JP2014163728A - Immunoassay method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、アルカリホスファターゼ標識コンジュゲートを用いた免疫測定方法に関する。 The present invention relates to an immunoassay method using an alkaline phosphatase-labeled conjugate.
免疫測定（イムノアッセイ）は、抗原抗体反応を利用して測定対象物質を検出もしくは定量する方法である。典型的なＥＩＡの測定原理の例は、次のような手順からなる。ガラスビーズや磁性ビーズ、またはプレート表面などの固相に固定化された一次抗体に測定対象物質を含む試料を添加し、測定対象物質を一次抗体に結合させる。固相をバッファー等で洗浄して測定対象物質以外の試料成分を除去し、ここに二次抗体を含む溶液を加えて、二次抗体を固相上に捕捉された測定対象物質に結合させる。この二次抗体は、ラジオアイソトープ、酵素、発光物質、金コロイド等で標識されている。さらに固相を洗浄することで、未結合の二次抗体を除去する。二次抗体がラジオアイソトープや発光物質の場合であれば、固相から発される放射線量や発光量を測定することにより、測定対象物質を検出または定量することができる。二次抗体が酵素により標識されたものである場合、各種酵素の働きにより発色もしくは発光する基質を添加し、発色もしくは発光の度合いを測定することにより測定対象物質を検出または定量することができる。 Immunoassay (immunoassay) is a method for detecting or quantifying a substance to be measured using an antigen-antibody reaction. An example of a typical EIA measurement principle consists of the following procedure. A sample containing a substance to be measured is added to a primary antibody immobilized on a solid phase such as glass beads, magnetic beads, or a plate surface, and the substance to be measured is bound to the primary antibody. The solid phase is washed with a buffer or the like to remove sample components other than the measurement target substance, and a solution containing a secondary antibody is added thereto to bind the secondary antibody to the measurement target substance captured on the solid phase. This secondary antibody is labeled with a radioisotope, an enzyme, a luminescent substance, a gold colloid or the like. Further, the unbound secondary antibody is removed by washing the solid phase. If the secondary antibody is a radioisotope or a luminescent substance, the substance to be measured can be detected or quantified by measuring the amount of radiation or luminescence emitted from the solid phase. When the secondary antibody is labeled with an enzyme, a substance to be measured can be detected or quantified by adding a substrate that develops or emits light by the action of various enzymes and measuring the degree of color or emission.
酵素標識抗体を用いる免疫測定を特に酵素免疫測定（ＥＩＡ）と呼び、近年の免疫測定の主流をなす方法である。高感度基質の開発により、ラジオアイソトープ標識抗体を用いた場合と同等以上の感度を実現している。ラジオアイソトープを使用する場合、発される放射線による障害を防止するために遮蔽等を行う必要がある他、使用・保管・廃棄の方法や設備の仕様も放射線障害防止法の規定に従う必要があり、煩雑さを極めている。その一方で酵素標識抗体はそのような煩雑さや人体への障害の懸念がなく、近年重宝されている。 An immunoassay using an enzyme-labeled antibody is particularly called an enzyme immunoassay (EIA), and is a mainstream method of immunoassays in recent years. Through the development of a highly sensitive substrate, the sensitivity is equivalent to or better than when radioisotope-labeled antibodies are used. When using radioisotopes, it is necessary to shield them to prevent damage caused by emitted radiation. In addition, the usage, storage, and disposal methods and equipment specifications must comply with the provisions of the Radiation Hazard Prevention Act. It is extremely complicated. On the other hand, enzyme-labeled antibodies do not have such complications and concerns about damage to the human body, and have recently come in handy.
ＥＩＡに用いられる酵素のひとつに、アルカリホスファターゼ（ＥＣ ３．１．３．１、以下ＡＰとも称する）がある。リン酸モノエステルを加水分解し、アルコールと無機リン酸を生じる反応を触媒する酵素であり、ＥＩＡにおいては基質としてｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）や５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−リン酸（ＢＣＩＰ）などの発色基質、１，２−ジオキセタンを基本骨格とする発光基質（商品名：ＡＭＰＰＤ、ＬｕｍｉｇｅｎＰＰＤ、ＣＳＰＤ、ＣＤＰ−ｓｔａｒ）、アクリダンを基本骨格とする発光基質（商品名：ＡＰＳ−５）などが用いられる。 One of the enzymes used for EIA is alkaline phosphatase (EC 3.1.3.1, hereinafter also referred to as AP). It is an enzyme that catalyzes a reaction that hydrolyzes a phosphoric acid monoester to produce alcohol and inorganic phosphate. In EIA, p-nitrophenyl phosphate (pNPP) or 5-bromo-4-chloro-3-indolyl is used as a substrate. A chromogenic substrate such as phosphoric acid (BCIP), a luminescent substrate having a basic skeleton of 1,2-dioxetane (trade names: AMPPD, LumigenPPD, CSPD, CDP-star), and a luminescent substrate having a basic skeleton of acridan (trade name: APS-5) or the like is used.
アルカリホスファターゼを標識酵素として用いるＥＩＡにおいて検出感度を高めるための試みは、高感度発光基質の開発のほか、ＡＰ自身の活性の高いものを選択し使用することによってもなされる。この目的のために、複数のアイソザイムが存在することで知られるウシ小腸由来ＡＰのうち高比活性のものを精製の過程で単離する、あるいは高比活性型ＡＰの遺伝子を特定してこれを組換え生産する、さらには高比活性の実現に重要な部位特異的アミノ酸変異の導入によりこれの比活性を高めるなどして、当業者らは高感度の要望に応えている（特許文献１など）。 Attempts to increase detection sensitivity in EIA using alkaline phosphatase as a labeling enzyme are made not only by development of a high-sensitivity luminescent substrate, but also by selecting and using an AP having high activity. For this purpose, a high specific activity AP isolated from bovine small intestine AP, which is known to have multiple isozymes, is isolated during purification, or a high specific activity AP gene is identified and used. Those skilled in the art have responded to the demand for high sensitivity by, for example, increasing the specific activity by introducing a site-specific amino acid mutation that is important for the realization of high specific activity, such as recombinant production (Patent Document 1, etc.). ).
また、非特許文献１には、感度を高めるための方策として、例えば、抗原結合能の高い抗体を使用する、径の小さいビーズを使用するなどして一次抗体を固相化する固相面積を大きくする、立体障壁をなくすために抗体をビオチン−アビジン、抗イムノグロブリン抗体などを介して間接的に固相化するなどの方法を紹介している（８９〜９７ページ）。さらには、アビジン−ビオチン標識酵素複合体を用いることにより、抗体１分子あたりに結合する標識酵素量を高める方法（ＡＢＣ法）も知られている。 In Non-Patent Document 1, as a measure for increasing sensitivity, for example, a solid phase area for immobilizing a primary antibody by using an antibody having a high antigen-binding ability or a bead having a small diameter is used. Introducing methods such as immobilizing antibodies indirectly via biotin-avidin, anti-immunoglobulin antibodies, etc. to increase the size and eliminate the steric barrier (pages 89-97). Furthermore, a method (ABC method) is also known in which the amount of labeled enzyme bound per antibody molecule is increased by using an avidin-biotin labeled enzyme complex.
上述の試みにより、ＥＩＡはアトモルレベルの微量の測定対象物質をも検出しうる系となったが、それにもかかわらず、今日における免疫診断法の感度はその要求を必ずしも十分に満たすものではなく、たとえばウイルスによる感染症の初期においては、測定対象となるウイルスの試料中濃度が検出限界以下であるがゆえに、感染の事実があっても測定結果は陰性となる可能性を排除できない。 Although the above-described attempts have made EIA a system that can detect even minute amounts of analytes at the atomic level, nonetheless, the sensitivity of today's immunodiagnostics does not always meet that requirement, for example, In the early stage of infection caused by viruses, the concentration of the virus to be measured in the sample is below the detection limit. Therefore, even if there is an infection fact, the possibility of a negative measurement result cannot be excluded.
本発明の目的は、ＡＰを標識酵素として用いる免疫測定において、その測定感度を高めるための方法を提供することである。 An object of the present invention is to provide a method for increasing the measurement sensitivity in an immunoassay using AP as a labeling enzyme.
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、免疫測定において使用するアルカリホスファターゼ標識抗体を溶解する溶媒および未結合の抗体を洗浄するための洗浄液に適切な金属を添加すること、あるいはさらに洗浄液のバッファー成分として特定の物質を使用することにより測定感度を増大しうることを見出した。 As a result of intensive studies, the inventors have added a suitable metal to a solvent for dissolving an alkaline phosphatase-labeled antibody used in immunoassay and a washing solution for washing unbound antibody, or further, It has been found that the measurement sensitivity can be increased by using a specific substance as a buffer component.
