JP2014083041A - Nucleic acid extraction apparatus - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、核酸抽出用装置に関する。 The present invention relates to an apparatus for nucleic acid extraction.
シリカ粒子等の核酸結合性固相担体とカオトロピック剤を用いて、生体材料からより簡便に核酸を抽出する方法が、Boomらにより報告された（非特許文献１参照）。このBoomらの方法を含め、シリカ等の核酸結合性固相担体とカオトロピック剤を用いて核酸を担体に吸着させ、抽出する方法は、主に、（１）カオトロピック剤存在下、核酸結合性固相担体に核酸を吸着させる工程（吸着工程）、（２）非特異的に結合した夾雑物及びカオトロピック剤を除くため、洗浄液にて核酸の吸着した担体を洗浄する工程（洗浄工程）、および（３）水または低塩濃度緩衝液にて核酸を担体から溶出させる工程（溶出工程）の３工程からなる。 Boom et al. Reported a method for more easily extracting nucleic acids from biomaterials using a nucleic acid-binding solid phase carrier such as silica particles and a chaotropic agent (see Non-Patent Document 1). Including the method of Boom et al., A method of adsorbing and extracting a nucleic acid on a carrier using a nucleic acid-binding solid phase carrier such as silica and a chaotropic agent mainly includes (1) a nucleic acid-binding solid phase in the presence of a chaotropic agent. A step of adsorbing nucleic acid to the phase carrier (adsorption step), (2) a step of washing the carrier adsorbed with nucleic acid with a washing solution (washing step) to remove non-specifically bound impurities and chaotropic agents, and ( 3) It consists of three steps of eluting nucleic acid from the carrier with water or a low salt concentration buffer (elution step).
本発明は、新規な核酸抽出用装置を提供することを目的とする。 An object of this invention is to provide the novel apparatus for nucleic acid extraction.
本発明の一実施形態の核酸抽出用装置は、第１のオイルからなる第１プラグ、オイルと相分離し、核酸が結合した核酸結合性固相担体を洗浄するための第１洗浄液からなる第２プラグ、第２のオイルからなる第３プラグ、オイルと相分離し、逆転写反応を行うための逆転写反応液からなる第４プラグ、第３のオイルからなる第５プラグ、オイルと相分離し、核酸が結合した核酸結合性固相担体から前記核酸を溶出するための溶出液からなる第６プラグ、第４のオイルからなる第７プラグ、を、この順で内部に備えたチューブと、前記チューブに前記核酸結合性固相担体を導入するためのタンクと、を備えた核酸抽出用器具と、前記チューブに磁力を印加するための磁力印加器具と、を備えた核酸抽出用装置である。 前記チューブの長手方向に沿って、前記チューブと前記磁力印加器具の位置関係を相対的に変化させるための磁力印加器具移動装置または核酸抽出用器具移動装置を備えてもよい。前記チューブの第４プラグ及び／又は第６プラグを加熱する位置に設けられた加熱装置をさらに備えてもよい。前記チューブが、第５プラグと第６プラグとの間に、第５プラグ側から順に、オイルと相分離し、核酸が結合した核酸結合性固相担体を洗浄するための第２洗浄液からなる洗浄液からなる第１０プラグ、及びオイルからなる第１１プラグ、を、さらに備えてもよい。前記溶出液が、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ及びＤＮＡポリメラーゼ用プライマーを含有してもよい。前記タンクと、前記チューブが着脱可能であってもよい。前記チューブの第７プラグ側の端が開放している開放端であって、前記開放端を封止する、着脱可能な栓をさらに有してもよい。前記タンクが、核酸を抽出するための試料を溶解するための溶解液を有してもよい。 An apparatus for nucleic acid extraction according to an embodiment of the present invention includes a first plug comprising a first oil, a first washing liquid for phase separation from the oil and washing a nucleic acid binding solid phase carrier to which nucleic acids are bound. 2 plug, 3rd plug made of 2nd oil, 4th plug made of reverse transcription reaction liquid for phase separation with oil and performing reverse transcription reaction, 5th plug made of 3rd oil, phase separation with oil A sixth plug made of an eluate for eluting the nucleic acid from the nucleic acid-binding solid phase carrier to which the nucleic acid is bound, and a seventh plug made of the fourth oil, in this order, A nucleic acid extraction apparatus comprising: a nucleic acid extraction instrument comprising: a tank for introducing the nucleic acid-binding solid phase carrier into the tube; and a magnetic force application instrument for applying a magnetic force to the tube. . A magnetic force applying device moving device or a nucleic acid extracting device moving device for relatively changing the positional relationship between the tube and the magnetic force applying device along the longitudinal direction of the tube may be provided. You may further provide the heating apparatus provided in the position which heats the 4th plug and / or 6th plug of the said tube. A washing liquid comprising a second washing liquid for washing the nucleic acid-binding solid phase carrier in which the tube is phase-separated from oil and is bound to the nucleic acid in order from the fifth plug side between the fifth plug and the sixth plug. A tenth plug made of and an eleventh plug made of oil may be further provided. The eluate may contain DNA polymerase, dNTP, and a primer for DNA polymerase. The tank and the tube may be detachable. The tube may further include a detachable plug that is an open end at which an end on the seventh plug side of the tube is open and seals the open end. The tank may have a lysing solution for dissolving a sample for extracting nucleic acid.
本発明によって、新規な核酸抽出用装置を提供することが可能になった。 The present invention has made it possible to provide a novel nucleic acid extraction apparatus.
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、M. R. Green & J. Sambrook (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (4th edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2012); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。 Unless otherwise stated in the embodiments and examples, MR Green & J. Sambrook (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (4th edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2012 ); Described in standard protocol collections such as FM Ausubel, R. Brent, RE Kingston, DD Moore, JG Seidman, JA Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd. Or a modified or modified method thereof. In addition, when using commercially available reagent kits and measuring devices, unless otherwise explained, protocols attached to them are used.
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。 The objects, features, advantages, and ideas of the present invention will be apparent to those skilled in the art from the description of the present specification, and those skilled in the art can easily reproduce the present invention from the description of the present specification. it can. The embodiments and specific examples of the invention described below show preferred embodiments of the present invention, and are shown for illustration or explanation. It is not limited. It will be apparent to those skilled in the art that various modifications and variations can be made based on the description of the present specification within the spirit and scope of the present invention disclosed herein.
＝＝核酸抽出用器具＝＝
（１）タンク
本発明の核酸抽出用器具は、単数または複数のチューブに核酸結合性固相担体を導入するためのタンクを備える。
== Nucleic acid extraction instrument ==
(1) Tank The nucleic acid extraction instrument of the present invention comprises a tank for introducing a nucleic acid-binding solid phase carrier into one or a plurality of tubes.
タンクは、内部に液体を収容することができ、外部から内部に物質を導入できる開口を有する。タンクにおける開口の位置は特に限定されず、開口を複数有してもよい。開口には、着脱可能な蓋を有していてもよい。 The tank can store liquid inside and has an opening through which a substance can be introduced from the outside to the inside. The position of the opening in the tank is not particularly limited, and a plurality of openings may be provided. The opening may have a detachable lid.
タンクの内容積は、特に限定されないが、例えば、０．１ｍＬ以上１００ｍＬ以下とすることができる。タンクの材質は、特に限定されないが、例えば、ガラス、プラスティックなどの樹脂、金属などとすることができる。特に、タンクの材質として透明なガラスや樹脂を選択すると、タンクの外部から内部を観察することができるので、より好ましい。なお、タンクと各チューブは、一体成形されていても、着脱可能になっていても構わない。タンクの材質にゴム、エラストマー、高分子等の可とう性を有するものを利用すると、タンクに蓋を装着した状態で、タンクを変形させることにより、タンクの内部を加圧することができる。それにより、チューブの内部から外部へと、チューブの先端側からチューブの内容物を押し出すことができる。 Although the internal volume of a tank is not specifically limited, For example, it can be 0.1 mL or more and 100 mL or less. Although the material of a tank is not specifically limited, For example, it can be set as resin, metals, etc., such as glass and a plastics. In particular, when transparent glass or resin is selected as the material of the tank, it is more preferable because the inside can be observed from the outside of the tank. The tank and each tube may be integrally formed or detachable. When a flexible material such as rubber, elastomer, or polymer is used as the material of the tank, the inside of the tank can be pressurized by deforming the tank with the lid attached to the tank. Thereby, the content of the tube can be pushed out from the distal end side of the tube from the inside to the outside of the tube.
また、タンクは、核酸を抽出するための試料を溶解するための溶解液を有しているのが好ましく、チューブとともに振とうすることができ、タンク内の液体を十分に撹拌することができる。 The tank preferably has a lysing solution for dissolving a sample for extracting nucleic acid, can be shaken with the tube, and can sufficiently agitate the liquid in the tank.
溶解液は、カオトロピック物質を含有すれば特に限定されないが、細胞膜の破壊あるいは細胞中に含まれるタンパク質を変性させる目的で界面活性剤を含有させてもよい。この界面活性剤としては、一般に細胞等からの核酸抽出に使用されるものであれば特に限定されないが、具体的には、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘなどのトリトン系界面活性剤やＴｗｅｅｎ２０などのツイーン系界面活性剤のような非イオン性界面活性剤、Ｎ‐ラウロイルサルコシンナトリウム（ＳＤＳ）等の陰イオン性界面活性剤が挙げられるが、特に非イオン性界面活性剤を、０．１〜２％の範囲となるように使用するのが好ましい。さらに、溶解液には、２−メルカプトエタノールあるいはジチオスレイトール等の還元剤を含有させることが好ましい。溶解液は、緩衝液であってもよいが、ｐＨ６〜８の中性であることが好ましい。これらのことを考慮し、具体的には、３〜７Ｍのグアニジン塩、０〜５％の非イオン性界面活性剤、０〜０．２ｍＭのＥＤＴＡ、０〜０．２Ｍの還元剤などを含有することが好ましい。 The lysing solution is not particularly limited as long as it contains a chaotropic substance, but it may contain a surfactant for the purpose of breaking the cell membrane or denaturing proteins contained in the cells. The surfactant is not particularly limited as long as it is generally used for nucleic acid extraction from cells or the like. Specifically, a Triton surfactant such as Triton-X or a tween surfactant such as Tween 20 is used. And nonionic surfactants such as N-lauroyl sarcosine sodium (SDS), and particularly nonionic surfactants in the range of 0.1 to 2%. It is preferable to use it as follows. Furthermore, it is preferable that the solution contains a reducing agent such as 2-mercaptoethanol or dithiothreitol. The lysis solution may be a buffer solution, but is preferably neutral at pH 6-8. In consideration of these matters, specifically, it contains 3 to 7 M guanidine salt, 0 to 5% nonionic surfactant, 0 to 0.2 mM EDTA, 0 to 0.2 M reducing agent and the like. It is preferable to do.
カオトロピック物質は、水溶液中でカオトロピックイオン（イオン半径の大きな１価の陰イオン）を生じ、疎水性分子の水溶性を増加させる作用を有しており、核酸の固相担体への吸着に寄与するものであれば、特に限定されない。具体的には、グアニジンチオシアン酸塩、グアニジン塩酸塩、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、過塩素酸ナトリウム等が挙げられるが、これらのうち、タンパク質変成作用の強いグアニジンチオシアン酸塩またはグアニジン塩酸塩が好ましい。これらのカオトロピック物質の使用濃度は、各物質により異なり、例えば、グアニジンチオシアン酸塩を使用する場合には、３〜５．５Ｍの範囲で、グアニジン塩酸塩を使用する場合は、５Ｍ以上で使用するのが好ましい。 A chaotropic substance generates chaotropic ions (monovalent anions having a large ionic radius) in an aqueous solution and has an action of increasing the water solubility of hydrophobic molecules, contributing to adsorption of nucleic acids to a solid phase carrier. If it is a thing, it will not specifically limit. Specific examples include guanidine thiocyanate, guanidine hydrochloride, sodium iodide, potassium iodide, sodium perchlorate and the like. Among these, guanidine thiocyanate or guanidine hydrochloride having a strong protein-denaturing action is used. preferable. The concentration of these chaotropic substances used varies depending on each substance. For example, when guanidine thiocyanate is used, it is in the range of 3 to 5.5M, and when guanidine hydrochloride is used, it is used at 5M or more. Is preferred.
