JP2014066661A - Method for detecting perspiratory gland cell - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、汗腺細胞の検出方法に関する。さらに詳しくは、皮膚化粧料などの開発などに有用な汗腺細胞を検出するための汗腺細胞の判定用マーカー、汗腺細胞の検出剤および汗腺細胞の検出方法に関する。 The present invention relates to a method for detecting sweat gland cells. More specifically, the present invention relates to a sweat gland cell determination marker, a sweat gland cell detection agent, and a sweat gland cell detection method for detecting sweat gland cells useful for development of skin cosmetics and the like.
汗腺は、汗を分泌する器官であり、主に体温調節の機能を担っていると考えられている。汗には、例えば、体臭の原因となるトランス−３−メチル−２−ヘキセン酸などの化合物の生成または分泌に関与する物質が含まれていることが知られている（例えば、特許文献１参照）。また、過度の発汗は、肌のベタつきおよび不快感を招くことがある。 The sweat glands are organs that secrete sweat and are thought to play a main role in regulating body temperature. For example, sweat is known to contain substances involved in the production or secretion of compounds such as trans-3-methyl-2-hexenoic acid that cause body odor (see, for example, Patent Document 1). ). Excessive sweating can also lead to skin stickiness and discomfort.
そこで、体臭の原因となる化合物の生成または分泌を抑制する成分を含むデオドラント剤、汗腺を閉塞または収斂させることなどによって発汗を抑制する成分を含む制汗剤などが開発されている。 Therefore, deodorant agents containing components that suppress the production or secretion of compounds that cause body odor, antiperspirants containing components that suppress sweating by blocking or converging sweat glands, and the like have been developed.
しかしながら、近年の清潔志向の高まりに伴い、体臭の原因となる化合物の生成または分泌、発汗などをより効果的に抑制することが求められている。そこで、体臭の原因となる化合物の生成または分泌、発汗などをより効果的に抑制する成分を開発するために、汗腺を特異的に同定する技術が求められている。 However, with the recent increase in cleanliness, there is a demand for more effectively suppressing the production or secretion of compounds that cause body odor, sweating, and the like. Therefore, in order to develop a component that more effectively suppresses the production or secretion of compounds causing body odor, sweating, and the like, a technique for specifically identifying sweat glands is required.
一方、汗腺細胞においては、ケラチン５が発現していることが知られている（例えば、非特許文献１参照）。しかしながら、ケラチン５は、皮膚組織または皮膚細胞集団において、表皮の基底細胞、皮脂腺などにおいても発現していることから、ケラチン５の発現に基づいて汗腺細胞のみを特異的に検出することが困難である。 On the other hand, it is known that keratin 5 is expressed in sweat gland cells (for example, see Non-Patent Document 1). However, since keratin 5 is also expressed in basal cells of the epidermis, sebaceous glands and the like in skin tissues or skin cell populations, it is difficult to specifically detect only sweat gland cells based on the expression of keratin 5. is there.
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであり、皮膚組織または皮膚細胞集団に含まれる細胞のなかから、汗腺細胞を簡便、かつ特異的に検出することができる汗腺細胞の判定用マーカー、汗腺細胞の検出剤および汗腺細胞の検出方法を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of such circumstances, and for determining sweat gland cells that can easily and specifically detect sweat gland cells from cells contained in skin tissue or a skin cell population. It is an object to provide a marker, a sweat gland cell detection agent, and a sweat gland cell detection method.
すなわち、本発明の要旨は、
（１）（Ａ）配列番号：１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号：１に示される配列に対する配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、前記（Ａ）のポリペプチドと同じ生理活性を示すポリペプチド、および
（Ｃ）配列番号：１において、１個もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加または挿入を有するアミノ酸配列からなり、前記（Ａ）のポリペプチドと同じ生理活性を示すポリペプチド
からなる群より選ばれたポリペプチド、または前記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列において、配列番号：１に示される配列中のアミノ酸番号：１のアミノ酸残基を含む連続した部分配列に対応するアミノ酸配列からなる部分ポリペプチドからなる汗腺細胞の判定用マーカー、
（２）前記（１）に記載の汗腺細胞の判定用マーカーに特異的に結合する結合物質と、前記汗腺細胞の判定用マーカーに結合した前記結合物質を検出するための検出試薬とを含んでなる汗腺細胞の検出剤、
（３）前記結合物質が、
（Ａ）配列番号：１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号：１に示される配列に対する配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、前記（Ａ）のポリペプチドと同じ生理活性を示すポリペプチド、および
（Ｃ）配列番号：１において、１個もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加または挿入を有するアミノ酸配列からなり、前記（Ａ）のポリペプチドと同じ生理活性を示すポリペプチド
からなる群より選ばれたポリペプチド、または前記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列において、配列番号：１に示される配列中のアミノ酸番号：１のアミノ酸残基を含む連続した部分配列に対応するアミノ酸配列からなる部分ポリペプチドに対する抗体または前記ポリペプチドもしくは部分ポリペプチドに対する結合活性を有する抗体断片である前記（２）に記載の汗腺細胞の検出剤、
（４）皮膚組織または皮膚細胞集団における前記（１）に記載の汗腺細胞の判定用マーカーの発現を指標として汗腺細胞を検出することを特徴とする汗腺細胞の検出方法、ならびに
（５）皮膚組織または皮膚細胞集団を含む試料と、前記（２）または（３）に記載の汗腺細胞の検出剤とを接触させ、前記検出剤に含まれる結合物質が結合した細胞を汗腺細胞であると判定する前記（４）に記載の検出方法
に関する。
That is, the gist of the present invention is as follows.
(1) (A) a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1,
(B) a polypeptide comprising an amino acid sequence having a sequence identity of 90% or more with respect to the sequence shown in SEQ ID NO: 1, and having the same physiological activity as the polypeptide of (A), and (C) SEQ ID NO: 1 A polypeptide selected from the group consisting of a polypeptide consisting of an amino acid sequence having substitution, deletion, addition or insertion of one or several amino acid residues and having the same physiological activity as the polypeptide of (A) above In the amino acid sequence of the peptide or any one of the polypeptides (A) to (C), amino acids corresponding to a continuous partial sequence containing the amino acid residue of amino acid number 1 in the sequence shown in SEQ ID NO: 1. A marker for determination of sweat gland cells consisting of a partial polypeptide consisting of a sequence;
(2) A binding substance that specifically binds to the sweat gland cell determination marker according to (1), and a detection reagent for detecting the binding substance that binds to the sweat gland cell determination marker. Sweat gland cell detection agent,
(3) The binding substance is
(A) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(B) a polypeptide comprising an amino acid sequence having a sequence identity of 90% or more with respect to the sequence shown in SEQ ID NO: 1, and having the same physiological activity as the polypeptide of (A), and (C) SEQ ID NO: 1 A polypeptide selected from the group consisting of a polypeptide consisting of an amino acid sequence having substitution, deletion, addition or insertion of one or several amino acid residues and having the same physiological activity as the polypeptide of (A) above In the amino acid sequence of the peptide or any one of the polypeptides (A) to (C), amino acids corresponding to a continuous partial sequence containing the amino acid residue of amino acid number 1 in the sequence shown in SEQ ID NO: 1. The antibody (2) which is an antibody against a partial polypeptide comprising a sequence or an antibody fragment having a binding activity to the polypeptide or partial polypeptide. Detection agents sweat gland cells described,
(4) A method for detecting sweat gland cells, characterized by detecting sweat gland cells using the expression of the marker for determination of sweat gland cells according to (1) above in skin tissue or a population of skin cells, and (5) skin tissue Alternatively, the sample containing the skin cell population is brought into contact with the sweat gland cell detection agent according to (2) or (3), and the cells bound by the binding substance contained in the detection agent are determined to be sweat gland cells. The present invention relates to the detection method according to (4).
