JP2014217339A - Anti-tls monoclonal antibody and method for producing the same, hybridoma and method for producing the same, and anti-tls monoclonal antibody-containing composition - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、抗ＴＬＳモノクローナル抗体及びその製造方法、ハイブリドーマ及びその製造方法、並びに抗ＴＬＳモノクローナル抗体含有組成物に関する。 The present invention relates to an anti-TLS monoclonal antibody and a method for producing the same, a hybridoma and a method for producing the same, and an anti-TLS monoclonal antibody-containing composition.
ＴＬＳ（Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｅｄ ｉｎ ＬｉｐｏＳａｒｃｏｍａ）は、ＲＮＡ結合タンパク質であり、ＦＵＳ（Ｆｕｓｅｄ ｉｎ Ｓａｒｃｏｍａ）とも称される。前記ＴＬＳは、家族性筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の原因遺伝子として同定されたものである。しかしながら、前記ＡＬＳの発症機構は未だ明確とはなっていない。 TLS (Translocated in LipoSarcoma) is an RNA-binding protein and is also called FUS (Fused in Sarcoma). The TLS has been identified as a gene responsible for familial amyotrophic lateral sclerosis (ALS). However, the onset mechanism of the ALS has not been clarified yet.
これまでに、前記ＴＬＳは、タンパク質アルギニンメチル化酵素と結合し、前記タンパク質アルギニンメチル化酵素により、２１６番目、２１８番目、２４２番目、及び３９４番目のアルギニン残基がジメチル化されることが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。
また、前記ＡＬＳの患者の中には、前記ＴＬＳの２１６番目のアルギニン残基がシステイン残基に置換された変異を有する患者が見つかっている。
そのため、前記ＡＬＳにおいて、前記ＴＬＳのアルギニン残基のメチル化修飾が重要な役割を果たすことが示唆されている。
So far, it has been reported that TLS binds to protein arginine methylase, and 216th, 218th, 242nd, and 394th arginine residues are dimethylated by the protein arginine methylase. (For example, refer nonpatent literature 1).
Among the ALS patients, a patient having a mutation in which the 216th arginine residue of the TLS is replaced with a cysteine residue has been found.
Therefore, it has been suggested that methylation modification of the arginine residue of the TLS plays an important role in the ALS.
しかしながら、アルギニン残基がメチル化修飾されたＴＬＳを特異的に認識する手段が無く、前記アルギニン残基のメチル化修飾の役割を解明することができていないのが現状である。
したがって、アルギニン残基がメチル化修飾されたＴＬＳを特異的に認識する手段の速やかな開発が強く求められている。
However, at present, there is no means for specifically recognizing TLS in which an arginine residue is methylated and the role of methylation modification of the arginine residue has not been elucidated.
Accordingly, there is a strong demand for rapid development of means for specifically recognizing TLS in which arginine residues are methylated.
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、アルギニン残基が非対称ジメチル化されたＴＬＳを特異的に認識することができる抗ＴＬＳモノクローナル抗体及びその製造方法、前記抗ＴＬＳモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ及びその製造方法、並びに前記抗ＴＬＳモノクローナル抗体を含有する抗ＴＬＳモノクローナル抗体含有組成物を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to solve the conventional problems and achieve the following objects. That is, the present invention relates to an anti-TLS monoclonal antibody capable of specifically recognizing TLS in which an arginine residue is asymmetrically dimethylated, a method for producing the same, a hybridoma producing the anti-TLS monoclonal antibody, a method for producing the same, It is an object of the present invention to provide an anti-TLS monoclonal antibody-containing composition containing an anti-TLS monoclonal antibody.
前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ 免疫原として、ＣＧＧＲＧＲＧＧＳＧ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（ただし、前記配列番号１中、Ｒは、非対称ジメチル化されたアルギニン残基である。）を動物に投与する工程と、
前記動物から抗体産生細胞を回収する工程と、
前記抗体産生細胞とミエローマとを細胞融合し、ハイブリドーマを調製する工程と、
前記ハイブリドーマが産生する抗体と、前記アミノ酸配列からなるペプチドを含む組成物とを接触させ、該アミノ酸配列からなるペプチドを含む組成物に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程と、
前記選択されたハイブリドーマが産生する抗体を回収する工程とを含む方法により得られ、
アルギニン残基が非対称ジメチル化されたＴＬＳを認識することを特徴とする抗ＴＬＳモノクローナル抗体である。
＜２＞ アルギニン残基が非対称ジメチル化されたＴＬＳを認識する抗ＴＬＳモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマであって、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−０１５９１であることを特徴とするハイブリドーマである。
＜３＞ 免疫原として、ＣＧＧＲＧＲＧＧＳＧ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（ただし、前記配列番号１中、Ｒは、非対称ジメチル化されたアルギニン残基である。）を動物に投与する工程と、
前記動物から抗体産生細胞を回収する工程と、
前記抗体産生細胞とミエローマとを細胞融合し、ハイブリドーマを調製する工程と、
前記ハイブリドーマが産生する抗体と、前記アミノ酸配列からなるペプチドを含む組成物とを接触させ、該アミノ酸配列からなるペプチドを含む組成物に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程と、
前記選択されたハイブリドーマが産生する抗体を回収する工程とを含み、
前記回収された抗体が、アルギニン残基が非対称ジメチル化されたＴＬＳを認識することを特徴とする抗ＴＬＳモノクローナル抗体の製造方法である。
＜４＞ 免疫原として、ＣＧＧＲＧＲＧＧＳＧ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（ただし、前記配列番号１中、Ｒは、非対称ジメチル化されたアルギニン残基である。）を動物に投与する工程と、
前記動物から抗体産生細胞を回収する工程と、
前記抗体産生細胞とミエローマとを細胞融合し、ハイブリドーマを調製する工程と、
前記ハイブリドーマが産生する抗体と、前記アミノ酸配列からなるペプチドを含む組成物とを接触させ、該アミノ酸配列からなるペプチドを含む組成物に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程とを含み、
前記選択されたハイブリドーマが産生する抗体が、アルギニン残基が非対称ジメチル化されたＴＬＳを認識することを特徴とするハイブリドーマの製造方法である。
＜５＞ 前記＜１＞に記載の抗ＴＬＳモノクローナル抗体を含むことを特徴とする抗ＴＬＳモノクローナル抗体含有組成物である。
Means for solving the problems are as follows. That is,
<1> As an immunogen, a peptide comprising an amino acid sequence represented by CGGRRGGGSG (SEQ ID NO: 1) (wherein R is an asymmetrically dimethylated arginine residue) is administered to an animal. And a process of
Recovering antibody-producing cells from the animal;
Cell fusion of the antibody-producing cells and myeloma to prepare a hybridoma;
Contacting the antibody produced by the hybridoma with a composition comprising a peptide comprising the amino acid sequence, and selecting a hybridoma producing an antibody that binds to the composition comprising the peptide comprising the amino acid sequence;
Recovering the antibody produced by the selected hybridoma.
An anti-TLS monoclonal antibody characterized by recognizing TLS in which an arginine residue is asymmetrically dimethylated.
<2> A hybridoma that produces an anti-TLS monoclonal antibody that recognizes TLS in which an arginine residue is asymmetrically dimethylated, and has a reception number NITE AP-01591.
<3> As an immunogen, a peptide comprising an amino acid sequence represented by CGGRRGGGSG (SEQ ID NO: 1) (wherein R is an asymmetrically dimethylated arginine residue) is administered to an animal. And a process of
Recovering antibody-producing cells from the animal;
Cell fusion of the antibody-producing cells and myeloma to prepare a hybridoma;
Contacting the antibody produced by the hybridoma with a composition comprising a peptide comprising the amino acid sequence, and selecting a hybridoma producing an antibody that binds to the composition comprising the peptide comprising the amino acid sequence;
Recovering the antibody produced by the selected hybridoma,
The method for producing an anti-TLS monoclonal antibody, wherein the recovered antibody recognizes TLS in which an arginine residue is asymmetrically dimethylated.
<4> As an immunogen, a peptide comprising an amino acid sequence represented by CGGRRGGGSG (SEQ ID NO: 1) (wherein R is an asymmetrically dimethylated arginine residue) is administered to an animal. And a process of
Recovering antibody-producing cells from the animal;
Cell fusion of the antibody-producing cells and myeloma to prepare a hybridoma;
Contacting the antibody produced by the hybridoma with a composition comprising a peptide comprising the amino acid sequence, and selecting a hybridoma producing an antibody that binds to the composition comprising the peptide comprising the amino acid sequence,
The method of producing a hybridoma, wherein the antibody produced by the selected hybridoma recognizes TLS in which an arginine residue is asymmetrically dimethylated.
<5> An anti-TLS monoclonal antibody-containing composition comprising the anti-TLS monoclonal antibody according to <1>.
