 １００ｎｇ（ｏｒ 蒸留水）
<Reagent>
A 10 μl solution containing the following reagents was prepared.
KOD plus DNA polymerase 0.5U
Oligo 5 5 pmol,
Oligo 7 15 pmol,
Oligo 10 (3 ′ end labeled with FITC) 5 pmol,
× 10 buffer (for KOD plus ver.2) 1 μl,
1 μl of 2 mM dNTP,
2 μl of 25 mM MgSO4,
Extracted DNA solution 100ng (or distilled water)
＜増幅条件＞
９４℃・３０秒、
９７℃・１秒、
５８℃・３秒、
６３℃・５秒（５０サイクル）
４０℃・３０秒
４０℃から７５℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は０．２℃／秒
<Amplification conditions>
94 ° C, 30 seconds,
97 ℃ for 1 second,
58 ℃, 3 seconds,
63 ° C for 5 seconds (50 cycles)
Detect fluorescence while increasing the temperature from 40 ° C to 75 ° C for 40 ° C for 30 seconds. Temperature rise rate is 0.2 ° C / second
＜融解曲線解析による検出＞
融解曲線解析結果 抽出ＤＮＡを用いた場合 ５７．℃付近にピークが認められたが、抽出ＤＮＡがない場合は、ピークは認められなかった。
<Detection by melting curve analysis>
Melting curve analysis results When extracted DNA is used 57. A peak was observed at around 0 ° C., but no peak was observed when there was no extracted DNA.
実施例５
（１）百日咳菌に由来する核酸のＰＣＲ法による増幅
＜ＰＣＲ法による増幅反応＞
百日咳菌より抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件により百日咳菌を検出した。
Example 5
(1) Amplification of nucleic acid derived from Bordetella pertussis by PCR method
<Amplification reaction by PCR method>
Using a DNA solution extracted from Bordetella pertussis as a sample, the following reagents were added, and Bordetella pertussis was detected under the following conditions.
＜試薬＞
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ ０．５Ｕ
オリゴ４ ５ｐｍｏｌ、
オリゴ６ １５ ｐｍｏｌ、
オリゴ１１（３’末端をＦＩＴＣにより標識） ５ｐｍｏｌ、
×１０緩衝液（KOD plus ver.2用） １μｌ、
２ｍＭ ｄＮＴＰ １μｌ、
２５ｍＭ ＭｇＳＯ４ ２μｌ、
抽出ＤＮＡ溶液 １００ｎｇ（ｏｒ 蒸留水）
<Reagent>
A 10 μl solution containing the following reagents was prepared.
KOD plus DNA polymerase 0.5U
Oligo 4 5 pmol,
Oligo 6 15 pmol,
Oligo 11 (3 ′ end labeled with FITC) 5 pmol,
× 10 buffer (for KOD plus ver.2) 1 μl,
1 μl of 2 mM dNTP,
2 μl of 25 mM MgSO4,
Extracted DNA solution 100ng (or distilled water)
＜増幅条件＞
９４℃・３０秒、
９７℃・１秒、
５８℃・３秒、
６３℃・５秒（５０サイクル）
４０℃・３０秒
４０℃から７５℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は０．２℃／秒
<Amplification conditions>
94 ° C, 30 seconds,
97 ℃ for 1 second,
58 ℃, 3 seconds,
63 ° C for 5 seconds (50 cycles)
Detect fluorescence while increasing the temperature from 40 ° C to 75 ° C for 40 ° C for 30 seconds. Temperature rise rate is 0.2 ° C / second
＜融解曲線解析による検出＞
融解曲線解析結果 抽出ＤＮＡを用いた場合 ６３℃付近にピークが認められたが、抽出ＤＮＡがない場合は、ピークは認められなかった。
<Detection by melting curve analysis>
Results of melting curve analysis When extracted DNA was used, a peak was observed at around 63 ° C., but no peak was observed when there was no extracted DNA.
（２）パラ百日咳菌に由来する核酸のＰＣＲ法による増幅
＜ＰＣＲ法による増幅反応＞
パラ百日咳菌より抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりパラ百日咳菌を検出した。
(2) Amplification of nucleic acid derived from Parapertussis by PCR <Amplification reaction by PCR>
Using the DNA solution extracted from Parapertussis as a sample, the following reagents were added, and Parapertussis was detected under the following conditions.
＜試薬＞
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ ０．５Ｕ
オリゴ４ ５ｐｍｏｌ、
オリゴ６ １５ ｐｍｏｌ、
オリゴ１１（３’末端をＦＩＴＣにより標識） ５ｐｍｏｌ、
×１０緩衝液（KOD plus ver.2用） １μｌ、
２ｍＭ ｄＮＴＰ １μｌ、
２５ｍＭ ＭｇＳＯ４ ２μｌ、
抽出ＤＮＡ溶液 １００ｎｇ（ｏｒ 蒸留水）
<Reagent>
A 10 μl solution containing the following reagents was prepared.
KOD plus DNA polymerase 0.5U
Oligo 4 5 pmol,
Oligo 6 15 pmol,
Oligo 11 (3 ′ end labeled with FITC) 5 pmol,
× 10 buffer (for KOD plus ver.2) 1 μl,
1 μl of 2 mM dNTP,
2 μl of 25 mM MgSO4,
Extracted DNA solution 100ng (or distilled water)
＜増幅条件＞
９４℃・３０秒、
９７℃・１秒、
５８℃・３秒、
６３℃・５秒（５０サイクル）
４０℃・３０秒
４０℃から７５℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は０．２℃／秒
<Amplification conditions>
94 ° C, 30 seconds,
97 ℃ for 1 second,
58 ℃, 3 seconds,
63 ° C for 5 seconds (50 cycles)
Detect fluorescence while increasing the temperature from 40 ° C to 75 ° C for 40 ° C for 30 seconds. Temperature rise rate is 0.2 ° C / second
＜融解曲線解析による検出＞
融解曲線解析結果 抽出ＤＮＡを用いた場合 ５６．℃付近にピークが認められたが、抽出ＤＮＡがない場合は、ピークは認められなかった。
<Detection by melting curve analysis>
Melting curve analysis results When extracted DNA is used 56. A peak was observed at around 0 ° C., but no peak was observed when there was no extracted DNA.
