JP2014128249A - USE OF miRNA OR TARGET GENE THEREOF IN INSPECTION AND THERAPY OF NEURODEGENERATIVE DISEASE - Google Patents

USE OF miRNA OR TARGET GENE THEREOF IN INSPECTION AND THERAPY OF NEURODEGENERATIVE DISEASE Download PDF

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Hidenao Sasaki
秀直 佐々木
Jun Uchiumi
潤 内海
Koichi Wakabayashi
孝一 若林
Tetsuya Ueda
哲也 上田
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Hokkaido Univ
国立大学法人北海道大学
Hirosaki Univ
国立大学法人弘前大学
Lsi Medience Corp
株式会社Lsiメディエンス
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an miRNA as being a biomarker which can be used in inspection diagnosis and therapy for an intractable neurodegenerative disease.SOLUTION: By measuring a gene product of an miRNA specified by the present invention or a target gene thereof, an intractable neurodegenerative disease, particularly amyotrophic lateral sclerosis and multiple system atrophy can be detected. In addition, the gene product of the miRNA of the present invention or a target gene thereof can be used in inspection diagnosis and therapy for the disease. Further, it can be used in screening a compound as being a therapeutic agent for the disease.

Description

本発明は、神経変性疾患の存在を検出するための検査診断および同疾患の治療標的として有用なマイクロRNA(miRNA)又はその標的遺伝子とそれらの利用に関する。 The present invention, there relates laboratory diagnostics and useful micro RNA (miRNA) or their use and the target gene as a therapeutic target for the disease to detect neurodegenerative diseases.

認知症を含む神経変性疾患は、一般に進行性であり、脳神経細胞の不可逆的な変性を伴うことから、早期に診断し治療を開始することが重要である。 Neurodegenerative diseases including dementia are generally progressive, since it involves an irreversible degeneration of brain neurons, it is important to start the diagnostic and treated early. しかし、現時点では有効なバイオマーカーが確立されておらず、血清学的検査方法を用いた診断法は確立されておらず、また確実な治療法も確立されていない。 However, no effective biomarkers is established at present, serological methods diagnostic method using has not been established, nor has been established reliably treatment. その結果、難治性で、日常生活が破壊される状況となり、患者本人の肉体的負担のみならず、家族にも多大の負担を来している。 As a result, in the refractory, become a situation in which daily life is destroyed, not only the physical burden of the patient himself, may have been reached a great deal of the burden to the family. 神経変性疾患は患者本人だけでなく、介護者にも多大な負担が及び、社会全体の活力の大きな損失につながるという実態がある。 Neurodegenerative disease is not only the patient himself, even to the caregiver Oyobi a great deal of burden, there is a reality that leads to a large loss of society as a whole of vitality. 超高齢化社会が進む我が国では、神経変性疾患対策が国家的な重要課題となってきている。 In Japan the super-aging society progresses, neurodegenerative disease measures has become a national important issue. すなわち、(1)高齢化社会における医療福祉行政の基幹的課題であること、(2)認知症による膨大な経済的損失(年間5兆円相当)を軽減すること、(3)医療イノベーションで日本発の革新的治療法の開発を推進し、日本の医薬品輸入赤字(2兆円超)を解消すること、(4)国の5ヵ年計画(2012)で対策が必要な重点疾患(がん、難病・希少疾病、肝炎、感染症、糖尿病、脳心血管疾患、精神神経疾患、小児疾患)に指定されていること、などである。 In other words, (1) it is a key challenge of medical welfare administration in an aging society, to reduce the (2) huge economic losses due to dementia (year 5 trillion yen worth), Japan (3) Medical Innovation promote the development of innovative treatments for departure, to eliminate the Japanese pharmaceutical import deficit (2 trillion yen more than), (4) 5-year plan (2012) in the measures necessary emphasis diseases of country (cancer, incurable diseases and rare diseases, hepatitis, infectious diseases, diabetes, cardiovascular and cerebrovascular disease, neuropsychiatric disorders, that are specified in the pediatric disease), and the like. このように、新たなバイオマーカーの開発、検査診断薬の開発、治療薬・治療法の開発が緊急の課題となっている。 In this way, the development of new biomarkers, the development of inspection diagnostics, the development of therapeutic agents and treatment methods has become an urgent issue.

検査診断法については、疾患関連バイオマーカーが特定され、血清学的診断法により簡便に早期の診断及び病態のモニタリングが実施できるようになれば、早期治療が可能となり、多くの患者の不可逆的なダメージを最小限に抑えることが可能となる。 For test diagnostics, disease-associated biomarkers are identified, if so conveniently diagnosis and monitoring of conditions of early Serological diagnosis can be performed, it is possible to early treatment, irreversible many patients it is possible to minimize the damage. 早期診断が可能となれば、患者だけでなく介護者のQOLの向上、ひいては超高齢化を迎えた日本社会全体の活力の維持にも大きく貢献することは間違いない。 If a possible early diagnosis, improvement of caregivers of QOL not only the patient, is no doubt that contribute significantly to the maintenance of the vitality of the whole Japanese society, which celebrated the turn super-aging. 治療法に関しては、病態改善薬のみならず、進行抑制薬も十分に医療上の意義が高く、そのためのバイオマーカーの神経機能への関与の解析も重要である。 For the treatment, not pathological improving drug alone, proceeds inhibitors also sufficiently high medical significance, analysis of involvement in neuronal function biomarkers for its also important.

神経変性疾患の発症や病態に関わる生体内因子は、遺伝子から細胞まで広く研究されているが、未解明な部分が非常に多く、未だに診断や治療につながる有用なバイオマーカーは見出されていない。 Vivo factors involved in onset and pathology of neurodegenerative diseases has been extensively studied from genetic to cells, unclear portions are so many, not yet useful biomarkers lead to the diagnosis and treatment is found . 難治性神経変性疾患のうちでも、筋萎縮性側索硬化症(Amyotrophic Lateral Sclerosis:ALS)と多系統萎縮症(Multiple System Atrophy:MSA)は重篤な神経機能障害と死に至る疾患であり、有用なバイオマーカーの開発は緊急の課題となっている。 Among the intractable neurodegenerative diseases, amyotrophic lateral sclerosis (Amyotrophic Lateral Sclerosis: ALS) and multiple system atrophy (Multiple System Atrophy: MSA) is a disease that leads to severe neurological dysfunction and death, useful development of such biomarkers has become an urgent issue.

近年、生体内因子の重要な因子として、マイクロRNA(miRNAと略す)が注目されている。 Recently, as an important factor in vivo factors, micro RNA (abbreviated as miRNA) has attracted attention. miRNAは、約22塩基の蛋白質非翻訳RNA(small non-coding RNA)であり、ヒトには約1000種類以上存在することが示唆されている。 miRNA is a protein untranslated RNA of about 22 bases (small non-coding RNA), it has been suggested to be present from about 1000 or more in humans. miRNAは生体内でさまざまな遺伝子の発現抑制を行う分子として注目されている。 miRNA has attracted attention as molecules for performing suppression of the expression of various genes in vivo. ゲノム上には各miRNA遺伝子の領域が存在し、RNAポリメラーゼIIによって転写され、約数百塩基のmiRNA初期転写産物が形成される。 The genome exist region of each miRNA genes are transcribed by RNA polymerase II, miRNA initial transcription product of about several hundred base is formed. miRNA初期転写産物は核内でDrosha、細胞質内でDicerと呼ばれる2種類のRNase III酵素によってプロセシングされ、成熟miRNAが形成される。 miRNA initial transcription product is processed by two RNase III enzyme called Drosha in the nucleus, and Dicer in the cytoplasm, mature miRNA is formed. 成熟miRNAは制御タンパク質複合体(RNA-induced silencing complex:RISC)と協調しつつ、相補的配列をもつ複数のターゲット遺伝子のmRNAと相互作用し、遺伝子の発現を抑制することが知られている。 Mature miRNA control protein complexes: while cooperation with (RNA-induced silencing complex RISC), and interact with the mRNA of a plurality of targets genes with complementary sequences, are known to suppress the expression of a gene.

