JP2013539975A - Gpcrgalr2の調節剤としてのニューロペプチドq及びその使用 - Google Patents
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Abstract
【選択図】 なし
Description
本発明は、Gタンパク質共役レセプター(GPCR)、GALR2の新規なリガンドとしてのニューロペプチドQ(Neuropeptide Q)の同定及びその使用に関する。
Gタンパク質共役レセプター(GPCR)は、細胞内のシグナルの伝達を担うタンパク質である。通常、GPCRは、7つの膜貫通部位を有する。リガンドがGPCRの部分又は断片に結合すると、シグナルが細胞内で伝達され、細胞の生物学的又は生理学的特性又は挙動の変化を引き起こす。G−タンパク質、エフェクター(細胞内酵素及びG−タンパク質により調節されるチャンネル)及びベーターアレスチンと共に、GPCRは、細胞内二次メッセンジャーの状態を細胞外入力と結び付けるシグナル伝達系モジュールの構成要素である。GPCR遺伝子及び遺伝子産物は、様々な生理学的プロセスを調節することができ、そして疾患の潜在的な原因となる。GPCRは、中枢神経系及び末梢生理学的プロセスの両方に対して重要であると思われる。GPCRスーパーファミリーは、5つのファミリーに代表される:ファミリーI、ロドプシン及びベータ2−アドレナリンレセプターに代表されるレセプターで、現在、200を超えるユニークなメンバーにより代表される;ファミリーII、副甲状腺ホルモン/カルシトニン/セクレチンレセプターファミリー;ファミリーIII、メタボトロピックグルタミン酸レセプターファミリー;ファミリーIV、cAMPレセプターファミリー、D.discoideumの走化性及び成長に重要;及びファミリーV、STE2等の真菌類の接合フェロモンレセプター。Gタンパク質は、グアニンヌクレオチドに結合する、アルファ、ベータ及びガンマサブユニットから構成されるヘテロ3量体タンパク質のファミリーの代表である。通常、これらのタンパク質は、シグナル伝達のために細胞表面レセプター(7つの膜貫通部位を含むレセプター)に結合する。実際、GPCRへのリガンドの結合に続き、コンフォメーションの変化がGタンパク質に伝えられ、それは、アルファ−サブユニットに結合したGDP分子のGTP分子への変換及びアルファ−サブユニットのベータ/ガンマ−サブユニットからのかい離を引き起こす。アルファ、ベータ/ガンマ−サブユニットのGTP−結合形態は、典型的には、エフェクター調節部分として機能し、cAMP(例えば、アデニルシクラーゼの活性化により)、ジアシルグリセロール又はイノシトールリン酸等の2次メッセンジャーの生成に導く。
armacol. 52:337−343、1997;Wangら、J.Biol.Chem. 272:31949−31953、1997;Ahmadら、Ann.N.Y.Acad.Sci. 863:108−119、1998;Bloomquistら、Biophys.Res.Commun. 243:474−479、1998;Kolakowskiら、J.Neurochem. 71:2239−2251、1998;Smithら、J.Biol.Chem. 273:23321−23326、1998)。ガラニンレセプター2、別名GALR2(SEQ NO:1(ヒトポリヌクレオチド配列、図1);SEQ ID NO:2(ヒトアミノ酸配列、図2);SEQ NO:3(マウスポリヌクレオチド配列、図3);SEQ ID NO:4(マウスアミノ酸配列、図4);SEQ NO:5(ラットポリヌクレオチド配列、図5);SEQ ID NO:6(ラットアミノ酸配列、図6);SEQ NO:7(アカゲザルポリヌクレオチド配列、図7);SEQ ID NO:8(アカゲザルアミノ酸配列、図8);SEQ NO:9(チンパンジーポリヌクレオチド配列、図9)及びSEQ ID NO:10(チンパンジーアミノ酸配列、図10))はGPCRとして記述され、ガラニンレセプター1(GALR1)及びガラニンレセプター3(GALR3)と共に、3つのガラニンレセプターのうちの1つである。
、2009)、てんかん発作に対する素因の減少を伴う海馬興奮性の減少(Mazaratiら、Brain Res. 589:164−166、1992);及び無傷動物及び神経損傷後の侵害刺激反応の著しい阻害(Wiesenfeldら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89、3:334−3337、1992)が含まれる。ガラニンのこれらの神経調節作用は、長い間、神経系におけるこのペプチドの主要な役割であると考えられてきた。訓練に先だってガラニンをげっ歯類に脳室内投与すると、空間学習及び受動回避を含む広い範囲の仕事において成績が損なわれたことから(Crawley、Cell.Mol.LifeSci. 65:1836−1841、2008)、ガラニンが、短期作業記憶及び長期連合記憶処理に関与することが示された。
Neurol. 2:463−472、2003)。最初の神経ペプチドである物質Pは、1931年にVon EulerとGaddumによって同定されたが、その正確な化学構造は1971年まで記述されなかった(Changら、Nat.New.Biol. 232:86−87、1971)。それらは大きなタンパク質(プレプロホルモン)内で見出され、成熟ホルモンの産生は通常特異的な法則に従う。プレプロホルモンは分泌ホルモンであり、プロセッシング及び分泌のために、そのタンパク質をゴルジ複合体から分泌胞内に輸送するのに必要なシグナル配列を有する。分泌胞において、分泌シグナルが除去され、プロホルモンとなる。神経ペプチドは合成され、そしてニューロンから中枢神経系(CNS)及び末梢神経系(PNS)へ放出され、それらはほとんど常に古典的な神経伝達物質と共存する(Hokfeltら、Nature 284:525−521、1980)。
存的に誘発した。
1) 本発明は、GALR2の機能を調節する作用剤を識別する方法に関し、当該方法は:a) ニューロペプチドQポリペプチドのGALR2ポリペプチドへの相互作用を許容する条件下で、候補調節剤の存在下及び非存在下にて、GALR2ポリペプチドをニューロペプチドQポリペプチドと接触させる工程;及びb) GALR2ポリペプチドのニューロペプチドQポリペプチドへの相互作用を測定する工程であって、候補調節剤非存在下での相互作用に対する、候補調節剤存在下での相互作用の増大又は減少が、候補調節剤をGALR2の機能を調節する作用剤として識別する上記工程、を含む。
GALR2ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する工程;及びc) GALR2及
びニューロペプチドQポリペプチドを含み、サンプルを含まない反応において測定した活性の量を、GALR2、ニューロペプチドQポリペプチド及びサンプルを含む反応において測定した活性の量と比較する工程であって、サンプル非存在下における活性に対する、サンプル存在下における活性の変化が、サンプル中のGALR2の機能を調節する作用剤の存在を示す上記工程、を含む。
候補調節剤の存在下で、GALR2ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する工程;及びc) 候補調節剤の存在下で測定した活性を、GALR2ポリペプチドをニューロペプチドQポリペプチドと接触させるサンプル内で測定した活性と比較する工程であって、候補調節剤の存在下で測定した活性の量が、EC50で存在するニューロペプチドQポリペプチドにより引き起こされる量の少なくとも50%である場合に、当該候補調節剤をGALR2の機能を調節する作用剤として識別する上記工程、を含む。
ID No:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID
NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID N
O:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40及びSEQ ID NO:41から成る群より選択される、態様1)〜13)又は15)〜20)のいずれか1つに従う方法に関する。