チューブを重力の方向と平行になるように設置したとき、タンクはチューブの上方に位置するように構成される。タンクの中に試料を入れ、振とうした上で、再度、チューブを重力の方向と平行になるように設置する。タンク内には、溶解液以外に、空間を残しておくのが好ましい。それによって、この核酸抽出用器具を逆さまにしたりして軽く振とうするだけで、タンク内の液体を、容易に混ぜることができるからである。 When the tube is installed so as to be parallel to the direction of gravity, the tank is configured to be positioned above the tube. Place the sample in the tank, shake it, and place the tube again in parallel with the direction of gravity. It is preferable to leave a space in the tank in addition to the solution. This is because the liquid in the tank can be easily mixed by simply shaking the nucleic acid extraction instrument upside down and shaking it lightly.
チューブが複数ある場合は、チューブが重力の方向と平行になるように設置されたとき、全て同じ高さで平行に並ぶように構成されている。タンクは、核酸結合性固相担体を含む液体を各チューブに分配するための液体分配部を備え、核酸結合性固相担体を含む液体をタンクに入れると、液体は液体分配部で核酸結合性固相担体とともに分配され、核酸結合性固相担体が、液体を介して、各チューブに入っていく様に構成されている。液体分配部は、各チューブに連通する空間を隔てる隔壁を有してもよい。この隔壁によって、チューブごとに、各チューブと連続するタンクの底面を区切ることが可能になる。そして、底面が重力の方向に垂直に広がり、隔壁が底面に対し垂直であれば、各チューブに繋がる底面の面積の比が、各チューブに分配される核酸結合性固相担体の比と一致する。例えば、各チューブに繋がる底面の面積が等しければ、各チューブに分配される核酸結合性固相担体も等しく分配される。タンクの中に試料を入れ、振とうした上で、再度、チューブを重力の方向と平行になるように設置すると、この設置状態で、タンク内の液体を隔壁より高くすることができる。これによって、複数のチューブに均等に液体が流れるようにできる。 When there are a plurality of tubes, all the tubes are arranged in parallel at the same height when installed so as to be parallel to the direction of gravity. The tank has a liquid distribution part for distributing the liquid containing the nucleic acid-binding solid phase carrier to each tube, and when the liquid containing the nucleic acid-binding solid phase carrier is put into the tank, the liquid is nucleic acid-binding in the liquid distribution part. The nucleic acid-binding solid phase carrier is distributed together with the solid phase carrier, and is configured to enter each tube via the liquid. The liquid distribution unit may have a partition that separates a space communicating with each tube. With this partition wall, the bottom surface of the tank continuous with each tube can be separated for each tube. If the bottom surface extends perpendicularly to the direction of gravity and the partition wall is perpendicular to the bottom surface, the ratio of the area of the bottom surface connected to each tube matches the ratio of the nucleic acid binding solid phase carriers distributed to each tube. . For example, if the area of the bottom surface connected to each tube is equal, the nucleic acid binding solid phase carrier distributed to each tube is equally distributed. If the sample is put in the tank, shaken, and the tube is installed again so as to be parallel to the direction of gravity, the liquid in the tank can be made higher than the partition wall in this installed state. As a result, the liquid can flow evenly through the plurality of tubes.
核酸結合性固相担体は、カオトロピックイオンの存在下で、核酸を吸着すなわち可逆的な物理的結合により保持することができる親水性表面を有する固体であれば、特に限定されない。具体的には、二酸化珪素を含有する物質、例えば、シリカ、ガラス、珪藻土、あるいはこれらを化学的修飾により表面処理を施したものが好ましく、磁性体や超常磁性金属酸化物等との複合体がより好ましい。化学的修飾により表面処理を施す場合は、核酸との可逆的な結合を妨げない程度に、適度な陽性電荷を帯びさせてもよい。 The nucleic acid-binding solid phase carrier is not particularly limited as long as it is a solid having a hydrophilic surface capable of adsorbing nucleic acid in the presence of chaotropic ions, that is, holding the nucleic acid by reversible physical binding. Specifically, a substance containing silicon dioxide, for example, silica, glass, diatomaceous earth, or those subjected to surface treatment by chemical modification is preferable, and a complex with a magnetic substance or a superparamagnetic metal oxide is used. More preferred. When surface treatment is performed by chemical modification, an appropriate positive charge may be imparted to the extent that reversible binding to nucleic acids is not hindered.
また、これらの核酸結合性固相の形態としては、塊、粒子、粉体等が具体的に挙げられるが、特に限定されない。これらのうち、吸着と溶出の効率を考慮すると粒子の形態がより好ましい。その場合の粒径は特に限定されないが、０．０５〜５００μｍであってもよく、好ましくは１〜１００μｍであり、特に好ましくは１〜１０μｍである。 In addition, examples of the form of these nucleic acid-binding solid phases include lumps, particles, powders and the like, but are not particularly limited. Among these, the particle form is more preferable in consideration of the efficiency of adsorption and elution. The particle size in that case is not particularly limited, but may be 0.05 to 500 μm, preferably 1 to 100 μm, and particularly preferably 1 to 10 μm.
核酸結合性固相担体は、溶解液より密度が大きい方が好ましい。例えば、分散液の密度が１．１〜１．２ｇ／ｍＬであれば、核酸結合性固相担体の密度は、１．５〜２．０ｇ／ｍＬなどとすればよい。 The nucleic acid-binding solid phase carrier preferably has a higher density than the lysate. For example, if the density of the dispersion is 1.1 to 1.2 g / mL, the density of the nucleic acid-binding solid phase carrier may be 1.5 to 2.0 g / mL.
（２）チューブ
本発明の核酸抽出用器具は、第１のオイルからなる第１プラグ、オイルと相分離し、核酸が結合した核酸結合性固相担体を洗浄するための第１洗浄液からなる第２プラグ、第２のオイルからなる第３プラグ、オイルと相分離し、逆転写反応を行うための逆転写反応液からなる第４プラグ、第３のオイルからなる第５プラグ、オイルと相分離し、核酸が結合した核酸結合性固相担体から核酸を溶出するための溶出液からなる第６プラグ、および第４のオイルからなる第７プラグを、この順で内部に備える、単数のチューブ、または平行に配置された、同様の形状を有する複数のチューブと、を備える。チューブが複数の場合、お互いに平行に配置されさえすれば、全体には、直線上に配置されても、環状に配置されても構わない。直線上の配置は、複数のチューブを全体に同時に制御しやすくするが、環状の配置は、器具全体の小型化を可能にする。ここで、プラグとは、チューブ内において、一種類の液体が一区画を占める場合の液体を指すものとする。
(2) Tube The nucleic acid extraction instrument of the present invention comprises a first plug comprising a first oil, a first washing liquid for phase separation from the oil and washing the nucleic acid binding solid phase carrier to which the nucleic acid is bound. 2 plug, 3rd plug made of 2nd oil, 4th plug made of reverse transcription reaction liquid for phase separation with oil and performing reverse transcription reaction, 5th plug made of 3rd oil, phase separation with oil A single tube having a sixth plug consisting of an eluate for eluting nucleic acid from a nucleic acid-binding solid phase carrier to which the nucleic acid is bound, and a seventh plug consisting of a fourth oil in this order, Or a plurality of tubes having the same shape and arranged in parallel. In the case where there are a plurality of tubes, as long as they are arranged in parallel to each other, they may be arranged on a straight line or in an annular shape as a whole. The linear arrangement makes it easy to control a plurality of tubes simultaneously at the same time, but the annular arrangement allows the entire instrument to be miniaturized. Here, the plug refers to a liquid when one kind of liquid occupies one section in the tube.
チューブは、内部に空洞を有し、液体を長手方向に流通させることのできる筒状の形状を有するものであって、キャピラリーと呼ばれるものであってもよい。チューブは、長手方向に、屈曲してもよいが、直線状であるのが好ましい。チューブの内部の空洞は、液体がチューブ内でプラグの形状を維持できれば、大きさ、形状ともに特に限定されない。また、チューブ内の空洞の大きさや、長手方向に対して垂直な断面の形状は、チューブの長手方向に沿って、一定であることが好ましいが、変化していてもよい。 The tube has a hollow shape inside and has a cylindrical shape that allows the liquid to flow in the longitudinal direction, and may be called a capillary. The tube may be bent in the longitudinal direction, but is preferably linear. The cavity inside the tube is not particularly limited in size and shape as long as the liquid can maintain the shape of the plug in the tube. Further, the size of the cavity in the tube and the shape of the cross section perpendicular to the longitudinal direction are preferably constant along the longitudinal direction of the tube, but may vary.
チューブの外形の長手方向に垂直な断面の形状も限定されないが、円であるか、円に近い楕円であることが好ましい。チューブの肉厚（内部の空洞の側面から外部の表面までの長さ）も特に限定されないが、均一であることが好ましい。チューブが円筒状の場合、その内径（内部の空洞の長手方向に垂直な断面における円の直径）は、例えば、０．５ｍｍ以上３ｍｍ以下とすることができる。チューブの内径がこの範囲であると、チューブの材質、液体の種類において広範な範囲で液体のプラグを形成しやすい。 The shape of the cross section perpendicular to the longitudinal direction of the outer shape of the tube is not limited, but is preferably a circle or an ellipse close to a circle. The wall thickness of the tube (the length from the side surface of the internal cavity to the external surface) is not particularly limited, but is preferably uniform. When the tube is cylindrical, the inner diameter (the diameter of a circle in a cross section perpendicular to the longitudinal direction of the internal cavity) can be, for example, 0.5 mm or more and 3 mm or less. When the inner diameter of the tube is in this range, it is easy to form a liquid plug in a wide range of tube materials and liquid types.
チューブの材質は、特に限定されないが、例えば、ガラス、プラスティックなどの樹脂、金属などとすることができる。特に、チューブの材質として透明なガラスや樹脂を選択すると、チューブの外部から空洞内を観察することができるので、より好ましい。また、チューブの材質に、磁力を透過する物質や非磁性体を選択すると、チューブに磁性粒子を通過させる場合などに、チューブの外部から磁力を与えることによってこれを行うことが容易化されるため好ましい。なお、チューブの材質は、タンクの材質と同じにしても構わない。 Although the material of a tube is not specifically limited, For example, it can be set as resin, metals, such as glass and a plastic. In particular, when transparent glass or resin is selected as the material of the tube, it is more preferable because the inside of the cavity can be observed from the outside of the tube. In addition, if a material that transmits magnetic force or a non-magnetic material is selected as the material of the tube, this can be facilitated by applying magnetic force from the outside of the tube when passing magnetic particles through the tube. preferable. The tube material may be the same as the tank material.
チューブの第７プラグ側の端は、開放している開放端であってもよいが、開放端を封止する、着脱可能な栓をさらに有することが好ましい。栓は、例えば、ゴムやエラストマー、樹脂等により作製することができる。栓は脱着自在であるが、その機構は特に限定されない。例えば、栓の一部がチューブ部の内部に挿入されて固定されてもよく、栓はキャップ状であってもよい。 The end of the tube on the seventh plug side may be an open end that is open, but preferably further has a detachable plug that seals the open end. The stopper can be made of, for example, rubber, elastomer, resin, or the like. The stopper is detachable, but the mechanism is not particularly limited. For example, a part of the stopper may be inserted and fixed inside the tube portion, and the stopper may be cap-shaped.
プラグの中やプラグ間には、気泡や他の液体がないことが好ましいが、核酸結合性固相担体がプラグを通過できる限りにおいて、気泡や他の液体が存在してもよい。 It is preferable that there are no bubbles or other liquids in or between the plugs, but bubbles or other liquids may exist as long as the nucleic acid-binding solid phase carrier can pass through the plug.
オイルからなるプラグは、その両側の水溶性のプラグが互いに混合することを抑制する機能を有する。 The plug made of oil has a function of preventing the water-soluble plugs on both sides from mixing with each other.