miRNAはヒト疾患に広く関連が示唆されているが、特にがんとmiRNAの関係に関して、様々な臓器において正常組織とがん組織で多くのmiRNAの発現様式が異なる事から、発がん過程へのmiRNA発現異常の関与が強く示唆されている。 miRNA is has been suggested widely associated with human disease, in particular with respect to the relationship of cancer and miRNA, from different possible number of miRNA manner expressed in normal tissue and cancer tissue in various organs, miRNA to carcinogenesis abnormal expression of involvement has been suggested strongly. すなわち、腫瘍抑制的miRNAの発現低下あるいは発がん促進的miRNAの発現上昇がヒト発がん過程に関与している可能性が強く示唆されている(非特許文献1)。 In other words, it decreased expression or increased expression of oncogenic facilitative miRNA tumor suppressive miRNA is strongly suggested possible involvement in human carcinogenesis (Non-Patent Document 1). miRNAの産業上の利用に関しても、もっぱらがんの領域での利用が主体であるが、ようやく各種疾患に対する創薬への利用が報告され始めてきた(非特許文献2)。 Also with respect to the use of the miRNA of the industry, exclusively the use of a cancer of the region is a principal, it has begun to be reported at last use of the drug for various diseases (Non-Patent Document 2). 神経疾患関係においては、損傷後の神経の再生にmiRNAを利用する方法(特許文献1)や多能性ストローマ細胞のニューロン分化を刺激する方法(特許文献2)が報告されている。 In neurological disorders related method of stimulating neuronal differentiation method (Patent Document 1) and pluripotent stromal cells utilizing miRNA to regeneration of nerve after injury (Patent Document 2) have been reported.

しかしながら、miRNAは各種疾患に広く関与している可能性が高いにもかかわらず、具体的にALSとMSAへのmiRNAの応用技術に関する情報は乏しく、ALSの進行抑制にmiRNA−206が関与することを示唆した文献(非文献情報3)、ALS患者の白血球中のmiRNAの変化の報告(非文献情報4)や脊髄性筋萎縮症(Spinal Muscular Atrophy:SMA)への関与を示唆する文献(非文献情報5)など、少数の報告があるにすぎない。 However, miRNA spite is likely to be involved extensively in various diseases, specifically information on applied technology of miRNA to ALS and MSA is poor, that miRNA-206 is involved in suppressing progression of ALS the suggested literature (non-document information 3), report of change of miRNA in white blood cells of ALS patients (non-document information 4) and spinal muscular atrophy (spinal muscular atrophy: SMA) literature suggesting the involvement of the (non literature information 5), and the like, not only there is a small number of reports. 進行性で内因的な因子の関与が大きいと考えられるALSとMSAでは、miRNAを利用した検査診断あるいは創薬に有用な疾患バイオマーカーの開発が切望されている。 In ALS the MSA intrinsic factor involvement is considered to be greater in progressive development of useful disease biomarkers in laboratory diagnosis or drug using miRNA is desired.

特表2011-515407号公報 JP-T 2011-515407 JP 特表2012-530054号公報 JP-T 2012-530054 JP

上記のとおり、難治性のALSやMSAに対する検査法や治療法は確立しておらず、医療上の大きな課題になっている。 As described above, tests and treatments for intractable for ALS and MSA is not established, it has become a major challenge in medical. 疾患に関与すると言われているmiRNAの神経変性疾患におけるバイオマーカーとなり得るmiRNAを見出し、その利用方法を確立すれば、新しい検査診断法、病態モニタリング法、さらには治療薬への応用が可能となる。 Found miRNA that can be a biomarker in neurodegenerative diseases miRNA that are said to be involved in the disease, if establish its use, new check diagnostics, pathology monitoring methods, further it is possible to apply to the therapeutic agent .
本発明の目的は、神経変性疾患の検査と治療に対するmiRNAの利用であり、特にALSとMSAのバイオマーカーとなるmiRNA、又はその標的遺伝子の遺伝子産物を臨床検査や病態モニタリング、さらには治療法へ応用することである。 An object of the present invention is the use of miRNA for examination and treatment of neurodegenerative diseases, in particular miRNA as a biomarker for ALS and MSA, or clinical examination and pathology monitor gene product of the target gene, more to therapy it is to be applied.

本発明は、以下の発明に関する: The present invention relates to the following invention:
[1]被験者から採取した試料中のmiRNA、又はその標的遺伝子の遺伝子産物を測定する工程を含み、前記miRNAが表1〜表4に記載のmiRNAの少なくとも1つであり、前記標的遺伝子が表5〜表8に記載の標的遺伝子の少なくとも1つである、神経変性疾患の検出方法。 [1] miRNA in a sample collected from a subject, or includes the step of measuring the gene product of the target gene, wherein the miRNA is at least one of miRNA shown in Table 1 to Table 4, the target gene is Table at least one is, the detection method of neurodegenerative diseases of a target gene according to 5 in table 8.
[2]表1〜表4に記載のmiRNAからなる群から選んだmiRNA、又は表5〜表8に記載の標的遺伝子からなる群から選んだ標的遺伝子の遺伝子産物である、神経変性疾患を検出するためのバイオマーカー。 [2] Table. 1 to miRNA selected from the group consisting of miRNA described in Table 4, or a gene product of the target gene selected from the group consisting of the target genes listed in Tables 5 to 8, detecting a neurodegenerative disease It biomarkers for.
[3]被験者から採取した試料中のmiRNA、又はその標的遺伝子の遺伝子産物を測定する工程を含み、前記miRNAが表1〜表2に記載のmiRNAの少なくとも1つであり、前記標的遺伝子が表5〜表6に記載の標的遺伝子の少なくとも1つである、多系統萎縮症の検出方法。 [3] miRNA in a sample collected from a subject, or includes the step of measuring the gene product of the target gene, wherein the miRNA is at least one of miRNA shown in Table 1 to Table 2, the target gene is Table at least one is, the detection method of multiple system atrophy of the target gene according to 5 in table 6.
[4]被験者から採取した試料中のmiRNA、又はその標的遺伝子の遺伝子産物を測定する工程を含み、前記miRNAが表3〜表4に記載のmiRNAの少なくとも1つであり、前記標的遺伝子が表7〜表8に記載の標的遺伝子の少なくとも1つである、筋萎縮性側索硬化症の検出方法。 [4] miRNA in a sample collected from a subject, or includes the step of measuring the gene product of the target gene, wherein the miRNA is at least one of miRNA shown in Table 3 to Table 4, the target gene is Table at least one is, the detection method of amyotrophic lateral sclerosis of the target gene according to 7 table 8.
[5]神経変性疾患に対する治療を行った対象から試料を採取する工程、および前記試料中のmiRNA、又はその標的遺伝子の遺伝子産物を測定する工程を含み、前記miRNAが表1〜表4に記載のmiRNAの少なくとも1つであり、前記標的遺伝子が表5〜表8に記載の標的遺伝子の少なくとも1つである、前記治療効果の判定方法。 [5] includes the steps of collecting a sample from a subject were treated for neurodegenerative diseases, and miRNA in the sample, or measuring the gene product of the target gene, wherein the miRNA is described in Table 1 to Table 4 at least one, and the said target gene is at least one of the target genes listed in tables 5 to 8, the determination method of the therapeutic effect of the miRNA.
[6]表1〜表4に記載のmiRNAの少なくとも1つの全長あるいは一部を有効成分とする医薬組成物。 [6] Table 1 to Table 4 Pharmaceutical compositions with at least one full-length or active ingredient portion of miRNA described.
[7]表1〜表4に記載のmiRNAの少なくとも1つを抑制するオリゴヌクレオチドを有効成分とする医薬組成物。 [7] Table 1 to Table 4 Pharmaceutical composition comprising, as an active ingredient, at least one of suppressing oligonucleotides miRNA described.
[8]多系統萎縮症又は筋萎縮性側索硬化症の治療用である、[6]又は[7]の医薬組成物。 [8] is for the treatment of multiple system atrophy or amyotrophic lateral sclerosis, the pharmaceutical composition of [6] or [7].
[9]表1〜4に記載したmiRNAの少なくとも1つの発現を指標とする、神経変性疾患の治療薬をスクリーニングする方法。 [9] Table 1-4 as an index the expression of at least one of miRNA described, a method of screening for therapeutic agents neurodegenerative diseases.
[10]表1〜4に記載したmiRNAの少なくとも1つの標的遺伝子の遺伝子産物を指標とする、神経変性疾患の治療薬をスクリーニングする方法。 [10] as an index the gene product of at least one target gene of miRNA described in Table 1-4, a method of screening for therapeutic agents neurodegenerative diseases.

