JP2014022292A

JP2014022292A - 粉砕装置及び粉砕方法

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Publication number: JP2014022292A
Application number: JP2012162131A
Authority: JP
Inventors: Atsushi Nakajima; 敦中嶋; Akinori Sugiyama; 彰教杉山
Original assignee: Keio University
Current assignee: Keio University
Priority date: 2012-07-20
Filing date: 2012-07-20
Publication date: 2014-02-03

Abstract

【課題】粉砕された液滴フラグメントの運動量分布が小さい、溶液試料の粉砕装置を提供すること。
【解決手段】溶液の液滴を形成する液滴形成手段と、前記液滴の溶媒が振動吸収する波長の光を含むレーザー光を、第１の方向から前記液滴に照射する、第１のレーザー照射手段と、前記液滴の溶媒が振動吸収する波長の光を含むレーザー光を、前記第１の方向とは異なる第２の方向から前記液滴に照射する、第２のレーザー照射手段と、を含む、溶液の粉砕装置。
【選択図】図１

Description

本発明は、粉砕装置及び粉砕方法に関する。

質量分析法は、未知物質の構造決定や既知物質の同定などで使用される、重要な分析法である。中でも、蛋白質分子を蛋白質溶液試料から直接的に質量分析する手法が、近年、医療診断の分野などにおいて注目され、多数研究されている。

蛋白質分子の質量分析法としては、レーザー脱離イオン化（ＬＤＩ）法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法などの手法が知られている。しかしながら、これらの手法は、利用できる溶媒に制約があること、測定試料の試料量が多くなることなどの問題点があった。

近年、上述の問題点を解決する質量分析の手法として、所定量の液滴を、質量分析に必要な所定時間でパルス状に送り込む手法が注目されている。蛋白質溶液試料から直接的に質量分析する場合、測定試料溶液中の蛋白質分子を、溶媒和を壊して孤立させる必要がある。そのため、測定試料溶液の液滴の溶媒が吸収する赤外光をパルスレーザーによって照射して、粉砕させる手法が開示されている（非特許文献１〜４参照）。

N. Morgner, H. D. Barth, B. Brutschy, Aust. J. Chem. 59, 109 (2006). J. Kohno, N. Toyama, T. Kondow, Chem. Phys. Lett. 420, 146 (2006). E. Rapp, A. Charvat, A. Beinsen, U. Plessmann, U. Reichl, A. Seidel-Morgenstern, H. Urlaub, B. Abel, Anal. Chem. 81, 443 (2009). A. Terasaki, in Advances in multi-photon process and spectroscopy, Vol. 19, ed. By S.H. Lin, A. A. Villaeys, Y. Fujimura (World Scientific, Singapore, 2010), pp.32-64.

しかしながら、上述の方法は、レーザー照射方向に起因して、レーザーによって粉砕された液滴フラグメントが運動量分布を有する。そのため、液滴フラグメントが空間的に大きく広がり、質量分析装置内に試料導入することが困難になるという問題点があった。

そこで、本発明は、粉砕された液滴フラグメントの運動量分布が小さい、溶液試料の粉砕装置を提供することを目的とする。

溶液の液滴を形成する液滴形成手段と、
前記液滴の溶媒が振動吸収する波長の光を含むレーザー光を、第１の方向から前記液滴に照射する、第１のレーザー照射手段と、
前記液滴の溶媒が振動吸収する波長の光を含むレーザー光を、前記第１の方向とは異なる第２の方向から前記液滴に照射する、第２のレーザー照射手段と、
を含む、溶液の粉砕装置が提供される。

本発明によれば、粉砕された液滴フラグメントの運動量分布が小さい、溶液試料の粉砕装置を提供できる。

図１は、本実施形態の粉砕装置の一例の構成概略図である。図２は、本実施形態の粉砕方法の一例を説明するためのフロー概略図である。図３は、本実施形態の粉砕装置の効果を確認した実施形態における、装置概略図である。図４は、本実施形態の赤外レーザーパルス照射後の液滴の様子を説明するための概略図である。図５は、レーザー強度と脱離陽イオンの数との関係を説明するための概略図である。図６は、２つのレーザー光の照射時間差と脱離陽イオンの数との関係を説明するための概略図である。

