JP2013534823A - ヒト多能性細胞に由来する細胞を使用してメバロン酸合成調節剤を選択するための方法 - Google Patents

ヒト多能性細胞に由来する細胞を使用してメバロン酸合成調節剤を選択するための方法 Download PDF

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Abstract

メバロン酸またはコレステロールに影響する医薬化合物を選択するための方法であって、試験される前記医薬化合物を、ヒト多能性細胞または誘導幹細胞からＭＳＣタイプの細胞を作製するための方法によって得られるＭＳＣタイプの細胞と接触させる工程を含み、ただし、前記作製方法が、前記ヒト多能性細胞または前記誘導幹細胞を、１）ＦＧＦ、ＨＧＦ、各種ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、各種ヘレグリンおよび各種ＶＥＧＦから選択される１つまたは複数の増殖因子と、２）アスコルビン酸およびその誘導体、ビタミンＥならびにＮ−アセチルシステインから選ばれる１つまたは複数の抗酸化剤とを含む培養培地において培養する工程を含む、方法。

Description

メバロン酸の合成が、多くの生物学的プロセスにおいて、例えば、コレステロールの合成、同様にまた、タンパク質のプレニル化などにおいて関与する。その代謝経路の種々の段階が特定されている。その律速となるＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼ（メバロン酸合成のための酵素）が、主要な治療標的である。ＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼの競合的阻害剤である各種スタチンが、治療分子の重要な一群である。これらの分子の第１の臨床適用が、ＬＤＬタイプのリポタンパク質を全身の血流において低下させることである。そのうえ、これらの分子は多面的な影響を有しており、それらのいくつかはコレステロール合成の制御とは無関係であり、おそらくは、細胞のシグナル伝達に関与するタンパク質の二次的修飾に関連づけられる。スタチン類は内皮細胞の機能を改善し、アテローム斑を安定化させ、抗炎症機能を有し、骨の再吸収において役割を果たし、認知症の危険性を低下させ、また、ある種の正常細胞および腫瘍細胞の細胞増殖を制御する。
そのうえ、スタチン類は、ある種の組織（例えば、筋肉組織など）については著しい毒性を有しており、このことがそれらの臨床使用を制限している。
メバロン酸の代謝を妨げる化合物のハイ・スループット・スクリーニングを可能にする細胞試験では、下記のことが可能とならなければならない：
・メバロン酸合成の新規な機能的阻害剤を特定すること；
・細胞毒性（具体的には筋毒性）を増大させるという結果を有する薬物相互作用を提供すること；
・細胞毒性（具体的には筋毒性）を防止する分子を特定すること；
・筋萎縮を防止する分子を特定すること；
・正常細胞および腫瘍細胞（腫瘍幹細胞を含む）の増殖を選択的に制御する分子を特定すること。
本発明は、メバロン酸の合成に関与する分子を、とりわけ、多能性細胞に由来する分化した正常なＭＳＣ細胞またはＭＳＣタイプの細胞を使用することによってスクリーニングするための方法に関連する。
細胞試験を使用することによるハイ・スループット・スクリーニングの効率は、使用される細胞試験の特異性、感度、ロバストネスおよび入手可能性に依存する。この問題は、治療分子をヒト種のためにスクリーニングするための非常に好適なモデルである正常なヒト細胞については特に重要である。実際、正常なヒト細胞の入手可能性が、ある種の細胞タイプ（例えば、心臓細胞および神経細胞など）については特に制限される。一方で、正常なヒト細胞は、ハイ・スループット・スクリーニングのためのその使用を制限する限定された複製能を有する。現在、ＨＴＳタイプのハイ・スループット・スクリーニングのために使用される細胞の大多数はヒト以外の細胞であるか、あるいは、そうでなければ、このタイプのスクリーニングにおける単離された分子の関連性を低下させる形質転換されたヒト細胞または腫瘍由来のヒト細胞であるかのどちらかである。
本発明は、多能性細胞に由来する分化した正常なＭＳＣ細胞またはＭＳＣタイプの細胞を使用することによる、メバロン酸の合成に関与する分子のハイ・スループット・スクリーニングのための方法に関連する。本発明はまた、多能性細胞に由来する分化した正常な細胞を作製するための方法に関連する。本発明はまた、メバロン酸の合成を薬理学的阻害剤の存在により制御することによる、多能性細胞に由来する分化した正常な細胞を使用するハイ・スループット・スクリーニングのための方法に関連する。
本発明の目的には、とりわけ、下記のものが挙げられる：
１．ＭＳＣタイプの細胞をヒト多能性細胞から作製するための方法であって、ヒト多能性細胞を、