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、アルギニン残基が非対称ジメチル化されたＴＬＳを特異的に認識することができる抗ＴＬＳモノクローナル抗体及びその製造方法、前記抗ＴＬＳモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ及びその製造方法、並びに前記抗ＴＬＳモノクローナル抗体を含有する抗ＴＬＳモノクローナル抗体含有組成物を提供することができる。 According to the present invention, the above-mentioned problems can be solved and the object can be achieved, and an anti-TLS monoclonal antibody capable of specifically recognizing TLS in which an arginine residue is asymmetrically dimethylated and its production It is possible to provide a method, a hybridoma producing the anti-TLS monoclonal antibody, a method for producing the same, and a composition containing an anti-TLS monoclonal antibody containing the anti-TLS monoclonal antibody.
（抗ＴＬＳモノクローナル抗体及びその製造方法、並びにハイブリドーマ及びその製造方法）
本発明の抗ＴＬＳモノクローナル抗体は、アルギニン残基が非対称ジメチル化されたＴＬＳを認識する抗体であり、本発明の抗ＴＬＳモノクローナル抗体の製造方法により、好適に製造することができる。
本発明のハイブリドーマは、前記アルギニン残基が非対称ジメチル化されたＴＬＳを認識する抗ＴＬＳモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマであり、本発明のハイブリドーマの製造方法により、好適に製造することができる。
以下、抗ＴＬＳモノクローナル抗体の製造方法、及びハイブリドーマの製造方法の説明と併せて、本発明の抗ＴＬＳモノクローナル抗体、及びハイブリドーマを説明する。
(Anti-TLS monoclonal antibody and production method thereof, and hybridoma and production method thereof)
The anti-TLS monoclonal antibody of the present invention is an antibody that recognizes TLS in which an arginine residue is asymmetrically dimethylated, and can be preferably produced by the method for producing an anti-TLS monoclonal antibody of the present invention.
The hybridoma of the present invention is a hybridoma that produces an anti-TLS monoclonal antibody that recognizes TLS in which the arginine residue is asymmetrically dimethylated, and can be preferably produced by the method for producing a hybridoma of the present invention.
Hereinafter, the anti-TLS monoclonal antibody and the hybridoma of the present invention will be described together with the description of the method for producing the anti-TLS monoclonal antibody and the method for producing the hybridoma.
前記抗ＴＬＳモノクローナル抗体の製造方法は、免疫原を投与する免疫原投与工程と、抗体産生細胞を回収する抗体産生細胞回収工程と、ハイブリドーマを調製するハイブリドーマ調製工程と、ハイブリドーマを選択するハイブリドーマ選択工程と、抗体を回収する抗体回収工程とを含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。 The anti-TLS monoclonal antibody production method includes an immunogen administration step of administering an immunogen, an antibody-producing cell collection step of collecting antibody-producing cells, a hybridoma preparation step of preparing a hybridoma, and a hybridoma selection step of selecting a hybridoma And an antibody recovery step for recovering the antibody, and further include other steps as necessary.
前記ハイブリドーマの製造方法は、免疫原を投与する免疫原投与工程と、抗体産生細胞を回収する抗体産生細胞回収工程と、ハイブリドーマを調製するハイブリドーマ調製工程と、ハイブリドーマを選択するハイブリドーマ選択工程とを含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
前記ハイブリドーマの製造方法における、前記免疫原投与工程、前記抗体産生細胞回収工程、前記ハイブリドーマ調製工程、及び前記ハイブリドーマ選択工程は、前記抗ＴＬＳモノクローナル抗体の製造方法と同様に行うことができる。
The hybridoma production method includes an immunogen administration step of administering an immunogen, an antibody-producing cell recovery step of recovering antibody-producing cells, a hybridoma preparation step of preparing a hybridoma, and a hybridoma selection step of selecting a hybridoma. Further, other steps are included as necessary.
The immunogen administration step, the antibody-producing cell recovery step, the hybridoma preparation step, and the hybridoma selection step in the hybridoma production method can be performed in the same manner as the anti-TLS monoclonal antibody production method.
＜免疫原投与工程＞
前記免疫原投与工程は、免疫原として、ＣＧＧＲＧＲＧＧＳＧ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（ただし、前記配列番号１中、Ｒは、非対称ジメチル化されたアルギニン残基である。）を動物に投与する工程である。
<Immunogen administration process>
In the immunogen administration step, a peptide having an amino acid sequence represented by CGGRRGGGSG (SEQ ID NO: 1) is used as an immunogen (wherein R is an asymmetrically dimethylated arginine residue). Is administered to an animal.
＜＜免疫原＞＞
前記ＣＧＧＲＧＲＧＧＳＧ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（ただし、前記配列番号１中、Ｒは、非対称ジメチル化されたアルギニン残基である。）は、ＴＬＳの２１３番目から２２２番目のアミノ酸に相当する。前記配列番号１中、下線部で示されたアルギニン残基は、内在的にジメチル化されることが報告されている。なお、前記ＴＬＳのアミノ酸配列情報は、ＧｅｎＢａｎｋから、アクセッション番号ＮＰ＿００４９５１で入手することができる。
<< Immunogen >>
The peptide consisting of the amino acid sequence represented by CGG R G R GGSG (SEQ ID NO: 1) (wherein R is an asymmetrically dimethylated arginine residue) is the 213rd position of TLS. Corresponds to the 222nd amino acid. It has been reported that the arginine residue indicated by the underlined part in SEQ ID NO: 1 is intrinsically dimethylated. The amino acid sequence information of the TLS can be obtained from GenBank with an accession number NP_004951.
アルギニン残基のジメチル化の流れを図１に示す。
タンパク質中のアルギニン残基のメチル化は、タンパク質アルギニンメチル化酵素（ｐｒｏｔｅｉｎ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、以下、「タンパク質アルギニンメチル基転移酵素」、「ＰＲＭＴ」と称することがある）が、Ｓ−アデノシルメチオニン（以下、「ＳＡＭ」、「ＡｄｏＭｅｔ」と称することがある）をメチル基供与体として、前記アルギニン残基へのメチル基の導入を触媒することにより行われる。
ここで、前記タンパク質アルギニンメチル化酵素には、タイプＩと、タイプＩＩとが存在する。前記タイプＩとしては、ＰＲＭＴ１が挙げられ、前記タイプＩＩとしては、ＰＲＭＴ５が挙げられる。
前記タイプＩのタンパク質アルギニンメチル化酵素によると、前記アルギニン残基は、非対称ジメチル化され、非対称性ジメチル化アルギニンとなる。一方、前記タイプＩＩのタンパク質アルギニンメチル化酵素によると、前記アルギニン残基は、対称ジメチル化され、対称性ジメチル化アルギニンとなる。
The flow of dimethylation of arginine residues is shown in FIG.
Methylation of arginine residues in proteins is performed by protein arginine methyltransferase (hereinafter sometimes referred to as “protein arginine methyltransferase” or “PRMT”) by S-adenosylmethionine (hereinafter referred to as “PRMT”). , Which may be referred to as “SAM” or “AdoMet”) as a methyl group donor, is carried out by catalyzing the introduction of a methyl group into the arginine residue.
Here, the protein arginine methylase has type I and type II. Examples of the type I include PRMT1, and examples of the type II include PRMT5.
According to the type I protein arginine methylase, the arginine residue is asymmetrically dimethylated into an asymmetrically dimethylated arginine. On the other hand, according to the type II protein arginine methylase, the arginine residue is symmetrically dimethylated to be symmetrically dimethylated arginine.
前記ＣＧＧＲＧＲＧＧＳＧ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（ただし、前記配列番号１中、Ｒは、非対称ジメチル化されたアルギニン残基である。）の調製方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、化学合成により調製することができる。 As a method for preparing a peptide consisting of the amino acid sequence represented by the CGG R G R GGSG (SEQ ID NO: 1) (wherein R is an asymmetrically dimethylated arginine residue), There is no restriction | limiting in particular, According to the objective, it can select suitably, For example, it can prepare by chemical synthesis.
＜＜動物＞＞
前記動物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、マウスが好ましい。
前記マウスとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウスなどが挙げられる。
<< animal >>
There is no restriction | limiting in particular as said animal, Although it can select suitably according to the objective, A mouse | mouth is preferable.
There is no restriction | limiting in particular as said mouse | mouth, According to the objective, it can select suitably, For example, a BALB / c mouse etc. are mentioned.
＜＜投与＞＞
前記免疫原を投与する方法（動物を免疫する方法）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、アジュバントとともに投与することが、前記マウスの免疫原への免疫応答性を高めることができる点で、好ましい。
前記アジュバントとしては、特に制限はなく、公知のアジュバントを適宜選択することができ、例えば、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバントなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記免疫原の投与は、原則１回であるが、複数回であってもよい。前記免疫原の投与を複数回行う場合に使用するアジュバントは、各回同一であってもよいし、異なっていてもよい。
前記免疫原の投与を複数回行う場合の投与間隔としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記免疫原の投与量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記アジュバントの投与量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記免疫原及びアジュバントの投与部位としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、尾根部に投与することが好ましい。
<< Administration >>
A method for administering the immunogen (a method for immunizing an animal) is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. However, administration with an adjuvant may result in an immune response to the mouse immunogen. It is preferable at the point which can improve property.