オイルは、より高粘度なオイルにすることによって、上側のプラグとの界面で、核酸結合性固相担体を移動させる場合に、オイルによる「ぬぐい効果」を高めることができる。これにより、上側のプラグから、オイルからなるプラグに核酸結合性固相担体を移動させた場合に、核酸結合性固相担体に付着した水溶性の成分をオイル内に、より持ち込まれにくくすることができる。 By making the oil more viscous, the “wiping effect” by the oil can be enhanced when the nucleic acid-binding solid phase carrier is moved at the interface with the upper plug. As a result, when the nucleic acid-binding solid phase carrier is moved from the upper plug to the plug made of oil, water-soluble components attached to the nucleic acid-binding solid phase carrier are made less likely to be brought into the oil. Can do.
チューブの長手方向に対する、オイルからなるプラグの長さは、プラグが形成可能な範囲であれば、いずれも特に限定されないが、具体的には、１ｍｍ以上５０ｍｍ以下であってもよく、核酸結合性固相担体の移動距離を大きくしすぎないように、１ｍｍ以上３０ｍｍ以下が好ましく、５ｍｍ以上２０ｍｍ以下がさらに好ましい。 The length of the plug made of oil with respect to the longitudinal direction of the tube is not particularly limited as long as the plug can be formed. Specifically, the length of the plug may be 1 mm or more and 50 mm or less. 1 mm or more and 30 mm or less is preferable and 5 mm or more and 20 mm or less is more preferable so that the moving distance of the solid phase carrier is not excessively increased.
第２プラグは、チューブ内の第１プラグと第３プラグとの間の位置に配置され、第１洗浄液からなる。 The second plug is disposed at a position between the first plug and the third plug in the tube and is made of the first cleaning liquid.
第１洗浄液は、第１プラグを構成するオイル及び第３プラグを構成するオイルのいずれとも混和しない液体である。第１洗浄液は、エタノールやイソプロピルアルコール等の有機溶媒およびカオトロピック物質を事実上含まない溶液であれば特に限定されないが、水または低塩濃度水溶液であることが好ましく、低塩濃度水溶液の場合、緩衝液であることが好ましい。低塩濃度水溶液の塩濃度は、１００ｍＭ以下が好ましく、５０ｍＭ以下がより好ましく、１５ｍＭ以下が最も好ましい。また、低塩濃度水溶液の下限は特に無いが、０．１ｍＭ以上であることが好ましく、１ｍＭ以上であることがさらに好ましく、１０ｍＭ以上であることが最も好ましい。また、この溶液はＴｒｉｔｏｎ、Ｔｗｅｅｎ、ＳＤＳなどの界面活性剤を含有しても良く、ｐＨは特に限定されない。緩衝液にするための塩は特に限定されないが、トリス、ヘペス、ピペス、リン酸などの塩が好ましく用いられる。 The first cleaning liquid is a liquid that is immiscible with either the oil constituting the first plug or the oil constituting the third plug. The first cleaning solution is not particularly limited as long as it is a solution that does not substantially contain an organic solvent such as ethanol or isopropyl alcohol and a chaotropic substance, but is preferably water or a low salt concentration aqueous solution. A liquid is preferred. The salt concentration of the low salt concentration aqueous solution is preferably 100 mM or less, more preferably 50 mM or less, and most preferably 15 mM or less. The lower limit of the low salt concentration aqueous solution is not particularly limited, but is preferably 0.1 mM or more, more preferably 1 mM or more, and most preferably 10 mM or more. Moreover, this solution may contain surfactants, such as Triton, Tween, and SDS, and pH is not specifically limited. The salt for making the buffer solution is not particularly limited, but salts such as Tris, Hepes, Pipes, and phosphoric acid are preferably used.
第２プラグの体積は、特に限定されず、核酸結合性固相担体の量等を指標として適宜設定することができる。例えば、核酸結合性固相担体の体積が、０．５μＬである場合には、第２プラグの体積は、１０μＬ以上であれば十分であり、２０μＬ以上５０μＬ以下とすることが好ましく、２０μＬ以上３０μＬ以下とすることがさらに好ましい。第２プラグの体積が、この範囲であれば、核酸結合性固相担体の体積が、０．５μＬである場合に核酸結合性固相担体の洗浄を十分に行うことができる。なお、核酸結合性固相担体の洗浄には、第２プラグの体積は、より大きいことが好ましいが、チューブの長さや太さ、これに依存する第２プラグのチューブの長手方向における長さ等を考慮して、適宜に設定することができる。 The volume of the second plug is not particularly limited, and can be set as appropriate using the amount of the nucleic acid-binding solid phase carrier and the like as an index. For example, when the volume of the nucleic acid binding solid phase carrier is 0.5 μL, it is sufficient that the volume of the second plug is 10 μL or more, preferably 20 μL or more and 50 μL or less, and 20 μL or more and 30 μL. More preferably, it is as follows. If the volume of the second plug is within this range, the nucleic acid-binding solid phase carrier can be sufficiently washed when the volume of the nucleic acid-binding solid phase carrier is 0.5 μL. For washing the nucleic acid-binding solid phase carrier, the volume of the second plug is preferably larger. However, the length and thickness of the tube, the length of the second plug in the longitudinal direction of the tube depending on this, etc. Can be set as appropriate.
第２プラグは、オイルのプラグによって分割されて任意の数の複数のプラグから構成されてもよい。第２プラグが複数のプラグからなる場合、各プラグの液体は、同じであっても異なっていても構わない。その中に、少なくとも１つの第１洗浄液のプラグがあれば、他のプラグの液体は特に限定されないが、全てのプラグが第１洗浄液であることが好ましい。第２プラグが分割される数は、例えば、チューブの長さや洗浄の対象等を考慮して適宜設定すれることができる。 The second plug may be composed of an arbitrary number of a plurality of plugs divided by an oil plug. When the second plug includes a plurality of plugs, the liquid in each plug may be the same or different. If there is at least one plug of the first cleaning liquid therein, the liquid of the other plugs is not particularly limited, but it is preferable that all the plugs are the first cleaning liquid. The number into which the second plug is divided can be appropriately set in consideration of, for example, the length of the tube and the object to be cleaned.
第４プラグは、チューブ内の第３プラグと第５プラグとの間の位置に設けられ、逆転写反応液からなる。 The fourth plug is provided at a position between the third plug and the fifth plug in the tube and is made of a reverse transcription reaction solution.
逆転写反応液は、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、及び逆転写酵素用プライマー（オリゴヌクレオチド）を含む。溶媒は、水であることが好ましく、逆転写反応液は、エタノールやイソプロピルアルコール等の有機溶媒およびカオトロピック物質を事実上含まない溶液が好ましい。また、逆転写酵素用バッファーとなるように、塩を含有することが好ましい。バッファーに含まれる塩は、酵素反応を阻害しない限り、特に限定されないが、トリス、ヘペス、ピペス、リン酸などの塩が好ましく用いられる。逆転写酵素は特に限定されず、例えば、アビアンミエロブラストウイルス（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔ Ｖｉｒｕｓ）、ラスアソシエーテッドウイルス２型（Ｒａｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ２型）、マウスモロニーミュリーンリューケミアウイルス（Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｌｏｎｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）、ヒト免疫不全ウイルス１型（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ１型）由来の逆転写酵素などが使用できるが、耐熱性の酵素が好ましい。逆転写反応液に含まれるｄＮＴＰや塩の濃度は、用いる逆転写酵素について適した濃度にすればよいが、通常、ｄＮＴＰを１０〜１０００μＭ、好ましくは１００〜５００μＭ、Ｍｇ２＋を１〜１００ｍＭ、好ましくは５〜１０ｍＭ、Ｃｌ−を１〜２０００ｍＭ、好ましくは２００〜７００ｍＭ、とすれば良く、総イオン濃度は、特に限定されないが、５０ｍＭより高い濃度であってもよく、１００ｍＭより高い濃度が好ましく、１２０ｍＭより高い濃度がより好ましく、１５０ｍＭより高い濃度がさらに好ましく、２００ｍＭより高い濃度がさらに好ましい。上限は、５００ｍＭ以下が好ましく、３００ｍＭ以下がより好ましく、２００ｍＭ以下がさらに好ましい。プライマー用オリゴヌクレオチドは、それぞれ０．１〜１０μＭ、好ましくは０．１〜１μＭが用いられる。キャリアとして、ＢＳＡまたはゼラチンなどを含有させてもよいが、その濃度は、１ｍｇ／ｍＬ以下では、反応阻害防止効果が少なく、１０ｍｇ／ｍＬ以上だと、逆転写反応やその後の酵素反応を阻害する可能性があるため、１〜１０ｍｇ／ｍＬが好ましい。ゼラチンを用いる場合、その由来は、牛皮、豚皮、牛骨が例示できるが、特に限定されない。ゼラチンが溶解にしくいときは、加温して溶解させてもよい。 The reverse transcription reaction solution contains reverse transcriptase, dNTP, and reverse transcriptase primer (oligonucleotide). The solvent is preferably water, and the reverse transcription reaction solution is preferably a solution that substantially does not contain an organic solvent such as ethanol or isopropyl alcohol and a chaotropic substance. Moreover, it is preferable to contain a salt so that it may become a buffer for reverse transcriptases. The salt contained in the buffer is not particularly limited as long as it does not inhibit the enzyme reaction, but salts such as Tris, Hepes, Pipes, and phosphoric acid are preferably used. The reverse transcriptase is not particularly limited. For example, Avian Myeloblast Virus, Ras Associated Virus type 2 (Ras Associated Virus type 2), Mouse Moloney Murine Leukemia virus (Mouse Molly Murine Lekemia virus, Mouse Molly Murine Lekemia virus) Although a reverse transcriptase derived from human immunodeficiency virus type 1 (Human Immunodefective Virus type 1) can be used, a thermostable enzyme is preferred. The concentration of dNTP or salt contained in the reverse transcription reaction solution may be a concentration suitable for the reverse transcriptase to be used. Usually, dNTP is 10 to 1000 μM, preferably 100 to 500 μM, and Mg 2+ is 1 to 100 mM, preferably Is 5 to 10 mM, Cl − is 1 to 2000 mM, preferably 200 to 700 mM, and the total ion concentration is not particularly limited, but may be higher than 50 mM, preferably higher than 100 mM, A concentration higher than 120 mM is more preferable, a concentration higher than 150 mM is more preferable, and a concentration higher than 200 mM is more preferable. The upper limit is preferably 500 mM or less, more preferably 300 mM or less, and even more preferably 200 mM or less. The primer oligonucleotide is 0.1 to 10 μM, preferably 0.1 to 1 μM. BSA or gelatin may be included as a carrier, but the concentration of 1 mg / mL or less has little effect of preventing reaction inhibition, and if the concentration is 10 mg / mL or more, reverse transcription reaction and subsequent enzyme reaction are inhibited. Since there is a possibility, 1-10 mg / mL is preferable. When gelatin is used, its origin can be exemplified by cow skin, pig skin, and cow bone, but is not particularly limited. If gelatin is difficult to dissolve, it may be dissolved by heating.
第４プラグの体積は、特に限定されず、核酸を吸着させた粒子等の量などを指標として適宜設定することができる。例えば、粒子等の体積が、０．５μＬである場合には、第４プラグの体積は、０．５μＬ以上であれば十分であり、０．８μＬ以上５μＬ以下とすることが好ましく、１μＬ以上３μＬ以下とすることがさらに好ましい。第４プラグの体積がこれらの範囲であれば、例えば、核酸結合性固相担体の体積を０．５μＬにしても、十分逆転写反応を行わせることができる。 The volume of the fourth plug is not particularly limited, and can be set as appropriate using the amount of particles or the like adsorbed with nucleic acid as an index. For example, when the volume of particles or the like is 0.5 μL, it is sufficient that the volume of the fourth plug is 0.5 μL or more, preferably 0.8 μL or more and 5 μL or less, and 1 μL or more and 3 μL. More preferably, it is as follows. If the volume of the fourth plug is within these ranges, for example, the reverse transcription reaction can be sufficiently performed even if the volume of the nucleic acid-binding solid phase carrier is 0.5 μL.
第６プラグは、チューブ内の第５プラグと第７プラグとの間の位置に設けられ、溶出液からなる。 The sixth plug is provided at a position between the fifth plug and the seventh plug in the tube and is made of an eluate.