実施例６
（１）百日咳菌に由来する核酸のＰＣＲ法による増幅
＜ＰＣＲ法による増幅反応＞
百日咳菌より抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件により百日咳菌を検出した。
Example 6
(1) Amplification of nucleic acid derived from Bordetella pertussis by PCR <Amplification reaction by PCR>
Using a DNA solution extracted from Bordetella pertussis as a sample, the following reagents were added, and Bordetella pertussis was detected under the following conditions.
＜試薬＞
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ ０．５Ｕ
オリゴ５ ５ｐｍｏｌ、
オリゴ７ １５ ｐｍｏｌ、
オリゴ１２（３’末端をＦＩＴＣにより標識） ５ｐｍｏｌ、
×１０緩衝液（KOD plus ver.2用） １μｌ、
２ｍＭ ｄＮＴＰ １μｌ、
２５ｍＭ ＭｇＳＯ４ ２μｌ、
抽出ＤＮＡ溶液 １００ｎｇ（ｏｒ 蒸留水）
<Reagent>
A 10 μl solution containing the following reagents was prepared.
KOD plus DNA polymerase 0.5U
Oligo 5 5 pmol,
Oligo 7 15 pmol,
Oligo 12 (3 ′ end labeled with FITC) 5 pmol,
× 10 buffer (for KOD plus ver.2) 1 μl,
1 μl of 2 mM dNTP,
2 μl of 25 mM MgSO4,
Extracted DNA solution 100ng (or distilled water)
＜増幅条件＞
９４℃・３０秒、
９７℃・１秒、
５８℃・３秒、
６３℃・５秒（５０サイクル）
４０℃・３０秒
４０℃から７５℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は０．２℃／秒
<Amplification conditions>
94 ° C, 30 seconds,
97 ℃ for 1 second,
58 ℃, 3 seconds,
63 ° C for 5 seconds (50 cycles)
Detect fluorescence while increasing the temperature from 40 ° C to 75 ° C for 40 ° C for 30 seconds. Temperature rise rate is 0.2 ° C / second
＜融解曲線解析による検出＞
融解曲線解析結果 抽出ＤＮＡを用いた場合 ６２℃付近にピークが認められたが、抽出ＤＮＡがない場合は、ピークは認められなかった。
<Detection by melting curve analysis>
Melting curve analysis results When extracted DNA was used, a peak was observed at around 62 ° C., but no peak was observed when there was no extracted DNA.
（２）パラ百日咳菌に由来する核酸のＰＣＲ法による増幅
＜ＰＣＲ法による増幅反応＞
パラ百日咳菌より抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりパラ百日咳菌を検出した。
(2) Amplification of nucleic acid derived from Parapertussis by PCR method
<Amplification reaction by PCR method>
Using the DNA solution extracted from Parapertussis as a sample, the following reagents were added, and Parapertussis was detected under the following conditions.
＜試薬＞
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ ０．５Ｕ
オリゴ５ ５ｐｍｏｌ、
オリゴ７ １５ ｐｍｏｌ、
オリゴ１２（３’末端をＦＩＴＣにより標識） ５ｐｍｏｌ、
×１０緩衝液（KOD plus ver.2用） １μｌ、
２ｍＭ ｄＮＴＰ １μｌ、
２５ｍＭ ＭｇＳＯ４ ２μｌ、
抽出ＤＮＡ溶液 １００ｎｇ（ｏｒ 蒸留水）
<Reagent>
A 10 μl solution containing the following reagents was prepared.
KOD plus DNA polymerase 0.5U
Oligo 5 5 pmol,
Oligo 7 15 pmol,
Oligo 12 (3 ′ end labeled with FITC) 5 pmol,
× 10 buffer (for KOD plus ver.2) 1 μl,
1 μl of 2 mM dNTP,
2 μl of 25 mM MgSO4,
Extracted DNA solution 100ng (or distilled water)
＜増幅条件＞
９４℃・３０秒、
９７℃・１秒、
５８℃・３秒、
６３℃・５秒（５０サイクル）
４０℃・３０秒
４０℃から７５℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は０．２℃／秒
<Amplification conditions>
94 ° C, 30 seconds,
97 ℃ for 1 second,
58 ℃, 3 seconds,
63 ° C for 5 seconds (50 cycles)
Detect fluorescence while increasing the temperature from 40 ° C to 75 ° C for 40 ° C for 30 seconds. Temperature rise rate is 0.2 ° C / second
＜融解曲線解析による検出＞
融解曲線解析結果 抽出ＤＮＡを用いた場合 ５５．℃付近にピークが認められたが、抽出ＤＮＡがない場合は、ピークは認められなかった。
<Detection by melting curve analysis>
Melting curve analysis results When extracted DNA is used 55. A peak was observed at around 0 ° C., but no peak was observed when there was no extracted DNA.
実施例７
（１）百日咳菌に由来する核酸のＰＣＲ法による増幅
＜ＰＣＲ法による増幅反応＞
百日咳菌より抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件により百日咳菌を検出した。
Example 7
(1) Amplification of nucleic acid derived from Bordetella pertussis by PCR <Amplification reaction by PCR>
Using a DNA solution extracted from Bordetella pertussis as a sample, the following reagents were added, and Bordetella pertussis was detected under the following conditions.
＜試薬＞
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ ０．５Ｕ
オリゴ４ ５ｐｍｏｌ、
オリゴ６ １５ ｐｍｏｌ、
オリゴ１３（３’末端をＦＩＴＣにより標識） ５ｐｍｏｌ、
×１０緩衝液（KOD plus ver.2用） １μｌ、
２ｍＭ ｄＮＴＰ １μｌ、
２５ｍＭ ＭｇＳＯ４ ２μｌ、
抽出ＤＮＡ溶液 １００ｎｇ（ｏｒ 蒸留水）
<Reagent>
A 10 μl solution containing the following reagents was prepared.
KOD plus DNA polymerase 0.5U
Oligo 4 5 pmol,
Oligo 6 15 pmol,
Oligo 13 (3 ′ end labeled with FITC) 5 pmol,
× 10 buffer (for KOD plus ver.2) 1 μl,
1 μl of 2 mM dNTP,
2 μl of 25 mM MgSO4,
Extracted DNA solution 100ng (or distilled water)
＜増幅条件＞
９４℃・３０秒、
９７℃・１秒、
５８℃・３秒、
６３℃・５秒（５０サイクル）
４０℃・３０秒
４０℃から７５℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は０．２℃／秒
<Amplification conditions>
94 ° C, 30 seconds,
97 ℃ for 1 second,
58 ℃, 3 seconds,
63 ° C for 5 seconds (50 cycles)
Detect fluorescence while increasing the temperature from 40 ° C to 75 ° C for 40 ° C for 30 seconds. Temperature rise rate is 0.2 ° C / second
＜融解曲線解析による検出＞
融解曲線解析結果 抽出ＤＮＡを用いた場合 ６１℃付近にピークが認められたが、抽出ＤＮＡがない場合は、ピークは認められなかった。
<Detection by melting curve analysis>
Melting curve analysis results When extracted DNA was used, a peak was observed at around 61 ° C., but no peak was observed when there was no extracted DNA.