There is no restriction | limiting in particular as said adjuvant, A well-known adjuvant can be selected suitably, For example, Freund's complete adjuvant, Freund's incomplete adjuvant, etc. are mentioned. These may be used individually by 1 type and may use 2 or more types together.
The immunogen is administered once in principle, but may be administered multiple times. The adjuvant used when the immunogen is administered a plurality of times may be the same or different each time.
There is no restriction | limiting in particular as an administration interval in the case of administering the said immunogen in multiple times, According to the objective, it can select suitably.
There is no restriction | limiting in particular as a dose of the said immunogen, According to the objective, it can select suitably.
There is no restriction | limiting in particular as a dosage of the said adjuvant, According to the objective, it can select suitably.
There is no restriction | limiting in particular as an administration site | part of the said immunogen and an adjuvant, Although it can select suitably according to the objective, It is preferable to administer to a ridge part.
＜抗体産生細胞回収工程＞
前記抗体産生細胞回収工程は、前記動物から抗体産生細胞を回収する工程である。
<Antibody producing cell recovery step>
The antibody-producing cell collection step is a step of collecting antibody-producing cells from the animal.
＜＜抗体産生細胞回収＞＞
前記抗体産生細胞を回収する時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、最後の免疫原の投与から１７日間後などが挙げられる。
前記抗体産生細胞の回収方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、マウスの腸骨リンパ節を取り出し、細胞をたたき出し、ステンレスのワイヤーメッシュを通して、回収する方法などが挙げられる。
<< Recovery of antibody-producing cells >>
There is no restriction | limiting in particular as time to collect | recover the said antibody producing cells, According to the objective, it can select suitably, For example, 17 days after administration of the last immunogen etc. are mentioned.
The method for collecting the antibody-producing cells is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. For example, a method of taking out mouse iliac lymph nodes, knocking out the cells, and collecting them through a stainless wire mesh Etc.
＜ハイブリドーマ調製工程＞
前記ハイブリドーマ調製工程は、前記抗体産生細胞とミエローマとを細胞融合し、ハイブリドーマを調製する工程である。
<Hybridoma preparation process>
The hybridoma preparation step is a step of preparing a hybridoma by fusing the antibody-producing cells with myeloma.
＜＜ミエローマ＞＞
前記ミエローマの由来としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、マウス由来のものが好ましい。
前記マウス由来のミエローマとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｐ３Ｕ１、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４などが挙げられる。
<< Mieroma >>
There is no restriction | limiting in particular as origin of the said myeloma, Although it can select suitably according to the objective, The thing derived from a mouse | mouth is preferable.
There is no restriction | limiting in particular as said myeloma derived from a mouse | mouth, According to the objective, it can select suitably, For example, P3U1, P3X63-Ag8.653, SP2 / O-Ag14 etc. are mentioned.
＜＜細胞融合＞＞
前記細胞融合の方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、ポリエチレングリコールを用いる方法（ＰＥＧ法）、センダイウイルスを用いる方法、電気融合装置を用いる方法などが挙げられる。
前記細胞融合された細胞の選択方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、選択培地として、ヒポキサン−アミノプテリン−チミジン培地（ＨＡＴ培地）を用いて細胞を培養する方法などが挙げられる。前記ＨＡＴ培地を用いることにより、親細胞株が死滅し、細胞融合された細胞のみが増殖する。
<< Cell fusion >>
The cell fusion method is not particularly limited, and a known method can be appropriately selected. Examples thereof include a method using polyethylene glycol (PEG method), a method using Sendai virus, and a method using an electrofusion device. Can be mentioned.
The method for selecting the cell-fused cells is not particularly limited, and a known method can be appropriately selected. For example, cells can be selected using hypoxan-aminopterin-thymidine medium (HAT medium) as a selection medium. Examples thereof include a culture method. By using the HAT medium, the parent cell line is killed and only the cell-fused cells grow.
＜ハイブリドーマ選択工程＞
前記ハイブリドーマ選択工程は、前記ハイブリドーマが産生する抗体と、前記ＣＧＧＲＧＲＧＧＳＧ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（ただし、前記配列番号１中、Ｒは、非対称ジメチル化されたアルギニン残基である。）を含む組成物とを接触させ、該アミノ酸配列からなるペプチドを含む組成物に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程である。
<Hybridoma selection process>
The hybridoma selection step comprises a peptide comprising an antibody produced by the hybridoma and an amino acid sequence represented by the CGG R G R GGSG (SEQ ID NO: 1) (wherein R is asymmetrically dimethylated in the SEQ ID NO: 1). A hybridoma that produces an antibody that binds to the composition comprising a peptide comprising the amino acid sequence.
＜＜選択＞＞
前記ハイブリドーマ選択工程の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＥＬＩＳＡ法により選択する方法、ウエスタンブロット法により選択する方法などが挙げられる。これらは、単独で行なってもよいし、併用してもよい。
前記選択の回数としては、特に制限はなく、１回であってもよいし、複数回であってもよい。
<< Selection >>
There is no restriction | limiting in particular as the method of the said hybridoma selection process, According to the objective, it can select suitably, For example, the method of selecting by ELISA method, the method of selecting by Western blotting etc. are mentioned. These may be performed alone or in combination.
There is no restriction | limiting in particular as the frequency | count of the said selection, One time may be sufficient and multiple times may be sufficient.
前記ＣＧＧＲＧＲＧＧＳＧ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（ただし、前記配列番号１中、Ｒは、非対称ジメチル化されたアルギニン残基である。）を含む組成物（以下、「ペプチド組成物」と称することがある）は、前記ＣＧＧＲＧＲＧＧＳＧ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド（ただし、前記配列番号１中、Ｒは、非対称ジメチル化されたアルギニン残基である。）を含み、必要に応じてその他の構成を含む。
前記ペプチド組成物の態様としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ＣＧＧＲＧＲＧＧＳＧ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、前記ＣＧＧＲＧＲＧＧＳＧ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドとＧＳＴタンパク質とを融合させたペプチドなどが挙げられる。
A composition comprising a peptide consisting of an amino acid sequence represented by the CGG R G R GGSG (SEQ ID NO: 1) (wherein R is an asymmetrically dimethylated arginine residue) (hereinafter, referred to as RGG). , Which may be referred to as “peptide composition”) is a peptide comprising the amino acid sequence represented by the above CGG R G R GGSG (SEQ ID NO: 1) (wherein R is asymmetrically dimethylated in the above SEQ ID NO: 1). Arginine residues) and other configurations as necessary.
As a mode of the peptide composition is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose, for example, a peptide consisting of the CGG R G R GGSG (SEQ ID NO: 1) represented by the amino acid sequence, wherein the CGG Examples thereof include a peptide obtained by fusing a peptide consisting of an amino acid sequence represented by R G R GGSG (SEQ ID NO: 1) and a GST protein.
前記ＥＬＩＳＡ法としては、例えば、前記ペプチド組成物として、前記ＣＧＧＲＧＲＧＧＳＧ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを用いた場合には、例えば、前記ペプチドを感作用プレートに固相化し、次いで、前記ハイブリドーマが産生する抗体が含まれる培養上清を加え反応させた後、酵素標識抗マウスＩｇＧを加えて反応させ、次いで、酵素基質（発色剤）を加え、発色させた後、波長４９２ｎｍの吸光度を測定する方法が挙げられる。
ここで、前記吸光度が高いものを選択することで、よりアルギニン残基が非対称ジメチル化されたＴＬＳに特異的な抗体を産生しているハイブリドーマを選択することができる。
As the ELISA method, for example, when a peptide consisting of the amino acid sequence represented by the CGG R G R GGSG (SEQ ID NO: 1) is used as the peptide composition, for example, the peptide is used as a sensitive plate. Next, the culture supernatant containing the antibody produced by the hybridoma was added and reacted, then enzyme-labeled anti-mouse IgG was added and reacted, and then an enzyme substrate (coloring agent) was added to cause color development. Thereafter, a method of measuring absorbance at a wavelength of 492 nm may be mentioned.
Here, a hybridoma producing an antibody specific to TLS in which the arginine residue is asymmetrically dimethylated can be selected by selecting one having a high absorbance.
前記ウエスタンブロット法としては、例えば、前記ＴＬＳを発現する細胞の溶解液を調製し、該溶解液をＳ−アデノシルメチオニンの存在下でＰＲＭＴ１にて処理し、前記処理液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離後、一次抗体として、前記ハイブリドーマが産生する抗体を用い、二次抗体として、西洋ワサビパーオキシダーゼ標識された抗体を用い、発光シグナルを検出することにより行う方法が挙げられる。
前記ＥＬＩＳＡ法と組み合わせることにより、よりアルギニン残基が非対称ジメチル化されたＴＬＳに特異的な抗体を産生しているハイブリドーマを選択することができる。
As the Western blotting method, for example, a lysate of cells expressing TLS is prepared, the lysate is treated with PRMT1 in the presence of S-adenosylmethionine, and the lysate is treated with SDS-PAGE. Examples include a method in which, after separation, an antibody produced by the hybridoma is used as a primary antibody, and a horseradish peroxidase-labeled antibody is used as a secondary antibody, and a luminescent signal is detected.