溶出液とは、核酸結合性固相担体に吸着した核酸を、担体から液中に溶出させる液体のことを言う。溶出液も特に限定されないが、水または低塩濃度水溶液が好ましく、エタノールやイソプロピルアルコール等の有機溶媒およびカオトロピック物質を事実上含まないものがより好ましい。低塩濃度水溶液の場合、バッファーであることが好ましい。低塩濃度水溶液の塩濃度は、１００ｍＭ以下が好ましく、５０ｍＭ以下がより好ましく、１５ｍＭ以下が最も好ましい。低塩濃度水溶液の下限は特に無いが、０．１ｍＭ以上であることが好ましく、１ｍＭ以上であることがさらに好ましく、１０ｍＭ以上であることが最も好ましい。バッファーにするための塩は特に限定されないが、トリス、ヘペス、ピペス、リン酸などの塩が好ましく用いられ、ＴＥ（１０ｍＭトリス塩酸緩衝液、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）が最も好ましい。なお、第１洗浄液と溶出液は、同じであっても異なっていてもよい。 The eluate refers to a liquid that elutes the nucleic acid adsorbed on the nucleic acid-binding solid phase carrier into the liquid from the carrier. The eluate is not particularly limited, but water or a low salt concentration aqueous solution is preferable, and an organic solvent such as ethanol or isopropyl alcohol and a substance that does not substantially contain a chaotropic substance are more preferable. In the case of a low salt concentration aqueous solution, a buffer is preferable. The salt concentration of the low salt concentration aqueous solution is preferably 100 mM or less, more preferably 50 mM or less, and most preferably 15 mM or less. The lower limit of the low salt concentration aqueous solution is not particularly limited, but is preferably 0.1 mM or more, more preferably 1 mM or more, and most preferably 10 mM or more. The salt for forming the buffer is not particularly limited, but salts such as Tris, Hepes, Pipes, and phosphoric acid are preferably used, and TE (10 mM Tris-HCl buffer, 1 mM EDTA, pH 8.0) is most preferable. Note that the first cleaning solution and the eluate may be the same or different.
溶出液は、さらに、ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡポリメラーゼ用プライマー（オリゴヌクレオチド）を含んでいても良く、ＴａｑＭａｎプローブや、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ、サイクリングプローブなどのリアルタイムＰＣＲ用プローブやＳＹＢＲグリーンなどのインターカレーター用蛍光色素を含んでいてもよい。ＤＮＡポリメラーゼも特に限定されないが、耐熱性の酵素やＰＣＲ用酵素が好ましく、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、あるいはそれらの改良型など、非常に多数の市販品がある。さらに、反応阻害防止剤として、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）またはゼラチンを含有することが好ましい。 The eluate may further contain a DNA polymerase and a primer (oligonucleotide) for DNA polymerase, and a real-time PCR probe such as TaqMan probe, Molecular Beacon or cycling probe, or a fluorescent dye for intercalators such as SYBR Green. May be included. The DNA polymerase is not particularly limited, but a heat-resistant enzyme or a PCR enzyme is preferable. For example, there are a large number of commercially available products such as Taq polymerase, Tfi polymerase, Tth polymerase, or improved versions thereof. Furthermore, it is preferable to contain BSA (bovine serum albumin) or gelatin as a reaction inhibition inhibitor.
溶出液に含まれるｄＮＴＰや塩の濃度は、用いるＤＮＡポリメラーゼについて適した濃度にすればよいが、通常、ｄＮＴＰを１０〜１０００μＭ、好ましくは１００〜５００μＭ、Ｍｇ２＋を１〜１００ｍＭ、好ましくは５〜１０ｍＭ、Ｃｌ−を１〜２０００ｍＭ、好ましくは２００〜７００ｍＭ、とすれば良く、総イオン濃度は、特に限定されないが、５０ｍＭより高い濃度であってもよく、１００ｍＭより高い濃度が好ましく、１２０ｍＭより高い濃度がより好ましく、１５０ｍＭより高い濃度がさらに好ましく、２００ｍＭより高い濃度がさらに好ましい。上限は、５００ｍＭ以下が好ましく、３００ｍＭ以下がより好ましく、２００ｍＭ以下がさらに好ましい。プライマー用オリゴヌクレオチドは、それぞれ０．１〜１０μＭ、好ましくは０．１〜１μＭが用いられる。キャリアとして、ＢＳＡまたはゼラチンなどを含有させてもよいが、その濃度は、１ｍｇ／ｍＬ以下では、反応阻害防止効果が少なく、１０ｍｇ／ｍＬ以上だと、重合反応やその後の酵素反応を阻害する可能性があるため、１〜１０ｍｇ／ｍＬが好ましい。ゼラチンを用いる場合、その由来は、牛皮、豚皮、牛骨が例示できるが、特に限定されない。ゼラチンが溶解にしくいときは、加温して溶解させてもよい。 The concentration of dNTP or salt contained in the eluate may be a concentration suitable for the DNA polymerase to be used. Usually, dNTP is 10 to 1000 μM, preferably 100 to 500 μM, Mg 2+ is 1 to 100 mM, preferably 5 to 5 mM. 10 mM, Cl − may be 1 to 2000 mM, preferably 200 to 700 mM, and the total ion concentration is not particularly limited, but may be higher than 50 mM, preferably higher than 100 mM, and higher than 120 mM. The concentration is more preferable, a concentration higher than 150 mM is further preferable, and a concentration higher than 200 mM is further preferable. The upper limit is preferably 500 mM or less, more preferably 300 mM or less, and even more preferably 200 mM or less. The primer oligonucleotide is 0.1 to 10 μM, preferably 0.1 to 1 μM. BSA or gelatin may be included as a carrier, but the concentration is 1 mg / mL or less, and the reaction inhibition preventing effect is small. If the concentration is 10 mg / mL or more, the polymerization reaction and the subsequent enzyme reaction can be inhibited. 1-10 mg / mL is preferable because of its properties. When gelatin is used, its origin can be exemplified by cow skin, pig skin, and cow bone, but is not particularly limited. If gelatin is difficult to dissolve, it may be dissolved by heating.
第６プラグの体積は、特に限定されず、核酸を吸着させた粒子等の量などを指標として適宜設定することができる。例えば、粒子等の体積が、０．５μＬである場合には、第６プラグの体積は、０．５μＬ以上であれば十分であり、０．８μＬ以上５μＬ以下とすることが好ましく、１μＬ以上３μＬ以下とすることがさらに好ましい。第６プラグの体積がこれらの範囲であれば、例えば、核酸結合性固相担体の体積を０．５μＬにしても、十分逆転写反応を行わせることができる。 The volume of the sixth plug is not particularly limited, and can be set as appropriate using the amount of particles or the like adsorbed with nucleic acid as an index. For example, when the volume of the particles or the like is 0.5 μL, it is sufficient that the volume of the sixth plug is 0.5 μL or more, preferably 0.8 μL or more and 5 μL or less, and 1 μL or more and 3 μL. More preferably, it is as follows. If the volume of the sixth plug is within these ranges, for example, even if the volume of the nucleic acid-binding solid phase carrier is 0.5 μL, the reverse transcription reaction can be sufficiently performed.
溶出液が、ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡポリメラーゼ用プライマーを含んでいる場合は、溶出後の溶出液を、直接ＤＮＡポリメラーゼ反応に用いることができる。この際、チューブ内で反応を行ってもよいが、溶出液をチューブから外に出して、新たにＤＮＡポリメラーゼ反応用容器に移して反応を行ってもよい。チューブ外でＤＮＡポリメラーゼ反応を行う際には、溶出液の一部または全部を用いてもよく、一部を用いる場合は、ＤＮＡポリメラーゼ用に調節したバッファーで希釈するのが好ましい。ＤＮＡポリメラーゼ用に調節したバッファーは、溶出液と同じ成分の溶液を用いてもよいが、塩濃度が適正に調節されていることが好ましく、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、及びＤＮＡポリメラーゼ用プライマーは、それぞれ添加されていてもいなくても構わない。 When the eluate contains DNA polymerase and a primer for DNA polymerase, the eluate after elution can be directly used for the DNA polymerase reaction. At this time, the reaction may be carried out in the tube, or the eluate may be taken out of the tube and newly transferred to a DNA polymerase reaction container to carry out the reaction. When performing the DNA polymerase reaction outside the tube, a part or all of the eluate may be used. When a part of the eluate is used, it is preferably diluted with a buffer adjusted for DNA polymerase. The buffer adjusted for DNA polymerase may be a solution of the same component as the eluate, but the salt concentration is preferably adjusted appropriately, and DNA polymerase, dNTP, and primer for DNA polymerase are added respectively. It does not matter if it is done or not.
この核酸抽出用器具には、第１〜第７プラグ以外に、目的に応じて、任意の場所にプラグを設けてもよい。オイルからなるプラグは、その両側の水溶性のプラグが互いに混合することを抑制することを考えると、オイルからなるプラグと水溶性のプラグは、交互に配置されるのが好ましく、水溶性のプラグを追加した場合、隣の水溶性のプラグとの間に、オイルからなるプラグを設ければよい。 In addition to the first to seventh plugs, the nucleic acid extraction instrument may be provided with a plug at an arbitrary place depending on the purpose. Considering that the plug made of oil suppresses mixing of the water-soluble plugs on both sides thereof, the plug made of oil and the water-soluble plug are preferably arranged alternately, and the water-soluble plug When the is added, a plug made of oil may be provided between the adjacent water-soluble plug.
例えば、第３プラグと第４プラグとの間に、第３プラグ側から順に、オイルと混和しない第２洗浄液からなる第８プラグ、及びオイルからなる第９プラグを有していてもよい。この場合、第２洗浄液は、第３プラグを構成するオイル及び第９プラグを構成するオイルのいずれとも混和しない液体である。第２洗浄液は、第１洗浄液と同じ組成であってもよいし、異なる組成であってもよいが、第８プラグの基本的な構成の選択の仕方は、第２プラグに準じる。 For example, an eighth plug made of a second cleaning liquid that is immiscible with oil and a ninth plug made of oil may be provided between the third plug and the fourth plug in order from the third plug side. In this case, the second cleaning liquid is a liquid that is immiscible with either the oil constituting the third plug or the oil constituting the ninth plug. The second cleaning liquid may have the same composition as the first cleaning liquid or may have a different composition, but the basic configuration of the eighth plug is the same as that of the second plug.
このように、逆転写反応液プラグの前に、洗浄液からなるプラグを複数設ける場合、上流側の洗浄液にカオトロピック剤を含有させてもよい。例えば、第２プラグの第１洗浄液にグアニジン塩酸塩を含有させると、第２プラグにおいて、粒子等に吸着した核酸の吸着を維持又は強化しつつ粒子等を洗浄することができる。第２プラグにグアニジン塩酸塩を含有させる場合の濃度としては、例えば、３ｍｏｌ／Ｌ以上１０ｍｏｌ／Ｌ以下、好ましくは５ｍｏｌ／Ｌ以上８ｍｏｌ／Ｌ以下とすることができる。グアニジン塩酸塩の濃度がこの範囲であれば、粒子等に吸着された核酸をより安定に吸着させつつ、他の夾雑物等を洗浄することができる。そして、第８プラグの第２洗浄液を、水又は緩衝液とすることで、第２プラグにおいて、粒子等に吸着した核酸をより安定して吸着させるとともに洗浄を行うことができ、かつ、第８プラグにおいて、カオトロピック剤を除去しつつ担体をさらに洗浄することができる。 As described above, when a plurality of plugs made of a cleaning solution are provided before the reverse transcription reaction solution plug, the upstream cleaning solution may contain a chaotropic agent. For example, when guanidine hydrochloride is contained in the first cleaning liquid of the second plug, the particles and the like can be washed while maintaining or enhancing the adsorption of the nucleic acid adsorbed to the particles and the like in the second plug. The concentration when guanidine hydrochloride is contained in the second plug is, for example, 3 mol / L or more and 10 mol / L or less, preferably 5 mol / L or more and 8 mol / L or less. If the concentration of guanidine hydrochloride is within this range, other impurities can be washed while more stably adsorbing the nucleic acid adsorbed on the particles and the like. Then, by using the second cleaning solution of the eighth plug as water or a buffer solution, the second plug can adsorb the nucleic acid adsorbed on the particles and the like more stably and perform cleaning. In the plug, the carrier can be further washed while removing the chaotropic agent.