ID No.22である、態様23)に従う方法に関する。
ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31及びSEQ ID NO:32より(好ましくは、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:28及びSEQ ID NO:31より)選択される、態様26)に従う方法に関する。
ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40及びSEQ ID NO:41より(好ましくは、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40及びSEQ ID NO:41より)選択される、態様28)に従う方法に関する。
LR2ポリペプチドに特異的に結合する、態様1)〜29)のいずれか1つに従う方法に関する。
の異常により特徴づけられる疾患又は障害の診断である上記工程、を含む。好ましい態様において、増幅工程はRT/PCRを含む。別の好ましい態様において、標準はSEQ ID NO:11である。別の好ましい態様において、配列を比較する当該工程はミニ配列分析を含む。別の好ましい態様において、配列を比較する当該工程は、マイクロアレイ試験内において行われる。
NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8又はSEQ ID NO:10(そして特に、SEQ ID NO:2)に対し、少な
くとも70%のアミノ酸相同性、そして好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%、そして特に100%のアミノ酸相同性を有し;そして2) GALR2ポリペプチドはGALR2活性を有する、すなわち、当該ポリペプチドは、ニューロペプチドQポリペプチド又はその機能的フラグメントに反応する。最適な場合には、「GALR2ポリペプチド」はまた、本明細書で定義したGALR2シグナル伝達活性を有する。
NO:2の配列を有するGALR2ポリペプチドに特異的に結合し、かつ/又はそのシグナル伝達活性を活性化するSEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15又はSEQ ID NO:16で表されるポリペプチドに対して(特に、SEQ ID NO:13で表されるポリペプチドに対して)、少なくとも31%の相同性、そして好ましくは少なくとも50%、より好ましくは少なくとも75%、最
も好ましくは少なくとも95%、そして特に100%の相同性を有するポリペプチドを意味する。「ニューロペプチドQポリペプチド」はまた、上記の定義に合致するポリペプチドのフラグメントであって、SEQ ID NO:13の全長ポリペプチドの結合活性及び/又はシグナル伝達活性のレベルの少なくとも10%(好ましくは、少なくとも50%)を保持する当該フラグメントをも意味する。得られたポリペプチドが、SEQ ID NO:13で表される全長ポリペプチドの結合活性及び/又はシグナル伝達活性のレベルの少なくとも10%(好ましくは、少なくとも50%)を保持する限り、ニューロペプチドQポリペプチドは、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15又はSEQ ID NO:16(特に、SEQ ID NO:13)に対して、付加、挿入、欠失又は置換を含むことができる。SEQ ID NO:14に対するニューロペプチドQポリペプチドのフラグメントの例は、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21及びSEQ ID NO:22のポリペプチドである。SEQ ID NO:14に対する置換を含むニューロペプチドQポリペプチドの例は、SEQ ID NO:23、SEQ
ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID
NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40及びSEQ ID NO:41のポリペプチドである。
血管疾患を包含するが、これらに限定されるものではない。アルツハイマー病、血管性痴呆、レビー小体型認知症、クロモソーム第17染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型痴呆、ピック病を含む前頭側頭型痴呆、進行性核性麻痺、皮質基底核変性症、ハンチントン病、視床変性症、クロイツフェルト−ヤコブ痴呆、HIV痴呆、痴呆を伴う精神分裂病及びコルサコフ精神病等の痴呆もまた、CNS障害と考えられる。同様に、軽度の認知障害、加齢関連性記憶障害、加齢関連性認知機能低下、血管性認知障害、注意欠陥障害、注意欠陥多動性障害及び学習障害を伴う小児における記憶障害等の認知関連障害もまた、CNS障害と考えられる。この定義の意味において、疼痛もまたCNS障害と考えられる。疼痛は、多発性硬化症、脊髄損傷、坐骨神経痛、腰椎術後疼痛症候群、外傷性脳損傷、てんかん、パーキンソン病、脳卒中後障害及び脳及び脊髄の血管性病変(例えば、梗塞、脳溢血、血管奇形)等のCNS障害と関連付けることができる。非中枢神経障害性疼痛は、乳房切除後疼痛と関連するもの、幻肢感、反射性交感神経性ジストロフィー(RSD)、三叉神経性ジアラジオキュロパシー(trigeminal neuralgiaradioculopathy)、術後疼痛、HIV/AIDS関連疼痛、癌疼痛、代謝性神経障害(例えば、糖尿病性神経障害、結合組織疾患に二次的な脈管神経障害)、例えば、肺癌、又は白血病、又はリンパ腫、又は前立腺癌、結腸癌若しくは胃癌に関連する腫瘍随伴症多発性神経障害、三叉神経痛、頭蓋神経痛およびヘルペス後神経痛を含む。末梢神経損傷に関連する疼痛、中心性疼痛(すなわち、脳虚血による)及び様々な慢性疼痛、すなわち、腰痛、背部疼痛(腰部疼痛)、炎症性及び/又はリウマチ性疼痛。頭痛(例えば、前兆のある偏頭痛、前兆のない偏頭痛、及びその他の偏頭痛障害)、一過性及び慢性緊張性頭痛、緊張性様頭痛、群発性頭痛並びに慢性発作性片側頭痛もまたCNS障害である。膵炎、腸膀胱炎(intestinal cystitis)、月経困難症、過敏性腸症候群、クローン病、胆石疝痛、尿管疝痛、心筋梗塞等の内臓疼痛及び骨盤腔疼痛症候群、例えば、外陰部痛、精巣痛、尿道症候群及びプロタトジニア(protatodynia)もまたCNS障害である。また、急性疼痛、例えば術後疼痛及び外傷後疼痛も神経系の障害であると考えられる。
は疾患の1又は2以上を含む:例えば、心臓バイパス手術及び移植後の脳障害、卒中、脳虚血、脊髄損傷、頭部外傷、周産期低酸素症、心停止、低血糖症性神経損傷,(AIDS−誘発認知症を含む)認知症、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、眼損傷、網膜症、認知障害、突発性および薬物誘発性パーキンソン病、筋肉痙攣及び振戦を含む筋肉痙攣に関連する障害、てんかん、痙攣、(偏頭痛様頭痛(migraine headache)を含む)偏頭痛、尿失禁、物質耐性、物質離脱(例えば、あへん剤、ニコチン、タバコ製品、アルコール、ベンゾジアゼピン、コカイン、鎮静剤、睡眠薬等の物質を含む)、精神病、統合失調症、(全般性不安障害、パニック障害及び強迫性障害を含む)不安、(うつ病、躁病、双極性障害を含む)気分障害、三叉神経症、難聴、耳鳴り、眼の黄斑変性、嘔吐、脳浮腫、(急性及び慢性状態、激痛、軟治性疼痛、神経障害性疼痛及び外傷後痛を含む)疼痛、遅発性ジスキネジア、(睡眠発作を含む)睡眠障害、注意欠陥/多動性障害及び行為障害等の急性神経及び精神障害。
する能力について評価を行う化合物又は組成物を意味する。候補調節剤は、例えば、低分子化合物、動物、植物、細菌又は真菌細胞の抽出物中並びにかかる細胞からの調整培地に含まれる化合物を包含する天然又は合成化合物でありえる。好ましくは、候補調節剤は、天然又は合成化合物であり得、特に有機低分子化合物である。
除かれている点で細胞ホモジネートと区別される。「膜関連」という用語は、脂質膜に組み込まれているか、又は脂質膜に組み込まれている成分と物理的に関連を有する細胞成分を意味する。