By combining with the ELISA method, a hybridoma producing an antibody specific for TLS in which the arginine residue is asymmetrically dimethylated can be selected.
前記選択したハイブリドーマを分離する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、限界希釈法、軟寒天法、蛍光励起セルソーターを用いる方法などが挙げられる。 A method for separating the selected hybridoma is not particularly limited, and a known method can be appropriately selected. Examples thereof include a limiting dilution method, a soft agar method, and a method using a fluorescence excitation cell sorter.
−ハイブリドーマ−
本発明のハイブリドーマは、上述した工程により得ることができる。
前記本発明のハイブリドーマであるハイブリドーマ２Ｂ１２株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−０１５９１として、２０１３年４月１０日に寄託申請した（受領日は２０１３年４月１１日である）。
-Hybridoma-
The hybridoma of the present invention can be obtained by the steps described above.
The hybridoma 2B12 strain, which is the hybridoma of the present invention, can be obtained from the National Institute for Product Evaluation Technology Patent Microorganism Depositary Center (〒 292-0818, 2-5-8, Kazusa Kamashichi, Kisarazu City, Chiba Prefecture) with the receipt number NITE AP-01591. As of April 10, 2013, the application for deposit was made (the receipt date was April 11, 2013).
＜抗体回収工程＞
前記抗体回収工程は、前記選択されたハイブリドーマが産生する抗体を回収する工程である。
<Antibody recovery process>
The antibody recovery step is a step of recovering an antibody produced by the selected hybridoma.
＜＜抗体回収＞＞
前記選択されたハイブリドーマが産生する抗体を回収する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ハイブリドーマの培養上清から回収する方法、ハイブリドーマを移植したマウスの腹水から回収する方法などが挙げられる。
<< Antibody recovery >>
The method for recovering the antibody produced by the selected hybridoma is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. For example, the method for recovering from the culture supernatant of the hybridoma, the method of recovering the mouse transplanted with the hybridoma The method of collecting from ascites is mentioned.
前記ハイブリドーマの培養上清から回収する方法における前記ハイブリドーマの培養方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、静置培養、高密度培養、スピナーフラスコによる培養などが挙げられる。前記各培養の条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記ハイブリドーマを移植したマウスの腹水から回収する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、プリスタンなどの免疫抑制作用を有する物質を投与したマウスの腹腔内へ前記ハイブリドーマを移植し、約１週間後から３週間後に腹水を採取する方法などが挙げられる。
The method for culturing the hybridoma in the method for recovering from the culture supernatant of the hybridoma is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. For example, stationary culture, high-density culture, spinner flask culture, etc. Is mentioned. The culture conditions are not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose.
The method for recovering from the ascites of the mouse transplanted with the hybridoma is not particularly limited, and a known method can be appropriately selected. For example, intraperitoneal injection into a mouse administered with a substance having an immunosuppressive action such as pristane. Examples include a method of transplanting the hybridoma and collecting ascites after about 1 week to 3 weeks.
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、精製工程などが挙げられる。
<Other processes>
The other steps are not particularly limited as long as the effects of the present invention are not impaired, and can be appropriately selected according to the purpose. Examples thereof include a purification step.
＜＜精製工程＞＞
前記精製工程は、前記回収工程により回収された抗体を精製する工程である。
前記精製の方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、ＰｒｏｔｅｉｎＡを充填したカラムに培養上清をアプライし、精製する方法などが挙げられる。
<< Purification process >>
The purification step is a step of purifying the antibody recovered by the recovery step.
There is no restriction | limiting in particular as the said purification method, A well-known method can be selected suitably, For example, the method etc. which apply | purify a culture supernatant to the column filled with ProteinA, etc. are mentioned.
−抗ＴＬＳモノクローナル抗体−
本発明の抗ＴＬＳモノクローナル抗体は、上述のように、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−０１５９１のハイブリドーマが産生し、アルギニン残基が非対称ジメチル化されたＴＬＳを認識する抗体である。
本発明の抗ＴＬＳモノクローナル抗体は、前記免疫原を用いているため、前記ＴＬＳの２１６番目及び２１８番目のアルギニン残基が非対称ジメチル化されたＴＬＳを特異的に認識すると考えられる。
-Anti-TLS monoclonal antibody-
As described above, the anti-TLS monoclonal antibody of the present invention is an antibody that recognizes TLS produced by a hybridoma having an accession number NITE AP-01591 and asymmetrically dimethylated at the arginine residue.
Since the anti-TLS monoclonal antibody of the present invention uses the immunogen, it is considered that the anti-TLS monoclonal antibody specifically recognizes TLS in which the 216th and 218th arginine residues of the TLS are asymmetrically dimethylated.
前記抗ＴＬＳモノクローナル抗体が、アルギニン残基が非対称ジメチル化されたＴＬＳを特異的に認識するか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏメチル化アッセイを行い、ウエスタンブロット法により確認する方法などが挙げられる。 The method for confirming whether the anti-TLS monoclonal antibody specifically recognizes TLS in which an arginine residue is asymmetrically dimethylated is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose. And a method of performing an in vitro methylation assay and confirming by Western blotting.
前記ｉｎ ｖｉｔｒｏメチル化アッセイは、例えば、以下のようにして行うことができる。
前記ＴＬＳと、前記アルギニンメチル化酵素（ＰＲＭＴ１又はＰＲＭＴ５）とをＳ−アデノシルメチオニンの存在下、メチレーションバッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＰＭＳＦ）中で反応させる。前記反応液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した後、一次抗体として、前記抗ＴＬＳモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロットを行う。
前記ウエスタンブロットの結果、前記アルギニンメチル化酵素として、ＰＲＭＴ１を用いた場合にのみ、前記ＴＬＳが検出された場合には、前記抗ＴＬＳモノクローナル抗体は、前記アルギニン残基が非対称ジメチル化されたＴＬＳを特異的に認識していると判断することができる。
前記ｉｎ ｖｉｔｒｏメチル化アッセイにおけるＴＬＳの態様としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＧＳＴタンパク質と融合させた融合タンパク質の態様などが挙げられる。
前記ｉｎ ｖｉｔｒｏメチル化アッセイの反応条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、３０℃で６０分間とするなどが挙げられる。
The in vitro methylation assay can be performed, for example, as follows.
The TLS and the arginine methylase (PRMT1 or PRMT5) are reacted in methylation buffer (50 mM HEPES (pH 8.0), 10 mM NaCl, 1 mM DTT, 1 mM PMSF) in the presence of S-adenosylmethionine. . After separating the reaction solution by SDS-PAGE, Western blotting using the anti-TLS monoclonal antibody as a primary antibody is performed.
As a result of the Western blotting, when the TLS is detected only when PRMT1 is used as the arginine methylase, the anti-TLS monoclonal antibody has a TLS in which the arginine residue is asymmetrically dimethylated. It can be determined that it is specifically recognized.
There is no restriction | limiting in particular as an aspect of TLS in the said in vitro methylation assay, According to the objective, it can select suitably, For example, the aspect of the fusion protein fused with GST protein etc. are mentioned.
The reaction conditions of the in vitro methylation assay are not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include 30 minutes at 30 ° C.
（抗ＴＬＳモノクローナル抗体含有組成物）
前記抗ＴＬＳモノクローナル抗体含有組成物は、前記抗ＴＬＳモノクローナル抗体を含み、必要に応じて更にその他の構成を含む。
前記抗ＴＬＳモノクローナル抗体含有組成物は、前記抗ＴＬＳモノクローナル抗体が、アルギニン残基が非対称ジメチル化されたＴＬＳを特異的に認識できるので、前記ＴＬＳのメチル化状態を調べるための試薬として好適に用いることができる。また、前記ＴＬＳは、前記ＡＬＳの原因遺伝子の１つであるので、前記抗ＴＬＳモノクローナル抗体含有組成物は、前記ＡＬＳのバイオマーカーとしても好適に用いることができる。
(Anti-TLS monoclonal antibody-containing composition)
The anti-TLS monoclonal antibody-containing composition includes the anti-TLS monoclonal antibody, and further includes other components as necessary.
The anti-TLS monoclonal antibody-containing composition is preferably used as a reagent for examining the methylation state of the TLS because the anti-TLS monoclonal antibody can specifically recognize TLS in which an arginine residue is asymmetrically dimethylated. be able to. In addition, since the TLS is one of the genes responsible for the ALS, the anti-TLS monoclonal antibody-containing composition can be suitably used as a biomarker for the ALS.