（２）パラ百日咳に由来する核酸のＰＣＲ法による増幅
＜ＰＣＲ法による増幅反応＞
パラ百日咳菌より抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりパラ百日咳菌を検出した。
(2) Amplification of nucleic acid derived from parapertussis by PCR
<Amplification reaction by PCR method>
Using the DNA solution extracted from Parapertussis as a sample, the following reagents were added, and Parapertussis was detected under the following conditions.
＜試薬＞
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ ０．５Ｕ
オリゴ４ ５ｐｍｏｌ、
オリゴ６ １５ ｐｍｏｌ、
オリゴ１３（３’末端をＦＩＴＣにより標識） ５ｐｍｏｌ、
×１０緩衝液（KOD plus ver.2用） １μｌ、
２ｍＭ ｄＮＴＰ １μｌ、
２５ｍＭ ＭｇＳＯ４ ２μｌ、
抽出ＤＮＡ溶液 １００ｎｇ（ｏｒ 蒸留水）
<Reagent>
A 10 μl solution containing the following reagents was prepared.
KOD plus DNA polymerase 0.5U
Oligo 4 5 pmol,
Oligo 6 15 pmol,
Oligo 13 (3 ′ end labeled with FITC) 5 pmol,
× 10 buffer (for KOD plus ver.2) 1 μl,
1 μl of 2 mM dNTP,
2 μl of 25 mM MgSO4,
Extracted DNA solution 100ng (or distilled water)
＜増幅条件＞
９４℃・３０秒、
９７℃・１秒、
５８℃・３秒、
６３℃・５秒（５０サイクル）
４０℃・３０秒
４０℃から７５℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は０．２℃／秒
<Amplification conditions>
94 ° C, 30 seconds,
97 ℃ for 1 second,
58 ℃, 3 seconds,
63 ° C for 5 seconds (50 cycles)
Detect fluorescence while increasing the temperature from 40 ° C to 75 ° C for 40 ° C for 30 seconds. Temperature rise rate is 0.2 ° C / second
＜融解曲線解析による検出＞
融解曲線解析結果 抽出ＤＮＡを用いた場合 ５４．℃付近にピークが認められたが、抽出ＤＮＡがない場合は、ピークは認められなかった。
<Detection by melting curve analysis>
Melting curve analysis results When extracted DNA is used 54. A peak was observed at around 0 ° C., but no peak was observed when there was no extracted DNA.
実施例８
（１）百日咳菌に由来する核酸のＰＣＲ法による増幅
＜ＰＣＲ法による増幅反応＞
百日咳菌より抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件により百日咳菌を検出した。
Example 8
(1) Amplification of nucleic acid derived from Bordetella pertussis by PCR method
<Amplification reaction by PCR method>
Using a DNA solution extracted from Bordetella pertussis as a sample, the following reagents were added, and Bordetella pertussis was detected under the following conditions.
＜試薬＞
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ ０．５Ｕ
オリゴ５ ５ｐｍｏｌ、
オリゴ７ １５ ｐｍｏｌ、
オリゴ１４（３’末端をＦＩＴＣにより標識） ５ｐｍｏｌ、
×１０緩衝液（KOD plus ver.2用） １μｌ、
２ｍＭ ｄＮＴＰ １μｌ、
２５ｍＭ ＭｇＳＯ４ ２μｌ、
抽出ＤＮＡ溶液 １００ｎｇ（ｏｒ 蒸留水）
<Reagent>
A 10 μl solution containing the following reagents was prepared.
KOD plus DNA polymerase 0.5U
Oligo 5 5 pmol,
Oligo 7 15 pmol,
Oligo 14 (3 ′ end labeled with FITC) 5 pmol,
× 10 buffer (for KOD plus ver.2) 1 μl,
1 μl of 2 mM dNTP,
2 μl of 25 mM MgSO4,
Extracted DNA solution 100ng (or distilled water)
＜増幅条件＞
９４℃・３０秒、
９７℃・１秒、
５８℃・３秒、
６３℃・５秒（５０サイクル）
４０℃・３０秒
４０℃から７５℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は０．２℃／秒
<Amplification conditions>
94 ° C, 30 seconds,
97 ℃ for 1 second,
58 ℃, 3 seconds,
63 ° C for 5 seconds (50 cycles)
Detect fluorescence while increasing the temperature from 40 ° C to 75 ° C for 40 ° C for 30 seconds. Temperature rise rate is 0.2 ° C / second
＜融解曲線解析による検出＞
融解曲線解析結果 抽出ＤＮＡを用いた場合 ６０℃付近にピークが認められたが、抽出ＤＮＡがない場合は、ピークは認められなかった。
<Detection by melting curve analysis>
Melting curve analysis results When extracted DNA was used, a peak was observed at around 60 ° C., but when no extracted DNA was present, no peak was observed.
（２）パラ百日咳菌に由来する核酸のＰＣＲ法による増幅
＜ＰＣＲ法による増幅反応＞
パラ百日咳菌より抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりパラ百日咳菌を検出した。
(2) Amplification of nucleic acid derived from Parapertussis by PCR method
<Amplification reaction by PCR method>
Using the DNA solution extracted from Parapertussis as a sample, the following reagents were added, and Parapertussis was detected under the following conditions.
＜試薬＞
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ ０．５Ｕ
オリゴ５ ５ｐｍｏｌ、
オリゴ７ １５ ｐｍｏｌ、
オリゴ１４（３’末端をＦＩＴＣにより標識） ５ｐｍｏｌ、
×１０緩衝液（KOD plus ver.2用） １μｌ、
２ｍＭ ｄＮＴＰ １μｌ、
２５ｍＭ ＭｇＳＯ４ ２μｌ、
抽出ＤＮＡ溶液 １００ｎｇ（ｏｒ 蒸留水）
<Reagent>
A 10 μl solution containing the following reagents was prepared.