本発明者らは、アルカリホスファターゼ標識物を用いた免疫測定のステップの中で、特に未結合のアルカリホスファターゼ標識物除去に用いる洗浄液中へのマグネシウム添加が感度向上の大きな鍵を握っており、マグネシウムを添加しない場合と比してその差異は顕著であることを見出した。
従来アルカリホスファターゼが活性中心近傍に亜鉛およびマグネシウムを配位しており、これらが酵素活性に必須であることは公知であった。また、マグネシウム塩および亜鉛塩は従来アルカリホスファターゼの活性化剤および安定化剤として用いられてきた。このように、かねてからアルカリホスファターゼを含む組成物やアルカリホスファターゼの活性測定に用いる溶液には、マグネシウムや亜鉛が添加される例が知られている。しかしながら、上記洗浄液への金属添加による顕著な感度向上効果については、これまで報告された例がなく、また示唆すらもなされていなかった。
In the immunoassay step using an alkaline phosphatase labeled product, the present inventors hold magnesium, especially in the washing solution used for removing unbound alkaline phosphatase labeled product. It was found that the difference was remarkable as compared with the case where no was added.
Conventionally, it has been known that alkaline phosphatase coordinates zinc and magnesium in the vicinity of the active center and these are essential for enzyme activity. Magnesium salts and zinc salts have conventionally been used as activators and stabilizers for alkaline phosphatase. Thus, examples in which magnesium or zinc is added to a composition containing alkaline phosphatase or a solution used for measuring the activity of alkaline phosphatase have been known for some time. However, there has been no report of any significant improvement in sensitivity due to the addition of metal to the cleaning solution, and no suggestion has been made.
本発明者らは、さらに、上記洗浄液に金属を添加することを前提として、アルカリホスファターゼ標識物を保存・反応させる際の溶液中にも金属塩を添加すること、さらには上記洗浄液に含まれるバッファー成分として特定の構造を有する化合物を添加すること、さらにはアルカリホスファターゼ用の基質溶液にも金属を添加することが高感度化に功を奏することを見出し、本発明を完成するに至った。 The present inventors further add a metal salt to the solution when the alkaline phosphatase-labeled product is stored and reacted on the premise that a metal is added to the cleaning solution, and further, a buffer contained in the cleaning solution. It has been found that adding a compound having a specific structure as a component and further adding a metal to a substrate solution for alkaline phosphatase is effective for achieving high sensitivity, and the present invention has been completed.
すなわち、本発明は以下の構成からなる。
［項１］
アルカリホスファターゼ標識物を用いた免疫測定において、測定対象物質に未結合のアルカリホスファターゼ標識物を洗浄する際に用いる洗浄液にマグネシウム塩を含ませることを特徴とする、免疫測定方法。
［項２］
さらに、アルカリホスファターゼ標識物を含む溶液に、マグネシウム塩を含ませることを特徴とする、項１に記載の方法。
［項３］
さらに、未結合のアルカリホスファターゼ標識物を洗浄後に添加するアルカリホスファターゼ用基質溶液にマグネシウム塩を含ませることを特徴とする、項１または２に記載の方法。
［項４］
アルカリホスファターゼ標識物が、アルカリホスファターゼ標識抗体である、項１〜３のいずれかに記載の免疫測定方法。
［項５］
洗浄液が、さらに水酸基とスルホン酸基とを有する第３級アミンを含んでなる水溶液である、項１に記載の方法。
［項６］
水酸基およびスルホン酸基を有する第３級アミンが、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシメチル）−２−アミノエタンスルホン酸、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸、および３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸からなる群より選ばれる、項５に記載の方法。
［項７］
アルカリホスファターゼが細菌由来である、項１〜４のいずれかに記載の方法。
［項８］
細菌がシェワネラ属である、項７に記載の方法。
［項９］
アルカリホスファターゼ標識物を用いた免疫測定において、測定対象物質に未結合のアルカリホスファターゼ標識物を洗浄するために用いる洗浄液であって、マグネシウム塩を含む洗浄液。
［項１０］
項９の洗浄液を含むプロダクト。
That is, the present invention has the following configuration.
[Claim 1]
In immunoassay using an alkaline phosphatase labeled product, a magnesium salt is contained in a washing solution used when washing an alkaline phosphatase labeled product unbound to a measurement target substance.
[Section 2]
Item 2. The method according to Item 1, wherein the solution containing the alkaline phosphatase-labeled product contains a magnesium salt.
[Section 3]
Item 3. The method according to Item 1 or 2, wherein a magnesium salt is contained in the alkaline phosphatase substrate solution to which unbound alkaline phosphatase-labeled product is added after washing.
[Claim 4]
Item 4. The immunoassay method according to any one of Items 1 to 3, wherein the alkaline phosphatase labeled product is an alkaline phosphatase labeled antibody.
[Section 5]
Item 2. The method according to Item 1, wherein the cleaning liquid is an aqueous solution further comprising a tertiary amine having a hydroxyl group and a sulfonic acid group.
[Claim 6]
A tertiary amine having a hydroxyl group and a sulfonic acid group is N, N-bis (2-hydroxymethyl) -2-aminoethanesulfonic acid, 2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfone. Item 6. The method according to Item 5, selected from the group consisting of an acid and 3- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] propanesulfonic acid.
[Claim 7]
Item 5. The method according to any one of Items 1 to 4, wherein the alkaline phosphatase is derived from bacteria.
[Section 8]
Item 8. The method according to Item 7, wherein the bacterium is of the genus Shewanella.
[Claim 9]
A washing liquid used for washing an alkaline phosphatase labeled substance unbound to a measurement target substance in an immunoassay using an alkaline phosphatase labeled substance, which contains a magnesium salt.
[Section 10]
A product containing the cleaning liquid according to Item 9.
本発明により、より検出感度の高い酵素免疫測定方法を提供することができる。また、該方法を用いた免疫測定試薬および診断キットを提供することができる。 The present invention can provide an enzyme immunoassay method with higher detection sensitivity. In addition, an immunoassay reagent and a diagnostic kit using the method can be provided.
本発明の免疫測定方法が適用されるのは、アルカリホスファターゼ標識コンジュゲート、より典型的にはアルカリホスファターゼ標識抗体を用いた免疫測定である。 The immunoassay method of the present invention is applied to an immunoassay using an alkaline phosphatase-labeled conjugate, more typically an alkaline phosphatase-labeled antibody.
その典型的な方法は以下の手順からなるが、この例示が本発明を限定するものではない。
工程（１）一次抗体を固相化した反応層に測定対象物質を成分として含有する試料（たとえば汗、尿、血液のような体液ならびにその希釈液等を含む）を添加、一定条件でインキュベートし、測定対象物質を一次抗体に捕捉させる。
工程（２）反応層を界面活性剤等を含む水溶液（溶液Ｉ）で洗浄することにより、一次抗体に捕捉された測定対象物質以外の試料成分を除去する。
工程（３）アルカリホスファターゼ標識二次抗体を含む溶液（溶液ＩＩ）を反応層に添加し、一次抗体に捕捉された測定対象物質に概標識抗体を結合させる。
工程（４）反応層を、界面活性剤等を含む洗浄液（溶液ＩＩＩ）で洗浄することにより、未結合の標識抗体を除去する。
工程（５）反応層にアルカリホスファターゼの発色または発光または蛍光基質を含む溶液（溶液ＩＶ）を添加し、発色・発光量をモニタリングする。蛍光基質の場合であれば励起光を照射し、得られる蛍光をモニタリングする。
The typical method includes the following procedures, but this example does not limit the present invention.
Step (1) A sample containing a substance to be measured as a component (including body fluid such as sweat, urine, blood and its diluted solution) is added to the reaction layer in which the primary antibody is immobilized, and incubated under a certain condition. The target substance is captured by the primary antibody.
Step (2) The reaction layer is washed with an aqueous solution (solution I) containing a surfactant or the like to remove sample components other than the measurement target substance captured by the primary antibody.
Step (3) A solution (solution II) containing an alkaline phosphatase-labeled secondary antibody is added to the reaction layer, and the roughly labeled antibody is bound to the measurement target substance captured by the primary antibody.
Step (4) The reaction layer is washed with a washing solution (solution III) containing a surfactant or the like to remove unbound labeled antibody.
Step (5) A solution (solution IV) containing alkaline phosphatase color development or luminescence or a fluorescent substrate is added to the reaction layer, and the color development / luminescence amount is monitored. In the case of a fluorescent substrate, excitation light is irradiated and the resulting fluorescence is monitored.