また、第５プラグと第６プラグとの間に、第５プラグ側から順に、オイルと混和しない第３洗浄液からなる第１０プラグ、及びオイルからなる第１１プラグを有していてもよい。この場合も、第３洗浄液は、第５プラグを構成するオイル及び第１１プラグを構成するオイルのいずれとも混和しない液体である。第３洗浄液は、第１洗浄液と同じ組成であってもよいし、異なる組成であってもよいが、第１０プラグの基本的な構成の選択の仕方は、第２プラグに準じる。 Further, a tenth plug made of a third cleaning solution that is immiscible with oil and an eleventh plug made of oil may be provided between the fifth plug and the sixth plug in order from the fifth plug side. In this case as well, the third cleaning liquid is a liquid that is immiscible with either the oil constituting the fifth plug or the oil constituting the eleventh plug. The third cleaning liquid may have the same composition as the first cleaning liquid or may have a different composition, but the basic configuration of the tenth plug is the same as that of the second plug.
このように、逆転写反応液プラグの後に、洗浄液からなるプラグを設ける場合、特に、第７プラグでＤＮＡポリメラーゼ反応を行う場合に、ＤＮＡポリメラーゼ反応溶液への逆転写反応液の持込が少なくなるので、ＤＮＡポリメラーゼ反応の効率が上がるという効果がある。 As described above, when a plug made of a cleaning solution is provided after the reverse transcription reaction solution plug, particularly when the DNA polymerase reaction is performed with the seventh plug, the amount of reverse transcription reaction solution brought into the DNA polymerase reaction solution is reduced. Therefore, there is an effect that the efficiency of the DNA polymerase reaction is increased.
＝＝核酸抽出用装置＝＝
本発明の核酸抽出用装置は、上述した核酸抽出用器具と、チューブと、必要な場合はタンクにも、磁力を印加するための磁力印加器具と、を有する。チューブが複数の場合、チューブの対応部に、同時に磁力を印加することができるように磁力印加器具を構成することが好ましい。磁力印加器具は特に限定されないが、例えば、永久磁石、電磁石等が例示できるが、発熱等を生じない点で、永久磁石がより好ましい。核酸抽出の際には、磁力印加器具を移動させる必要があるので、磁力印加器具を自動的に移動させるための磁力印加器具移動装置を備えていてもよい。あるいは、磁力印加器具に対し、核酸抽出用器具のほうを移動させてもよく、その場合、核酸抽出用器具移動装置を備えていてもよい。
== Nucleic acid extraction apparatus ==
The nucleic acid extraction apparatus of the present invention includes the above-described nucleic acid extraction instrument, a tube, and, if necessary, a magnetic force application instrument for applying a magnetic force to a tank. When there are a plurality of tubes, it is preferable to configure the magnetic force application device so that a magnetic force can be simultaneously applied to the corresponding portion of the tube. Although a magnetic force application instrument is not specifically limited, For example, although a permanent magnet, an electromagnet, etc. can be illustrated, a permanent magnet is more preferable at the point which does not produce heat etc. When extracting nucleic acids, it is necessary to move the magnetic force applying instrument, and therefore a magnetic force applying instrument moving device for automatically moving the magnetic force applying instrument may be provided. Alternatively, the nucleic acid extraction instrument may be moved relative to the magnetic force application instrument, and in that case, a nucleic acid extraction instrument moving device may be provided.
また、本発明の核酸抽出用装置は、逆転写反応液からなる第４プラグ、及びチューブの溶出液からなる第６プラグを加熱する位置に設けられた加熱装置をさらに備えてもよい。ここで、第４プラグと第６プラグを制御する加熱装置を設けてもよいが、それぞれ別個に制御する複数の加熱装置を設けてもよい。加熱装置は特に限定されないが、例えば、ヒートブロック、ヒーター、電磁加熱などを例示することができる。 The nucleic acid extraction apparatus of the present invention may further include a heating device provided at a position for heating the fourth plug made of the reverse transcription reaction solution and the sixth plug made of the tube eluate. Here, a heating device that controls the fourth plug and the sixth plug may be provided, or a plurality of heating devices that are separately controlled may be provided. Although a heating apparatus is not specifically limited, For example, a heat block, a heater, electromagnetic heating etc. can be illustrated.
なお、核酸を抽出するための試料を溶解するための溶解液と、磁性体を有する核酸結合性固相担体と、核酸抽出用器具を核酸抽出用キットとしてもよい。それによって、この核酸抽出用装置で用いるうちの、使い捨てにできる部分だけをキット化できる。 In addition, a solution for dissolving a sample for extracting nucleic acid, a nucleic acid-binding solid phase carrier having a magnetic substance, and a nucleic acid extraction instrument may be used as a nucleic acid extraction kit. As a result, only the disposable part of the nucleic acid extraction apparatus can be made into a kit.
＝＝核酸抽出方法＝＝
上述した核酸抽出用装置は、本発明の核酸抽出方法に、好適に用いることができる。核酸を抽出するための試料は、核酸を含んでいれば特に限定されず、細胞や、組織などの細胞塊などの生体試料、ウイルス、合成核酸、一旦単離した核酸に不純物や夾雑物が混入した試料などであってもよい。
== Nucleic acid extraction method ==
The nucleic acid extraction apparatus described above can be suitably used in the nucleic acid extraction method of the present invention. Samples for extracting nucleic acids are not particularly limited as long as they contain nucleic acids, and impurities and contaminants are mixed into biological samples such as cells and cell masses such as tissues, viruses, synthetic nucleic acids, and once isolated nucleic acids. It may be a sample.
まず、上述した核酸抽出用器具を、単数又は複数のチューブの長手方向が重力方向と平行になるように固定器具に設置する。 First, the above-described nucleic acid extraction instrument is placed on a fixing instrument such that the longitudinal direction of one or more tubes is parallel to the direction of gravity.
次に、磁性体を有する核酸結合性固相担体と、溶解液と、核酸を抽出するための試料をタンクに投入する。投入する順序は限定されず、具体的な方法は、例えば下記工程を含んでもよいが、その場合、各工程を行う順序は、特に限定されない。
（１）溶解液に試料を投入し、溶解液を混合する工程と、
（２）溶解液に、磁性体を有する核酸結合性固相担体を添加する工程と、
（３）核酸抽出用器具のタンクに、試料を混合した溶解液を投入する工程と、
（４）溶解液中で、核酸と結合した核酸結合性固相担体を均一にする均一工程
Next, a nucleic acid-binding solid phase carrier having a magnetic substance, a lysis solution, and a sample for extracting nucleic acid are put into a tank. The order of charging is not limited, and a specific method may include, for example, the following steps. In that case, the order of performing each step is not particularly limited.
(1) A step of putting a sample into the solution and mixing the solution,
(2) adding a nucleic acid-binding solid phase carrier having a magnetic substance to the lysis solution;
(3) a step of introducing a lysate mixed with a sample into a tank of a nucleic acid extraction instrument;
(4) Uniform process for homogenizing nucleic acid-binding solid phase carriers bound to nucleic acids in a lysis solution
例えば、核酸を抽出するための試料を溶解するための溶解液に試料及び核酸結合性固相担体を投入して混合し（１）（２）、ホモジェナイザーやヴォルテックス・ミキサーなどによって試料を溶解させた（４）あと、この粉砕物をタンクに入れてもよい（３）。あるいは、試料は、それだけで溶解させ（１）、溶解させた試料と核酸結合性固相担体を別々にタンクに入れ（２）（３）、核酸抽出用器具の開口部に蓋をして、十分混合してもよい（４）。または、試料は、それだけで溶解させ（１）、溶解させた試料と核酸結合性固相担体を混ぜて（２）、十分混合し（４）、混合物をタンクに投入してもよい（３）。この工程で、試料中の核酸が、核酸結合性固相担体に吸着する。 For example, a sample and a nucleic acid-binding solid phase carrier are put into a solution for dissolving a sample for extracting nucleic acid and mixed (1) (2), and the sample is dissolved by a homogenizer, a vortex mixer, or the like. After letting (4), this pulverized product may be put in a tank (3). Alternatively, the sample is dissolved by itself (1), the dissolved sample and the nucleic acid binding solid phase carrier are separately put in a tank (2) (3), and the opening of the nucleic acid extraction instrument is covered, Mix well (4). Alternatively, the sample may be dissolved by itself (1), the dissolved sample and the nucleic acid binding solid phase carrier may be mixed (2), sufficiently mixed (4), and the mixture may be put into a tank (3). . In this step, the nucleic acid in the sample is adsorbed to the nucleic acid binding solid phase carrier.
なお、タンクに、すでに磁性体を有する核酸結合性固相担体及び／又は溶解液が入っていれば、そこに核酸を抽出するための試料を投入すればよく、担体又は溶解液が欠けていれば、それを一緒に投入すればよい。 If the tank already contains a nucleic acid-binding solid phase carrier having a magnetic substance and / or a lysate, a sample for extracting nucleic acid may be added to the tank, and the carrier or lysate may be missing. Just put it together.
複数のチューブを設けた場合、核酸抽出用器具は、チューブの長手方向が重力方向と平行になるように固定器具に設置されているので、全てのチューブに均等に担体が入って行くようになる。タンク内に、各チューブに連通する空間を隔てる隔壁が設けられている場合は、試料溶解物と担体を含んだ溶解液は、隔壁より高くすることによって、各チューブに均等に担体が入って行く。 When a plurality of tubes are provided, the nucleic acid extraction device is installed in the fixing device so that the longitudinal direction of the tube is parallel to the direction of gravity, so that the carrier enters the tubes evenly. . When a partition wall is provided in the tank to separate the space communicating with each tube, the lysate containing the sample lysate and the carrier is made higher than the partition wall, so that the carrier enters the tubes evenly. .
その後、核酸結合性固相担体は、磁性体を有しているので、単数又は複数のチューブの対応部に同時に磁力を印加できる磁力印加器具を用いて、第１プラグから第６プラグの方向へ、磁力を印加し、核酸結合性固相担体をタンク内から第６プラグに移動させることができる。その際、永久磁石を用いる場合には、作業者の手で磁石を動かして行ってもよいし、磁力印加器具移動装置等を利用して行ってもよい。核酸結合性固相担体が各プラグを通過するときの各プラグにおける滞在時間は特に限定されない。なお、磁力印加器具は、同一プラグ内でチューブの長手方向に沿って往復するようにして移動させてもよい。また、磁力印加器具を進行方向に対して角度をもった方向に（例えば、ほぼ垂直に）振動させてもよい。この振動は、いずれのプラグでも与えることは可能だが、例えば、洗浄液からなる第２プラグでそのような振動を与えることによって、洗浄効果を増強させることができる。 Thereafter, since the nucleic acid-binding solid phase carrier has a magnetic substance, a magnetic force applying device capable of simultaneously applying a magnetic force to the corresponding part of one or a plurality of tubes is used to move from the first plug to the sixth plug. By applying a magnetic force, the nucleic acid binding solid phase carrier can be moved from the tank to the sixth plug. In that case, when using a permanent magnet, you may carry out by moving a magnet with an operator's hand, and you may carry out using a magnetic force application instrument moving apparatus. The residence time in each plug when the nucleic acid-binding solid phase carrier passes through each plug is not particularly limited. In addition, you may move a magnetic force application instrument so that it may reciprocate along the longitudinal direction of a tube within the same plug. Further, the magnetic force applying device may be vibrated in a direction having an angle with respect to the traveling direction (for example, substantially perpendicular). This vibration can be applied to any plug, but the cleaning effect can be enhanced by applying such vibration with a second plug made of a cleaning liquid, for example.