以下、添付図面を参照して本発明の実施形態について説明する。

［粉砕試料］
本実施形態の粉砕方法は、対象成分とする溶質が、液体成分である溶媒中に含まれている溶液であれば、特に制限なく、試料として使用することができる。本明細書における溶液とは、溶質成分が溶媒成分中に溶解しているもの、溶質成分と溶媒成分とが互いに分散又は混合しているもの、溶質成分が溶媒成分中で分子間相互作用などにより集合体を形成しているもの、などを全て含む。前記集合体としては、例えば、多量体分子（蛋白質などの高分子化合物を含む）、溶媒和分子、分子クラスター、コロイド粒子などが挙げられ、これらが溶媒中に分散しているものも、本明細書における溶液に含まれる。

従来の質量分析法であるＥＳＩ法では、原理上、分析対象物（溶質）の電荷状態や、溶媒の極性に大きく制限される。しかしながら、本実施形態の粉砕方法は、溶質、溶媒の電荷状態、極性状態に依存されず、上述で定義した試料を全て測定することができる。また、ＥＳＩ法では、時間的に連続的にイオンが噴出されてしまうため、微量試料の測定に使用することが困難である。しかしながら、本実施形態の粉砕方法では、粉砕対象物を含む溶液から液滴を形成することができる試料量を要するため、従来の粉砕法と比して、必要とされる試料量が少ないという有利な特徴を有する。

［粉砕装置及び粉砕方法］
次に、本実施形態の粉砕装置及び該粉砕装置を使用した粉砕方法について、説明する。

図１に、本実施形態の粉砕装置１０の一例の構成概略図を示す。

図１の粉砕装置１０は、前述した溶液から液滴を形成するよう構成された、液滴形成手段１と、前記液滴に第１の方向からレーザー光を照射するよう構成された、第１のレーザー照射手段２と、前記液滴に第２の方向からレーザーを照射するよう構成された、第２のレーザー照射手段３と、を含む。また、本実施形態の粉砕装置１０は、第１の方向及び第２の方向からの少なくとも二方向からレーザーを照射する手段（図１においては、第１のレーザー照射手段２及び第２のレーザー照射手段３）を有していれば良く、その他の一乃至複数のレーザー照射手段を更に有していても良い。

また、本実施形態の変形例として、第１の方向及び第２の方向からレーザー光を照射するために、所定の方向にレーザー光を照射する光照射手段と、該光照射手段から発せられた光を分割・分光し、液滴に第１の方向及び第２の方向からレーザー光を照射するよう構成された、ハーフミラーなどの分光素子と、を含む構成であっても良い。

また、図２に、本実施形態の粉砕方法の一例を説明するためのフロー概略図を示す。本実施形態の粉砕方法は、前述の溶液から液滴を形成するステップ（Ｓ１０１）と、形成された前記液滴に、第１の方向からレーザー光を照射するステップ（Ｓ１０３）と、前記液滴に、第２の方向からレーザー光を照射するステップ（Ｓ１０５）と、を含む。

Ｓ１０１では、液滴形成手段１などを介して、対象成分を含む溶液から、例えば１００μｍ以下の液滴ｄを形成するステップである。

液滴形成手段１としては、特に制限されないが、例えば、液滴射出ノズルなどを使用することができる。このとき、ノズルの径は、ノズルを用いて溶液から液滴を形成することができれば、溶質の溶媒中での存在形態及び大きさに応じて、当業者が適宜選択することができる。なお、溶液から液滴を形成する技術分野において、液滴の直径は、通常、１００μｍ以下である。

本実施形態の粉砕装置は、液体試料の供給が連続的である必要がなく、液滴を使用する。そのため、従来の粉砕装置と比較して、使用する液体試料の量を低減することができる。

Ｓ１０１で形成された液滴は、第１の方向からレーザー光Ｌ１を照射するステップ（Ｓ１０３）及び第２の方向からレーザー光Ｌ２を照射するステップ（Ｓ１０５）により、液滴フラグメントにされる。ここで言う液滴フラグメントは、前述した溶質成分及び溶媒成分の種類などに依存するが、微細化された液滴、脱離したイオン、溶媒和が破壊された溶質（分子）及びそれらの集合体であるクラスター及びナノ粒子などを含む。