KOD plus DNA polymerase 0.5U
Oligo 5 5 pmol,
Oligo 7 15 pmol,
Oligo 14 (3 ′ end labeled with FITC) 5 pmol,
× 10 buffer (for KOD plus ver.2) 1 μl,
1 μl of 2 mM dNTP,
2 μl of 25 mM MgSO4,
Extracted DNA solution 100ng (or distilled water)
＜増幅条件＞
９４℃・３０秒、
９７℃・１秒、
５８℃・３秒、
６３℃・５秒（５０サイクル）
４０℃・３０秒
４０℃から７５℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は０．２℃／秒
<Amplification conditions>
94 ° C, 30 seconds,
97 ℃ for 1 second,
58 ℃, 3 seconds,
63 ° C for 5 seconds (50 cycles)
Detect fluorescence while increasing the temperature from 40 ° C to 75 ° C for 40 ° C for 30 seconds. Temperature rise rate is 0.2 ° C / second
＜融解曲線解析による検出＞
融解曲線解析結果 抽出ＤＮＡを用いた場合 ５３．℃付近にピークが認められたが、抽出ＤＮＡがない場合は、ピークは認められなかった。
<Detection by melting curve analysis>
Melting curve analysis results When extracted DNA is used 53. A peak was observed at around 0 ° C., but no peak was observed when there was no extracted DNA.
実施例９
（１）百日咳菌に由来する核酸のＰＣＲ法による増幅
＜ＰＣＲ法による増幅反応＞
百日咳菌より抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件により百日咳菌を検出した。
Example 9
(1) Amplification of nucleic acid derived from Bordetella pertussis by PCR method
<Amplification reaction by PCR method>
Using a DNA solution extracted from Bordetella pertussis as a sample, the following reagents were added, and Bordetella pertussis was detected under the following conditions.
＜試薬＞
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ ０．５Ｕ
オリゴ４ ５ｐｍｏｌ、
オリゴ６ １５ ｐｍｏｌ、
オリゴ１５（３’末端をＦＩＴＣにより標識） ５ｐｍｏｌ、
×１０緩衝液（KOD plus ver.2用） １μｌ、
２ｍＭ ｄＮＴＰ １μｌ、
２５ｍＭ ＭｇＳＯ４ ２μｌ、
抽出ＤＮＡ溶液 １００ｎｇ（ｏｒ 蒸留水）
<Reagent>
A 10 μl solution containing the following reagents was prepared.
KOD plus DNA polymerase 0.5U
Oligo 4 5 pmol,
Oligo 6 15 pmol,
Oligo 15 (3 ′ end labeled with FITC) 5 pmol,
× 10 buffer (for KOD plus ver.2) 1 μl,
1 μl of 2 mM dNTP,
2 μl of 25 mM MgSO4,
Extracted DNA solution 100ng (or distilled water)
＜増幅条件＞
９４℃・３０秒、
９７℃・１秒、
５８℃・３秒、
６３℃・５秒（５０サイクル）
４０℃・３０秒
４０℃から７５℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は０．２℃／秒
<Amplification conditions>
94 ° C, 30 seconds,
97 ℃ for 1 second,
58 ℃, 3 seconds,
63 ° C for 5 seconds (50 cycles)
Detect fluorescence while increasing the temperature from 40 ° C to 75 ° C for 40 ° C for 30 seconds. Temperature rise rate is 0.2 ° C / second
＜融解曲線解析による検出＞
融解曲線解析結果 抽出ＤＮＡを用いた場合 ５９℃付近にピークが認められたが、抽出ＤＮＡがない場合は、ピークは認められなかった。
<Detection by melting curve analysis>
Results of melting curve analysis When extracted DNA was used, a peak was observed at around 59 ° C., but no peak was observed when no extracted DNA was present.
（２）パラ百日咳菌に由来する核酸のＰＣＲ法による増幅
＜ＰＣＲ法による増幅反応＞
パラ百日咳菌より抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりパラ百日咳菌を検出した。
(2) Amplification of nucleic acid derived from Parapertussis by PCR method
<Amplification reaction by PCR method>
Using the DNA solution extracted from Parapertussis as a sample, the following reagents were added, and Parapertussis was detected under the following conditions.
＜試薬＞
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ ０．５Ｕ
オリゴ４ ５ｐｍｏｌ、
オリゴ６ １５ ｐｍｏｌ、
オリゴ１５（３’末端をＦＩＴＣにより標識） ５ｐｍｏｌ、
×１０緩衝液（KOD plus ver.2用） １μｌ、
２ｍＭ ｄＮＴＰ １μｌ、
２５ｍＭ ＭｇＳＯ４ ２μｌ、
抽出ＤＮＡ溶液 １００ｎｇ（ｏｒ 蒸留水）
<Reagent>
A 10 μl solution containing the following reagents was prepared.
KOD plus DNA polymerase 0.5U
Oligo 4 5 pmol,
Oligo 6 15 pmol,
Oligo 15 (3 ′ end labeled with FITC) 5 pmol,
× 10 buffer (for KOD plus ver.2) 1 μl,
1 μl of 2 mM dNTP,
2 μl of 25 mM MgSO4,
Extracted DNA solution 100ng (or distilled water)
＜増幅条件＞
９４℃・３０秒、
９７℃・１秒、
５８℃・３秒、
６３℃・５秒（５０サイクル）
４０℃・３０秒
４０℃から７５℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は０．２℃／秒
<Amplification conditions>
94 ° C, 30 seconds,
97 ℃ for 1 second,
58 ℃, 3 seconds,
63 ° C for 5 seconds (50 cycles)
Detect fluorescence while increasing the temperature from 40 ° C to 75 ° C for 40 ° C for 30 seconds. Temperature rise rate is 0.2 ° C / second
＜融解曲線解析による検出＞
融解曲線解析結果 抽出ＤＮＡを用いた場合 ５２．℃付近にピークが認められたが、抽出ＤＮＡがない場合は、ピークは認められなかった。
<Detection by melting curve analysis>
Melting curve analysis results When extracted DNA is used 52. A peak was observed at around 0 ° C., but no peak was observed when there was no extracted DNA.