本発明の免疫測定方法は、アルカリホスファターゼ標識物を用いた免疫測定において、測定対象物質に未結合のアルカリホスファターゼ標識物を洗浄する際に用いる洗浄液（上記の例示であれば、（４）の工程に用いる洗浄液（溶液ＩＩＩ））にマグネシウム塩を含ませることを特徴とする。 In the immunoassay method of the present invention, the immunoassay using the alkaline phosphatase labeled product is a washing solution used when washing the unbound alkaline phosphatase labeled product that is not bound to the substance to be measured (in the above example, the step (4) The cleaning liquid (solution III)) used in the above is characterized by including a magnesium salt.
本発明者らは、免疫測定において、抗原等に未結合のアルカリホスファターゼ標識コンジュゲートを洗浄し除去する工程に用いる洗浄用溶媒に金属（たとえばマグネシウム塩）を添加することにより高い測定感度を実現しうることを見出した。このように洗浄工程に用いる溶液に金属を添加することによる測定感度の上昇についてはこれまで文献等に報告例はなく、その可能性についても示唆されていなかった。 In the immunoassay, the present inventors realized high measurement sensitivity by adding a metal (for example, a magnesium salt) to a washing solvent used in a step of washing and removing an alkaline phosphatase-labeled conjugate that is not bound to an antigen or the like. I found out. Thus, there has been no report on the increase in measurement sensitivity due to the addition of metal to the solution used in the washing step, and no possibility has been suggested.
（４）の工程に用いる洗浄液（溶液ＩＩＩ）に含まれるマグネシウムイオン濃度は、感度向上に奏功する限りであれば特に限定されない。好ましくはマグネシウムイオンとしての下限は０．１ｍＭであり、より好ましくは０．５ｍＭであり、最も好ましくは１ｍＭである。マグネシウムイオンとしての上限は好ましくは２０ｍＭであり、より好ましくは１０ｍＭであり、最も好ましくは３ｍＭである。
（４）の工程に用いる洗浄液（溶液ＩＩＩ）には、さらに洗浄効果を高めるために界面活性剤を添加することが好ましい。添加される界面活性剤としては、抗原抗体反応およびアルカリホスファターゼ活性を損なわない限りにおいては特に限定されないが、好適にはポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（商品名：Ｔｗｅｅｎ２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（商品名：Ｔｗｅｅｎ８０）、ポリオキシエチレンラウリルエーテル（商品名：Ｂｒｉｊ３５）、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル（商品名：エマルゲンＡ６０）、ポリオキシエチレンオレイルエーテル（商品名：エマルゲン４３０）、コール酸塩、デオキシコール酸塩、マンノシルエリスリトールリピッド等が挙げられる。上記の界面活性剤は、１種類のみで、もしくは数種類を混合して用いられる。
The magnesium ion concentration contained in the cleaning liquid (solution III) used in the step (4) is not particularly limited as long as it improves the sensitivity. Preferably the lower limit for magnesium ions is 0.1 mM, more preferably 0.5 mM, and most preferably 1 mM. The upper limit of magnesium ion is preferably 20 mM, more preferably 10 mM, and most preferably 3 mM.
In order to further enhance the cleaning effect, it is preferable to add a surfactant to the cleaning liquid (solution III) used in the step (4). The surfactant to be added is not particularly limited as long as it does not impair antigen-antibody reaction and alkaline phosphatase activity, but preferably polyoxyethylene sorbitan monolaurate (trade name: Tween 20), polyoxyethylene sorbitan monooleate. Art (trade name: Tween 80), polyoxyethylene lauryl ether (trade name: Brij35), polyoxyethylene distyrenated phenyl ether (trade name: Emulgen A60), polyoxyethylene oleyl ether (trade name: Emulgen 430), Cole Acid salt, deoxycholate, mannosylerythritol lipid and the like. The above-mentioned surfactant is used alone or in combination of several kinds.
（４）の工程に用いる洗浄液（溶液ＩＩＩ）の組成は、マグネシウムを含むこと以外には、測定対象物質に未結合のアルカリホスファターゼ標識物を洗浄する機能を実用上損ねない範囲において、特に限定されるものではない。上記の界面活性剤のほか、当業者によく用いられる緩衝剤、塩類、防腐剤などを含むことができる。亜鉛については、後述の実施例においては０．１ｍＭの添加で感度増大効果がほとんど見られないことが示されているが、その添加を妨げるものではない。 The composition of the cleaning liquid (solution III) used in the step (4) is not particularly limited as long as it does not impair practically the function of cleaning the alkaline phosphatase label unbound to the measurement target substance, other than containing magnesium. It is not something. In addition to the above-mentioned surfactants, buffers, salts, preservatives and the like often used by those skilled in the art can be included. With respect to zinc, in the examples described later, it has been shown that the addition of 0.1 mM hardly shows the effect of increasing sensitivity, but this does not hinder the addition.
本発明の免疫測定方法においては、さらに、アルカリホスファターゼ標識物を含む溶液（上記の例示であれば、（３）の工程に用いられる基質液（溶液ＩＩ））にマグネシウムイオンを含ませることが好ましい。 In the immunoassay method of the present invention, it is preferable to further contain magnesium ions in the solution containing the alkaline phosphatase labeled product (in the above example, the substrate solution (solution II) used in the step (3)). .
アルカリホスファターゼ標識コンジュゲートの保存中における金属（たとえばマグネシウム塩）の添加による保存安定性上昇が、免疫測定の感度をさらに高めることに寄与すると考えられ、これらを洗浄工程における金属添加と組合せることがより好ましく推奨される。 Increased storage stability due to the addition of metals (eg, magnesium salts) during storage of alkaline phosphatase-labeled conjugates may contribute to further increase the sensitivity of the immunoassay, which can be combined with the addition of metals in the washing step. More preferably recommended.
（３）の工程に用いる標識抗体を含む溶液（溶液ＩＩ）に含まれるマグネシウムイオン濃度は、感度向上に奏功する限りあれば特に限定されない。好ましくはマグネシウムイオンとしての下限は０．１ｍＭであり、より好ましくは０．２ｍＭであり、最も好ましくは０．２５ｍＭである。マグネシウムイオンとしての上限は好ましくは１０ｍＭであり、より好ましくは２ｍＭであり、最も好ましくは１ｍＭである。
（３）の工程に用いる標識抗体を含む溶液（溶液ＩＩ）には、マグネシウムのほかに亜鉛を含むことが好ましい。亜鉛の濃度は、感度向上に奏功する限りあれば特に限定されないが、好ましい亜鉛イオン濃度の下限は０．０１ｍＭであり、より好ましくは０．０２ｍＭであり、最も好ましくは０．０２５ｍＭである。亜鉛イオンとしての上限は好ましくは１ｍＭであり、より好ましくは０．２ｍＭであり、最も好ましくは０．１ｍＭである。
The magnesium ion concentration contained in the solution (solution II) containing the labeled antibody used in the step (3) is not particularly limited as long as it improves the sensitivity. Preferably, the lower limit for magnesium ions is 0.1 mM, more preferably 0.2 mM, and most preferably 0.25 mM. The upper limit of magnesium ion is preferably 10 mM, more preferably 2 mM, and most preferably 1 mM.
The solution (solution II) containing the labeled antibody used in the step (3) preferably contains zinc in addition to magnesium. The concentration of zinc is not particularly limited as long as it improves the sensitivity, but the lower limit of the preferable zinc ion concentration is 0.01 mM, more preferably 0.02 mM, and most preferably 0.025 mM. The upper limit for zinc ions is preferably 1 mM, more preferably 0.2 mM, and most preferably 0.1 mM.
これらの溶液には金属イオンのほかに、ｐＨの急激な変動を抑えるための緩衝剤を含んでもよい。緩衝剤としてはリン酸塩、トリス塩酸塩、ホウ酸塩、ＧＯＯＤの緩衝剤などが利用可能である。その濃度はｐＨを適正に保持できる範囲であれば特に限定されないが、好ましくは１〜５００ｍＭであり、より好ましくは５〜１００ｍＭである。また保持すべきｐＨ領域としては、抗体や酵素の安定性を担保しうる範囲であれば特に限定されないが、たとえばｐＨ５〜９の範囲が例示される。
さらに、（３）の工程に用いる標識抗体を含む溶液（溶液ＩＩ）中にあっては、標識抗体が測定対象物質以外の固相上の物質に非特異的に結合するのを防ぐためにブロッキング剤を添加してもよい。ブロッキング剤としては、ウシ血清アルブミン、スキムミルク、不活性化型アルカリホスファターゼ等が例示される。
These solutions may contain a buffering agent for suppressing rapid fluctuations in pH in addition to metal ions. As the buffer, phosphate, Tris hydrochloride, borate, GOOD buffer, and the like can be used. Although the density | concentration will not be specifically limited if it is a range which can maintain pH appropriately, Preferably it is 1-500 mM, More preferably, it is 5-100 mM. The pH range to be maintained is not particularly limited as long as the stability of the antibody and the enzyme can be ensured, and examples thereof include a pH range of 5 to 9.