容易に検出できる官能基(標識)を組み込む構造的な修飾を有するニューロペプチドQポリペプチド又は他のGALR2リガンドを意味する。検出可能な標識は、蛍光性化合物、同位体標識化合物、化学発光化合物、量子ドット(quantum dot)標識、ビオチン、酵素、高電子密度試薬(electron−dense reagents)及び抗血清又はモノクロナル抗体が入手できるハプテン又はタンパク質を含むが、これらに限定されるものではない。様々な検出方法は、分光的、光化学的、放射化学的、生化学的、免疫化学的又は化学的手段を含むが、これらに限定されるものではない。
本発明は、GALR2 GPCRのリガンドとしてのニューロペプチドQポリペプチドの識別に関する。これらのリガンド−レセプター相互作用は、内在リガンドのGALR2との相互作用を調節する作用剤のスクリーニングアッセイに有用である。既知のニューロペプチドQポリペプチド及びそれらのレセプターとの相互作用もまた、異常なレセプター活性に関連する状態の診断のためのツールを提供する。
GALR2の活性を調節する作用剤は、レセプターのニューロペプチドQポリペプチドとの相互作用を利用する多くの方法において識別することができる。例えば、GALR2/ニューロペプチドQポリペプチド相互作用をin vitro、培養細胞上で又はin vivoで再構成する能力は、結合を阻害する作用剤の識別のためのターゲットを提供する。相互作用の遮断に基づくアッセイは、かかる分子のライブラリー又は集合から、有機低分子等の作用剤を識別できる。あるいは、かかるアッセイは、天然資源からのサンプル又は抽出物、例えば、植物、真菌若しくは細菌抽出物中の、又はヒトの組織サンプル(例えば、腫瘍組織)中の作用剤を識別することができる。1つの側面において、抽出物は、例えば、ニューロペプチドQポリペプチド自体の変異を含む、変異核酸、ペプチド又はポリペプチドのライブラリーを発現する細胞から作ることができる。
GALR2とニューロペプチドQポリペプチドの相互作用を用いるアッセイは、GALR2ポリペプチド源を必要とする。ヒトGALR2のポリヌクレオチドとポリペプチド配列は、本明細書において、SEQ ID NO:1及び2として表される。マウスGALR2のポリヌクレオチドとポリペプチド配列は、本明細書において、SEQ ID NO:3及び4として表される。ラットGALR2のポリヌクレオチドとポリペプチド配列は、本明細書において、SEQ ID NO:5及び6として表される。アカゲザルGALR2のポリヌクレオチドとポリペプチド配列は、本明細書において、SEQ ID NO:
7及び8として表される。チンパンジーGALR2のポリヌクレオチドとポリペプチド配列は、本明細書において、SEQ ID NO:9及び10として表される。
ヒトプレプロニューロペプチドQのポリヌクレオチド配列は、本明細書において、SEQ
ID NO:11として表される。ヒトプレプロニューロペプチドQのポリペプチド配列は、本明細書において、SEQ ID NO:12として表される。ヒトニューロペプチドQのポリペプチド配列は、本明細書において、SEQ ID NO:13として表される。
NO:12、13又は14)に比べて変わるかもしれず、従って、そのアッセイに必要な量は、野生型の値に対して調整することができる。そのアッセイにおいて必要な場合には、ニューロペプチドQポリペプチドは、合成の間に、培地中で、放射標識されたアミノ酸、例えば、35S−Met等の35S−標識アミノ酸、14C−Leu等の14C−標識アミノ酸、3H−標識(トリチウム標識した)アミノ酸又は適宜な他のアミノ酸、を取り込ませることによって標識することができる。化学標識の方法は、当該技術分野で知られている。
GALR2レセプターのリガンドとしてのニューロペプチドQポリペプチドの識別は、レセプター活性のアゴニスト、アンタゴニスト及びインバースアゴニストを識別するためのスクリーニングアッセイを可能にする。スクリーニングアッセイには2つの一般的なアプローチがある。
る固定化脂質膜を、標識ニューロペプチドQポリペプチド及び候補化合物に暴露するリガンド結合アッセイ。インキュベーションに続いて、反応混合物を、標識ニューロペプチドQポリペプチドのGALR2レセプターへの特異的結合について計測する。標識ニューロペプチドQポリペプチドに干渉するか又はそれを置換する化合物は、GALR2活性のアゴニスト、アンタゴニスト又はインバースアゴニストでありえる。これらのカテゴリーのいずれが適合するかを確かめるためには、陽性化合物に対して機能性分析を行うことができる。
ID NO:12、13又は14)の最大活性の少なくとも10%に相当する最大生物学的活性を持ち、そして好ましくは、50%、75%、100%又はそれ以上の活性を持ち、野生型ヒトニューロペプチドQポリペプチドよりも2−倍、5−倍、10−倍又はそれ以上の高い活性を有する場合も含まれる。b) アンタゴニスト又はインバースアゴニストのスクリーニングについては、GALR2を発現する細胞又はそれから単離した膜を、ニューロペプチドQポリペプチドの存在下にて、候補化合物の存在下又は非存在下で、シグナル伝達活性についてアッセイする。アンタゴニスト又はインバースアゴニストは、アンタゴニスト又はインバースアゴニストを欠いた反応に比べ、ニューロペプチドQポリペプチド−刺激レセプター活性のレベルを少なくとも10%減少させる。c) インバースアゴニストスクリーニングについては、恒常的なGALR2活性を発現する細胞又はそれから単離した膜を、候補化合物の存在下及び非存在下にて、レセプター活性を測定する機能性アッセイにおいて使用することができる。インバースアゴニストは、レセプターの恒常的な活性を少なくとも10%減少させる化合物である。GALR2の過剰発現(すなわち、in vivoで細胞において自然に発現されるレベルに対し、GALR2ポリペプチドの5倍以上過剰な発現)は、恒常的な活性化につながるかもしれない。GALR2は、強い構成的プロモーター(constitutive promoter)、例えば、CMV early promoterの制御下に置くことにより過剰発現させることができる。あるいは、保存GPCRアミノ酸又はアミノ酸部位の特定の突然変異は、恒常的な活性を導く傾向がある(Kjelsbergら、J.Biol.Chem.、267:1430−1433、1992;McWhinneyら、J.Biol.Chem.、275:2087−2097、2000;Renら、J.Biol.Chem.、268:16483−16487,1993;及びParmaら、Nature、365:649−651、1993)。
中でインキュベートする。アッセイを検証し較正するためには、非標識ニューロペプチドQポリペプチドの濃度上昇を用いた対照競合反応を行うことができる。インキュベーション後、細胞をよく洗い、そして結合している標識ニューロペプチドQポリペプチドを、その標識について適宜な方法で測定する(例えば、シンチレーション計測、酵素アッセイ、蛍光等)。候補調節剤存在下における、結合した標識ニューロペプチドQポリペプチドの量の少なくとも10%の減少は、候補調節剤による結合の置換を示す。標識ニューロペプチドQポリペプチドの50%を置換する場合(準飽和(sub−saturating)ニューロペプチドQポリペプチド用量)には、候補調節剤は、本明細書に記載した本アッセイ又は他のアッセイにおいて、特異的に結合すると考えられる。
A(1)アデノシンレセプターに対するリガンドの結合を検出するためにSPRを使用することができることを示した。当業者は、Sarrioらにより報告された条件(Mol.Cell.Biol.、20:5164−5174、2000)を出発点として用いて、SPRアッセイにおける、ニューロペプチドQポリペプチドのGALR2への結合の条件を微調整することができる。