実施例１０
（１）百日咳菌に由来する核酸のＰＣＲ法による増幅
＜ＰＣＲ法による増幅反応＞
百日咳菌より抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件により百日咳菌を検出した。
Example 10
(1) Amplification of nucleic acid derived from Bordetella pertussis by PCR method
<Amplification reaction by PCR method>
Using a DNA solution extracted from Bordetella pertussis as a sample, the following reagents were added, and Bordetella pertussis was detected under the following conditions.
＜試薬＞
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ ０．５Ｕ
オリゴ５ ５ｐｍｏｌ、
オリゴ７ １５ ｐｍｏｌ、
オリゴ１６（３’末端をＦＩＴＣにより標識） ５ｐｍｏｌ、
×１０緩衝液（KOD plus ver.2用） １μｌ、
２ｍＭ ｄＮＴＰ １μｌ、
２５ｍＭ ＭｇＳＯ４ ２μｌ、
抽出ＤＮＡ溶液 １００ｎｇ（ｏｒ 蒸留水）
<Reagent>
A 10 μl solution containing the following reagents was prepared.
KOD plus DNA polymerase 0.5U
Oligo 5 5 pmol,
Oligo 7 15 pmol,
Oligo 16 (3 ′ end labeled with FITC) 5 pmol,
× 10 buffer (for KOD plus ver.2) 1 μl,
1 μl of 2 mM dNTP,
2 μl of 25 mM MgSO4,
Extracted DNA solution 100ng (or distilled water)
＜増幅条件＞
９４℃・３０秒、
９７℃・１秒、
５８℃・３秒、
６３℃・５秒（５０サイクル）
４０℃・３０秒
４０℃から７５℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は０．２℃／秒
<Amplification conditions>
94 ° C, 30 seconds,
97 ℃ for 1 second,
58 ℃, 3 seconds,
63 ° C for 5 seconds (50 cycles)
Detect fluorescence while increasing the temperature from 40 ° C to 75 ° C for 40 ° C for 30 seconds. Temperature rise rate is 0.2 ° C / second
＜融解曲線解析による検出＞
融解曲線解析結果 抽出ＤＮＡを用いた場合 ５８℃付近にピークが認められたが、抽出ＤＮＡがない場合は、ピークは認められなかった。
<Detection by melting curve analysis>
Results of melting curve analysis When extracted DNA was used, a peak was observed at around 58 ° C., but no peak was observed when there was no extracted DNA.
（２）パラ百日咳菌に由来する核酸のＰＣＲ法による増幅
＜ＰＣＲ法による増幅反応＞
パラ百日咳菌より抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりパラ百日咳菌を検出した。
(2) Amplification of nucleic acid derived from Parapertussis by PCR <Amplification reaction by PCR>
Using the DNA solution extracted from Parapertussis as a sample, the following reagents were added, and Parapertussis was detected under the following conditions.
＜試薬＞
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ ０．５Ｕ
オリゴ５ ５ｐｍｏｌ、
オリゴ７ １５ ｐｍｏｌ、
オリゴ１６（３’末端をＦＩＴＣにより標識） ５ｐｍｏｌ、
×１０緩衝液（KOD plus ver.2用） １μｌ、
２ｍＭ ｄＮＴＰ １μｌ、
２５ｍＭ ＭｇＳＯ４ ２μｌ、
抽出ＤＮＡ溶液 １００ｎｇ（ｏｒ 蒸留水）
<Reagent>
A 10 μl solution containing the following reagents was prepared.
KOD plus DNA polymerase 0.5U
Oligo 5 5 pmol,
Oligo 7 15 pmol,
Oligo 16 (3 ′ end labeled with FITC) 5 pmol,
× 10 buffer (for KOD plus ver.2) 1 μl,
1 μl of 2 mM dNTP,
2 μl of 25 mM MgSO4,
Extracted DNA solution 100ng (or distilled water)
＜増幅条件＞
９４℃・３０秒、
９７℃・１秒、
５８℃・３秒、
６３℃・５秒（５０サイクル）
４０℃・３０秒
４０℃から７５℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は０．２℃／秒
<Amplification conditions>
94 ° C, 30 seconds,
97 ℃ for 1 second,
58 ℃, 3 seconds,
63 ° C for 5 seconds (50 cycles)
Detect fluorescence while increasing the temperature from 40 ° C to 75 ° C for 40 ° C for 30 seconds. Temperature rise rate is 0.2 ° C / second
＜融解曲線解析による検出＞
融解曲線解析結果 抽出ＤＮＡを用いた場合 ５１．℃付近にピークが認められたが、抽出ＤＮＡがない場合は、ピークは認められなかった。
<Detection by melting curve analysis>
Melting curve analysis results When extracted DNA is used 51. A peak was observed at around 0 ° C., but no peak was observed when there was no extracted DNA.
実施例１１
（１）百日咳菌に由来する核酸のＰＣＲ法による増幅
＜ＰＣＲ法による増幅反応＞
百日咳菌より抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件により百日咳菌を検出した。
Example 11
(1) Amplification of nucleic acid derived from Bordetella pertussis by PCR method
<Amplification reaction by PCR method>
Using a DNA solution extracted from Bordetella pertussis as a sample, the following reagents were added, and Bordetella pertussis was detected under the following conditions.
＜試薬＞
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ ０．５Ｕ
オリゴ４ ５ｐｍｏｌ、
オリゴ６ １５ ｐｍｏｌ、
オリゴ１７（３’末端をＦＩＴＣにより標識） ５ｐｍｏｌ、
×１０緩衝液（KOD plus ver.2用） １μｌ、
２ｍＭ ｄＮＴＰ １μｌ、
２５ｍＭ ＭｇＳＯ４ ２μｌ、
抽出ＤＮＡ溶液 １００ｎｇ（ｏｒ 蒸留水）
<Reagent>
A 10 μl solution containing the following reagents was prepared.
KOD plus DNA polymerase 0.5U
Oligo 4 5 pmol,
Oligo 6 15 pmol,
Oligo 17 (3 ′ end labeled with FITC) 5 pmol,
× 10 buffer (for KOD plus ver.2) 1 μl,
1 μl of 2 mM dNTP,
2 μl of 25 mM MgSO4,
Extracted DNA solution 100ng (or distilled water)
＜増幅条件＞
９４℃・３０秒、
９７℃・１秒、
５８℃・３秒、
６３℃・５秒（５０サイクル）
４０℃・３０秒
４０℃から７５℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は０．２℃／秒
<Amplification conditions>
94 ° C, 30 seconds,
97 ℃ for 1 second,
58 ℃, 3 seconds,
63 ° C for 5 seconds (50 cycles)
Detect fluorescence while increasing the temperature from 40 ° C to 75 ° C for 40 ° C for 30 seconds. Temperature rise rate is 0.2 ° C / second
＜融解曲線解析による検出＞
融解曲線解析結果 抽出ＤＮＡを用いた場合 ６２℃付近にピークが認められたが、抽出ＤＮＡがない場合は、ピークは認められなかった。
<Detection by melting curve analysis>
Melting curve analysis results When extracted DNA was used, a peak was observed at around 62 ° C., but no peak was observed when there was no extracted DNA.
