JP2014205626A - Platinum binder, and use thereof - Google Patents

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Akihiko Yamagishi
明彦 山岸
哲史 赤沼
Tetsushi Akanuma
哲史 赤沼
寛也 新納
Hiroya Niino
寛也 新納
内田　達也
Tatsuya Uchida
達也 内田
勇人 秋山
Hayato Akiyama
勇人 秋山
理文 八尾
Masafumi Yao
理文 八尾
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a platinum binder using a peptide or polypeptide having binding capacity to platinum.SOLUTION: A peptide comprising amino acid sequence YKRGYK, or a polypeptide comprising the amino acid sequence has platinum binding capacity, and can be used as a platinum binder.

Description

本発明は、白金に対する結合能を有するペプチド又はポリペプチドを利用した白金結合剤に関する。更に、本発明は、当該白金結合剤を利用した、白金−ペプチド又はポリペプチド複合体、ファージ、白金−ファージ複合体、及び各種方法に関する。   The present invention relates to a platinum binding agent using a peptide or polypeptide having binding ability to platinum. Furthermore, the present invention relates to a platinum-peptide or polypeptide complex, phage, platinum-phage complex, and various methods using the platinum binder.

タンパク質の生体における機能は多種多様であり、様々な種類のタンパク質が存在している。例えば、酵素、生体構造を形成するタンパク質、生体内の情報のやり取りに関与するタンパク質、運動に関与するタンパク質等がある。これらのタンパク質が機能を発揮する上で最も重要な過程に、他の分子との特異的な会合が挙げられる。酵素及び抗体は、その基質及び抗原と特異的に会合することにより機能を発揮する。また、構造形成、運動や情報のやり取りも、タンパク質の特異的会合なしでは考えられない。この特異的会合は、基本的には二次〜四次元構造の形成と同様の原理に基づき、対象分子との間に複数の疎水結合、水素結合、イオン結合が作られ安定化することで実現される。   Proteins have various functions in the living body, and various types of proteins exist. For example, there are enzymes, proteins that form biological structures, proteins involved in the exchange of information in the living body, proteins involved in movement, and the like. The most important process for the function of these proteins is specific association with other molecules. Enzymes and antibodies exert their functions by specifically associating with their substrates and antigens. In addition, structure formation, movement and exchange of information cannot be considered without specific association of proteins. This specific association is realized by creating and stabilizing multiple hydrophobic bonds, hydrogen bonds, and ionic bonds with the target molecule, basically based on the same principle as the formation of secondary to four-dimensional structures. Is done.

生体低分子と金属の結合に関しては１９９０年代から研究が始まっている。例えば、非特許文献１では酸化鉄に結合するペプチドが報告されている。その後、酸化鉄に結合するアダプター（非特許文献２）、酸化亜鉛に結合するアダプター（非特許文献３）等が見出されている。こうしたアダプターは、開発当初、環境中の毒性物質の除去や測定をするための研究結果として生み出されてきた。   Research has started on the binding of small biological molecules and metals since the 1990s. For example, Non-Patent Document 1 reports a peptide that binds to iron oxide. Thereafter, adapters that bind to iron oxide (Non-Patent Document 2), adapters that bind to zinc oxide (Non-Patent Document 3), and the like have been found. These adapters were originally developed as a result of research to remove and measure toxic substances in the environment.

一方で、２０００年に半導体の材料であるガリウム砒素に結合するペプチドが非特許文献４において報告されたことにより、ペプチドの応用範囲が広がり、半導体分野での応用も期待されるようになった。ガリウム砒素と結合するペプチドの成果によって、これまでと異なった視点から金属と結合するペプチドが注目を集めることとなった。その後、自然界の自己組織化に見られる炭酸カルシウム（非特許文献５）、シリカ（非特許文献６）、銀（特許文献１、非特許文献７）、チタン（特許文献１）といったバイオミネラリゼーションに関わる化合物に対して結合能を有するペプチドが見出された。また、コンピューターや触媒等の分野で工業的に広く利用されている金に対して結合能を有するアプタマーも見出されている（非特許文献８）。   On the other hand, since a peptide that binds to gallium arsenide, which is a semiconductor material, was reported in Non-Patent Document 4 in 2000, the application range of the peptide has expanded and application in the semiconductor field has also been expected. Due to the results of peptides that bind to gallium arsenide, peptides that bind to metals have attracted attention from different perspectives. Thereafter, biomineralization such as calcium carbonate (Non-patent document 6), silica (Non-patent document 6), silver (Patent document 1, Non-patent document 7), and titanium (Patent document 1) found in self-organization in nature. Peptides having a binding ability to compounds related to the above have been found. In addition, aptamers having binding ability to gold that are widely used industrially in the fields of computers and catalysts have been found (Non-patent Document 8).

しかしながら、金属に対して結合能を有するアプタマーは、二次構造を持ちながら金属と結合しているという報告はほとんど存在しない。タンパク質として立体構造を維持しながら金属と結合するナノブロックを作製できれば、高いレベルでの特異性、ナノサイズでの金属粒子の配置コントロールが可能になると期待される。更に、遺伝子改変によるタンパク質のデザインで無機材料との相互作用を制御する方法が確立できれば、各種バイオデバイスおよび医療材料の開発に寄与すると考えられる。   However, there are almost no reports that aptamers having a binding ability to a metal have a secondary structure and are bound to the metal. If nanoblocks that bind to metals can be produced while maintaining the three-dimensional structure as proteins, it is expected that specificity at a high level and arrangement control of metal particles at nano-sizes will be possible. Furthermore, if a method for controlling the interaction with inorganic materials can be established by designing proteins by genetic modification, it is considered to contribute to the development of various biodevices and medical materials.

更に、白金は、各種バイオセンサの電極、触媒、抗菌剤等として利用されているが、白金に対して結合能を有するアプタマーは報告されていない。そこで、白金に対して結合能を有するアプタマーを開発できれば、白金を利用する技術分野において革新的な技術進歩をもたらし得ると期待される。   Furthermore, platinum is used as an electrode, catalyst, antibacterial agent and the like for various biosensors, but no aptamer having a binding ability to platinum has been reported. Thus, if an aptamer capable of binding to platinum can be developed, it is expected that an innovative technological advance can be brought about in the technical field using platinum.

国際公開第２００５／１００３１号International Publication No. 2005/10031

PNAS ８９（１８）、p８６５１-５、１９９２PNAS 89 (18), p8651-5, 1992 FEMS １７０（２）、p３６３-７１、１９９９FEMS 170 (2), p363-71, 1999 Appl Environ Microbiol ６６（１）、p１０-４、２０００Appl Environ Microbiol 66 (1), p10-4, 2000 Nature ４０５（６７８７）、p６６５-８、２０００Nature 405 (6787), p665-8, 2000 Biotech Lett ２２、p１２１１-６、２０００Biotech Lett 22, p1211-6, 2000 J Nanosci Nanotechnol ２（１）、p９５-１００、２００２J Nanosci Nanotechnol 2 (1), p95-100, 2002 Nat Mater. １（３）、p１６９-７２、２００２Nat Mater. 1 (3), p169-72, 2002 Nat Biotechnol １５（３）、p２６９-７２、１９９７Nat Biotechnol 15 (3), p269-72, 1997

本発明は、前述する従来技術の現状に鑑み創案されたものであり、その目的は、白金に対する結合能を有するペプチド又はポリペプチドを利用した白金結合剤、及び当該白金結合剤を利用した各種技術を提供することである。   The present invention was devised in view of the above-described current state of the prior art, and the object thereof is a platinum binder using a peptide or polypeptide having a binding ability to platinum, and various techniques using the platinum binder. Is to provide.

本発明者らは、まず、白金に結合能を有するペプチドの探索に人工タンパク質を利用することを想起し、当該人工タンパク質のループ構造にランダム変異を導入した変異体ライブラリーを作製し、ファージディスプレイ法を用いたスクリーニングにより、白金結合能が格別に高い変異人工タンパク質として、ループ構造にアミノ酸配列ＹＫＲＧＹＫ（配列番号１）を有するポリペプチドを見出した。次に、得られた変異体人工タンパク質と白金表面との結合状態をフロー型水晶振動子マイクロバランス測定装置により測定したところ、当該変異体人工タンパク質は、前記ループ構造の領域が白金表面に配向して結合していることを見出した。三次構造を維持したタンパク質の白金表面への配向性のある結合は、本発明が初めての発見である。本発明は、これらの知見に基づいて、更に検討を重ねることにより完成されたものである。   The present inventors first recalled the use of an artificial protein for the search for peptides capable of binding to platinum, prepared a mutant library in which random mutations were introduced into the loop structure of the artificial protein, and phage display. As a result of screening using this method, a polypeptide having the amino acid sequence YKRGYK (SEQ ID NO: 1) in the loop structure was found as a mutant artificial protein having a particularly high platinum-binding ability. Next, when the binding state of the obtained mutant artificial protein and the platinum surface was measured with a flow-type quartz crystal microbalance measuring device, the mutant artificial protein had the loop structure region oriented on the platinum surface. And found that they are combined. This is the first discovery of the present invention for the orientational binding of proteins that maintain tertiary structure to the platinum surface. The present invention has been completed by further studies based on these findings.

即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１． 下記(i)又は(ii)に示すペプチド、或いは下記(iii)又は(iv)に示すポリペプチドからなることを特徴とする、白金吸着剤：
(i)配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド。
(ii)配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するペプチド。
(iii)配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するポリペプチド。
(iv)配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するポリペプチド。
項２． 下記(A)〜(D)のいずれかに示すポリペプチドからなる、請求項１に記載の白金吸着剤：
(A)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(B)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１〜２０位のアミノ酸配列及び／又は２７〜９７位のアミノ酸配列の領域における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するポリペプチド。
(C)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、２１〜２６位のアミノ酸配列の領域における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するポリペプチド。
(D)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、２１〜２６位のアミノ酸配列の領域における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加され、且つ１〜２０位のアミノ酸配列及び／又は２７〜９７位のアミノ酸配列の領域における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するポリペプチド。
項３． 項１又は２に記載の白金吸着剤が白金と結合されてなる、白金−ペプチド又はポリペプチド複合体。
項４． 項１又は２に記載の白金吸着剤を提示してなるファージ。
項５． 項４に記載のファージが白金と結合されてなる、白金−ファージ複合体。
項６． 項１又は２に記載の白金吸着剤又は項４に記載のファージを、白金と接触させる工程を含む、白金の結合方法。
項７． 項１又は２に記載の白金吸着剤を、白金表面に結合させる工程を含む、白金の改質方法。
項８． 項１又は２に記載の白金結合剤又は項４に記載のファージを、白金電極面上に配向させる工程を含む、白金の配向方法。
項９． 項１又は２に記載の白金吸着剤又は項４に記載のファージを、白金含有物と接触させる工程を含む、白金含有物から白金を回収する方法。
項１０． 項１又は２に記載の白金結合剤又は項４に記載のファージを用いて基板上にパターンを作製し、当該白金結合剤又はファージを介して白金粒子を結合させる工程、或いは項３に記載の白金−ペプチド又はポリペプチド複合体、又は項５に記載の白金−ファージ複合体を用いて基板上にパターンを作製する工程を含む、基板上に白金粒子を配置する方法。
項１１． 下記(i)又は(ii)に示すペプチド：
(i)配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド。
(ii)配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するペプチド。
項１２． 下記(A)〜(D)のいずれかに示すポリペプチド：
(A)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(B)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１〜２０位のアミノ酸配列及び／又は２７〜９７位のアミノ酸配列の領域における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するポリペプチド。
(C)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、２１〜２６位のアミノ酸配列の領域における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するポリペプチド。
(D)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、２１〜２６位のアミノ酸配列の領域における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加され、且つ１〜２０位のアミノ酸配列及び／又は２７〜９７位のアミノ酸配列の領域における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するポリペプチド。 That is, this invention provides the invention of the aspect hung up below.
Item 1. A platinum adsorbent comprising the peptide shown in the following (i) or (ii) or the polypeptide shown in the following (iii) or (iv):
(i) A peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(ii) A peptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having a binding ability to platinum.
(iii) A polypeptide comprising an amino acid sequence having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and capable of binding to platinum.
(iv) A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and having a binding ability to platinum.
Item 2. The platinum adsorbent according to claim 1, comprising the polypeptide shown in any of (A) to (D) below:
(A) A polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
(B) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, one or several amino acids in the region of the amino acid sequence at positions 1 to 20 and / or the amino acid sequence at positions 27 to 97 were substituted, deleted, inserted or added A polypeptide comprising an amino acid sequence and capable of binding to platinum.
(C) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, the amino acid sequence consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids in the region of the amino acid sequence at positions 21 to 26 are substituted, deleted, inserted or added, and has an ability to bind to platinum. Having a polypeptide.
(D) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, one or several amino acids in the region of the amino acid sequence at positions 21 to 26 are substituted, deleted, inserted or added, and the amino acid sequence at positions 1 to 20 and / or Or a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids in the region of the amino acid sequence at positions 27 to 97 are substituted, deleted, inserted or added, and having a binding ability to platinum.
Item 3. Item 3. A platinum-peptide or polypeptide complex formed by combining the platinum adsorbent according to Item 1 or 2 with platinum.
Item 4. Item 3. A phage displaying the platinum adsorbent according to item 1 or 2.
Item 5. Item 5. A platinum-phage complex, wherein the phage according to Item 4 is bound to platinum.
Item 6. Item 5. A method for binding platinum, comprising the step of bringing the platinum adsorbent according to Item 1 or 2 or the phage according to Item 4 into contact with platinum.
Item 7. Item 3. A method for modifying platinum, comprising the step of bonding the platinum adsorbent according to Item 1 or 2 to a platinum surface.
Item 8. Item 5. A method for aligning platinum, comprising the step of aligning the platinum binding agent according to Item 1 or 2 or the phage according to Item 4 on a platinum electrode surface.
Item 9. Item 5. A method for recovering platinum from a platinum-containing material, comprising the step of bringing the platinum adsorbent according to Item 1 or 2 or the phage according to Item 4 into contact with the platinum-containing material.
Item 10. Item 5. A step of producing a pattern on a substrate using the platinum binding agent according to Item 1 or 2 or the phage according to Item 4, and binding platinum particles via the platinum binding agent or phage, or A method for arranging platinum particles on a substrate, comprising a step of producing a pattern on the substrate using the platinum-peptide or polypeptide complex or the platinum-phage complex according to Item 5.
Item 11. Peptides shown in (i) or (ii) below:
(i) A peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(ii) A peptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having a binding ability to platinum.
Item 12. The polypeptide shown in any of the following (A) to (D):
(A) A polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
(B) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, one or several amino acids in the region of the amino acid sequence at positions 1 to 20 and / or the amino acid sequence at positions 27 to 97 were substituted, deleted, inserted or added A polypeptide comprising an amino acid sequence and capable of binding to platinum.
(C) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, the amino acid sequence consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids in the region of the amino acid sequence at positions 21 to 26 are substituted, deleted, inserted or added, and has an ability to bind to platinum. Having a polypeptide.
(D) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, one or several amino acids in the region of the amino acid sequence at positions 21 to 26 are substituted, deleted, inserted or added, and the amino acid sequence at positions 1 to 20 and / or Or a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids in the region of the amino acid sequence at positions 27 to 97 are substituted, deleted, inserted or added, and having a binding ability to platinum.