本発明の汗腺細胞の判定用マーカー、汗腺細胞の検出剤および汗腺細胞の検出方法によれば、皮膚組織または皮膚細胞集団に含まれる細胞のなかから、汗腺細胞を簡便、かつ特異的に検出することができるという優れた効果を奏する。 According to the sweat gland cell determination marker, sweat gland cell detection agent, and sweat gland cell detection method of the present invention, sweat gland cells are easily and specifically detected from the cells contained in the skin tissue or skin cell population. There is an excellent effect of being able to.
１．汗腺細胞の判定用マーカー
本発明の汗腺細胞の判定用マーカーは、
（Ａ）配列番号：１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号：１に示される配列に対する配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、前記（Ａ）のポリペプチドの生理活性と同等の生理活性を示すポリペプチド、および
（Ｃ）配列番号：１において、１個もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加または挿入を有するアミノ酸配列からなり、前記（Ａ）のポリペプチドの生理活性と同等の生理活性を示すポリペプチド
からなる群より選ばれたポリペプチド、または前記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列において、配列番号：１に示される配列中のアミノ酸番号：１のアミノ酸残基を含む連続した部分配列に対応するアミノ酸配列からなる部分ポリペプチドからなることに１つの大きな特徴を有する。
1. Marker for determination of sweat gland cells The marker for determination of sweat gland cells of the present invention,
(A) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(B) a polypeptide comprising an amino acid sequence having a sequence identity of 90% or more with respect to the sequence represented by SEQ ID NO: 1, and having a physiological activity equivalent to the physiological activity of the polypeptide of (A), and (C) A polypeptide comprising an amino acid sequence having substitution, deletion, addition or insertion of one or several amino acid residues in SEQ ID NO: 1 and showing a physiological activity equivalent to the physiological activity of the polypeptide of (A) A polypeptide selected from the group consisting of: or an amino acid sequence of any one of the polypeptides (A) to (C) above, comprising the amino acid residue of amino acid number 1 in the sequence shown in SEQ ID NO: 1 One major characteristic is that it consists of a partial polypeptide consisting of an amino acid sequence corresponding to a continuous partial sequence.
前記ポリペプチドまたは部分ポリペプチドは、後述の実施例にも示されるように、ヒトの皮膚細胞のうち、汗腺細胞では発現しているが、汗腺細胞以外の皮膚細胞では発現していないため、かかるポリペプチドまたは部分ポリペプチドからなる本発明の汗腺細胞の判定用マーカーによれば、皮膚組織または皮膚細胞集団のなかから、汗腺細胞を簡便、かつ特異的に検出することができる。 The polypeptide or partial polypeptide is expressed in sweat gland cells among human skin cells, but is not expressed in skin cells other than sweat gland cells, as shown in Examples below. According to the sweat gland cell determination marker of the present invention comprising a polypeptide or a partial polypeptide, sweat gland cells can be easily and specifically detected from skin tissue or a skin cell population.
なお、本明細書において、「皮膚細胞集団」とは、皮膚組織から分離された複数の細胞の群をいう。 In the present specification, “skin cell population” refers to a group of a plurality of cells separated from skin tissue.
汗腺細胞としては、例えば、筋上皮細胞、管腔細胞などが挙げられるが、本発明は、係る例示のみに限定されるものではない。本発明の汗腺細胞の判定用マーカーは、前記汗腺細胞、好ましくは汗腺の基底側に存在する筋上皮細胞に発現している。 Examples of sweat gland cells include myoepithelial cells and luminal cells, but the present invention is not limited to such examples. The sweat gland cell determination marker of the present invention is expressed in the sweat gland cells, preferably myoepithelial cells present on the basal side of the sweat glands.
前記（Ａ）において、配列番号：１に示されるアミノ酸配列は、配列番号：２に示される配列からなるポリペプチドが切断されることによって生じる活性型ポリペプチドのアミノ酸配列である。 In (A) above, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence of the active polypeptide generated by cleaving the polypeptide consisting of the sequence shown in SEQ ID NO: 2.
前記（Ｂ）において、配列同一性は、ポリペプチドが、汗腺細胞における特異的な発現が見られる範囲であればよく、９０％以上であり、好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは１００％である。本明細書において、「配列同一性」は、配列番号：１に示されるアミノ酸配列（参照配列）に対して、評価対象のアミノ酸配列（クエリー配列）を、Ｅｘｐｅｃｔ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ：１０、ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ：３、Ｇａｐ Ｃｏｓｔｓ（Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ １１、Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ １）およびＭａｔｒｉｘ：ＢＬＳＵＭ６２の条件でＢＬＡＳＴアルゴリズムに基づくＰＲＯＴＥＩＮ ＢＬＡＳＴを用いてアライメントして算出された値をいう。 In (B), the sequence identity may be within the range where the polypeptide is specifically expressed in sweat gland cells, and is 90% or more, preferably 92% or more, more preferably 95% or more, More preferably, it is 98% or more, and particularly preferably 100%. In the present specification, “sequence identity” refers to the amino acid sequence (query sequence) to be evaluated with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (reference sequence), Expect threshold: 10, word size: 3, Gap Costs (Existence 11, Extension 1) and Matrix: A value calculated by alignment using PROTEIN BLAST based on the BLAST algorithm under conditions of BLSUM62.
前記（Ｃ）において、前記「１個もしくは数個」とは、１〜３０個であるが、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜３個、特に好ましくは１個または２個をいう。また、前記（Ｃ）において、前記置換は、特定のアミノ酸残基と、当該特定のアミノ酸残基と親水性、疎水性、極性、非極性、電荷、ｐＫ、立体構造上における特徴などの物理化学的性質が類似したアミノ酸残基（以下、本明細書においては、「類似アミノ酸残基」ともいう）との間の保存的置換であってもよい。前記保存的置換としては、例えば、グリシン残基およびアラニン残基の相互間での置換、バリン残基、イソロイシン残基およびロイシン残基の相互間での置換、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、アスパラギン残基およびグルタミン残基の相互間での置換、セリン残基およびスレオニン残基の相互間での置換、リジン残基およびアルギニン残基の相互間での置換、フェニルアラニン残基およびチロシン残基の相互間での置換などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。 In the above (C), the “one or several” is 1 to 30, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, further preferably 1 to 3, particularly preferably. Means one or two. In addition, in (C), the substitution is made up of a specific amino acid residue and physical chemistry such as the specific amino acid residue and hydrophilicity, hydrophobicity, polarity, nonpolarity, charge, pK, and steric features. It may be a conservative substitution between amino acid residues having similar physical properties (hereinafter also referred to as “similar amino acid residues”). Examples of the conservative substitution include substitution between glycine residue and alanine residue, substitution between valine residue, isoleucine residue and leucine residue, aspartic acid residue, glutamic acid residue, Substitution between asparagine and glutamine residues, substitution between serine and threonine residues, substitution between lysine and arginine residues, phenylalanine and tyrosine residues Although mutual substitution etc. are mentioned, this invention is not limited only to this illustration.
前記（Ａ）のポリペプチドの生理活性としては、例えば、シグナル伝達などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記シグナル伝達は、例えば、前記（Ａ）のポリペプチドに対するリガンドとの結合活性を測定することなどによって評価することができる。なお、本明細書において、「前記（Ａ）のポリペプチドの生理活性と同等の生理活性」とは、前記（Ａ）のポリペプチドの生理活性と同じ種類の活性をいう。 Examples of the physiological activity of the polypeptide (A) include signal transduction, but the present invention is not limited to such examples. The signal transduction can be evaluated by, for example, measuring the binding activity with a ligand for the polypeptide (A). In the present specification, the “physiological activity equivalent to the physiological activity of the polypeptide (A)” refers to the same type of activity as the physiological activity of the polypeptide (A).