される蛍光は、ポリペプチドが結合していない場合にその励起波長に反応して発光された蛍光とは異なる波長を有し、各波長での発光強度の測定により、非結合ポリペプチドに対する結合ポリペプチドの定量化を可能にする。ポリペプチドを標識する蛍光体の供与体:受容体ペアは、当業者によく知られている。Cyan FP(CFP、供与体(D))及びYellow FP(YFP、受容体(A))として知られるA.victoria GFPの変異体は、特に有用である。GFP変異体は、タンパク質−タンパク質相互作用を測定するためのFRETスキームのD−Aペアとして供するために、結合ペアのそれぞれのメンバーを用いて融合タンパク質として作ることができる。融合体としてのGFP変異体の発現のためのベクターは、当該技術分野で知られている。例として、CFP−ニューロペプチドQポリペプチド融合体とYFP−GALR2融合体を作ることができる。標識ニューロペプチドQポリペプチドとGALR2タンパク質の混合物への候補調節剤の添加は、候補調節剤を欠いたサンプルと比べて、例えば、YFP蛍光の減少により裏付けられるエネルギー転移の阻害を引き起こす。
定可能な変化と関連付けられる。このアプローチは、6桁を超えるアドミッタンスの変化において直線的であり、小分子コンビナトリアルライブラリの大規模なハイスループットスクリーニング(high throughput screening)に理想的である。候補調節剤を欠いたサンプルのアドミッタンスに比べた、候補調節剤を含むサンプルにおけるアドミッタンスの10%以上の変化(増大又は減少)は、候補調節剤が、GALR2とニューロペプチドQポリペプチドの相互作用を阻害することを示す。
i. GTPアーゼ/GTP結合性アッセイ:
GALR2等のGPCRに関しては、レセプター活性は、そのレセプターを有する細胞膜によるGTP結合により測定される。Traynor及びNahorskiにより記述された方法(Mol.Pharmacol.、47:848−854、1995)においては、標識されたGTPの結合を測定することにより、膜に結合したG−タンパク質を本質的に測定する。GTP結合性アッセイでは、レセプターを発現する細胞から単離した膜は、それ自体35S−GTP−ガンマ−S及びGDPを含むバッファー中でインキュベートしてもよい。インキュベーションの後、非結合標識GTPをろ過により除く。Gタンパク質に結合した標識GTPを、液体シンチレーション計測により測定する。
a. カルシウム流動−イクオリン−アッセイ:
イクオリンアッセイは、GPCRの活性化により誘導された細胞内カルシウム放出に対するミトコンドリアのアポイクオリンの応答を利用する(Stablesら、Anal.Biochem.、252:115−126、1997;Detheuxら、J.Exp.Med.、192 1501−1508、2000)。要約すると、GALR2−発現クローンを、ミトコンドリアのアポイクオリンとGα16を同時発現するようにトランスフェクトする。細胞をセレンテラジンH(Molecular Probes)とインキュベートし、洗浄し(例えば、DMEM−F12培養培地中で)、そして所定の濃度にて再懸濁する(例えば、約0.5×106細胞/ml)。次いで、細胞をニューロペプチドQペプチドと混合し、そしてイクオリンによる光照射をルミノメーターで記録する。結果を相対発光量(Relative Light Units)(RLU)として表す。候補化合物の非特異的効果を除外するために、対照は、GALR2を発現しない細胞(モック−感染)から単離された膜を用いたアッセイを含む。
アデニルシクラーゼ活性のアッセイは、Kenimer&Nirenberg(Mol.Pharmacol.、20:585−591、1981)に記載されている。
細胞内又は細胞外cAMPは、cAMPラジオイムノアッセイ(RIA)又はcAMP結合タンパク質又はcAMP結合抗体を用いて、当該技術分野において広く知られた方法
に従って測定される。例えば、Horton及びBaxendale(Methods Mol.Biol.、41:91−105、1995)は、cAMP測定に対するRIAアッセイを記述する。cAMPを測定するための多くのキットが市販されている。幾つかの候補調節剤に有りえる非特異的効果を除外するために、対照反応はモック感染細胞の抽出物を用いて行うべきである。
リン脂質の分解を活性化するレセプターは、リン脂質の分解及び結果としての2次メッセンジャー、ジアシルグリセロール(DAG)及び/又はイノシトール三リン酸(IP3)の生成をモニターすることにより、GALR2の既知の又は被疑調節剤の活性の変化についてモニターできる。これらの生成物の各々を測定する方法は、Ian M.Bird.Totowa、NJ、Humana Press、1998により編集されたPhospholipid Signaling Protocolsに記載されている。ホスファチジルイノシトールの分解のアッセイについても記載するRudolphら(J.Biol.Chem.、274:11824−11831、1999)も参照されたい。アッセイは、候補調節剤の存在下又は非存在下で、ニューロペプチドQポリペプチドで処理し又は処理しないGALR2を発現する細胞又は細胞抽出物を用いて行うべきである。幾つかの候補調節剤に有りえる非特異的効果を除外するために、対照反応はモック感染細胞又はそれらの抽出物を用いて行うべきである。
成長因子レセプターチロシンキナーゼは、リン脂質−及びカルシウム−依存プロテインキナーゼのファミリーであるプロテインキナーゼC(PKC)の活性化が関与する経路を介してシグナル伝達を行う傾向がある。PKCの活性化は、最終的には、c−fos、c−myc及びc−junを含む数々のプロトオンコジーン転写因子をコードする遺伝子、プロテアーゼ、I型コラゲナーゼ及びプラスミノーゲン活性化因子阻害因子を含むプロテアーゼ阻害因子並びに細胞内接着分子I(ICAM I)を含む接着分子の転写に帰結する。PKCによって誘導された遺伝子産物の増大を検出するためにデザインされたアッセイは、PKCの活性化、そしてそれによってレセプター活性をモニターするために用いることができる。加えて、PKCを介してシグナルを伝達するレセプターの活性は、PKCの活性化による遺伝子の活性化のための制御配列によって主導されるレポーター遺伝子コンストラクトを通じてモニターすることができる。このタイプのレポーター遺伝子−ベースのアッセイについて、以下により詳細に議論する。PKC活性のより直接的な測定については、Kikkawaら(J.Biol.Chem.、257:13341、1982)の方法を用いることができる。このアッセイは、PKCの基質ペプチドのリン酸化を測定するもので、基質ペプチドは、その後、ホスフォセルロースろ紙への結合により分離される。このPKCアッセイ系は、精製したキナーゼの活性又は粗細胞抽出物の活性を測定
するために使用できる。
マイトジェン活性化タンパク質(MAP)キナーゼ活性は、市販の幾つかのキット、例えば、New England Biolabsにより販売されるp38MAPキナーゼアッセイキット(Cat♯9820)又はPerkin−Elmer Life Sciencesにより販売されるFlashPlate MAPキナーゼアッセイのいずれかを用いてアッセイすることができる。
アゴニストのレセプター、例えばGALR2、の結合により開始された細胞内シグナルは、細胞内事象のカスケードを始動させ、それは、最終的に、1又は2以上の遺伝子の転写又は翻訳の急速かつ検出可能な変化を引き起こす。従って、レセプターの活性は、GALR2活性化に応答する制御配列により主導されるレポーター遺伝子の発現を測定することによりモニターできる。
2発現細胞をニューロペプチドQポリペプチドに暴露することによって試験されるべきである。ニューロペプチドQポリペプチドに応答するレポーターの発現の少なくとも2倍の増加は、そのレポータがGALR2活性の指標であることを示す。
ストを単離又は精製することができる。サンプルが調節剤を含んでいると言うために必要な、測定した活性の増大又は減少の量は、用いたアッセイのタイプに依存する。一般的に、サンプルの非存在下で行ったアッセイに比べた10%以上の変化(増大又は減少)は、サンプル中の調節剤の存在を示す。好ましくは、アゴニストは、ニューロペプチドQポリペプチドの少なくとも20%、そして好ましくは75%又は100%以上、例えば、2−倍、5−倍、10−倍以上のレセプターの活性化を刺激する。
GPCRシグナル伝達異常は、多くの疾患及び障害の病理の進行において重要である。GALR2は、免疫不全症ウイルスのコレセプターとして作用し、免疫プロセス、障害又は疾患において役割を担うことが示された。GALR2の発現パターンはまた、このレセプターが他の疾患、障害又はプロセスにおいて役割を担っている可能性を示唆するが、当該GALR2−関連疾患又はGALR2−関連障害は前記の通りである。