＜その他の構成＞
前記その他の構成としては、本発明の効果を損なわない限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知の試薬又は試薬キットに用いられている構成を目的に応じて適宜選択することができる。前記公知の試薬又は試薬キットに用いられている構成としては、例えば、標識、緩衝液、プレート、反応停止液などが挙げられる。前記標識の具体例としては、酵素とその発色基質、放射性同位元素、発光物質、蛍光物質、着色物質などが挙げられる。
<Other configurations>
The other configuration is not particularly limited as long as the effects of the present invention are not impaired, and can be appropriately selected depending on the purpose. For example, a configuration used in a known reagent or reagent kit can be selected depending on the purpose. It can be selected appropriately. Examples of the configuration used in the known reagent or reagent kit include a label, a buffer solution, a plate, and a reaction stop solution. Specific examples of the label include an enzyme and its chromogenic substrate, a radioisotope, a luminescent substance, a fluorescent substance, and a colored substance.
以下、製造例、試験例を挙げて、本発明を説明するが、本発明は、以下の製造例、試験例に何ら限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described with reference to production examples and test examples, but the present invention is not limited to the following production examples and test examples.
（製造例１：免疫原の調製）
免疫原として、以下の３種類のペプチドを化学合成により製造した（ＡｎｙＧｅｎ社製）。
免疫原１：ＣＧＧＲＧＲＧＧＳＧ（配列番号１）
ただし、前記配列番号１中、下線部で示された「Ｒ」は、非対称ジメチル化されたアルギニン残基であり、左から順に、ＴＬＳにおける２１６番目、２１８番目のアルギニン残基に相当する。前記配列番号１で表されるペプチドは、ＴＬＳの２１３番目から２２２番目の部分に相当する。
免疫原２：ＣＧＹＥＰＲＧＲＧＧ（配列番号２）
ただし、前記配列番号２中、下線部で示された「Ｒ」は、非対称ジメチル化されたアルギニン残基であり、ＴＬＳにおける２４２番目のアルギニン残基に相当する。前記配列番号２で表されるペプチドは、ＴＬＳの２３７番目から２４６番目の部分に相当する。
免疫原３：ＣＰＭＧＲＧＧＹＧＧ（配列番号３）
ただし、前記配列番号３中、下線部で示された「Ｒ」は、非対称ジメチル化されたアルギニン残基であり、ＴＬＳにおける３９４番目のアルギニン残基に相当する。前記配列番号３で表されるペプチドは、ＴＬＳの３９０番目から３９９番目の部分に相当する。
(Production Example 1: Preparation of immunogen)
As immunogens, the following three types of peptides were produced by chemical synthesis (manufactured by AnyGen).
Immunogen 1: CGG R G R GGSG (SEQ ID NO: 1)
However, “R” shown in the underlined part in SEQ ID NO: 1 is an asymmetrically dimethylated arginine residue, which corresponds to the 216th and 218th arginine residues in TLS in order from the left. The peptide represented by SEQ ID NO: 1 corresponds to the 213th to 222nd portion of TLS.
Immunogen 2: CGYEP R GRGG (SEQ ID NO: 2)
However, “R” shown in the underlined part in SEQ ID NO: 2 is an asymmetrically dimethylated arginine residue and corresponds to the 242nd arginine residue in TLS. The peptide represented by SEQ ID NO: 2 corresponds to the 237th to 246th part of TLS.
Immunogen 3: CPMG R GGYGG (SEQ ID NO: 3)
However, “R” shown in the underlined part in SEQ ID NO: 3 is an asymmetrically dimethylated arginine residue and corresponds to the 394th arginine residue in TLS. The peptide represented by SEQ ID NO: 3 corresponds to the 390th to 399th portion of TLS.
（製造例２：ハイブリドーマ及びモノクローナル抗体の製造）
＜免疫原投与工程＞
免疫原として、前記免疫原１を用い、以下のようにしてマウスに免疫原を投与した。
前記免疫原１と、オボアルブミンとをガラスニードル中で混合して抗原エマルジョンを作製し、該抗原エマルジョンをＢＡＬＢ／ｃマウスの尾根部に注射した。
(Production Example 2: Production of hybridoma and monoclonal antibody)
<Immunogen administration process>
The immunogen 1 was used as an immunogen, and the immunogen was administered to mice as follows.
The immunogen 1 and ovalbumin were mixed in a glass needle to prepare an antigen emulsion, and the antigen emulsion was injected into the tail of BALB / c mice.
＜抗体産生細胞回収工程＞
前記免疫原投与工程免疫原の投与から１７日間後に、免疫したマウスの腸骨リンパ節を取り出し、以下のようにして細胞を回収した。
前記取り出したマウスの腸骨リンパ節を破砕し、ステンレスのワイヤーメッシュを通して、リンパ球細胞を回収した。
<Antibody producing cell recovery step>
The immunogen administration step 17 days after administration of the immunogen, the iliac lymph nodes of the immunized mice were removed and the cells were collected as follows.
The removed mouse iliac lymph nodes were crushed, and lymphocytes were collected through a stainless steel wire mesh.
＜ハイブリドーマ調製工程＞
前記抗体産生細胞回収工程で回収したリンパ球細胞と、ミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１）とを用い、以下のようにして細胞融合を行った。
前記リンパ球細胞と、前記ミエローマ細胞とを遠心管に入れ、混ぜ合わせた。前記混ぜ合わせた細胞を遠心して回収し、培地を除去した。そこに、予め温めておいたＰＥＧを添加し、緩やかに震盪した。次いで、ＲＰＭＩ培地を加え、ＰＥＧを希釈した。その後、遠心して細胞を回収し、該細胞をＨＡＴ培地で９６穴プレートにまいて培養した。
<Hybridoma preparation process>
Using the lymphocyte cells collected in the antibody-producing cell collection step and myeloma cells (P3U1), cell fusion was performed as follows.
The lymphocyte cells and the myeloma cells were placed in a centrifuge tube and mixed. The mixed cells were collected by centrifugation, and the medium was removed. PEG that had been warmed in advance was added thereto and gently shaken. RPMI medium was then added to dilute the PEG. Thereafter, the cells were collected by centrifugation, and the cells were spread in a 96-well plate using HAT medium and cultured.
＜ハイブリドーマ選択工程＞
前記細胞融合を行った細胞について、以下のようにして、ＥＬＩＳＡ法によるスクリーニング、及び単クローン化を行い、ハイブリドーマ２Ｂ１２株を得た。
９６穴プレートの各穴に抗原（前記免疫原１（配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド））を加え、室温で３時間、又は４℃で一晩反応させた。その後、各穴に前記細胞融合で得られたハイブリドーマの培養上清を加え、室温で３時間、又は４℃で一晩反応させた後、ＰＢＳで４回洗浄した。
次いで、西洋ワサビパーオキシターゼ標識された抗体（Ｐ０１６１、ＤＡＫＯ社製）を各穴に加え、室温で３時間、又は４℃で一晩反応させた後、西洋ワサビパーオキシターゼの基質Ｏ−フェニレンジアミン（１６１−１１８５１、Ｗａｋｏ社製）を各穴に加え、発色させた。前記発色は、波長４９２ｎｍの吸光度を測定することにより確認した。前記発色が強かったハイブリドーマを選択し、以下のようにして単クローン化した。
前記ハイブリドーマの単クローン化は、限界希釈法により、以下のようにして行った。
前記選択されたハイブリドーマを９６穴プレートの穴からはがして回収し、段階希釈した。次いで、１穴に１細胞だけ撒けた穴を記録し、数日後に抗体産生の有無を確認した。
<Hybridoma selection process>
The cells subjected to the cell fusion were screened by ELISA and monocloned as follows to obtain a hybridoma 2B12 strain.
Antigen (the immunogen 1 (a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1)) was added to each well of a 96-well plate and allowed to react at room temperature for 3 hours or overnight at 4 ° C. Thereafter, the culture supernatant of the hybridoma obtained by the cell fusion was added to each well, and the mixture was reacted at room temperature for 3 hours or overnight at 4 ° C., and then washed 4 times with PBS.
Next, horseradish peroxidase-labeled antibody (P0161, manufactured by DAKO) was added to each well and reacted at room temperature for 3 hours or overnight at 4 ° C., and then horseradish peroxidase substrate O-phenylenediamine ( 161-11851 (manufactured by Wako) was added to each hole for color development. The color development was confirmed by measuring the absorbance at a wavelength of 492 nm. The hybridoma with strong color development was selected and cloned as follows.
Monocloning of the hybridoma was performed by the limiting dilution method as follows.
The selected hybridomas were recovered by peeling them from the holes of a 96-well plate and serially diluted. Subsequently, a hole in which only one cell was made was recorded in one hole, and the presence or absence of antibody production was confirmed after several days.