本発明によれば、ペプチド又はポリペプチドを利用して、白金を結合させることができるので、白金表面の改質、白金の回収、白金とペプチド又はポリペプチドが結合して複合化された各種複合材料の提供、基板上での白金粒子の配置コントロール等が可能になる。また、本発明によれば、白金結合能を有するループ構造のアミノ酸配列を各種機能性タンパク質に導入したポリペプチドを使用することによって、白金と機能性タンパク質の複合化材料を提供できるので、白金と機能性タンパク質の両特性を併せ持つ新たな機能性素材を提供することも可能になる。   According to the present invention, platinum can be bound using a peptide or polypeptide, so that platinum surface modification, recovery of platinum, and various complexes in which platinum and peptide or polypeptide are combined and combined. It is possible to provide materials and control the arrangement of platinum particles on the substrate. Further, according to the present invention, by using a polypeptide in which an amino acid sequence having a loop structure having platinum binding ability is introduced into various functional proteins, a composite material of platinum and functional proteins can be provided. It is also possible to provide a new functional material having both characteristics of a functional protein.

アスペルギルス属由来グルコース酸化酵素（ＥＣ１．１．３．４）（配列番号４に示されるアミノ酸配列）の立体構造を模式的に示す。図下部の矢印は、配列番号４に示されるアミノ酸配列における２５５〜２６０位の領域で形成されるループ構造を示す。図上部の矢印は、当該グルコース酸化酵素の基質ポケット／活性中心の位置を示している。3 schematically shows the three-dimensional structure of Aspergillus-derived glucose oxidase (EC 1.1.3.4) (amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4). The arrow at the bottom of the figure shows the loop structure formed by the region of positions 255 to 260 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4. The arrow at the top of the figure indicates the position of the substrate pocket / active center of the glucose oxidase. Ａ及びＢは、野生型ＬＡＲＦＨの立体構造を示す図である。Ａには、野生型ＬＡＲＦＨサイズを示し、Ｂには、矢印にてＬＡＲＦＨのループ構造を示している。A and B are diagrams showing the three-dimensional structure of wild-type LARFH. A shows the wild type LARFH size, and B shows the loop structure of LARFH with an arrow. 野生型ＬＡＲＦＨ（ループ構造の領域がＳＧＱＧＧＳ）と変異型ＬＡＲＦＨ（ループ構造の領域がＹＫＲＧＹＫ）のアミノ酸配列のペアワイズアライメントを示す図である。It is a figure which shows the pairwise alignment of the amino acid sequence of wild type LARFH (region of loop structure is SGQGGS) and mutant type LARFH (region of loop structure is YKRGYK). 野生型ＬＡＲＦＨ（Ｗｉｌｄ ＬＡＲＦＨ）を提示するファージ、変異型ＬＡＲＦＨ（ＹＫＲＧＹＫ ＬＡＲＦＨ）を提示するファージ、未提示のファージ（Ｔ７ ｐｈａｇｅ）について、ファージ濃度と白金吸着の関係を示す図である。横軸は反応に使用したファージ数（ｐｆｕ）、縦軸は白金粒子に結合したファージ数（ｐｆｕ）を示す。It is a figure which shows the relationship between phage density | concentration and platinum adsorption | suction about the phage which displays wild type LARFH (Wild LARFH), the phage which displays mutant | variant LARFH (YKRGYK LARFH), and the undisplayed phage (T7 phage). The horizontal axis represents the number of phages used for the reaction (pfu), and the vertical axis represents the number of phages bound to the platinum particles (pfu). 実施例で使用したフロー型水晶振動子マイクロバランス（ＦＱＣＭ）装置の模式図である。Ａはサンプル溶液のリザーバー、Ｂはキャリア溶液のリザーバー、Ｃは恒温ループ、Ｄは切替バルブ、Ｅはフローセル、Ｆはポンプ、Ｇはドレイン、ＨはＰＣ、Ｉは周波数カウンタ、二重線はインキュベーター、矢印は溶液の流れる方向を示す。1 is a schematic diagram of a flow-type crystal resonator microbalance (FQCM) device used in an example. FIG. A is a sample solution reservoir, B is a carrier solution reservoir, C is a constant temperature loop, D is a switching valve, E is a flow cell, F is a pump, G is a drain, H is a PC, I is a frequency counter, and a double line is an incubator The arrows indicate the direction of solution flow. ＦＱＣＭ装置にて周波数の時間経過を測定した際に得られる結果の例を示す図である。ａには、キャリア溶液をフローセルに送液した際に得られ周波数の経時変化（ベースライン）の例を示し、ｂには、キャリア溶液、サンプル溶液、及びキャリア液の順でフローセルに送液した際に得られる周波数の経時変化の例を示す。It is a figure which shows the example of the result obtained when measuring the time passage of a frequency with a FQCM apparatus. a shows an example of frequency change (baseline) obtained when the carrier solution is sent to the flow cell, and b shows the carrier solution, the sample solution, and the carrier solution in this order. The example of the time-dependent change of the frequency obtained in this case is shown. 実施例で使用した水晶振動子のセットアップの模式図である。It is a schematic diagram of the setup of the crystal oscillator used in the Example. 実施例で使用したＦＱＣＭ装置の外観を撮影した写真図である。It is the photograph which image | photographed the external appearance of the FQCM apparatus used in the Example. 白金表面ＦＱＣＭ測定を行った結果を示す図である。横軸には時間、縦軸には周波数変化ΔＦを示す。Ａには野生型ＬＡＲＦＨをサンプルとした測定結果を示し、Ｂには変異型ＬＡＲＦＨをサンプルとした測定結果を示す。It is a figure which shows the result of having performed platinum surface FQCM measurement. The horizontal axis represents time, and the vertical axis represents frequency change ΔF. A shows the measurement results using wild-type LARFH as a sample, and B shows the measurement results using mutant LARFH as a sample. ＱＣＭ測定より算出された計算値に基づく、野生型ＬＡＲＦＨ及び変異型ＬＡＲＦＨの白金電極表面への結合形態の模式図である。It is a schematic diagram of the binding form to the platinum electrode surface of wild type LARFH and mutant type LARFH based on the calculated value calculated from the QCM measurement.

配列表を除いた本明細書において、アミノ酸配列中の２０種類のアミノ酸残基は、一文字略記で表現することもある。即ち、グリシン（Ｇｌｙ）はＧ、アラニン（Ａｌａ）はＡ、バリン（Ｖａｌ）はＶ、ロイシン（Ｌｅｕ）はＬ、イソロイシン（Ｉｌｅ）はＩ、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）はＦ、チロシン（Ｔｙｒ）はＹ、トリプトファン（Ｔｒｐ）はＷ、セリン（Ｓｅｒ）はＳ、スレオニン（Ｔｈｒ）はＴ、システイン（Ｃｙｓ）はＣ、メチオニン（Ｍｅｔ）はＭ、アスパラギン酸（Ａｓｐ）はＤ、グルタミン酸（Ｇｌｕ）はＥ、アスパラギン（Ａｓｎ）はＮ、グルタミン（Ｇｌｎ）はＱ、リジン（Ｌｙｓ）はＫ、アルギニン（Ａｒｇ）はＲ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）はＨ、プロリン（Ｐｒｏ）はＰである。   In the present specification excluding the sequence listing, the 20 amino acid residues in the amino acid sequence may be expressed by single letter abbreviations. That is, glycine (Gly) is G, alanine (Ala) is A, valine (Val) is V, leucine (Leu) is L, isoleucine (Ile) is I, phenylalanine (Phe) is F, tyrosine (Tyr) is Y , Tryptophan (Trp) is W, serine (Ser) is S, threonine (Thr) is T, cysteine (Cys) is C, methionine (Met) is M, aspartic acid (Asp) is D, glutamic acid (Glu) is E Asparagine (Asn) is N, glutamine (Gln) is Q, lysine (Lys) is K, arginine (Arg) is R, histidine (His) is H, and proline (Pro) is P.

１．白金結合剤として使用されるペプチド及びポリペプチド
本発明の白金結合剤は、下記(i)又は(ii)に示すペプチド、或いは下記(iii)又は(iv)に示すポリペプチドからなることを特徴とする。
(i)配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド。
(ii)配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するペプチド。
(iii)配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するポリペプチド。
(iv)配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するポリペプチド。 1. Peptides and polypeptides used as a platinum binding agent The platinum binding agent of the present invention is characterized by comprising a peptide shown in the following (i) or (ii) or a polypeptide shown in the following (iii) or (iv): To do.
(i) A peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(ii) A peptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having a binding ability to platinum.
(iii) A polypeptide comprising an amino acid sequence having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and capable of binding to platinum.
(iv) A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and having a binding ability to platinum.

以下、(i)及び(ii)に示すペプチド、並びに(iii)及び(iv)に示すポリペプチドについて詳述する。   Hereinafter, the peptides shown in (i) and (ii) and the polypeptides shown in (iii) and (iv) will be described in detail.

(i)に示すペプチド
(i)に示すペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列（ＹＫＲＧＹＫ）からなる。(i)に示すペプチドは、前記特定のアミノ酸配列に基づいて白金に対する結合能を備えることが可能になっていると考えられる。 Peptide shown in (i)
The peptide shown in (i) consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (YKRGYK). The peptide shown in (i) is considered to be capable of binding to platinum based on the specific amino acid sequence.