ａ．各種ＦＧＦ、各種ＨＧＦ、各種ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、各種ヘルグリン（ｈｅｒｕｇｕｌｉｎ）および各種ＶＥＧＦから選択される１つまたは複数の増殖因子、
ｂ．アスコルビン酸およびその誘導体、ビタミンＥならびにＮ−アセチルシステインから選択される１つまたは複数の抗酸化剤
を含む培養培地において培養するための工程を含む方法。
２．ＭＳＣタイプの細胞を誘導多能性幹細胞から作製するための方法であって、誘導幹細胞を、
ａ．各種ＦＧＦ、ＨＧＦ、各種ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、各種ヘルグリン（ｈｅｒｕｇｕｌｉｎ）および各種ＶＥＧＦから選択される１つまたは複数の増殖因子、
ｂ．アスコルビン酸およびその誘導体、ビタミンＥならびにＮ−アセチルシステインから選択される１つまたは複数の抗酸化剤
を含む培養培地において培養するための工程を含む方法。
３．培養培地が、
ａ．ＦＧＦ；および
ｂ．アスコルビン酸またはその誘導体の１つ
を含むことを特徴とする、目的１または目的２による方法。
４．培養培地が、
ａ．ＦＧＦ２；および
ｂ．アスコルビン酸および／またはアスコルビン酸２−リン酸
を含むことを特徴とする、目的３による方法。
５．培養培地がＦＧＦ２を１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で含み、かつ、アスコルビン酸２−リン酸を１ｍＭの最終濃度で含むことを特徴とする、目的４による方法。
６．ＭＳＣタイプの作製された細胞が、ＣＤ７３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１６６またはＣＤ１０５のマーカーのうちの１つまたは複数を発現することを特徴とする、前記目的による方法。
７．ＭＳＣタイプの作製された細胞がＳＳＥＡ４を発現することを特徴とする、前記目的による方法。
８．メバロン酸またはコレステロールに影響する医薬化合物を選択するための方法であって、目的１〜目的７による方法によって得られる細胞を試験される前記医薬化合物と接触させるための工程を含む方法。
９．メバロン酸またはコレステロールの代謝経路を調節する医薬化合物を選択するための方法であって、目的１〜目的７による方法によって得られる細胞を試験される前記医薬化合物と接触させるための工程を含む方法。
１０．メバロン酸の合成を阻害することの効果を高める医薬化合物を選択するための方法であって、目的１〜目的７による方法によって得られる細胞を試験される前記医薬化合物と接触させるための工程を含む方法。
１１．メバロン酸の合成を阻害することの影響を補償する医薬化合物を選択するための方法であって、目的１〜目的７による方法によって得られる細胞を試験される前記医薬化合物と接触させるための工程を含む方法。
１２．メバロン酸の合成およびコレステロールの合成の機能的阻害剤である医薬化合物を選択するための方法であって、目的１〜目的７による方法によって得られる細胞を試験される前記医薬化合物と接触させるための工程を含む方法。
１３．筋肉組織に対する毒性影響を有する医薬化合物を選択するための方法であって、目的１〜目的７による方法によって得られる細胞を試験される前記医薬化合物と接触させるための工程を含む方法。
１４．筋萎縮または筋肉減少症から守る医薬化合物を選択するための方法であって、目的１〜目的７による方法によって得られる細胞を試験される前記医薬化合物と接触させるための工程を含む方法。
１５．抗腫瘍性の医薬化合物を選択するための方法であって、目的１〜目的７による方法によって得られる細胞を試験される前記医薬化合物と接触させるための工程を含む方法。
１６．骨組織を修復するための、目的１〜目的７の方法によって得られる細胞。
１７．軟骨を修復するための、目的１〜目的７の方法によって得られる細胞。
１８．白色脂肪細胞または褐色脂肪細胞を得るための、目的１〜目的７の方法によって得られる細胞の使用。
１９．免疫調節細胞を得るための、目的１〜目的７の方法によって得られる細胞の使用。
本発明は、多能性細胞に由来する分化した正常なＭＳＣ細胞またはＭＳＣタイプの細胞を使用することによる、メバロン酸の合成に関与する分子のハイ・スループット・スクリーニングのための方法に関連する。この新規な方法の目標の１つが、ハイ・スループット・スクリーニングのロバストネス、特異性および感度を、制限のない量で入手可能な正常なヒト細胞の供給源と、メバロン酸合成の調節剤とを連携させることによって増大させることである。細胞システムの特異性、感度、ロバストネスおよび入手可能性により、ハイ・スループット・スクリーニングの関連性が決定される。