Further, in the solution (solution II) containing the labeled antibody used in the step (3), a blocking agent is used to prevent the labeled antibody from binding nonspecifically to a substance on the solid phase other than the substance to be measured. May be added. Examples of the blocking agent include bovine serum albumin, skim milk, inactivated alkaline phosphatase, and the like.
（３）の工程に用いる標識抗体を含む溶液（溶液ＩＩ）の組成は、その機能を実用上損ねない範囲において、特に限定されるものではない。上記の緩衝剤やブロッキング剤などのほか、当業者によく用いられる塩類、防腐剤などを含むことができる。 The composition of the solution (solution II) containing the labeled antibody used in the step (3) is not particularly limited as long as its function is not impaired in practice. In addition to the above-mentioned buffering agent and blocking agent, salts and preservatives often used by those skilled in the art can be included.
また、本発明の免疫測定方法においては、さらに、未結合のアルカリホスファターゼ標識物を洗浄後に添加するアルカリホスファターゼ用基質溶液（上記の例示であれば、（５）の工程に用いられる基質液（溶液ＩＶ））にマグネシウムイオンを含ませることが好ましい。 Further, in the immunoassay method of the present invention, an alkaline phosphatase substrate solution to which an unbound alkaline phosphatase-labeled product is added after washing (in the above example, a substrate solution (solution) used in the step (5) IV)) preferably contains magnesium ions.
基質溶液における金属（たとえばマグネシウム塩）の添加による活性の増大が、免疫測定の感度をさらに高めることに寄与すると考えられ、これらを洗浄工程における金属添加と組合せることがより好ましく推奨される。 It is considered that the increase in activity due to the addition of a metal (for example, a magnesium salt) in the substrate solution contributes to further increase the sensitivity of the immunoassay, and it is more preferable to combine these with the metal addition in the washing step.
含まれるマグネシウムイオン濃度としては、感度を向上させることができる限りにおいては特に限定されない。好ましいマグネシウムイオンの下限は０．１ｍＭであり、より好ましくは０．２ｍＭであり、最も好ましくは０．５ｍＭである。マグネシウムイオンとしての上限は好ましくは５０ｍＭであり、より好ましくは２０ｍＭであり、最も好ましくは１０ｍＭである。 The magnesium ion concentration contained is not particularly limited as long as the sensitivity can be improved. The lower limit of the preferred magnesium ion is 0.1 mM, more preferably 0.2 mM, and most preferably 0.5 mM. The upper limit of magnesium ion is preferably 50 mM, more preferably 20 mM, and most preferably 10 mM.
また、含まれる基質としては、活性の検出方法が比色法であればｐ−ニトロフェニルリン酸や５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸が、蛍光法であれば４−メチルウンベリフェリルリン酸が、発光法であれば１，２−ジオキセタン系もしくはアクリダン系発光基質からなる各種発光基質を利用可能である。
これらの中で、特に発光基質を用いる方法の検出感度が高く、これを用いる方法がより好適に選択される。発光基質としては、たとえばＡＭＰＰＤ、ＣＳＰＤ、ＣＤＰ−ｓｔａｒ、Ｌｕｍｉｇｅｎ ＰＰＤ、Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏｓ５３０、ＡＰＳ−５などが挙げられるが、これらに限定されない。
Further, as a substrate to be contained, p-nitrophenyl phosphate or 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate is used if the activity detection method is a colorimetric method, and 4-methyl is used if the method is a fluorescence method. If umbelliferyl phosphate is a luminescence method, various luminescent substrates composed of 1,2-dioxetane-based or acridan-based luminescent substrates can be used.
Among these, the detection sensitivity of the method using a luminescent substrate is particularly high, and the method using this is more preferably selected. Examples of the luminescent substrate include, but are not limited to, AMPPD, CSPD, CDP-star, Lumigen PPD, Lumi-Phos530, and APS-5.
（５）の工程に用いる基質液（溶液ＩＶ）の組成は、その機能を実用上損ねない範囲において、特に限定されるものではない。上記の発光基質のほか、当業者によく用いられる緩衝剤、亜鉛やその他の塩類、防腐剤などを含むことができる。 The composition of the substrate solution (solution IV) used in the step (5) is not particularly limited as long as its function is not impaired in practice. In addition to the above-mentioned luminescent substrate, it can contain a buffer, zinc and other salts, preservatives and the like often used by those skilled in the art.
なお、工程（２）に用いる溶液（Ｉ）については金属塩を添加する必要はないが、溶液の種類を抑制するために溶液（ＩＩＩ）を溶液（Ｉ）と兼用させてもよい。 In addition, although it is not necessary to add a metal salt about the solution (I) used for a process (2), in order to suppress the kind of solution, you may make the solution (III) serve as solution (I).
また、本発明の免疫測定方法においては、さらに、測定対象物質に未結合のアルカリホスファターゼ標識物を洗浄する際に用いる洗浄液（上記の例示であれば、（４）の工程に用いる洗浄液（溶液ＩＩＩ））に、水酸基とスルホン酸基とを有する第３級アミンを緩衝剤として用いることが好ましい。
このような物質としては、より具体的にはＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシメチル）−２−アミノエタンスルホン酸（通称名：ＢＥＳ）、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（通称名：ＭＯＰＳ）、および３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸（通称名：ＨＥＰＥＳ）が例示される。これらは中性付近のｐＨ領域で緩衝能を有しており、濃度としてはｐＨを適正値に保持しうる範囲であればよく特に限定されないが、好ましくは１〜５００ｍＭであり、より好ましくは５〜１００ｍＭである。
Further, in the immunoassay method of the present invention, the washing solution used for washing the unbound alkaline phosphatase labeled product unbound to the measurement target substance (in the above example, the washing solution (solution III used in the step (4)) is used. )), A tertiary amine having a hydroxyl group and a sulfonic acid group is preferably used as a buffer.
As such a substance, more specifically, N, N-bis (2-hydroxymethyl) -2-aminoethanesulfonic acid (common name: BES), 2- [4- (2-hydroxyethyl) -1 -Piperazinyl] ethanesulfonic acid (common name: MOPS) and 3- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] propanesulfonic acid (common name: HEPES) are exemplified. These have buffer capacity in the pH range near neutral, and the concentration is not particularly limited as long as the pH can be maintained at an appropriate value, but is preferably 1 to 500 mM, more preferably 5 ~ 100 mM.
本発明において使用されるアルカリホスファターゼ標識物は、典型的には標識抗体であるが、たとえば二次抗体をビオチン標識抗体とし、これにストレプトアビジン化アルカリホスファターゼを結合させるような場合にあっても同様に効果を得られるものと考えられる。 The alkaline phosphatase labeled product used in the present invention is typically a labeled antibody. For example, even when a secondary antibody is a biotin-labeled antibody and streptavidinated alkaline phosphatase is bound thereto, the same applies. It is thought that an effect can be obtained.
本発明において使用されるアルカリホスファターゼ標識抗体は、アルカリホスファターゼおよび抗体いずれについても特にその由来を限定するものではなく、また標識方法も限定されない。さらに、抗体としてはＩｇＧ等をそのままの状態で、あるいは２−メルカプトエチルアミン等の還元剤で処理しヒンジ部を切断させて還元ＩｇＧとしたもの、あるいはＩｇＧをペプシンにより切断し、さらに還元剤で処理することによりＦａｂ’としたもの等が使用可能である。さらに、標識方法もマレイミド法、ピリジルジスルフィド法、過ヨウ素酸法、グルタルアルデヒド法などの公知技術が適用可能であり、さらに抗体および酵素のうち一方をビオチン化、他方をアビジン化し、これら分子間の親和性により結合させることによって標識抗体とするなど、別の親和性分子種を介して標識することも可能である。これらの中で、マレイミド法が好適な標識方法として選択されうる。 The origin of the alkaline phosphatase-labeled antibody used in the present invention is not particularly limited for either alkaline phosphatase or antibody, and the labeling method is not limited. Furthermore, as an antibody, IgG or the like is used as it is, or treated with a reducing agent such as 2-mercaptoethylamine to cleave the hinge part to obtain reduced IgG, or IgG is cleaved with pepsin and further treated with a reducing agent. As a result, Fab ′ or the like can be used. Furthermore, as the labeling method, known techniques such as maleimide method, pyridyl disulfide method, periodic acid method, glutaraldehyde method and the like can be applied. Furthermore, one of the antibody and the enzyme is biotinylated and the other is avidinized. It is also possible to label through another affinity molecular species such as a labeled antibody by binding with affinity. Among these, the maleimide method can be selected as a suitable labeling method.