前記部分ポリペプチドは、前記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列において、配列番号：１に示される配列中のアミノ酸番号：１のアミノ酸残基を含む連続した部分配列に対応するアミノ酸配列からなる。かかる部分配列の長さは、汗腺細胞に特異的に発現するポリペプチドのエピトープを含む範囲で適宜設定することができる。 The partial polypeptide is a continuous partial sequence including the amino acid residue of amino acid number 1 in the sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the amino acid sequence of the polypeptide of any one of (A) to (C). It consists of the corresponding amino acid sequence. The length of such a partial sequence can be appropriately set within the range including the polypeptide epitope specifically expressed in sweat gland cells.
以上説明したように、本発明の汗腺細胞の判定用マーカーによれば、ヒトの皮膚細胞のうち、汗腺細胞に特異的に発現していることから、皮膚組織または皮膚細胞集団のなかから、汗腺細胞を簡便、かつ特異的に検出することができる。したがって、本発明の汗腺細胞の判定用マーカーは、汗腺で分泌される成分の特定、汗腺の挙動の観察などの際に汗腺の特定に用いることができることから、制汗成分、デオドラント成分などの評価およびスクリーニング、制汗剤、デオドラント剤などの皮膚化粧料の開発などに有用である。 As described above, according to the sweat gland cell determination marker of the present invention, since it is expressed specifically in sweat gland cells among human skin cells, sweat glands can be obtained from the skin tissue or skin cell population. Cells can be detected conveniently and specifically. Therefore, the determination marker for sweat gland cells of the present invention can be used for identification of sweat glands when identifying components secreted by sweat glands and observing the behavior of sweat glands, so that evaluation of antiperspirant components, deodorant components, etc. It is also useful for screening, development of skin cosmetics such as antiperspirants and deodorants.
２．汗腺細胞の検出剤
本発明の汗腺細胞の検出剤は、前述した汗腺細胞の判定用マーカーに特異的に結合する結合物質と、前記汗腺細胞の判定用マーカーに結合した前記結合物質を検出するための検出試薬とを含んでいることに１つの大きな特徴を有する。したがって、本発明の汗腺細胞の検出剤によれば、汗腺細胞に発現する前記判定用マーカーに特異的に結合した当該結合物質を前記検出試薬によって検出することができることから、皮膚組織または皮膚細胞集団のなかから、汗腺細胞を簡便、かつ特異的に検出することができる。
2. Sweat Gland Cell Detection Agent The sweat gland cell detection agent of the present invention detects a binding substance that specifically binds to the aforementioned sweat gland cell determination marker and the binding substance that binds to the sweat gland cell determination marker. And one detection feature. Therefore, according to the detection agent for sweat gland cells of the present invention, since the binding substance specifically bound to the determination marker expressed in sweat gland cells can be detected by the detection reagent, skin tissue or skin cell population Among them, sweat gland cells can be detected easily and specifically.
前記結合物質としては、例えば、前記ポリペプチドまたは前記部分ポリペプチドに対する抗体（以下、単に、「抗体」という）、前記ポリペプチドまたは部分ポリペプチドに対する結合活性を有する抗体断片（以下、単に、「抗体断片」という）、汗腺細胞内における前記ポリペプチドまたは部分ポリペプチドの下流エフェクター分子などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。 Examples of the binding substance include an antibody to the polypeptide or the partial polypeptide (hereinafter simply referred to as “antibody”), and an antibody fragment having a binding activity to the polypeptide or the partial polypeptide (hereinafter simply referred to as “antibody”). And a downstream effector molecule of the polypeptide or partial polypeptide in sweat gland cells, but the present invention is not limited to such examples.
前記抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。前記抗体のなかでは、前記汗腺細胞の判定用マーカーに対する特異性が高いことから、モノクローナル抗体が好ましい。 The antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. Among the antibodies, a monoclonal antibody is preferable because of its high specificity for the determination marker of the sweat gland cells.
前記モノクローナル抗体は、例えば、前記ポリペプチドまたは部分ポリペプチドに対して反応性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを培養し、培養上清を得、得られた培養上清について、必要に応じて、硫安分画法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどによる精製を行なうことにより得られる。前記ハイブリドーマは、前記ポリペプチドまたは部分ポリペプチドを動物の静脈内、皮下または腹腔内に投与することにより当該動物を免疫し、抗体産生細胞を得、この抗体産生細胞とミエローマ細胞とを細胞融合させ、得られた融合細胞をＨＡＴ培地で培養することにより得られる。 The monoclonal antibody is, for example, cultivating a hybridoma that produces a monoclonal antibody reactive to the polypeptide or partial polypeptide, obtaining a culture supernatant, and for the obtained culture supernatant, if necessary, It can be obtained by performing purification by ammonium sulfate fractionation, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, affinity chromatography, and the like. The hybridoma immunizes the animal by administering the polypeptide or partial polypeptide intravenously, subcutaneously or intraperitoneally to obtain an antibody-producing cell, and the antibody-producing cell and myeloma cell are fused. It is obtained by culturing the obtained fused cells in a HAT medium.
前記ポリクローナル抗体は、前記ポリペプチドまたは部分ポリペプチドを動物の静脈内、皮下または腹腔内に投与することにより当該動物を免疫し、抗血清を得、得られた抗血清について、必要に応じて、硫安分画法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどによる精製を行なうことにより得られる。 The polyclonal antibody immunizes the animal by administering the polypeptide or partial polypeptide intravenously, subcutaneously or intraperitoneally, obtaining an antiserum, and for the obtained antiserum, if necessary, It can be obtained by performing purification by ammonium sulfate fractionation, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, affinity chromatography, and the like.
前記抗体断片としては、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、前記抗体の軽鎖の可変領域と前記抗体の重鎖の可変領域とがリンカーを介して連結された単鎖抗体などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記Ｆａｂフラグメントは、例えば、前記抗体をシステイン存在下に消化酵素であるパパインで分解し、必要に応じて、精製を行なうことなどによって作製することができる。また、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントは、例えば、前記抗体を、消化酵素であるペプシンなどで分解し、必要に応じて、精製を行なうことなどによって作製することができる。単鎖抗体は、前記抗体の軽鎖の可変領域をコードする核酸とリンカーをコードする核酸と前記抗体の重鎖の可変領域をコードする核酸とを連結した核酸構築物を含む単鎖抗体発現用ファージミドベクターを適切な宿主細胞に導入した後、当該宿主細胞内で核酸構築物にコードされるポリペプチドを発現させ、必要に応じて、精製を行なうことなどによって作製することができる。 Examples of the antibody fragment include a Fab fragment, an F (ab ′) 2 fragment, a single chain antibody in which the variable region of the light chain of the antibody and the variable region of the heavy chain of the antibody are linked via a linker, and the like. Although mentioned, this invention is not limited only to this illustration. The Fab fragment can be prepared, for example, by degrading the antibody with papain, which is a digestive enzyme, in the presence of cysteine, and purifying as necessary. The F (ab ′) 2 fragment can be prepared, for example, by decomposing the antibody with pepsin or the like, which is a digestive enzyme, and purifying it as necessary. A single chain antibody comprises a phagemid for expressing a single chain antibody comprising a nucleic acid construct in which a nucleic acid encoding a variable region of a light chain of the antibody, a nucleic acid encoding a linker, and a nucleic acid encoding a variable region of a heavy chain of the antibody are linked. After introducing the vector into an appropriate host cell, the polypeptide encoded by the nucleic acid construct is expressed in the host cell, and purified as necessary.
本発明の汗腺細胞の検出剤に用いることができる抗体または抗体断片の前記汗腺細胞の判定用マーカーに対する反応性は、例えば、酵素標識免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降法などの免疫測定法などによって確認することができる。 The reactivity of the antibody or antibody fragment that can be used in the sweat gland cell detection agent of the present invention to the sweat gland cell determination marker is, for example, an immunoassay such as enzyme-labeled immunoassay (ELISA) or immunoprecipitation. Can be confirmed.
前記下流エフェクター分子としては、例えば、ＣＳＬファミリー転写因子などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。 Examples of the downstream effector molecule include CSL family transcription factors, but the present invention is not limited to such examples.