(i)に示すペプチドは、前記アミノ酸配列に従って、液相法、固相法等の、一般的なペプチドの化学合成法により製造することができる。   The peptide shown in (i) can be produced by a general peptide chemical synthesis method such as a liquid phase method or a solid phase method according to the amino acid sequence.

(ii)に示すペプチド
(ii)に示すペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するペプチドからなる。 Peptide shown in (ii)
The peptide shown in (ii) consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and has a binding ability to platinum.

(ii)に示すペプチドにおいて、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して、置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸の数としては、１又は数個で、且つ白金に対する結合能を有する範囲で適宜設定される。例えば、アミノ酸の置換の場合には、１〜３個、好ましくは１又は２個、更に好ましくは１個が挙げられる。アミノ酸の欠失の場合には、１又は２個、好ましくは１個が挙げられる。アミノ酸の挿入（配列番号１における１位のＹのＣ末端側から６位のＫのＮ末端側内へのアミノ酸の挿入）の場合には、１〜３個、好ましくは１又は２個、更に好ましくは１個が挙げられる。アミノ酸の付加（配列番号１における１位のＹのＮ末端及び／又は６位のＫのＣ末端へのアミノ酸の付加）の場合には、１〜７個、好ましくは１〜５個、更に好ましくは１〜３個が挙げられる。   In the peptide shown in (ii), the number of amino acids substituted, deleted, inserted or added with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is 1 or several and has a binding ability to platinum. Is set as appropriate. For example, in the case of amino acid substitution, 1 to 3, preferably 1 or 2, more preferably 1 may be mentioned. In the case of amino acid deletion, one or two, preferably one is mentioned. In the case of insertion of an amino acid (insertion of an amino acid from the C-terminal side of Y at position 1 to the N-terminal side of K at position 6 in SEQ ID NO: 1), 1 to 3, preferably 1 or 2, Preferably one is mentioned. In the case of addition of an amino acid (addition of an amino acid to the N-terminus of Y at position 1 and / or the C-terminus of K at position 6 in SEQ ID NO: 1), 1 to 7, preferably 1 to 5, more preferably 1-3 are mentioned.

なお、(ii)に示すペプチドにおいて、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して、置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸の種類は、配列番号１に示されるアミノ酸配列によって形成されるループ構造がある程度維持されることを一つの指標として、当該アミノ酸配列によって備え得る白金結合能を保持できるように設定すればよい。例えば、アミノ酸の置換の場合であれば、置換前のアミノ酸残基の性質と置換後のアミノ酸残基の性質が異なる非保存的置換を行ってもよいが、側鎖官能基の性質に基づいて保存的置換を行うことが好ましい。保存的置換とは、もとのアミノ酸残基と置換後のアミノ酸残基が同一のカテゴリーに分類されるアミノ酸残基であることを指す。具体的には、配列番号１における１位及び／又は５位のチロシン（Ｙ）を置換する場合であれば、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン、及びグルタミンの中のいずれか一つの非電荷アミノ酸に置換すればよい。また、配列番号１における２位及び／又は６位のリジン（Ｋ）を置換する場合であれば、アルギニン及びヒスチジンの中のいずれか一つの塩基性アミノ酸に置換すればよい。また、配列番号１における３位のアルギニン（Ｒ）を置換する場合であれば、リジン及びヒスチジンの中のいずれか一つの塩基性アミノ酸に置換すればよい。また、配列番号１における４位のグリシン（Ｇ）を置換する場合であれば、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンの中のいずれか一つの非電荷アミノ酸に置換すればよい。なお、配列番号１における４位のグリシンは、ペプチドの立体構造の形成に大きく寄与していると考えられるため、(ii)に示すペプチドにおいて置換されていないことが好ましい。   In the peptide shown in (ii), the type of amino acid substituted, deleted, inserted or added to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is a loop formed by the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. What is necessary is just to set so that the platinum-binding ability which can be provided with the said amino acid sequence can be hold | maintained by making the structure maintain to some extent into one parameter | index. For example, in the case of amino acid substitution, non-conservative substitution may be performed in which the nature of the amino acid residue before substitution and the nature of the amino acid residue after substitution are different, but based on the nature of the side chain functional group Preferably conservative substitutions are made. A conservative substitution refers to an amino acid residue in which the original amino acid residue and the amino acid residue after substitution are classified into the same category. Specifically, in the case of substituting tyrosine (Y) at position 1 and / or 5 in SEQ ID NO: 1, any one uncharged glycine, serine, threonine, cysteine, asparagine, and glutamine What is necessary is just to substitute for an amino acid. In addition, in the case of substituting lysine (K) at position 2 and / or 6 in SEQ ID NO: 1, it may be replaced with any one of arginine and histidine. Further, in the case of substituting arginine (R) at position 3 in SEQ ID NO: 1, it may be substituted with any one basic amino acid of lysine and histidine. In addition, when substituting glycine (G) at position 4 in SEQ ID NO: 1, it may be substituted with any one uncharged amino acid among serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, and glutamine. Note that the glycine at position 4 in SEQ ID NO: 1 is considered not to be substituted in the peptide shown in (ii) because it is considered that it greatly contributes to the formation of the three-dimensional structure of the peptide.

(ii)に示すペプチドは、前記(i)に示すペプチドと同様、そのアミノ酸配列に従って、液相法、固相法等の、一般的なペプチドの化学合成法により製造することができる。   The peptide shown in (ii) can be produced by a general peptide chemical synthesis method, such as a liquid phase method or a solid phase method, according to the amino acid sequence in the same manner as the peptide shown in (i) above.

(iii)に示すポリペプチド
(iii)に示すポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するアミノ酸配列からなり、且つ白金に対する結合能を有するポリペプチドである。即ち、(iii)に示すポリペプチドは、前記(i)に示すペプチドが挿入されているポリペプチドである。 Polypeptide shown in (iii)
The polypeptide shown in (iii) is a polypeptide having an amino acid sequence having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having a binding ability to platinum. That is, the polypeptide shown in (iii) is a polypeptide into which the peptide shown in (i) is inserted.

(iii)に示すポリペプチドのアミノ酸配列おいて、配列番号１に示されるアミノ酸配列が配置される位置については、白金に対する結合能を備えることを限度として、特に制限されず、Ｎ末端又はＣ末端に配置されていてもよく、また非末端部分に配置されていてもよい。   In the amino acid sequence of the polypeptide shown in (iii), the position at which the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is arranged is not particularly limited as long as it has a binding ability to platinum, and is N-terminal or C-terminal. It may be arranged in a non-terminal part.

(iii)に示すポリペプチドにおける全アミノ酸数については、白金に対する結合能を備えることを限度として特に制限されないが、例えば、５０〜１０，０００個、好ましくは５０〜５，０００個、更に好ましくは５０〜１，０００個、より好ましくは５０〜５００個、特に好ましくは５０〜１００個が挙げられる。   The total number of amino acids in the polypeptide shown in (iii) is not particularly limited as long as it has the ability to bind to platinum. For example, 50 to 10,000, preferably 50 to 5,000, more preferably 50-1,000, More preferably, 50-500, Especially preferably, 50-100 is mentioned.

(iii)に示すポリペプチドにおいて、配列番号１に示されるアミノ酸配列以外の領域のアミノ酸配列については、白金結合能を備えることを限度として特に制限されないが、例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列によってループ構造が形成され、且つ当該ループ構造が３次元構造において表面に露出可能になるように設定すればよい。   In the polypeptide shown in (iii), the amino acid sequence in a region other than the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is not particularly limited as long as it has platinum-binding ability. For example, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 The loop structure may be formed by the above and the loop structure may be set to be exposed on the surface in the three-dimensional structure.

また、(iii)に示すポリペプチドにおいて、配列番号１に示されるアミノ酸配列以外の領域のアミノ酸配列については、人工的に作製されたアミノ酸配列であってもよく、また生物由来のタンパク質、その変異体、又はそれらのフラグメントのアミノ酸配列であってもよい。ここで、生物由来のタンパク質としては、動物、植物、微生物等のいずれに由来するものであってもよく、例えば、酵素、生理活性タンパク質、色素タンパク質、構造タンパク質、及びそれらの複合体等が挙げられる。   In addition, in the polypeptide shown in (iii), the amino acid sequence in a region other than the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 may be an artificially prepared amino acid sequence. The amino acid sequence of the body, or a fragment thereof. Here, the biological protein may be derived from any animal, plant, microorganism, etc., and examples thereof include enzymes, physiologically active proteins, chromoproteins, structural proteins, and complexes thereof. It is done.

例えば、(iii)に示すポリペプチドにおいて、配列番号１に示されるアミノ酸配列以外の領域を、人工的に作製されたアミノ酸配列にする場合（以下、人工型ポリペプチドと表記することもある）、その具体的態様として、人工的に作製されたアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に配列番号１に示されるアミノ酸配列を付加したポリペプチド；人工的に作製されたアミノ酸配列内に配列番号１に示されるアミノ酸配列を挿入又は置換したポリペプチドが挙げられる。   For example, in the polypeptide shown in (iii), when a region other than the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is to be an artificially prepared amino acid sequence (hereinafter sometimes referred to as an artificial polypeptide), As a specific embodiment thereof, a polypeptide in which the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is added to the N-terminal and / or C-terminal of an artificially prepared amino acid sequence; SEQ ID NO: 1 in the artificially prepared amino acid sequence And a polypeptide in which the amino acid sequence shown in FIG.

より具体的には、(iii)に示すポリペプチドを人工型ポリペプチドとして提供する場合の一態様として、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に、アミノ酸数が４〜４０個からなるα−へリックスを少なくとも１つ形成するアミノ酸配列が付加されているアミノ酸配列からなるポリペプチド；好ましくは、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮ末端にアミノ酸数が４〜４０個からなるα−へリックスを１つ形成するアミノ酸配列が付加されており、且つ配列番号１に示されるアミノ酸配列のＣ末端にアミノ酸数が４〜４０個からなるα−へリックスを１〜３つ（好ましくは２又３つ、更に好ましくは３つ）形成するアミノ酸配列が付加されているポリペプチドが挙げられる。   More specifically, as an embodiment when the polypeptide shown in (iii) is provided as an artificial polypeptide, the number of amino acids is 4 to 4 at the N-terminus and / or C-terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. A polypeptide consisting of an amino acid sequence to which an amino acid sequence forming at least one α-helix consisting of 40 is added; preferably 4 to 40 amino acids at the N-terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 An amino acid sequence forming one α-helix consisting of 1 to 3 is added, and 1 to 3 α-helices consisting of 4 to 40 amino acids at the C-terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. (Preferably two or three, more preferably three) Polypeptides to which the forming amino acid sequence has been added can be mentioned.

また、(iii)に示すポリペプチドを人工型ポリペプチドとして提供する場合の具体例として、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。配列番号２に示されるアミノ酸配列は、人工タンパク質であるＬＡＲＦＨ（Ｌａｃ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ｆｏｕｒ ｈｅｌｉｘ ｐｒｏｔｅｉｎ；配列番号３）における２１〜２６位のアミノ酸配列（ループ構造）を配列番号１に示されるアミノ酸配列に置換したものであり、第１〜２０位のアミノ酸配列の領域において１つのαへリックスを形成し、２７〜９７位のアミノ酸配列の領域において３つのαへリックスを形成するように構成されている。   A specific example of providing the polypeptide shown in (iii) as an artificial polypeptide is a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, the amino acid sequence (loop structure) at positions 21 to 26 in the artificial protein LARFH (Lac repressor four helix protein; SEQ ID NO: 3) is substituted with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. It is configured so that one α helix is formed in the region of the amino acid sequence at the 1st to 20th positions, and three α helices are formed in the region of the amino acid sequence at the 27th to 97th positions.

また、(iii)に示すポリペプチドを人工型ポリペプチドとして提供する場合の他の具体例として、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１〜２０位のアミノ酸配列及び／又は２７〜９７位のアミノ酸配列の領域における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するポリペプチドが挙げられる。ここで、置換、欠失、挿入又は付加されるアミノ酸数としては、具体的には１〜２５個、好ましくは１〜２０個、更に好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜７個、特に好ましくは１〜５個が挙げられる。より具体的には、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１〜２０位のアミノ酸配列の領域において、置換、欠失、挿入又は付加されるアミノ酸数としては、具体的には１〜６個、好ましくは１〜５個、更に好ましくは１〜３個、より好ましくは１又は２個、特に好ましくは１個が挙げられる。また、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、２７〜９７位のアミノ酸配列の領域において、置換、欠失、挿入又は付加されるアミノ酸数としては、具体的には１〜１９個、好ましくは１〜１５個、更に好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜４個が挙げられる。また、アミノ酸の置換は、白金結合能を有することを限度として、非保存的置換であってもよく、また保存的置換であってもよい。アミノ酸は、「非極性アミノ酸」として、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン、及びトリプトファン；「非電荷アミノ酸」として、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミン；「酸性アミノ酸」として、アスパラギン酸及びグルタミン酸；「塩基性アミノ酸」として、リジン、アルギニン、及びヒスチジンにそれぞれ分類されるため、保存的置換を行う場合であれば、置換後のアミノ酸が置換前のアミノ酸と同じ分類に属するように設定すればよく、非保存的置換を行う場合であれば、置換後のアミノ酸が置換前のアミノ酸と異なる分類に属するように設定すればよい。   In addition, as another specific example in the case of providing the polypeptide shown in (iii) as an artificial polypeptide, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 has an amino acid sequence at positions 1 to 20 and / or positions 27 to 97. A polypeptide having an amino acid sequence in which one or several amino acids in the region of the amino acid sequence are substituted, deleted, inserted or added, and having a binding ability to platinum can be mentioned. Here, the number of amino acids to be substituted, deleted, inserted or added is specifically 1 to 25, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, more preferably 1 to 7, Especially preferably, 1-5 is mentioned. More specifically, in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, the number of amino acids to be substituted, deleted, inserted or added in the region of the amino acid sequence at positions 1 to 20 is specifically 1 to 6 , Preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, more preferably 1 or 2, and particularly preferably 1. In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, the number of amino acids to be substituted, deleted, inserted or added in the region of the 27th to 97th amino acid sequence is specifically 1 to 19, preferably 1 To 15, more preferably 1 to 7, more preferably 1 to 5, particularly preferably 1 to 4. The amino acid substitution may be a non-conservative substitution or a conservative substitution as long as it has a platinum-binding ability. Amino acids include “nonpolar amino acids” as alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, methionine, phenylalanine, and tryptophan; “uncharged amino acids” as glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, and glutamine; Acidic amino acids ”are aspartic acid and glutamic acid;“ basic amino acids ”are classified into lysine, arginine, and histidine, respectively. Therefore, if conservative substitution is performed, the amino acid after substitution is the same as the amino acid before substitution. What is necessary is just to set so that it may belong to the same classification | category, and when performing non-conservative substitution, what is necessary is just to set so that the amino acid after substitution may belong to the classification | category different from the amino acid before substitution.

また、(iii)に示すポリペプチドを人工型ポリペプチドとして提供する場合の他の具体例として、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有し、且つ配列番号２に示されるアミノ酸配列における２１〜２６位に対応する領域がＹＫＲＧＹＫであるアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するポリペプチドが挙げられる。ここで、「同一性」とは、ＢＬＡＳＴ ＰＡＣＫＡＧＥ〔ｓｇｉ３２ ｂｉｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０．１２；ａｖａｉｌａｂｌｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ［ＮＣＢＩ］〕のｂｌ２ｓｅｑ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｔａｔｉａｎａ Ａ．Ｔａｔｓｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．１７４，２４７−２５０，１９９９）により得られる同一性の値を示す。パラメーターは、Ｇａｐ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ Ｃｏｓｔ ｖａｌｕｅ：１１、Ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｃｏｓｔ ｖａｌｕｅ：１に設定して算出される。   As another specific example of providing the polypeptide shown in (iii) as an artificial polypeptide, it is 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. %, Particularly preferably 99% or more, and the region corresponding to positions 21 to 26 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 consists of an amino acid sequence of YKRGYK and has a binding ability to platinum. Peptides are mentioned. As used herein, “identity” refers to blst PACKAGE [sgi32 bit edition, Version 2.0.12; available from the National Center for Biotechnology Information [NCBI], bl2seq prog. FEMS Microbiol.Lett., Vol.174, 247-250, 1999). The parameters are calculated by setting Gap insertion Cost value: 11 and Gap extension Cost value: 1.

また、例えば、(iii)に示すペプチドにおいて、配列番号１に示されるアミノ酸配列以外の領域を、生物由来のタンパク質、その変異体、又はそれらのフラグメントのアミノ酸配列にする場合（以下、天然型ポリペプチド改変体と表記することもある）には、その具体的態様として、これらのアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に配列番号１に示されるアミノ酸配列を付加したポリペプチド、これらのアミノ酸配列内に配列番号１に示されるアミノ酸配列を挿入又は置換したポリペプチドが挙げられる。   In addition, for example, in the peptide shown in (iii), when the region other than the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is used as the amino acid sequence of an organism-derived protein, a variant thereof, or a fragment thereof (hereinafter referred to as natural polymorph (It may be referred to as a peptide variant)), as a specific embodiment thereof, a polypeptide obtained by adding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 to the N-terminal and / or C-terminal of these amino acid sequences, these amino acid sequences The polypeptide which inserted or substituted the amino acid sequence shown by sequence number 1 in the inside is mentioned.

(iii)に示すポリペプチドを天然型ポリペプチド改変体として提供する場合の一態様として、ループ構造（例えば、アミノ酸数が３〜２０個からなるループ構造）を有する、生物由来のタンパク質、その変異体、又はそれらのフラグメントのアミノ酸配列において、当該ループ構造の領域を配列番号１に示されるアミノ酸配列に置換したアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。   As an embodiment when the polypeptide shown in (iii) is provided as a natural polypeptide variant, an organism-derived protein having a loop structure (for example, a loop structure consisting of 3 to 20 amino acids), and its mutation And a polypeptide comprising an amino acid sequence obtained by substituting the region of the loop structure with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the amino acid sequence of the body or a fragment thereof.

(iii)に示すポリペプチドを天然型ポリペプチド改変体として提供する場合の具体例として、ループ構造を有する酵素のアミノ酸配列において当該ループ構造部分の領域を配列番号１に示されるアミノ酸配列に置換したアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。(iii)に示すポリペプチドを天然型ポリペプチド改変体として提供する場合について、グルコース酸化酵素（ＥＣ１．１．３．４）を例に挙げてより具体的に説明する。グルコース酸化酵素（ＥＣ１．１．３．４）は、血糖測定用のグルコースセンサ等に利用される酵素であり、例えば、ＰＤＢ ＩＤが１ＧＡＬで規定されるアスペルギルス属由来のグルコース酸化酵素はその一次構造と三次元立体構造が判明しており、その情報をＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／）より入手することができる。アスペルギルス属由来のグルコース酸化酵素（ＥＣ１．１．３．４）のアミノ酸配列を配列番号４に示す。配列番号４に示されるアミノ酸配列の２５５〜２６０位にあたる６アミノ酸からなる領域が、立体構造表面に局在するループ構造を形成しており、配列番号４に示されるアミノ酸配列において、２５５〜２６０位のアミノ酸配列を配列番号１に示されるアミノ酸配列に置換することにより、白金結合能を有する変異型グルコース酸化酵素をデザインすることができる。なお、ここでは、グルコース酸化酵素（ＥＣ１．１．３．４）を例に挙げて、白金結合能を有する天然型ポリペプチド改変体のデザイン指針を示したが、本発明で使用される白金結合能を有する天然型ポリペプチド改変体は、当該グルコース酸化酵素に限定されるものではない。   As a specific example of providing the polypeptide shown in (iii) as a natural polypeptide variant, the region of the loop structure portion in the amino acid sequence of an enzyme having a loop structure was substituted with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. A polypeptide consisting of an amino acid sequence is exemplified. The case where the polypeptide shown in (iii) is provided as a natural polypeptide variant will be described more specifically by taking glucose oxidase (EC 1.1.3.4) as an example. Glucose oxidase (EC 1.1.3.4) is an enzyme used for a glucose sensor for measuring blood glucose, for example, the primary structure of glucose oxidase derived from the genus Aspergillus whose PDB ID is defined by 1GAL. The three-dimensional structure is known, and the information can be obtained from Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb/). The amino acid sequence of the glucose oxidase (EC 1.1.3.4) derived from Aspergillus is shown in SEQ ID NO: 4. A region consisting of 6 amino acids corresponding to positions 255 to 260 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 forms a loop structure localized on the surface of the three-dimensional structure, and positions 255 to 260 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 By substituting the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, a mutant glucose oxidase having a platinum binding ability can be designed. In addition, here, the glucose oxidase (EC 1.1.3.4) is taken as an example, and the design guideline of the natural polypeptide variant having platinum binding ability is shown, but the platinum binding used in the present invention is shown. The natural polypeptide variant having the ability is not limited to the glucose oxidase.

(iii)に示すポリペプチドは、当該ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを用いて、遺伝子工学的手法によって製造することができる。即ち、(iii)に示すポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ）を発現ベクターに挿入し、宿主細胞に導入して形質転換体を得て、これを培養することにより(iii)に示すポリペプチドを得ることができる。また、例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされており、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いて形質転換体を得て、これを培養することにより得ることができる。   The polypeptide shown in (iii) can be produced by genetic engineering techniques using DNA encoding the amino acid sequence of the polypeptide. That is, by inserting a polynucleotide (DNA) encoding the amino acid sequence of the polypeptide shown in (iii) into an expression vector, introducing it into a host cell, obtaining a transformant, and culturing this to obtain (iii) The polypeptide shown can be obtained. Further, for example, the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is encoded by the polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5, and the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is It can be obtained by obtaining a transformant using a polynucleotide comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 and culturing it.

(iii)に示すポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、例えば部位特異的変異導入法等によって得ることができ、具体的には、Ｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲに基づく手法、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）の市販キットを利用する方法等によって調製できる。   A polynucleotide encoding the amino acid sequence of the polypeptide shown in (iii) can be obtained, for example, by site-directed mutagenesis, and the like. Specifically, a technique based on Inverse PCR, QuikChange II Kit (manufactured by Stratagene) ) And the like using a commercially available kit.

発現ベクターとしては、宿主内で自律的に増殖し得るファージ又はプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたものを使用できる。ファージとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、Ｌａｍｂｄａ ｇｔ１０、Ｌａｍｂｄａ ｇｔ１１等が例示される。また、プラスミドとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＱＥ３０ＸａおよびコスミドであるＳｕｐｅｒ Ｃｏｓ Ｉ等が例示される。また、シュードモナスを用いる場合には、グラム陰性菌用広宿主域ベクターであるＲＳＦ１０１０、ｐＢＢＲ１２２およびｐＣＮ５１等が例示される。   As the expression vector, a vector constructed for gene recombination from a phage or plasmid capable of autonomously growing in a host can be used. Examples of the phage include Lambda gt10 and Lambda gt11 when E. coli is used as a host. Examples of plasmids include pBR322, pUC18, pUC118, pUC19, pUC119, pTrc99A, pBluescript, pQE30Xa, and Super Cos I which is a cosmid when Escherichia coli is used as a host. Moreover, when using Pseudomonas, RSF1010, pBBR122, pCN51 etc. which are the wide host range vectors for Gram-negative bacteria are illustrated.

宿主としては、組換えベクターが安定であり、かつ自律増殖可能で外来性遺伝子の形質を発現できるのであれば特に制限されないが、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属およびシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属等に属する細菌が挙げられる。これらの中でも、大腸菌が好ましく、大腸菌ＤＨ５α、大腸菌ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ 大腸菌ＭＲＭ１５（ｐＲｅｐ４）株がより好ましい。   The host is not particularly limited as long as the recombinant vector is stable, can autonomously proliferate, and can express a trait of a foreign gene. For example, Escherichia such as Escherichia coli, Bacillus subtilis (Bacillus) and bacteria belonging to the genus Bacillus such as Subtilis and the genus Pseudomonas such as Pseudomonas putida. Among these, E. coli is preferable, and E. coli DH5α and E. coli XL-1 Blue E. coli MRM15 (pRep4) are more preferable.

宿主への発現ベクターの導入方法は公知であり、宿主の種類等により適宜選択することができる。具体的には、コンピテントセル法、エレクトロポレーション法、ヒートショック法等が挙げられる。   Methods for introducing an expression vector into a host are known and can be appropriately selected depending on the type of host. Specific examples include a competent cell method, an electroporation method, a heat shock method, and the like.

宿主に発現ベクターが導入された形質転換体は、組換えベクターが有するマーカー等を指標としてスクリーニングすることにより選択することができる。   A transformant having an expression vector introduced into a host can be selected by screening using a marker or the like of the recombinant vector as an indicator.

形質転換体の培養は、宿主の種類に応じて従来公知の培養条件に基づいて行うことができる。形質転換体の培養は、好ましくは液体培養で行う。工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。   The transformant can be cultured based on conventionally known culture conditions depending on the type of host. The transformant is preferably cultured in a liquid culture. Industrially, aeration and agitation culture is advantageous.

形質転換体の培養に使用される培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるものを使用でき。炭素源としては、資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、糖蜜およびピルビン酸等が挙げられる。窒素源としては、資化可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物および大豆粕アルカリ抽出物等が挙げられる。また、培地には、炭素源と窒素源の他に、必要に応じて、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガンおよび亜鉛等の塩類；アミノ酸、ビタミン等が添加されていてもよい。また、培地のｐＨは、形質転換体が発育し、形質転換体が(iii)に示すポリペプチドを産生する範囲で適宜すればよいが、通常ｐＨ５．０〜９．０程度の範囲である。   As a nutrient source for the medium used for culturing the transformant, those commonly used for culturing microorganisms can be used. The carbon source may be any carbon compound that can be assimilated, and examples thereof include glucose, sucrose, lactose, maltose, molasses, and pyruvic acid. The nitrogen source may be any assimilable nitrogen compound, and examples thereof include peptone, meat extract, yeast extract, casein hydrolyzate, and soybean meal alkaline extract. In addition to carbon and nitrogen sources, the medium contains salts such as phosphate, carbonate, sulfate, magnesium, calcium, potassium, iron, manganese and zinc; amino acids, vitamins, etc. It may be added. The pH of the medium may be appropriately determined within the range in which the transformant develops and the transformant produces the polypeptide shown in (iii), but is usually in the range of about pH 5.0 to 9.0.

形質転換体の培養温度は、宿主が生育し、宿主が本発明に記載のポリペプチドを産生する範囲で適宜設定すればよいが、通常１５〜３７℃程度である。培養は、(iii)に示すポリペプチドが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に完了すればよく、通常は培養時間が１２〜４８時間程度である。   The culture temperature of the transformant may be appropriately set within the range in which the host grows and the host produces the polypeptide of the present invention, but is usually about 15 to 37 ° C. The culture may be completed at an appropriate time in consideration of the time when the polypeptide shown in (iii) reaches the maximum yield, and the culture time is usually about 12 to 48 hours.

培養終了後、培養物から(iii)に示すポリペプチドを回収するには、培養物から(iii)に示すポリペプチドを含む水溶性画分を調製し、これを必要に応じて濃縮した後に、精製を行えばよい。培養液から(iii)に示すポリペプチドを含む水溶性画分を調製するには、例えば、培養した菌体を、超音波破壊、フレンチプレス等の機械的破壊、リゾチーム等の溶菌酵素による溶菌処理等によって可溶化すればよい。また、当該可溶化には、必要に応じてプロテアーゼ等の酵素や、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤を併用してもよい。また、適当な発現ベクターと宿主を選択することにより、発現した(iii)に示すポリペプチドを培養液中に分泌させることもできるので、このような場合には、培養液から遠心分離等によって菌体を除去することによって、(iii)に示すポリペプチドを含む水溶性画分を得ることもできる。(iii)に示すポリペプチドを含む水溶性画分の濃縮は、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、塩析処理、親水性有機溶媒（例えば、メタノール、エタノール、アセトン等）による分別沈殿法により行うことができる。また、精製は、例えば、ゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の方法を適宜組み合わせることによって行うことができる。   To recover the polypeptide shown in (iii) from the culture after completion of the culture, after preparing a water-soluble fraction containing the polypeptide shown in (iii) from the culture and concentrating it as necessary, Purification may be performed. In order to prepare a water-soluble fraction containing the polypeptide shown in (iii) from the culture solution, for example, the cultured cells are subjected to ultrasonic disruption, mechanical disruption such as a French press, or lysis treatment using a lytic enzyme such as lysozyme. What is necessary is just to solubilize by etc. In addition, for the solubilization, an enzyme such as a protease or a surfactant such as sodium lauryl sulfate (SDS) may be used in combination as necessary. In addition, by selecting an appropriate expression vector and host, the expressed polypeptide (iii) can be secreted into the culture solution. In such a case, the bacteria are separated from the culture solution by centrifugation or the like. By removing the body, a water-soluble fraction containing the polypeptide shown in (iii) can also be obtained. Concentration of the water-soluble fraction containing the polypeptide shown in (iii) is performed by, for example, vacuum concentration, membrane concentration, salting-out treatment, or fractional precipitation with a hydrophilic organic solvent (eg, methanol, ethanol, acetone, etc.). Can do. Further, purification can be performed by appropriately combining methods such as gel filtration, adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography and the like.

斯して精製された(iii)に示すポリペプチドは、水溶液の状態で提供してもよいが、例えば、凍結乾燥、真空乾燥、スプレードライ等の乾燥工程を経て粉末化して提供してもよい。   The purified polypeptide shown in (iii) may be provided in the form of an aqueous solution, but may be provided in the form of powder through a drying step such as freeze drying, vacuum drying, spray drying, or the like. .

(iv)に示すポリペプチド
(iv)に示すポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するポリペプチドである。即ち、(iv)に示すポリペプチドは、前記(ii)に示すペプチドが挿入されているポリペプチドである。 Polypeptide shown in (iv)
The polypeptide shown in (iv) consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and has a binding ability to platinum It is. That is, the polypeptide shown in (iv) is a polypeptide into which the peptide shown in (ii) is inserted.

(iv)に示すポリペプチドの具体的態様、製造方法等は、前記(iii)に示すポリペプチドにおいて、前記(i)に示すペプチド部分が、前記(ii)に示すペプチドに置き換わっていること以外は、前記(iii)に示すポリペプチドの場合と同様である。   The specific embodiment, production method and the like of the polypeptide shown in (iv) are the same as those in the polypeptide shown in (iii) except that the peptide part shown in (i) is replaced with the peptide shown in (ii). Is the same as in the case of the polypeptide shown in (iii) above.

２．白金結合剤の用途、使用方法
本発明の白金結合剤は、白金に結合させる用途に使用される。本発明の白金結合剤において、結合対象となる白金としては、白金の微粒子又は白金の金属表面が挙げられる。 2. Use of platinum binder and method of use The platinum binder of the present invention is used for the purpose of binding to platinum. In the platinum binding agent of the present invention, platinum to be bound includes platinum fine particles or platinum metal surfaces.

本発明の白金結合剤は、白金と接触すると、アミノ酸配列ＹＫＲＧＹＫ（配列番号１）、或いは当該アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列において白金を結合する。本発明の白金結合剤を白金に結合させる際の条件については、特に制限されないが、水、緩衝液等の水性溶媒中で行うことが好ましい。   When the platinum binding agent of the present invention comes into contact with platinum, amino acid sequence YKRGYK (SEQ ID NO: 1) or an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, or added in the amino acid sequence is substituted with platinum. Join. The conditions for binding the platinum binder of the present invention to platinum are not particularly limited, but it is preferably performed in an aqueous solvent such as water or a buffer solution.

本発明の白金結合剤は、ペプチド又はポリペプチドからなるものであり、ファージに提示させて使用することもできる。ペプチド又はポリペプチドをファージに提示させる方法は公知であり、本発明の白金結合剤を提示したファージは、従来公知の方法に従って製造される。   The platinum binding agent of the present invention consists of a peptide or a polypeptide, and can also be used by being displayed on a phage. A method for displaying a peptide or polypeptide on a phage is known, and a phage displaying the platinum binding agent of the present invention is produced according to a conventionally known method.

本発明の白金結合剤は、白金と結合できるので、白金とペプチド又はポリペプチドが結合して複合化された複合材料の提供に利用できる。このような複合材料としては、具体的井は、前記(i)又は(ii)に示すぺプチド、或いは前記(iii)又は(iv)に示すポリペプチドに、白金が結合した白金−ペプチド又はポリペプチド複合体；(i)又は(ii)に示すぺプチド、或いは前記(iii)又は(iv)に示すポリペプチドを提示するファージに、白金が結合した白金−ファージ複合体が挙げられる。このような複合材料は、本発明の白金結合剤が持つ機能性と白金の機能性を併せ持つことができる。例えば、前記(iii)又は(iv)に示すポリペプチド又は当該ポリペプチドを提示するファージと白金を結合させた複合材料は、当該ポリペプチドが有する機能性と、白金が有する機能性（例えば、電極物質としての機能、触媒機能、抗菌機能等）を併せ持つことができる。   Since the platinum binding agent of the present invention can bind to platinum, it can be used to provide a composite material in which platinum and a peptide or polypeptide are combined and combined. Specific examples of such a composite material include a platinum-peptide or a polypeptide in which platinum is bound to the peptide shown in (i) or (ii) above, or the polypeptide shown in (iii) or (iv) above. Peptide complex: Platinum-phage complex in which platinum is bound to the peptide shown in (i) or (ii) or the phage displaying the polypeptide shown in (iii) or (iv) above. Such a composite material can have both the functionality of the platinum binder of the present invention and the functionality of platinum. For example, the composite material in which the polypeptide shown in the above (iii) or (iv) or the phage displaying the polypeptide and platinum is bound to the functionality of the polypeptide and the functionality of the platinum (for example, the electrode) Functions as a substance, catalyst function, antibacterial function, etc.).

また、本発明の白金結合剤は、白金表面の改質、白金の回収、白金粒子の基板上での配置等にも利用できる。   The platinum binder of the present invention can also be used for modification of platinum surface, recovery of platinum, arrangement of platinum particles on a substrate, and the like.

本発明の白金結合剤を白金表面の改質に使用する場合であれば、改質対象となる白金表面に本発明の白金結合剤を結合させればよい。例えば、本発明の白金結合剤として前記(iii)又は(iv)に示すポリペプチドを使用し、白金と結合させることにより、白金表面に当該ポリペプチドが備える機能性を付与することができる。例えば、白金電極を利用したバイオセンサ（グルコースセンサ等）等に、前記(iii)又は(iv)に示すポリペプチドを結合させると、白金電極を利用したバイオセンサ等に前記(iii)又は(iv)に示すポリペプチドが有する機能性（例えば、酵素としての機能等）を備えさせることが可能になる。例えば、白金電極に、配列番号４に示されるアミノ酸配列において、２５５〜２６０位のアミノ酸配列を配列番号１に示されるアミノ酸配列に置換したアミノ酸配列からなる変異型グルコース酸化酵素を、白金電極に結合させることによって、白金電極に、グルコース酸化作用を備えさせることができる。通常、白金電極への酵素を含むポリペプチドの結合は非特異吸着であり、吸着したポリペプチド全てが十分な触媒能を発揮しないといった課題があるが、本発明により白金電極表面への配向性を有するポリペプチドの結合が可能であるため、センサーの高感度化への寄与が期待できる。   If the platinum binder of the present invention is used for modifying the platinum surface, the platinum binder of the present invention may be bound to the platinum surface to be modified. For example, the functionality of the polypeptide can be imparted to the platinum surface by using the polypeptide shown in (iii) or (iv) above as the platinum binder of the present invention and binding it to platinum. For example, when the polypeptide shown in (iii) or (iv) is bound to a biosensor (such as a glucose sensor) using a platinum electrode, the (iii) or (iv) ) Having the functionality (for example, the function as an enzyme). For example, a mutant glucose oxidase consisting of an amino acid sequence in which the amino acid sequence at positions 255 to 260 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 is replaced with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is bound to the platinum electrode. By doing so, the platinum electrode can be provided with a glucose oxidizing action. Usually, the binding of a polypeptide containing an enzyme to a platinum electrode is non-specific adsorption, and there is a problem that not all of the adsorbed polypeptide exerts sufficient catalytic ability. Since the polypeptide can be bound, it can be expected to contribute to high sensitivity of the sensor.

また、本発明の白金結合剤を白金の回収方法に使用する場合であれば、本発明の白金結合剤又はこれを提示するファージを、必要に応じて担持体に担持させて、金属廃液等の白金含有物と接触させればよい。本発明の白金結合剤又はこれを提示するファージが、白金含有物中の白金に結合するので、白金含有物から白金を回収することができる。また、本発明の白金結合剤又はこれを提示するファージによって結合された白金は、例えば、１Ｍ以上の濃度の塩化ナトリウム水溶液に懸濁することによって、本発明の白金結合剤又はこれを提示するファージから遊離させることができ、更に、濾過等に供することにより白金を分離することができる。   Further, if the platinum binding agent of the present invention is used in a platinum recovery method, the platinum binding agent of the present invention or a phage displaying the same is supported on a support as necessary, such as a metal waste liquid. What is necessary is just to make it contact with a platinum containing material. Since the platinum binding agent of the present invention or the phage displaying the same binds to platinum in the platinum-containing material, platinum can be recovered from the platinum-containing material. The platinum bound by the platinum binding agent of the present invention or the phage displaying the same is suspended in, for example, an aqueous sodium chloride solution having a concentration of 1 M or more, thereby causing the platinum binding agent of the present invention or the phage displaying the same. The platinum can be separated by subjecting it to filtration and the like.

また、本発明の白金結合剤を白金粒子の基板上での配置に使用する場合であれば、例えば、本発明の白金結合剤又はこれを提示するファージを用いて基板上にパターンを作製した後、当該白金結合剤又はファージを介して白金粒子を結合させればよい。また、本発明の白金結合剤に白金粒子を結合させた白金−ペプチド又はポリペプチド複合体、或いは本発明の白金結合剤を提示するファージに白金粒子を結合させた白金−ファージ複合体を基板上に配置することによって、白金粒子を基板上に配置することもできる。このように、本発明の白金結合剤を使用することにより、基板上に白金粒子を精密に配置することができるので、本発明の白金結合剤は、白金粒子を利用したデバイスや回路の精密設計にも有用である。   Further, if the platinum binder of the present invention is used for arranging platinum particles on a substrate, for example, after a pattern is formed on the substrate using the platinum binder of the present invention or a phage displaying the same. The platinum particles may be bound via the platinum binding agent or phage. Further, a platinum-peptide or polypeptide complex in which platinum particles are bound to the platinum binder of the present invention, or a platinum-phage complex in which platinum particles are bound to a phage presenting the platinum binder of the present invention on a substrate. The platinum particles can also be disposed on the substrate by disposing them on the substrate. As described above, since the platinum particles can be precisely arranged on the substrate by using the platinum binder of the present invention, the platinum binder of the present invention is a precision design of devices and circuits using the platinum particles. Also useful.

以下、本発明の実施例をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。   Examples of the present invention will be described more specifically below, but the present invention is not limited to these examples.

（１）変異型ＬＡＲＦＨの作製
ＬＡＲＦＨ（Ｌａｃ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ｆｏｕｒ ｈｅｌｉｘ ｐｒｏｔｅｉｎ）は赤沼らによって作製された人工タンパク質である（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４７（３）、p３７１-３７９、２０１０）。Ｌａｃ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒはテトラマー構造を形成し、各サブユニットのＣ末端の４本のα-ヘリックスが束になった構造（４―ｈｅｌｉｘ ｂｕｎｄｌｅ）をとる。２本の逆平行α-ヘリックスを模倣し人工的に連結したものに、更に２本のα-ヘリックスをループでつなぎ、１本鎖の４―ｈｅｌｉｘ ｂｕｎｄｌｅタンパク質として作製されたのが野生型ＬＡＲＦＨである。図２Ａに示すように、野生型ＬＡＲＦＨ単分子の大きさは約５ｎｍ×３ｎｍである。 (1) Production of Mutant LARFH LARFH (Lac repressor four helix protein) is an artificial protein produced by Akanuma et al. (J. Biochem. 147 (3), p371-379, 2010). Lac repressor forms a tetramer structure, and has a structure in which four α-helices at the C-terminal of each subunit are bundled (4-helix bundle). Wild-type LARFH was created as a single-stranded 4-helix bundle protein by linking two anti-helixes mimicking and artificially linking two anti-parallel α-helices, and then connecting two α-helices in a loop. is there. As shown in FIG. 2A, the size of the wild type LARFH single molecule is about 5 nm × 3 nm.

野生型ＬＡＲＦＨのアミノ酸配列（配列番号２）において、配列番号１の２１番目から２６番目のアミノ酸配列「ＳＧＱＧＧＳ」がＬＡＲＦＨ分子表面でループを形成することが判明している（図２Ｂの矢印部分参照）。このループ構造の領域のランダム変異体ライブラリをスクリーニング母体として選択した。   In the amino acid sequence of wild-type LARFH (SEQ ID NO: 2), it has been found that the 21st to 26th amino acid sequence “SGQGGS” of SEQ ID NO: 1 forms a loop on the surface of the LARFH molecule (see the arrow in FIG. 2B). ). A random mutant library of this loop structure region was selected as the screening matrix.

ＬＡＲＦＨ遺伝子のＳ２１をコードするコドンＡＧＣ、Ｇ２２をコードするコドンＧＧＧ、Ｑ２３をコードするコドンＣＡＧ、Ｇ２５をコードするコドンＧＧＴ、Ｓ２６をコードするコドンＡＧＣを、それぞれＮＶＳ（Ｎ＝Ａ、Ｔ、Ｇ、又はＣ；Ｖ＝Ａ、Ｇ、又はＣ；Ｓ＝Ｇ又はＣ）にＰＣＲを用いた部位特異的変異導入により変異体ＬＡＲＦＨ遺伝子ライブラリーを構築した。予想ライブラリーサイズは７．９６×１０６であった。 The codon AGC encoding S21 of the LARFH gene, the codon GGG encoding G22, the codon CAG encoding Q23, the codon GGT encoding G25, and the codon AGC encoding S26 are respectively NVS (N = A, T, G, Alternatively, mutant LARFH gene library was constructed by site-directed mutagenesis using PCR in C; V = A, G, or C; S = G or C). The expected library size was 7.96 × 10 6 .

白金結合能を有する変異型ＬＡＲＦＨの選抜
白金結合能を有する変異体ＬＡＲＦＨの探索には、公知のＴ７ Ｓｅｌｅｃｔ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｓｙｓｔｅｍを使用した。Ｔ７ファージのキャプシドタンパク質をコードする遺伝子に先に作製した変異体ＬＡＲＦＨ遺伝子ライブラリーを連結し、変異体ＬＡＲＦＨをファージ表面に提示させて、以下の条件で白金と相互作用させた。 Selection of Mutant LARFH Having Platinum Binding Ability For the search for mutant LARFH having platinum binding ability, a known T7 Select Page Display System was used. The mutant LARFH gene library prepared previously was linked to the gene encoding the capsid protein of T7 phage, and the mutant LARFH was displayed on the phage surface and allowed to interact with platinum under the following conditions.

１．５ｍｌチューブに０．１ｍｇの白金粒子を入れ、溶液Ａ（８．１ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ-Ｘ、０．２％ＢＳＡ）を０．５ｍｌ添加し、４℃で１０分間インキュベートした。１４，０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を除去した。予め調整した変異体ＬＡＲＦＨライブラリーを表面に提示させたファージ液０．２５ｍｌと溶液Ａ０．２５ｍｌを添加して懸濁し、１４，０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を除去した。洗浄を３回繰り返した後、溶液Ｂ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭ ＭｇＣｌ２、２Ｍ尿素、１％ＳＤＳ）２５μｌを加えて懸濁し、１０分間超音波処理した。５Ｍ ＮａＣｌ溶液１００μｌと溶液Ａ３７５μｌを添加して懸濁した後に、１４，０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を除去した。この超音波処理を含む洗浄操作を６回繰り返した。遠心分離後の沈殿に溶液Ｃ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭ ＭｇＣｌ２）２５μｌを添加して懸濁した。２０分間室温で静置した後、５Ｍ ＮａＣｌ溶液１００μｌと溶液Ａ３７５μｌを添加して懸濁、大腸菌に感染させた。大腸菌のプラークから白金に結合する変異体ＬＡＲＦＨ遺伝子を単離した。単離した変異体ＬＡＲＦＨ遺伝子のＤＮＡシーケンシングにより、変異体ＬＡＲＦＨのループ構造の領域である２１番目から２６番目のアミノ酸配列が「ＹＫＲＧＹＫ」であることが判明した。ＤＮＡシーケンシングの結果得られた該変異体ＬＡＲＦＨのアミノ酸配列は配列表の配列番号２に示す通りであった。野生型と変異型ＬＡＲＦＨとの相違点を明確にするため、図３にアミノ酸配列のペアワイズアライメント図を示す。 Place 0.1 mg of platinum particles in a 1.5 ml tube and add solution A (8.1 mM Na 2 HPO 4 , 1.5 mM KH 2 PO 4 , 0.3% Triton-X, 0.2% BSA) to 0. 5 ml was added and incubated at 4 ° C. for 10 minutes. Centrifugation was performed at 14,000 rpm for 2 minutes, and the supernatant was removed. 0.25 ml of a phage solution on which the mutant LARFH library prepared in advance and 0.25 ml of solution A were added and suspended were suspended, centrifuged at 14,000 rpm for 2 minutes, and the supernatant was removed. After repeating washing three times, 25 μl of solution B (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 100 mM NaCl, 6 mM MgCl 2 , 2M urea, 1% SDS) was added and suspended, and sonicated for 10 minutes. After suspension by adding 100 μl of 5M NaCl solution and 375 μl of solution A, the mixture was centrifuged at 14,000 rpm for 2 minutes, and the supernatant was removed. This washing operation including sonication was repeated 6 times. 25 μl of solution C (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 100 mM NaCl, 6 mM MgCl 2 ) was added to the precipitate after centrifugation and suspended. After allowing to stand at room temperature for 20 minutes, 100 μl of 5M NaCl solution and 375 μl of solution A were added, suspended, and infected with E. coli. A mutant LARFH gene that binds to platinum was isolated from E. coli plaques. The DNA sequencing of the isolated mutant LARFH gene revealed that the 21st to 26th amino acid sequence, which is the region of the loop structure of the mutant LARFH, was “YKRGYK”. The amino acid sequence of the mutant LARFH obtained as a result of DNA sequencing was as shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. In order to clarify the difference between the wild type and the mutant type LARFH, FIG. 3 shows a pairwise alignment diagram of amino acid sequences.

ＬＡＲＦＨ提示ファージ濃度依存的な白金の結合
変異型ＬＡＲＦＨの白金への吸着力を相対評価すべく、以下の実験を行った。Ｔ７ファージ、野生型ＬＡＲＦＨを提示したＴ７ファージ、変異型ＬＡＲＦＨを提示したＴ７ファージ液をそれぞれ調整し、１×１０-１１までの希釈系列を作製した。白金微粒子にファージ液と０．２５ｍｌと溶液Ａ０．２５ｍｌを添加して懸濁した後に、１４，０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清画分を回収した。溶液Ｂ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭ ＭｇＣｌ２、２Ｍ尿素、１％ＳＤＳ）２５μｌを加えて懸濁し、１０分間超音波処理した。０．２％ＢＳＡ、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ-Ｘ、１Ｍ ＮａＣｌを含む溶液０．４５ｍｌを添加し、沈殿画分とした。それぞれの上清溶液と沈殿溶液をプラークアッセイに供した。 The following experiment was conducted in order to evaluate the adsorptive power of platinum binding mutant LARFH to platinum depending on the concentration of LARFH-displayed phage . T7 phage, T7 phage exhibits wildtype LARFH, T7 phage solution presented mutant LARFH was adjusted respectively, to prepare a dilution series of up to 1 × 10- 11. Phage solution, 0.25 ml and solution A 0.25 ml were added to and suspended in platinum fine particles, and then centrifuged at 14,000 rpm for 2 minutes to collect the supernatant fraction. 25 μl of solution B (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 100 mM NaCl, 6 mM MgCl 2 , 2M urea, 1% SDS) was added and suspended, and sonicated for 10 minutes. 0.45 ml of a solution containing 0.2% BSA, 0.3% Triton-X, and 1M NaCl was added to obtain a precipitate fraction. Each supernatant solution and precipitation solution was subjected to plaque assay.

得られた結果を表１に示す。また、図４に、表１から計算したファージ濃度依存的な白金結合能をグラフを示す。濃度が増加するとＴ７ファージ及び野生型ＬＡＲＦＨ提示ファージの非特異的な結合も増加するが、変異型ＬＡＲＦＨ提示ファージはおおむねそれらに比べて白金結合能が強く、１０４〜１０６ｐｆｕの範囲では１０〜１００倍の白金結合能を示した。この結果から、変異型ＬＡＲＦＨは白金粒子に強力に結合することが示された。 The obtained results are shown in Table 1. In addition, FIG. 4 shows a graph of the platinum concentration-dependent platinum binding ability calculated from Table 1. As the concentration increases, nonspecific binding of T7 phage and wild-type LARFH-displayed phage also increases, but mutant-type LARFH-displayed phage has a stronger platinum-binding ability compared to them, and in the range of 10 4 to 10 6 pfu, 10 A platinum binding capacity of ˜100 times was exhibited. From this result, it was shown that mutant type LARFH binds strongly to platinum particles.

ＬＡＲＦＨタンパク質の精製
ＬＡＲＦＨ遺伝子あるいは変異体ＬＡＲＦＨ遺伝子をｐＱＥ３０Ｘａベクター（Ｑｉａｇｅｎ）にサブクローニングし、大腸菌Ｍ１５（ｐＲｅｐ４）株を形質転換して寒天培地上で培養し、組換え大腸菌の単コロニーを得た。１５０ｍｇ／ｍｌアンピシリン、２５ｍｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ培地に組換え大腸菌の単コロニーを植菌し、３７℃で振とう培養した。ＯＤ６００が０．６〜０．８になった時点でＩＰＴＧ（イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド）を終濃度０．５ｍＭとなるように添加し、更に６時間培養した。遠心分離により菌体を回収して、５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に懸濁して菌体を超音波破砕した。菌体破砕液を１０，０００ｒｐｍで３０分間、遠心分離し、上清を回収した。上清を６０℃で２０分間、熱処理し、遠心分離により上清を回収した。熱処理後の遠心上清をＨｉｓＴｒａｐＨＦ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）ニッケルアフィにティーカラムにより精製した。吸着緩衝液には１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、溶出緩衝液には５００ｍＭイミダゾールと１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を使用し、イミダゾールのリニアグラジエントにより溶出させた。ＬＡＲＦＨを含む溶出画分を回収し、５０ｍＭのＮａＣｌと１ｍＭのＣａＣｌ２を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に対して透析した。 Purification of LARFH protein The LARFH gene or mutant LARFH gene was subcloned into the pQE30Xa vector (Qiagen), E. coli M15 (pRep4) strain was transformed and cultured on an agar medium to obtain a single colony of recombinant E. coli. A single colony of recombinant E. coli was inoculated into an LB medium containing 150 mg / ml ampicillin and 25 mg / ml kanamycin, and cultured with shaking at 37 ° C. When OD600 reached 0.6 to 0.8, IPTG (isopropyl-β-thiogalactopyranoside) was added to a final concentration of 0.5 mM, and further cultured for 6 hours. The cells were collected by centrifugation, suspended in 20 mM Tris-HCl (pH 7.4) containing 50 mM NaCl, and the cells were sonicated. The cell disruption solution was centrifuged at 10,000 rpm for 30 minutes, and the supernatant was collected. The supernatant was heat treated at 60 ° C. for 20 minutes, and the supernatant was collected by centrifugation. The centrifuged supernatant after the heat treatment was purified on HisTrapHF (GE Healthcare Bioscience) nickel affy using a tea column. The adsorption buffer was 20 mM Tris-HCl (pH 7.4) containing 150 mM NaCl, and the elution buffer was 20 mM Tris-HCl (pH 7.4) containing 500 mM imidazole and 150 mM NaCl. Was eluted with. The elution fraction containing LARFH was collected and dialyzed against 20 mM Tris-HCl (pH 7.4) containing 50 mM NaCl and 1 mM CaCl 2 .

得られたＬＡＲＦＨ含有溶液にＦａｃｔｏｒＸａプロテアーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）を添加して４℃で一晩処理した。ＨｉＴｒａｐＱ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）とＨｉｓＴｒａｐＨＦをタンデムにつないで先の処理溶液を素通りさせて回収し、１００ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に対して透析した。この溶液をＬＡＲＦＨ溶液あるいは変異体ＬＡＲＦＨ溶液として使用した。   Factor Xa protease (Qiagen) was added to the obtained LARFH-containing solution and treated at 4 ° C. overnight. HiTrapQ (GE Healthcare Bioscience) and HisTrappHF were connected in tandem, and the previous treatment solution was passed through and collected, and dialyzed against 20 mM Tris-HCl (pH 8.0) containing 100 mM NaCl. This solution was used as a LARFH solution or a mutant LARFH solution.

フロー型水晶振動子マイクロバランス装置の構築
使用したフロー型水晶振動子マイクロバランス（ＦＱＣＭ）装置は、独自に開発した装置である。装置の構成について詳細に述べる。 Construction of flow-type crystal resonator microbalance device The flow-type crystal resonator microbalance (FQCM) device used is a device originally developed. The configuration of the apparatus will be described in detail.

まず、フロー測定系について述べる。送液ポンプはペリスタリックポンプ（ＲＥＧＲＯ Ｄｉｇｉｔａｌ ＩＳＭ ５９７ ４ｃｈ／ＩＳＭＡＴＥＣ）を使用した。ポンプチューブはＴＹＧＯＮ２７６５-１７５ ＩＤ：０．７６ｍｍを使用した。流路の切り替えバルブは低圧スイッチバルブ（Ｖ-１１０１Ｄ-ＤＣ／ＵＰＣＨＵＲＣＨ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を使用した。流路関連部品はテフロンチューブ（ＩＤ：０．７５ｍｍ）、フランジフェラル（ＥＴＦＥ）、フランジナット（ＥＴＦＥ）、ショートフランジナット（ＥＴＦＥ）、コニカルアダプタ、マイクロタイトアダプタは、全てＵＰＣＨＵＲＣＨ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製のものを使用した。ＥＴＦＥとは熱可塑性フッ素樹脂で、テトラフルオロエチレンとエチレンの共重合体であり、低摩擦性、非粘着性、撥水性などの表面特性に信頼性が高く、フロー測定系を構築する上で最適である。流路は、サンプル溶液用とキャリア溶液用の２系列である。図５の模式図のように、上流からリザーバー、恒温ループ、切り替えバルブ、フローセル、送液ポンプ、ドレインの順に連結した。恒温ループ、切り替えバルブ、フローセルは±１℃の精度で温度制御可能な恒温インキュベーター内に設置した。恒温ループはアルミ製の円筒にテフロンチューブを各流路１ｍを巻き付けて作製した。切り替えバルブと発信器が一体となったＦＱＣＭ装置を設計し作製した。装置をＰＣへと接続し、流路切り替えをＰＣで制御した。ＦＱＣＭ装置に接続された周波数カウンタ（５３１３１Ａ／Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で測定した周波数変化をＰＣへ出力するようにした。キャリア溶液は切り替えバルブ、フローセル、ドレインの順に流れる（流路１）。一方、サンプル溶液は切り替えバルブ、ドレインの順に流れる（流路２）。流路を切り替えると、キャリア溶液は切り替えバルブからドレインへ送液され、サンプル溶液が切り替えバルブからフローセルへ送液される。サンプル溶液の反応を観測し、任意時間にバルブを切り替えると再び最初の流路１に戻る。周波数の時間経過を測定した例を図６に示す。流路１の場合、キャリア溶液がフローセルへ送液され、図６ａのような安定したベースラインを得る。バルブを切り替える（流路２）と、図６ｂのようにサンプルが金属板に吸着することで周波数が減少し始め、その後平衡状態となり周波数は一定となる。これによりベースラインとのΔＦを求めることがきる。さらに流路１に戻すとサンプルの離脱による周波数回復が見られ、もとのベースラインに戻る（図６ｂ）。   First, the flow measurement system will be described. A peristaltic pump (REGRO Digital ISM 597 4ch / ISMATEC) was used as the liquid feeding pump. The pump tube used was TYGON 2765-175 ID: 0.76 mm. A low-pressure switch valve (V-1101D-DC / UPCHURCH SCIENTIFIC) was used as the flow path switching valve. Flow-path related parts are Teflon tube (ID: 0.75mm), flange ferrule (ETFE), flange nut (ETFE), short flange nut (ETFE), conical adapter, and micro tight adapter, all made by UPCHURCH SCIENTIFIC. used. ETFE is a thermoplastic fluororesin that is a copolymer of tetrafluoroethylene and ethylene, and has high reliability in surface characteristics such as low friction, non-adhesiveness, and water repellency, and is ideal for building a flow measurement system. It is. There are two channels for the sample solution and the carrier solution. As shown in the schematic diagram of FIG. 5, the reservoir, the constant temperature loop, the switching valve, the flow cell, the liquid feed pump, and the drain were connected in this order from the upstream. The constant temperature loop, switching valve, and flow cell were installed in a constant temperature incubator capable of controlling the temperature with an accuracy of ± 1 ° C. The constant temperature loop was prepared by winding a teflon tube around an aluminum cylinder with each flow path 1 m. An FQCM device with an integrated switching valve and transmitter was designed and manufactured. The apparatus was connected to a PC, and flow path switching was controlled by the PC. The frequency change measured by the frequency counter (53131A / Agilent Technologies) connected to the FQCM apparatus was output to the PC. The carrier solution flows in the order of the switching valve, the flow cell, and the drain (flow path 1). On the other hand, the sample solution flows in the order of the switching valve and the drain (flow path 2). When the flow path is switched, the carrier solution is sent from the switching valve to the drain, and the sample solution is sent from the switching valve to the flow cell. When the reaction of the sample solution is observed and the valve is switched at an arbitrary time, the flow returns to the first flow path 1 again. FIG. 6 shows an example of measuring the time lapse of the frequency. In the case of the channel 1, the carrier solution is sent to the flow cell, and a stable baseline as shown in FIG. 6a is obtained. When the valve is switched (channel 2), the frequency begins to decrease due to the sample adsorbing to the metal plate as shown in FIG. 6b, and then the equilibrium is reached and the frequency becomes constant. As a result, ΔF with respect to the baseline can be obtained. When the flow is further returned to the flow path 1, frequency recovery is observed due to the separation of the sample, and the original baseline is restored (FIG. 6b).

次に、水晶振動子のセットアップについて述べる。凹状の発信器にパッキン、水晶振動子、スペーサー、フローセルの順に設置する。セットアップの状態を図７に示す。ねじを締めると発信器の側の電極と水晶振動子側の電極が接触し、共振周波数が得られる。スペーサー素材にはシリコンラバーを使用した。フローセルを重ねたときにできるスペースの容積は５．６μｌであり、これをフローセル容積とした。９ＭＨｚの水晶振動子（ＡＴカット水晶素板、下地金属：チタン、蒸着金属：白金、白金電極面積：０．１９６ｃｍ２）を使用した。構築したＦＱＣＭ装置を図８に示す。   Next, the setup of the crystal unit will be described. Install the packing, crystal resonator, spacer, and flow cell in the concave transmitter. The setup state is shown in FIG. When the screw is tightened, the electrode on the transmitter side and the electrode on the crystal resonator side come into contact with each other, and a resonance frequency is obtained. Silicone rubber was used for the spacer material. The volume of the space formed when the flow cells were stacked was 5.6 μl, and this was defined as the flow cell volume. A 9 MHz crystal resonator (AT-cut crystal base plate, base metal: titanium, vapor deposition metal: platinum, platinum electrode area: 0.196 cm 2) was used. The constructed FQCM device is shown in FIG.

白金表面ＦＱＣＭ測定
送液サンプルは、送液バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ ｐＨ８．０ １００ｍＭ ＮａＣｌ）に１μＭの野生型又は変異型ＬＡＲＦＨを溶解させたものを使用した。キャリアには送液バッファーを使用した。流速は１００μｌ／分、インキュベーター内の温度は２５℃とした。キャリア溶液を送液し応答が安定した時間を０秒とし、サンプルを６００秒間送液して野生型又は変異型ＬＡＲＦＨを吸着させた。その後、６００秒間キャリア溶液を送液することにより離脱過程を測定した。非特異的吸着の影響を観察すべく、送液サンプルおよび送液バッファーに尿素２Ｍを添加した条件でも実験を行った。 A platinum surface FQCM measurement liquid-feeding sample was prepared by dissolving 1 μM of wild-type or mutant LARFH in a liquid-feeding buffer (20 mM Tris-HCl pH 8.0 100 mM NaCl). The carrier buffer was used as the carrier. The flow rate was 100 μl / min, and the temperature in the incubator was 25 ° C. The carrier solution was sent and the time when the response was stabilized was set to 0 second, and the sample was sent for 600 seconds to adsorb the wild type or mutant type LARFH. Then, the separation process was measured by feeding the carrier solution for 600 seconds. In order to observe the influence of non-specific adsorption, the experiment was also performed under the condition in which urea 2M was added to the liquid feeding sample and the liquid feeding buffer.

得られた結果を図９に示す。図９Ａに示す通り、野生型ＬＡＲＦＨの応答は約３２Ｈｚ（尿素添加条件では約２８Ｈｚ）であった。これに対して、図９Ｂに示す通り、変異型ＬＡＲＦＨの応答は約５０Ｈｚ（尿素添加条件では約４５Ｈｚ）であり、最大の結合能を示した。周波数の減少傾向が観察される尿素添加条件の結果を加味しても、ループ配列「ＹＫＲＧＹＫ」を有する変異型ＬＡＲＦＨは白金に特異的に強力に結合することが判明した。   The obtained results are shown in FIG. As shown in FIG. 9A, the response of wild-type LARFH was about 32 Hz (about 28 Hz under urea addition conditions). On the other hand, as shown in FIG. 9B, the response of mutant LARFH was about 50 Hz (about 45 Hz under urea addition conditions), indicating the maximum binding ability. Considering the result of the urea addition condition in which a tendency of decreasing frequency is observed, it has been found that the mutant LARFH having the loop sequence “YKRGYK” specifically and strongly binds to platinum.

変異体ＬＡＲＦＨの白金表面における吸着形態の解明
野生型又は変異型ＬＡＲＦＨ単分子あたりの占有面積を計算することにより、野生型又は変異型ＬＡＲＦＨの金属表面への結合形態を調べることができる。先ず、ＦＱＣＭ測定の質量変化と周波数変化の関係式について以下に述べる。ΔＦを初期状態からの周波数変化、Δｍを質量変化（ｎｇ）、Ｆ０を水晶振動子の基本発振周波数（９ＭＨｚ）、Ａを金電極表面積（０．１９６ｃｍ２）、ρｑを水晶の密度（２．６５g／ｃｍ３）μｑを水晶の定数（２．９５×１０１１ｄｙｎ／cm２）とすると、下記のＳａｕｅｒｂｅｒの式が得られる。 Elucidation of Adsorption Form of Mutant LARFH on Platinum Surface By calculating the area occupied per wild-type or mutant LARFH molecule, the binding form of wild-type or mutant LARFH to the metal surface can be examined. First, a relational expression between mass change and frequency change in FQCM measurement will be described below. ΔF is the change in frequency from the initial state, Δm is the change in mass (ng), F0 is the fundamental oscillation frequency (9 MHz) of the crystal resonator, A is the gold electrode surface area (0.196 cm 2 ), and ρ q is the density of the crystal (2 .65 g / cm 3 ) μq is a constant of quartz (2.95 × 10 11 dyn / cm 2 ), the following Sauerber equation is obtained.

よって、Δｍは次式により求めることができる。   Therefore, Δm can be obtained by the following equation.

また、野生型及び変異型ＬＡＲＦＨの分子量Ｍ（１．２×１０４Ｄａ）、アボガドロ数ＮＡ（６．０２×１０２３ｍｏｌ-１）、白金表面の表面積ＳＰｔ（０．１９８ｃｍ２）とすると、野生型及び変異型ＬＡＲＦＨ１分子あたりの占有面積Ｓ（ｎｍ２）は、次式により求めることができる。 In addition, the molecular weight M (1.2 × 10 4 Da) of wild type and mutant LARFH, Avogadro number N A (6.02 × 10 23 mol- 1 ), surface area S Pt (0.198 cm 2 ) of the platinum surface Then, the occupied area S (nm 2 ) per wild-type and mutant-type LARFH molecule can be obtained by the following equation.

また、野生型及び変異型ＬＡＲＦＨ単分子の大きさは約３ｎｍ×５ｎｍであるから、得られたΔＦのデータから、野生型又は変異型ＬＡＲＦＨの白金表面への結合方向を見積もることができる。   Further, since the size of the wild-type and mutant LARFH single molecules is about 3 nm × 5 nm, the binding direction of the wild-type or mutant LARFH to the platinum surface can be estimated from the obtained ΔF data.

上記の計算式から、サンプルを６００秒間送液後の飽和吸着時の応答をもとに野生型及び変異型ＬＡＲＦＨの専有面積を計算したところ、野生型ＬＡＲＦＨの占有面積は１３ｎｍ２、変異型ＬＡＲＦＨの占有面積は７．９ｎｍ２と算出された。 From the above formula, the area occupied by wild type and mutant LARFH was calculated based on the response at the time of saturated adsorption after feeding the sample for 600 seconds. The occupied area of wild type LARFH was 13 nm 2 , and mutant LARFH The occupation area was calculated as 7.9 nm 2 .

野生型及び変異型ＬＡＲＦＨの大きさを約３ｎｍ×５ｎｍの長方形に近似すると、図１０に示すように野生型ＬＡＲＦＨは横向き（約１５ｎｍ２）、変異型ＬＡＲＦＨの結合形態は縦向き（約９ｎｍ２）に結合していることが判明した。これらの結果から、アミノ酸配列「ＹＫＲＧＹＫ」を含む変異型ＬＡＲＦＨはそのループ部分で結合しており、当該配列が白金表面へ変異型ＬＡＲＦＨを配向させていることが示された。即ち、本結果から、アミノ酸配列「ＹＫＲＧＹＫ」からなるペプチド、当該アミノ酸配列を有するポリペプチド、及びこれらの変異体は、白金に対する結合能を有しており、白金結合剤として有用であることが明らかとなった。 When the size of wild type and mutant type LARFH is approximated to a rectangle of about 3 nm × 5 nm, as shown in FIG. 10, wild type LARFH has a horizontal orientation (about 15 nm 2 ), and the mutant form of LARFH has a vertical orientation (about 9 nm 2). ). From these results, it was shown that the mutant LARFH containing the amino acid sequence “YKRGYK” was bound at the loop portion, and the sequence oriented the mutant LARFH on the platinum surface. That is, it is clear from this result that the peptide consisting of the amino acid sequence “YKRGYK”, the polypeptide having the amino acid sequence, and variants thereof have a binding ability to platinum and are useful as a platinum binding agent. It became.

Claims (12)

下記(i)又は(ii)に示すペプチド、或いは下記(iii)又は(iv)に示すポリペプチドからなることを特徴とする、白金吸着剤：
(i)配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド。
(ii)配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するペプチド。
(iii)配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するポリペプチド。
(iv)配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するポリペプチド。 A platinum adsorbent comprising the peptide shown in the following (i) or (ii) or the polypeptide shown in the following (iii) or (iv):
(i) A peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(ii) A peptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having a binding ability to platinum.
(iii) A polypeptide comprising an amino acid sequence having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and capable of binding to platinum.
(iv) A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and having a binding ability to platinum. 下記(A)〜(D)のいずれかに示すポリペプチドからなる、請求項１に記載の白金吸着剤：
(A)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(B)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１〜２０位のアミノ酸配列及び／又は２７〜９７位のアミノ酸配列の領域における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するポリペプチド。
(C)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、２１〜２６位のアミノ酸配列の領域における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するポリペプチド。
(D)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、２１〜２６位のアミノ酸配列の領域における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加され、且つ１〜２０位のアミノ酸配列及び／又は２７〜９７位のアミノ酸配列の領域における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するポリペプチド。 The platinum adsorbent according to claim 1, comprising the polypeptide shown in any of (A) to (D) below:
(A) A polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
(B) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, one or several amino acids in the region of the amino acid sequence at positions 1 to 20 and / or the amino acid sequence at positions 27 to 97 were substituted, deleted, inserted or added A polypeptide comprising an amino acid sequence and capable of binding to platinum.
(C) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, the amino acid sequence consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids in the region of the amino acid sequence at positions 21 to 26 are substituted, deleted, inserted or added, and has an ability to bind to platinum. Having a polypeptide.
(D) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, one or several amino acids in the region of the amino acid sequence at positions 21 to 26 are substituted, deleted, inserted or added, and the amino acid sequence at positions 1 to 20 and / or Or a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids in the region of the amino acid sequence at positions 27 to 97 are substituted, deleted, inserted or added, and having a binding ability to platinum. 請求項１又は２に記載の白金吸着剤が白金と結合されてなる、白金−ペプチド又はポリペプチド複合体。   A platinum-peptide or polypeptide complex comprising the platinum adsorbent according to claim 1 or 2 bound to platinum. 請求項１又は２に記載の白金吸着剤を提示してなるファージ。   A phage obtained by displaying the platinum adsorbent according to claim 1 or 2. 請求項４に記載のファージが白金と結合されてなる、白金−ファージ複合体。   A platinum-phage complex, wherein the phage according to claim 4 is bound to platinum. 請求項１又は２に記載の白金吸着剤又は請求項４に記載のファージを、白金と接触させる工程を含む、白金の結合方法。   A method for binding platinum, comprising the step of bringing the platinum adsorbent according to claim 1 or 2 or the phage according to claim 4 into contact with platinum. 請求項１又は２に記載の白金吸着剤を、白金表面に結合させる工程を含む、白金の改質方法。   A method for modifying platinum, comprising a step of bonding the platinum adsorbent according to claim 1 or 2 to a platinum surface. 請求項１又は２に記載の白金結合剤又は請求項４に記載のファージを、白金電極面上に配向させる工程を含む、白金の配向方法。   A method for orienting platinum, comprising the step of orienting the platinum binding agent according to claim 1 or 2 or the phage according to claim 4 on a platinum electrode surface. 請求項１又は２に記載の白金吸着剤又は請求項４に記載のファージを、白金含有物と接触させる工程を含む、白金含有物から白金を回収する方法。   A method for recovering platinum from a platinum-containing material, comprising the step of bringing the platinum adsorbent according to claim 1 or 2 or the phage according to claim 4 into contact with the platinum-containing material. 請求項１又は２に記載の白金結合剤又は請求項４に記載のファージを用いて基板上にパターンを作製し、当該白金結合剤又はファージを介して白金粒子を結合させる工程、或いは請求項３に記載の白金−ペプチド又はポリペプチド複合体、又は請求項５に記載の白金−ファージ複合体を用いて基板上にパターンを作製する工程を含む、基板上に白金粒子を配置する方法。   A step of producing a pattern on a substrate using the platinum binding agent according to claim 1 or 2 or the phage according to claim 4 and binding platinum particles via the platinum binding agent or phage, or claim 3 A method for arranging platinum particles on a substrate, comprising the step of creating a pattern on the substrate using the platinum-peptide or polypeptide complex according to claim 5 or the platinum-phage complex according to claim 5. 下記(i)又は(ii)に示すペプチド：
(i)配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド。
(ii)配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するペプチド。 Peptides shown in (i) or (ii) below:
(i) A peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(ii) A peptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having a binding ability to platinum. 下記(A)〜(D)のいずれかに示すポリペプチド：
(A)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(B)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１〜２０位のアミノ酸配列及び／又は２７〜９７位のアミノ酸配列の領域における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するポリペプチド。
(C)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、２１〜２６位のアミノ酸配列の領域における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するポリペプチド。
(D)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、２１〜２６位のアミノ酸配列の領域における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加され、且つ１〜２０位のアミノ酸配列及び／又は２７〜９７位のアミノ酸配列の領域における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、白金に対する結合能を有するポリペプチド。
The polypeptide shown in any of the following (A) to (D):
(A) A polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
(B) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, one or several amino acids in the region of the amino acid sequence at positions 1 to 20 and / or the amino acid sequence at positions 27 to 97 were substituted, deleted, inserted or added A polypeptide comprising an amino acid sequence and capable of binding to platinum.
(C) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, the amino acid sequence consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids in the region of the amino acid sequence at positions 21 to 26 are substituted, deleted, inserted or added, and has an ability to bind to platinum. Having a polypeptide.
(D) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, one or several amino acids in the region of the amino acid sequence at positions 21 to 26 are substituted, deleted, inserted or added, and the amino acid sequence at positions 1 to 20 and / or Or a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids in the region of the amino acid sequence at positions 27 to 97 are substituted, deleted, inserted or added, and having a binding ability to platinum.
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WO2017026505A1 (en) * 2015-08-11 2017-02-16 池田食研株式会社 Binding agent
JP2017037014A (en) * 2015-08-11 2017-02-16 池田食研株式会社 Binder agent

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