標識に用いるアルカリホスファターゼとしては、ウシ小腸由来のもの、ホッコクアカエビ由来のもの、細菌由来のもの等が好適に例示される。細菌由来アルカリホスファターゼとしては、シェワネラ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）属由来のもの、コベティア（Ｃｏｂｅｔｉａ）属由来のもの等が好適に例示される。これらの中でより好適に選択されるアルカリホスファターゼとしては細菌由来のものであり、よりさらに好適にはシェワネラ属由来のものが選択されうる。最も好適には、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むアルカリホスファターゼが選択されうる。また、配列番号２に示す配列のうち、１または数個のアミノ酸残基を置換・欠失または挿入してなる配列を含むアルカリホスファターゼであってもよい。 Preferred examples of the alkaline phosphatase used for labeling include those derived from bovine small intestine, those derived from pink shrimp, and bacteria. Preferred examples of bacterial alkaline phosphatase include those derived from the genus Shewanella, those derived from the genus Covetia, and the like. Among these, the alkaline phosphatase selected more preferably is derived from bacteria, and more preferably one derived from the genus Shewanella. Most preferably, an alkaline phosphatase comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 can be selected. Moreover, alkaline phosphatase containing the sequence formed by substituting, deleting, or inserting one or several amino acid residues in the sequence shown in SEQ ID NO: 2 may be used.
本発明の洗浄液は、アルカリホスファターゼ標識物を用いた免疫測定において、測定対象物質に未結合のアルカリホスファターゼ標識物を洗浄するために用いる洗浄液であって、マグネシウム塩を含む洗浄液である。この洗浄液は、測定対象物質に未結合のアルカリホスファターゼ標識物を洗浄する際に用いる洗浄液（上記の例示であれば、（４）の工程に用いる洗浄液（溶液ＩＩＩ））である。
洗浄液の組成は、上述のとおり、マグネシウムを含むこと以外には、測定対象物質に未結合のアルカリホスファターゼ標識物を洗浄する機能を実用上損ねない範囲において、特に限定されるものではない。
The washing liquid of the present invention is a washing liquid used for washing an alkaline phosphatase labeled substance unbound to a substance to be measured in an immunoassay using an alkaline phosphatase labeled substance, and is a washing liquid containing a magnesium salt. This washing solution is a washing solution used when washing the unbound alkaline phosphatase labeling substance unbound to the measurement target substance (in the above example, the washing solution (solution III) used in the step (4)).
As described above, the composition of the cleaning liquid is not particularly limited as long as it does not impair the function of cleaning the alkaline phosphatase labeled product unbound to the substance to be measured, other than containing magnesium.
本発明のプロダクトは、上記の洗浄液を含むものであれば、その構成、組成などは特に限定されない。たとえば、洗浄液を含む免疫測定試薬が挙げられる。 If the product of this invention contains said washing | cleaning liquid, the structure, a composition, etc. will not be specifically limited. For example, an immunoassay reagent containing a washing solution can be mentioned.
本発明を利用した典型的な免疫測定試薬の構成の一例は、反応層、一次抗体が固定化され、かつウシ血清アルブミンやスキムミルク等のタンパク質でブロッキングされた固相、測定対象である抗原の標準液、アルカリホスファターゼが標識された二次抗体を含む溶液、反応層中でサンプルや二次抗体を反応させた後に洗浄するための洗浄液、ＡＰの基質溶液、使用マニュアルを含む。ここで、アルカリホスファターゼが標識された二次抗体を含む溶液にはマグネシウムイオンおよび亜鉛イオンが含まれ、さらに洗浄液にはマグネシウムイオンが含まれる。より好適にはさらに基質溶液にマグネシウムイオンが含まれ、よりさらに好適には水酸基およびスルホン酸基を有する第３級アミン、より典型的にはＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシメチル）−２−アミノエタンスルホン酸（通称名：ＢＥＳ）、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（通称名：ＭＯＰＳ）、および３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸（通称名：ＨＥＰＥＳ）より選択される物質を緩衝剤として含まれる。 An example of the configuration of a typical immunoassay reagent using the present invention is a reaction layer, a solid phase on which a primary antibody is immobilized and blocked with a protein such as bovine serum albumin or skim milk, and a standard for an antigen to be measured. Solution, a solution containing a secondary antibody labeled with alkaline phosphatase, a washing solution for washing after reacting a sample or secondary antibody in the reaction layer, a substrate solution of AP, and a use manual. Here, the solution containing the secondary antibody labeled with alkaline phosphatase contains magnesium ions and zinc ions, and the washing solution contains magnesium ions. More preferably, the substrate solution further contains magnesium ions, and even more preferably a tertiary amine having a hydroxyl group and a sulfonic acid group, more typically N, N-bis (2-hydroxymethyl) -2- Aminoethanesulfonic acid (common name: BES), 2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (common name: MOPS), and 3- [4- (2-hydroxyethyl)- A substance selected from 1-piperazinyl] propanesulfonic acid (common name: HEPES) is included as a buffer.
なお、本明細書において「プロダクト」とは、使用者が或る用途を実行する目的で用いる１セットのうち一部または全部を構成する製品であって、本発明の洗浄液（測定対象物質に未結合のアルカリホスファターゼ標識物を洗浄する際に用いる洗浄液（上記の例示であれば、（４）の工程に用いる洗浄液（溶液ＩＩＩ）））を含むものを意味する。したがって、例えば免疫測定試薬であれば、該洗浄液と標識抗体を含む溶液との組合せ、該洗浄液と基質液との組合せ、該洗浄液と標識抗体を含む溶液と基質液との組合せ、および、これらを含むあらゆる組合せが含まれる。さらに、それらの組合せにおいて、一次抗体に捕捉された測定対象物質以外の試料成分を除去するために用いる溶液（上記の例示であれば、（２）の工程に用いる溶液（Ｉ））を含む組合せであってもよいし、試料希釈液または精度管理用の標準物質などを含む組合せであってもよい。 In this specification, “product” is a product that constitutes a part or all of one set used by a user for the purpose of carrying out a certain application, and is a cleaning liquid of the present invention. It means one containing a washing solution used for washing the bound alkaline phosphatase-labeled product (in the above example, the washing solution (solution III) used in the step (4)). Thus, for example, in the case of an immunoassay reagent, a combination of the washing solution and a solution containing a labeled antibody, a combination of the washing solution and a substrate solution, a combination of a solution containing the washing solution and a labeled antibody and a substrate solution, and these Any combination is included. Furthermore, in those combinations, a combination including a solution used for removing sample components other than the measurement target substance captured by the primary antibody (in the above example, the solution (I) used in the step (2)). It may be a combination including a sample diluent or a standard substance for quality control.
活性測定例
本発明に述べるアルカリホスファターゼ活性は、特に断りがない限り以下の方法で測定されたものである。
まず、下記の溶液Ａ・Ｂを調製する。
Ａ：１Ｍジエタノールアミン緩衝液 （ｐＨ９．８）
Ｂ：０．６７Ｍ ｐ−ニトロフェニルリン酸 （溶液Ａに溶解する）
溶液Ａ２．９ｍＬと溶液Ｂ０．１ｍＬとをキュベット（光路長＝１．０ｃｍ）に調製し、３７℃で５分間予備加温する。ＡＰ溶液０．１ｍＬを添加してゆるやかに混和し、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で４０５ｎｍの吸光度変化を３〜５分間記録し、その直線部分から１分間あたりの吸光度変化を求める（ΔＯＤＴＥＳＴ）。盲検は酵素の代わりに酵素を溶解しているバッファーを０．１ｍＬ加え、同様に１分間あたりの吸光度変化を求める（ΔＯＤＢＬＡＮＫ）。これらの値を用いて、下記の式よりＡＰ活性を求める。
ＡＰ活性（Ｕ／ｍＬ）＝{（ΔＯＤＴＥＳＴ−ΔＯＤＢＬＡＮＫ）×３．１}／{１８．２×１．０×０．１}
３．１：ＡＰ溶液添加後の反応液量（ｍＬ）
１８．２：上記測定条件における、ｐ−ニトロフェノールのミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／μｍｏｌ）
１．０：光路長（ｃｍ）
０．１：酵素溶液の添加量（ｍＬ）
Activity measurement examples The alkaline phosphatase activity described in the present invention was measured by the following method unless otherwise specified.