非常に頻繁に、ハイ・スループット・スクリーニングのために使用される細胞は、齧歯類（ラット、マウス）の細胞、または、形質転換されたヒト細胞である。自然発生的形質転換のかなり大きい確率を有する多くの齧歯類細胞とは異なり、正常なヒト細胞は有限の成長能を有しており、約５０回の細胞分裂の後で老化に入る。ヒト細胞の延長された成長には、表現型の不安定性が付随する。これらの性質により、正常なヒト細胞をハイ・スループット・スクリーニングのために使用することがかなり制限される。
ヒト多能性幹細胞の存在は、正常なヒト細胞を何ら制限なく入手するという可能性をもたらす。２つのタイプの多能性細胞、すなわち、胚性幹細胞（ｈＥＳ）および誘導幹細胞（ｉＰＳ）が存在する。多能性細胞が持つ本質的特徴は、制限を何ら伴わない自己再生の能力、および、生物体全体を構成するすべてのタイプの細胞への分化の可能性である。
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）を使用することの、Ｊ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎの研究（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ他、１９９８）以後の可能性により、非常に数多くの可能性が広がっている。実験的には、ヒト胚性幹細胞は、多くのタイプの細胞（心臓細胞、平滑筋細胞、神経細胞、ケラチノサイト、造血細胞、インスリン産生細胞）の分化手法および単離の開発を可能にしている。しかしながら、胚性幹細胞の単離は、著しいノウハウを必要とする技術であるとともに、傷つきやすく、かつ、限定された生物学的材料、すなわち、余分な胚を入手することに依存する技術である。さらに、胚性幹細胞は、国に依存して国毎に解決される多くの倫理的問題を提起している。倫理面、規制面および工業所有権における様々な問題により、現在、胚性幹細胞の使用は制限されている。
Ｓ．Ｙａｍａｎａｋａによって率いられる研究チームによるｉＰＳ細胞の発見（Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ．＆Ｙａｍａｎａｋａ Ｓ．，２００６）は、後者の可逆性、ならびに、ＥＳ細胞と非常に類似する性質（自己再生、生物を構成するすべての細胞タイプへの分化能、および、許容する動物に注入されると、奇形腫を形成することができること）を有するｉＰＳ細胞への非常に多様なタイプの細胞の脱分化および初期化がそれらの「強制された」同時発現により引き起こされ得る減少した数の遺伝子を示している。ｉＰＳを得るための制限は何ら存在しないようである。実際、初代細胞、不死化細胞、皮膚または肺の線維芽細胞、肝細胞、膵臓細胞、リンパ球および神経前駆体をｉＰＳ細胞に「初期化」することができた。多くの病状（例えば、ＳＭＡ、ＡＬＳ、パーキンソン病またはデュシェンヌ型ジストロフィーなど）に冒された患者の細胞に由来するｉＰＳ細胞もまた作製されている（Ｐａｒｋ他、２００８）。したがって、この取り組みは、容易に入手できる生物学的材料からのｉＰＳ細胞の単離を可能にしている。最後に、これらの非常に数多くの研究はこの技術の質的ロバストネスを明瞭に示していることを付け加えなければならない。
本発明の第１の部分は、ＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼ（メバロン酸の合成における重要な酵素）の阻害剤に対して感受性のある、多能性細胞に由来する分化したＭＳＣ細胞またはＭＳＣタイプの細胞を作製することに関連する。以前の研究では、筋肉組織に由来する細胞（筋肉前駆体細胞（ＭＰＣ））が各種スタチンに対して特に感受性であることが示されている。実際、スタチンの存在により、このタイプの細胞の成長が特異的に阻害される。本発明の記載される方法は、多能性細胞に由来する、すなわち、ｈＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞に由来する、ＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼの阻害剤に対して感受性のある分化した細胞を作製することを可能にする。本発明の作製方法は２段階の方法であり、第１段階は多能性細胞からの分化方法であり、第２段階は、前記方法により分化させた細胞を増幅し、保存するための方法である。