液滴試料を用いた質量分析法では、相当程度の溶媒和を破壊して、液滴中の溶質を孤立させる必要がある。レーザー光の照射が、溶媒の振動吸収と共鳴関係にある条件下において、液滴は、多光子吸収過程によって励起される。そのため、第１のレーザー照射手段２及び第２のレーザー照射手段３は、液滴の溶媒が振動吸収する波長の光を含むレーザーを照射するよう構成される。このことは、従来のＭＡＬＤＩ法では、マトリックスの選択やレーザー照射条件の最適化などが技術的に多大な労力を要することに対して、本実施形態が有利な効果を有することを意味する。また、本実施形態では、第１のレーザー照射手段２及び第２のレーザー照射手段３により照射されるレーザー光のレーザー出力も、使用する溶媒の種類などに応じて、当業者が適宜選択することができる。また、本実施形態の粉砕方法は、上述の特徴から、極性が高い溶液も極性が低い溶液でも、粉砕することができるという特徴を有する。また、レーザー出力やレーザー波長によっては、溶質の溶媒和を一部残したままクラスターとして孤立化させることも可能である。

第１のレーザー照射手段２から照射されるレーザー光Ｌ１の第１の方向と、第２のレーザー照射手段３から照射されるレーザー光Ｌ２の第２の方向とは、同一の方向でなければ特に制限はない。具体的には、第１の方向と第２の方向とは、対向する方向であっても良く、粉砕された液滴フラグメントに所定の方向の運動量を与えるために、所定の角度を有していても良い。第１の方向と第２の方向とを、対向する方向でなく、所定の角度を有するように構成することによって、運動量分布を所定の方向に制御することができる。

［第１の実施形態］
次に、本実施形態の粉砕装置及び粉砕方法の効果を確認した第１の実施形態について、図を参照して説明する。図３に、本実施形態の粉砕装置の効果を確認した実施形態における、装置概略図を示す。

図３の粉砕装置１０は、図１における粉砕装置１０と同様の構成を有する。図３の実施形態では更に、確認手段として、撮像装置４、光源５又は６、解析装置７が使用された。

本実施形態では、粉砕する溶液として、１０^−３ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム水溶液を使用した。予め調整された塩化ナトリウム水溶液を、液滴形成手段１としてピエゾ駆動型の電動ノズル（ＭｉｃｒｏｄｒｏｐＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を使用して、直径約９０μｍの液滴を形成させた。

本実施形態においては、第１のレーザー照射手段２及び第２のレーザー照射手段３として、Ｎｄ^３＋：ＹＡＧレーザー（Ｓｕｒｅｌｉｔｅ；Ｃｏｎｔｉｎｕｕｍ社製）の基本波で励起したＩＲ−ＯＰＯ−ＯＰＡシステム（ＬａｓｅｒＶｉｓｉｏｎ社製）を使用した。また、出力光としての条件は、赤外パルスレーザー（強度１−８ｍＪ／ｐｕｌｓｅ， λ＝２．９μｍ，１０Ｈｚ）を採用した。なお、出力光は、バルク水のＯＨ振動に共鳴するように波長が調整された。

図３の実施形態においては、第１のレーザー照射手段２及び第２のレーザー照射手段３は、対向する位置に配置されたが、前述の通り、本発明はこの実施形態に限定されない。粉砕された液滴フラグメントが所定の方向の運動量を有するように、第１のレーザー照射手段２と第２のレーザー照射手段３とを所定の角度を有して配置しても良い。また、比較の実施形態として、第１のレーザー照射手段２（又は第２のレーザー照射手段３）のみを配置した例も行った。

前述の液滴形成手段１で形成された液滴に、第１のレーザー照射手段２及び／又は第２のレーザー照射手段を照射して、液滴を粉砕した。粉砕された液滴の軌跡を調べるために、撮像装置４及び光源５又は６が配置された。