最も好ましくは少なくとも95%、そして特に100%の相同性を有するポリペプチドであってもよく;かつ、当該ポリペプチドは、SEQ ID NO:2の配列を持つGALR2ポリペプチドに特異的に結合し、そしてそのシグナル伝達活性を活性化する。あるいは、当該ニューロペプチドQポリペプチドは、SEQ ID NO:13、SEQ ID
NO:14、SEQ ID NO:15又はSEQ ID NO:16(特に、SEQ
ID NO:13)の全長ポリペプチドのフラグメントであって、SEQ ID NO:13の全長ポリペプチドの結合活性及び/又はシグナル伝達活性化のレベルの少なくとも10%(好ましくは少なくとも50%)を保持する当該フラグメントであってもよい。本発明によれば、当該ニューロペプチドQポリペプチドは、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15又はSEQ ID NO:16(特に、SEQ ID NO:13)に対し1又は2以上の付加、挿入、欠失又は置換を含んでもよい。当該ニューロペプチドQポリペプチドは、追加の配列を含んでニューロペプチドQ融合タンパク質を形成してもよく、当該追加の配列は、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)、マルトース結合タンパク質、アルカリホスファターゼ、チオレドキシン、緑色蛍光タンパク質(GFP)、ヒスチジンタグ(例えば、6X以上のHis)又はエピトープタグ(例えば、HAタグ、Mycタグ、FLAGタグ)配列から成る群より選択してもよい。
レセプター又はそのリガンドの異常なレベルがサンプル中に存在するか否かを測定するために、GALR2及びニューロペプチドQポリペプチドレベルを測定し、標準と比較することができ、そのいずれもが、GALR2シグナル伝達の障害の可能性を示す。ポリペプチドレベルは、例えば、そのポリペプチドに特異的な抗体を用いて、免疫組織化学により測定される。GALR2活性により特徴づけられる疾患又は障害を患うと疑われる個体から単離したサンプルを、GALR2又はニューロペプチドQポリペプチドの抗体と接触させ、そして抗体の結合を、当該技術分野で知られているように(例えば、二次抗体と複合した酵素の活性の測定により)測定する。
e to Methods and Applications、Innisら、Academic Press、Inc.N.Y.、(1990)中に記載されており、これは、参考文献として本明細書に取り込まれる。健常な個体からの同様の組織のサンプル中の、又は影響を受けた個体の影響を受けていない部位からの組織のサンプル中の発現量と比較した、サンプル中のGALR2又はニューロペプチドQポリペプチドをコードするmRNAの量の10%以上の増大は、GALR2シグナル伝達の異常により特徴づけられる疾患又は障害であると診断される。
GALR2ポリペプチド又はそれをコードするmRNAが野生型であるか否かを評価するアッセイは、診断に用いることができる。
GALR2シグナル伝達の異常により特徴づけられる疾患又は障害の診断は、機能性アッセイを用いて行うこともできる。それを行うためには、組織サンプルから調製した細胞膜又は抽出物を、本明細書に記載したようなGALR2活性のアッセイに用いる(例えば、リガンド結合アッセイ、GTP−結合アッセイ、GTPアーゼアッセイ、アデニル酸シクラーゼアッセイ、cAMPアッセイ、リン脂質の分解、DAG若しくはIP3アッセイ、PKC活性化アッセイ又はキナーゼアッセイ)。検出した活性を、健常な個体又は影響を受けた個体の影響を受けていない部位から得た標準サンプル中のものと比較する。代替法として、サンプル又はサンプル抽出物をGALR2を発現する細胞に適用し、次いで標準サンプルと比較したGALR2シグナル伝達活性を測定することができる。これらのアッセイのいずれかにおいて測定した活性における、標準の活性に対する10%以上の違い
は、GALR2シグナル伝達の異常により特徴づけられる疾患又は障害と診断される。
GALR2のリガンドとしてのニューロペプチドQポリペプチドの同定により、細胞内でGALR2ポリペプチドの活性を調節する方法が得られる。GALR2ポリペプチドの機能を調節する作用剤をその細胞に与えることにより、細胞内のGALR2活性は調節される。この調節は、さらなる調節剤の識別のためのアッセイの一部として培養細胞中で、又は例えば、ヒトを含む動物中で行うことができる。作用剤には、本明細書で定義したニューロペプチドQポリペプチド並びに本明細書に記載したスクリーニング方法を用いて識別されたさらなる調節剤が含まれる。
候補調節剤は、いかなる大きさ又は起源の合成又は天然化合物のライブラリーからもスクリーニングすることができる。莫大な数の方法が、現在、糖類、ペプチド、脂質、炭水化物及び核酸ベースの化合物のランダム及び指向性合成(random and directed synthesis)に用いられている。有機低分子のライブラリーを含む、異なる大きさの合成化合物ライブラリーは、よく知られたコンビナトリアル又はパラレル化学技術を用いて調製してもよく、又は多くの企業から市販されている。あるいは、細菌、真菌、植物及び動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーは、多くの企業から入手可能であるか、又は当業者によく知られた方法により容易に製造できる。加えて、天然又は合成的に製造されたライブラリー及び化合物は、従来の化学的、物理的及び生化学的手段を用いて容易に修飾される。
本発明は、GALR2及びニューロペプチドQポリペプチドの抗体を提供する。抗体は、当該技術分野で知られた標準的なプロトコル(例えば、Antibodies:A Laboratory Manual ed. by Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press:1988)を見よ。)を用いて作成することができる。マウス、ハムスター又はウサギ等の哺乳動物は、ペプチドの免疫原
性フォーム(例えば、抗体反応を誘起できるGALR2又はニューロペプチドQポリペプチド又は抗原性フラグメント又は本明細書に前記した融合タンパク質)を用いて免疫できる。抗体を生成させるための免疫原は、ポリペプチド(例えば、単離した組み換えポリペプチド又は合成ペプチド)をアジュバントと混合することにより調製できる。あるいは、GALR2又はニューロペプチドQポリペプチド又はペプチドは、より大きな免疫原性タンパク質との融合タンパク質として製造される。ポリペプチドは、キーホールリンペットヘモシニアン(keyhole limpet hemocyanin)等の他のより大きな免疫原性タンパク質に共有結合させることもできる。あるいは、Costagliolaら(J.Clin.Invest.、105:803−811、2000)に記載されているように、GALR2若しくはニューロペプチドQポリペプチド又はこれらのタンパク質のフラグメントをコードするプラスミド又はウイルスベクターを、ポリペプチドを発現させ、そして動物中で免疫反応を起こすために用いることもできる。抗体を生成させるためには、典型的には、免疫原を、ウサギ、ヒツジ又はマウス等の実験動物の皮内、皮下又は筋肉内に投与する。上記の抗体に加えて、単鎖抗体等の遺伝子改変した抗体誘導体を製造することができる。
GALR2又はニューロペプチドQポリペプチド又はその変異体を発現するトランスジェニック動物は、GALR2を介したシグナル伝達の研究並びにGALR2の活性を調節する薬剤又は作用剤の研究に有用である。トランスジェニック動物は少なくとも1つの外来遺伝子を含む非ヒト動物であり、その外来遺伝子はトランスジーンと呼ばれ、トランスジェニック動物の遺伝物質の一部である。好ましくは、トランスジーンは動物の生殖細胞系に含まれ、その動物の子孫に伝えられることができる。トランスジーンを動物の遺伝物質中に導入するためには多くの技術を用いることができ、そのような技術には、トランスジーンの受精卵の前核へのマイクロインジェクション及び胚性幹細胞の操作(U.S.Patent No.US4,873,191;Palmiter and Brinster、Ann.Rev.Genet.、20:465−499、1986;フランス特許出願FR2593827)が含まれるが、それらに限定されるものではない。トランスジェニック動物は、そのすべての細胞内にトランスジーンを担持でき、又は遺伝的にモザイ