（２）パラ百日咳菌に由来する核酸のＰＣＲ法による増幅
＜ＰＣＲ法による増幅反応＞
パラ百日咳菌より抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりパラ百日咳菌を検出した。
(2) Amplification of nucleic acid derived from Parapertussis by PCR <Amplification reaction by PCR>
Using the DNA solution extracted from Parapertussis as a sample, the following reagents were added, and Parapertussis was detected under the following conditions.
＜試薬＞
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ ０．５Ｕ
オリゴ４ ５ｐｍｏｌ、
オリゴ６ １５ ｐｍｏｌ、
オリゴ１７（３’末端をＦＩＴＣにより標識） ５ｐｍｏｌ、
×１０緩衝液（KOD plus ver.2用） １μｌ、
２ｍＭ ｄＮＴＰ １μｌ、
２５ｍＭ ＭｇＳＯ４ ２μｌ、
抽出ＤＮＡ溶液 １００ｎｇ（ｏｒ 蒸留水）
<Reagent>
A 10 μl solution containing the following reagents was prepared.
KOD plus DNA polymerase 0.5U
Oligo 4 5 pmol,
Oligo 6 15 pmol,
Oligo 17 (3 ′ end labeled with FITC) 5 pmol,
× 10 buffer (for KOD plus ver.2) 1 μl,
1 μl of 2 mM dNTP,
2 μl of 25 mM MgSO4,
Extracted DNA solution 100ng (or distilled water)
＜増幅条件＞
９４℃・３０秒、
９７℃・１秒、
５８℃・３秒、
６３℃・５秒（５０サイクル）
４０℃・３０秒
４０℃から７５℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は０．２℃／秒
<Amplification conditions>
94 ° C, 30 seconds,
97 ℃ for 1 second,
58 ℃, 3 seconds,
63 ° C for 5 seconds (50 cycles)
Detect fluorescence while increasing the temperature from 40 ° C to 75 ° C for 40 ° C for 30 seconds. Temperature rise rate is 0.2 ° C / second
＜融解曲線解析による検出＞
融解曲線解析結果 抽出ＤＮＡを用いた場合 ５５．℃付近にピークが認められたが、抽出ＤＮＡがない場合は、ピークは認められなかった。
<Detection by melting curve analysis>
Melting curve analysis results When extracted DNA is used 55. A peak was observed at around 0 ° C., but no peak was observed when there was no extracted DNA.
実施例１２
（１）百日咳菌に由来する核酸のＰＣＲ法による増幅
＜ＰＣＲ法による増幅反応＞
百日咳菌より抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件により百日咳菌を検出した。
Example 12
(1) Amplification of nucleic acid derived from Bordetella pertussis by PCR method
<Amplification reaction by PCR method>
Using a DNA solution extracted from Bordetella pertussis as a sample, the following reagents were added, and Bordetella pertussis was detected under the following conditions.
＜試薬＞
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ ０．５Ｕ
オリゴ５ ５ｐｍｏｌ、
オリゴ７ １５ ｐｍｏｌ、
オリゴ１８（３’末端をＦＩＴＣにより標識） ５ｐｍｏｌ、
×１０緩衝液（KOD plus ver.2用） １μｌ、
２ｍＭ ｄＮＴＰ １μｌ、
２５ｍＭ ＭｇＳＯ４ ２μｌ、
抽出ＤＮＡ溶液 １００ｎｇ（ｏｒ 蒸留水）
<Reagent>
A 10 μl solution containing the following reagents was prepared.
KOD plus DNA polymerase 0.5U
Oligo 5 5 pmol,
Oligo 7 15 pmol,
Oligo 18 (3 ′ end labeled with FITC) 5 pmol,
× 10 buffer (for KOD plus ver.2) 1 μl,
1 μl of 2 mM dNTP,
2 μl of 25 mM MgSO4,
Extracted DNA solution 100ng (or distilled water)
＜増幅条件＞
９４℃・３０秒、
９７℃・１秒、
５８℃・３秒、
６３℃・５秒（５０サイクル）
４０℃・３０秒
４０℃から７５℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は０．２℃／秒
<Amplification conditions>
94 ° C, 30 seconds,
97 ℃ for 1 second,
58 ℃, 3 seconds,
63 ° C for 5 seconds (50 cycles)
Detect fluorescence while increasing the temperature from 40 ° C to 75 ° C for 40 ° C for 30 seconds. Temperature rise rate is 0.2 ° C / second
＜融解曲線解析による検出＞
融解曲線解析結果 抽出ＤＮＡを用いた場合 ６１℃付近にピークが認められたが、抽出ＤＮＡがない場合は、ピークは認められなかった。
<Detection by melting curve analysis>
Melting curve analysis results When extracted DNA was used, a peak was observed at around 61 ° C., but no peak was observed when there was no extracted DNA.
（２）パラ百日咳菌に由来する核酸のＰＣＲ法による増幅
＜ＰＣＲ法による増幅反応＞
パラ百日咳菌より抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりパラ百日咳菌を検出した。
(2) Amplification of nucleic acid derived from Parapertussis by PCR <Amplification reaction by PCR>
Using the DNA solution extracted from Parapertussis as a sample, the following reagents were added, and Parapertussis was detected under the following conditions.
＜試薬＞
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ ０．５Ｕ
オリゴ５ ５ｐｍｏｌ、
オリゴ７ １５ ｐｍｏｌ、
オリゴ１８（３’末端をＦＩＴＣにより標識） ５ｐｍｏｌ、
×１０緩衝液（KOD plus ver.2用） １μｌ、
２ｍＭ ｄＮＴＰ １μｌ、
２５ｍＭ ＭｇＳＯ４ ２μｌ、
抽出ＤＮＡ溶液 １００ｎｇ（ｏｒ 蒸留水）
<Reagent>
A 10 μl solution containing the following reagents was prepared.