本発明の汗腺細胞の検出剤中における前記結合物質の含有量は、前記結合物質の種類、本発明の汗腺細胞の検出剤の用途などによって異なるため、一概に決定されるものではないことから、前記結合物質の種類、本発明の汗腺細胞の検出剤の用途などに応じて適宜設定することが好ましい。 Since the content of the binding substance in the sweat gland cell detection agent of the present invention varies depending on the type of the binding substance, the use of the sweat gland cell detection agent of the present invention, etc., it is not generally determined. It is preferable to set appropriately according to the kind of the binding substance, the use of the detection agent for sweat gland cells of the present invention, and the like.
前記検出試薬としては、例えば、標識物質、前記結合物質または当該結合物質と汗腺細胞の判定用マーカーとを含む複合体への特異的結合能を有する第２の結合物質に前記標識物質が結合している標識結合物質などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。 As the detection reagent, for example, the labeling substance is bound to a second binding substance having a specific binding ability to a labeling substance, the binding substance or a complex containing the binding substance and a sweat gland cell determination marker. However, the present invention is not limited to such examples.
前記標識物質としては、例えば、蛍光物質、酵素などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記蛍光物質としては、例えば、フルオレセインイソチオシアネート、２−（３−イミニオ−４，５−ジスルホナト−６−アミノ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−５−［［５−（２，５−ジオキソ−３−ピロリン−１−イル）ペンチル］カルバモイル］安息香酸〔例えば、インビトロジェン製、商品名：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８など〕、４−［［２−［（５−カルボキシペンチル）アミノ］−２−オキソエチル］チオ］−２，３，５−トリクロロ−６−（１，３，４，８，９，１０−ヘキサヒドロ−２，２，４，８，１０，１０−ヘキサメチル−１２，１４−ジスルホ−２Ｈ−ピラノ［３，２−ｇ：５，６−ｇ’］ジキノリン−６−イル）安息香酸・ナトリウム〔例えば、インビトロジェン製、商品名：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６など〕などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。また、前記酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリホスフォターゼなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらの標識物質のなかでは、操作が容易であり、かつ共染色によってマーカーの局在を高い精度で解析することができることから、蛍光物質が好ましく、２−（３−イミニオ−４，５−ジスルホナト−６−アミノ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−５−［［５−（２，５−ジオキソ−３−ピロリン−１−イル）ペンチル］カルバモイル］安息香酸および４−［［２−［（５−カルボキシペンチル）アミノ］−２−オキソエチル］チオ］−２，３，５−トリクロロ−６−（１，３，４，８，９，１０−ヘキサヒドロ−２，２，４，８，１０，１０−ヘキサメチル−１２，１４−ジスルホ−２Ｈ−ピラノ［３，２−ｇ：５，６−ｇ’］ジキノリン−６−イル）安息香酸・ナトリウムがより好ましい。 Examples of the labeling substance include a fluorescent substance and an enzyme, but the present invention is not limited to such examples. Examples of the fluorescent substance include fluorescein isothiocyanate, 2- (3-iminio-4,5-disulfonato-6-amino-3H-xanthen-9-yl) -5-[[5- (2,5-dioxo -3-pyrrolin-1-yl) pentyl] carbamoyl] benzoic acid [for example, manufactured by Invitrogen, trade name: Alexa Fluor 488, etc.], 4-[[2-[(5-carboxypentyl) amino] -2-oxoethyl] Thio] -2,3,5-trichloro-6- (1,3,4,8,9,10-hexahydro-2,2,4,8,10,10-hexamethyl-12,14-disulfo-2H- Pyrano [3,2-g: 5,6-g ′] diquinolin-6-yl) benzoic acid / sodium [for example, manufactured by Invitrogen, trade name: Alexa Fluor 5 6, etc.] Although the like, the present invention is not limited only to those exemplified. Examples of the enzyme include peroxidase, alkaline phosphatase, and the like, but the present invention is not limited to such examples. Among these labeling substances, a fluorescent substance is preferable because it is easy to operate and can analyze the localization of the marker with high accuracy by co-staining, and 2- (3-iminio-4,5-disulfonate -6-amino-3H-xanthen-9-yl) -5-[[5- (2,5-dioxo-3-pyrrolin-1-yl) pentyl] carbamoyl] benzoic acid and 4-[[2-[( 5-carboxypentyl) amino] -2-oxoethyl] thio] -2,3,5-trichloro-6- (1,3,4,8,9,10-hexahydro-2,2,4,8,10, 10-hexamethyl-12,14-disulfo-2H-pyrano [3,2-g: 5,6-g ′] diquinolin-6-yl) benzoic acid / sodium is more preferred.
前記検出試薬が標識物質である場合、当該標識物質を前記結合物質に直接結合させて用いることができる。 When the detection reagent is a labeling substance, the labeling substance can be used by directly binding to the binding substance.
前記第２の結合物質および標識結合物質は、前記結合物質の種類によって異なるため、一概に決定されるものではないことから、前記結合物質の種類に応じて適宜選択することが好ましい。前記結合物質が抗体または抗体断片である場合、前記第２の結合物質としては、例えば、前記抗体を製造する際に免疫した動物が有する免疫グロブリンまたは当該免疫グロブリンの断片などに対する抗体（以下、「抗免疫グロブリン抗体」ともいう）などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記結合物質が抗体または抗体断片である場合、前記標識結合物質としては、例えば、前記抗免疫グロブリン抗体に前記標識物質が結合している標識抗免疫グロブリン抗体などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。また、前記結合物質が前記下流エフェクター分子である場合、前記第２の結合物質としては、例えば、前記下流エフェクター分子に対する抗体（以下、「抗エフェクター抗体」ともいう）などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記結合物質が抗エフェクター抗体である場合、前記標識結合物質としては、例えば、前記抗エフェクター抗体に前記標識物質が結合している標識抗エフェクター抗体などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。 Since the second binding substance and the label binding substance are different depending on the type of the binding substance and are not generally determined, it is preferable to select them appropriately according to the type of the binding substance. When the binding substance is an antibody or antibody fragment, examples of the second binding substance include an antibody against an immunoglobulin or an immunoglobulin fragment of an animal immunized when the antibody is produced (hereinafter, “ The present invention is not limited to only such examples. When the binding substance is an antibody or an antibody fragment, examples of the label binding substance include a labeled anti-immunoglobulin antibody in which the labeling substance is bound to the anti-immunoglobulin antibody. It is not limited only to such illustration. When the binding substance is the downstream effector molecule, examples of the second binding substance include an antibody against the downstream effector molecule (hereinafter, also referred to as “anti-effector antibody”). Is not limited to such examples. When the binding substance is an anti-effector antibody, examples of the labeled binding substance include a labeled anti-effector antibody in which the labeling substance is bound to the anti-effector antibody, but the present invention is only such examples. It is not limited to.
なお、本発明においては、前記結合物質にビオチン、アビジン、ストレプトアビジンなどを結合させて用いることもできる。ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンなどを用いた場合、ビオチン−アビジン間の特異的親和性またはビオチン−ストレプトアビジン間の特異的親和性を利用して汗腺細胞の判定用マーカーに結合した前記結合物質を検出することが可能になる。前記結合物質にビオチンを結合させた場合、第２の結合物質としてアビジンまたはストレプトアビジンを用いることができる。また、前記結合物質にアビジンまたはストレプトアビジンを結合させた場合、第２の結合物質としてビオチンを用いることができる。 In the present invention, biotin, avidin, streptavidin or the like can be bound to the binding substance. When biotin, avidin, streptavidin, etc. are used, the binding substance bound to the marker for determination of sweat gland cells is detected using the specific affinity between biotin and avidin or the specific affinity between biotin and streptavidin. It becomes possible to do. When biotin is bound to the binding substance, avidin or streptavidin can be used as the second binding substance. Further, when avidin or streptavidin is bound to the binding substance, biotin can be used as the second binding substance.