First, the following solutions A and B are prepared.
A: 1M diethanolamine buffer (pH 9.8)
B: 0.67M p-nitrophenyl phosphate (dissolves in solution A)
Prepare 2.9 mL of solution A and 0.1 mL of solution B in a cuvette (optical path length = 1.0 cm), and preheat at 37 ° C. for 5 minutes. Add 0.1 mL of AP solution and mix gently. Record the change in absorbance at 405 nm for 3 to 5 minutes using a spectrophotometer controlled at 37 ° C. with water as a control, and change the absorbance per minute from the linear portion. (ΔOD TEST ). In the blind test, 0.1 mL of a buffer dissolving the enzyme is added instead of the enzyme, and the change in absorbance per minute is similarly determined (ΔOD BLANK ). Using these values, the AP activity is obtained from the following formula.
AP activity (U / mL) = {(ΔOD TEST− ΔOD BLANK ) × 3.1} / {18.2 × 1.0 × 0.1}
3.1: Amount of reaction solution after addition of AP solution (mL)
18.2: Molar molecular extinction coefficient of p-nitrophenol (cm2 / μmol) under the above measurement conditions
1.0: Optical path length (cm)
0.1: Amount of enzyme solution added (mL)
タンパク質の定量および比活性の算出例
本発明に述べるタンパク質量は２８０ｎｍの吸光度を測定することにより測定したものである。すなわち、２８０ｎｍにおける吸光度が０．１〜１．０の範囲となるように酵素溶液を蒸留水で希釈し、蒸留水を用いてゼロ点補正を行った吸光度計を用いて２８０ｎｍの吸光度（Ａｂｓ）を測定する。本発明に述べるタンパク質濃度は、１Ａｂｓ≒１ｍｇ／ｍＬと近似し、吸光度の測定と測定した溶液の希釈倍率とを乗じた値で示したものである。また、本発明に述べる比活性とは、本測定方法によるタンパク質量として１ｍｇあたりのＡＰの活性（Ｕ／ｍｇ）であり、この際のＡＰ活性は、上記活性測定例に従って測定することにより得られる値である。
Example of Calculation of Protein Quantification and Specific Activity The amount of protein described in the present invention is measured by measuring absorbance at 280 nm. In other words, the enzyme solution was diluted with distilled water so that the absorbance at 280 nm was in the range of 0.1 to 1.0, and the absorbance at 280 nm (Abs) was obtained using a zero point correction using distilled water. Measure. The protein concentration described in the present invention approximates 1 Abs≈1 mg / mL, and is expressed by a value obtained by multiplying the absorbance measurement and the measured solution dilution rate. The specific activity described in the present invention is the activity (U / mg) of AP per mg as the amount of protein according to this measurement method, and the AP activity at this time is obtained by measuring according to the above activity measurement example. Value.
以下、本発明を具体的に実施例として示すが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is shown as an Example concretely, this invention is not limited to a following example.
［実施例１］
アルカリホスファターゼの作製
配列番号２に示すアミノ酸配列を含むアルカリホスファターゼを、以下のように調製した。
配列番号１に記載する塩基配列を有するＤＮＡを、大腸菌用のベクターであるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）のＢａｍＨＩサイトに挿入した発現プラスミドを、定法に従って大腸菌Ｃ６００株に形質転換し、アルカリホスファターゼ産生菌株を作製した。なお、配列番号１に記載する塩基配列を有するＤＮＡの取得方法は、本願発明者らの別の出願（ＷＯ ２０１２／１１５０２３）に詳述している。この菌株を５００ｍＬ容坂口フラスコ中の６０ｍＬＬＢ培地（１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む）に一白金耳植菌し、３０℃１８０ｒｐｍで一晩振とう培養した。この培養液全量を１０Ｌ容ジャーファーメンター中の６Ｌ生産培地（１．２％ペプトン、２．４％酵母エキス、０．１％ＮａＣｌ、０．１ｍＭ硫酸亜鉛、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、ｐＨ７．０）に全量投入し、通気量２Ｌ／分、攪拌３８０ｒｐｍ、温度３０℃で４８時間攪拌通気培養した。この培養液を５８℃で１６時間加温し、硫酸アンモニウムによる塩析、Ｇ−２５セファロースカラムを用いたゲルろ過法による脱塩、ＤＥＡＥ−セファロースカラムによる陰イオン交換クロマトグラフィー、フェニルセファロースカラムによる疎水クロマトグラフィー、スーパーデックス２００カラムを用いたゲルろ過クロマトグラフィーを経て精製アルカリホスファターゼを得た。このように作製したアルカリホスファターゼの比活性は７５００Ｕ／ｍｇであった。
[Example 1]
Preparation of alkaline phosphatase Alkaline phosphatase containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 was prepared as follows.
An alkaline phosphatase-producing strain is prepared by transforming an expression plasmid obtained by inserting the DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 into the BamHI site of pBluescript SK (-), which is a vector for E. coli, according to a conventional method. did. The method for obtaining DNA having the base sequence described in SEQ ID NO: 1 is described in detail in another application (WO 2012/115023) of the present inventors. One strain of this strain was inoculated into 60 mL LB medium (containing 100 μg / mL ampicillin) in a 500 mL Sakaguchi flask, and cultured with shaking at 30 ° C. and 180 rpm overnight. The total amount of this culture solution was added to 6 L production medium (1.2% peptone, 2.4% yeast extract, 0.1% NaCl, 0.1 mM zinc sulfate, 100 μg / mL ampicillin, pH 7.0 in a 10 L jar fermenter. ), And aerated with aeration at an aeration rate of 2 L / min, agitation of 380 rpm, and a temperature of 30 ° C. for 48 hours. This culture solution is heated at 58 ° C. for 16 hours, salted out with ammonium sulfate, desalted by gel filtration using G-25 Sepharose column, anion exchange chromatography using DEAE-Sepharose column, hydrophobic chromatography using phenyl Sepharose column. Purified alkaline phosphatase was obtained through chromatography and gel filtration chromatography using a Superdex 200 column. The specific activity of the alkaline phosphatase thus prepared was 7500 U / mg.
［実施例２］
アルカリホスファターゼ標識抗体の作製
実施例１で作製したアルカリホスファターゼ２ｍｇを、ボリュームが０．５ｍＬとなるように５０ｍＭ ホウ酸ナトリウム、１ｍＭ 塩化マグネシウム、０．１ｍＭ 塩化亜鉛 （ｐＨ７．６）で希釈し、さらにセロファンチューブに入れて同バッファーを用いて４℃で一晩透析した。透析液に１０μＬのＮ−スクシンイミジル−６−マレイミドヘキサノアート溶液（０．１７ｍｇを１０μＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解）を加えて３０℃で３０分間インキュベートした。これを０．１Ｍトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．０、１ｍＭの塩化マグネシウムおよび０．１ｍＭの硫酸亜鉛を含む）で緩衝化した５ｍＬのＧ−２５ＦａｓｔＦｌｏｗプレパックカラム（ＧＥヘルスケア製）にアプライし、同バッファーを通液してタンパク質画分を集めることでバッファー置換した。一方、マウス抗ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ抗体（ＩｇＧ）２ｍｇ／０．４５ｍＬの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に５０μＬの０．１Ｍ ２−メルカプトエチルアミンを加えて混合し、３７℃で９０分インキュベートすることにより、還元ＩｇＧを生じさせた。これを５ｍＭ エチレンジアミン４酢酸を含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で緩衝化した５ｍＬのＧ−２５ＦａｓｔＦｌｏｗプレパックカラム（ＧＥヘルスケア製）を用いて同バッファーでバッファー置換を行った。
還元ＩｇＧ溶液とマレイミド化ＡＰ溶液を等量混合し、４℃で２０時間インキュベートすることによりコンジュゲートを生じさせた。この溶液を１０ｍＭトリス塩酸バッファー、０．１Ｍ 塩化ナトリウム、１ｍＭ 塩化マグネシウム、０．１ｍＭ 塩化亜鉛 （ｐＨ６．８）で緩衝化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００プレパックカラム（１６ｍｍ×６００ｍｍ、ＧＥヘスルケア製）でゲルろ過し、ＡＰ活性および２８０ｎｍにおける吸光度を指標に、ＡＰ標識マウス抗ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ抗体を含む画分を回収した。この標識抗体を、５ｍＬのＧ−２５ＦａｓｔＦｌｏｗプレパックカラムを用いて１ｍＭ 塩化マグネシウム、０．１ｍＭ 塩化亜鉛、０．１％ ＢＳＡを含むＴＢＳバッファーに置換し、その後の実験に供した。
[Example 2]
Preparation of alkaline phosphatase-labeled antibody 2 mg of alkaline phosphatase prepared in Example 1 was diluted with 50 mM sodium borate, 1 mM magnesium chloride, 0.1 mM zinc chloride (pH 7.6) so that the volume was 0.5 mL. It was put into a cellophane tube and dialyzed overnight at 4 ° C. using the same buffer. 10 μL of N-succinimidyl-6-maleimidohexanoate solution (0.17 mg dissolved in 10 μL of N, N-dimethylformamide) was added to the dialysate and incubated at 30 ° C. for 30 minutes. This was applied to a 5 mL G-25 FastFlow prepacked column (manufactured by GE Healthcare) buffered with 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.0, containing 1 mM magnesium chloride and 0.1 mM zinc sulfate). The buffer was replaced by collecting the protein fraction by passing through the solution. On the other hand, mouse anti-KOD DNA polymerase antibody (IgG) 2 mg / 0.45 mL of 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.0) was mixed with 50 μL of 0.1 M 2-mercaptoethylamine and stirred at 37 ° C. for 90 minutes. Reduced IgG was generated by incubating for minutes. Buffer replacement was performed with the same buffer using a 5 mL G-25 FastFlow prepacked column (manufactured by GE Healthcare) buffered with 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.0) containing 5 mM ethylenediaminetetraacetic acid.