本作製方法の種々の工程が下記において記載される。本方法の原理は、多能性細胞に由来する未分化細胞クラスターの機械的解離または酵素的解離、および、コラーゲンまたはその誘導体（例えば、ゼラチンなど）からなる細胞支持体における播種によって分化を開始させることである。細胞が分化すると、細胞は、ＦＧＦファミリーから選ばれる増殖因子と、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸の誘導体など）とを含む培地において増幅される。この目的のために、他の増殖因子を使用することができ、例えば、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）、様々なＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）、ＥＧＦ（上皮増殖因子）ファミリーから選ばれる因子、ＶＧＥＦファミリーから選ばれる因子、各種ヘルグリンなどを使用することができる。本方法により、安定した表現型を有する分化した細胞を、量に関して何ら制限されることなく作製することが可能である。これらの細胞は、正常な核型および有限の成長によって特徴づけられる正常な表現型を有する。
細胞タイプの定義
多能性幹細胞
多能性細胞は、２つの性質によって、すなわち、自己再生能と、成体の生物を構成するすべての細胞タイプを形成するという性質とによって特徴づけられる。分化によるこれらの細胞は３つの胚葉（外胚葉、内胚葉、中胚葉）の細胞を与え得る。本質的には、２つのタイプの多能性細胞、すなわち、胚性幹細胞と、多能性にまで誘導される細胞とが存在する。
胚性幹細胞（ＥＳ細胞）
胚性幹細胞は、胚盤胞段階にある胚に由来する多能性幹細胞である。これらの細胞の単離は、胚を用いることを必要とした。今日では、入手可能である非常に多数の系統の胚性幹細胞が世界中に存在する。
誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）
誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）は、成体の体細胞を多能性細胞に初期化することから生じるものであり、現在のところ、大多数の場合において、初期化のために要求される遺伝子の移入によって得られる。これらの遺伝子には、ＥＳ細胞によって発現される遺伝子（例えば、Ｓｏｘ２およびＯｃｔ４など）、および、増殖を制御する遺伝子（例えば、ｃＭｙｃ、Ｌｉｎ２８およびＫｌｆ４など）が見出されている。ｉＰＳ細胞はＥＳ細胞の本質的性質を有する。近い将来には、様々なｉＰＳを、他の取り組み（例えば、タンパク質の移入、小分子による処理など）を使用することによって得ることが可能となる。
中胚葉系前駆体細胞（ＭｅＰＣ）
「ＭＳＣ」細胞が多能性細胞（ＥＳおよびｉＰＳ）に由来する。これらの細胞は中胚葉に属しており、それらの成長については基質への付着に依存しており、また、著しいが、有限の成長能を有している。「ＭＳＣ」細胞は一連の膜マーカー（例えば、ＣＤ４４、ＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ１０５およびＳＳＥＡ４など）を発現し、また、ある種の実験条件のもとでは、骨組織、軟骨組織および脂肪組織を形成することができる。
中胚葉系の間質細胞または幹細胞（ＭＳＣ細胞）
成体において、ＭＳＣを非常に多数の組織から単離することができる。最初のＭＳＣ細胞が骨髄から単離された。第２の段階において、ＭＳＣ細胞が、研究された組織のほとんどすべてにおいて見出された。これらの細胞は中胚葉に属しており、それらの成長については基質への付着に依存しており、また、有限の成長能を有している。ＭＳＣ細胞は一連の膜マーカー（例えば、ＣＤ４４、ＣＤ２９、ＣＤ７３など）を発現し、また、ある種の実験条件のもとでは、骨組織、軟骨組織および脂肪組織を形成することができる。
ＭＳＣ細胞またはＭＳＣタイプの細胞
ＭＳＣ細胞またはＭＳＣタイプの細胞は、多能性間質細胞の名でも知られている中胚葉系の幹細胞、同様にまた、同じ生物学的特徴を有する細胞を意味する。ＭＳＣ細胞またはＭＳＣタイプの細胞には、非限定的な様式において、成体組織の中胚葉系の前駆体細胞（ＭｅＰＣ）および中胚葉系の間質細胞または幹細胞（ＭＳＣ）が含まれる。
筋肉前駆体細胞（「ＭＰＣ」）
ＭＰＣ細胞は筋肉組織に由来し、筋肉組織から単離される。これらの細胞は、筋肉の機能を維持することに関わっており、また、筋肉組織の修復を制御する。ＭＰＣは限定的な様式で自己再生することができ、また、筋肉組織をエクスビボおよびインビボにおいて形成することができる。
ヒト多能性細胞（ｈＥＳおよびｉＰＳ）に由来するスクリーニング用の細胞を単離および作製するための手順の説明
上記細胞を未分化のｈＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞から作製することができる。作製条件は下記の通りであり、両方の細胞タイプについて同一である。それらの形態学的特徴によって特定され得る未分化細胞の塊が、細胞を作製するための細胞材料の根幹をなすものである。