本発明の汗腺細胞の検出剤中における前記検出試薬の含有量は、前記結合物質および検出試薬の種類、本発明の汗腺細胞の検出剤の用途などによって異なるため、一概に決定されるものではないことから、前記結合物質および検出試薬の種類、本発明の汗腺細胞の検出剤の用途などに応じて適宜設定することが好ましい。 The content of the detection reagent in the sweat gland cell detection agent of the present invention varies depending on the types of the binding substance and detection reagent, the use of the sweat gland cell detection agent of the present invention, and so on, and thus is not generally determined. Therefore, it is preferable to set appropriately according to the kind of the binding substance and detection reagent, the use of the detection agent for sweat gland cells of the present invention, and the like.
本発明の汗腺細胞の検出剤は、本発明の目的が妨げられない範囲内で、例えば、前記結合物質の安定化剤、水、ｐＨ調整剤、キレート化剤などの助剤をさらに含有していてもよい。また、本発明の汗腺細胞の検出剤は、汗腺細胞の検出精度をより向上させる観点から、前記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列において、配列番号：１に示される配列中のアミノ酸番号：１のアミノ酸残基を除く部分配列に対応するアミノ酸配列からなる内部部分ポリペプチドに対する抗体または抗体断片をさらに含有していてもよい。 The sweat gland cell detection agent of the present invention further contains, for example, auxiliary agents such as a stabilizer for the binding substance, water, a pH adjuster, and a chelating agent within the range in which the object of the present invention is not hindered. May be. Further, the sweat gland cell detection agent of the present invention is represented by SEQ ID NO: 1 in the amino acid sequence of the polypeptide of any one of (A) to (C) from the viewpoint of further improving the detection accuracy of sweat gland cells. An antibody or antibody fragment against an internal partial polypeptide consisting of an amino acid sequence corresponding to the partial sequence excluding the amino acid residue of amino acid number 1 in the sequence may be further contained.
以上説明したように、本発明の汗腺細胞の検出剤によれば、ヒトの皮膚細胞のうち、汗腺細胞に特異的に発現している前記汗腺細胞の判定用マーカーに特異的に結合する結合物質と前記結合物質を検出するための検出試薬とを含んでいるので、皮膚組織または皮膚細胞集団のなかから、汗腺細胞を簡便、かつ特異的に検出することができる。したがって、本発明の汗腺細胞の検出剤は、汗腺で分泌される成分の特定、汗腺の挙動の観察などの際に汗腺の特定に用いることができることから、制汗成分、デオドラント成分などの評価およびスクリーニング、制汗剤、デオドラント剤などの皮膚化粧料の開発などに有用である。 As described above, according to the sweat gland cell detection agent of the present invention, among the human skin cells, the binding substance that specifically binds to the sweat gland cell determination marker that is specifically expressed in the sweat gland cells. And a detection reagent for detecting the binding substance, sweat gland cells can be easily and specifically detected from the skin tissue or the skin cell population. Therefore, the sweat gland cell detection agent of the present invention can be used for identification of sweat glands when identifying components secreted by sweat glands, observing the behavior of sweat glands, etc., and therefore evaluating antiperspirant components, deodorant components, etc. This is useful for screening, development of skin cosmetics such as antiperspirants and deodorants.
３．汗腺細胞の検出方法
本発明の汗腺細胞の検出方法は、皮膚組織または皮膚細胞集団における本発明の汗腺細胞の判定用マーカーの発現を指標として汗腺細胞を検出することに１つの大きな特徴を有する。本発明の汗腺細胞の検出方法は、皮膚組織または皮膚細胞集団における本発明の汗腺細胞の判定用マーカーの発現が汗腺細胞の指標として用いられているため、皮膚組織または皮膚細胞集団のなかから、汗腺細胞を簡便、かつ特異的に検出することができる。
3. Sweat Gland Cell Detection Method The sweat gland cell detection method of the present invention has one major feature in detecting sweat gland cells using the expression of the sweat gland cell determination marker of the present invention in skin tissue or a skin cell population as an index. In the method for detecting sweat gland cells of the present invention, since the expression of the marker for determination of sweat gland cells of the present invention in skin tissue or skin cell population is used as an index of sweat gland cells, Sweat gland cells can be detected easily and specifically.
本発明の汗腺細胞の検出方法は、操作が簡便であることから、皮膚組織または皮膚細胞集団を含む試料と、前記汗腺細胞の検出剤とを接触させ、前記検出剤に含まれる結合物質が結合した細胞を汗腺細胞であると判定することが好ましい。 Since the method for detecting sweat gland cells of the present invention is simple in operation, a sample containing skin tissue or a population of skin cells is brought into contact with the sweat gland cell detection agent, and the binding substance contained in the detection agent binds. It is preferable to determine that the obtained cells are sweat gland cells.
本発明の汗腺細胞の検出方法においては、例えば、
（Ｉ）皮膚組織または皮膚細胞集団を含む試料と、前記汗腺細胞の検出剤とを混合して前記皮膚組織または皮膚細胞集団と前記検出剤に含まれる結合物質とを接触させるステップ、
（ＩＩ）前記ステップ（Ｉ）で得られた混合物中の前記結合物質が結合した細胞を検出するステップ、および
（ＩＩＩ）前記ステップ（ＩＩ）において、前記結合物質が結合したことが検出された細胞を汗腺細胞であると判定するステップ
を含むプロセスを行なうことができる。
In the method for detecting sweat gland cells of the present invention, for example,
(I) mixing a sample containing skin tissue or a skin cell population with the sweat gland cell detection agent and bringing the skin tissue or skin cell population into contact with a binding substance contained in the detection agent;
(II) detecting a cell to which the binding substance is bound in the mixture obtained in step (I); and (III) a cell in which the binding substance is detected to be bound in step (II). A process can be performed that includes determining that is a sweat gland cell.
ステップ（Ｉ）では、皮膚組織または皮膚細胞集団を含む試料と、前記汗腺細胞の検出剤とを混合して前記皮膚組織または皮膚細胞集団と前記検出剤に含まれる結合物質とを接触させる。 In step (I), the sample containing skin tissue or skin cell population and the sweat gland cell detection agent are mixed to bring the skin tissue or skin cell population into contact with the binding substance contained in the detection agent.
前記皮膚組織または皮膚細胞集団を含む試料としては、例えば、固定液によって皮膚組織または皮膚細胞集団を固定した試料（以下、「固定試料」という）などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記固定試料は、前記皮膚組織または皮膚細胞集団に含まれる各細胞の細胞膜が前記検出剤を透過させるのに十分な透過性を有する状態にされた試料であればよい。 Examples of the sample containing the skin tissue or skin cell population include a sample in which the skin tissue or skin cell population is fixed with a fixing solution (hereinafter referred to as “fixed sample”), but the present invention is only such examples. It is not limited to. The fixed sample may be a sample in which the cell membrane of each cell included in the skin tissue or skin cell population has a sufficient permeability to allow the detection agent to pass therethrough.
皮膚組織または皮膚細胞集団は、用いられる皮膚組織または皮膚細胞集団に適した培地中、用いられる皮膚組織または皮膚細胞集団に適した条件下で培養することができる。 The skin tissue or skin cell population can be cultured in a medium suitable for the skin tissue or skin cell population used under conditions suitable for the skin tissue or skin cell population used.
前記培地としては、皮膚組織または皮膚細胞集団が生育するのに適した成分、例えば、アミノ酸、ビタミン、無機塩、糖類、細胞増殖促進因子〔例えば、細胞成長因子、ホルモン（例えば、インスリン、上皮細胞増殖因子、ハイドロコーチゾンなど）など〕、ウシ脳下垂体抽出物（ＢＰＥ）などを含む培地であればよい。前記培地は、慣用の基本培地に、必要な成分を補った培地であってもよく、市販されている培地であってもよい。 The medium includes components suitable for growth of skin tissue or skin cell population, such as amino acids, vitamins, inorganic salts, saccharides, cell growth promoting factors [eg, cell growth factors, hormones (eg, insulin, epithelial cells). Growth medium, hydrocortisone, etc.)], bovine pituitary extract (BPE) and the like. The medium may be a conventional basic medium supplemented with necessary components, or a commercially available medium.