撮像装置４は、粉砕された液滴の軌跡を撮像する装置であり、本実施形態ではＣＣＤカメラ（Ｃ５４０５−５０；浜松ホトニクス社製）を使用した。また、撮像装置４による撮像のための発光ストロボとして、光源５又は６を配置した。光源５、６としては、各々、発光ダイオード（ＬＥＤ）又はＱスイッチＮｄ^３＋：ＹＡＧレーザー（ＮｅｗＷａｖｅＲｅｓｅａｒｃｈ社製）の２次高調波を使用した。本実施形態では、赤外レーザーパルス照射後、０〜４μｓまでの時間範囲での、液滴（及び液滴フラグメント）を撮像した。

第１のレーザー照射手段２及び／又は第２のレーザー照射手段３により粉砕された液滴の特性を調べるために、解析装置７が配置された。本実施形態においては、解析装置７として、０．４ｍｍ−０．３ｍｍの吸入スキマー８を有する真空チャンバー９内に設置された、図示しないピコアンペアメータ（６５１７Ａ；Ｋｅｉｔｈｌｅｙ社製）を使用した。真空チャンバー９内は予め図示しない真空ポンプにより排気されており、液滴フラグメントの脱着陽イオンのイオン種は、差動排気を介して真空チャンバー９内に導入される。

上述のような構成の解析装置７により、本実施形態では、吸入スキマー８を通って真空チャンバー９内に導入された液滴フラグメントの脱離陽イオンのイオン種の総数（即ち、イオンの電流量）を計測した。

図４に、本実施形態の赤外レーザーパルス照射後の液滴の様子を説明するための、概略図を示す。図４（ａ）は、第１のレーザー照射手段２及び第２のレーザー照射手段３を使用して、液滴にレーザー光を同時に照射し、光源５を使用した実施形態であり、図４（ｂ）は、第１のレーザー照射手段２及び第２のレーザー照射手段３を液滴に同時に照射し、光源６を使用した実施形態であり、図４（ｃ）は、第１のレーザー照射手段２のみを使用し、液滴に図中右側からレーザー光を照射し、光源５を使用した実施形態であり、図４（ｄ）は、第１のレーザー照射手段２のみを使用し、液滴に図中右側からレーザー光を照射し、光源６を使用した実施形態であり、図４（ｅ）は、第２のレーザー照射手段３のみを使用し、液滴に図中左側からレーザー光を照射し、光源５を使用した実施形態であり、図４（ｆ）は、第２のレーザー照射手段３のみを使用し、液滴に図中左側からレーザー光を照射し、光源６を使用した実施形態である。また、図４（ａ）〜（ｆ）の各々において、左側から、レーザー光照射直前、レーザー光照射後１μｓ後、レーザー光照射後２μｓ後、レーザー光照射後３μｓ後、レーザー光照射後４μｓ後の概略図である。

図４（ａ）及び図４（ｂ）より明らかであるように、２つの対向するレーザー照射手段２、３によってレーザー光が照射された液滴は、その飛沫及び蒸気が、液滴の初期位置周辺で、概ね対照的かつ均一に広がっている。これは、２つの対向するレーザー照射手段２、３を同時に液滴に照射することによって、液滴の粉砕時に発生する運動量分布が相殺されて小さくなり、液滴フラグメントの空間的な広がりが抑制されていることを意味する。そのため、本実施形態の粉砕装置及び粉砕方法で粉砕された試料を、例えば飛行時間型質量分析などの質量分析法で測定する際には、分解能（隣接質量との分別の程度）を高くすることができる。

一方、図４（ｃ）乃至（ｆ）などの、レーザー照射手段２、３のいずれか一方によって照射された実施形態では、粉砕された液滴は、前述の実施形態と比較して、運動量分布が大きい。運動量分布としては、レーザーの光軸方向へのベクトル成分が大きくなっている。これは、エネルギー吸収は、主として、レーザー光が照射された液滴の表面から約数μｍ内で起こり、吸収されたエネルギーは、液滴の残りの部分へと伝播することに起因していると考えられる。

図５に、レーザー強度と脱離陽イオンの数との関係を説明するための概略図を示す。図５（ａ）は吸入スキマーの直径が０．４ｍｍの場合における図であり、図５（ｂ）は吸入スキマーの直径が０．３ｍｍの場合における図である。