前記ハイブリドーマ２Ｂ１２株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−０１５９１として、２０１３年４月１０日に寄託申請した（受領日は２０１３年４月１１日である）。 The hybridoma 2B12 strain was registered with the Patent Microorganism Depositary Center of the National Institute of Technology and Evaluation (Kazusa-Kamazu 2-5-8, Kisarazu-shi, Chiba 292-0818) as receipt number NITE AP-01591 in April 2013. An application was made on the 10th (the date of receipt was April 11, 2013).
＜抗体回収工程＞
前記ハイブリドーマ２Ｂ１２株を以下のようにして培養した後、培養上清を回収し、抗体を回収した。
前記ハイブリドーマ２Ｂ１２株は、１０％牛胎児血清入りＲＰＭＩ１６４０培地中で、５％二酸化炭素、３７℃で、１×１０７細胞／ｍＬ程度になるまで培養し、３日ごとに継代培養した。なお、前記ハイブリドーマは、無血清培地での培養する馴化を行なうことも可能である。
<Antibody recovery process>
After culturing the hybridoma 2B12 strain as follows, the culture supernatant was recovered and the antibody was recovered.
The hybridoma 2B12 strain was cultured in RPMI 1640 medium containing 10% fetal bovine serum at 5% carbon dioxide at 37 ° C. until it reached about 1 × 10 7 cells / mL, and subcultured every 3 days. The hybridoma can be acclimatized to culture in a serum-free medium.
＜精製工程＞
前記培養上清に含まれる抗体を以下のようにして精製し、モノクローナル抗体１を得た。
回収した培養上清を遠心した後、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａを充填したカラムに前記培養上清をアプライした。その後、結合バッファー（２０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０））で洗浄し、次いで、溶出バッファー（０．１Ｍ クエン酸ナトリウム）で溶出した。
<Purification process>
The antibody contained in the culture supernatant was purified as follows to obtain monoclonal antibody 1.
After the collected culture supernatant was centrifuged, the culture supernatant was applied to a column filled with Protein A. Thereafter, it was washed with a binding buffer (20 mM sodium phosphate (pH 7.0)) and then eluted with an elution buffer (0.1 M sodium citrate).
（比較製造例１：ハイブリドーマ及びモノクローナル抗体の製造）
＜免疫原投与工程＞
前記製造例２において、前記免疫原１を用いた代わりに前記免疫原２を用いた以外は、前記製造例２と同様にして、マウスに免疫原を投与した。
(Comparative Production Example 1: Production of hybridoma and monoclonal antibody)
<Immunogen administration process>
In Production Example 2, the immunogen was administered to mice in the same manner as in Production Example 2 except that the immunogen 2 was used instead of the immunogen 1.
＜抗体産生細胞回収工程＞
前記製造例２と同様にして、細胞を回収した。
<Antibody producing cell recovery step>
Cells were collected in the same manner as in Production Example 2.
＜ハイブリドーマ調製工程＞
前記製造例２と同様にして、細胞融合を行った。
<Hybridoma preparation process>
Cell fusion was performed in the same manner as in Production Example 2.
＜ハイブリドーマ選択工程＞
前記製造例２において、抗原として免疫原１（配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド）を用いた代わりに、免疫原２（配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド）を用いた以外は、前記製造例２と同様にして、ＥＬＩＳＡ法によるスクリーニング、及び単クローン化を行い、ハイブリドーマ４Ｅ５株を得た。
<Hybridoma selection process>
In Production Example 2, instead of using immunogen 1 (peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1) as an antigen, immunogen 2 (peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2) is used. The hybridoma 4E5 strain was obtained in the same manner as in Production Example 2 except that screening and ELISA were performed by ELISA.
＜抗体回収工程＞
前記製造例２において、前記ハイブリドーマ２Ｂ１２株を用いた代わりに前記ハイブリドーマ４Ｅ５株を用いた以外は、前記製造例２と同様にして、抗体を回収した。
<Antibody recovery process>
The antibody was recovered in the same manner as in Production Example 2 except that the hybridoma 4E5 strain was used instead of the hybridoma 2B12 strain in Production Example 2.
＜精製工程＞
前記製造例２において、ハイブリドーマ２Ｂ１２株の培養上清を用いた代わりにハイブリドーマ４Ｅ５株の培養上清を用いた以外は、前記製造例２と同様にして精製し、モノクローナル抗体２を得た。
<Purification process>
Purification in the same manner as in Production Example 2 except that the culture supernatant of hybridoma 4E5 was used instead of the culture supernatant of hybridoma 2B12 in Production Example 2 to obtain monoclonal antibody 2.
（比較製造例２：ハイブリドーマ及びモノクローナル抗体の製造）
＜免疫原投与工程＞
前記製造例２において、前記免疫原１を用いた代わりに前記免疫原３を用いた以外は、前記製造例２と同様にして、マウスに免疫原を投与した。
(Comparative Production Example 2: Production of hybridoma and monoclonal antibody)
<Immunogen administration process>
In Production Example 2, the immunogen was administered to mice in the same manner as in Production Example 2 except that the immunogen 3 was used instead of the immunogen 1.
＜抗体産生細胞回収工程＞
前記製造例２と同様にして、細胞を回収した。
<Antibody producing cell recovery step>
Cells were collected in the same manner as in Production Example 2.
＜ハイブリドーマ調製工程＞
前記製造例２と同様にして、細胞融合を行った。
<Hybridoma preparation process>
Cell fusion was performed in the same manner as in Production Example 2.
＜ハイブリドーマ選択工程＞
前記製造例２において、抗原として免疫原１（配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド）を用いた代わりに、免疫原３（配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド）を用いた以外は、前記製造例２と同様にして、ＥＬＩＳＡ法によるスクリーニング、及び単クローン化を行い、ハイブリドーマＢ５株を得た。
<Hybridoma selection process>
In Production Example 2, instead of using immunogen 1 (peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1) as an antigen, immunogen 3 (peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3) was used. Except for the above, screening by ELISA method and single cloning were performed in the same manner as in Production Example 2 to obtain a hybridoma B5 strain.
＜抗体回収工程＞
前記製造例２において、前記ハイブリドーマ２Ｂ１２株を用いた代わりに前記ハイブリドーマＢ５株を用いた以外は、前記製造例２と同様にして、抗体を回収した。
<Antibody recovery process>
The antibody was recovered in the same manner as in Production Example 2 except that the hybridoma B5 strain was used instead of the hybridoma 2B12 strain in Production Example 2.
＜精製工程＞
前記製造例２において、ハイブリドーマ２Ｂ１２株の培養上清を用いた代わりにハイブリドーマＢ５株の培養上清を用いた以外は、前記製造例２と同様にして精製し、モノクローナル抗体３を得た。
<Purification process>
A monoclonal antibody 3 was obtained by purification in the same manner as in Production Example 2 except that the culture supernatant of the hybridoma B5 strain was used instead of the culture supernatant of the hybridoma 2B12 strain in Production Example 2.
（試験例１：アルギニン残基が非対称ジメチル化されたＴＬＳの認識）
前記モノクローナル抗体１〜３の特異性をｉｎ ｖｉｔｒｏメチル化アッセイを行い、ウエスタンブロット法により確認した。
(Test Example 1: Recognition of TLS in which arginine residue is asymmetrically dimethylated)
The specificity of the monoclonal antibodies 1 to 3 was confirmed by Western blotting using an in vitro methylation assay.
＜ＧＳＴとＴＬＳとの融合タンパク質の調製＞
−プラスミドの調製−
大腸菌ＤＨ５α株にトランスフォーメーションした以下のプラスミドＤＮＡをもつシングルコロニーを、アンピシリン含有ＬＢ培地で、３７℃で一晩震盪培養した。培養後、遠心により大腸菌を回収し、アルカリＳＤＳ法で大腸菌から前記プラスミドＤＮＡを抽出した。
前記プラスミドＤＮＡは、配列番号４で表されるＧＳＴとＴＬＳとの融合タンパク質をコードするＤＮＡを含むものであり、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｃＲＮＡｓ ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｙ ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｃｉｓ ｔｏ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．、 Ｎａｔｕｒｅ ２００８年、４５４（７２００）、１２６−１３０の記載を参考にして作製した。
−大腸菌による融合タンパク質の発現−
大腸菌Ｙ１０ ９０株にトランスフォーメーションした前記プラスミドＤＮＡをもつシングルコロニーを、アンピシリン含有ＬＢ培地で、３７℃で一晩震盪培養した。一晩培養した大腸菌５ｍＬをアンピシリン含有ＬＢ培地２００ｍＬに移し替え、３７℃で３時間震盪培養した後、ＩＰＴＧ（最終濃度２．５ｍＭ）を加え、２０℃で３時間震盪培養した。その後、遠心により大腸菌を回収し、ＷＣＥバッファー（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）， １５０ｍＭ ＮａＣｌ， １．５ｍＭ ＭｇＣｌ２， ０．２ｍＭ ＥＤＴＡ， ０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００， １０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を加え、超音波破砕を行った。次いで、遠心により、融合タンパク質を含む細胞抽出液を回収した。
−融合タンパク質の精製−
前記大腸菌で発現させた融合タンパク質は、ＧＳＴアガロースビーズ（シグマアルドリッチ社製）を用い、以下のようにして精製した。
カラムに、前記融合タンパク質の細胞抽出液と、前記ＧＳＴアガロースビーズとを加え、４℃で３０分間ローテーターによりカラムを旋回させた。その後、遠心により前記ＧＳＴアガロースビーズを回収し、ＷＣＥバッファーで洗った。この操作を２回繰り返した後、ＳＤＳサンプルバッファーを加え、前記融合タンパク質を溶出させた。
<Preparation of fusion protein of GST and TLS>
-Preparation of plasmid-
A single colony having the following plasmid DNA transformed into E. coli DH5α strain was shaken and cultured overnight at 37 ° C. in ampicillin-containing LB medium. After culturing, E. coli was recovered by centrifugation, and the plasmid DNA was extracted from the E. coli by alkaline SDS method.