第２プラグで洗浄された核酸結合性固相担体を第４プラグに移動させたとき、そこで、逆転写反応をさせる。反応は、用いる逆転写酵素に適した条件で行えばよい。例えば、逆転写反応液を、３０〜５０℃、好ましくは４２〜４５℃に加熱し、その中で核酸結合性固相担体を一定時間保持することで、ＲＮＡを担体に結合させたままで、逆転写反応を起こさせることができる。加熱方法としては、特に限定されないが、例えば、チューブの第４プラグに対応する位置に、ヒートブロック等の熱媒体を接触させる方法や、ヒーター等の熱源を用いる方法、電磁加熱による方法などを例示することができる。保持時間も、実施者が適時選択できるが、１０秒〜５分、好ましくは３０秒から１分、保持すればよい。この段階で合成されたｃＤＮＡは、ＲＮＡと結合したままの状態で、固相担体に結合している。 When the nucleic acid-binding solid phase carrier washed with the second plug is moved to the fourth plug, a reverse transcription reaction is performed there. The reaction may be performed under conditions suitable for the reverse transcriptase used. For example, the reverse transcription reaction solution is heated to 30 to 50 ° C., preferably 42 to 45 ° C., and the nucleic acid-binding solid phase carrier is held therein for a certain period of time, so that the RNA remains bound to the carrier and is reversed. It can cause a photoreaction. Although it does not specifically limit as a heating method, For example, the method of contacting heat media, such as a heat block, in the position corresponding to the 4th plug of a tube, the method of using heat sources, such as a heater, the method by electromagnetic heating, etc. are illustrated. can do. Although the practitioner can select the holding time as appropriate, it may be held for 10 seconds to 5 minutes, preferably 30 seconds to 1 minute. The cDNA synthesized at this stage is bound to the solid support in a state of being bound to RNA.
その後、核酸結合性固相担体を第６プラグの溶出液中に移動させる。ここで、核酸結合性固相担体から核酸、特にｃＤＮＡを効率よく遊離させるために、第６プラグを加熱するのが好ましい。加熱方法としては、特に限定されないが、第４プラグの加熱で用いるのと同様の方法を用いることができる。加熱温度は、４０℃より高ければ良く、５０℃以上が好ましく、６０℃以上がより好ましい。加熱温度の上限は特に限定されないが、７０℃以下であることが好ましく、６５℃以下であることがより好ましく、６０℃以下であることがさらに好ましく、６０℃であることが最も好ましい。 Thereafter, the nucleic acid-binding solid phase carrier is moved into the eluate of the sixth plug. Here, it is preferable to heat the sixth plug in order to efficiently release nucleic acid, particularly cDNA, from the nucleic acid-binding solid phase carrier. Although it does not specifically limit as a heating method, The method similar to using with the heating of a 4th plug can be used. The heating temperature should just be higher than 40 degreeC, 50 degreeC or more is preferable and 60 degreeC or more is more preferable. The upper limit of the heating temperature is not particularly limited, but is preferably 70 ° C. or less, more preferably 65 ° C. or less, further preferably 60 ° C. or less, and most preferably 60 ° C.
核酸結合性固相担体から核酸を遊離させた後、磁力印加器具を用いて、核酸結合性固相担体を第６プラグから上方に移動させる。第６プラグの溶出液に混入していなければ、どこに移動させても構わない。 After the nucleic acid is released from the nucleic acid-binding solid phase carrier, the nucleic acid-binding solid phase carrier is moved upward from the sixth plug using a magnetic force applying device. If it is not mixed in the eluate of the sixth plug, it may be moved anywhere.
その後、第６プラグの溶出液に遊離した核酸を回収する。例えば、タンクの材質にゴム、エラストマー、高分子等の可とう性を有するものを利用した場合、チューブの先端の栓を外し、タンクに蓋を装着した状態で、タンクを変形させることによってタンクの内部を加圧すると、チューブの先端からチューブ内部の溶液が吐出される。まず、第７プラグのオイルが吐出され、その後、第６プラグの溶出液が吐出される。 Thereafter, the nucleic acid released in the eluate of the sixth plug is recovered. For example, when using a flexible material such as rubber, elastomer, polymer, etc. as the material of the tank, remove the stopper at the tip of the tube and deform the tank with the lid attached to the tank. When the inside is pressurized, the solution inside the tube is discharged from the tip of the tube. First, the oil of the seventh plug is discharged, and then the eluate of the sixth plug is discharged.
このようにして溶出したｃＤＮＡは、透析やエタノール沈殿法等の脱塩、濃縮操作を施すことなく、ＰＣＲなどの酵素反応に直接使用することができる。なお、溶出液からｃＤＮＡを単離してもよく、例えばＲＮＡを除去するためには、得られた溶出液にＲＮａｓｅを添加してもよいが、あらかじめＲＮａｓｅを溶出液に含有させてもよい。例えば、溶出液にRibonuclease Aを１０〜２０μｇ／ｍＬ含有させることで、効率よくＲＮＡを分解させることができる。通常、ＲＮａｓｅが含まれたままで、ＰＣＲなどの操作を行うことができるが、ＲＮａｓｅを除去したい時には、本発明の方法を再度繰り返すか、その他公知の方法によって、ｃＤＮＡを精製してもよい。 The cDNA eluted in this way can be directly used for enzymatic reactions such as PCR without performing desalting and concentration operations such as dialysis and ethanol precipitation. In addition, cDNA may be isolated from the eluate. For example, in order to remove RNA, RNase may be added to the obtained eluate, but RNase may be included in the eluate in advance. For example, RNA can be efficiently degraded by containing 10-20 μg / mL of Ribonuclease A in the eluate. Usually, an operation such as PCR can be performed with RNase contained, but when it is desired to remove RNase, the method of the present invention may be repeated again or the cDNA may be purified by other known methods.
一方、溶出液に、予めＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ及びＤＮＡポリメラーゼ用プライマー（オリゴヌクレオチド）を含ませることも可能である。それにより、第６プラグから回収した溶液そのものをもちいて、直接ＰＣＲを行うことができる。 On the other hand, DNA polymerase, dNTP and a primer for DNA polymerase (oligonucleotide) can be included in the eluate in advance. Thereby, PCR can be directly performed using the solution itself recovered from the sixth plug.
なお、第６プラグの溶出液に遊離した核酸を回収せず、チューブに保持したまま第６プラグ内でＰＣＲを行ってもよい。この場合、溶出液に、予めＰＣＲ酵素、ｄＮＴＰ、及びＰＣＲ酵素用プライマー（オリゴヌクレオチド）を含ませておく必要がある。ＰＣＲのための加熱方法としては、特に限定されないが、第４プラグの加熱で用いるのと同様の方法を用いてもよく、昇降ＰＣＲ法を用いてもよい。ＰＣＲ反応後、増幅したｃＤＮＡを回収すればよいが、回収方法は特に限定されず、増幅せずに回収する場合と同様の方法を用いることができる。 Note that the nucleic acid released in the eluate of the sixth plug may not be collected and PCR may be performed in the sixth plug while being retained in the tube. In this case, it is necessary to previously contain the PCR enzyme, dNTP, and PCR enzyme primer (oligonucleotide) in the eluate. The heating method for PCR is not particularly limited, but a method similar to that used for heating the fourth plug may be used, or a lift PCR method may be used. The amplified cDNA may be recovered after the PCR reaction, but the recovery method is not particularly limited, and a method similar to that for recovering without amplification can be used.
（１）核酸抽出用器具の構成 Ｉ
図１に核酸抽出用器具の組み立て前の分解図（図１Ａ）および組み立て後の完成図（図１Ｂ）を示す。
(1) Configuration of nucleic acid extraction instrument I
FIG. 1 shows an exploded view before assembly of the nucleic acid extraction instrument (FIG. 1A) and a completed view after assembly (FIG. 1B).
この器具は、１本のキャピラリー１００と、そのキャピラリー１００に液体を注入するためのタンク１２０を有する。このキャピラリー１００とタンク１２０とは、核酸抽出用器具組み立て用キット１３０を構成できる。 This instrument has one capillary 100 and a tank 120 for injecting liquid into the capillary 100. The capillary 100 and the tank 120 can constitute a nucleic acid extraction instrument assembly kit 130.
キャピラリー１００は栓１１０を有し、内部には、第１〜第７プラグが設けられ、それぞれ順に、オイル１０、洗浄液２０、オイル３０、逆転写反応液４０、オイル５０、溶出液６０、オイル７０が充填されている。オイルは、各水溶液を分離するための役割を有している。 The capillary 100 has a plug 110 and is provided with first to seventh plugs therein. The oil 10, the cleaning liquid 20, the oil 30, the reverse transcription reaction liquid 40, the oil 50, the elution liquid 60, and the oil 70 are sequentially provided. Is filled. The oil has a role for separating each aqueous solution.
タンク１２０は、開口部１２１、開口部１２１に対する着脱可能な蓋１２２、空間１２３、溶解液１２４を有する。また、溶解液１２４中に、表面にコーティングされたシリカに核酸が吸着した磁性ビーズ１２５が含まれている。 The tank 120 includes an opening 121, a lid 122 that can be attached to and detached from the opening 121, a space 123, and a solution 124. Further, the lysis solution 124 includes magnetic beads 125 in which nucleic acids are adsorbed on silica coated on the surface.
キャピラリー１００とタンク１２０は、それぞれ、栓１１０と蓋１２２を外して、図１Ｂのように接続することができる。 Capillary 100 and tank 120 can be connected as shown in FIG. 1B with stopper 110 and lid 122 removed.
（２）核酸抽出用器具の構成 ＩＩ
図２の装置は、複数のキャピラリー１００、及びそのキャピラリー１００に液体を注入するためのタンク２２０、矩形磁石２６０を有する。
(2) Configuration of nucleic acid extraction instrument II
The apparatus of FIG. 2 includes a plurality of capillaries 100, a tank 220 for injecting liquid into the capillaries 100, and a rectangular magnet 260.
タンク２２０は、開口部２２１、開口部２２１に対する着脱可能な蓋２２３、空間２２３、溶解液２２４、液体分配部の隔壁２４０、タンク２２０の内壁および隔壁２４０によって囲まれたコンパートメント２５０を有する。また、溶解液２２４中に、表面にコーティングされたシリカに核酸が吸着した磁性ビーズ２２５が示されている。 The tank 220 includes an opening 221, a lid 223 that can be attached to and detached from the opening 221, a space 223, a solution 224, a partition wall 240 of the liquid distribution unit, a compartment 250 surrounded by the inner wall of the tank 220 and the partition wall 240. In addition, magnetic beads 225 in which nucleic acids are adsorbed on silica coated on the surface are shown in the solution 224.
複数のキャピラリー１００は、互いに独立で、平行に、かつ直線状の配列になるように、設けられている。キャピラリー１００を直線的な配列にすることで、互いに正対する矩形磁石２６０は、容易に複数のキャピラリー１００を挟み込み、上下運動のような単純作業によって同時に複数のキャピラリー１００の対応部に、同時に磁力を印加することができる。それによって、複数のキャピラリー１００内で、磁性ビーズ２２５に対し、同一の動きをさせることが容易になり、自動化装置の単純化が可能になる。なお、キャピラリー１００の内部には、第１〜第７プラグが設けられ、それぞれ順に、オイル１０、洗浄液２０、オイル３０、逆転写反応液４０、オイル５０、溶出液６０、オイル７０が充填されている。 The plurality of capillaries 100 are provided so as to be independent of each other, in parallel, and in a linear array. By arranging the capillaries 100 in a linear arrangement, the rectangular magnets 260 facing each other easily sandwich the plurality of capillaries 100 and simultaneously apply magnetic force to the corresponding portions of the plurality of capillaries 100 simultaneously by a simple operation such as vertical movement. Can be applied. Thereby, it becomes easy to make the magnetic beads 225 move in the same manner within the plurality of capillaries 100, and the automation device can be simplified. The capillary 100 is provided with first to seventh plugs, which are filled with oil 10, cleaning solution 20, oil 30, reverse transcription reaction solution 40, oil 50, elution solution 60, and oil 70, respectively. Yes.