図５（ａ）及び図５（ｂ）より明らかであるように、第１のレーザー照射手段２及び第２のレーザー照射手段３を使用した実施形態では、レーザー照射手段２、３のいずれか一方によって照射された実施形態と比較して、液滴の粉砕で得られるイオンの電流量が大きいことがわかった。そのため、本実施形態の粉砕装置及び粉砕方法で粉砕された試料を、例えば飛行時間型質量分析などの質量分析法で測定する際には、分析機器の感度を高くすることができる。

第１の実施形態では、本実施形態の粉砕装置及び粉砕方法の効果を確認した。第１のレーザー照射手段２及び第２のレーザー照射手段３を使用することにより、レーザー照射手段２、３のいずれか一方を使用する場合と比較して、粉砕された液滴は、その運動量分布が対照的かつ均一で小さく、また、粉砕で得られるイオンの電流量が大きいことがわかった。

［第２の実施形態］
次に、本実施形態の粉砕装置及び粉砕方法の効果を確認した第２の実施形態について、図を参照して説明する。

第２の実施形態では、第１のレーザー照射手段２及び第２のレーザー照射手段３から照射されたレーザー光に、時間差を設けた以外は、第１の実施形態と同様の装置及び方法で、液滴を粉砕した。

図６に、粉砕された液滴フラグメントの運動量分布が小さい、溶液試料の粉砕装置を示す。

図６より明らかであるように、第１のレーザー照射手段２及び第２のレーザー照射手段３とから照射されるレーザー光の時間差が大きくなるにつれ、脱離陽イオンの数（イオンの電流量）が小さくなっている。特に、１０^２ｎｓ〜１０^４ｎｓの範囲内では、時間当たりの電流量の減少が大きい。そのため、好ましくは１０^３ｎｓ以内、より好ましくは１０^２ｎｓ以内に、液滴に２つ又はそれ以上のレーザー光を照射することにより、粉砕される液滴フラグメントの運動量を効果的に抑制することができ、結果、粉砕で得られるイオンの電流量が大きくなるため、より好ましいことがわかった。

１液滴形成手段
２第１のレーザー照射手段
３第２のレーザー照射手段
４撮像装置
５光源
６光源
７解析装置
８吸入スキマー
９真空チャンバー
１０粉砕装置

Claims

溶液の液滴を形成する液滴形成手段と、
前記液滴の溶媒が振動吸収する波長の光を含むレーザー光を、第１の方向から前記液滴に照射する、第１のレーザー照射手段と、
前記液滴の溶媒が振動吸収する波長の光を含むレーザー光を、前記第１の方向とは異なる第２の方向から前記液滴に照射する、第２のレーザー照射手段と、
を含む、溶液の粉砕装置。
溶液の液滴を形成する液滴形成手段と、
前記液滴の溶媒が振動吸収する波長の光を含むレーザー光を照射する、レーザー照射手段と、
前記レーザー照射手段から照射されたレーザー光が、第１の方向及び前記第１の方向とは異なる第２の方向から前記液滴に照射されるように分割・分光する、分光手段と、
を含む、溶液の粉砕装置。
前記第１の方向と前記第２の方向とは、対向する方向である、請求項１又は２に記載の溶液の粉砕装置。
溶液から液滴を形成するステップと、
形成された前記液滴に、前記液滴の溶媒が振動吸収する波長の光を含むレーザー光を、第１の方向から照射する、第１照射ステップと、
前記液滴に、前記液滴の溶媒が振動吸収する波長の光を含むレーザー光を、前記第１の方向とは異なる第２の方向から照射する、第２照射ステップと、
を含む、溶液の粉砕方法。
前記第１の方向と前記第２の方向とは、対向する方向である、請求項４に記載の溶液の粉砕方法。
前記第１照射ステップ及び前記第２照射ステップを同時に行う、
請求項４又は５に記載の溶液の粉砕方法。
前記第１照射ステップと前記第２照射ステップとの時間差は、１０^３ｎｓ以内である、
請求項４又は５に記載の溶液の粉砕方法。