The plasmid DNA contains DNA encoding a fusion protein of GST and TLS represented by SEQ ID NO: 4, and is described in Wang et al. Induced ncRNAs allotropically modified RNA-binding proteins in cis to inhibition transcription. , Nature 2008, 454 (7200), 126-130.
-Expression of fusion protein by E. coli-
A single colony having the plasmid DNA transformed into Escherichia coli Y10 90 strain was cultured with shaking in ampicillin-containing LB medium at 37 ° C. overnight. 5 mL of E. coli cultured overnight was transferred to 200 mL of ampicillin-containing LB medium, shake-cultured at 37 ° C. for 3 hours, IPTG (final concentration 2.5 mM) was added, and shake-cultured at 20 ° C. for 3 hours. Thereafter, E. coli was recovered by centrifugation, WCE buffer (25 mM HEPES (pH 7.9), 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl 2 , 0.2 mM EDTA, 0.05% Triton X100, 10% Glycerol) was added, and ultrasonic waves were added. Crushing was performed. Subsequently, the cell extract containing the fusion protein was recovered by centrifugation.
-Purification of fusion protein-
The fusion protein expressed in E. coli was purified as follows using GST agarose beads (manufactured by Sigma-Aldrich).
The cell extract of the fusion protein and the GST agarose beads were added to the column, and the column was swirled with a rotator at 4 ° C. for 30 minutes. Thereafter, the GST agarose beads were collected by centrifugation and washed with WCE buffer. After repeating this operation twice, SDS sample buffer was added to elute the fusion protein.
＜タンパク質アルギニンメチル化酵素ＰＲＭＴ１の調製＞
−プラスミドの調製−
前記ＧＳＴとＴＬＳとの融合タンパク質の調製におけるプラスミドの調製において、ＧＳＴ−ＴＬＳのプラスミドＤＮＡを用いた代わりに、以下のＰＲＭＴ１のプラスミドＤＮＡを用いた以外は同様にして調製した。
前記ＰＲＭＴ１のプラスミドＤＮＡは、配列番号５で表されるＰＲＭＴ１タンパク質をコードするＤＮＡを含むものであり、前記非特許文献１の記載を参考にして作製した。なお、前記ＰＲＭＴ１の配列情報は、ＧｅｎＢａｎｋから、アクセッション番号ＮＭ＿１９８３１８、ＮＰ＿９３８０７４で入手することができる。
−大腸菌によるＰＲＭＴ１の発現−
前記ＧＳＴとＴＬＳとの融合タンパク質の調製における大腸菌による融合タンパク質の発現において、ＧＳＴ−ＴＬＳのプラスミドＤＮＡを保有する大腸菌株を用いた代わりに、前記ＰＲＭＴ１のプラスミドＤＮＡを保有する大腸菌株を用いた以外は同様にして行い、ＰＲＭＴ１を含む細胞抽出液を回収した。
<Preparation of protein arginine methylase PRMT1>
-Preparation of plasmid-
In the preparation of the plasmid in the preparation of the fusion protein of GST and TLS, it was prepared in the same manner except that the following plasmid DNA of PRMT1 was used instead of the plasmid DNA of GST-TLS.
The plasmid DNA of PRMT1 contains DNA encoding PRMT1 protein represented by SEQ ID NO: 5, and was prepared with reference to the description of Non-Patent Document 1. The PRMT1 sequence information can be obtained from GenBank with accession numbers NM_198318 and NP_938074.
-Expression of PRMT1 by E. coli-
For the expression of the fusion protein by E. coli in the preparation of the fusion protein of GST and TLS, instead of using the E. coli strain having the plasmid DNA of GST-TLS, the E. coli strain having the plasmid DNA of PRMT1 was used. Was carried out in the same manner, and a cell extract containing PRMT1 was collected.
＜タンパク質アルギニンメチル化酵素ＰＲＭＴ５の調製＞
−プラスミドの調製−
前記ＧＳＴとＴＬＳとの融合タンパク質の調製におけるプラスミドの調製において、ＧＳＴ−ＴＬＳのプラスミドＤＮＡを用いた代わりに、以下のＰＲＭＴ５のプラスミドＤＮＡを用いた以外は同様にして調製した。
前記ＰＲＭＴ５のプラスミドＤＮＡは、配列番号６で表されるＰＲＭＴ５タンパク質をコードするＤＮＡをｐＡＳＫ−ＩＢＡベクター（２−１４０４−０００、ＩＢＡ社製）のＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ部位に挿入したものである。前記ＤＮＡは、ＨｅＬａ細胞のＲＮＡから作製したｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法により調製した。なお、前記ＰＲＭＴ５の配列情報は、ＧｅｎＢａｎｋから、アクセッション番号ＮＭ＿００６１０９、ＮＰ＿００６１００で入手することができる。
−大腸菌によるＰＲＭＴ５の発現−
前記ＧＳＴとＴＬＳとの融合タンパク質の調製における大腸菌による融合タンパク質の発現において、ＧＳＴ−ＴＬＳのプラスミドＤＮＡを保有する大腸菌株を用いた代わりに、ＰＲＭＴ５のプラスミドＤＮＡを保有する大腸菌株を用いた以外は同様にして行い、ＰＲＭＴ５を含む細胞抽出液を回収した。
<Preparation of protein arginine methylase PRMT5>
-Preparation of plasmid-
In the preparation of the plasmid in the preparation of the fusion protein of GST and TLS, it was prepared in the same manner except that the following plasmid DNA of PRMT5 was used instead of using the plasmid DNA of GST-TLS.
The plasmid DNA of PRMT5 is obtained by inserting the DNA encoding the PRMT5 protein represented by SEQ ID NO: 6 into the BamHI and EcoRI sites of the pASK-IBA vector (2-1404-000, manufactured by IBA). The DNA was prepared by the PCR method using cDNA prepared from RNA of HeLa cells as a template. The PRMT5 sequence information can be obtained from GenBank with accession numbers NM_006109 and NP_006100.
-Expression of PRMT5 by E. coli-
In the expression of the fusion protein by E. coli in the preparation of the fusion protein of GST and TLS, instead of using the E. coli strain having the plasmid DNA of GST-TLS, an E. coli strain having the plasmid DNA of PRMT5 was used. The cell extract containing PRMT5 was collected in the same manner.
＜ｉｎ ｖｉｔｒｏメチル化アッセイ＞
１μｇの前記融合タンパク質（ＧＳＴ−ＴＬＳ）と、２００ｎｇの前記ＰＲＭＴ１及び前記ＰＲＭＴ５のいずれかとを、２０μＭのＳ−（５’−Ａｄｅｎｏｓｙｌ）−Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ（以下、「ＳＡＭ」と称することがある）を含むメチレーションバッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＰＭＳＦ）中で、３０℃で６０分間反応させた。
前記反応液をＷＣＥバッファー（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）， １５０ｍＭ ＮａＣｌ， １．５ｍＭ ＭｇＣｌ２， ０．２ｍＭ ＥＤＴＡ， ０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００， １０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）により洗浄した後、ＳＤＳサンプルバッファーを８μＬ加え、その全量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離後、以下のようにしてウエスタンブロット法にて解析した。
<In vitro methylation assay>
1 μg of the fusion protein (GST-TLS) and 200 ng of the PRMT1 and the PRMT5 are combined with 20 μM of S- (5′-Adenosyl) -L-methionine (hereinafter sometimes referred to as “SAM”). In a methylation buffer containing 50 mM HEPES (pH 8.0), 10 mM NaCl, 1 mM DTT, 1 mM PMSF), and reacted at 30 ° C. for 60 minutes.
The reaction solution was washed with WCE buffer (25 mM HEPES (pH 7.9), 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl 2 , 0.2 mM EDTA, 0.05% Triton X100, 10% Glycerol), and then 8 μL of SDS sample buffer was added. In addition, the entire amount was separated by SDS-PAGE and then analyzed by Western blotting as follows.