皮膚組織または皮膚細胞集団の固定は、例えば、皮膚組織または皮膚細胞集団が入っている培養容器中に、固定液を添加して、皮膚組織または皮膚細胞集団と固定液とを接触させることなどによって行なわれる。 The fixation of the skin tissue or skin cell population is performed, for example, by adding a fixative to a culture container containing the skin tissue or skin cell population and bringing the skin tissue or skin cell population into contact with the fixative. Done.
前記固定液としては、例えば、アセトン、メタノール、アセトンとメタノールとの混合溶液（以下、「アセトン−メタノール混合溶液」という）、ホルムアルデヒド水溶液、ホルムアルデヒドのリン酸緩衝液溶液、パラホルムアルデヒド水溶液、パラホルムアルデヒドのリン酸緩衝液溶液などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらの固定液のなかでは、固定組織または固定細胞集団において、前記検出剤に含まれる結合物質との反応性を十分に確保する観点から、好ましくはアセトンである。 Examples of the fixing solution include acetone, methanol, a mixed solution of acetone and methanol (hereinafter referred to as “acetone-methanol mixed solution”), an aqueous formaldehyde solution, a phosphate buffer solution of formaldehyde, an aqueous paraformaldehyde solution, and paraformaldehyde aqueous solution. Examples thereof include a phosphate buffer solution, but the present invention is not limited to such examples. Among these fixing solutions, acetone is preferable from the viewpoint of sufficiently ensuring the reactivity with the binding substance contained in the detection agent in a fixed tissue or a fixed cell population.
皮膚組織または皮膚細胞集団を固定することによって得られた固定組織または固定細胞集団は、必要に応じて、適切な洗浄液で洗浄してもよく、洗浄しなくてもよい。前記洗浄液としては、例えば、リン酸緩衝化生理的食塩水、トリス緩衝化生理的食塩水などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。 The fixed tissue or fixed cell population obtained by fixing the skin tissue or skin cell population may or may not be washed with an appropriate washing solution as necessary. Examples of the washing solution include phosphate buffered physiological saline and Tris buffered physiological saline, but the present invention is not limited to such examples.
ステップ（Ｉ）において、皮膚組織または皮膚細胞集団を含む試料と、前記汗腺細胞の検出剤との混合比および接触時間は、前記試料中における皮膚組織または皮膚細胞集団の含有量、前記検出剤中における結合物質の含有量などによって異なるため、一概に決定されるものではないことから、前記試料中における皮膚組織または皮膚細胞集団の含有量、前記検出剤中における結合物質の含有量などに応じて適宜設定することが好ましい。 In step (I), the mixing ratio and the contact time of the sample containing skin tissue or skin cell population and the detection agent for sweat gland cells are the content of the skin tissue or skin cell population in the sample, Since it differs depending on the content of the binding substance in the sample, it is not generally determined, so depending on the content of the skin tissue or skin cell population in the sample, the content of the binding substance in the detection agent, etc. It is preferable to set appropriately.
ステップ（ＩＩ）では、前記ステップ（Ｉ）で得られた混合物中の前記結合物質が結合した細胞を検出する。前記結合物質が結合した細胞の検出は、前記検出剤に含まれる検出試薬の種類に応じた方法によって検出することができる。前記検出試薬が標識物質として蛍光物質が用いられた標識結合物質である場合、当該蛍光物質が発する蛍光に基づいて前記結合物質が結合した細胞を検出することができる。また、前記検出試薬が標識物質として酵素が用いられた標識結合物質である場合、当該酵素とその基質との反応時に生じる反応生成物に基づいて前記結合物質が結合した細胞を検出することができる。 In step (II), cells bound with the binding substance in the mixture obtained in step (I) are detected. Detection of cells bound by the binding substance can be detected by a method according to the type of detection reagent contained in the detection agent. When the detection reagent is a label-binding substance in which a fluorescent substance is used as a labeling substance, cells to which the binding substance is bound can be detected based on the fluorescence emitted by the fluorescent substance. In addition, when the detection reagent is a label binding substance in which an enzyme is used as a labeling substance, a cell to which the binding substance is bound can be detected based on a reaction product generated during the reaction between the enzyme and its substrate. .
ステップ（ＩＩＩ）では、前記ステップ（ＩＩ）において、前記結合物質が結合したことが検出された細胞を汗腺細胞であると判定する。前記結合物質が結合した細胞は、汗腺細胞の判定用マーカーを発現する皮膚細胞であることから、汗腺細胞であると判断することができる。 In step (III), the cell in which the binding substance is detected to be bound in step (II) is determined to be a sweat gland cell. Since the cells to which the binding substance is bound are skin cells that express the sweat gland cell determination marker, it can be determined that they are sweat gland cells.
以上説明したように、本発明の汗腺細胞の検出方法によれば、汗腺細胞に特異的に発現している前記汗腺細胞の判定用マーカーが汗腺細胞の指標として用いられているので、皮膚組織または皮膚細胞集団に含まれる細胞のなかから、汗腺細胞を簡便、かつ特異的に検出することができる。したがって、本発明の汗腺細胞の検出方法は、汗腺で分泌される成分の特定、汗腺の挙動の観察などの際に汗腺の特定に用いることができることから、制汗成分、デオドラント成分などの評価およびスクリーニング、制汗剤、デオドラント剤などの皮膚化粧料の開発などに有用である。 As described above, according to the method for detecting sweat gland cells of the present invention, since the sweat gland cell determination marker specifically expressed in sweat gland cells is used as an index of sweat gland cells, Sweat gland cells can be detected easily and specifically from the cells contained in the skin cell population. Therefore, since the method for detecting sweat gland cells of the present invention can be used for identification of sweat glands when identifying components secreted in sweat glands and observing sweat gland behavior, evaluation of antiperspirant components, deodorant components, etc. This is useful for screening, development of skin cosmetics such as antiperspirants and deodorants.
４．汗腺細胞の分離方法
前記汗腺細胞の判定用マーカーは、皮膚細胞集団からの汗腺細胞の分離に用いることができる。本発明の汗腺細胞の分離方法は、
（ｉ）皮膚細胞集団を含む試料と本発明の汗腺細胞の判定用マーカーに特異的に結合する結合物質とを混合して当該皮膚細胞集団と前記結合物質とを接触させるステップ、および
（ｉｉ）前記ステップ（ｉ）で得られた混合物中に含まれる皮膚細胞集団から前記結合物質が結合した細胞を分離するステップ
を含むことに１つの大きな特徴を有する。本発明の汗腺細胞の分離方法は、皮膚細胞集団から前記結合物質が結合した細胞を分離するため、汗腺細胞を簡便に分離することができる。
4). Sweat Gland Cell Separation Method The sweat gland cell determination marker can be used to separate sweat gland cells from a skin cell population. The method for separating sweat gland cells of the present invention comprises:
(I) mixing a sample containing a skin cell population with a binding substance that specifically binds to the sweat gland cell determination marker of the present invention, and bringing the skin cell population into contact with the binding substance; and (ii) One major feature is that it includes the step of separating the cells bound by the binding substance from the skin cell population contained in the mixture obtained in the step (i). Since the method for separating sweat gland cells of the present invention separates cells bound with the binding substance from the skin cell population, sweat gland cells can be easily separated.
前記皮膚細胞集団を含む試料としては、例えば、固定液によって皮膚細胞集団を固定した試料などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。皮膚細胞集団の固定は、前記汗腺細胞の検出方法における皮膚細胞集団の固定と同様の操作を行なうことによって実施することができる。 Examples of the sample containing the skin cell population include a sample in which the skin cell population is fixed with a fixing solution, but the present invention is not limited to such examples. The fixation of the skin cell population can be carried out by performing the same operation as the fixation of the skin cell population in the sweat gland cell detection method.