本発明の検出方法によれば、簡便な遺伝子検査方法、又はタンパク質分析方法により、神経変性疾患、特に多系統萎縮症(MSA)又は筋萎縮性側索硬化症(ALS)を検出することができる。 According to the detection method of the present invention, it is possible to detect a simple genetic test methods, or by protein analysis methods, a neurodegenerative disease, in particular Multiple System Atrophy (MSA) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS) . また、本発明におけるmiRNA、又はその標的遺伝子の遺伝子産物を同疾患の検査診断並び治療に利用することができる。 Also, miRNA in the present invention, or the gene product of the target gene can be used for laboratory diagnosis alignment treatment of the disease. さらに、同疾患の治療薬となる化合物のスクリーニングに利用することができる。 Furthermore, it can be used for screening compounds comprising a therapeutic agent of the disease.

以下に特に記載すること以外は、本発明の検出方法・治療効果判定方法・治療方法・医薬組成物・治療薬のスクリーニング方法において、適宜、相互に参照することができる。 Except that specifically described below, in the detection method and therapeutic effect judging method, treating method, pharmaceutical composition or therapeutic drug screening method of the present invention, as appropriate, it can be referred to one another.
本発明の検出方法では、神経変性疾患、特には多系統萎縮症(MSA)又は筋萎縮性側索硬化症(ALS)を検出するバイオマーカーとして、表1〜表4に記載のmiRNA、あるいは、表5〜表8に記載の標的遺伝子の遺伝子産物(ポリペプチド又はメッセンジャーRNA(以下、mRNAと称する)、好ましくはポリペプチド)を使用することができる。 In the detection method of the present invention, the neurodegenerative disease, as biomarkers particularly for detecting the multiple system atrophy (MSA) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS), miRNA set forth in Table 1 to Table 4 or, gene product of the target gene according to tables 5 8 (a polypeptide or messenger RNA (hereinafter referred to as mRNA), preferably a polypeptide) may be used.
該miRNA又はその標的遺伝子の遺伝子産物は、単独で使用することもできるし、複数を使用することもできる。 The miRNA or gene product of the target gene can either be used alone, it is also possible to use multiple. 精度を高めるため複数を組み合わせて使用する方が好ましい。 It is preferable to use a combination of plural order to improve the accuracy. 具体的には、miRNA及び/又はその標的遺伝子の遺伝子産物を1〜20、好ましくは2〜10を組み合わせて利用することが望ましい。 Specifically, miRNA and / or gene product of the target gene 20, preferably it is desirable to utilize a combination of 2 to 10.
また、公知のmiRNA及び/又はその標的遺伝子の遺伝子産物を組み合わせて利用することもできる。 It is also possible to use a combination of known miRNA and / or gene product of the target gene.

後述の実施例において具体的実験データを示すとおり、MSA患者は健常者と比較して、表1のmiRNAが脳疾患部位にて増大、かつ表2のmiRNAが減少しており、他方、ALS患者では表3のmiRNAが脳疾患部位において健常者に比べて増大、かつ表4のmiRNAが減少している。 As showing specific experimental data in Examples below, MSA patients compared to healthy subjects, increased miRNA shown in Table 1 at a brain disease site, and have miRNA shown in Table 2 is reduced, while, ALS patients in increased compared to healthy subjects miRNA in Table 3 in the brain disease site, and miRNA in Table 4 is reduced. 従って、被験者、特に、神経変性疾患が疑われる患者又は神経変性疾患患者から採取した臓器組織、細胞、血液、脳脊髄液、唾液、涙液等の試料中のこれらのmiRNA(以下、それぞれ、MSA又はALS検出用miRNAと称する)の少なくとも1つを、それ自体公知の方法に従って測定することにより、MSA又はALSであるか否かを判定することができる。 Thus, the subject, in particular, organ tissues neurodegenerative diseases taken from the patient or neurodegenerative disease patients suspected cells, blood, cerebrospinal fluid, saliva, these miRNA in a sample tear like (hereinafter, respectively, MSA or referred to as ALS detecting miRNA at least one of), by measuring in accordance with methods known per se, it is possible to determine whether the MSA or ALS. 特に、脳疾患部位(MSA患者であれば小脳病巣部位等、ALS患者であれば脳運動野病巣部位等)やその周辺部位(脳脊髄液等)を試料とすることが好ましい。 In particular, the brain disease site (if MSA patients cerebellar disease site or the like, if ALS patients brain motor cortex lesion sites, etc.) and it is preferable to surrounding sites (cerebrospinal fluid, etc.) and the sample.
また、減少したmiRNAの全部または一部を医薬組成物として投与し、miRNAを補充すること、あるいは増大したmiRNAを減少させる作用の有するオリゴヌクレオチド類の核酸医薬を投与し、過剰なmiRNAの作用を抑制することは、いずれもMSA又はALSの治療に有用な薬剤を提供する。 Moreover, administration of all or part of reduced miRNA as a pharmaceutical composition, to replenish the miRNA, or by administering a nucleic acid medicament oligonucleotides having the effect of reducing the increased miRNA, the effects of excess miRNA suppressing are both provide useful agents for the treatment of MSA or ALS.

存在率が増大しているmiRNAの場合は、より好ましい標的遺伝子では、その変化率(signal ratio)が高い傾向にある。 For miRNA the present rate is increasing, in a more preferred target genes, the rate of change (Signal ratio) tends to be higher. よって、変化率(Log2表記)が+0.1以上、好ましくは+0.5以上のmiRNAを神経変性疾患バイオマーカーとして使用することができる。 Therefore, the rate of change (Log2 notation) is +0.1 or more, can be preferably used a +0.5 or more miRNA as neurodegenerative disease biomarkers. 他方、存在率が減少しているmiRNAの場合は、より好ましい標的遺伝子では、その変化率(signal ratio)が低い傾向にある。 On the other hand, in the case of a miRNA existence ratio is decreased, in a more preferred target genes, the rate of change (Signal ratio) tends to be low. よって、変化率(Log2表記)が−0.5未満、好ましくは−1.0未満のmiRNAを神経変性疾患バイオマーカーとして使用することができる。 Thus, less than the rate of change (Log2 notation) is -0.5, preferably can be used miRNA less than -1.0 as a neurodegenerative disease biomarkers. ただし、変化率は測定条件によって変動する場合があるので、変化率の基準値によらず、変動幅の大きい順からバイオマーカーとなるmiRNAを選定することもできる。 However, since the rate of change can vary depending on measurement conditions, regardless of the reference value of the change rate, it is also possible to select the miRNA as a biomarker from descending order of the variation width. 表1〜表4のmiRNAの配列は公知のデータベース(miRBase:http://www.mirbase.org/)から入手することができる。 Tables 1-4 miRNA sequences known databases (miRBase: http: //www.mirbase.org/) can be obtained from.

前記MSAで増大したmiRNAの標的遺伝子候補で、遺伝子発現が抑制されていると推定される因子を表5に、MSAで減少したmiRNAの標的遺伝子候補で、遺伝子発現が増強されていると推定される因子を表6に示した(以下、これらをMSA検出用遺伝子産物と称する場合がある)。 In the target gene candidate miRNA was increased by the MSA, a factor that gene expression is estimated to be suppressed in Table 5, in the target gene candidate miRNA was reduced in MSA, is estimated that the gene expression is enhanced that factor are shown in Table 6 (hereinafter, sometimes these called MSA detecting gene product). これらの標的遺伝子でコードされる遺伝子産物(ポリペプチド又はmRNA、好ましくはポリペプチド)は、それ自体、MSAのバイオマーカーとして使用することができるだけでなく、MSA治療薬、または発症予防薬のターゲットとしても使用することができる。 Gene product encoded by these target genes (polypeptide or mRNA, preferably the polypeptide) itself, not only can be used as a biomarker of MSA, as a target for MSA treatment, or developing prophylactic it can also be used.