（３）核酸抽出用装置の構成
本発明の核酸抽出用装置３０００は、（１）の核酸抽出用器具２０００を装着して核酸の抽出を行う装置である（図３）。この装置３０００は、キャピラリー２００で支持しながら核酸抽出用器具２０００を装着するための装着部３００と、装着部３００に核酸抽出用器具２０００が装着された場合に、キャピラリー２００及び必要に応じてタンク１２０の側面から磁力を印加するための磁力印加部４００と、装着部３００及び磁力印加部４００の相対的な配置を、キャピラリー２００の長手方向に沿って変化させるための移動機構５００と、キャピラリー２００の一部を過熱するための加熱部６００を有する。そして、装着部３００と磁力印加部４００との相対的な位置関係を変化させることによって、核酸抽出用器具２０００内の磁性粒子をその内部で移動させることができる。
(3) Configuration of Nucleic Acid Extraction Apparatus The nucleic acid extraction apparatus 3000 of the present invention is an apparatus that performs nucleic acid extraction by mounting the nucleic acid extraction instrument 2000 of (1) (FIG. 3). The apparatus 3000 includes a mounting unit 300 for mounting the nucleic acid extraction instrument 2000 while being supported by the capillary 200, and a capillary 200 and, if necessary, a tank when the mounting unit 300 is mounted with the nucleic acid extraction instrument 2000. 120, a magnetic force application unit 400 for applying a magnetic force from the side surface, a moving mechanism 500 for changing the relative arrangement of the mounting unit 300 and the magnetic force application unit 400 along the longitudinal direction of the capillary 200, and the capillary 200. It has a heating part 600 for overheating a part. And the magnetic particle in the nucleic acid extraction instrument 2000 can be moved inside by changing the relative positional relationship between the mounting part 300 and the magnetic force application part 400.
装着部３００は、キャピラリー２００が沿うように配置される添え板３１０を有している。この添え板３１０によって、キャピラリー２００の振動等を抑制することができる。また、装着部３００は、クリップ機構３２０を有しており、これによりキャピラリー２００を２箇所で固定する。 The mounting part 300 has a plate 310 arranged so that the capillary 200 is along. With this attachment plate 310, vibration of the capillary 200 and the like can be suppressed. The mounting unit 300 has a clip mechanism 320, which fixes the capillary 200 at two locations.
装着部３００は、磁力印加部４００との位置関係が、キャピラリー２００の長手方向に対して相対的に変化することができるように構成される。本実施例では、磁力印加部４００の移動を行わずに装着部３００を磁力印加部４００に対して相対的に移動させるように設計されているため、装着部３００を移動させる移動機構５００が設けられている。なお、装着部３００には、ヒンジ３３０、ガイドレール３４０、駆動ベルト３５０、モーターが設けられている。 The mounting unit 300 is configured such that the positional relationship with the magnetic force application unit 400 can be changed relative to the longitudinal direction of the capillary 200. In the present embodiment, since the mounting unit 300 is designed to move relative to the magnetic force application unit 400 without moving the magnetic force application unit 400, a moving mechanism 500 that moves the mounting unit 300 is provided. It has been. The mounting portion 300 is provided with a hinge 330, a guide rail 340, a drive belt 350, and a motor.
磁力印加部４００は、タンク１２０及びキャピラリー２００を挟んで対向して設けられた一対の矩形磁石４１０を有している。一対の矩形磁石４１０は、キャピラリー２００の外径よりも大きい間隔で離れて位置している。また、磁力印加部４００は、一対の矩形磁石４１０の一方がキャピラリー２００に接近すると他方がキャピラリー２００から離間するように配置され、モーター４２０によって、一対の矩形磁石４１０がキャピラリー２００に接近したり離れたりするように揺動させることができるようになっている（詳しくは後述）。モーター４２０は、タンク１２０やキャピラリー２００のどの位置に磁力を印加する場合でも、必要に応じて駆動することができる。 The magnetic force application unit 400 includes a pair of rectangular magnets 410 provided to face each other with the tank 120 and the capillary 200 interposed therebetween. The pair of rectangular magnets 410 are located at a distance greater than the outer diameter of the capillary 200. The magnetic force applying unit 400 is arranged so that when one of the pair of rectangular magnets 410 approaches the capillary 200, the other is separated from the capillary 200, and the motor 420 causes the pair of rectangular magnets 410 to approach or separate from the capillary 200. (It will be described later in detail). The motor 420 can be driven as necessary regardless of the position of the tank 120 or the capillary 200 where the magnetic force is applied.
加熱部６００は、装着部３００にキャピラリー２００が装着された場合に、キャピラリー２００の第４プラグと第６プラグを加熱することができ、独立に制御される２個のヒーターを備える。 When the capillary 200 is mounted on the mounting unit 300, the heating unit 600 can heat the fourth plug and the sixth plug of the capillary 200, and includes two heaters that are controlled independently.
核酸抽出装置３０００は、第２プラグ２０の第１洗浄液及び第６プラグ６０の第２洗浄液の少なくとも一方による洗浄によって、磁性粒子Ｍに吸着した核酸の量が減少している場合でも、第４プラグ４０の溶出液に対して、十分な量の核酸を溶出させることができる。これにより、洗浄効果を高めることができるとともに、ＰＣＲのために十分な濃度の核酸を溶出液に対して溶出させることができる。 Even when the amount of nucleic acid adsorbed on the magnetic particles M is reduced by the washing with at least one of the first washing liquid of the second plug 20 and the second washing liquid of the sixth plug 60, the nucleic acid extraction device 3000 has the fourth plug. A sufficient amount of nucleic acid can be eluted with respect to 40 eluates. As a result, the washing effect can be enhanced, and a sufficient concentration of nucleic acid for PCR can be eluted from the eluate.
（４）矩形磁石の使用方法
図４は、核酸抽出用装置のうち、キャピラリー２００と矩形磁石４１０、及び矩形磁石４１０の使用方法が示されている。
(4) Usage Method of Rectangular Magnet FIG. 4 shows a usage method of the capillary 200, the rectangular magnet 410, and the rectangular magnet 410 in the nucleic acid extraction apparatus.
互いに正対する矩形磁石４１０は、容易にキャピラリー２００を挟み込み、上下運動のような単純作業によってキャピラリー２００に、磁力を印加し、キャピラリー２００内の磁性ビーズ１２５を上下させることができる。それによって、自動化装置の単純化が可能になる。 The rectangular magnets 410 facing each other can easily sandwich the capillary 200 and apply a magnetic force to the capillary 200 by a simple operation such as a vertical movement to move the magnetic beads 125 in the capillary 200 up and down. Thereby, the automation device can be simplified.
また、例えば、Ａのように、両側に２つある矩形磁石４１０のうち、左側をキャピラリー２００にちかづけることで、磁性ビーズ１２５はキャピラリー２００の左側に固まり、右側をキャピラリー２００にちかづけることで、磁性ビーズ１２５はキャピラリー２００の右側に固まる。また、Ｃのように、両方の矩形磁石４１０ともに、キャピラリー２００から離すことによって、磁性ビーズ１２５はキャピラリー２００内で、散在するようになる。従って、同じ場所で、矩形磁石４１０を左右に動かすことで、Ａの状態とＢの状態を繰りかえすことができ、磁性ビーズ１２５を揺動させることができる。 Further, for example, as shown in A, by placing the left side of two rectangular magnets 410 on the capillary 200, the magnetic beads 125 are solidified on the left side of the capillary 200, and on the right side of the capillary 200. The magnetic beads 125 are hardened on the right side of the capillary 200. Further, as in C, when both the rectangular magnets 410 are separated from the capillary 200, the magnetic beads 125 are scattered in the capillary 200. Therefore, by moving the rectangular magnet 410 left and right at the same place, the state A and the state B can be repeated, and the magnetic beads 125 can be swung.
（５）核酸抽出方法
以下、１本のキャピラリー２００を有する核酸抽出用装置３０００を用いた核酸抽出方法を示す。
(5) Nucleic acid extraction method Hereinafter, a nucleic acid extraction method using a nucleic acid extraction apparatus 3000 having one capillary 200 will be described.
インフルエンザの診断において、綿棒で咽頭内の粘膜から採取された検体を、タンク１３０の蓋１２２を外した後、溶解液１２４を含むタンク１３０内に挿入し、溶解液１２４に検体を採取した綿棒を浸すことで、ウイルスを溶解液１２４中に採取する。溶解液１２４内には、表面がシリカでコーティングされた磁性ビーズ１２５が入っており、蓋１２１を閉め、タンク１３０を振とうすることによって、磁性ビーズ１２５に核酸を吸着させる。 In the diagnosis of influenza, a sample collected from the mucous membrane in the pharynx with a cotton swab is removed from the lid 130 of the tank 130 and then inserted into the tank 130 containing the lysate 124. By soaking, the virus is collected in the lysate 124. The solution 124 contains magnetic beads 125 whose surfaces are coated with silica. The lid 121 is closed and the tank 130 is shaken to adsorb nucleic acids to the magnetic beads 125.
次に、再度、タンク１３０の蓋１２２を外し、キャピラリー１００の上栓１１０を外して、タンク１３０とキャピラリー１００を接続し、キャピラリーを重力方向に平行に設置する。 Next, the lid 122 of the tank 130 is removed again, the upper plug 110 of the capillary 100 is removed, the tank 130 and the capillary 100 are connected, and the capillary is installed in parallel to the direction of gravity.
その後、矩形磁石４１０を用い、キャピラリー１００に沿って、重力方向に動かすことによって、磁性ビーズ１２５を各プラグ内に通してゆく。途中で、図４に示したように、左右の矩形磁石４１０を交互に用いることによって、磁性ビーズ１２５を左右に振動させてもよい。 Thereafter, the magnetic beads 125 are passed through the plugs by moving in the direction of gravity along the capillary 100 using the rectangular magnet 410. On the way, as shown in FIG. 4, the magnetic beads 125 may be vibrated left and right by alternately using the left and right rectangular magnets 410.
磁性ビーズ１２５を、予めヒートブロックで４５℃に加熱した第４プラグまで移動させた後、３０秒間静止させ、逆転写反応を行う。 After moving the magnetic beads 125 to a fourth plug that has been heated to 45 ° C. in advance with a heat block, the magnetic beads 125 are allowed to stand still for 30 seconds to perform a reverse transcription reaction.
その後、さらに、磁性ビーズ１２５を、予めヒートブロックで８０℃に加熱した第６プラグまで移動させ、３０秒間、矩形磁石４１０を揺動させて、磁気ビーズ上のｃＤＮＡを溶出させる。 Thereafter, the magnetic beads 125 are further moved to a sixth plug that has been heated to 80 ° C. in advance with a heat block, and the rectangular magnet 410 is swung for 30 seconds to elute the cDNA on the magnetic beads.
最後に、キャピラリー１００の下栓１１０を外し、タンク１２０を指で両側から押してへこませることで、タンク１２０内を加圧し、キャピラリー１００の下端からオイル７０及び溶出液６０を押し出すことで、溶出させたｃＤＮＡを含む溶出液６０を別の容器に受け取ることが可能である。 Finally, the bottom cap 110 of the capillary 100 is removed, and the tank 120 is pressed from both sides with a finger to pressurize the tank 120, and the oil 70 and the eluate 60 are pushed out from the lower end of the capillary 100, thereby elution. It is possible to receive the eluate 60 containing the cleaved cDNA in another container.
あるいは、第６プラグ内で、ＰＣＲ反応を行なってもよい。 Alternatively, the PCR reaction may be performed in the sixth plug.
（６）１段階溶出と２段階溶出の比較
内径１．０ｍｍ、長さ１００ｍｍのキャピラリー及び１０ｍＬのタンクを用いて、第１〜第７プラグを有する核酸抽出用器具（２段階溶出用）を作製した。ここで、第２プラグは２５μＬ、第４及び第６プラグは２μＬとした。また、各オイルプラグの長さは、１２．５ｍｍとした。各プラグの溶液は、以下のものを用いた。
第２プラグ：５ｍＭトリス塩酸緩衝液
第４プラグ：
０．２ｕ／μＬ ＡＭＶ逆転写酵素（日本ジーン）
０．８ｍＭ ｄＮＴＰ
０．５μＭ プライマー（reverse）
２．０ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ
ｘ１ バッファー (MgCl2 7mM; Tris pH9.0 25mM; KCl 50mM)
第６プラグ：
０．０５ｕ／μＬ Ｇｅｎｅ Ｔａｑ ＮＴ ＰＣＲ酵素（日本ジーン）
０．５ｍＭ ｄＮＴＰ
０．５μＭ プライマー（forward）
０．５μＭ プライマー（reverse）
０．２５μＭ プローブ（Taq man）
２．０ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ
ｘ１ バッファー (MgCl2 7mM; Tris pH9.0 25mM; KCl 50mM)
(6) Comparison between 1-step elution and 2-step elution Using a capillary with an inner diameter of 1.0 mm, a length of 100 mm, and a 10 mL tank, a nucleic acid extraction instrument having first to seventh plugs (for two-step elution) is prepared. did. Here, the second plug was 25 μL, and the fourth and sixth plugs were 2 μL. The length of each oil plug was 12.5 mm. The following solutions were used for each plug.