Conjugates were formed by mixing equal amounts of reduced IgG solution and maleimidated AP solution and incubating at 4 ° C. for 20 hours. This solution was subjected to gel filtration with a Superdex 200 prepacked column (16 mm × 600 mm, manufactured by GE Health Care) buffered with 10 mM Tris-HCl buffer, 0.1 M sodium chloride, 1 mM magnesium chloride, 0.1 mM zinc chloride (pH 6.8), and AP Fractions containing AP-labeled mouse anti-KOD DNA polymerase antibody were collected using the activity and absorbance at 280 nm as indices. This labeled antibody was replaced with a TBS buffer containing 1 mM magnesium chloride, 0.1 mM zinc chloride, and 0.1% BSA using a 5 mL G-25 FastFlow prepacked column, and used for the subsequent experiments.
［実施例３］
抗原固相化プレートの作製
９６ウエルＥＬＩＳＡプレート（ｎｕｎｃ製９６Ｆ ＭＡＸＩＳＯＲＰ ＢＬＡＣＫ ＭＩＣＲＯＷＥＬＬ ＳＨ）に、１ウエルあたり５０μＬの抗ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ一次抗体（１０μｇ／ｍＬ）を添加し、振とうにより液を底面全体に行き渡らせたのち２５℃で２時間インキュベートし、液を完全に除いた。続いて１ウエルあたり３００μＬのＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ７．４）を添加して液を除いた。この操作を３回繰り返して洗浄の後、１ウエルあたり３００μＬのＰＢＳ＋０．１％ウシ血清アルブミンを加えて２５℃で１時間インキュベートすることによりブロッキングを行い、液を完全に除いた。続いて１ウエルあたり３００μＬのＴＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ７．４）を添加して液を除き、この操作を３回繰り返して洗浄し、抗ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ一次抗体被覆ＥＬＩＳＡプレートを作製した。このプレートに対し、０．１μｇ／ｍＬの抗原（ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ）溶液を１ウエルあたり５０μＬずつ添加し、振とうにより液を底面全体に行き渡らせたのち３７℃で１時間インキュベートして抗原を固相上の一次抗体に捕捉させ、液を完全に除いた。続いて１ウエルあたり３００μＬのＴＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ７．４）を添加して液を除いた。この操作を３回繰り返すことで未結合の抗原を除いた。以下の実験には、この抗原を固相に捕捉させたプレートを用いた。
[Example 3]
Preparation of antigen-immobilized plate 50 μL of anti-KOD DNA polymerase primary antibody (10 μg / mL) per well was added to a 96-well ELISA plate (nunc 96F MAXISORP BLACK MICROWELL SH), and the solution was shaken over the entire bottom surface. After spreading, the mixture was incubated at 25 ° C. for 2 hours to completely remove the liquid. Subsequently, 300 μL of PBS + 0.05% Tween 20 (pH 7.4) was added per well to remove the solution. This operation was repeated 3 times, and after washing, blocking was performed by adding 300 μL of PBS + 0.1% bovine serum albumin per well and incubating at 25 ° C. for 1 hour to completely remove the solution. Subsequently, 300 μL of TBS + 0.05% Tween 20 (pH 7.4) was added per well to remove the solution, and this operation was repeated three times to wash, thereby preparing an anti-KOD DNA polymerase primary antibody-coated ELISA plate. To this plate, add 50 μL of 0.1 μg / mL antigen (KOD DNA polymerase) solution per well, spread the solution over the entire bottom surface by shaking, and then incubate at 37 ° C. for 1 hour to fix the antigen. The primary antibody on the phase was captured and the solution was completely removed. Subsequently, 300 μL of TBS + 0.05% Tween 20 (pH 7.4) was added per well to remove the solution. This operation was repeated three times to remove unbound antigen. In the following experiment, a plate having this antigen captured on a solid phase was used.
［実施例４］
免疫測定における未結合の酵素標識抗体洗浄液中の金属組成検討
実施例３で作製したプレートに、実施例２で作製した標識抗体溶液（０．４μｇ／ｍＬ ｉｎ ＴＢＳ ＋ １ｍＭ 塩化マグネシウム ＋ ０．１ｍＭ 塩化亜鉛 ＋ ０．１％ ＢＳＡ）を１ウエルあたり５０μＬ添加し、３７℃で１時間インキュベートすることにより抗原に結合させた。その後、ウエル中の液体を除き、洗浄液３００μＬを各ウエルに添加して除く操作を３回実施することで未結合の標識抗体をのぞいた。この際、使用した洗浄液は次の組成のものを使用した。すなわち、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ， １３７ｍＭ ＮａＣｌ， １ｍＭ ＫＣｌ， ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ （ｐＨ＝７．２）からなり、さらに金属の種類およびその濃度について表１に示す条件の洗浄液を使用した。
[Example 4]
Examination of metal composition in unbound enzyme-labeled antibody washing solution in immunoassay The labeled antibody solution prepared in Example 2 (0.4 μg / mL in TBS + 1 mM magnesium chloride + 0.1 mM chloride) was applied to the plate prepared in Example 3. Zinc + 0.1% BSA) was added at 50 μL per well and allowed to bind to the antigen by incubating at 37 ° C. for 1 hour. Thereafter, the liquid in the well was removed, and 300 μL of the washing solution was added to each well and removed three times to remove unbound labeled antibody. At this time, the cleaning liquid used had the following composition. That is, it was composed of 25 mM HEPES, 137 mM NaCl, 1 mM KCl, 0.05% Tween 20 (pH = 7.2), and a cleaning solution having the conditions shown in Table 1 for the type of metal and its concentration was used.
洗浄工程後、各ウエルに５０μＬのＡＰＳ−５（ルミジェン社製）を添加し、発光強度をルミノメトリー（パーキンエルマー製Ｗａｌｌａｃ １４２０ ＡＲＶＯ ＭＸ）を用いて測定した。
結果を図１に示す。洗浄液にマグネシウム塩を添加することで、その発光強度は大幅に増大した。一方、マグネシウム塩に加えて亜鉛塩を加えても感度増大効果としてはみられなかった。
After the washing step, 50 μL of APS-5 (Lumigen) was added to each well, and the luminescence intensity was measured using luminometry (Perkin Elmer Wallac 1420 ARVO MX).
The results are shown in FIG. By adding a magnesium salt to the cleaning solution, the emission intensity was greatly increased. On the other hand, the addition of a zinc salt in addition to a magnesium salt did not show an effect of increasing sensitivity.