クでありえる。
GALR2又はニューロペプチドQポリペプチド又は変異体のいずれかをコードする染色体配列中にホモ接合型欠失(homozygous deletion)を有する動物は、レセプター及びリガンドの機能を研究するために有用でありえる。さらに、特定の生理学的及び/又は病理学的過程におけるGALR2/ニューロペプチドQポリペプチドの同定は特に重要である。
ノックアウト動物は、相同的組み換えを用いて遺伝子欠失を創る方法により製造することができる。この技術は、胚に由来し、培養で維持され、そしてホストの胚盤胞に導入された場合に、動物のすべての組織の形成に関与する能力を有する胚性幹(ES)細胞の開発に基づく。ノックアウト動物は、相同的組み換えをES細胞中の特定のターゲット遺伝子に向け、それによりヌル対立遺伝子を作ることにより製造される。ノックアウト動物を作る技術は、十分に記載されている(例えば、Huszarら、Cell、88:131、1997;及びOhki−Hamazakiら、Nature、390:165、1997を見よ。)。当業者は、遺伝子標的コンストラクトを作成するために、(本明細書に記載され、そして当該技術分野で知られた)GALR2及びニューロペプチドQの配列を用いて、ホモ接合GALR2又はニューロペプチドQポリペプチドノックアウト動物(例えば、マウス)を作ることができる。
部位指定相同的組み換え(targeted homologous recombination)の方法は、バクテリオファージP1、部位特異的リコンビナーゼCreに基づく、部位特異的組み換えのためのシステムの開発によって改善されてきた。バクテリオファージP1からのCre−loxP部位特異的DNAリコンビナーゼは、特定の組織又は成長段階に限定した遺伝子のノックアウトを作成するために、トランスジェニックマウスアッセイにおいて使用される。全体的な遺伝子ノックアウトに対し、部位に限定された遺伝的欠失は、フェノタイプを特定の細胞/組織にわりあてることができるという利点がある。Cre−loxP系においては、1番目のトランスジェニックマウス株は、loxP部位を、興味の対象である遺伝子の1又は2以上のエクソンに並べて配置するように設計する。このいわゆる「floxed遺伝子」のホモ接合体を、細胞/組織型転写プロモーターの制御下でCre遺伝子を発現する2番目のトランスジェニックマウスと交配させる。次いで、Creタンパク質がloxP認識配列の間のDNAを切除し、そして標的遺伝子機能を効果的に除去する。現在では、例えば、哺乳動物組織特異的遺伝子の誘導的不活性化を含む、この方法の多くのin vivoの実例がある(Wagnerら、Nucleic Acids Res.、25:4323、1997)。従って、当業者は、GALR2又はニューロペプチドQが、選択した組織又は細胞型内で組織特異的に除去されたノックアウト動物を作ることができる。
本発明は、GALR2活性の調節剤のスクリーニングに有用なキットを提供する。加えて、本発明は、GALR2シグナル伝達の異常により特徴づけられる疾患又は障害の診断に有用なキットを提供する。本発明に従う有用なキットは、(例えば、単離した膜上、GALR2を発現する細胞又はSPRチップ上等、膜−又は細胞−結合GALR2ポリペプチドを含む)単離したGALR2ポリペプチド及び単離したニューロペプチドQポリペプチドを含むことができる。
ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40及びSEQ ID NO:41のポリペプチドである。当該ニューロペプチドQポリペプチドは追加の配列を含んでニューロペプチドQ融合タンパク質を形成してもよく、当該追加の配列は、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)、マルトース結合タンパク質、アルカリホスファターゼ、チオレドキシン、緑色蛍光タンパク質(GFP)、ヒスチジンタグ(例
えば、6X以上のHis)又はエピトープタグ(例えば、HA−タグ、Mycタグ、FLAGタグ)配列から成る群より選択してもよい。
In vitroアッセイ
ニューロペプチドQポリペプチドによるヒトGALR2レセプター活性の調節を、下記の実験方法に従って測定する。
放射性リガンド結合アッセイ:
GALR2への競合結合アッセイは、結合バッファー(25mMのHEPES、pH7.4、5mMのMgCl2、1mMのEDTA、0.5%のプロテアーゼフリーBSA)、ヒトGALR2膜(タンパク質0.5μg/チューブ)、[125I]ガラニン(最終濃度、1,3nM)を含むポリエチレンMiniSorpチューブ(Nunc)内で行う。低濃度から高濃度までの候補調節剤又はニューロペプチドQポリペプチドを添加する。サンプルを、0.1mlの最終体積で、25℃にて60minインキュベートし、次いで、多層膜フィルター(multiple membrane filter)(Linca Lamon Instrumentation、テルアビブ、イスラエル)を用い、0.5%PEI中に少なくとも1h前もって浸したGF/Cフィルター上でろ過する。フィルターを、4mlの氷冷洗浄バッファー(結合バッファーと同じ組成)で3回洗浄し、乾燥し、ガンマカウンターで計測する。
抗生物質を含まない培養培地中で対数増殖期中期(mid−log phase)まで増殖した、ミトコンドリアアポイクオリン、Gα16及び組み換えヒトGALR2レセプターを共発現するCHO−K1細胞を、PBS−EDTAを用いて剥がし、遠心分離し、アッセイバッファー(HEPESを含み、フェノールレッドを含まず、プロテアーゼフリーのBSAを0.1%含むDMEM/HAM’s F12)に、1×106細胞/mlで再懸濁する。細胞を、セレンテラジンHと共に、室温で少なくとも4hインキュベートする。試験の各日に、ニューロペプチドQポリペプチドを試験してアッセイの成績を評価し、EC50を決定する。アゴニストの試験については、96−ウェルプレート内で、50μlの細胞懸濁液を50μlの候補調節剤又はニューロペプチドQポリペプチドと混合する。放射された光を、Hamamatsu Functional Drug Screening System 6000(FDSS6000)luminometerを用いて記録する。アンタゴニストの試験については、100μlのニューロペプチドQポリペプチドを、そのEC80にて、細胞と候補調節剤の混合物に注入し、次いで、最初の注入後15minインキュベートする。放射された光を、Hamamatsu Functional Drug Screening System 6000(FDSS6000)luminometerを用いて記録する。候補調節剤のアゴニスト活性は、ニューロペプチドQポリペプチドのEC100濃度における活性の百分率で表す。候補調節剤のアンタゴニスト活性は、EC80濃度におけるニューロペプチドQポリペプチド活性の阻害の百分率で表す。
培養培地中で対数増殖期中期まで増殖した、Gα16及び組み換えヒトGALR2レセプターを共発現するCHO−K1細胞をPBS−EDTAで剥がし、遠心分離し、細胞培養培地(HEPES、10%(v/v)のウシ胎児血清を含むHAM‘sF12)に再懸濁し、384−ウェルFLIPRプレート中に、各ウェル当たり15’000細胞を播く。37℃/5%CO2加湿インキュベーター内で一晩インキュベートした後、培地を廃棄し、(フェノールレッドを含まず、HEPES、Fluo4−AM及びプロベネシドを含
むDMEM)染色溶液で置換する。37℃/5%CO2加湿インキュベーター内で1時間インキュベートした後、染色溶液をアッセイ培地(フェノールレッドを含まないHBSS/DMEM)で置換した。ニューロペプチドQを含むペプチドは、それらの標的であるGALR2に結合した後の細胞内カルシウムの放出における成績について評価するために試験される。放射された蛍光をFLIPRテトラを用いて記録する。アンタゴニストの試験については、100μlのニューロペプチドQポリペプチドを、そのEC80にて、細胞と候補調節剤の混合物に注入し、次いで、最初の注入後15minインキュベートする。放射された蛍光をFLIPRテトラを用いて記録する。候補調節剤のアゴニスト活性は、ニューロペプチドQポリペプチドのEC100濃度における活性の百分率で表す。候補調節剤のアンタゴニスト活性は、EC80濃度におけるニューロペプチドQポリペプチド活性の阻害の百分率で表す。