形態学的基準に基づいて、または、発現基準（例えば、Ｏｃｔ４／ｐｏｕｆ５などの、多能性を維持することに関連する遺伝子プロモーターの制御下でのＴｒａ１−６０の発現またはＧＦＰの発現など）に基づいて特定され得る未分化細胞の塊が、ニードルによって、双眼拡大鏡の管理下のもとで機械的に解離させられる。コラゲナーゼタイプおよびトリプシンタイプの酵素を使用することによる穏やかな酵素的解離もまた使用することができる。二価イオンのキレート化剤（例えば、ＥＤＴＡおよびＥＧＴＡなど）を加えることもまた可能である。後者の場合には、Ｒｈｏａタンパク質の阻害剤（Ｒｏｃｋ阻害剤）の使用により、上記により解離させられた細胞のより良好な再開が可能になる。解離後に得られる細胞の小さいクラスターが自動計数されるか、または、血球計数器によって計数され、そして、生存性が、トリパンブルー排除またはヨウ化プロピジウム標識化の技術を使用することによって推定される。その後の工程が、細胞凝集物を、コラーゲンまたはその誘導体（例えば、ゼラチンなど）により被覆された細胞支持体に播種することによって形成される。細胞外マトリックスの他の構成成分（例えば、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチンなど）または合成化合物（例えば、ポリオルニチン（ｐｏｌｙ−ｏｍｉｔｈｉｎｅ）など）をこの工程のために使用することができる。その後、細胞は、グルタミンが補充され、かつ、非必須アミノ酸、ベータ−メルカプトエタノール、および、ウシ血清または別の起源から得られる血清（例えば、ヒト血清など）の混合物が補充されるＤＭＥＭタイプの培養培地の存在下で培養される。この操作を、動物起源のタンパク質を全く含まない完全合成培地において行うことができる。
本発明の期間中、ＦＧＦと、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸の誘導体など）との連携により、作製方法のロバストネスと、作製された細胞の作製速度および量との両方が大きくなったことを示すことができた。ＦＧＦをアスコルビン酸２−リン酸と組み合わせるこの取り組みを使用することによって、多能性細胞に由来する分化した細胞を、多能性細胞がｈＥＳ細胞またはｉＰＳであろうとも、種々のタイプの多能性細胞を用いた実験のすべてにおいて作製することができた。播種後５日で、細胞クラスターから現れ、その後、細胞分裂に入る、細胞基質に接着している個々の細胞を区別することが可能である。これが形態学的分化の第１段階である。１０日目〜２０日目の間で、細胞は、ＥＤＴＡタイプのキレート化剤と組み合わされるトリプシンタイプの酵素溶液を使用することによって移植される。機械的な解離を使用することもまた可能である。上記により得られた細胞は、コラーゲンにより、または、ゼラチンタイプのその誘導体により被覆された細胞支持体に播種される。第１段階の場合と同様に、別のタイプの基質を使用することが可能である。この第２段階が、細胞数の増大、および、上記により得られた細胞集団の均質化を可能にする細胞増殖工程である。最初の移植が行われるとすぐに、アスコルビン酸２−リン酸と連携されるＦＧＦの存在は、細胞数を２倍増大させることを可能にし、その後、継代培養の期間中において、細胞数がこの組み合わせの存在下ではかなり増大する。その後、差が対数での倍数で数単位に達し得る。このタイプの細胞を、ＦＧＦおよび抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸およびその誘導体など）を含有する合成培地において作製することもまた可能である。ＦＧＦが存在し、抗酸化剤が何ら存在しない場合、多能性細胞に由来する細胞の数を増大させることができないことは、注目すべきことである。上記により得られた細胞は、標準的な方法によって、例えば、ＤＭＳＯを冷凍保存剤とする冷凍保存などによって保存される。この工程のために、市販の溶液と同様に、グリセロール、トレハロース、グリシンおよびアルブチンを凍結保護剤として使用することもまた可能である。保存がガラス化によって行われる場合がある。作製された細胞の冷凍保存は優れた収量を有しており、また、生物学的パラメーター（例えば、細胞成長または表面マーカーの発現など）を変化させない。これらの作製条件のもとでは、細胞は、有限の成長および正常な核型を有しながら、その正常な性質を保ち続ける。
上記により作製された細胞のための記載された分化方法および増幅方法は、ｈＥＳまたはｉＰＳに由来する細胞について類似する効率を有する。両方の場合において、培養培地においてアスコルビン酸２−リン酸と連携されるＦＧＦの組み合わせの存在は細胞分化方法および細胞増幅方法の効率を劇的に増大させる。
ヒト多能性細胞（ｈＥＳおよびｉＰＳ）に由来する分化した細胞の、スクリーニングのための特徴づけ
最初の特徴づけ段階は機能的基準（例えば、成長能、基質への接着など）および形態学的基準に基づく。形態学的には、作製された細胞は、間葉系細胞の特徴と類似する特徴を有する。その成長は基質への付着に依存している。行われた分子分析では、多能性細胞の特徴的な多能性状態に関連する遺伝子（例えば、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇなど）の発現が、ＲＴ−ＰＣＲ技術によって、作製された細胞において検出できないことが示される。