前記ステップ（ｉ）において、皮膚細胞集団を含む試料と、前記結合物質との混合比および接触時間は、前記試料中における皮膚細胞集団の含有量などによって異なるため、一概に決定されるものではないことから、前記試料中における皮膚細胞集団の含有量などに応じて適宜設定することが好ましい。 In step (i), the mixing ratio and contact time between the sample containing the skin cell population and the binding substance are different depending on the content of the skin cell population in the sample and so on, and thus are not generally determined. Therefore, it is preferable to set appropriately according to the content of the skin cell population in the sample.
前記ステップ（ｉｉ）において、前記ステップ（ｉ）で得られた混合物中に含まれる皮膚細胞集団から前記結合物質が結合した細胞を分離する。前記結合物質が結合した細胞の分離は、前記結合試薬などを用いることによって行なうことができる。かかるステップ（ｉｉ）における前記結合物質が結合した細胞の分離には、例えば、フローサイトメトリーなどを用いることができる。 In the step (ii), cells bound with the binding substance are separated from the skin cell population contained in the mixture obtained in the step (i). Separation of cells bound by the binding substance can be performed by using the binding reagent or the like. In the step (ii), for example, flow cytometry can be used for separation of the cells bound with the binding substance.
以上説明したように、本発明の汗腺細胞の分離方法によれば、皮膚細胞集団から前記結合物質が結合した細胞を簡便に分離することができる。 As described above, according to the method for separating sweat gland cells of the present invention, cells bound with the binding substance can be easily separated from the skin cell population.
つぎに、実施例に基づいて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例のみに限定されるものではない。 Next, the present invention will be described in more detail based on examples. However, the present invention is not limited to the examples.
実施例１
ヒト皮膚凍結組織を、凍結組織切片作製用包埋剤〔サクラファインテックジャパン（株）製、商品名：ティッシュー・テックＯ．Ｃ．Ｔコンパウンド〕に包埋させた。包埋後の組織を、液体窒素で冷却された２−メチルブタンで凍結させ、凍結切片を作製した。得られた凍結切片を１時間風乾させた後、−２０℃に冷却されたアセトンで固定した。固定後の切片をリン酸緩衝生理的食塩水で２回洗浄した。洗浄後の切片を０．３体積％過酸化水素含有リン酸緩衝生理的食塩水溶液中でインキュベーションすることにより、当該切片における内因性のペルオキシターゼを不活化させた。つぎに、インキュベーション後の切片をリン酸緩衝生理的食塩水で３回洗浄した。洗浄後の切片を、０．５体積％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ含有リン酸緩衝生理的食塩水溶液中で１０分間インキュベーションすることにより、切片の浸透化処理を行なった。浸透化処理後の切片をリン酸緩衝生理的食塩水で３回洗浄した。つぎに、得られた切片を１質量％ヤギ血清−リン酸緩衝生理的食塩水溶液中で３０分間インキュベーションすることにより、ブロッキング処理を行なった。
Example 1
An embedding agent for frozen tissue section preparation [manufactured by Sakura Finetech Japan Co., Ltd., trade name: Tissue Tech O. C. Embedded in [T compound]. The embedded tissue was frozen with 2-methylbutane cooled with liquid nitrogen to prepare a frozen section. The obtained frozen section was air-dried for 1 hour and then fixed with acetone cooled to -20 ° C. The section after fixation was washed twice with phosphate buffered saline. Endogenous peroxidase in the section was inactivated by incubating the section after washing in a phosphate buffered saline solution containing 0.3% by volume hydrogen peroxide. Next, the section after incubation was washed three times with phosphate buffered saline. The section after permeation was permeabilized by incubating the section after washing for 10 minutes in a phosphate buffered saline solution containing 0.5% by volume Triton-X. The section after permeabilization was washed three times with phosphate buffered saline. Next, blocking treatment was performed by incubating the obtained section for 30 minutes in a 1% by mass goat serum-phosphate buffered physiological saline solution.
ブロッキング処理後の切片を、一次抗体含有０．１質量％ヤギ血清−リン酸緩衝生理的食塩水溶液中、４℃で１６時間インキュベーションした後、リン酸緩衝生理的食塩水で３回洗浄した。なお、一次抗体として種々のポリペプチドに対するモノクローナル抗体を用いた。その後、得られた切片を西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体（抗ヤギＩｇＧ抗体）とともに室温（２５℃）で１時間インキュベーションした。インキュベーション後の切片をリン酸緩衝生理的食塩水で３回洗浄した後、当該切片に３，３−ジアミノベンジジンを滴下してペルオキシダーゼ反応を行なうことにより、前記切片中における一次抗体が結合した部位を染色した。また、染色後の切片をリン酸緩衝生理的食塩水で３回洗浄した後、切片の核を核染色剤〔和光純薬社製、商品名：ヘマトキシリンン染色液〕によって染色した。染色後の切片を流水で１０分間洗浄した。洗浄後の切片を９５体積％エタノール水溶液中で３分間浸漬させた後、１００体積％エタノール中で３分間のインキュベーションを３回行ない、つぎにキシレン中で３分間のインキュベーションを４回行なうことにより、当該切片の脱水を行なった。処理後の切片を封入剤で封入し、顕微鏡〔（株）ニコン製、商品名：Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ８００〕で観察した。 The section after the blocking treatment was incubated for 16 hours at 4 ° C. in a 0.1 mass% goat serum-phosphate buffered saline solution containing a primary antibody, and then washed three times with phosphate buffered saline. Monoclonal antibodies against various polypeptides were used as primary antibodies. Thereafter, the obtained sections were incubated with a horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody (anti-goat IgG antibody) at room temperature (25 ° C.) for 1 hour. After washing the section after incubation three times with phosphate buffered saline, 3,3-diaminobenzidine was added dropwise to the section, and a peroxidase reaction was performed, so that the site where the primary antibody was bound in the section was determined. Stained. The stained sections were washed three times with phosphate buffered physiological saline, and the nuclei of the sections were stained with a nuclear stain (trade name: hematoxylin staining solution, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). The stained section was washed with running water for 10 minutes. By immersing the washed section in 95% by volume ethanol aqueous solution for 3 minutes, followed by 3 minutes of incubation in 100% ethanol by volume for 3 minutes, followed by 4 minutes of incubation in xylene for 3 minutes, The section was dehydrated. The section after the treatment was encapsulated with an encapsulant, and observed with a microscope [trade name: Nikon Eclipse E800, manufactured by Nikon Corporation].
その結果、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドに対する抗体、すなわち、Ｎｏｔｃｈファミリーに属する膜貫通型糖タンパク質Ｎｏｔｃｈ１（配列番号：２）の細胞内ドメイン（以下、「ＮＩＣＤ１」という）に対する抗体が、汗腺細胞に結合することがわかった。そこで、皮膚における配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現パターンを調べた。実施例１において、表皮における配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現の有無を調べた結果を図１（Ａ）に、実施例１において、汗腺における配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現の有無を調べた結果を図１（Ｂ）に、（Ｂ）を拡大して観察した結果を図１（Ｃ）に示す。図中、スケールバーは２０μｍを示す。なお、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現の検出には、一次抗体として、配列番号：１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体を用いた。 As a result, an antibody against the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, that is, against the intracellular domain (hereinafter referred to as “NICD1”) of the transmembrane glycoprotein Notch1 (SEQ ID NO: 2) belonging to the Notch family. The antibody was found to bind to sweat gland cells. Therefore, the expression pattern of the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the skin was examined. In Example 1, the result of examining the presence or absence of expression of the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the epidermis is shown in FIG. 1 (A), and in Example 1, it is represented by SEQ ID NO: 1 in the sweat gland. The results of examining the presence or absence of expression of a polypeptide comprising an amino acid sequence are shown in FIG. 1 (B), and the results of magnifying (B) are shown in FIG. 1 (C). In the figure, the scale bar indicates 20 μm. For detecting the expression of the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, an antibody that specifically binds to the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 was used as the primary antibody.