Second plug: 5 mM Tris-HCl buffer Fourth plug:
0.2u / μL AMV reverse transcriptase (Nippon Gene)
0.8 mM dNTP
0.5μM primer (reverse)
2.0mg / mL BSA
x1 buffer (MgCl 2 7mM; Tris pH9.0 25mM; KCl 50mM)
6th plug:
0.05u / μL Gene Taq NT PCR enzyme (Nippon Gene)
0.5 mM dNTP
0.5μM primer (forward)
0.5μM primer (reverse)
0.25 μM probe (Taq man)
2.0mg / mL BSA
x1 buffer (MgCl 2 7mM; Tris pH9.0 25mM; KCl 50mM)
対照として、第６〜第７プラグを有さず、第４プラグにＰＣＲ用試薬が混合されている以下の溶液が入っているキャピラリー（１段階溶出用）を用いた。
第４プラグ：
０．２ｕ／μＬ ＡＭＶ逆転写酵素（日本ジーン）
０．１２５ｕ／μＬ Ｇｅｎｅ Ｔａｑ ＮＴ ＰＣＲ酵素（日本ジーン）
０．５ｍＭ ｄＮＴＰ
１．０μＭ プライマー（forward）
１．０μＭ プライマー（reverse）
０．５μＭ プローブ（Taq man）
４．０ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ
ｘ１ バッファー(MgCl2 7mM; Tris pH9.0 25mM; KCl 50mM)
As a control, a capillary (for one-step elution) that did not have the sixth to seventh plugs and contained the following solution mixed with the PCR reagent in the fourth plug was used.
4th plug:
0.2u / μL AMV reverse transcriptase (Nippon Gene)
0.125u / μL Gene Taq NT PCR enzyme (Nippon Gene)
0.5 mM dNTP
1.0μM primer (forward)
1.0μM primer (reverse)
0.5μM probe (Taq man)
4.0 mg / mL BSA
x1 buffer (MgCl 2 7 mM; Tris pH 9.0 25 mM; KCl 50 mM)
オリゴヌクレオチド配列：
プライマー（forward）：GAC CAA TCC TGT CAC CTC TGA C （配列番号１）
プライマー（reverse）：AGG GCA TTT TGG ACA AAG CGT CTA （配列番号２）
プローブ（Taq man）：FAM- TGC AGT CCT CGC TCA CTG GGC ACG -TAMRA （配列番号３）
Oligonucleotide sequence:
Primer (forward): GAC CAA TCC TGT CAC CTC TGA C (SEQ ID NO: 1)
Primer (reverse): AGG GCA TTT TGG ACA AAG CGT CTA (SEQ ID NO: 2)
Probe (Taq man): FAM-TGC AGT CCT CGC TCA CTG GGC ACG-TAMRA (SEQ ID NO: 3)
これらのキャピラリーについて、作製した直後のもの、１週間４℃保存のもの、６ヵ月間４℃保存のもの、の３種類を以下の実験に用いた。 Three types of these capillaries were used in the following experiments: those immediately after fabrication, those stored at 4 ° C. for 1 week, and those stored at 4 ° C. for 6 months.
タンクに、３５０μＬの溶解液[５Ｍグアニジンチオシアン酸塩、２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）］及び２μＬの磁性ビーズ分散液を入れて、検体を採取した綿棒を浸し、蓋を閉めて、３０秒間、約１００回振ることにより混合した。この磁性ビーズ分散液として、３０体積％の磁性シリカ粒子（ＮＰＫ−４０１、東洋紡績社）を含む３０質量％塩化ナトリウム水溶液を用いた。 350 μL of the lysate [5M guanidine thiocyanate, 2% Triton X-100, 50 mM Tris-HCl (pH 7.2)] and 2 μL of the magnetic bead dispersion were immersed in the tank, and the cotton swab from which the sample was collected was immersed. The lid was closed and mixed by shaking about 100 times for 30 seconds. As this magnetic bead dispersion, a 30% by mass aqueous sodium chloride solution containing 30% by volume of magnetic silica particles (NPK-401, Toyobo Co., Ltd.) was used.
このようにして準備したタンクを、キャピラリーに接続し、重力と平行になるように核酸抽出用器具を設置した。そして、容器側面に磁石を接触させ、上述の方法によって、洗浄、逆転写、溶出の工程を行い。溶出液をキャピラリーの外に放出した。得られた溶出液２μＬ全量を昇降式ＰＣＲ装置（特願２０１０−２６８０９０明細書・実施例１に記載の装置）を用いて、ＰＣＲ反応を行った。図５は、ＰＣＲサイクルの経過に伴う輝度の変化を示す。 The thus prepared tank was connected to a capillary, and a nucleic acid extraction instrument was installed so as to be parallel to gravity. Then, a magnet is brought into contact with the side surface of the container, and the steps of washing, reverse transcription and elution are performed by the above-described method. The eluate was discharged out of the capillary. The total amount of 2 μL of the obtained eluate was subjected to a PCR reaction using an elevating PCR apparatus (the apparatus described in Japanese Patent Application No. 2010-268090 specification / Example 1). FIG. 5 shows the change in luminance over the course of the PCR cycle.
図５より、対照の１段階溶出では、キャピラリー作製後１週間で、すでに検出感度が落ちており、６ヶ月経つと、ほとんど検出できなくなったのに対し、本発明の２段階溶出では、キャピラリー作製後６ヶ月経っても、ほとんど検出感度の現象は観察されなかった。 As shown in FIG. 5, in the one-step elution of the control, the detection sensitivity has already dropped in one week after the capillary production, and almost no detection was possible after six months, whereas in the two-step elution of the present invention, the capillary production was Even after 6 months, almost no detection sensitivity phenomenon was observed.
また、キャピラリー作製直後で比較しても（図６）、本発明の２段階溶出のほうが、対照の１段階溶出より、検出感度が高かった。 In addition, even when compared immediately after capillary production (FIG. 6), the detection sensitivity of the two-step elution of the present invention was higher than that of the control one-step elution.
（７）洗浄プラグを増やした場合
さらに、第５プラグと第６プラグとの間に、第５プラグ側から順に、オイルと混和しない洗浄液からなる第１０プラグ、及びオイルからなる第１１プラグを有したキャピラリーを作製し、作製直後に実験を行った。第１０プラグは第２プラグと同じプラグとし、第１１プラグは他のオイルプラグと同じプラグとした。なお、キャピラリー以外は、（２）と同様に実験を行った。図７は、ＰＣＲサイクルの経過に伴う輝度の変化を示す。
(7) When the number of cleaning plugs is increased Further, in order from the fifth plug side, there are a tenth plug made of a cleaning liquid that is immiscible with oil and an eleventh plug made of oil, between the fifth plug and the sixth plug. A capillary was prepared and an experiment was conducted immediately after the production. The tenth plug was the same plug as the second plug, and the eleventh plug was the same plug as the other oil plugs. The experiment was performed in the same manner as (2) except for the capillary. FIG. 7 shows the change in luminance over the course of the PCR cycle.
（３）で行ったように、洗浄プラグの無い場合と結果を比較すると（図７）、洗浄プラグを増やした場合のほうが、ＰＣＲによる増幅効率が良かった。 As was done in (3), comparing the results with the case without the washing plug (FIG. 7), the amplification efficiency by PCR was better when the number of washing plugs was increased.
１０〜７０ 第１〜第７プラグ
１００ キャピラリー
１１０ 栓
１２０ （装着後の）タンク
１２１ 開口部
１２２ 蓋
１２３ 空間
１２４ 溶解液
１２５ 磁気ビーズ
１３０ （装着前の）タンク
２００ キャピラリー
２２０ タンク
２２１ 開口部
２２２ 蓋
２２３ 空間
２２４ 溶解液
２２５ 磁気ビーズ
３００ 装着部
３１０ 添え板
３２０ クリップ機構
３３０ ヒンジ
３４０ ガイドレール
３５０ 駆動ベルト
４００ 磁力印加部
４１０ 矩形磁石
４２０ モーター
５００ 移動機構
６００ 加熱部
２０００ 核酸抽出器具
３０００ 核酸抽出装置
10 to 70 First to seventh plugs 100 Capillary 110 Plug 120 Tank 121 (after mounting) Opening 122 Lid 123 Space 124 Dissolved liquid 125 Magnetic beads 130 (Before mounting) Tank 200 Capillary 220 Tank 221 Opening 222 Lid 223 Space 224 Lysing solution 225 Magnetic bead 300 Mounting unit 310 Clip plate 320 Clip mechanism 330 Hinge 340 Guide rail 350 Driving belt 400 Magnetic force applying unit 410 Rectangular magnet 420 Motor 500 Moving mechanism 600 Heating unit 2000 Nucleic acid extraction instrument 3000 Nucleic acid extraction apparatus
Claims (8)
オイルと相分離し、核酸が結合した核酸結合性固相担体を洗浄するための第１洗浄液からなる第２プラグ、
第２のオイルからなる第３プラグ、
オイルと相分離し、逆転写反応を行うための逆転写反応液からなる第４プラグ、
第３のオイルからなる第５プラグ、
オイルと相分離し、核酸が結合した核酸結合性固相担体から前記核酸を溶出するための溶出液からなる第６プラグ、
第４のオイルからなる第７プラグ、
を、この順で内部に備えたチューブと、
前記チューブに前記核酸結合性固相担体を導入するためのタンクと、
を備えた核酸抽出用器具と、
前記チューブに磁力を印加するための磁力印加器具と、
を備えた核酸抽出用装置。 A first plug comprising a first oil;
A second plug comprising a first washing solution for washing the nucleic acid-binding solid phase carrier phase-separated from oil and bound with nucleic acid;
A third plug comprising a second oil;
A fourth plug comprising a reverse transcription reaction solution for phase separation from oil and performing a reverse transcription reaction,
A fifth plug comprising a third oil;
A sixth plug comprising an eluent for phase-separating from oil and eluting the nucleic acid from a nucleic acid-binding solid phase carrier to which the nucleic acid is bound;
A seventh plug comprising a fourth oil;
With the tubes provided inside in this order,
A tank for introducing the nucleic acid binding solid phase carrier into the tube;
A nucleic acid extraction instrument comprising:
A magnetic force applying device for applying a magnetic force to the tube;
A nucleic acid extraction apparatus comprising:
オイルと相分離し、核酸が結合した核酸結合性固相担体を洗浄するための第２洗浄液からなる第１０プラグ、及び
オイルからなる第１１プラグ、
を、さらに備える、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸抽出用装置。 The tube is between the fifth plug and the sixth plug in order from the fifth plug side,
A tenth plug made of a second washing solution for washing a nucleic acid-binding solid phase carrier phase-separated from oil and bound with nucleic acid, and an eleventh plug made of oil;
The nucleic acid extraction device according to any one of claims 1 to 3, further comprising:
前記開放端を封止する、着脱可能な栓をさらに有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸抽出用装置。 An open end at which an end of the tube on the seventh plug side is open,
The nucleic acid extraction apparatus according to claim 1, further comprising a detachable stopper that seals the open end.
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| JP2012237069A JP2014083041A (en) | 2012-10-26 | 2012-10-26 | Nucleic acid extraction apparatus |
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| JP2020500505A (en) * | 2016-11-07 | 2020-01-16 | ウェーブセンス インコーポレイテッド | Systems and methods for sequestering substances in bulk liquids |
| JP2020168600A (en) * | 2019-04-02 | 2020-10-15 | 株式会社島津製作所 | Magnetic particle operation device |
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2012
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