前記ALSで増大したmiRNAの標的遺伝子候補で、遺伝子発現が抑制されていると推定される因子を表7に、ALSで減少したmiRNAの標的遺伝子候補で、遺伝子発現が増強されていると推定される因子を表8に示す(以下、これらをALS検出用遺伝子産物と称する場合がある)。 In the target gene candidate miRNA was increased by the ALS, an agent that gene expression is estimated to be suppressed in Table 7, in the target gene candidate miRNA was decreased in ALS, is estimated that the gene expression is enhanced that factors shown in Table 8 (hereinafter, sometimes these is referred to as ALS detection gene product). これらの標的遺伝子でコードされる遺伝子産物(ポリペプチド又はmRNA、好ましくはポリペプチド)は、それ自体、ALS検出用のバイオマーカーとして使用することができるだけでなく、ALS治療薬または発症予防薬のターゲットとしても使用することができる。 These target genes encoded gene product in (polypeptide or mRNA, preferably the polypeptide) itself, not only can be used as a biomarker for ALS detection, of ALS therapeutic or onset prophylactic targets it can also be used as.

本発明の検出方法においてバイオマーカーとしてmiRNA又はその標的遺伝子のmRNAを使用する場合、それ自体公知の遺伝子検査方法、例えば、核酸プローブを用いるハイブリダイゼーション法や、PCRプライマーを用いるPCR法により、測定することができる。 When using mRNA of miRNA or target genes as biomarkers in the detection method of the present invention, known genetic testing method that, for example, a hybridization method using a nucleic acid probe by the PCR method using a PCR primer, measured be able to.
また、本発明の検出方法においてバイオマーカーとしてmiRNAの標的遺伝子がコードするポリペプチドを使用する場合、それ自体公知のタンパク質分析方法、例えば、抗体を用いる免疫学的分析方法、電気泳動等の生化学的分析方法や質量分析方法により実施することができ、臨床検査用の自動分析機を使用することもできる。 Also, when using a polypeptide target genes of miRNA as biomarker encoding in the detection method of the present invention, per se known protein analytical methods that, for example, immunoassay method using an antibody, biochemistry, such as electrophoresis analytical methods can be carried out by, mass spectrometry methods can also be used automatic analyzer for clinical examination.

本発明方法で用いる試料としては、例えば、脳疾患部位、脳脊髄液、血液試料(例えば、末梢血、血漿、血清)、唾液、涙液、尿、リンパ液、その他の体液、好ましくは、脳疾患部位やその周辺部位(脳脊髄液等)を用いることができる。 The samples used in the method of the present invention, for example, site brain disease, cerebral spinal fluid, blood sample (e.g., peripheral blood, plasma, serum), saliva, tears, urine, lymph, and other body fluids, preferably, brain disease can be used portion or its peripheral portion (cerebrospinal fluid, etc.). さらには生検で採取された臓器組織、病理組織、細胞、又はそれらからの抽出成分も利用できる。 Further organ tissues taken at biopsy, pathological tissue, cell, or extract component from them can also be used.

本発明の検出方法においてバイオマーカーとして用いる表1〜表4に記載のmiRNA、あるいは、表5〜表8に記載の標的遺伝子の遺伝子産物(ポリペプチド又はmRNA、好ましくはポリペプチド)は、神経変性疾患、特にはMSA又はALSの患者に対して行う各種治療の効果を判定するために使用することもできる。 miRNA shown in Table 1 to Table 4 to be used as a biomarker in the detection method of the present invention or the gene product of the target gene according to Tables 5 8 (polypeptide or mRNA, preferably polypeptides), neurodegeneration diseases, in particular can also be used to determine the effects of various treatments to be performed on the patient's MSA or ALS.
本発明の治療効果判定方法は、神経変性疾患に対する治療を行った対象から試料を採取する工程、および前記試料中のmiRNA又はその標的遺伝子の遺伝子産物を測定する工程を含む。 Therapeutic effect determination method of the present invention comprises the step of measuring steps taking a sample from a subject were treated for neurodegenerative diseases, and the miRNA or the gene product of the target gene in the sample.

本発明の治療効果判定方法において、MSA患者に対する治療効果を判定する場合には、表1又は表2に記載のMSA検出用miRNA、あるいは、表5又は表6に記載の標的遺伝子の遺伝子産物(ポリペプチド又はmRNA)を使用することができる。 In the therapeutic effect determination method of the present invention, when determining a therapeutic effect against MSA patients, MSA detecting miRNA described in Table 1 or Table 2 or the gene product of the target gene described in Table 5 or Table 6 ( can be used polypeptide or mRNA).
表1に記載のMSA検出用miRNA(MSA患者において存在率が増加しているmiRNA)をバイオマーカーとして用いる場合、当該治療を行う前のMSA患者では、そのmiRNA値が健常者よりも高い数値を示す傾向がある。 When using MSA detection miRNA according to Table 1 (miRNA that existence ratio is increased in MSA patients) as a biomarker, in MSA patients before performing the treatment, the miRNA value higher number than the healthy subjects They tend to show. 当該miRNA値が、治療を行うことにより低下した場合、その治療は効果があったと判定することができる。 If the miRNA value, decreased by performing treatment, it can be determined that the treatment was effective. 一方、治療を行っても低下しなかった場合には、その治療は効果がなかったと判定することができる。 If it does not decrease even if the treatment can be determined and their treatment had no effect.
また、表2に記載のMSA検出用miRNA(MSA患者において存在率が減少しているmiRNA)をバイオマーカーとして用いる場合、当該治療を行う前のMSA患者では、そのmiRNA値が健常者よりも低い数値を示す傾向がある。 Furthermore, when used as a biomarker for (miRNA that existence ratio is decreased in MSA patients) MSA detecting miRNA described in Table 2, the MSA patients before performing the treatment, the miRNA value is lower than in healthy persons there is a tendency to show a numerical value. 当該miRNA値が、治療を行うことにより増加した場合、その治療は効果があったと判定することができる。 If the miRNA value increased by performing the treatment, it can be determined that the treatment was effective. 一方、治療を行っても増加しなかった場合には、その治療は効果がなかったと判定することができる。 If it does not increase even if the treatment can be determined and their treatment had no effect.
ただし、miRNAは複数種で個々に標的遺伝子の発現制御を行っていることが推定されるので、個々のmiRNA値が協調的に変動せずともよく、臨床症状の状態を勘案して治療効果が判定される。 However, miRNA since it is estimated that performed individually control the expression of a target gene in multiple species may even individual miRNA values ​​do not cooperatively variation, therapeutic effect, taking into account the state of the clinical symptoms It is determined.

表5に記載のMSA検出用遺伝子産物(MSA患者において遺伝子発現が抑制されていると推定されるmiRNAの標的遺伝子の遺伝子産物)をバイオマーカーとして用いる場合、当該治療を行う前のMSA患者では、その発現量が健常者よりも低い数値を示すと推定される。 When using MSA detecting gene products described in Table 5 (the gene product of the target gene of the miRNA gene expression in MSA patients is estimated to be suppressed) as a biomarker, in MSA patients before performing the treatment, its expression level is estimated to show a lower value than the healthy subjects. 当該発現量が、治療を行うことにより増加した場合、その治療は効果があったと判定することができる。 If the amount of the expression was increased by performing the treatment, it can be determined that the treatment was effective. 一方、治療を行っても増加しなかった場合には、その治療は効果がなかったと判定することができる。 If it does not increase even if the treatment can be determined and their treatment had no effect.
表6に記載のMSA検出用遺伝子産物(MSA患者において遺伝子発現が増強されていると推定されるmiRNAの標的遺伝子の遺伝子産物)をバイオマーカーとして用いる場合、当該治療を行う前のMSA患者では、その発現量が健常者よりも高い数値を示すと推定される。 When using MSA detecting gene products listed in Table 6 (the gene product of the target gene miRNA gene expression in MSA patients is estimated to be enhanced) as a biomarker, in MSA patients before performing the treatment, its expression level is estimated to show a higher number than healthy individuals. 当該発現量が、治療を行うことにより低下した場合、その治療は効果があったと判定することができる。 If the amount of the expression was decreased by performing treatment, it can be determined that the treatment was effective. 一方、治療を行っても低下しなかった場合には、その治療は効果がなかったと判定することができる。 If it does not decrease even if the treatment can be determined and their treatment had no effect.