［実施例５］
免疫測定における酵素標識抗体溶液中の金属組成検討
実施例２で作製した標識抗体を含む溶液について、表２に示す金属の種類および濃度条件のバッファー（ＴＢＳバッファー ＋ ０．１％ ＢＳＡ）を用いて０．４μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、種々の金属組成の酵素標識抗体溶液を作製した。これを実施例３で作製したプレートに１ウエルあたり５０μＬ添加し、３７℃で１時間インキュベートすることにより抗原に結合させた。その後、ウエル中の液体を除き、洗浄液（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ， １３７ｍＭ ＮａＣｌ， １ｍＭ ＫＣｌ， ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０， ３ｍＭ 塩化マグネシウム， ｐＨ＝７．２）３００μＬを各ウエルに添加して除く操作を３回実施することで未結合の標識抗体をのぞいた。ここに基質溶液としてＡＰＳ−５もしくはＬｕｍｉ−ｐｈｏｓ５３０（共にルミジェン社製）を添加し、発光量をルミノメトリーを用いて測定した。
結果を図２に示す。洗浄バッファーに金属を添加する前提においても、酵素標識抗体溶液にも金属を含ませることがより好ましいことがわかった。また、金属の種類としては、マグネシウム塩単独よりも、さらに亜鉛塩を含ませることがより好ましいことが見出された。
Examination of metal composition in enzyme-labeled antibody solution in immunoassay For the solution containing the labeled antibody prepared in Example 2, the metal type and concentration condition buffer shown in Table 2 (TBS buffer + 0.1% BSA) was used. It diluted to the density | concentration of 0.4 microgram / mL and the enzyme label antibody solution of various metal compositions was produced. This was added to the plate prepared in Example 3 at 50 μL per well and allowed to bind to the antigen by incubating at 37 ° C. for 1 hour. Thereafter, the liquid in the well was removed, and 300 μL of the washing solution (25 mM HEPES, 137 mM NaCl, 1 mM KCl, 0.05% Tween 20, 3 mM magnesium chloride, pH = 7.2) was added to each well and removed three times. As a result, unbound labeled antibody was removed. Here, APS-5 or Lumi-phos 530 (both manufactured by Lumigen) was added as a substrate solution, and the amount of luminescence was measured using luminometry.
The results are shown in FIG. It was found that it is more preferable to include metal in the enzyme-labeled antibody solution even under the premise that metal is added to the washing buffer. In addition, it has been found that it is more preferable to further include a zinc salt as a kind of metal than to a magnesium salt alone.
［実施例６］
免疫測定における基質溶液中の金属組成検討
実施例３で作製したプレートに、実施例２で作製した標識抗体溶液（０．４μｇ／ｍＬ ｉｎ ＴＢＳ ＋ １ｍＭ 塩化マグネシウム ＋ ０．１ｍＭ 塩化亜鉛 ＋ ０．１％ ＢＳＡ）を１ウエルあたり５０μＬ添加し、３７℃で１時間インキュベートすることにより抗原に結合させた。その後、ウエル中の液体を除き、洗浄液（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ， １３７ｍＭ ＮａＣｌ， １ｍＭ ＫＣｌ， ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０， ３ｍＭ 塩化マグネシウム， ｐＨ＝７．２）３００μＬを各ウエルに添加して除く操作を３回実施することで未結合の標識抗体をのぞいた。ここに、基質溶液として０〜１０ｍＭの範囲でマグネシウム塩を含む基質溶液（ＣＤＰ−ｓｔａｒ ×１００ストック溶液、ロシュ製を２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ９．８）， １３７ｍＭ ＮａＣｌ２および各濃度塩化マグネシウムを含むバッファーで１００倍希釈したもの）を５０μＬ添加し、発光量をルミノメトリーを用いて測定した。
結果を図３に示す。マグネシウム塩を基質溶液に加えることで、免疫測定における検出感度をさらに高めることが可能であることが見出された。
[Example 6]
Examination of metal composition in substrate solution in immunoassay The labeled antibody solution prepared in Example 2 (0.4 μg / mL in TBS + 1 mM magnesium chloride + 0.1 mM zinc chloride + 0.1 was added to the plate prepared in Example 3. % BSA) was added at 50 μL per well and allowed to bind to the antigen by incubating at 37 ° C. for 1 hour. Thereafter, the liquid in the well was removed, and 300 μL of the washing solution (25 mM HEPES, 137 mM NaCl, 1 mM KCl, 0.05% Tween 20, 3 mM magnesium chloride, pH = 7.2) was added to each well and removed three times. As a result, unbound labeled antibody was removed. Here, a substrate solution containing a magnesium salt in a range of 0 to 10 mM as a substrate solution (CDP-star × 100 stock solution, manufactured by Roche is a buffer containing 25 mM Tris-HCl (pH 9.8), 137 mM NaCl 2 and each concentration of magnesium chloride) Was diluted 100 times) and the amount of luminescence was measured using luminometry.
The results are shown in FIG. It has been found that detection sensitivity in an immunoassay can be further increased by adding magnesium salt to a substrate solution.
［実施例7］
免疫測定における酵素標識抗体溶液中のバッファー成分検討
実施例３で作製したプレートに、実施例２で作製した標識抗体溶液（０．４μｇ／ｍＬ ｉｎ ＴＢＳ ＋ １ｍＭ 塩化マグネシウム ＋ ０．１ｍＭ 塩化亜鉛 ＋ ０．１％ ＢＳＡ）を１ウエルあたり５０μＬ添加し、３７℃で１時間インキュベートすることにより抗原に結合させた。その後、ウエル中の液体を除き、洗浄液３００μＬを各ウエルに添加して除く操作を３回実施することで未結合の標識抗体をのぞいた。この際、使用した洗浄液は次の組成のものを使用した。すなわち、２５ｍＭ 各種バッファー， １３７ｍＭ ＮａＣｌ， １ｍＭ ＫＣｌ， １ｍＭ 塩化マグネシウム， ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ （ｐＨ＝７．２） である。洗浄工程後、各ウエルに５０μＬの基質溶液（ＡＰＳ−５、Ｌｕｍｉ−ｐｈｏｓ５３０およびＣＤＰ−ｓｔａｒ）を添加し、発光強度を、ルミノメトリーを用いて測定した。
結果を図４に示す。なお、発光強度は、それぞれの発光基質を使用した際に、バッファー成分としてＴｒｉｓ−ＨＣｌ（図中ではＴＢＳと記載）を加えた場合を１とした相対値として示した。結果から、３種類の発光基質いずれを用いても、比較対象のＴｒｉｓ−ＨＣｌと比して１．２倍以上の発光強度を示したバッファー成分として、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシメチル）−２−アミノエタンスルホン酸（通称名：ＢＥＳ）、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（通称名：ＭＯＰＳ）、および３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸（通称名：ＨＥＰＥＳ）が挙げられる。これら成分に共通するのは、水酸基およびスルホン酸基を有する第３級アミンであるという点である。よって、このような成分を含む洗浄液を用いることで、免疫測定における検出感度をさらに高めることが可能であることが見出された。
[Example 7]
Examination of buffer components in enzyme-labeled antibody solution in immunoassay The labeled antibody solution prepared in Example 2 (0.4 μg / mL in TBS + 1 mM magnesium chloride + 0.1 mM zinc chloride + 0) was added to the plate prepared in Example 3. .1% BSA) was added to the antigen by adding 50 μL per well and incubating at 37 ° C. for 1 hour. Thereafter, the liquid in the well was removed, and 300 μL of the washing solution was added to each well and removed three times to remove unbound labeled antibody. At this time, the cleaning liquid used had the following composition. That is, 25 mM various buffers, 137 mM NaCl, 1 mM KCl, 1 mM magnesium chloride, 0.05% Tween 20 (pH = 7.2). After the washing step, 50 μL of a substrate solution (APS-5, Lumi-phos 530 and CDP-star) was added to each well, and the luminescence intensity was measured using luminometry.
The results are shown in FIG. In addition, when using each luminescent substrate, the luminescence intensity was shown as a relative value with 1 when Tris-HCl (described as TBS in the figure) was added as a buffer component. From the results, N, N-bis (2-hydroxymethyl) was used as a buffer component that showed a luminescence intensity 1.2 times or more higher than that of Tris-HCl as a comparison target, regardless of which of the three types of luminescent substrates was used. 2-aminoethanesulfonic acid (common name: BES), 2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (common name: MOPS), and 3- [4- (2-hydroxy Ethyl) -1-piperazinyl] propanesulfonic acid (common name: HEPES). What is common to these components is that they are tertiary amines having a hydroxyl group and a sulfonic acid group. Therefore, it has been found that the detection sensitivity in immunoassay can be further increased by using a washing solution containing such components.
本発明は、免疫測定であって、アルカリホスファターゼ標識物、より典型的にはアルカリホスファターゼ標識抗体を用いた測定に利用可能であり、検出感度を高める効果がある。 The present invention is an immunoassay and can be used for measurement using an alkaline phosphatase-labeled product, more typically an alkaline phosphatase-labeled antibody, and has an effect of increasing detection sensitivity.
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