KOD plus DNA polymerase 0.5U
Oligo 5 5 pmol,
Oligo 7 15 pmol,
Oligo 18 (3 ′ end labeled with FITC) 5 pmol,
× 10 buffer (for KOD plus ver.2) 1 μl,
1 μl of 2 mM dNTP,
2 μl of 25 mM MgSO4,
Extracted DNA solution 100ng (or distilled water)
＜増幅条件＞
９４℃・３０秒、
９７℃・１秒、
５８℃・３秒、
６３℃・５秒（５０サイクル）
４０℃・３０秒
４０℃から７５℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は０．２℃／秒
<Amplification conditions>
94 ° C, 30 seconds,
97 ℃ for 1 second,
58 ℃, 3 seconds,
63 ° C for 5 seconds (50 cycles)
Detect fluorescence while increasing the temperature from 40 ° C to 75 ° C for 40 ° C for 30 seconds. Temperature rise rate is 0.2 ° C / second
＜融解曲線解析による検出＞
融解曲線解析結果 抽出ＤＮＡを用いた場合 ５３．℃付近にピークが認められたが、抽出ＤＮＡがない場合は、ピークは認められなかった。
<Detection by melting curve analysis>
Melting curve analysis results When extracted DNA is used 53. A peak was observed at around 0 ° C., but no peak was observed when there was no extracted DNA.
本発明を百日咳菌および／またはパラ百日咳菌の検出に利用することで、迅速性、正確性の両方に優れ、なおかつ高感度に百日咳菌および／またはパラ百日咳菌を検出することができる。 By utilizing the present invention for detection of Bordetella pertussis and / or Parapertussis, it is possible to detect Bordetella pertussis and / or Parapertussis with high sensitivity and high sensitivity.
Claims (12)
（Ａ）
（１）配列番号１と９５％以上相同な塩基配列で示される核酸配列のうち一部領域を核酸増幅するための核酸プライマー対であって、以下の（Ｉ）または（ＩＩ）のいずれか１つ以上に該当する核酸プライマー対を用意する工程。
（Ｉ）フォワードプライマーが、配列番号２で示される塩基配列のうち１６塩基以上３６塩基以下の塩基配列からなる核酸プライマーである。
（ＩＩ）リバースプライマーが、配列番号３で示される塩基配列のうち１６塩基以上３６塩基以下の塩基配列からなる核酸プライマーである。
（２）被検核酸および核酸プライマー対を含む反応液によって、被検核酸を増幅する工程。
（３）工程（２）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部と複合体を形成せしめるように設計された核酸プローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる工程。
（４）工程（３）で得られた複合体を検出する工程。 A method for detecting Bordetella pertussis and / or Parapertussis in a sample, comprising means for detecting nucleic acid derived from Bordetella pertussis and / or Parapertussis in a sample by the step shown in (A) below: A method for detecting Bordetella pertussis and / or Parapertussis.
(A)
(1) A nucleic acid primer pair for amplifying a partial region of a nucleic acid sequence represented by a nucleotide sequence 95% or more homologous to SEQ ID NO: 1, which is one of the following (I) or (II) Preparing a nucleic acid primer pair corresponding to one or more.
(I) The forward primer is a nucleic acid primer having a base sequence of 16 to 36 bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
(II) The reverse primer is a nucleic acid primer having a base sequence of 16 to 36 bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3.
(2) A step of amplifying a test nucleic acid with a reaction solution containing the test nucleic acid and a nucleic acid primer pair.
(3) A step of hybridizing the nucleic acid amplification product obtained in step (2) with a nucleic acid probe designed to form a complex with a part of the nucleic acid amplification product.
(4) A step of detecting the complex obtained in the step (3).
（ａ）フォワードプライマーが配列番号４、リバースプライマーが配列番号６、プローブが配列番号８でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
（ｂ）フォワードプライマーが配列番号４、リバースプライマーが配列番号６、プローブが配列番号９でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
（ｃ）フォワードプライマーが配列番号５、リバースプライマーが配列番号７、プローブが配列番号１０でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
（ｄ）フォワードプライマーが配列番号４、リバースプライマーが配列番号６、プローブが配列番号１１でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
（ｅ）フォワードプライマーが配列番号５、リバースプライマーが配列番号７、プローブが配列番号１２でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
（ｆ）フォワードプライマーが配列番号４、リバースプライマーが配列番号６、プローブが配列番号１３でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
（ｇ）フォワードプライマーが配列番号５、リバースプライマーが配列番号７、プローブが配列番号１４でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
（ｈ）フォワードプライマーが配列番号４、リバースプライマーが配列番号６、プローブが配列番号１５でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
（ｉ）フォワードプライマーが配列番号５、リバースプライマーが配列番号７、プローブが配列番号１６でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
（ｊ）フォワードプライマーが配列番号４、リバースプライマーが配列番号６、プローブが配列番号１７でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
（ｋ）フォワードプライマーが配列番号５、リバースプライマーが配列番号７、プローブが配列番号１８でそれぞれ示される塩基配列の組合せ In the method for detecting Bordetella pertussis and / or Bordetella pertussis according to claim 1, the forward primer according to step (A) (I), the reverse primer according to step (A) (II), and the step (A The method for detecting Bordetella pertussis and / or Parapertussis according to claim 1, wherein the nucleic acid probe according to claim 1 is represented by a combination of any one of the following base sequences (a) to (k):
(A) Combination of nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 4, the forward primer is SEQ ID NO: 6, the probe is SEQ ID NO: 8, and (b) the forward primer is SEQ ID NO: 4, the reverse primer is SEQ ID NO: 6, and the probe is a sequence. Combination of base sequences represented by number 9 (c) Forward primer is SEQ ID NO: 5, reverse primer is SEQ ID NO: 7 and probe is a combination of base sequences represented by SEQ ID NO: 10 (d) Forward primer is SEQ ID NO: 4, Combination of nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 6 for reverse primer and SEQ ID NO: 11 for probe (e) Combination of nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 5 for forward primer, SEQ ID NO: 7 for reverse primer and SEQ ID NO: 12 for probe (F) A forward primer is arranged Combination of base sequences represented by SEQ ID NO: 6, reverse primer is SEQ ID NO: 6, probe is SEQ ID NO: 13 (g) forward primer is SEQ ID NO: 5, reverse primer is SEQ ID NO: 7, probe is SEQ ID NO: 14 Combination of sequences (h) Combination of base sequences represented by SEQ ID NO: 4, forward primer is SEQ ID NO: 6, and probe is SEQ ID NO: 15, respectively (i) Forward primer is SEQ ID NO: 5, reverse primer is SEQ ID NO: 7, Combination of base sequences represented by SEQ ID NO: 16 for the probe (j) Combination of base sequences represented by SEQ ID NO: 4 for the forward primer, SEQ ID NO: 6 for the reverse primer and SEQ ID NO: 17 for the probe (k) Sequence of the forward primer Number 5, reverse primer The combination of nucleotide sequences but that SEQ ID NO: 7, probe as shown in SEQ ID NO: 18