本発明の治療効果判定方法において、ALS患者に対する治療効果を判定する場合には、表3又は表4に記載のALS検出用miRNA、あるいは、表7又は表8に記載の標的遺伝子の遺伝子産物(ポリペプチド又はmRNA)を使用することができる。 In the therapeutic effect determination method of the present invention, when determining a therapeutic effect for ALS patients, Table 3 or ALS detection miRNA described in Table 4 or the gene product of the target gene according to Table 7 or Table 8 ( can be used polypeptide or mRNA).
表3に記載のALS検出用miRNA(ALS患者において存在率が増加しているmiRNA)をバイオマーカーとして用いる場合、当該治療を行う前のALS患者では、そのmiRNA値が健常者よりも高い数値を示す傾向がある。 When using ALS detection miRNA described in Table 3 (miRNA presence rate in ALS patients is increasing) as a biomarker, in ALS patients before performing the treatment, the miRNA value higher number than the healthy subjects They tend to show. 当該miRNA値が、治療を行うことにより低下した場合、その治療は効果があったと判定することができる。 If the miRNA value, decreased by performing treatment, it can be determined that the treatment was effective. 一方、治療を行っても低下しなかった場合には、その治療は効果がなかったと判定することができる。 If it does not decrease even if the treatment can be determined and their treatment had no effect.
また、表4に記載のALS検出用miRNA(ALS患者において存在率が減少しているmiRNA)をバイオマーカーとして用いる場合、当該治療を行う前のALS患者では、そのmiRNA値が健常者よりも低い数値を示す傾向がある。 Furthermore, when used as a biomarker for ALS detection miRNA (miRNA presence rate in ALS patients is reduced) described in Table 4, in ALS patients before performing the treatment, the miRNA value is lower than in healthy persons there is a tendency to show a numerical value. 当該miRNA値が、治療を行うことにより増加した場合、その治療は効果があったと判定することができる。 If the miRNA value increased by performing the treatment, it can be determined that the treatment was effective. 一方、治療を行っても増加しなかった場合には、その治療は効果がなかったと判定することができる。 If it does not increase even if the treatment can be determined and their treatment had no effect.
ただし、miRNAは複数種で個々に標的遺伝子の発現制御を行っていることが推定されるので、個々のmiRNA値が協調的に変動せずともよく、臨床症状の状態を勘案して治療効果が判定される。 However, miRNA since it is estimated that performed individually control the expression of a target gene in multiple species may even individual miRNA values ​​do not cooperatively variation, therapeutic effect, taking into account the state of the clinical symptoms It is determined.

表7に記載のALS検出用遺伝子産物(ALS患者において遺伝子発現が抑制されていると推定されるmiRNAの標的遺伝子の遺伝子産物)をバイオマーカーとして用いる場合、当該治療を行う前のALS患者では、その発現量が健常者よりも低い数値を示すと推定される。 When using ALS detecting gene products described in Table 7 (the gene product of the target gene of the miRNA gene expression in ALS patients is estimated to be suppressed) as a biomarker, in ALS patients before performing the treatment, its expression level is estimated to show a lower value than the healthy subjects. 当該発現量が、治療を行うことにより増加した場合、その治療は効果があったと判定することができる。 If the amount of the expression was increased by performing the treatment, it can be determined that the treatment was effective. 一方、治療を行っても増加しなかった場合には、その治療は効果がなかったと判定することができる。 If it does not increase even if the treatment can be determined and their treatment had no effect.
表8に記載のALS検出用遺伝子産物(ALS患者において遺伝子発現が増強されていると推定されるmiRNAの標的遺伝子の遺伝子産物)をバイオマーカーとして用いる場合、当該治療を行う前のALS患者では、その発現量が健常者よりも高い数値を示すと推定される。 When using ALS detecting gene products described in Table 8 (the gene product of the target gene of miRNA which is presumed to gene expression in ALS patients is enhanced) as a biomarker, in ALS patients before performing the treatment, its expression level is estimated to show a higher number than healthy individuals. 当該発現量が、治療を行うことにより低下した場合、その治療は効果があったと判定することができる。 If the amount of the expression was decreased by performing treatment, it can be determined that the treatment was effective. 一方、治療を行っても低下しなかった場合には、その治療は効果がなかったと判定することができる。 If it does not decrease even if the treatment can be determined and their treatment had no effect.

本発明の治療方法では、神経変性疾患、特にはMSA又はALSで存在率が減少している表2又は表4に記載のmiRNAの全長又は一部を用いて、あるいは、当該疾患で存在率が増加している表1又は表3に記載のmiRNAに対する抑制性オリゴヌクレオチドを用いて、神経変性疾患を治療することができる。 In the treatment method of the present invention, a neurodegenerative disease, in particular by using the entire length or a part of the miRNA shown in Table 2 or Table 4 ratio present in MSA or ALS is reduced, or the existence ratio in the disease with inhibitory oligonucleotide against miRNA shown in Table 1 or Table 3 are increased, it is possible to treat neurodegenerative diseases. また、miRNAの標的遺伝子の遺伝子発現が抑制されている神経変性疾患患者では、その遺伝子産物を補充することにより、逆に、遺伝子発現が増強されている神経変性疾患患者では、その遺伝子産物の発現又は活性を抑制することにより、神経変性疾患を治療することができる。 Further, the neurodegenerative disease patients gene expression of a target gene of miRNA is inhibited, by replenishing the gene product, conversely, the neurodegenerative disease patients gene expression is enhanced, the expression of the gene product or by inhibiting the activity, it can be used to treat neurodegenerative diseases. なお、本明細書において、用語「治療」には、疾患発症後の患者を処置する狭義の「治療」と、疾患発症前の患者を処置する「予防」が含まれる。 In this specification, the term "treatment", "treatment" in the narrow sense of treating a patient after the onset of the disease, includes "prophylaxis" treating patients before disease onset.

表2又は表4に記載のmiRNAの少なくとも1つが減少している神経変性疾患患者(特には、表2に記載のmiRNAの少なくとも1つが減少しているMSA患者、又は表4に記載のmiRNAの少なくとも1つが減少しているALS患者)では、その減少しているmiRNAを患者に補充することにより、神経変性疾患を治療することができる。 Table 2 or at least one neurodegenerative disease patients decreased miRNA shown in Table 4 (in particular, MSA patients at least one of miRNA shown in Table 2 which has decreased, or the miRNA shown in Table 4 in ALS patients) at least one is decreased, by supplementing the miRNA that the decrease in the patient can be treated neurodegenerative diseases. miRNAを患者に投与する方法としては、それ自体公知の方法に従って実施することができ、miRNA又はその誘導体を、エキソソームを模倣したリポソームに封入する方法、コラーゲンとの複合体として徐放化させる方法、RNAの糖部分のO(酸素)をS(硫黄) で置き換えた4'−チオRNA化による化学修飾体の利用、オリゴヌクレオチドの糖の部分を2'−F、2'−O−メチル、2'−O−メトキシエチルに修飾した化学修飾体の利用、などで生体内において安定的に補充することができる。 How miRNA as administered to a patient can be carried out according to methods known per se, a miRNA or a derivative thereof, a method of encapsulating in liposomes that mimic exosomes for sustained release as a complex with collagen, of the sugar moiety of RNA O (oxygen) S use of chemical modifications by 4'-thio RNA reduction was replaced with (sulfur), portions 2'-F sugar oligonucleotide, 2'-O-methyl, 2 '-O- use of methoxyethyl chemical modifications which have been modified, it is possible to stably replenished in vivo like. 同時に、miRNAは複数分子で標的遺伝子を制御する可能性が高いため、上記の核酸補充法に関しても、複数の核酸カクテルによる補充を好んで用いることができる。 At the same time, miRNA has a high possibility of controlling the target gene in a plurality of molecules, also with reference to the above nucleic acid supplementation may be used in favor of supplementation by a plurality of nucleic acid cocktail.