作製された細胞のフローサイトメトリーによる表面マーカーの分析では、多能性状態に関連する膜決定因子であるＳＳＥＡ３、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８０の発現がないこと、そして、ＣＤ７３、ＣＤ４４、ＣＤ１６６、ＣＤ１０５およびＣＤ２９などの膜決定因子が存在することが示される。これらのマーカーの発現はまた、多能性間質細胞（ＭＳＣ）においても存在する。ＭＳＣ細胞が約１０年前に他と区別された。したがって、本発明の方法によって作製される細胞もまた、下記のような、ＭＳＣのいくつかの性質を有する：
・基質への接着
・大きいが、有限の成長能
・凍結による保存
・ＣＤ７３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１６６の各マーカーについての発現均一性
・骨形成性の分化能。
培養培地におけるＦＧＦ２およびアスコルビン酸２−リン酸の組み合わされた存在は、本発明の方法によって作製される細胞の成長能およびＳＳＥＡ４の発現を増大させる。
本発明の方法では、ＦＧＦ２およびアスコルビン酸２−リン酸の存在により、分化した細胞を多能性細胞から作製することが可能である。成長能におけるこの増大には、膜マーカーＳＳＥＡ４の特異的な発現が伴う。この膜マーカーはまた、多能性細胞およびある種の（神経系または中胚葉系の）前駆体細胞によっても発現される。ＦＧＦ２およびアスコルビン酸２−リン酸が個々には、ＳＳＥＡ４の発現を誘導するという可能性、または、増殖能を著しく増大させるという可能性をもたらさないことに留意することは、注目すべきことである。一方で、ＦＧＦ２およびアスコルビン酸２−リン酸が一緒に存在することにより、成長能およびＳＳＥＡ４の発現が、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１ ８０、ＳＳＥＡ３およびＳＳＥＡ１のような分化全能性に関連する他のマーカーの発現を改変することなく、かなり増大する。本発明の方法により、ＳＳＥＡ４を発現する分化した細胞を均一に作製することが可能である。本発明の方法によって記載されるこれらの作製条件のもとでは、分化した細胞は、ＳＳＥＡ４の発現を伴う著しい増殖能を有する。
本発明の方法によって作製される細胞は、ＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼの阻害剤のようなメバロン酸合成の阻害剤に対する特異的な感受性を有する。
メバロン酸は、細胞活性の鍵である代謝産物コレステロールの合成に不可欠な前駆体である。スタチン、すなわち、ＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼ（メバロン酸の合成を制御する酵素）の立体的阻害剤は、メバロン酸の産生、したがって、コレステロールの産生を阻止する。メバロン酸が細胞外培地によって提供されることにより、コレステロールの産生を、スタチンが存在するにもかかわらず、回復させることが可能である。
これらの性質は、とりわけ、メバロン酸合成の阻害剤の毒性を予測し、分析するための細胞試験を組み立てるという可能性をもたらす。ＭＰＣ細胞のようなある種の細胞タイプが、スタチンに対して特に感受性がある。この細胞タイプにおいて、スタチンは毒性であり、だが、この毒性が、細胞外培地の存在下におけるメバロン酸の存在によってなくなる。したがって、簡便な細胞試験によって、スタチンが毒性であることを、メバロン酸の合成を伴う機構により示すことが可能である。
ＣＯＸ２の阻害剤およびＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼの阻害剤を用いる最近の例では、毒物学的問題を過小評価することは、ヒト、健康および経済の観点から、少なからぬ結果を有し得ることが示される。したがって、予測可能な毒物学システムを規定することが非常に重要な目標である。スタチンを含めて、ＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼの阻害剤は、筋肉組織については特段の毒性を有する。この毒性は、単純な痛みから、死を招き得る横紋筋融解にまで及び得る。
ヒト筋肉前駆体細胞（ＭＰＣ）は筋肉毒性の良好な指標物である。実際、ＭＰＣの細胞成長が成長培地におけるスタチンの存在によって阻害される。この阻害は用量依存的である。メバロン酸の存在は、この成長阻害を完全に解除するという可能性をもたらす。したがって、この阻害が、ＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼの阻害を介して、すなわち、メバロン酸（コレステロールの合成における前駆体）の産生に関わる酵素の阻害を介して達成される。