試験に先だって、抗生物質を含まない培地中で増殖させたヒト組み換えGALR2レセプターを発現するCHO−K1細胞を、PBS−EDTA(5mMのEDTA)で静かにフラッシュすることにより剥がし、遠心分離により回収し、アッセイバッファー(KRH:5mMのKCl、1.25mMのMgSO4、124mMのNaCl、25mMのHEPES、13.3mMのグルコース、1.25mMのKH2PO4、1.45mMのCaCl2、0.5g/lのBSA)に再懸濁する。ニューロペプチドQポリペプチドに対して容量反応曲線を作成する。アゴニストの試験(96ウェル)については:12μlの細胞を低濃度から高濃度までの候補調節剤6μl及び6μlのホルスコリンと混合し、次いで、室温で30minインキュベートする。溶解バッファー(lysis buffer)を添加し、1時間インキュベートした後、HTRFキットを用い、製造業者の仕様書に従ってcAMP濃度を推定する。アンタゴニストの試験(96ウェル)については:12μlの細胞を、低濃度から高濃度までの候補調節剤6μlと混合し、次いで、10minインキュベートする。その後、ホルスコリンとニューロペプチドQポリペプチドの混合物6μlを、最終濃度が先述のEC80に対応するするように添加する。次いで、プレートを室温で30minインキュベートする。溶解バッファーを添加し、1時間インキュベートした後、HTRFキットを用い、製造業者の仕様書に従ってcAMP濃度を推定する。
抗生物質を含まない培養培地中で対数増殖期中期まで増殖した、ヒト組み換えGALR2レセプターを発現するCHO−K1細胞を、PBS−EDTAを用いて剥がし、遠心分離し、抗生物質バッファーを含まない培地中に再懸濁する。20,000個の細胞を96ウェルプレート中に分配し、5%CO2下、37℃にて一晩インキュベートする。アゴニストの試験については、培地を除き、20μlのアッセイバッファーに加えて、20μlの候補調節剤又はニューロペプチドQポリペプチドを各ウェルに添加する。プレートを、5%CO2下、37℃にて60minインキュベートする。次いで、IP1−D2試薬と抗IP1クリプテート(anti−IP1 cryptate)試薬をウェルに添加し、製造業者の推奨に従って、IP1濃度を測定する。アンタゴニストの試験については、20μlの候補調節剤又は対照アンタゴニストを添加し、プレートを、5%のCO2を含む95%の空気の加湿雰囲気下、37℃にて15minインキュベートし、次いで、20μlのニューロペプチドQポリペプチドを、最終濃度が先述のEC80に対応するするように添加する。プレートを、5%CO2下、37℃にて60minインキュベートする。次いで、IP1−D2試薬と抗IP1クリプテートをウェルに添加し、製造業者の推奨に従って、IP1濃度を測定する。
アッセイバッファーは、20mMのHEPES、pH7.4;200mMのNaCl、
10μg/mlのサポニン、1mMのMgCl2及び0.1%(w/v)のBSAからなる。組み換えヒトGALR2レセプターを発現するCHO−K1細胞から、膜を調製する。膜抽出物をアイスの上で融かし、アッセイバッファーで希釈し、アイスの上に保つ。GDPを、アッセイバッファーで、1μMの最終濃度に希釈する。PVT−WGA Beads(Amersham、RPNQ001)を、アッセイバッファーで、50mg/ml(0.5mg/10μl)に希釈する。GTP−γ−35S(PerkinElmer NEG030X)を、アッセイバッファーで0.1nMに希釈する。アゴニストの試験については、膜(12.5μl)をGDP(12.5μl)と混合する。並行して、反応を開始する直前に、GTP−γ−35S(12.5μl)をbeads(12.5μl)と混合する。以下の試薬をOptiplate(Perkin Elmer)のウェルに連続的に添加する:50μlの候補調節剤又はニューロペプチドQポリペプチドリガンド、25μlの膜:GDPミックス及び25μlのGTP−γ−35S:ビーズミックス。プレートをトップシールで覆い、オービタルシェイカー上で2min混合し、次いで、室温にて1時間インキュベートする。次いで、プレートを2000rpmにて10min遠心し、室温にて1時間インキュベートし、PerkinElmer TopCountリーダーを用いて、各ウェル当たり1min計測する。
TANGO GALR2細胞を、PBS−EDTA(5mM EDTA)を用いて静かにフラッシュすることにより剥がし、遠心分離により回収し、アッセイバッファー(10%のチャコールデキストラン処理FBSを含むDMEM,0.1mMのNEAA、25mMのHEPES、100U/mlのペニシリン及び100μg/mlのストレプトマイシン)中に、312,500細胞/mlの密度で再懸濁する。32μlの細胞懸濁液(10,000細胞)を、ブラッククリアボトム(black clear−bottom)384−ウェル培養プレートのウェルに添加する。アゴニストの試験については、0.5%のDMSOを含むアッセイバッファーで5倍に濃縮したニューロペプチドQポリペプチド又は候補調節剤8μlを、培養プレートのウェルに添加する。アンタゴニストの試験については、0.5%のDMSOを含むアッセイバッファーで10倍に濃縮した候補調節剤4μlを、培養プレートのウェルに添加する。室温で30分間インキュベートした後、0.5%のDMSOを含むアッセイバッファーで10倍に濃縮したニューロペプチドQポリペプチド4μlを、最終濃度が先述のEC80に対応するするように添加する。次いで、プレートを、37℃/5%CO2の加湿インキュベーター内で16時間インキュベートする。
組み換えヒトGALR2レセプター及びベータ−アレスチン2(CHO−K1−hGALR2−ベータ−アレスチン2)を発現する細胞を、384−ウェル組織培養プレート中に、20.000細胞/ウェルの密度、25μlの細胞培養培地(キット中のOCC2培地)体積にて、OCC2培地(P/N30−409)中にプレートした。細胞をマイクロプレート中にシードした後、試験前に、それらを37℃、5%CO2の加湿インキュベー
タ内に24時間置いた。OCC2培地を廃棄し、そして各ウェル当たり20μlのHBSS 1X(Gibco、14065)、20mMHEPES(Gibco、16530)、0.1%BSA(Sigma、A3803)、pH7.4で置き換えた。候補調節剤のストック溶液をDMSO中に10mMの濃度で調製し、そしてHBSS1X(Gibco、14065)、20mM HEPES(Gibco、16530)、0.1%BSA(Sigma、A3803)、pH7.4で、活性化用量反応曲線に必要な濃度に段階希釈した。PathHunter eXpress細胞をインキュベータから除き、化合物プレートから5μlを移した。37℃にて90分間インキュベートした。インキュベーションの間、各384ウェルプレート用の検出試薬の検量線用溶液を、下記の試薬を混合することにより調製した:細胞アッセイバッファー(19部)、基質試薬1(5部)及び基質2(1部)。調製した検出試薬をウェル当たり12.5μl添加し、そして室温(23℃)で90分間インキュベートした。サンプルを、標準蛍光プレートリーダー(Fluostar)にて、下記の条件下で読んだ:測定インターバル(measurement interval):0.1秒、interval time:0.1秒、インターバル数(number of interval):1、ゲイン:自動調整、発光フィルター:レンズ。生データをGraphPad Prism softwareで分析して、曲線を作成し、そしてEC50を算出した。
ATP: アデノシン三リン酸
BSA: ウシ血清アルブミン
cAMP: 環状アデノシン一リン酸
CAT: クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
CDR: 相補性決定領域
CNS 中枢神経系
CPM 分当たりの計数
CRE: cAMP応答配列
CRE: 環化組み換え(Cyclization Recombination)
CRF 副腎皮質刺激ホルモン放出因子
DAG: ジアシルグリセロール
DMEM: ダルベッコ修正イーグル培地
DMSO: ジメチルスルホキシド
DR: 背側縫線
DRN: 背側縫線核
DTT: ジチオスレイトール
EDTA: エチレンジアミン四酢酸
EGTA: エチレングリコール−ビス(ベータ−アミノエチルエーテル)−N,N,N’,N’−テトラ酢酸
ELISA: 酵素免疫測定法
FBS: ウシ胎児血清
FLIPR: 蛍光イメージングプレートリーダー
FLP: フリッパーゼ組み換え酵素(FLiPpase Recombinase Enzyme)
FRET: 蛍光エネルギー転移
GALR1: Galaninレセプター1
GALR2: Galaninレセプター2
GALR3: Galaninレセプター3
GDP: グアノシン二リン酸
GFP: 緑色蛍光タンパク質
GPCR: Gタンパク質共役レセプター
GTP: グアノシン三リン酸
HBSS: ハンクス平衡塩類溶液
HEPES: 4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジンエタンスルホン酸
HIV: ヒト免疫不全症ウイルス
HTRF: 均一時間分解蛍光測定(Homogeneous Time
Resolved Fluorescence)
icv: 脳室内
KRH: Krebs-Ringer−Hepes
NEAA: 非必須アミノ酸
NPQ: ニューロペプチドQ
Kd: 解離の平衡定数
LC: 青斑核
MAP(kinase): マイトジェン活性化タンパク質(キナーゼ)
PBS: リン酸緩衝生理食塩水
PCR: ポリメラーゼ連鎖反応
PEI: ポリエチレンイミン
PNS 末梢神経系
RT/PCR: 逆転写酵素/ポリメラーゼ連鎖反応
RLU 相対発光量(Relative Light Units
Claims (17)
- GALR2の機能を調節する作用剤を識別する方法であって:a) ニューロペプチドQポリペプチドのGALR2ポリペプチドへの相互作用を許容する条件下で、候補調節剤の存在下及び非存在下にて、GALR2ポリペプチドをニューロペプチドQポリペプチドと接触させる工程;及びb) GALR2ポリペプチドのニューロペプチドQポリペプチドへの相互作用を測定する工程であって、候補調節剤非存在下での相互作用に対する、候補調節剤存在下での相互作用の増大又は減少が、候補調節剤をGALR2の機能を調節する作用剤として識別する上記工程、を含む上記方法。
- GALR2の機能を調節する作用剤を識別する方法であって:a) ニューロペプチドQポリペプチドのGALR2ポリペプチドへの相互作用を許容する条件下で、候補調節剤の存在下及び非存在下にて、GALR2ポリペプチドをニューロペプチドQポリペプチドに接触させる工程;及びb) GALR2ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する工程であって、候補調節剤非存在下における活性に対する、候補調節剤の存在下における活性の変化が、候補調節剤をGALR2の機能を調節する作用剤として識別する上記工程、を含む上記方法。
- GALR2の機能を調節する作用剤を識別する方法であって:a) GALR2ポリペプチドを候補調節剤と接触させる工程;b) 候補調節剤の存在下で、GALR2ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する工程;及びc) 候補調節剤の存在下で測定した活性を、GALR2ポリペプチドがニューロペプチドQポリペプチドと接触するサンプル内で測定した活性と比較する工程であって、候補調節剤の存在下で測定した活性の量が、EC50で存在するニューロペプチドQポリペプチドにより引き起こされる量の少なくとも50%である場合に、当該候補調節剤をGALR2の機能を調節する作用剤として識別する上記工程、を含む上記方法。
- GALR2の機能を調節する当該作用剤がサンプル中に存在する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 当該測定が、標識置換、表面プラズモン共鳴、蛍光共鳴エネルギー転移、蛍光消光及び蛍光偏光から選択される方法を用いて行われる、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 当該GALR2ポリペプチド配列がSEQ ID No.2であり、かつ当該ニューロペプチドQポリペプチド配列がSEQ ID No.13、SEQ ID No.14又はSEQ ID No.15であり、そして当該ニューロペプチドQポリペプチドが当該GALR2ポリペプチドに特異的に結合する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 当該GALR2ポリペプチド配列がSEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8及びSEQ ID No.10から成る群より選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 当該ニューロペプチドQポリペプチド配列が、SEQ ID No:13、SEQ ID
No:14、SEQ ID No:15、SEQ ID No:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33
、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40及びSEQ ID NO:41から成る群より選択される、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。 - 当該ニューロペプチドQポリペプチド配列が、SEQ ID No:13、SEQ ID
No:14、SEQ ID No:15及びSEQ ID No:16から成る群より選択される、請求項1〜5又は7のいずれか1項に記載の方法。 - 当該ニューロペプチドQポリペプチドが検出可能に標識された、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 当該GALR2ポリペプチドが細胞内又は細胞上で発現する、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 当該GALR2ポリペプチドが細胞膜内に存在する、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 当該細胞が、COS−7−細胞、CHO細胞、U2OS細胞、LM(TK−)細胞、NIH−3T3細胞、HEK細胞、K−562細胞及び1321N1星状細胞種細胞から成る群より選択される、請求項11又は12のいずれか1項に記載の方法。
- 当該GALR2ポリペプチドが、合成リポソーム又はウイルス誘発性発芽膜上又はそれらの内部に存在する、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 当該方法が、さらにGα16の存在下で行われる、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 当該作用剤が、ペプチド、ポリペプチド、抗体又はその抗原結合フラグメント、脂質、炭水化物、核酸及び有機低分子から成る群より選択される、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
- シグナル伝達活性を測定する工程が、グアニンヌクレオチドの結合又は交換、アデニルシクラーゼ活性、cAMP、ベータ−アレスチン1の移動、ベータ−アレスチン2の移動、プロテインキナーゼC活性、ホスファチジルイノシトールの分解、ジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸、細胞内カルシウム、アラキドン酸、MAPキナーゼ活性、チロシンキナーゼ活性又はレポーター遺伝子発現の測定を含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
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