一方、表1又は表3に記載のmiRNAの少なくとも1つが増加している神経変性疾患患者(特には、表1に記載のmiRNAの少なくとも1つが増加しているMSA患者、又は表3に記載のmiRNAの少なくとも1つが増加しているALS患者)では、その増加しているmiRNAを患者体内において抑制することにより、神経変性疾患を治療することができる。 On the other hand, the miRNA described in Table 1 or Table 3 is a neurodegenerative disease patients (especially at least one is increased, MSA patients at least one miRNA shown in Table 1, increasing, or according to Table 3 in ALS patients) at least one miRNA is increasing, the miRNA that the increase by suppressing the patient's body, it is possible to treat neurodegenerative diseases. 生体内のmiRNAを抑制する方法としては、それ自体公知の方法に従って実施することができ、例えば、対象miRNAの全長または一部とハイブリダイズ可能な相補的配列を含むオリゴヌクレオチド(アンチセンスオリゴヌクレオチド)を投与することによって行うことができる。 As a method of suppressing the miRNA in vivo can be carried out according to methods known per se, for example, oligonucleotides containing a full length or a portion capable of hybridizing complementary sequences of the target miRNA (antisense oligonucleotide) it can be carried out by administering the. この場合のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、エキソソームを模倣したリポソームに封入する方法、コラーゲンとの複合体として徐放化させる方法、RNAの糖部分のO(酸素)をS(硫黄)で置き換えた4'−チオRNA化による化学修飾体の利用、オリゴヌクレオチドの糖の部分を2'−F、2'−O−メチル、2'−O−メトキシエチルに修飾した化学修飾体の利用、などで生体内において安定的に補充することができる。 Antisense oligonucleotide in this case, a method of encapsulating in liposomes that mimics exosomes method for sustained release as a complex with collagen, 4 of the sugar moiety of RNA O (oxygen) was replaced by S (sulfur) ' - thio RNA use of chemical modifications by reduction, a moiety of the sugar of the oligonucleotide 2'-F, 2'-O- methyl, 2'-O-utilization of methoxyethyl the modified chemical modifications, in vivo, etc. it can be stably replenished in. 同時に、miRNAは複数分子で標的遺伝子を制御する可能性が高いため、上記の核酸補充法に関しても、複数の核酸カクテルによる補充を好んで用いることができる。 At the same time, miRNA has a high possibility of controlling the target gene in a plurality of molecules, also with reference to the above nucleic acid supplementation may be used in favor of supplementation by a plurality of nucleic acid cocktail.

本発明の医薬組成物は、神経変性疾患、特にMSA又はALSの治療に用いることができ、有効成分として、表2若しくは表4に記載のmiRNAの少なくとも1つ(その全長又は一部)、あるいは、表1若しくは表3に記載のmiRNAの少なくとも1つに対する抑制性オリゴヌクレオチドを含むことができ、所望により、製薬学的に許容される担体を更に含むことができる。 The pharmaceutical compositions of the present invention, a neurodegenerative disease, in particular can be used in the treatment of MSA or ALS, as active ingredient, at least one (the full length or a part) of the miRNA described in Table 2 or Table 4, or , can contain inhibitory oligonucleotide against at least one miRNA shown in Table 1 or Table 3, if desired, can further include a pharmaceutically acceptable carrier.
表2に記載のmiRNAの少なくとも1つ(その全長又は一部)、若しくはその誘導体、又は表1に記載のmiRNAの少なくとも1つに対する抑制性オリゴヌクレオチドを含む、本発明の医薬組成物は、MSA患者の治療に用いることができる。 At least one of the miRNA shown in Table 2 (the full length or a part), or a derivative thereof, or Table 1 including the inhibitory oligonucleotide against at least one miRNA described, the pharmaceutical compositions of the present invention, MSA it can be used to treat patients.
表4に記載のmiRNAの少なくとも1つ(その全長又は一部)、若しくはその誘導体、又は表3に記載のmiRNAの少なくとも1つに対する抑制性オリゴヌクレオチドを含む、本発明の医薬組成物は、ALS患者の治療に用いることができる。 Table 4 at least one of the miRNA described (its entire length or a part), or derivatives thereof, or in Table 3 including the inhibitory oligonucleotide against at least one miRNA described, the pharmaceutical compositions of the present invention, ALS it can be used to treat patients.

本発明の検出方法においてバイオマーカーとして用いる表1〜表4に記載のmiRNA、あるいは、その標的遺伝子でコードされる遺伝子産物(ポリペプチド又はmRNA、好ましくはポリペプチド)は、神経変性疾患、特にはMSA又はALSの治療薬をスクリーニングするために使用することができる。 miRNA shown in Table 1 to Table 4 to be used as a biomarker in the detection method of the present invention or the gene product encoded by the target gene (polypeptide or mRNA, preferably polypeptides), neurodegenerative diseases, in particular the MSA or ALS therapeutic agents can be used to screen.
本発明において、miRNAまたはその標的遺伝子の遺伝子産物を標的とする候補物質(例えば化合物)をスクリーニングする方法は、in vitroでは、直接標的に結合する候補物質を分光学的な変化で調べる方法や培養細胞に候補物質を暴露させて培養細胞中の標的(miRNAまたはその標的遺伝子の遺伝子産物)の発現を調べる方法などが適用され、さらにin vivoでは、モデル動物にて神経変性症状または神経変性病理像の改善を指標とした方法などが適用される。 In the present invention, a method of miRNA or screening a candidate substance (e.g., a compound) that the gene product of the target gene targeting, the in vitro, a method examines a candidate substance to bind directly to the target with spectroscopic changes culture and a method in which by exposing the candidate substance to a cell determine the expression of a target in the cultured cells (miRNA or gene product of the target gene) is applied, in further in vivo, neurodegenerative conditions or neurodegenerative pathological image in an animal model a method of improving as an indicator of apply.

例えば、本発明のスクリーニング方法の内、表5〜表8に記載の標的遺伝子でコードされるポリペプチドを利用する態様では、前記の各種in vitroアッセイ又はin vivoアッセイを用いて実施することができる。 For example, among the screening methods of the present invention, in an embodiment utilizing a polypeptide encoded by the target gene according to Table 5 to Table 8, it can be carried out using the various in vitro assays or in vivo assays . 本態様では、例えば、当該ポリペプチド又はそれを発現する細胞、組織、若しくは動物個体(特には非ヒト動物)と、候補物質とを接触させる工程、および前記候補物質とポリペプチドとの結合、前記ポリペプチドの発現量変化若しくは活性変化、又は動物固体における症状変化を分析する工程を含む方法により、実施することができる。 In this embodiment, for example, cells expressing the polypeptide or, tissue, or animal (particularly non-human animal) and, contacting the candidate substance, and the candidate binding of the substance and the polypeptide, wherein expression level changes or altered activity of the polypeptide, or by a method comprising the step of analyzing the condition change in the animal solids, may be implemented.

また、本発明のスクリーニング方法の内、表1〜表4に記載のmiRNA、又は表5〜表8に記載の標的遺伝子のmRNAの発現を指標とする態様では、例えば、候補物質を培養細胞、組織、又は動物個体(特には、非ヒト動物)に投与する工程、前記個体から試料を採取する工程、および前記試料中のmiRNA又はmRNAを測定する工程を含む方法により、実施することができる。 Among the screening methods of the present invention, in the embodiment as an index the expression of mRNA of a target gene according to miRNA or Tables 5 8, described in Table 1 to Table 4, for example, culturing a candidate substance cells, tissue, or animal (particularly a non-human animal) administering to the steps of collecting a sample from said individual, and by a method comprising the step of measuring the miRNA or mRNA in the sample can be carried out.