本発明の方法に従って多能性細胞から作製される細胞は、ＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼの阻害剤について、ＭＰＣに匹敵する感受性を有する。実際、ノバスタチンまたはシンバスタチンのようなＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼの阻害剤の培養培地における存在は、多能性細胞に由来する分化した細胞の数を用量依存的様式で低下させる。この阻害がメバロン酸の存在によって高まる。したがって、上記により認められた成長阻害は、メバロン酸の産生に関わる酵素の阻害に起因する。胚性幹細胞から作製される細胞、および、誘導多能性細胞から作製される細胞は、ＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼの阻害剤に対して、また、メバロン酸に対して同じタイプの感受性を有する。
ｉＰＳの技術は、多能性細胞をどのような個体からでも作製するという可能性をもたらす。本発明の方法は、ｉＰＳ細胞に由来する分化した細胞を、メバロン酸合成の阻害剤に対する悪化した感受性を有する患者から生じさせるという可能性をもたらす。これらの細胞ツールは、毒性機構を理解し、そして、この毒性を防止し、また、追跡するためのマーカーを単離するために有用である。
本発明の方法によって作製される細胞はメバロン酸合成のハイ・スループット・スクリーニングを可能にする。
化合物のハイ・スループット・スクリーニングでは、細胞をこの技術と適合し得る形式（例えば、９６ウエルまたは３８４ウエルのマルチウエルプレートなど）で培養するという可能性が要求される。一方で、分析ロボットと適合し得る、結果を読み取るための迅速なシステムの使用もまた要求される。本発明の方法によって作製される細胞は９６ウエルおよび３８４ウエルのマルチウエルプレートにおいて培養することができる。これらの条件のもとでは、細胞カウント数の変動係数が小さい。第１の段階において、マルチウエルで得られる細胞の数が、細胞を、画像分析システムを使用することにより標識化後に直接に計数することによって求められた。これらの分析システムは正確ではあるが、比較的、時間がかかる。したがって、ＡＴＰの量およびミトコンドリアの活性に基づく試験が開発された。本発明の方法によって作製される細胞については、直線関係が、測定されたＡＴＰの量またはミトコンドリアの活性と、ウエルあたりの細胞数との間に存在することを明らかにすることが可能であった。言い換えれば、ＡＴＰの量または測定されたミトコンドリア活性が細胞数の大きさである。ヒトの臨床診療において使用される主要な活性製造物を表す１，２００超の化合物からなる化学分子のバンクがスクリーニングされた。
本発明の方法によって記載される細胞は、このバンクをスクリーニングするという可能性をもたらした。これらの細胞が、メバロン酸の存在下および非存在下で、かつ、このバンクの種々の化合物の存在下で３日間、９６ウエルおよび３８４ウエルのマルチウエルにおいて培養された。すべてのこれらの実験が、化合物の分配および無菌培地での細胞の培養を可能にするロボットにより行われた。化合物が下記の基準で選択された：メバロン酸の非存在下における細胞数の低下、および、メバロン酸の存在下において細胞数を維持すること。これらの基準により、その毒性がメバロン酸合成の阻害に関連づけられる分子を選び出すことが可能である。行われたスクリーニングのすべてにおいて、ヒトの臨床診療において使用され、バンクに存在するＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼ（メバロン酸合成のための律速酵素）の阻害剤を選択することができた。これらの実験により、本発明の方法に従って作製される細胞は、メバロン酸合成の阻害剤のスクリーニングを、ハイ・スループット・スクリーニング技術を使用することによってロバストな様式で可能にすることを示すことができた。実現可能性がこのように立証されたことで、数十万個の異なる化合物を表すバンクを、上記により記載されるシステムを用いてスクリーニングすることを検討するという可能性が生まれる。分子は、機能的基準に基づいて、すなわち、メバロン酸合成の阻害に起因する細胞毒性に基づいて選び出されることにもまた留意しなければならない。これらのタイプの試験は、メバロン酸合成の他のクラスの阻害剤を単離するという可能性をもたらす。このシステムにより、新規な阻害剤を、ＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼとのそれらの直接的な相互作用に関係なく、それらの機能的能力に基づいて単離することが可能である。