図１（Ａ）〜（Ｃ）に示された結果から、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、表皮においては検出されないが、汗腺細胞（図中、矢印）においては検出されることがわかる。これらの結果から、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、皮膚においては、汗腺細胞、特に、汗腺の筋上皮細胞に特異的に発現していることが示唆される。 From the results shown in FIGS. 1A to 1C, the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is not detected in the epidermis, but is detected in sweat gland cells (arrows in the figure). I understand that From these results, it is suggested that the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is specifically expressed in sweat gland cells, particularly myoepithelial cells of sweat glands in the skin.
以上の結果から、配列番号：１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドならびにその変異体である配列番号：１に示される配列に対する配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号：１において、１個もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加または挿入を有するアミノ酸配列からなる群より選ばれたアミノ酸配列からなるポリペプチド、および前記アミノ酸配列において、配列番号：１に示される配列中のアミノ酸番号：１のアミノ酸残基を含む連続した部分配列に対応するアミノ酸配列からなる部分ポリペプチドは、汗腺細胞の判定用マーカーとして有用であることが示唆される。 From the above results, a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and a polypeptide comprising the amino acid sequence having a sequence identity of 90% or more to the sequence represented by SEQ ID NO: 1 which is a variant thereof, and a sequence In No. 1, a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of amino acid sequences having substitution, deletion, addition or insertion of one or several amino acid residues, and the amino acid sequence, SEQ ID NO: It is suggested that a partial polypeptide consisting of an amino acid sequence corresponding to a continuous partial sequence containing the amino acid residue of amino acid number 1 in the sequence shown in 1 is useful as a marker for determination of sweat gland cells.
比較例１
実施例１において、従来、汗腺細胞を同定するためのマーカーとして用いられているケラチン５またはケラチン１４に対する抗体（抗ケラチン５抗体または抗ケラチン１４抗体）を一次抗体として用いたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、表皮および汗腺におけるケラチン５およびケラチン１４それぞれの発現を調べた。比較例１において、表皮および汗腺細胞におけるケラチン５およびケラチン１４それぞれの発現を調べた結果を図２に示す。図中、スケールバーは２０μｍを示す。
Comparative Example 1
In Example 1, except that an antibody against keratin 5 or keratin 14 (anti-keratin 5 antibody or anti-keratin 14 antibody) conventionally used as a marker for identifying sweat gland cells was used as a primary antibody. The same operation as 1 was performed, and the expression of keratin 5 and keratin 14 in the epidermis and sweat glands was examined. In Comparative Example 1, the results of examining the expression of keratin 5 and keratin 14 in the epidermis and sweat gland cells are shown in FIG. In the figure, the scale bar indicates 20 μm.
図２に示された結果から、従来、汗腺細胞を同定するためのマーカーとして用いられていたケラチン５（図２中の「Ｋ５」）およびケラチン１４（図２中の「Ｋ１４」）は、表皮および汗腺細胞の両方で検出されることがわかる。これらの結果から、皮膚組織または皮膚細胞集団において、ケラチン５またはケラチン１４の発現を指標として細胞を選別した場合、表皮および汗腺細胞の両方が検出されてしまうことから、ケラチン５およびケラチン１４は、汗腺細胞の判定用マーカーとしては適していないことが示唆される。 From the results shown in FIG. 2, keratin 5 (“K5” in FIG. 2) and keratin 14 (“K14” in FIG. 2), which were conventionally used as markers for identifying sweat gland cells, It can be seen that it is detected in both sweat gland cells. From these results, when cells are selected using the expression of keratin 5 or keratin 14 as an index in skin tissue or skin cell population, both epidermis and sweat gland cells are detected. Therefore, keratin 5 and keratin 14 are This suggests that it is not suitable as a marker for determining sweat gland cells.
以上の結果から、皮膚組織または皮膚細胞集団において、配列番号：１に示されるアミノ酸配列、配列番号：１に示される配列に対する配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列、および配列番号：１において、１個もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加または挿入を有するアミノ酸配列からなる群より選ばれたアミノ酸配列からなるポリペプチド、および前記アミノ酸配列において、配列番号：１に示される配列中のアミノ酸番号：１のアミノ酸残基を含む連続した部分配列に対応するアミノ酸配列からなる部分ポリペプチドの発現を調べることにより、汗腺細胞を簡便、かつ特異的に検出することができることがわかる。 From the above results, in the skin tissue or skin cell population, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence having 90% or more sequence identity to the sequence shown in SEQ ID NO: 1, and SEQ ID NO: 1 A polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of amino acid sequences having substitution, deletion, addition or insertion of one or several amino acid residues, and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 It can be seen that sweat gland cells can be detected easily and specifically by examining the expression of a partial polypeptide consisting of an amino acid sequence corresponding to a continuous partial sequence containing the amino acid residue of amino acid number 1 in the sequence. .
Claims (5)
（Ｂ）配列番号：１に示される配列に対する配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、前記（Ａ）のポリペプチドと同じ生理活性を示すポリペプチド、および
（Ｃ）配列番号：１において、１個もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加または挿入を有するアミノ酸配列からなり、前記（Ａ）のポリペプチドと同じ生理活性を示すポリペプチド
からなる群より選ばれたポリペプチド、または前記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列において、配列番号：１に示される配列中のアミノ酸番号：１のアミノ酸残基を含む連続した部分配列に対応するアミノ酸配列からなる部分ポリペプチドからなる汗腺細胞の判定用マーカー。 (A) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(B) a polypeptide comprising an amino acid sequence having a sequence identity of 90% or more with respect to the sequence shown in SEQ ID NO: 1, and having the same physiological activity as the polypeptide of (A), and (C) SEQ ID NO: 1 A polypeptide selected from the group consisting of a polypeptide consisting of an amino acid sequence having substitution, deletion, addition or insertion of one or several amino acid residues and having the same physiological activity as the polypeptide of (A) above In the amino acid sequence of the peptide or any one of the polypeptides (A) to (C), amino acids corresponding to a continuous partial sequence containing the amino acid residue of amino acid number 1 in the sequence shown in SEQ ID NO: 1. A marker for determination of sweat gland cells consisting of a partial polypeptide consisting of a sequence.
（Ａ）配列番号：１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号：１に示される配列に対する配列同一性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、前記（Ａ）のポリペプチドと同じ生理活性を示すポリペプチド、および
（Ｃ）配列番号：１において、１個もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加または挿入を有するアミノ酸配列からなり、前記（Ａ）のポリペプチドと同じ生理活性を示すポリペプチド
からなる群より選ばれたポリペプチド、または前記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列において、配列番号：１に示される配列中のアミノ酸番号：１のアミノ酸残基を含む連続した部分配列に対応するアミノ酸配列からなる部分ポリペプチドに対する抗体または前記ポリペプチドもしくは部分ポリペプチドに対する結合活性を有する抗体断片である請求項２に記載の汗腺細胞の検出剤。 The binding substance is
(A) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(B) a polypeptide comprising an amino acid sequence having a sequence identity of 90% or more with respect to the sequence shown in SEQ ID NO: 1, and having the same physiological activity as the polypeptide of (A), and (C) SEQ ID NO: 1 A polypeptide selected from the group consisting of a polypeptide consisting of an amino acid sequence having substitution, deletion, addition or insertion of one or several amino acid residues and having the same physiological activity as the polypeptide of (A) above In the amino acid sequence of the peptide or any one of the polypeptides (A) to (C), amino acids corresponding to a continuous partial sequence containing the amino acid residue of amino acid number 1 in the sequence shown in SEQ ID NO: 1. 3. An antibody against a partial polypeptide comprising a sequence or an antibody fragment having binding activity to the polypeptide or partial polypeptide. Detection agents sweat gland cells described.
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