本発明のスクリーニング方法で評価する候補物質は、特に限定されるものではないが、各種化合物に加え、各種抽出物、例えば、微生物の培養上清、各種生物若しくはその組織由来の天然成分若しくは抽出物を挙げることができる。 Candidate substance evaluated in the screening methods of the present invention, but are not particularly limited, in addition to the various compounds, various extracts, for example, culture supernatants of microorganisms, various biological or natural ingredients or extracts of the tissue derived from it can be mentioned. また、使用する細胞は、組織から分離された培養細胞、樹立された培養細胞株、ES細胞、iPS細胞、Muse細胞などが、非ヒト動物においては、特定遺伝子のノックアウトあるいはノックインの処理を施したモデルマウス、モデルラットなどを挙げることができる。 Furthermore, cells used, isolated cultured cells from tissue, an established cultured cell lines, ES cells, iPS cells, Muse cells in non-human animals were subjected to treatment knockout or knock-specific gene mouse model, such as model rats can be mentioned.

本発明のスクリーニング方法において、表2又は表4に記載のmiRNAの少なくとも1つを測定する場合、そのmiRNA量を増加させることができる物質を神経変性疾患の治療薬の候補として選択することができる。 In the screening method of the present invention, when measuring at least one of the miRNA shown in Table 2 or Table 4, it is possible to select a substance which can increase the miRNA amount as a candidate therapeutic agent for neurodegenerative diseases . 特に、表2に記載のmiRNA量を増加させることができる物質はALS治療薬の候補として、また、表4に記載のmiRNA量を増加させることができる物質はMSA治療薬の候補として、選択することができる。 In particular, materials that can increase the miRNA amount described in Table 2 as a candidate for ALS therapeutic, also substances that can increase the miRNA amount described in Table 4 as a candidate for MSA treatment, select be able to.

一方、表1又は表3に記載のmiRNAの少なくとも1つを測定する場合、そのmiRNA量を減少させることができる物質を神経変性疾患の治療薬の候補として選択することができる。 On the other hand, when measuring at least one of the miRNA described in Table 1 or Table 3, it is possible to select a substance capable of reducing the miRNA amount as candidates for therapeutic agents for neurodegenerative diseases. 特に、表1に記載のmiRNA量を減少させることができる物質はALS治療薬の候補として、また、表3に記載のmiRNA量を減少させることができる物質はMSA治療薬の候補として、選択することができる。 In particular, materials that can reduce the miRNA amount described in Table 1 as a candidate for ALS therapeutic, also substances which can reduce the miRNA amount described in Table 3 as candidates for MSA treatment, select be able to.

また、表6又は表8に記載の標的遺伝子の遺伝子産物の少なくとも1つを測定する場合、その遺伝子産物の発現量又は活性を低下させることができる物質を神経変性疾患の治療薬の候補として選択することができる。 Also, when measuring at least one gene product of the target gene listed in Table 6 or Table 8, selecting a substance capable of reducing the expression level or activity of the gene product as a candidate therapeutic agent for neurodegenerative diseases can do. 特に、表6に記載の標的遺伝子の遺伝子産物の発現量又は活性を低下させることができる物質はALS治療薬の候補として、また、表8に記載の標的遺伝子の遺伝子産物の発現量又は活性を低下させることができる物質はMSA治療薬の候補として、選択することができる。 In particular, substances capable of reducing the expression level or activity of a target gene of a gene product listed in Table 6 as candidates for ALS therapeutic, also the expression level or activity of a target gene of a gene product listed in Table 8 substances capable of decreasing the candidates for MSA treatment can be selected.

一方、表5又は表7に記載の標的遺伝子の遺伝子産物の少なくとも1つを測定する場合、その遺伝子産物の発現量又は活性を増加させることができる物質を神経変性疾患の治療薬の候補として選択することができる。 On the other hand, when measuring at least one gene product of the target gene described in Table 5 or Table 7, selecting a substance capable of increasing the expression level or activity of the gene product as a candidate therapeutic agent for neurodegenerative diseases can do. 特に、表6に記載の標的遺伝子の遺伝子産物の発現量又は活性を増加させることができる物質はALS治療薬の候補として、また、表8に記載の標的遺伝子の遺伝子産物の発現量又は活性を増加させることができる物質はMSA治療薬の候補として、選択することができる。 In particular, substances capable of increasing the expression level or activity of a target gene of a gene product listed in Table 6 as candidates for ALS therapeutic, also the expression level or activity of a target gene of a gene product listed in Table 8 substance which can increase the candidates for MSA treatment can be selected.

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。 It will be specifically described below by way of examples the invention but are not intended to limit the scope of the present invention.

《実施例1:脳病変組織中のmiRNAの分析》 "Example 1: analysis of miRNA of brain lesions tissue"
確定診断された多系統萎縮症(MSA)患者の小脳病巣部位、確定診断された筋萎縮性側索硬化症(ALS)の患者の脳運動野病巣部位、及び健常対照群として健常者脳の正常部位を、剖検後に採取し、10%ホルマリンにて固定し、パラフィンにて包埋し、FFPE(ホルマリン固定パラフィン包埋)標本とした。 Confirmed diagnosed multiple system atrophy (MSA) patients cerebellar disease site, cerebral motor cortex lesion site in a patient's confirmed diagnosed amyotrophic lateral sclerosis (ALS), and normal healthy individuals brain as healthy controls the site collected after necropsy, fixed with 10% formalin, embedded in paraffin, and the FFPE (formalin-fixed paraffin-embedded) specimen. FFPE標本(5x5mm、5μm、2〜4枚)を材料とし、MSA患者5例、MSA健常対照3例、ALS患者3例、ALS健常対照3例の標本から、それぞれRNA抽出後、マイクロアレイによるmiRNA分析を行った。 FFPE specimen (5x5mm, 5 [mu] m, 2 to 4 pieces) and the material, five of MSA patients, MSA healthy controls three cases, 3 cases ALS patients, from a sample of ALS healthy controls three cases, after each RNA extraction, miRNA analysis by microarray It was carried out.

マイクロアレイは3D−geneチップ(東レ(株)製)を用い、メーカー指定のmiRNA抽出液並びにハイブリダイゼーション試薬セットとHuman miRNA Oligo chip(データベースmiRBase Release17.0から選定したヒト約1,800種のmiRNAプローブを搭載)で行い、対象群に対する患者群のシグナル強度の変化を求めた。 Microarrays using 3D-gene chips (manufactured by Toray Industries, Inc.), specified by the manufacturer miRNA extract and hybridization reagent set and Human miRNA Oligo Chip (human 1,800 species of miRNA probes were selected from the database miRBase Release17.0 performed in the mounting), it was determined the change of the signal intensity of the patients for control group.
miRNA増減の変化率を求め、健常対照に対して増大した上位20位のmiRNA「増大したmiRNA(upregulated miRNA)」、及び減少した上位30位のmiRNAを「減少したmiRNA(downregulated miRNA)」と規定した。 Defining rate of change in miRNA decrease, top 20 miRNA was increased relative to healthy control "increased miRNA (upregulated miRNA)", and a reduced upper position 30 miRNA and "reduced miRNA (downregulated miRNA)" did.

その結果として、表1〜表4に示す結果が得られた。 As a result, the results shown in Table 1 to Table 4 were obtained. 表1はMSA患者の小脳FFPE標本中で増大したmiRNA群であり、表2はMSA患者の小脳FFPE標本中で減少したmiRNA群である。 Table 1 is a miRNA group that has been increased in the cerebellum FFPE specimens of MSA patients, Table 2 is a miRNA group decreased in the cerebellum FFPE specimens of MSA patients. 表3はALS患者の脳運動野FFPE中で増大したmiRNA群であり、表4はALS患者の脳運動野FFPE中で減少したmiRNA群である。 Table 3 is a miRNA group increased in the brain motor cortex FFPE of ALS patients, Table 4 is a miRNA group that has been reduced in the brain motor cortex FFPE of ALS patients.
これらのmiRNA群は、それぞれの疾患の検査診断バイオマーカーあるいは治療のためのmiRNA情報として利用することができる。 These miRNA groups, can be utilized as a miRNA information for laboratory diagnostics biomarkers or treatment of each disease.