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2013112859A JP6277603B2 (en) | 2013-05-29 | 2013-05-29 | Detection method of Bordetella pertussis |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2013112859A JP6277603B2 (en) | 2013-05-29 | 2013-05-29 | Detection method of Bordetella pertussis |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2014230511A true JP2014230511A (en) | 2014-12-11 |
| JP6277603B2 JP6277603B2 (en) | 2018-02-14 |
Family
ID=52124320
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2013112859A Active JP6277603B2 (en) | 2013-05-29 | 2013-05-29 | Detection method of Bordetella pertussis |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP6277603B2 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2021069336A (en) * | 2019-10-31 | 2021-05-06 | 東洋紡株式会社 | Methods for detecting bordetella bacteria |
| CN113718046A (en) * | 2021-09-23 | 2021-11-30 | 深圳市儿童医院 | Bordetella pertussis genome specificity multi-copy sequence, corresponding primer and probe and application thereof |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007124970A (en) * | 2005-11-07 | 2007-05-24 | Japan Health Science Foundation | Method for detecting bordetella pertussis gene using lamp method and primer set therefor |
-
2013
- 2013-05-29 JP JP2013112859A patent/JP6277603B2/en active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007124970A (en) * | 2005-11-07 | 2007-05-24 | Japan Health Science Foundation | Method for detecting bordetella pertussis gene using lamp method and primer set therefor |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| HOUARD, S. ET AL., RES. MICROBIOL., vol. 140, no. 7, JPN6017010767, 1989, pages 477 - 487, ISSN: 0003701266 * |
| NYGREN M ET AL, J CLIN MICROBIOL., vol. 38, no. 1, JPN6017010764, 2000, pages 55 - 60, ISSN: 0003625023 * |
| REIZENSTEIN E ET AL, DIAGN MICROBIOL INFECT DIS, vol. 17, no. 3, JPN6017010765, 1993, pages 185 - 191, ISSN: 0003625024 * |
| 中村和憲: "蛍光消光現象を利用した遺伝子定量・解析技術", 産総研TODAY, JPN6016049830, February 2008 (2008-02-01), pages 18 - 19, ISSN: 0003625026 * |
| 曽家 義博, JJCLA, vol. 36, no. 3, JPN6017010766, 2011, pages 401 - 403, ISSN: 0003625025 * |
| 野田 尚宏, SYNTHESIOLOGY, vol. 3, no. 2, JPN6017010768, May 2010 (2010-05-01), pages 147 - 157, ISSN: 0003625027 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2021069336A (en) * | 2019-10-31 | 2021-05-06 | 東洋紡株式会社 | Methods for detecting bordetella bacteria |
| CN113718046A (en) * | 2021-09-23 | 2021-11-30 | 深圳市儿童医院 | Bordetella pertussis genome specificity multi-copy sequence, corresponding primer and probe and application thereof |
| CN113718046B (en) * | 2021-09-23 | 2022-05-17 | 深圳市儿童医院 | Bordetella pertussis genome specificity multi-copy sequence, corresponding primer and probe and application thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP6277603B2 (en) | 2018-02-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11499199B2 (en) | Bordetella detection assay | |
| EP3442984B1 (en) | Methods for detecting bordetella | |
| JP6007652B2 (en) | Primers and probes for detecting methicillin-resistant Staphylococcus aureus, and methods for detecting methicillin-resistant Staphylococcus aureus using them | |
| US20120045747A1 (en) | Kit for detecting hepatitis b virus and method for detecting hepatitis b virus using the same | |
| JP6181742B2 (en) | HEV assay | |
| US20240011083A1 (en) | Looped primer and loop-de-loop method for detecting target nucleic acid | |
| US20120052482A1 (en) | Kit for detecting hepatitis c virus and method of detecting hepatitis c virus using the same | |
| JP6277603B2 (en) | Detection method of Bordetella pertussis | |
| JP6435568B2 (en) | Detection of Acinetobacter baumannii | |
| CN105705660B (en) | Detection of single nucleotide polymorphisms using overlapping primers and melting probes | |
| JP2015128399A (en) | Method of detecting cyp3a5 | |
| JP2014230510A (en) | Method of detecting chlamydophila pneumoniae and chlamydophila psittaci | |
| US20220145367A1 (en) | Methods for detecting legionella | |
| JP7392270B2 (en) | Method for detecting IDH-1 gene polymorphism | |
| JP2017521083A (en) | Sequence for detecting Listeria monocytogenes and use of this sequence | |
| US20120052500A1 (en) | Kit for detecting chlamydia trachomatis strains and method for detecting chlamydia trachomatis strains using the same | |
| JP6225623B2 (en) | Method for detecting methicillin resistance gene | |
| JP6343899B2 (en) | Method for detecting Staphylococcus aureus | |
| KR20240058022A (en) | Primer sets for rapid detection of Escherichia coli O105, O10, O119, O132, O150, O35, O25, O36, O177, O26 or O2 serotype and a method of detecting a serotype of Escherichia coli using the same | |
| KR20240058024A (en) | Primer sets for rapid detection of Escherichia coli O115 serotype and a method of detecting a serotype of Escherichia coli using the same | |
| KR20240058019A (en) | Primer sets for rapid detection of Escherichia coli O127, O128ac or O86 serotype and a method of detecting a serotype of Escherichia coli using the same | |
| WO2015053061A1 (en) | Method for detecting methicillin resistance gene and method for detecting staphylococcus aureus | |
| US20120045750A1 (en) | Kit for detecting hiv-2 and method for detecting hiv-2 using the same |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20160520 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170328 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170519 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20170823 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20171115 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20171122 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20171219 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20180101 |
|
| R151 | Written notification of patent or utility model registration |
Ref document number: 6277603 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R151 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |