JP2006304633A - Immunoglobulin-binding protein - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、イムノグロブリン結合タンパク質に関するものであり、より詳しくは、アルカリ性条件下における化学的安定性を高める変異が導入されたプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメイン及びその変異導入方法に関する。また本発明は、アルカリ性条件下で安定なプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインの改変タンパク質をアフィニティリガンドとして結合したアフィニティクロマトグラフィ用担体とその使用に関する。 The present invention relates to an immunoglobulin-binding protein, and more particularly to an immunoglobulin-binding domain of protein A into which a mutation that enhances chemical stability under alkaline conditions is introduced and a method for introducing the mutation. The present invention also relates to a carrier for affinity chromatography in which a modified protein of an immunoglobulin binding domain of protein A that is stable under alkaline conditions is bound as an affinity ligand, and the use thereof.
生物工学及び生化学の分野における研究や製薬産業の分野において、純度の高いタンパク質試薬やタンパク質医薬の需要が高まっている。純度の高いタンパク質を製造するための精製方法としては、イオン交換クロマトグラフィ、疎水クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ等の様々な原理によるクロマトグラフィが採用されるが、なかでもアフィニティクロマトグラフィは目的タンパク質と夾雑物を分離する効率が極めて高い方法である。 In the fields of biotechnology and biochemistry and in the pharmaceutical industry, there is an increasing demand for highly pure protein reagents and protein drugs. As a purification method for producing high-purity proteins, chromatography based on various principles such as ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration chromatography, etc. is adopted. Among them, affinity chromatography separates target protein and contaminants. This is an extremely efficient method.
タンパク質をアフィニティリガンドとしたアフィニティクロマトグラフィ用担体は、一般に他のクロマトグラフィ担体より高価である。このことから、該アフィニティクロマトグラフィ用担体を充填したアフィニティカラムを用いて試料を精製する場合、該アフィニティカラムは、できる限り多数回の使用が望まれ、前記精製に一定の性能を保持している間、繰り返し使用される。このためタンパク質試薬やタンパク質医薬を、アフィニティカラムを用いて精製する際には、試料をアフィニティクロマトグラフィに供する前に、前回のアフィニティカラムに残留している有機物等を除去し、必要に応じて滅菌するなどの目的でカラムを洗浄する操作が行われる。安価かつ簡便で高い洗浄効果が得られることから、この洗浄操作には、通常ＮａＯＨ溶液が汎用される。０．１〜１．０ＭのＮａＯＨ溶液は、ウイルス、細菌、酵母、核酸、タンパク質及び他の夾雑因子を除去することができる。 A carrier for affinity chromatography using protein as an affinity ligand is generally more expensive than other chromatographic carriers. Therefore, when a sample is purified using an affinity column packed with the affinity chromatography carrier, the affinity column is desired to be used as many times as possible, while maintaining a certain performance in the purification. Used repeatedly. Therefore, when purifying protein reagents and protein drugs using an affinity column, remove the organic matter remaining in the previous affinity column and sterilize it if necessary before subjecting the sample to affinity chromatography. For example, the column is washed for the purpose. Since an inexpensive, simple and high cleaning effect is obtained, a NaOH solution is generally used for this cleaning operation. A 0.1-1.0 M NaOH solution can remove viruses, bacteria, yeast, nucleic acids, proteins and other contaminants.
一方でこの様な苛酷な洗浄条件は、アフィニティクロマトグラフィ用担体に固定されたリガンド（タンパク質）にとって傷害性が高い。一般にタンパク質は強酸性や強アルカリ性の条件には感受性である場合が多い。例えば上述のＮａＯＨ溶液を用いた洗浄によって、担体に固定されたリガンドの目的分子への特異的結合能力は減衰する。従って上述のアルカリ洗浄を伴う使用におけるアフィニティクロマトグラフィ用担体の有用寿命は、担体に固定されたリガンド（タンパク質）のアルカリ性条件下における安定性に依存する。すなわち、アルカリ性条件下における安定性が高いリガンド（タンパク質）の供給は、安価で高品質なタンパク質を製造するために求められている大きな課題である。 On the other hand, such severe washing conditions are highly damaging to the ligand (protein) immobilized on the carrier for affinity chromatography. In general, proteins are often sensitive to strongly acidic or strongly alkaline conditions. For example, washing with the above-mentioned NaOH solution attenuates the specific binding ability of the ligand immobilized on the carrier to the target molecule. Therefore, the useful life of the carrier for affinity chromatography in the use involving the above-mentioned alkaline washing depends on the stability of the ligand (protein) immobilized on the carrier under alkaline conditions. That is, the supply of a ligand (protein) that is highly stable under alkaline conditions is a major issue that is required to produce inexpensive and high-quality proteins.
アルカリ性条件に対するタンパク質の感受性に影響しうる既存の要因は、タンパク質中の主としてアスパラギン（Ａｓｎ）及びグルタミン（Ｇｌｎ）、特にＡｓｎにおける脱アミド反応の起こりやすさである。Ａｓｎの脱アミド反応は、環状イミド中間体を介して、約３：１の比率でイソアスパラギン酸及びアスパラギン酸（Ａｓｐ）を生じる。この反応は生理学的ｐＨの条件下でも進むが、アルカリ性条件下でははるかに速い。イソアスパラギン酸の生成反応は、α−カルボキシル基とα−アミノ基との間に形成されていた正常のアミド結合がβ−カルボキシル基とα−アミノ基との間のアミド結合に転移することを意味し、この反応は、タンパク質骨格中に余分な−ＣＨ２−鎖及び遊離のα−カルボキシル基を生じさせるとともに、タンパク質の高次構造に変化を及ぼす。また脱アミド反応の結果としてペプチド骨格が切断される場合もある等、Ａｓｎの脱アミド反応に伴うタンパク質の構造的変化は、しばしば多くのタンパク質においてその活性を損なうこと、さらにタンパク質のＡｓｎをアルカリ感受性がより低いアミノ酸に置換すると安定性が増すことが述べられている（Ｔｏｎｉｅ Ｗｒｉｇｈｔ Ｈ． １９９１年、Ｎｏｎｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａｓｐａｒａｇｉｎｙｌ ａｎｄ ｇｌｕｔａｍｉｎｙｌ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２６巻１号、１−５２頁）。酸性条件下におけるＡｓｎの脱アミド反応の生じ易さは、配列及び高次構造に非依存性であるが、アルカリ性条件下におけるＡｓｎの脱アミド反応の生じ易さは、配列及び高次構造に依存性であり、なかでもタンパク質表面に存在するＡｓｎ−グリシン（Ｇｌｙ）配列のＡｓｎは、アルカリ性条件下において他の配列のＡｓｎよりも約７０倍脱アミド化され易い（非特許文献１参照）。この様な知見に基づいて、Ａｓｎを修飾することによりアフィニティ担体に固定化されたリガンドタンパク質を安定化する技術に関する情報が開示されている（特許文献１参照）。 An existing factor that can affect the sensitivity of proteins to alkaline conditions is the susceptibility of deamidation reactions primarily in asparagine (Asn) and glutamine (Gln), particularly Asn, in proteins. The Asn deamidation reaction yields isoaspartic acid and aspartic acid (Asp) in a ratio of about 3: 1 via the cyclic imide intermediate. This reaction proceeds even under physiological pH conditions, but is much faster under alkaline conditions. The formation reaction of isoaspartic acid indicates that the normal amide bond formed between the α-carboxyl group and the α-amino group is transferred to the amide bond between the β-carboxyl group and the α-amino group. refers to, the reaction is extra in the protein backbone -CH 2 - with causing chain and free α- carboxyl group, exerts a change in the conformation of the protein. In addition, structural changes in the protein accompanying the deamidation of Asn, such as the peptide skeleton being cleaved as a result of the deamidation reaction, often impair the activity of many proteins, and further, the protein Asn is alkali-sensitive. Is substituted with lower amino acids (Tonnie Wright H. 1991, Nonzymatic degeneration of asparaginyl and glutaminyl residues in Bioresin in Bioproteins. -52). The ease of Asn deamidation under acidic conditions is independent of sequence and higher order structure, but the ease of Asn deamidation under alkaline conditions depends on the sequence and higher order structure. Among them, Asn of the Asn-glycine (Gly) sequence existing on the protein surface is more easily deamidated about 70 times than Asn of other sequences under alkaline conditions (see Non-Patent Document 1). Based on such findings, information on a technique for stabilizing a ligand protein immobilized on an affinity carrier by modifying Asn is disclosed (see Patent Document 1).
アフィニティリガンドとしてのプロテインＡの需要は高く、アルカリ性条件下における安定性の高いプロテインＡ及びその使用に関する技術情報も開示されている（特許文献２参照）。本技術情報資料には、プロテインＡに含まれる５つのイムノグロブリン結合ドメインに最も共通なアミノ酸配列を有するＢドメイン及び、Ｂドメインの１位のアラニン（Ａｌａ）をバリン（Ｖａｌ）に、２８−２９位のＡｓｎ−Ｇｌｙ配列をＡｓｎ−Ａｌａ配列に変換したイムノグロブリン結合ドメイン変異体（Ｚ−ドメイン）を基本として、その６位、１１位、２３位、２８位及び４３位のＡｓｎをグルタミン（Ｇｌｎ）以外のアミノ酸に置換することにより、アルカリ性条件下での安定性を高めることができると記述されている。しかし、この方法は、全てＡｓｎをアルカリ感受性がより低いアミノ酸に置換する既知の方法に該当する。本技術情報資料において、アルカリ耐性付与に寄与する最良の実施形態として述べられているＡｓｎの置換は、２３位のＡｓｎのスレオニン（Ｔｈｒ）への置換及び該置換と４３位のＡｓｎのグルタミン酸（Ｇｌｕ）への置換との組み合わせであるが、天然型Ｃドメインの２３位及び４３位のアミノ酸は、元よりそれぞれＴｈｒ及びＧｌｕであり、新規な配列ではない。さらに１１位のＡｓｎのセリン（Ｓｅｒ）への置換についても、同様に天然型Ｄドメインに元より含まれる形態である。 There is a high demand for protein A as an affinity ligand, and protein A having high stability under alkaline conditions and technical information relating to its use are also disclosed (see Patent Document 2). This technical information document includes a B domain having the most common amino acid sequence in five immunoglobulin binding domains contained in protein A, and alanine (Ala) at position 1 of the B domain as valine (Val). Based on the immunoglobulin binding domain mutant (Z-domain) obtained by converting the Asn-Gly sequence at the position to the Asn-Ala sequence, Asn at the 6th, 11th, 23rd, 28th and 43rd positions was converted to glutamine (Gln It is described that the stability under alkaline conditions can be increased by substituting with an amino acid other than (). However, this method corresponds to a known method in which Asn is replaced with an amino acid having a lower alkali sensitivity. In this technical information document, the substitution of Asn described as the best embodiment that contributes to imparting alkali resistance is the substitution of Asn at position 23 with threonine (Thr) and the substitution of Asn with glutamine (Glu at position 43). The amino acids at positions 23 and 43 of the natural C domain are originally Thr and Glu, respectively, and are not new sequences. Further, substitution of Asn at position 11 with serine (Ser) is also a form originally contained in the natural D domain.
また天然型のイムノグロブリン結合ドメインはいずれも２８−２９位にＡｓｎ−Ｇｌｙ配列を一カ所含んでおり、アルカリ性条件下において不安定であるが、２８−２９位のＡｓｎ−Ｇｌｙ配列がＡｓｎ−Ａｌａに変換された上述のＺ−ドメインが天然型ドメインと同様にイムノグロブリン結合能を有し、かつ化学的に安定であることは確認されている（非特許文献２参照）。すなわち、既知の知見によれば、アルカリ性条件下での安定性を高める方法は、もっぱらＡｓｎを含んだ配列の化学的不安定性に着目してアルカリ感受性の高い配列をアルカリ感受性の低い配列に変更する方法である。この方法によって実現できるアルカリ性条件に安定なイムノグロブリン結合ドメインの具体例を挙げると、２８−２９位にＡｓｎ−Ａｌａ配列をもち、かつ１１位、２３位及び４３位にそれぞれＳｅｒ、Ｔｈｒ及びＧｌｕを有する変異体であるといえる。このイムノグロブリン結合タンパク質は、天然型のイムノグロブリン結合タンパク質に比べてアルカリ性条件下での安定性は高いが、その化学的安定性はなお充分なものではない。
本発明の目的は、アルカリ性溶液による洗浄など苛酷な条件において、既存のものに比べて化学的安定性がより高いイムノグロブリン結合タンパク質をアフィニティクロマトグラフィ用担体に固定するリガンドとして提供することにある。 An object of the present invention is to provide an immunoglobulin-binding protein having higher chemical stability than a conventional one as a ligand to be immobilized on an affinity chromatography carrier under severe conditions such as washing with an alkaline solution.
アフィニティクロマトグラフィ用担体に固定するリガンド（タンパク質）に、アルカリ耐性を付与する方法として、アルカリ感受性の高いアミノ酸残基の置換による方法が、一般に多くのタンパク質に比較的共通して適応され得るが、ＡｓｎとそのＣ末端側のアミノ酸置換に限られていたため、自ずと限界があった。一方で、タンパク質の高次構造に着目して構造の安定性を高める様なアミノ酸置換を行うことでタンパク質の化学的安定性を高めることができる。この様な方法によれば、タンパク質毎に異なる構造情報が必要となり普遍性は低いが、アミノ酸配列情報のみによる改変に比べて、より安定性の高い変異体を創出できる。 As a method for imparting alkali resistance to a ligand (protein) immobilized on a carrier for affinity chromatography, a method based on substitution of amino acid residues having high alkali sensitivity can be generally applied in common to many proteins. And the C-terminal amino acid substitution was limited. On the other hand, the chemical stability of a protein can be increased by focusing on the higher order structure of the protein and performing amino acid substitution that enhances the stability of the structure. According to such a method, different structural information is required for each protein and the universality is low, but a more stable variant can be created as compared with the modification using only amino acid sequence information.
プロテインＡは、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）から単離され、Ｅドメイン、Ｄドメイン、Ａドメイン、Ｂドメイン及びＣドメインと呼ばれる５つの相同性を有するイムノグロブリン（Ｉｇ）結合ドメインを有する。該プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインは、いずれも３個のへリックス構造（Ｎ末端側から順にへリックス−１、へリックス−２及びへリックス−３）とそれらを互いに連結している２個のループ構造（Ｎ末端側から順にループ−１及びループ−２）から構成される。イムノグロブリンのＦｃ領域との結合に直接関与するアミノ酸は５位及び１３位のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）、９位、１０位及び３２位のＧｌｎ、１１位及び２８位のＡｓｎ、１４位のチロシン（Ｔｙｒ）、１７位のロイシン（Ｌｅｕ）、３１位のイソロイシン（Ｉｌｅ）及び３５位のリジン（Ｌｙｓ）であり、イムノグロブリンのＦｃ領域との結合に直接関与する全てのアミノ酸が、へリックス−１及びヘリックス−２に存在している（Ｔａｓｈｉｒｏ Ｍ．他 １９９７年 Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ＮＭＲ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｚ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｓｔａｐｈｙｒｏｃｏｃｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 第２７２巻４号、５７３−５９０頁）。これらのアミノ酸置換はイムノグロブリンとの結合特性を変化させることが予測される。
Protein A is isolated from Staphylococcus and has an immunoglobulin (Ig) binding domain with five homologies called E domain, D domain, A domain, B domain and C domain. The immunoglobulin-binding domain of protein A has three helix structures (helix-1, helix-2 and helix-3 in this order from the N-terminal side) and two helix structures linking them to each other. It is composed of a loop structure (loop-1 and loop-2 in order from the N-terminal side). The amino acids directly involved in binding to the immunoglobulin Fc region are phenylalanine (Phe) at positions 5 and 13, Gln at
Ｚドメインは、へリックス−３が欠落していてもイムノグロブリンと結合できるが、へリックス−３の欠落したＺドメインは安定性が低いことが知られている（Ｍｅｌｉｓｓａ Ａ．他 １９９７年、 Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｍｉｍｉｃｒｙ ｏｆ ａ ｎａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ ａ ｍｉｎｉｍｉｚｅｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ Ｎａｔｕｒａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ、第９４巻、１００８０−１００８５頁）。また、へリックス−２及びヘリックス−３の間にあるループ２のアミノ酸配列をＧｌｙが４個連続した配列に置換した変異体及びループ２にＧｌｙが６個連続した配列を挿入した変異体は、元のＺドメインタンパク質よりも安定性が低いことが知られている（Ｇｕｌｉｃｈ Ｓ．他 ２０００年、 Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ａｎ ＩｇＧ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ａｌｌｏｗｓ ｍｉｌｄｅｒ ｅｌｕｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第７６巻、２３３−２４４頁）。すなわち、プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインにおいて、ループ２は、イムノグロブリン結合部位であるヘリックス−１及びへリックス−２と、ドメインの安定性を維持するヘリックス−３との間の相互作用に影響する部位であり、ループ２及びその周辺のアミノ酸を置換することで、プロテインＡのイムノグロブリン結合タンパク質を安定化できる可能性が考えられる。また、一般的にタンパク質におけるループ構造はヘリックス構造に比べてタンパク質表面に存在していることが多く、タンパク質分子が化学的な攻撃を受けやすい部位であると言える。 Z domains can bind to immunoglobulins even in the absence of helix-3, but Z domains lacking helix-3 are known to be less stable (Melissa A. et al. 1997, Structural mimicry of a native protein by a minimized binding domain. Proceeding Natural Academy of Sciences USA, Vol. 94, pages 108010085). Further, a mutant in which the amino acid sequence of loop 2 between helix-2 and helix-3 is replaced with a sequence of 4 consecutive Gly, and a mutant in which a sequence of 6 consecutive Gly is inserted into loop 2, It is known to be less stable than the original Z-domain protein (Gulich S. et al. 2000, Protein engineering of an IgG-binding domains inflow conditions conjugation chemistry, Vol. 33, Biochemistry, Vol. 33). -244). That is, in the immunoglobulin A binding domain of protein A, loop 2 affects the interaction between helix-1 and helix-2, which are immunoglobulin binding sites, and helix-3, which maintains domain stability. It is considered that the immunoglobulin A binding protein of protein A can be stabilized by substituting the amino acid around the loop 2 and its periphery. In general, a loop structure in a protein often exists on the protein surface as compared with a helix structure, and it can be said that the protein molecule is a site susceptible to chemical attack.
そこで、本発明者らは、プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインにおいて、へリックス−へリックス間、へリックス−ループ間の相互作用を強めて、タンパク質の構造的な安定度を増し、又はタンパク質の水和表面積を減らすことによって本タンパク質の化学的安定性を高めることを目的とし、本タンパク質の高次構造に関する情報を基に、（１）空間的に互いに近接し、非共有結合が形成可能な距離にあるアミノ酸間に、イオン結合、水素結合又は疎水結合を形成させる置換、（２）本タンパク質において露出表面積が大きく、近辺のアミノ酸との相互作用による高次構造の維持やイムノグロブリンとの結合に直接関与していないと考えられるアミノ酸のうち、電荷を有するなど親水性が高いアミノ酸を水和表面積のより小さいアミノ酸に置換を行った。得られたイムノグロブリン結合タンパク質の変異体について、ＩｇＧ結合活性及びアルカリ安定性を検討した結果、主としてループ１及びループ２及びその周辺部におけるアミノ酸を置換したタンパク質が、ＩｇＧ結合活性を有するとともにアルカリに対する安定性が高いことを見いだした。本発明者らは、さらに研究を進め、本発明を完成した。 Therefore, the present inventors strengthened the helix-helix and helix-loop interactions in the immunoglobulin binding domain of protein A to increase the structural stability of the protein, or The purpose is to increase the chemical stability of the protein by reducing the total surface area. Based on information on the higher-order structure of the protein, (1) a distance that is close to each other and can form a non-covalent bond Substitution to form an ionic bond, hydrogen bond or hydrophobic bond between amino acids in (2), the exposed surface area of this protein is large, and maintenance of higher-order structure by interaction with nearby amino acids and binding to immunoglobulin Among amino acids that are considered not directly involved, amino acids with high hydrophilicity, such as those with a charge, have amino acids with a smaller hydration surface area. It was replaced with acid. As a result of investigating IgG binding activity and alkali stability of the obtained immunoglobulin binding protein mutant, proteins mainly substituted with amino acids in Loop 1 and Loop 2 and its peripheral part have IgG binding activity and are resistant to alkali. Found high stability. The inventors have further studied and completed the present invention.
すなわち、本発明は、
（１） スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）プロテインＡのＣドメイン若しくは配列番号２で示されるＣドメインの等機能変異体、又はＺドメイン若しくは配列番号１で示されるＺドメインの等機能変異体において、
イ）３３位及び／又は４４位のアミノ酸を、３３位及び４４位のアミノ酸間に疎水結合が形成されるアミノ酸に置換、
ロ）３７位及び／又は４０位のアミノ酸を、３７位及び４０位のアミノ酸間にイオン結合が形成されるアミノ酸に置換、
ハ）５位及び／又は３９位のアミノ酸を、５位及び３９位のアミノ酸間に疎水結合が形成されるアミノ酸に置換、
ニ）２７位のアミノ酸を、１６位、１７位、２２位及び３１位のアミノ酸から選択される少なくとも１つのアミノ酸との間に疎水結合が形成されるアミノ酸に置換、
のうちいずれか１箇所の置換又は２箇所以上の置換を行うことを特徴とする、該イムノグロブリン結合ドメインを含むイムノグロブリン結合タンパク質のアルカリ性条件下における化学的安定性を高める方法、
（２） スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）プロテインＡのＣドメイン若しくは配列番号２で示されるＣドメインの等機能変異体、又はＺドメイン若しくは配列番号１で示されるＺドメインの等機能変異体において、
イ）３３位のアミノ酸を、Ｖａｌ、Ｌｅｕ又はＩｌｅに置換、
及び／又は、
ロ）３７位のアミノ酸を、Ｌｙｓに、４０位のアミノ酸を、Ｇｌｕにそれぞれ置換、
ハ）３９位のアミノ酸を、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、又はＰｈｅに置換、
ニ）２７位のアミノ酸を、Ｌｅｕ又はＩｌｅに置換、
のうちいずれか１箇所の置換又は２箇所以上の置換を行うことを特徴とする、前記（１）に記載の方法、
（３） スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）プロテインＡのＣドメイン若しくは配列番号２で示されるＣドメインの等機能変異体、又はＺドメイン若しくは配列番号１で示されるＺドメインの等機能変異体において、
７位及び／又は２５位のアミノ酸を、より水和表面積の小さいアミノ酸に置換することを特徴とする、該イムノグロブリン結合ドメインを含むイムノグロブリン結合タンパク質のアルカリ性条件下における化学的安定性を高める方法、
（４） スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）プロテインＡのＣドメイン若しくは配列番号２で示されるＣドメインの等機能変異体、又はＺドメイン若しくは配列番号１で示されるＺドメインの等機能変異体において、
イ）７位のアミノ酸を、Ａｌａ、Ｓｅｒ又はＴｈｒに置換、及び／又は
ロ）２５位のアミノ酸を、Ａｌａ、Ｓｅｒ又はＴｈｒに置換、
することを特徴とする前記（３）に記載の方法、
That is, the present invention
(1) In a C domain of Staphylococcus protein A or an isofunctional variant of the C domain represented by SEQ ID NO: 2, or an isofunctional variant of the Z domain or Z domain represented by SEQ ID NO: 1,
A) Substitution of amino acids at positions 33 and / or 44 with amino acids in which a hydrophobic bond is formed between the amino acids at positions 33 and 44,
B) The amino acid at position 37 and / or 40 is replaced with an amino acid in which an ionic bond is formed between the amino acids at
C) substitution of amino acids at positions 5 and / or 39 with amino acids in which a hydrophobic bond is formed between the amino acids at positions 5 and 39;
D) replacing the amino acid at position 27 with an amino acid that forms a hydrophobic bond with at least one amino acid selected from amino acids at positions 16, 17, 22, and 31;
A method for improving chemical stability under alkaline conditions of an immunoglobulin-binding protein containing the immunoglobulin-binding domain, wherein the substitution is performed at any one of the above or at least two substitutions,
(2) In a C domain of Staphylococcus protein A or an isofunctional variant of the C domain represented by SEQ ID NO: 2, or an isofunctional variant of the Z domain or Z domain represented by SEQ ID NO: 1,
A) The amino acid at position 33 is replaced with Val, Leu or Ile.
And / or
B) The amino acid at position 37 is replaced with Lys, the amino acid at
C) replacing the amino acid at position 39 with Val, Leu, Ile, or Phe;
D) replacing the amino acid at position 27 with Leu or Ile;
The method according to (1) above, wherein any one of the substitutions or two or more substitutions is performed,
(3) In a C domain of Staphylococcus protein A or an isofunctional variant of the C domain represented by SEQ ID NO: 2, or an isofunctional variant of the Z domain or Z domain represented by SEQ ID NO: 1,
A method for increasing chemical stability under alkaline conditions of an immunoglobulin-binding protein comprising the immunoglobulin-binding domain, wherein the amino acid at position 7 and / or 25 is substituted with an amino acid having a smaller hydration surface area ,
(4) In a C domain of Staphylococcus protein A or an isofunctional variant of the C domain represented by SEQ ID NO: 2, or an isofunctional variant of the Z domain or Z domain represented by SEQ ID NO: 1,
A) the amino acid at position 7 is replaced with Ala, Ser or Thr; and / or b) the amino acid at position 25 is replaced with Ala, Ser or Thr;
The method according to (3), characterized in that:
（５） 前記（１）〜（４）のいずれかに記載の置換によって改変されたイムノグロブリン結合タンパク質、
（６） 前記（１）〜（４）のいずれかに記載の置換を２つ以上組み合わせて改変されたイムノグロブリン結合タンパク質、
（７） 改変前のイムノグロブリン結合タンパク質がスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）プロテインＡのＣドメインの等機能変異体であるＧ２９Ａ変異体（配列表：配列番号２）またはその等機能変異体であることを特徴とする、前記（５）又は（６）に記載のイムノグロブリン結合タンパク質、
（８） 配列表の配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とするイムノグロブリン結合タンパク質又はその等機能変異体、
（９） イムノグロブリン結合タンパク質の単位が２個またはそれ以上連結されており、その中に前記（５）から（８）のいずれかに記載のイムノグロブリン結合タンパク質を１又は２以上含むことを特徴とするイムノグロブリン結合タンパク質多量体、
（１０） 前記（５）〜（８）のいずれかに記載のイムノグロブリン結合タンパク質をコードすることを特徴とする核酸配列、
（１１） 前記（１０）に記載の核酸配列を含むことを特徴とする遺伝子発現系、
（１２） アフィニティリガンドとして前記（５）〜（９）のいずれかに記載のイムノグロブリン結合タンパク質又はその多量体を含むことを特徴とするアフィニティクロマトグラフィ用担体、
（１３） 前記（１２）に記載のアフィニティクロマトグラフィ用担体を含むことを特徴とするアフィニティカラム、
（１４） 前記（１３）に記載のアフィニティクロマトグラフィ用担体を用いることを特徴とするＩｇＧ、ＩｇＡ及び／又はＩｇＭのアフィニティ分離方法、及び
（１５） ＩｇＧ、ＩｇＡ及び／又はＩｇＭを前記（１４）に記載のアフィニティカラムを搭載したアフィニティクロマトグラフィに付すこと特徴とするＩｇＧ、ＩｇＡ及び／又はＩｇＭの分離方法、
に関する。
(5) an immunoglobulin-binding protein modified by the substitution according to any one of (1) to (4),
(6) an immunoglobulin-binding protein modified by combining two or more of the substitutions according to any one of (1) to (4) above,
(7) The immunoglobulin-binding protein before modification is a G29A mutant (sequence table: SEQ ID NO: 2), which is an isofunctional mutant of the C domain of Staphylococcus protein A, or an isofunctional mutant thereof. The immunoglobulin-binding protein according to (5) or (6) above,
(8) an immunoglobulin-binding protein or an equivalent functional variant thereof, comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 in the sequence listing;
(9) Two or more immunoglobulin-binding protein units are linked, and one or more of the immunoglobulin-binding proteins according to any one of (5) to (8) are contained therein. An immunoglobulin-binding protein multimer,
(10) A nucleic acid sequence encoding the immunoglobulin binding protein according to any one of (5) to (8),
(11) A gene expression system comprising the nucleic acid sequence according to (10),
(12) The affinity chromatography carrier comprising the immunoglobulin binding protein according to any one of (5) to (9) or a multimer thereof as an affinity ligand,
(13) An affinity column comprising the carrier for affinity chromatography described in (12) above,
(14) A method for affinity separation of IgG, IgA and / or IgM using the carrier for affinity chromatography described in (13), and (15) IgG, IgA and / or IgM in (14) A method for separating IgG, IgA and / or IgM, which is subjected to affinity chromatography equipped with the described affinity column;
About.
本発明により、アルカリ性条件下等における化学的安定性を著しく高めたプロテインＡの改変イムノグロブリン結合タンパク質を提供できる。
本発明の化学的により安定なイムノグロブリン結合タンパク質をアフィニティリガンドとして利用することによって、繰り返し使用される際における、苛酷な条件での洗浄又は滅菌操作を伴う使用におけるアフィニティクロマトグラフィ用担体の有用寿命を延長できる。すなわち、本発明は、安価で高品質なイムノグロブリンを製造するために有用である。
INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, it is possible to provide a modified immunoglobulin-binding protein of protein A that has significantly enhanced chemical stability under alkaline conditions and the like.
Use of the chemically stable immunoglobulin-binding protein of the present invention as an affinity ligand extends the useful life of an affinity chromatography support in repeated use or in conjunction with washing or sterilization operations under harsh conditions it can. That is, the present invention is useful for producing an inexpensive and high-quality immunoglobulin.
本発明において、「プロテインＡ」とは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）の細胞壁に存在する約５８．７ｋＤａのタンパク質で、５３−５８アミノ酸で構成される３個のα−へリックスの束から成るイムノグロブリン結合ドメインの単位を１分子中に５個有しており、Ｃｏｗａｎ Ｉ株の培養液から製造できる［Ｕｈｌｅｎ Ｍ．他 １９８４年 Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ． Ａ ｇｅｎｅ ｅｖｏｌｖｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｏｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２５９巻３号、１６９５−１７０２頁、及び福井三郎他監修 『バイオテクノロジー事典』 （株）シーエムシー、９５８頁（１９８６−１０−９）］。５個のイムノグロブリン結合ドメインは、Ｎ末端から順番にＥ，Ｄ，Ａ，Ｂ，Ｃと呼ばれており、これら各ドメインのアミノ酸配列には互いに高い相同性があり、すべてのドメインが単独でイムノグロブリンと結合する（例えば、米国特許番号ＵＳ５１５１３５０号参照）。 In the present invention, “Protein A” is an approximately 58.7 kDa protein present in the cell wall of Staphylococcus aureus, and consists of a bundle of three α-helices composed of 53-58 amino acids. It has 5 units of immunoglobulin binding domain per molecule and can be produced from the culture of Cowan I strain [Uhlen M. et al. 1984 Complete sequence of the staphylococcal gene encoding protein A. et al. A gene evolved through multiple duplications. The Journal of Biological Chemistry, Vol. 259, No. 3, pp. 1695-1702, and supervision of Saburo Fukui et al., “Biotechnology Encyclopedia” CMC, 958 (1986-10-9)]. The five immunoglobulin binding domains are called E, D, A, B, and C in order from the N-terminus, and the amino acid sequences of these domains are highly homologous to each other, and all domains are independent. It binds to immunoglobulin (see, for example, US Pat. No. US5151,350).
また、本発明において「アミノ酸」というときは、特に断らない限りタンパク質を構成するアミノ酸配列を構成するアミノ酸残基のことをいう。なお、本発明において、各アミノ酸残基は以下の略号で示す。
Ａｌａ（又はＡ）：アラニン、Ａｒｇ（又はＲ）：アルギニン、Ａｓｎ（又はＮ）：アスパラギン、Ａｓｐ（又はＤ）：アスパラギン酸、Ｃｙｓ（又はＣ）：システイン、Ｇｌｕ（又はＥ）：グルタミン酸、Ｇｌｎ（又はＱ）：グルタミン、Ｇｌｙ（又はＧ）：グリシン、Ｈｉｓ（又はＨ）：ヒスチジン、Ｉｌｅ（又はＩ）：イソロイシン、Ｌｅｕ（又はＬ）：ロイシン、Ｌｙｓ（又はＫ）：リジン、Ｍｅｔ（又はＭ）：メチオニン、Ｐｈｅ（又はＦ）：フェニルアラニン、Ｐｒｏ（又はＰ）：プロリン、Ｓｅｒ（又はＳ）：セリン、Ｔｈｒ（又はＴ）：スレオニン、Ｔｒｐ（又はＷ）：トリプトファン、Ｔｙｒ（又はＹ）：チロシン、Ｖａｌ（又はＶ）：バリン
In the present invention, the term “amino acid” refers to an amino acid residue constituting an amino acid sequence constituting a protein unless otherwise specified. In the present invention, each amino acid residue is represented by the following abbreviation.
Ala (or A): alanine, Arg (or R): arginine, Asn (or N): asparagine, Asp (or D): aspartic acid, Cys (or C): cysteine, Glu (or E): glutamic acid, Gln (Or Q): glutamine, Gly (or G): glycine, His (or H): histidine, Ile (or I): isoleucine, Leu (or L): leucine, Lys (or K): lysine, Met (or M): methionine, Phe (or F): phenylalanine, Pro (or P): proline, Ser (or S): serine, Thr (or T): threonine, Trp (or W): tryptophan, Tyr (or Y) : Tyrosine, Val (or V): Valine
「イムノグロブリン」とは、免疫グロブリンともいいＩｇと略記される。イムノグロブリンは、生体が細菌のような異物（自分以外の物）に反応して、異物に対する免疫抵抗力を与える役目をする抗体及びこれと構造上又は機能上の関連のもつタンパク質をいう。ヒトをはじめとする動物の体液中に存在し、リンパ系細胞、特にＢ細胞によって産生される。イムノグロブリンとしては、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥが挙げられる。 “Immunoglobulin” is also called immunoglobulin and is abbreviated as Ig. Immunoglobulin refers to an antibody that serves to provide immune resistance to foreign substances by reacting with foreign substances (other than itself) such as bacteria, and proteins structurally or functionally related thereto. It exists in body fluids of animals including humans and is produced by lymphoid cells, particularly B cells. Examples of the immunoglobulin include IgG, IgM, IgA, IgD, and IgE.
例えばイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）は、研究用試薬または医薬としての需要が高い生体高分子であり、抗原により免疫した動物の血清や、モノクローナル抗体の作成技術を用いた細胞培養液などを出発原料として調製される。イムノグロブリンの分離・精製過程には、イムノグロブリンの可変領域（Ｆａ領域）と選択的な親和性を持つ抗原分子をアフィニティリガンドとしたアフィニティクロマトグラフィが利用できる。しかし、優良なイムノグロブリンのＦａ領域と抗原分子との親和性は極めて強く、場合によっては結合したイムノグロブリンをカラムから流出させて回収する過程で強酸性の緩衝液を用いるなど苛酷な条件を必要とするため、しばしば回収の過程で無視できない量のイムノグロブリンが失活してしまうという問題がある。その様な問題がより小さな方法として、イムノグロブリンの不変領域（Ｆｃ領域）と選択的な親和性を持つプロテインＡをアフィニティリガンドとしたアフィニティクロマトグラフィが広く利用されている。 Immunoglobulin G (IgG), for example, is a biopolymer with high demand as a research reagent or medicine, and it uses as a starting material the serum of animals immunized with antigens, cell culture solutions using monoclonal antibody production technology, and the like. Prepared. For the separation / purification process of immunoglobulin, affinity chromatography using an antigen molecule having selective affinity for immunoglobulin variable region (Fa region) as an affinity ligand can be used. However, the affinity between the fa region of a good immunoglobulin and the antigen molecule is extremely strong. In some cases, severe conditions such as using a strongly acidic buffer in the process of collecting and recovering the bound immunoglobulin from the column are required. Therefore, there is a problem that an amount of immunoglobulin that cannot be ignored in the process of recovery is often inactivated. As a method for reducing such a problem, affinity chromatography using a protein A having a selective affinity for an immunoglobulin constant region (Fc region) as an affinity ligand is widely used.
「タンパク質」とは、ポリペプチド又はペプチド構造を有するあらゆる分子を含むものであって、天然型タンパク質の部分的断片や天然型の配列を人為的に改変した変異体を含む。
「イムノグロブリン結合タンパク質」とは、イムノグロブリンに特異的な親和性を有し、選択的に結合する「イムノグロブリン結合ドメイン」を含んで成るタンパク質をいう。結合の様式は、イオン結合、水素結合又は疎水結合等の非共有結合である。
「イムノグロブリン結合ドメイン」とは、単独でイムノグロブリン結合能を有するポリペプチドの機能単位を指す。「Ｚドメイン」はスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）プロテインＡのＢドメインをもとに、１位のＡｌａをＶａｌに（Ａ１Ｖ）、２９位のＧｌｙをＡｌａ（Ｇ２９Ａ）に置換した改変ドメインである。
“Protein” includes any molecule having a polypeptide or peptide structure, and includes a partial fragment of a natural protein and a variant obtained by artificially modifying a natural sequence.
An “immunoglobulin binding protein” refers to a protein comprising an “immunoglobulin binding domain” that has specific affinity for an immunoglobulin and selectively binds to it. The mode of bonding is non-covalent bonding such as ionic bonding, hydrogen bonding or hydrophobic bonding.
The “immunoglobulin binding domain” refers to a functional unit of a polypeptide having an immunoglobulin binding ability alone. “Z domain” is a modified domain in which Ala at position 1 is replaced with Val (A1V) and Gly at position 29 is replaced with Ala (G29A) based on the B domain of Staphylococcus protein A.
「イムノグロブリン結合タンパク質の等機能変異体」又は「イムノグロブリン結合ドメインの等機能変異体」とは、部分的なアミノ酸の挿入、削除、置換、アミノ酸残基の化学的修飾等により改変されたイムノグロブリン結合タンパク質またはイムノグロブリン結合ドメインであって、改変前のアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を保持し、かつイムノグロブリン結合特性（活性）において、改変前のタンパク質又はドメインと同等と見なされるものを指す。プロテインＡのＣドメインに係る等機能変異体としては、例えば配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメイン、プロテインＡのドメインＡ、Ｂ、Ｄ又はＥ等が挙げられる。 “Immunoglobulin-binding protein isofunctional variant” or “immunoglobulin-binding domain isofunctional variant” refers to an immunogen that has been altered by partial amino acid insertion, deletion, substitution, chemical modification of amino acid residues, etc. Globulin-binding protein or immunoglobulin-binding domain, which retains homology of 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more with the amino acid sequence before modification, and in immunoglobulin binding properties (activity) , Refers to what is considered equivalent to the protein or domain before modification. Examples of the isofunctional variant related to the C domain of protein A include an immunoglobulin binding domain consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, domain A, B, D or E of protein A.
「アミノ酸間に疎水結合」又は「アミノ酸間にイオン結合」とは、イムノグロブリン結合タンパク質が高次構造を形成するときに空間的に近接するアミノ酸間に形成される非共有結合の形式をいう。非共有結合が形成可能なアミノ酸間における近接する距離は、結合の種類によって異なる。例えば、イオン結合は、一般に２．６Å〜３．５Åの距離にあるアミノ酸の間に形成される。疎水結合（疎水的相互作用）の強さはアミノ酸周辺の環境によって異なるが、一般に３．０Å〜４．０Åの距離にあるアミノ酸の間に形成される。ただし、互いが結合形成可能なアミノ酸の組み合わせに限られることは言うまでもない。具体的には、イオン結合はＧｌｕ又はＡｓｐ（マイナスの電荷を持つアミノ酸）とＬｙｓ、ＨｉｓまたはＡｒｇ（プラスの電荷を持つアミノ酸）の間に限り形成される。また、疎水結合は、一般にＡｌａ，Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ及びＰｒｏといった疎水性アミノ酸同士の間に形成される。タンパク質が高次構造を維持している状態において、近接するアミノ酸間の距離の近似値は、例えば公的なタンパク質データベース（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ）から得たデータを基に、例えば分子設計支援・分子構造表示ソフトウェア「ＴＵＲＢＯ−ＦＲＯＤＯ」（株式会社エルエイシステムズ製）を用いて表示させることができる。具体的には、例えば配列番号１で示されるドメインＺについて説明する。ドメインＺにおいて、３９位のＳｅｒは５位のＰｈｅとの間に疎水結合形成し得ないが、３９位のアミノ酸を例えばＬｅｕに置換することで、５位との距離が約３．５Åとなり、かつＬｅｕ及びＰｈｅはともに疎水性の強いアミノ酸であることから、これらの間には疎水結合が形成される。 “Hydrophobic bond between amino acids” or “ionic bond between amino acids” refers to a form of non-covalent bond formed between amino acids in spatial proximity when an immunoglobulin-binding protein forms a higher order structure. The close distance between amino acids that can form a non-covalent bond varies depending on the type of bond. For example, ionic bonds are formed between amino acids that are generally at a distance of 2.6 to 3.5 inches. The strength of the hydrophobic bond (hydrophobic interaction) varies depending on the environment around the amino acid, but is generally formed between amino acids at a distance of 3.0 to 4.0 mm. However, it goes without saying that it is limited to combinations of amino acids that can form a bond with each other. Specifically, an ionic bond is formed only between Glu or Asp (a negatively charged amino acid) and Lys, His or Arg (a positively charged amino acid). In addition, a hydrophobic bond is generally formed between hydrophobic amino acids such as Ala, Val, Leu, Ile, Met, Trp, Phe and Pro. In a state where the protein maintains a higher-order structure, the approximate value of the distance between adjacent amino acids is, for example, based on data obtained from a public protein database, for example, molecular design support / molecular structure It can be displayed using display software “TURBO-FRODO” (manufactured by L Systems Co., Ltd.). Specifically, for example, domain Z represented by SEQ ID NO: 1 will be described. In domain Z, Ser at position 39 cannot form a hydrophobic bond with Phe at position 5, but by replacing the amino acid at position 39 with, for example, Leu, the distance from position 5 is about 3.5 mm. In addition, since Leu and Phe are both highly hydrophobic amino acids, a hydrophobic bond is formed between them.
「水和表面積の小さいアミノ酸」とは、親水性及び露出表面積がともに小さいアミノ酸をいう。一般にアミノ酸の親水性は、「電荷を持つアミノ酸」＞「極性だが電荷のないアミノ酸」＞＞「疎水性アミノ酸」の順に大きい。「電荷を持つアミノ酸」としては、例えばＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ又はＧｌｕが挙げられる。「極性だが電荷のないアミノ酸」としては、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ又はＧｌｙが挙げられる。「疎水性アミノ酸」としては、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はＰｒｏが挙げられる。アミノ酸の露出表面積は概ねアミノ酸の分子量に比例して大きくなる。
水和表面積の小さいアミノ酸への置換とは、具体的には配列番号１で示される第７位Ｌｙｓや第２５位Ｇｌｕから例えばＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ又はＰｒｏ等への置換が挙げられる。ただし、特別に理由がない限り、化学的性質が特徴的なＣｙｓやペプチド鎖の基本骨格に変化を及ぼす可能性があるＰｒｏ及びＧｌｙへの変換はタンパク質全体の構造を変化させる場合があるので、避けるほうが好ましい。また、イムノグロブリン結合ドメインのような水溶性タンパク質の表面に露出している親水性アミノ酸を疎水性の高いアミノ酸に置換すると、タンパク質全体の特性を変化させる場合があるので、避ける方が好ましい。
The “amino acid having a small hydrated surface area” refers to an amino acid having both a hydrophilic property and a small exposed surface area. In general, the hydrophilicity of amino acids increases in the order of “charged amino acid”> “polar but uncharged amino acid” >> “hydrophobic amino acid”. Examples of the “charged amino acid” include Lys, Arg, His, Asp, or Glu. “A polar but uncharged amino acid” includes Ser, Thr, Tyr, Cys, Asn, Gln, or Gly. “Hydrophobic amino acids” include Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp or Pro. The exposed surface area of amino acids generally increases in proportion to the molecular weight of the amino acid.
Specifically, substitution with an amino acid having a small hydration surface area is substitution from 7th position Lys or 25th position Glu shown in SEQ ID NO: 1, for example, Ser, Thr, Cys, Ala, Gly, Val or Pro. Is mentioned. However, unless there is a specific reason, conversion to Pro and Gly, which may change the basic skeleton of the chemical properties and Cys, whose chemical properties are characteristic, may change the structure of the entire protein. It is better to avoid it. In addition, it is preferable to avoid substitution of a hydrophilic amino acid exposed on the surface of a water-soluble protein such as an immunoglobulin-binding domain with a highly hydrophobic amino acid because it may change the properties of the entire protein.
「アフィニティ」とは、タンパク質−タンパク質、タンパク質−核酸、酵素−基質、受容体−リガンド間などに認められる選択的な親和性をいう。
「アフィニティカラムクロマトグラフィ」とは、上記親和性を利用したカラムクロマトグラフィをいうが、一般に生体分子にタンパク質が関与する特異性の高い分子間相互作用を利用したタンパク質の分離方法である。この方法は、タンパク質−タンパク質、タンパク質−核酸、酵素−基質、受容体−リガンド間などに認められる選択的な親和性を利用して、標的分子とそれ以外の分子を効率よく分離することができるものである。標的分子（本発明においてはイムノグロブリン）と特異的相互作用を有する分子（アフィニティリガンド）を共有結合によって固定化した不溶性担体をカラムに充填し、これに標的分子を含む溶液を流して標的分子のみをアフィニティリガンドに結合させ、次いでカラムを洗浄して混在する他の非特異的分子を除去した後、標的分子を溶出させることで、純度の高い試料を調製することができる。標的分子の溶出は、溶離液を変化、例えば塩濃度を徐々に高めるグラジエントにより変化させ、アフィニティリガンドに捕らえられていた標的分子をリガンドから離すことによって実施できる。すなわち、アフィニティクロマトグラフィは極めて効率のよい精製／分離技術であり、簡便かつ迅速に高純度の目的タンパク質を精製できる。「アフィニティカラム」とは、アフィニティクロマトグラフィ用担体を充填したアフニティクロマトグラフィを実施できるカラムをいう。
“Affinity” refers to the selective affinity observed between protein-protein, protein-nucleic acid, enzyme-substrate, receptor-ligand and the like.
“Affinity column chromatography” refers to column chromatography using the above affinity, and is generally a method for separating proteins using a highly specific intermolecular interaction involving a protein in a biomolecule. This method can efficiently separate a target molecule and other molecules by utilizing the selective affinity observed between protein-protein, protein-nucleic acid, enzyme-substrate, receptor-ligand, etc. Is. A target molecule (immunoglobulin in the present invention) and a molecule having an specific interaction (affinity ligand) immobilized with a covalent bond are packed in a column, and a solution containing the target molecule is passed through it to flow only the target molecule. Is then bound to the affinity ligand, and the column is washed to remove other non-specific molecules present therein, followed by elution of the target molecule, whereby a sample with high purity can be prepared. The elution of the target molecule can be carried out by changing the eluent, for example, by changing the gradient of the salt concentration gradually, and separating the target molecule captured by the affinity ligand from the ligand. In other words, affinity chromatography is an extremely efficient purification / separation technique, and a high-purity target protein can be purified simply and quickly. “Affinity column” refers to a column that can be subjected to affinity chromatography packed with a carrier for affinity chromatography.
「アフィニティリガンド」とは、例えば抗原と抗体のペアで代表される特異的親和力に基づいて、例えば抗体を特異的に捕集（結合）する抗原等の官能基をいう。本発明においては、イムノグロブリン（Ｉｇ）を選択的に捕集（結合）する官能基となるイムノグロブリン結合タンパク質をいう。なお、本発明においては、単に「リガンド」ということもある。
「アフィニティクロマトグラフィ用担体」とは、不溶性担体にアフィニティリガンドを固定化させた担体をいう。固定化とは、不溶性担体にアフィニティリガンドを結合させることをいい、これによって不溶性担体が標的分子（イムノグロブリン）の親和性吸着体となる。不溶性担体としては、例えば、キトサン、デキストランなどの天然の高分子材料、ポリアクリルアミド、アセチルセルロース、ポリイミドなどの合成樹脂材料、シリケート結晶子多孔体、セラミック、多孔質ガラスなどからビーズ状に整形したものなどを挙げることができる。アフィニティリガンドの該担体への固定方法としては、担体結合法、架橋法、包括法等が挙げられる。これらは公知の方法に従って行なわれる。
The “affinity ligand” refers to a functional group such as an antigen that specifically collects (binds) an antibody, for example, based on a specific affinity represented by a pair of an antigen and an antibody. In the present invention, it refers to an immunoglobulin-binding protein that serves as a functional group for selectively collecting (binding) immunoglobulin (Ig). In the present invention, it may be simply referred to as “ligand”.
“Affinity chromatography support” refers to a support in which an affinity ligand is immobilized on an insoluble support. Immobilization refers to binding of an affinity ligand to an insoluble carrier, whereby the insoluble carrier becomes an affinity adsorbent for a target molecule (immunoglobulin). Insoluble carriers include, for example, natural polymer materials such as chitosan and dextran, synthetic resin materials such as polyacrylamide, acetylcellulose, and polyimide, silicate crystallite porous bodies, ceramics, porous glass, etc. And so on. Examples of the method for immobilizing the affinity ligand on the carrier include a carrier binding method, a crosslinking method, and a comprehensive method. These are performed according to known methods.
「アルカリ性条件下」とは、タンパク質試薬やタンパク質医薬をアフィニティ精製する際に、使用後のクロマトグラフィにおいて、カラムに残留している有機物等を除去し、必要に応じて滅菌する洗浄が塩基性溶液を用いて行われるが、この洗浄の目的を達成し得る程度のアルカリ性をいう。具体的には、約０．１〜１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液等を用いることにより、前記カラム残留物の除去、滅菌または洗浄等の目的を達成し得る。 “Alkaline conditions” means that, when affinity purification of protein reagents and protein drugs, in the chromatography after use, organic substances remaining on the column are removed, and the basic solution is washed by sterilization as necessary. Although it is used, it is said to be alkaline enough to achieve the purpose of this cleaning. Specifically, the purpose of removing the column residue, sterilization, or washing can be achieved by using about 0.1 to 1N sodium hydroxide aqueous solution.
「化学的安定性」とは、タンパク質がアルカリ性条件や酸性条件或いは高温条件等において、アミノ酸残基の化学変化又はアミド結合の転移や切断などの変性を受けず、タンパク質の機能（本発明においては、イムノグロブリンの捕集活性）を保持する性質をいう。すなわち「化学的安定性」が高いほど変性、失活が起こりにくいタンパク質である。
本発明のイムノグロブリン結合タンパク質を化学的に安定化する方法は、イムノグロブリン結合ドメインのへリックス−へリックス間、へリックス−ループ間の相互作用を強めて、タンパク質の構造的な安定度を増すとともに、露出表面積が大きく機能発現に関係しないアミノ酸の水和表面積を減らすことによって、本タンパク質の化学的安定性を高める変異の導入により実現する。具体的には、３３位及び４４位アミノ酸の組み合わせ、３７位及び４０位アミノ酸の組み合わせ、５位及び３９位のアミノ酸の組み合わせ並びに１６、２２位及び２７位アミノ酸の組み合わせ、１６位、１７位、３１位及び２７位アミノ酸の組み合わせ、さらに、７位及び２５位におけるアミノ酸に適切な置換を導入することで実施される。プロテインＡの化学的安定性を高めるための従来技術から考えると、本発明による変異体作成の基になるイムノグロブリン結合ドメインは、２３位及び２９位のアミノ酸が、それぞれＴｈｒ及びＡｌａであるのが望ましいが、これを必要条件とするものではない。
“Chemical stability” refers to the function of a protein (in the present invention, it is not subject to denaturation such as chemical changes of amino acid residues or amide bond transfer or cleavage under alkaline, acidic or high temperature conditions). , The property of retaining the activity of collecting immunoglobulin). That is, the protein is less likely to be denatured or inactivated as the “chemical stability” is higher.
The method for chemically stabilizing the immunoglobulin binding protein of the present invention increases the structural stability of the protein by enhancing the helix-helix and helix-loop interactions of the immunoglobulin binding domain. At the same time, it is realized by introducing mutations that increase the chemical stability of the protein by reducing the hydration surface area of amino acids that have a large exposed surface area and are not related to function expression. Specifically, a combination of amino acids at positions 33 and 44, a combination of amino acids at
本発明のイムノグロブリン結合タンパク質は、目的とするイムノグロブリン結合タンパク質をコードするｃＤＮＡを含有する組換え発現ベクターを宿主に形質転換することにより、遺伝子組換え技術を応用して大量かつ経済的に組換えイムノグロブリン結合タンパク質を取得することができる。改変タンパク質をコードするｃＤＮＡを含有する組換え発現ベクターは、宿主細胞へ導入され、形質転換体が構築される。イムノグロブリン結合タンパク質を製造するための技術としては、公知の方法を利用できる。核酸配列の部位指定突然変異の誘発、目的遺伝子の発現系の構築等についての標準技術は、例えばＦｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ． ＡｕｓｕｂｅｌらによるＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙに記載されている。具体的には、プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインの最小単位は６０アミノ酸程度より成る小さなタンパク質であるので、例えば望まれるアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列を数十塩基からなる合成オリゴヌクレオチドに分割して合成し、それらをＤＮＡリガーゼによって繋げ、そのままベクターに挿入して大腸菌を形質転換することで、クローニングすることができる。この場合、大腸菌で効率よく発現させる目的で、大腸菌の至適コドンを用いた遺伝子の塩基配列を採用することは、当業者によって、一般的に行われている。また改変前のクローンＤＮＡを鋳型として、ミスマッチ塩基対を組み込む合成オリゴＤＮＡを一回目のポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）のプライマーとして利用し、オーバーラップ伸張法を用いて意図した部位に突然変異を導入することもできる。 The immunoglobulin binding protein of the present invention can be assembled in large quantities and economically by applying a gene recombination technique by transforming a recombinant expression vector containing a cDNA encoding the target immunoglobulin binding protein into a host. A modified immunoglobulin binding protein can be obtained. A recombinant expression vector containing a cDNA encoding the modified protein is introduced into a host cell, and a transformant is constructed. A known method can be used as a technique for producing the immunoglobulin binding protein. Standard techniques for inducing site-directed mutagenesis of nucleic acid sequences, constructing expression systems for target genes, etc. are described in, for example, Frederick M. et al. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology. Specifically, since the minimum unit of the immunoglobulin A binding domain of protein A is a small protein consisting of about 60 amino acids, for example, a cDNA sequence encoding a desired amino acid sequence is divided into synthetic oligonucleotides consisting of several tens of bases. It can be cloned by synthesizing, ligating them with DNA ligase, inserting it into a vector as it is, and transforming E. coli. In this case, for the purpose of efficient expression in E. coli, it is common practice by those skilled in the art to employ the base sequence of the gene using the optimal codon of E. coli. In addition, using the cloned DNA before modification as a template and using synthetic oligo DNA incorporating mismatched base pairs as primers for the first polymerase chain reaction (PCR), a mutation is introduced at the intended site using the overlap extension method. You can also.
形質転換された大腸菌を培養し、目的とするイムノグロブリン結合タンパク質を生成させる。該タンパク質は、菌体中に生成されることから、培養後の形質転換体よりイムノグロブリン結合タンパク質の分離、精製を行うことができる。生成された該タンパク質は、培養液中に分泌されることから、この形質転換体の培養上清を用いてイムノグロブリン結合タンパク質の分離、精製を行うことができる。また、形質転換体中に生成されたイムノグロブリン結合タンパク質の分離、精製を行うこともできる。イムノグロブリン結合タンパク質の分離、精製は、自体公知の分離、精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法、透析法、限外濾過法、ゲル濾過法、及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法等の主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィ等の荷電の差を利用する方法、アフィニティクロマトグラフィ等の特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィ等の疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法等の等電点の差を利用する方法等が挙げられる。なお、イムノグロブリン結合タンパク質には、例えばヒスチジンタグ等をイムノグロブリン結合タンパク質のＮ末端又はＣ末端に付加し、ヒスチジンタグ融合タンパク質としてもよい。ヒスチジンタグ融合タンパク質は、例えば金属アフィニティ樹脂を用いたアフィニティクロマトグラフィ等により、容易に分離、精製できる。 The transformed E. coli is cultured to produce the desired immunoglobulin binding protein. Since the protein is produced in bacterial cells, immunoglobulin-binding protein can be separated and purified from the transformant after culturing. Since the produced protein is secreted into the culture solution, the immunoglobulin binding protein can be separated and purified using the culture supernatant of the transformant. In addition, the immunoglobulin binding protein produced in the transformant can be separated and purified. Separation and purification of immunoglobulin-binding protein can be performed by appropriately combining per se known separation and purification methods. These known separation and purification methods include mainly molecular weights such as methods utilizing solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Method using difference in charge, method using difference in charge such as ion exchange chromatography, method utilizing specific affinity such as affinity chromatography, method utilizing difference in hydrophobicity such as reverse phase high performance liquid chromatography, etc. Examples thereof include a method using a difference in isoelectric point such as electric point electrophoresis. For example, a histidine tag or the like may be added to the immunoglobulin binding protein by adding a histidine tag or the like to the N-terminus or C-terminus of the immunoglobulin binding protein. The histidine tag fusion protein can be easily separated and purified, for example, by affinity chromatography using a metal affinity resin.
さらに、プロテインＡ由来のイムノグロブリン結合タンパク質をイムノグロブリンのアフィニティクロマトグラフィ用のリガンドとして利用する際には、従来より２個以上、望ましくは４個程度のイムノグロブリン結合ドメインを連結した多量体タンパク質が製造され、使用されている。従って、本発明により得られる化学的に安定なイムノグロブリン結合タンパク質についても、イムノグロブリン結合ドメインを２個以上、望ましくは４個程度を連結した多量体たんぱく質として製造され、利用されることが好ましい。この様な多量体タンパク質をコードするｃＤＮＡは、単量体をコードするｃＤＮＡを意図する数だけ連結することにより、容易に作成することができる。こうして作成したｃＤＮＡを適切な発現プラスミド上に挿入して利用することで、イムノグロブリン結合ドメインの単位が２個またはそれ以上連結された多量体タンパク質を容易に製造することが可能である。目的のｃＤＮＡを連結するには、あらかじめ該ｃＤＮＡの両末端に制限酵素の認識配列を設計しておくと良い。ただし、この様な方法を採用する際には、目的タンパク質単量体の連結部分のアミノ酸配列が、制限酵素の認識配列にコードされるアミノ酸配列に置換又は／及び挿入されることに注意する必要がある。 Furthermore, when protein A-derived immunoglobulin binding protein is used as a ligand for immunoglobulin affinity chromatography, a multimeric protein in which 2 or more, preferably about 4 immunoglobulin binding domains are linked is produced. Is being used. Therefore, the chemically stable immunoglobulin binding protein obtained by the present invention is also preferably produced and used as a multimeric protein in which two or more, preferably about four, immunoglobulin binding domains are linked. A cDNA encoding such a multimeric protein can be easily prepared by linking a desired number of cDNA encoding monomers. By inserting the cDNA thus prepared into an appropriate expression plasmid and using it, it is possible to easily produce a multimeric protein in which two or more immunoglobulin binding domain units are linked. In order to link the target cDNA, it is preferable to design a restriction enzyme recognition sequence at both ends of the cDNA in advance. However, when adopting such a method, it should be noted that the amino acid sequence of the linking portion of the target protein monomer is substituted or / and inserted into the amino acid sequence encoded by the restriction enzyme recognition sequence. There is.
「遺伝子発現系」とは、本発明の変異タンパク質をコードするｃＤＮＡが挿入される発現ベクター及び／又は該ｃＤＮＡが挿入された発現ベクターを導入した宿主細胞をいう。本発明の変異タンパク質をコードするｃＤＮＡが挿入される発現ベクターは、宿主細胞において複製可能である限りプラスミド、ファージ、ウイルス等いかなるベクターも用いることができる。好ましくは、商業的に入手可能なものを使用することができる。そのような発現ベクターとしては、例えば、ｐＱＥ系ベクター（ＱＩＡＧＥＮ ＧｍｂＨ社製）、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ２Ｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、ｐＥＴ系ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）等が挙げられる。中でもｐＥＴ系ベクターが好ましい。 The “gene expression system” refers to an expression vector into which a cDNA encoding the mutant protein of the present invention is inserted and / or a host cell into which an expression vector into which the cDNA has been introduced is introduced. As the expression vector into which the cDNA encoding the mutant protein of the present invention is inserted, any vector such as a plasmid, phage or virus can be used as long as it can replicate in the host cell. Preferably, commercially available products can be used. Examples of such expression vectors include pQE vectors (QIAGEN GmbH), ptrc99a, pKK223-3, pDR540, pRIT2T (Amersham Biosciences), pET vectors (Novagen), and the like. Of these, pET vectors are preferred.
発現ベクターと宿主細胞は適切な組み合わせを選んで使用するのが望ましい。発現ベクターと宿主細胞の適切な組み合わせとしては、例えば大腸菌を宿主とする場合には、ｐＤＲ５４０ベクターとＪＭ１０９大腸菌株の組み合わせ、又はｐＥＴ系ベクターとＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌株の組み合わせ等が好ましく挙げられる。 It is desirable to use an appropriate combination of expression vector and host cell. As an appropriate combination of an expression vector and a host cell, for example, when Escherichia coli is used as a host, a combination of a pDR540 vector and a JM109 E. coli strain, or a combination of a pET system vector and a BL21 (DE3) E. coli strain is preferable.
培養に使用される培地は、宿主細胞に応じて、適切な培地が選択される。例えば宿主細胞が大腸菌等の細菌の場合、培地は液体培地が適当であり、例えばＬＢ培地（Ｌｕｒｉｓ−Ｂｅｒｔａｎｉ ｍｅｄｉｕｍ）、２×ＴＹ培地（１Ｌ中に１６ｇのトリプトン、１０ｇの酵母エキス、５ｇのＮａＣｌを含む）等が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。また、タンパク質の発現誘導剤として、例えばイソプロピル−１−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（以下、ＩＰＴＧと略記する。）等を添加してもよい。培養は通常約１５〜４０℃で約３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌を加えてもよい。 As a medium used for the culture, an appropriate medium is selected depending on the host cell. For example, when the host cell is a bacterium such as Escherichia coli, a liquid medium is suitable, for example, LB medium (Luris-Bertani medium), 2 × TY medium (16 g tryptone in 1 L, 10 g yeast extract, 5 g NaCl. And the like). The pH of the medium is preferably about 5-8. Further, as a protein expression inducer, for example, isopropyl-1-β-D-galactopyranoside (hereinafter abbreviated as IPTG) may be added. The culture is usually performed at about 15 to 40 ° C. for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration or agitation may be added.
目的タンパク質を発現した細胞を遠心分離等により集め、リン酸緩衝生理食塩水に懸濁して超音波処理等にて破砕した後、再び遠心分離することで、目的のイムノグロブリン結合タンパク質を可溶性画分に回収することができる。可溶性画分からイムノグロブリン結合タンパク質を精製するには、イムノグロブリンをアフィニティリガンドとしたアフィニティクロマトグラフィが利用できる。また目的によっては、発現させるタンパク質のＮ末端部か、又はＣ末端部に２〜６個のヒスチジンから成るタグ（例えば、特開昭６３−２５１０９５号公報、或いは特開平３−１０１６９３号公報参照。）を付加した形で発現させ、金属キレートアフィニティクロマトグラフィを利用して精製することもできる。 Cells that express the target protein are collected by centrifugation, etc., suspended in phosphate buffered saline, disrupted by sonication, etc., and then centrifuged again to separate the target immunoglobulin-binding protein into a soluble fraction. Can be recovered. In order to purify the immunoglobulin binding protein from the soluble fraction, affinity chromatography using immunoglobulin as an affinity ligand can be used. Depending on the purpose, a tag comprising 2 to 6 histidines at the N-terminal part or C-terminal part of the protein to be expressed (see, for example, JP-A 63-251095 or JP-A-3-101893). ) Can be expressed and purified using metal chelate affinity chromatography.
本発明により得られるイムノグロブリン結合タンパク質をアフィニティリガンドとしてイムノグロブリンのアフィニティクロマトグラフィに用いる際には、公知の好適なマトリックスに固定して使用することができる。典型的にはアガロース、ポリアクリルアミド、ポリビニルスチレン、デキストラン又は他のポリマー等、当該技術分野で公知の任意の固体支持体を用いることができる。 When the immunoglobulin-binding protein obtained by the present invention is used as an affinity ligand for immunoglobulin affinity chromatography, it can be used by immobilizing it on a known suitable matrix. Any solid support known in the art can be used, typically agarose, polyacrylamide, polyvinyl styrene, dextran or other polymers.
通常、リガンドタンパク質は、シアノゲンブロミド、エピクロロヒドリン、ビソキシラン、ジビニルスルホン、カルボニルジイミダゾール、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、トシル／トレシルクロリド、エピクロロヒドリン、カルボジイミド、グルタールアルデヒド、ヒドラジン、オキシランのようなカップリング剤、そしてまたカルボキシル又はチオール活性化マトリックス等によって、マトリックスに固定される。このようなカップリング剤及びカップリングの化学は、当該技術分野において周知であり、文献に広く記載されている（Ｊａｎｓｓｏｎ，
Ｊ．Ｃ．及びＲｙｄｅｎ， Ｌ．，「Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、第２版、３７５−４４２頁、ＩＳＢＮ０−４７１−１８６２６−０）。簡単な固定化を可能にするマトリックスの種々の誘導体としては、ＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
４Ｂ、ＡＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ及びＣＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦＦ並びにエポキシ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
６８（アマシャムバイオサイエンス株式会社）が挙げられる。
Usually, ligand proteins are cyanogen bromide, epichlorohydrin, bisoxolan, divinylsulfone, carbonyldiimidazole, N-hydroxysuccinimide, tosyl / tresyl chloride, epichlorohydrin, carbodiimide, glutaraldehyde, hydrazine, oxirane. Such a coupling agent, and also immobilized on the matrix, such as by a carboxyl or thiol activated matrix. Such coupling agents and coupling chemistries are well known in the art and are widely described in the literature (Jansson,
J. et al. C. And Ryden, L .; "Protein purification", 2nd edition, pages 375-442, ISBN 0-471-18626-0). Various derivatives of the matrix that allow easy immobilization include CNBr activated Sepharose.
4B, AH-Sepharose 4B and CH-Sepharose 4B, N-hydroxysuccinimide activated Sepharose 4FF and epoxy activated Sepharose
68 (Amersham Bioscience Co., Ltd.).
本発明により得られるイムノグロブリン結合タンパク質をアフィニティリガンドとして上記担体に結合させたアフィニティクロマトグラフィ用担体を用いることにより、イムノグロブリン、例えばＩｇＧを容易に分離できる。また、該アフィニティクロマトグラフィ用担体は、従来のリガンドよりもアルカリ性条件下において安定であるので、例えば０．１〜０．５Ｎ水酸化ナトリウム溶液での洗浄サイクルを従来よりも多く繰返してもなお有効にイムノグロブリンの分離に用いることができる。 By using an affinity chromatography carrier in which the immunoglobulin-binding protein obtained by the present invention is bound to the above carrier as an affinity ligand, immunoglobulins such as IgG can be easily separated. In addition, since the affinity chromatography carrier is more stable under alkaline conditions than conventional ligands, it is still effective even if the washing cycle with, for example, 0.1 to 0.5N sodium hydroxide solution is repeated more than before. It can be used for the separation of immunoglobulins.
イムノグロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＡ及び／又はＩｇＭ）の分離方法は、例えば上記アフィニティクロマトグアフィ用担体を充填したアフィニティカラムにＩｇＧ、ＩｇＡ及び／又はＩｇＭを含有する試料溶液を注入する。次いで、緩衝液（ｐＨ約７〜８）を用いて、アフィニティリガンドに結合されないイムノグロブリンや他の物質を完全に洗浄する。緩衝液としては、例えばリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝、クエン酸緩衝液等が挙げられる。アフィニティリガンドに結合したイムノグロブリンは、例えば塩濃度約０．１〜０．５Ｍを含む上記緩衝液又はｐＨ約１〜５程度の緩衝液（例えばクエン酸−塩酸緩衝液等）で溶出する。イムノグロブリンの検出は、例えばＵＶ２８０ｎｍの吸光度を測定することにより行なうことができる。 As a method for separating immunoglobulin (IgG, IgA and / or IgM), for example, a sample solution containing IgG, IgA and / or IgM is injected into an affinity column packed with the above-described affinity chromatography carrier. Next, using a buffer solution (pH of about 7 to 8), immunoglobulins and other substances not bound to the affinity ligand are thoroughly washed. Examples of the buffer include a phosphate buffer, Tris-HCl buffer, and citrate buffer. The immunoglobulin bound to the affinity ligand is eluted with, for example, the above buffer containing a salt concentration of about 0.1 to 0.5 M or a buffer having a pH of about 1 to 5 (for example, a citrate-hydrochloric acid buffer). Immunoglobulin can be detected, for example, by measuring absorbance at UV 280 nm.
以下に本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
Ｚ−ドメインを基にして改変されたイムノグロブリン結合タンパク質の構築とその化学的安定性の評価
（１）発現用プラスミドｐＥＴ−ＳＨの構築
目的とするイムノグロブリン結合タンパク質をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドクローンを構築する工程を図１に示した。まず、制限酵素（ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ）を用いてｐＥＴ−３ａプラスミド（ノバジェン、メルク株式会社）を切断し、アガロースゲル電気泳動後、Ｔ７−プロモーター領域を含むベクター部分をＷｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ株式会社）を用いて精製した。表１の２対４本の合成オリゴヌクレオチドのうち、ＳＨ６−１Ｒ及びＳＨ６−２Ｕの５’末端をＴ４ ポリヌクレオチドキナーゼ（タカラバイオ株式会社）を用いてリン酸化した後、ＳＨ６−１ＲをＳＨ６−１Ｕと、ＳＨ６−２ＵをＳＨ６−２Ｒとそれぞれ混合してアニーリングさせた。アニーリングにより得られた２本のＤＮＡ断片を、上述の制限酵素で切断したｐＥＴ−３ａベクターと混合し、ＬｉｇａＦａｓｔ Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ株式会社）を用いてライゲーション反応を行った。次いでライゲーション反応物にてＤＨ５αコンピテントセル（インビトロゲン株式会社）と混合後３０分間氷上に置き、９０秒間４２℃に置いた後直ちに氷上に５分間置くことで該宿主大腸菌を形質転換し、次いで０．１ｍｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ（以下、ＬＢ＋Ａｍｐと略記する）培地プレート上で一晩増殖させた。出現したコロニーをＬＢ＋Ａｍｐ液体培地に接種し、増殖させ、目的のプラスミドで形質転換された大腸菌クローンを選択した。この大腸菌株からＷｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ ＳＶ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ株式会社）を用いてプラスミドを精製し、シグナルペプチドをコードする塩基配列（配列表：配列番号７の第５番目〜１９番目；図１中、Ｓｉｇｎａｌで示される。）とヒスチジンタグをコードする塩基配列（配列表：配列番号７の第２６番目〜４３番目；（図１中、６×Ｈｉｓで示される。）の間に制限酵素（ＮｈｅＩ；配列表：配列番号７の第２０番目〜２５番目）を挟む塩基配列を有する発現用プラスミドｐＥＴ−ＳＨを得た。
Construction of immunoglobulin-binding protein modified based on Z-domain and evaluation of its chemical stability (1) Construction of expression plasmid pET-SH Plasmid clone containing cDNA encoding target immunoglobulin-binding protein The process of constructing is shown in FIG. First, pET-3a plasmid (Novagen, Merck) was cleaved using restriction enzymes (NdeI and BamHI), and after agarose gel electrophoresis, the vector portion containing the T7-promoter region was subjected to Wizard SV Gel and PCR Clean-Up. Purification was performed using System (Promega Corporation). Among the 2 to 4 synthetic oligonucleotides in Table 1, the 5 ′ ends of SH6-1R and SH6-2U were phosphorylated using T4 polynucleotide kinase (Takara Bio Inc.), and then SH6-1R was converted to SH6- 1U and SH6-2U were mixed with SH6-2R and annealed. The two DNA fragments obtained by annealing were mixed with the pET-3a vector cleaved with the above-mentioned restriction enzyme, and ligation reaction was performed using LigaFast Rapid DNA Ligation System (Promega Corporation). Next, after mixing with DH5α competent cells (Invitrogen Corp.) in the ligation reaction product, the mixture was placed on ice for 30 minutes, placed at 42 ° C. for 90 seconds, and then immediately placed on ice for 5 minutes to transform the host E. coli. The cells were grown overnight on LB (hereinafter abbreviated as LB + Amp) medium plates containing 0.1 mg / mL ampicillin. The emerged colonies were inoculated into LB + Amp liquid medium, grown, and E. coli clones transformed with the plasmid of interest were selected. From this Escherichia coli strain, a plasmid was purified using Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega Corporation), and the nucleotide sequence encoding the signal peptide (sequence table: 5th to 19th in SEQ ID NO: 7; A restriction enzyme (NheI; indicated by 6 × His in FIG. 1) (indicated by 6 × His in FIG. 1). An expression plasmid pET-SH having a base sequence sandwiching the sequence listing: 20th to 25th in SEQ ID NO: 7 was obtained.
上記発現ベクターの構築に用いた合成オリゴヌクレオチドの配列を表１に示す。
この２対の合成オリゴヌクレオチドの挿入によって得られる核酸配列は以下の通りである。
TATGGCACAGCACGACGAAGCTAGCCATCACCATCACCACCATTAATAATAAGCGGCCGCTGCAG（配列表の配列番号８）
The nucleic acid sequence obtained by inserting these two pairs of synthetic oligonucleotides is as follows.
TATGGCACAGCACGACGAAGCTAGCCATCACCATCACCACCATTAATAATAAGCGGCCGCTGCAG (SEQ ID NO: 8 in the Sequence Listing)
（２）発現用プラスミドｐＥＴ−ＩＢＤの構築
発現用プラスミドｐＥＴ−ＳＨの制限酵素サイトにイムノグロブリン結合ドメイン（以下、ＩＢＤということもある。）をコードする塩基配列を挿入した発現用プラスミドｐＥＴ−ＩＢＤを構築した。
まず、本発明の発現用プラスミドｐＥＴ−ＩＢＤに先立ち、前記発現用プラスミドｐＥＴ−ＳＨの制限酵素サイトにＺドメインの等機能改変体（Ｚドメインの１位をＡｌａに置換したＺドメイン；Ｚ−Ｖ１Ａ）及びＣドメインの等機能改変体（Ｃドメインの２９位をＡｌａに置換したＣドメイン；Ｃ−Ｇ２９Ａ）をコードするｃＤＮＡを挿入した、発現用プラスミドｐＥＴ−Ｚ−Ｖ１Ａ及びｐＥＴ−Ｃ−Ｇ２９Ａを構築した。
(2) Construction of expression plasmid pET-IBD Expression plasmid pET-IBD in which a nucleotide sequence encoding an immunoglobulin binding domain (hereinafter also referred to as IBD) is inserted into the restriction enzyme site of expression plasmid pET-SH. Built.
First, prior to the expression plasmid pET-IBD of the present invention, an isofunctional variant of the Z domain (a Z domain in which position 1 of the Z domain is replaced with Ala; Z-V1A) at the restriction enzyme site of the expression plasmid pET-SH. And pET-Z-V1A and pET-C-G29A for expression, into which cDNA encoding the C domain isofunctional variant (C domain in which position 29 of the C domain is substituted with Ala; C-G29A) was inserted. It was constructed.
ｐＥＴ−Ｚ−Ｖ１Ａ及びｐＥＴ−Ｃ−Ｇ２９Ａを構築するために用いた合成オリゴヌクレオチドを表２に示した。表２において５対の合成オリゴヌクレオチド、すなわちＣＺ−１ＵとＣＺ−１Ｒ、Ｚ−２ＵとＺ−２Ｒ、ＣＺ−３ＵとＣＺ−３Ｒ、Ｚ−４ＵとＺ−４Ｒ及びＣＺ−５ＵとＣＺ−５Ｕとをアニーリングし、ｐＥＴ−Ｚ−Ｖ１Ａの構築に用いた。また同様にＣＺ−１ＵとＣＺ−１Ｒ、Ｃ−２ＵとＣ−２Ｒ、ＣＺ−３ＵとＣＺ−３Ｒ、Ｃ−４ＵとＣ−４Ｒ及びＣＺ−５ＵとＣＺ−５Ｕとをアニーリングし、ｐＥＴ−Ｃ−Ｇ２９Ａの構築に用いた。次いで、ＮｈｅＩ酵素で切断した上記（１）で作製した発現プラスミドｐＥＴ−ＳＨを、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ， Ｃａｌｆ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ（プロメガ株式会社）を用いて脱リン酸化し、上記５対のアニーリングした合成オリゴヌクレオチドを混合し、ＬｉｇａＦａｓｔ Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いてライゲーション反応を行った。なお、ライゲーションに先立ち、ＣＺ−１Ｕ及びＣＺ−５Ｒ以外の合成オリゴヌクレオチドは、Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（タカラバイオ株式会社）を用いて５’末端をリン酸化した。また、５対の合成オリゴヌクレオチドから構築されるイムノグロブリン結合ドメインの核酸配列は、Ｎ末端側がＳｐｅＩの認識部位、Ｃ末端側がＮｈｅＩの認識部位となるよう設計した。ＮｈｅＩの切断により生じる開列形状は、ＳｐｅＩにより生じる開列形状と全く同一であるので、イムノグロブリン結合ドメインをコードするＤＮＡ断片は、プラスミドｐＥＴ−ＳＨのＮｈｅＩ認識部位に、ライゲーション反応によって挿入することができる
ライゲーション反応物にてＤＨ５αコンピテントセルを形質転換し、目的のプラスミドを有するクローンを選択した。選択したプラスミドは、Ｔ７プロモーターの支配下に、シグナルペプチド−Ｚ−Ｖ１Ａ（又はＣ−Ｇ２９Ａ）−ヒスチジンタグの順番で連結されたＺ−Ｖ１Ａ融合タンパク質又はＣ−Ｇ２９Ａ融合タンパク質をコードする核酸配列を有する発現用プラスミドｐＥＴ−Ｚ−Ｖ１Ａ及びｐＥＴ−Ｃ−Ｇ２９Ａであった。
Ｚ−Ｖ１Ａ融合タンパク質（配列表：配列番号２４）及びＣ−Ｇ２９Ａ融合タンパク質（配列表：配列番号２６）のアミノ酸配列とそれをコードする核酸配列（配列表：配列番号２３及び２５）をそれぞれ以下に示す。
Ｚ−Ｖ１Ａ融合タンパク質：イムノグロブリン結合ドメイン部分は配列番号１に相当
Z-V1A fusion protein: the immunoglobulin binding domain portion corresponds to SEQ ID NO: 1
Ｃ−Ｇ２９Ａ融合タンパク質：イムノグロブリン結合ドメイン部分は配列番号２に相当
（３）本発明イムノグロブリン結合タンパク質をコードする核酸配列を挿入した発現用プラスミドｐＥＴ−ＩＢＤの作製
上述の発現プラスミドｐＥＴ−Ｚ−Ｖ１Ａ及びｐＥＴ−Ｃ−Ｇ２９Ａの作製方法と同様の方法を用い、表２の５対１０本の核酸配列を改変することで、部位特異的なアミノ酸置換を導入した本発明のイムノグロブリン結合ドメインを得た。各改変体を製造するために用いた５対の合成オリゴヌクレオチドの組み合わせを表７及び表８に、各合成オリゴヌクレオチドの配列を表５及び表６に示した。
なお、５対の合成オリゴヌクレオチドから構築されるイムノグロブリン結合ドメインの核酸配列は、Ｎ末端側がＳｐｅＩの認識部位、Ｃ末端側がＮｈｅＩの認識部位となるよう設計した。ＮｈｅＩの切断により生じる開列形状は、ＳｐｅＩにより生じる開列形状と全く同一であるので、イムノグロブリン結合ドメインをコードするＤＮＡ断片は、プラスミドｐＥＴ−ＳＨのＮｈｅＩ認識部位に、ライゲーション反応によって挿入することができる。正しい方向に挿入されたプラスミドを選択すれば、挿入後イムノグロブリン結合ドメイン部分のＮ末端側はＳｐｅＩでもＮｈｅＩでも切断できなくなるが、Ｃ末端側はＮｈｅＩで切断できるので、後に同様の操作を繰り返すことでイムノグロブリン結合ドメインをコードするＤＮＡ断片をＣ末端側にさらに挿入して、複数のイムノグロブリン結合ドメインをコードするＤＮＡを複数連結した。例えば４個のイムノグロブリン結合ドメインをコードするＤＮＡを連結したプラスミドは、例えばシグナルペプチド（図１中、Ｓで示される。）−イムノグロブリン結合ドメイン−イムノグロブリン結合ドメイン−イムノグロブリン結合ドメイン−イムノグロブリン結合ドメイン−ヒスチジンタグ（図１中、Ｈｉｓで示される。）を有するタンパク質を製造できる。
なお、シグナルペプチド−イムノグロブリン結合ドメイン間、イムノグロブリン結合ドメイン−イムノグロブリン結合ドメイン間及びイムノグロブリン結合ドメイン−ヒスチジンタグ間の連結部位には、それぞれＡｌａ−Ｓｅｒの２アミノ酸の配列が挿入される。
The nucleic acid sequence of the immunoglobulin binding domain constructed from 5 pairs of synthetic oligonucleotides was designed so that the N-terminal side was a SpeI recognition site and the C-terminal side was a NheI recognition site. Since the open shape generated by cleavage of NheI is exactly the same as the open shape generated by SpeI, the DNA fragment encoding the immunoglobulin binding domain can be inserted into the NheI recognition site of plasmid pET-SH by a ligation reaction. . If a plasmid inserted in the correct direction is selected, the N-terminal side of the immunoglobulin-binding domain after insertion cannot be cleaved by SpeI or NheI, but the C-terminal side can be cleaved by NheI, so the same operation is repeated later. Then, a DNA fragment encoding an immunoglobulin binding domain was further inserted on the C-terminal side, and a plurality of DNAs encoding a plurality of immunoglobulin binding domains were linked. For example, a plasmid in which DNAs encoding four immunoglobulin binding domains are linked is, for example, a signal peptide (indicated by S in FIG. 1) -immunoglobulin binding domain-immunoglobulin binding domain-immunoglobulin binding domain-immunoglobulin. A protein having a binding domain-histidine tag (indicated as His in FIG. 1) can be produced.
The two amino acid sequences of Ala-Ser are inserted into the linking sites between the signal peptide-immunoglobulin binding domain, between the immunoglobulin binding domain-immunoglobulin binding domain, and between the immunoglobulin binding domain-histidine tag.
タンパク質の発現及び目的タンパク質の精製：
構築したプラスミドにて、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピーテントセル（ノバジェン、メルク株式会社）を形質転換し、次いでアンピシリン０．１ｍｇ／ｍｌ含有ＬＢ培地（Ｌｕｒｉｓ−Ｂｅｒｔａｎｉ ｍｅｄｉｕｍ；以下、ＬＢ＋Ａｍｐ培地と略記する。）プレート上で一晩増殖させた。出現したコロニーをＬＢ＋Ａｍｐ液体培地に接種して増殖させ、目的のタンパク質を発現する大腸菌株を得た。この大腸菌株を０．１ｍｇ／ｍＬのアンピシリンを含む２×ＴＹ培地に接種し、３７℃にて濁度が０．４〜０．５前後に達するまで振とう培養した後、最終濃度が１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを加え、さらに２５℃にて６時間培養し、目的とする融合タンパク質を発現させた。
Protein expression and target protein purification:
BL21 (DE3) competent cells (Novagen, Merck Ltd.) are transformed with the constructed plasmid, and then 0.1 mg / ml ampicillin in LB medium (Luris-Bertani medium; hereinafter abbreviated as LB + Amp medium). Grow overnight on plate. The emerged colonies were inoculated into an LB + Amp liquid medium and grown to obtain an E. coli strain expressing the target protein. After inoculating this Escherichia coli strain into 2 × TY medium containing 0.1 mg / mL ampicillin and shaking culture at 37 ° C. until the turbidity reaches around 0.4 to 0.5, the final concentration is 1 mM. Then, IPTG was added and further cultured at 25 ° C. for 6 hours to express the desired fusion protein.
培養後の大腸菌を遠心分離によって集め、リン酸緩衝生理食塩水（以下ＰＢＳと略記する）で洗浄した後、２０ｍＭ イミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．４）に懸濁した。この懸濁液を超音波処理して大腸菌を破砕し、遠心分離によって目的の融合タンパク質を上清に回収した。次いでこの溶液をＵＬＴＲＡＦＲＥＥ ０．４５μｍ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ（日本ミリポア株式会社）を用いて濾過した後、Ｈｉｓ Ｔｒａｐ Ｎｉ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰカラム（アマシャムバイオサイエンス株式会社）にアプライし、カラムを４０ｍＭ イミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．４）で洗浄した後、０．５Ｍ イミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．４）を用いて目的タンパク質を流出させて回収した。以上の操作により精製された目的タンパク質の純度は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下ＳＤＳ−ＰＡＧＥと略記する）によって確認し、タンパク質濃度はＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｃｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）を用いて決定した。 The cultured Escherichia coli is collected by centrifugation, washed with phosphate buffered saline (hereinafter abbreviated as PBS), and then suspended in 20 mM phosphate buffer (pH 7.4) containing 20 mM imidazole and 0.5 M NaCl. It became cloudy. This suspension was sonicated to disrupt E. coli, and the desired fusion protein was recovered in the supernatant by centrifugation. Next, this solution was filtered using ULTRAFREE 0.45 μm Filter Unit (Nippon Millipore Corporation), and then applied to a His Trap Ni-Sepharose HP column (Amersham Biosciences Corporation), and the column was applied with 40 mM imidazole, 0.5 M NaCl. After washing with a 20 mM phosphate buffer solution (pH 7.4) containing 20 mM phosphate buffer solution (pH 7.4) containing 0.5 M imidazole and 0.5 M NaCl, the target protein is washed out and recovered. did. The purity of the target protein purified by the above operations was confirmed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (hereinafter abbreviated as SDS-PAGE), and the protein concentration was determined using BCA Protein Assay (Pierce Bioctechnology, Inc.). Decided.
イムノグロブリン結合タンパク質のイムノグロブリン結合活性及びそのアルカリ性条件下における化学安定性の評価：
イムノグロブリン結合タンパク質のイムノグロブリン結合活性は、酵素結合免疫反応吸着測定法（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ法）を応用して測定した。まず、９６ウェルイムノプレート（ＮＡＬＧＥ ＮＵＮＣ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｋ．Ｋ．）の各ウェルに５μｇ／ｍｌのヒトイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）のＰＢＳ溶液０．１ｍｌを入れ、室温にて５〜２４時間放置し、ＩｇＧを吸着させた後、各ウェルを、４％ウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡと略記する）を含むＰＢＳ０．２ｍｌで各ウェルをブロッキングした。次いで、各ウェルを、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（以下Ｔ−ＰＢＳと略記）で洗浄し、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（以下反応緩衝液と略記する）を用いて、６．０〜２００ ｎｇ／ｍｌの濃度に希釈、
調製したイムノグロブリン結合タンパク質の溶液を０．０５ｍｌ加えて室温で１時間放置したのち、ウェルを再度Ｔ−ＰＢＳで洗浄した。次に、反応緩衝液にて８０００倍希釈したペルオキシダーゼ結合抗Ｈｉｓタグ抗体（ナカライテスク株式会社）溶液を０．０５ｍｌ加えて室温で１時間放置したのち、再びウェルをＴ−ＰＢＳで洗浄した。最後にペルオキシダーゼの基質として２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸［２，２’−Ａｚｉｎｏ ｂｉｓ（３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）；以下ＡＢＴＳと略記する。］を用い、ＩｇＧに結合したイムノグロブリン結合タンパク質を比色定量した。すなわち、各ウェルに０．３ｍｇ／ｍｌのＡＢＴＳ及び０．００６％過酸化水素を含む０．２Ｍ クエン酸緩衝液（ｐＨ ４．０）を０．１ｍｌ加えて室温で３０分発色させた後、１．５％シュウ酸水溶液を０．１ｍｌ加えて反応を停止し、４０５ｎｍと４９０ｎｍの吸光度差を測定した。
Evaluation of immunoglobulin binding activity of immunoglobulin binding proteins and their chemical stability under alkaline conditions:
The immunoglobulin binding activity of the immunoglobulin binding protein was measured by applying an enzyme-linked immunoreaction adsorption assay (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay method). First, 0.1 ml of 5 μg / ml human immunoglobulin G (IgG) in PBS was placed in each well of a 96-well immunoplate (NALGE NUNNC International KK) and allowed to stand at room temperature for 5 to 24 hours. Then, each well was blocked with 0.2 ml of PBS containing 4% bovine serum albumin (hereinafter abbreviated as BSA). Next, each well was washed with PBS containing 0.1% Tween 20 (hereinafter abbreviated as T-PBS), and 6.0% with PBS containing 0.1% BSA (hereinafter abbreviated as reaction buffer). Diluted to a concentration of ~ 200 ng / ml,
0.05 ml of the prepared immunoglobulin binding protein solution was added and allowed to stand at room temperature for 1 hour, and then the wells were washed again with T-PBS. Next, 0.05 ml of a peroxidase-conjugated anti-His tag antibody (Nacalai Tesque) solution diluted 8000 times with a reaction buffer was added and allowed to stand at room temperature for 1 hour, and then the wells were washed again with T-PBS. Finally, 2,2′-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid [2,2′-Azino bis (3-ethylbenzothizoline-6-sulfonic acid); hereinafter abbreviated as ABTS)] as a substrate for peroxidase. The immunoglobulin binding protein bound to IgG was colorimetrically determined, ie 0.2 M citrate buffer (pH 4.0) containing 0.3 mg / ml ABTS and 0.006% hydrogen peroxide in each well. ) Was added and allowed to color at room temperature for 30 minutes, and then 0.1 ml of a 1.5% oxalic acid aqueous solution was added to stop the reaction, and the difference in absorbance between 405 nm and 490 nm was measured.
また、あらかじめ０．１Ｎ ＮａＯＨ溶液中で１６時間室温にて保温したイムノグロブリン結合タンパク質を用いて、同様の測定を同一のプレート上で行った。イムノグロブリン結合タンパク質の濃度と測定した吸光度差との関係のグラフを図２に表す。この結果から、改変Ｚ−ドメイン及び改変Ｃ−ドメインは、等濃度で同程度のＩｇＧ結合活性を示すことが確認できた。また、アルカリ性条件下で処理されたイムノグロブリン結合タンパク質は、同一濃度を用いても、アルカリ処理前よりも測定値が低かった。この結果はアルカリ性条件下での処理によって、これらイムノグロブリン結合タンパク質のＩｇＧ結合活性が低下したことを示している。両ドメインについて、アルカリ処理前の濃度−吸光度曲線を基に、アルカリ性条件下未処理のＩｇＧ結合活性を１００％としたときの０．１Ｎ ＮａＯＨ溶液中で１６時間室温にて保温した後の残存活性を算出すると、Ｚ−Ｖ１Ａは３１．７±５．０％であったのに対して、Ｃ−Ｇ２９Ａは７９．３±１０．６％であった。 In addition, the same measurement was performed on the same plate using an immunoglobulin-binding protein that had been kept warm in a 0.1N NaOH solution for 16 hours at room temperature. A graph of the relationship between the concentration of immunoglobulin binding protein and the measured absorbance difference is shown in FIG. From this result, it was confirmed that the modified Z-domain and the modified C-domain showed comparable IgG binding activity at the same concentration. Moreover, the measured value of the immunoglobulin binding protein treated under alkaline conditions was lower than that before alkaline treatment even when the same concentration was used. This result shows that the IgG binding activity of these immunoglobulin binding proteins was reduced by treatment under alkaline conditions. For both domains, based on the concentration-absorbance curve before alkaline treatment, the residual activity after incubation at room temperature for 16 hours in 0.1N NaOH solution when the untreated IgG binding activity is defined as 100% under alkaline conditions , Z-V1A was 31.7 ± 5.0%, while C-G29A was 79.3 ± 10.6%.
上述の改変Ｚ−Ｖ１Ａを基にして、表７及び８に示す各改変体を製造し、各々のＩｇＧ結合活性及びアルカリ性条件下の処理後残存活性を測定した。構築した改変体のうち、目的タンパク質の発現が確認された改変体について、測定した活性を表９に表した。また、表９に示した改変体のうち、改変Ｚ−ドメインと同程度のＩｇＧ結合活性が認められたものについて、０．１Ｎ ＮａＯＨ溶液中で１６時間室温にて保温し、アルカリ性条件下での処理後残存活性を測定した。その結果を図３に示す。この結果は、８位と４２位、３３位と４４位、３７位と４０位、５位と３９位及び２７位と１６位、１７位、２２位、３１位の少なくとも１つの部位との間に非共有結合を形成させるアミノ酸置換ならびに７位及び２５位の親水性アミノ酸のより水和表面積の小さいアミノ酸への置換によって、Ｚドメイン又はその等機能変異体から成るイムノグロブリン結合タンパク質の化学的安定性が増すことを示している。なおＮ２３Ｋ改変体及びＮ２３Ｄ＋Ｅ２５Ｑ改変体もＺ−ドメインに比べて化学的安定性が増している結果を得たが、Ｎ２３Ｔ改変体より安定でなかったので、これら改変体の安定化は、２３位と２５位との間に非共有結合が形成されたことによるものではなく、２３位のＡｓｎが、アルカリ感受性が低いアミノ酸に置換されたことによる効果であると考えられた。またＥ２５Ａ改変体やＮ２３Ｔ＋Ｅ２５Ｔ改変体がＮ２３Ｔ改変体に比べてより安定であったことから、２５位のアミノ酸をより水和表面積の小さいアミノ酸に置換することによって、Ｃ−ドメインのＧ２９Ａ改変体よりさらに安定な改変体を製造できることを示している。 Based on the modified Z-V1A described above, each modified product shown in Tables 7 and 8 was produced, and each IgG binding activity and residual activity after treatment under alkaline conditions were measured. Table 9 shows the activity measured for the variants in which the expression of the target protein was confirmed among the constructed variants. In addition, among the variants shown in Table 9, those in which IgG binding activity similar to that of the modified Z-domain was observed were kept warm in a 0.1N NaOH solution for 16 hours at room temperature. Residual activity was measured after treatment. The result is shown in FIG. This result is between 8th and 42nd, 33th and 44th, 37th and 40th, 5th and 39th, 27th and 16th, 17th, 22nd and 31st positions. Chemical stability of immunoglobulin-binding proteins consisting of the Z domain or its functional variants by amino acid substitutions that form non-covalent bonds and substitution of hydrophilic amino acids at positions 7 and 25 with amino acids having a lower hydration surface area It shows that the nature increases. The N23K variant and the N23D + E25Q variant also obtained a result in which the chemical stability was increased compared to the Z-domain. However, since the N23T variant was not more stable than the N23T variant, It was thought that this was not due to the formation of a non-covalent bond with the 25th position, but the effect due to the substitution of Asn at the 23rd position with an amino acid having low alkali sensitivity. Moreover, since the E25A variant and the N23T + E25T variant were more stable than the N23T variant, the amino acid at position 25 was replaced with an amino acid having a smaller hydration surface area, thereby further improving the C-domain G29A variant. It shows that stable variants can be produced.
本発明によるイムノグロブリン結合タンパク質は、アルカリ性条件下での安定性が高く、イムノグロブリンのアフィニティクロマトグラフィ用のリガンドタンパク質として有用である。 The immunoglobulin-binding protein according to the present invention has high stability under alkaline conditions and is useful as a ligand protein for immunoglobulin affinity chromatography.
Claims (15)
イ）３３位及び／又は４４位のアミノ酸を、３３位及び４４位のアミノ酸間に疎水結合が形成されるアミノ酸に置換、
ロ）３７位及び／又は４０位のアミノ酸を、３７位及び４０位のアミノ酸間にイオン結合が形成されるアミノ酸に置換、
ハ）５位及び／又は３９位のアミノ酸を、５位及び３９位のアミノ酸間に疎水結合が形成されるアミノ酸に置換、
ニ）２７位のアミノ酸を、１６位、１７位、２２位及び３１位のアミノ酸から選択される少なくとも１つのアミノ酸との間に疎水結合が形成されるアミノ酸に置換、
のうちいずれか１箇所の置換又は２箇所以上の置換を行うことを特徴とする、該イムノグロブリン結合ドメインを含むイムノグロブリン結合タンパク質のアルカリ性条件下における化学的安定性を高める方法。 In a C domain of Staphylococcus protein A or an isofunctional variant of the C domain represented by SEQ ID NO: 2, or an isofunctional variant of the Z domain or Z domain represented by SEQ ID NO: 1,
A) Substitution of amino acids at positions 33 and / or 44 with amino acids in which a hydrophobic bond is formed between the amino acids at positions 33 and 44,
B) The amino acid at position 37 and / or 40 is replaced with an amino acid in which an ionic bond is formed between the amino acids at positions 37 and 40,
C) substitution of amino acids at positions 5 and / or 39 with amino acids in which a hydrophobic bond is formed between the amino acids at positions 5 and 39;
D) replacing the amino acid at position 27 with an amino acid that forms a hydrophobic bond with at least one amino acid selected from amino acids at positions 16, 17, 22, and 31;
A method for enhancing chemical stability under alkaline conditions of an immunoglobulin-binding protein comprising the immunoglobulin-binding domain, comprising performing substitution at any one of the above or at least two substitutions.
イ）３３位のアミノ酸を、Ｖａｌ、Ｌｅｕ又はＩｌｅに置換、
ロ）３７位のアミノ酸を、Ｌｙｓに、４０位のアミノ酸を、Ｇｌｕにそれぞれ置換、
ハ）３９位のアミノ酸を、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、又はＰｈｅに置換、
ニ）２７位のアミノ酸を、Ｌｅｕ又はＩｌｅに置換、
のうちいずれか１箇所の置換又は２箇所以上の置換を行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。 In a C domain of Staphylococcus protein A or an isofunctional variant of the C domain represented by SEQ ID NO: 2, or an isofunctional variant of the Z domain or Z domain represented by SEQ ID NO: 1,
A) The amino acid at position 33 is replaced with Val, Leu or Ile.
B) The amino acid at position 37 is replaced with Lys, the amino acid at position 40 is replaced with Glu,
C) replacing the amino acid at position 39 with Val, Leu, Ile, or Phe;
D) replacing the amino acid at position 27 with Leu or Ile;
The method according to claim 1, wherein one of the substitutions or two or more substitutions is performed.
７位及び／又は２５位のアミノ酸を、より水和表面積の小さいアミノ酸に置換することを特徴とする、該イムノグロブリン結合ドメインを含むイムノグロブリン結合タンパク質のアルカリ性条件下における化学的安定性を高める方法。 In a C domain of Staphylococcus protein A or an isofunctional variant of the C domain represented by SEQ ID NO: 2, or an isofunctional variant of the Z domain or Z domain represented by SEQ ID NO: 1,
A method for increasing chemical stability under alkaline conditions of an immunoglobulin-binding protein comprising the immunoglobulin-binding domain, wherein the amino acid at position 7 and / or 25 is substituted with an amino acid having a smaller hydration surface area .
イ）７位のアミノ酸を、Ａｌａ、Ｓｅｒ又はＴｈｒに置換、及び／又は
ロ）２５位のアミノ酸を、Ａｌａ、Ｓｅｒ又はＴｈｒに置換、
することを特徴とする請求項３に記載の方法。 In a C domain of Staphylococcus protein A or an isofunctional variant of the C domain represented by SEQ ID NO: 2, or an isofunctional variant of the Z domain or Z domain represented by SEQ ID NO: 1,
A) the amino acid at position 7 is replaced with Ala, Ser or Thr; and / or b) the amino acid at position 25 is replaced with Ala, Ser or Thr;
4. The method of claim 3, wherein:
A method for separating IgG, IgA and / or IgM, comprising subjecting IgG, IgA and / or IgM to affinity chromatography equipped with the affinity column according to claim 14.
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