《実施例2:miRNAの標的遺伝子を特定する方法》 "Example 2: How to identify the target genes of miRNA"
実施例1で検出されたmiRNA群が生体内で制御する標的遺伝子群を特定するために、2段の解析法を用いた。 To detected miRNA group in Example 1 to identify the target genes that control in vivo, using a two-stage analysis.
まず、検出されたmiRNAリスト(前記表1〜表4)から標的遺伝子を推定するために、miRanda-mirSVRをベースにした解析ツールmicroRNA.org-Targets and Expression(http://www.microrna.org/microrna/home.do)にて、miRNA配列情報とのマッチングによる標的遺伝子候補をリストアップし(〜50種程度)、このうち、神経系に関連があると思われる10〜30種の因子を抽出した。 First, in order to estimate the target gene from the detected miRNA list (Table 1 to Table 4), analysis tools were based on miRanda-mirSVR microRNA.org-Targets and Expression (http://www.microrna.org at /Microrna/home.Do), lists target gene candidates by matching between the miRNA sequence information (50 or so), of which 10 to 30 kinds of factors appear to be related to the nervous system Extracted.
MSAで増大したmiRNAの標的遺伝子候補で、遺伝子発現が抑制されていると推定される因子を表5に、MSAで減少したmiRNAの標的遺伝子候補で、遺伝子発現が増強されていると推定される因子を表6に、ALSで増大したmiRNAの標的遺伝子候補で、遺伝子発現が抑制されていると推定される因子を表7に、ALSで減少したmiRNAの標的遺伝子候補で、遺伝子発現が増強されていると推定される因子を表8に示す。 In the target gene candidates for increased miRNA in MSA, factors that gene expression is estimated to be suppressed in Table 5, in the target gene candidate miRNA was reduced in MSA, it is estimated that the gene expression is enhanced the factors in Table 6, in the target gene candidate miRNA was increased in ALS, an agent that gene expression is estimated to be suppressed in Table 7, in the target gene candidate miRNA was decreased in ALS, gene expression is enhanced the factors are the estimated shown in Table 8.

なお、本明細書に記載のmiRNAは、先述したとおり、データベースmiRBase Release17.0から選定したヒト約1,800種のmiRNAプローブを搭載した市販の3D−geneチップ(東レ(株)製)を使用したため、データベースmiRBase Release17.0に基づいた名称(ID)を使用している。 Incidentally, miRNA described herein, as previously described, using a commercially available 3D-gene chip equipped with human 1,800 species of miRNA probes were selected from the database miRBase Release17.0 (manufactured by Toray Industries, Inc.) since the, using the name (ID) based on the database miRBase Release17.0. 本明細書に記載したmiRNAの名称と、データベースmiRBase(http://www.mirbase.org/)におけるAccession No.を表9〜表12に示す。 The name of the miRNA described herein, the Accession No. in the database miRBase (http://www.mirbase.org/) shown in Table 9 to Table 12.

本発明は、神経変性疾患の検査診断並びに治療に利用することができる。 The present invention can be utilized in laboratory diagnosis and treatment of neurodegenerative diseases. さらに、同疾患の治療薬となる化合物のスクリーニングに利用することができる。 Furthermore, it can be used for screening compounds comprising a therapeutic agent of the disease.

Claims (10)

  1. 被験者から採取した試料中のmiRNA、又はその標的遺伝子の遺伝子産物を測定する工程を含み、前記miRNAが表1〜表4に記載のmiRNAの少なくとも1つであり、前記標的遺伝子が表5〜表8に記載の標的遺伝子の少なくとも1つである、神経変性疾患の検出方法。 miRNA in a sample collected from a subject, or includes the step of measuring the gene product of the target gene, wherein the miRNA is at least one of miRNA shown in Table 1 to Table 4, 5 Table the target gene Table 8 is at least one of the target genes according to the detection method of neurodegenerative diseases.
  2. 表1〜表4に記載のmiRNAからなる群から選んだmiRNA、又は表5〜表8に記載の標的遺伝子からなる群から選んだ標的遺伝子の遺伝子産物である、神経変性疾患を検出するためのバイオマーカー。 Tables 1 4 miRNA selected from the group consisting of miRNA described, or a gene product of the target gene selected from the group consisting of the target genes listed in Tables 5 to 8, for detecting a neurodegenerative disease biomarkers.
  3. 被験者から採取した試料中のmiRNA、又はその標的遺伝子の遺伝子産物を測定する工程を含み、前記miRNAが表1〜表2に記載のmiRNAの少なくとも1つであり、前記標的遺伝子が表5〜表6に記載の標的遺伝子の少なくとも1つである、多系統萎縮症の検出方法。 miRNA in a sample collected from a subject, or includes the step of measuring the gene product of the target gene, wherein the miRNA is at least one of miRNA shown in Table 1 to Table 2, 5 table the target gene Table at least one is, the detection method of multiple system atrophy of the target gene according to 6.
  4. 被験者から採取した試料中のmiRNA、又はその標的遺伝子の遺伝子産物を測定する工程を含み、前記miRNAが表3〜表4に記載のmiRNAの少なくとも1つであり、前記標的遺伝子が表7〜表8に記載の標的遺伝子の少なくとも1つである、筋萎縮性側索硬化症の検出方法。 miRNA in a sample collected from a subject, or includes the step of measuring the gene product of the target gene, wherein the miRNA is at least one of miRNA described in Tables 3 4, 7 to table the target gene Table at least one is, the detection method of amyotrophic lateral sclerosis target gene described in 8.
  5. 神経変性疾患に対する治療を行った対象から試料を採取する工程、および前記試料中のmiRNA、又はその標的遺伝子の遺伝子産物を測定する工程を含み、前記miRNAが表1〜表4に記載のmiRNAの少なくとも1つであり、前記標的遺伝子が表5〜表8に記載の標的遺伝子の少なくとも1つである、前記治療効果の判定方法。 Includes a step of collecting a sample from a subject were treated for neurodegenerative diseases, and miRNA in the sample, or measuring the gene product of the target gene, wherein the miRNA is a miRNA set forth in Table 1 to Table 4 is at least one, the target gene is at least one of the target genes listed in tables 5 to 8, the determination method of the therapeutic effect.
  6. 表1〜表4に記載のmiRNAの少なくとも1つの全長あるいは一部を有効成分とする医薬組成物。 Tables 1-4 pharmaceutical composition, at least one full-length or active ingredient portion of miRNA described.
  7. 表1〜表4に記載のmiRNAの少なくとも1つを抑制するオリゴヌクレオチドを有効成分とする医薬組成物。 Tables 1-4 pharmaceutical composition comprising, as an active ingredient, at least one of suppressing oligonucleotides miRNA described.
  8. 多系統萎縮症又は筋萎縮性側索硬化症の治療用である、請求項6又は7に記載の医薬組成物。 It is for the treatment of multiple system atrophy or amyotrophic lateral sclerosis, the pharmaceutical composition according to claim 6 or 7.
  9. 表1〜4に記載したmiRNAの少なくとも1つの発現を指標とする、神経変性疾患の治療薬をスクリーニングする方法。 As an index the expression of at least one of miRNA set forth in Table 1-4, a method of screening for therapeutic agents neurodegenerative diseases.
  10. 表1〜4に記載したmiRNAの少なくとも1つの標的遺伝子の遺伝子産物を指標とする、神経変性疾患の治療薬をスクリーニングする方法。 An indicator gene products of at least one target gene of miRNA listed in Table 1-4, a method of screening for therapeutic agents neurodegenerative diseases.
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