−ウエスタンブロット−
前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ニトロセルロース膜（バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社製）へブロッティングした。
前記ブロッティングされた膜を、前記モノクローナル抗体１〜３のいずれかと、１％スキムミルク含有ＰＢＳ中で１時間、室温で反応させ、次いで、二次抗体であるＡｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ， ＨＲＰ−ｌｉｎｋｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ （Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）と１％スキムミルク含有ＰＢＳ中で１時間、室温で反応させた後、発光シグナルをＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）により検出した。結果を図２から図４に示した。
-Western blot-
After the SDS-PAGE, blotting was performed on a nitrocellulose membrane (manufactured by Bio-Rad Laboratories).
The blotted membrane was reacted with any one of the monoclonal antibodies 1 to 3 in PBS containing 1% skim milk for 1 hour at room temperature, and then secondary antibodies Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody (Cell Signaling Technology (manufactured by Signaling Technology) and 1% skim milk-containing PBS for 1 hour at room temperature, and then the luminescence signal was detected by SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (manufactured by Thermo Scientific). The results are shown in FIGS.
図２は、一次抗体として前記モノクローナル抗体１を用いた結果を示し、図３は、一次抗体として前記モノクローナル抗体２を用いた結果を示し、図４は、一次抗体として前記モノクローナル抗体３を用いた結果を示す。図２から図４中、「Ｍ」は、分子量マーカーを示し、「ｎｏ」は、タンパク質アルギニンメチル化酵素を用いなかった場合の結果を示し、「Ｐ１」は、タンパク質アルギニンメチル化酵素としてＰＲＭＴ１を用いた場合の結果を示し、「Ｐ５」は、タンパク質アルギニンメチル化酵素としてＰＲＭＴ５を用いた場合の結果を示す。
図２から図４の結果から、前記モノクローナル抗体１を用いた場合には、タンパク質アルギニンメチル化酵素としてＰＲＭＴ１を用いた場合にのみ前記融合タンパク質のシグナルが確認され、タンパク質アルギニンメチル化酵素を用いなかった場合及びタンパク質アルギニンメチル化酵素としてＰＲＭＴ５を用いた場合には、前記融合タンパク質のシグナルは、確認されなかった。前記ＰＲＭＴ１は、アルギニン残基の非対称ジメチル化を触媒し、前記ＰＲＭＴ５は、アルギニン残基の対称ジメチル化を触媒することから、前記モノクローナル抗体１は、アルギニン残基が非対称ジメチル化されたＴＬＳを特異的に認識することがわかった。
一方、前記モノクローナル抗体２及び３では、タンパク質アルギニンメチル化酵素を用いなかった場合及びタンパク質アルギニンメチル化酵素としてＰＲＭＴ５を用いた場合にも前記融合タンパク質のシグナルが確認された。そのため、前記モノクローナル抗体２及び３は、アルギニン残基が非対称ジメチル化されたＴＬＳを特異的に認識するものではないことがわかった。
FIG. 2 shows the results of using the monoclonal antibody 1 as a primary antibody, FIG. 3 shows the results of using the monoclonal antibody 2 as a primary antibody, and FIG. 4 used the monoclonal antibody 3 as a primary antibody. Results are shown. 2 to 4, “M” represents a molecular weight marker, “no” represents a result when no protein arginine methylase was used, and “P1” represents PRMT1 as a protein arginine methylase. The result when used is shown, and “P5” shows the result when PRMT5 is used as the protein arginine methylase.
From the results of FIGS. 2 to 4, when the monoclonal antibody 1 was used, the signal of the fusion protein was confirmed only when PRMT1 was used as the protein arginine methylase, and no protein arginine methylase was used. And when PRMT5 was used as the protein arginine methylase, the signal of the fusion protein was not confirmed. Since PRMT1 catalyzes asymmetric dimethylation of arginine residues and PRMT5 catalyzes symmetric dimethylation of arginine residues, the monoclonal antibody 1 is specific to TLS in which arginine residues are asymmetrically dimethylated. It was understood that it recognized.
On the other hand, in the monoclonal antibodies 2 and 3, the signal of the fusion protein was confirmed when the protein arginine methylase was not used and when PRMT5 was used as the protein arginine methylase. Therefore, it was found that the monoclonal antibodies 2 and 3 did not specifically recognize TLS in which the arginine residue was asymmetrically dimethylated.
本発明の抗ＴＬＳモノクローナル抗体は、アルギニン残基が非対称ジメチル化されたＴＬＳを特異的に認識できるので、アルギニン残基のメチル化状態を調べるための試薬、ＡＬＳのバイオマーカーなどとして好適に利用可能である。
本発明のハイブリドーマは、本発明の抗ＴＬＳモノクローナル抗体の製造に好適に用いることができる。
Since the anti-TLS monoclonal antibody of the present invention can specifically recognize TLS in which an arginine residue is asymmetrically dimethylated, it can be suitably used as a reagent for examining the methylation state of an arginine residue, a biomarker of ALS, etc. It is.
The hybridoma of the present invention can be suitably used for the production of the anti-TLS monoclonal antibody of the present invention.
ＮＩＴＥ ＡＰ−０１５９１ NITE AP-01591
Claims (5)
前記動物から抗体産生細胞を回収する工程と、
前記抗体産生細胞とミエローマとを細胞融合し、ハイブリドーマを調製する工程と、
前記ハイブリドーマが産生する抗体と、前記アミノ酸配列からなるペプチドを含む組成物とを接触させ、該アミノ酸配列からなるペプチドを含む組成物に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程と、
前記選択されたハイブリドーマが産生する抗体を回収する工程とを含む方法により得られ、
アルギニン残基が非対称ジメチル化されたＴＬＳを認識することを特徴とする抗ＴＬＳモノクローナル抗体。 A step of administering to an animal a peptide comprising an amino acid sequence represented by CGGRRGGGSG (SEQ ID NO: 1) (wherein R is an asymmetrically dimethylated arginine residue) as an immunogen; ,
Recovering antibody-producing cells from the animal;
Cell fusion of the antibody-producing cells and myeloma to prepare a hybridoma;
Contacting the antibody produced by the hybridoma with a composition comprising a peptide comprising the amino acid sequence, and selecting a hybridoma producing an antibody that binds to the composition comprising the peptide comprising the amino acid sequence;
Recovering the antibody produced by the selected hybridoma.
An anti-TLS monoclonal antibody characterized by recognizing TLS in which an arginine residue is asymmetrically dimethylated.
前記動物から抗体産生細胞を回収する工程と、
前記抗体産生細胞とミエローマとを細胞融合し、ハイブリドーマを調製する工程と、
前記ハイブリドーマが産生する抗体と、前記アミノ酸配列からなるペプチドを含む組成物とを接触させ、該アミノ酸配列からなるペプチドを含む組成物に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程と、
前記選択されたハイブリドーマが産生する抗体を回収する工程とを含み、
前記回収された抗体が、アルギニン残基が非対称ジメチル化されたＴＬＳを認識することを特徴とする抗ＴＬＳモノクローナル抗体の製造方法。 A step of administering to an animal a peptide comprising an amino acid sequence represented by CGGRRGGGSG (SEQ ID NO: 1) (wherein R is an asymmetrically dimethylated arginine residue) as an immunogen; ,
Recovering antibody-producing cells from the animal;
Cell fusion of the antibody-producing cells and myeloma to prepare a hybridoma;
Contacting the antibody produced by the hybridoma with a composition comprising a peptide comprising the amino acid sequence, and selecting a hybridoma producing an antibody that binds to the composition comprising the peptide comprising the amino acid sequence;
Recovering the antibody produced by the selected hybridoma,
A method for producing an anti-TLS monoclonal antibody, wherein the recovered antibody recognizes TLS in which an arginine residue is asymmetrically dimethylated.
前記動物から抗体産生細胞を回収する工程と、
前記抗体産生細胞とミエローマとを細胞融合し、ハイブリドーマを調製する工程と、
前記ハイブリドーマが産生する抗体と、前記アミノ酸配列からなるペプチドを含む組成物とを接触させ、該アミノ酸配列からなるペプチドを含む組成物に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程とを含み、
前記選択されたハイブリドーマが産生する抗体が、アルギニン残基が非対称ジメチル化されたＴＬＳを認識することを特徴とするハイブリドーマの製造方法。 A step of administering to an animal a peptide comprising an amino acid sequence represented by CGGRRGGGSG (SEQ ID NO: 1) (wherein R is an asymmetrically dimethylated arginine residue) as an immunogen; ,
Recovering antibody-producing cells from the animal;
Cell fusion of the antibody-producing cells and myeloma to prepare a hybridoma;
Contacting the antibody produced by the hybridoma with a composition comprising a peptide comprising the amino acid sequence, and selecting a hybridoma producing an antibody that binds to the composition comprising the peptide comprising the amino acid sequence,
A method for producing a hybridoma, wherein the antibody produced by the selected hybridoma recognizes TLS in which an arginine residue is asymmetrically dimethylated.
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