本発明の方法によって作製される細胞は、メバロン酸合成の阻害剤の毒性影響から守る化合物のハイ・スループット・スクリーニングを可能にする。
メバロン酸合成の阻害剤の毒性影響により、臨床診療におけるこのタイプの化合物の使用が制限されている。実際、筋肉組織に対する多くの二次的影響が認められており、だが、それらのほとんどが限定的であり、また、可逆的である。それにもかかわらず、多くの場合、処置された患者の２０％前後が筋肉の痛み（筋痛、痙攣）を有する。これらの影響は、非常に頻繁に、処置における中断を引き起こしている。メバロン酸合成の阻害剤の毒性影響を軽減し得る化合物を特定することは、臨床的重要性を有し得る目標である。このことを念頭において、スクリーニングが、メバロン酸合成の阻害剤（例えば、ＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼの阻害剤など）により処理される本発明の方法によって作製された細胞を使用することによって行われる。スクリーニング条件が前記のようにもたらされ、細胞が、ＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼの阻害剤により、すなわち、シンバスタチンまたはこの薬物クラスの分子のすべてにより処理される。化合物は、シンバスタチンの毒性影響を軽減するそれらの能力に従って選別される。この取り組みを使用することによって、約１０個の化合物を、１，２００超の化合物からなるバンクにおいて選択することができた。これらは、このクラスの治療分子の毒性影響を軽減させるための潜在的な候補である。
一方で、ＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼの阻害剤が、タンパク質、アトロギン（ａｔｒｏｇｉｎ）、すなわち、筋萎縮の様々な現象に関与するタンパク質の発現を誘導することが示された。筋萎縮が多くの病理（神経筋疾患、ガン、ＨＩＶ、腎不全、加齢または不動化）に関連し、筋萎縮はそれ自体が不良な予後因子である。上記により記載されるスクリーニングはまた、筋萎縮を制限し得る化合物を単離することを可能にする。実際、本発明の方法によって作製される細胞をＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼの阻害剤により処理することにより、抑制された細胞萎縮のモデルを培養ディッシュにおいて再現するという可能性がもたらされる。本発明の方法によって作製される細胞については毒性をＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼの阻害剤の存在下において制限する化合物は、筋萎縮を軽減し、かつ、筋肉減少症を処置するための潜在的な候補である。筋肉減少症は、加齢、神経学的疾患、ウイルス性疾患（例えば、ＡＩＤＳ）または腫瘍疾患に起因する筋肉の喪失である。これは、そのための特異的な治療的解決策が未だ何ら存在しない頻発する疾患である。
本発明の方法によって作製される細胞は、メバロン酸合成の阻害剤の毒性影響を高める化合物のハイ・スループット・スクリーニングを可能にする。
細胞毒性をメバロン酸合成の阻害剤の存在下において高める化合物を予測するという可能性は、組織（例えば、筋肉組織など）のための潜在的毒性薬物の組み合わせを防止すること、または、腫瘍の処置のために有用である細胞毒性効果を有する薬物の組み合わせを明確化することのどちらをも可能にするにちがいない。ヒトの臨床診療においては、ＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼの阻害剤の毒性が、ある種の薬物組み合わせによって悪化し得ることが頻繁に認められている。一方で、各種スタチンが、ある種の形態の腫瘍（消化器腫瘍、乳腫瘍またはリンパ腫）の処置におけるそれらの細胞毒性のために、また、予防剤としてのそれらの可能な使用（結腸ガンまたは前立腺ガン）のためにこの数年前から使用されている。大多数の場合において、この後者の適応では、スタチンが他の抗腫瘍分子との併用で使用される。
このことを念頭において、スクリーニングが、メバロン酸合成の阻害剤（例えば、ＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼの阻害剤など）により処理される本発明の方法によって作製された細胞を使用することによって行われる。スクリーニングの条件が前記のようにもたらされ、細胞が、ＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼの阻害剤により、すなわち、シンバスタチンにより処理される。化合物は、シンバスタチンの毒性影響を高めるそれらの能力に従って選別される。この取り組みを使用することによって、約１５個の化合物を、１，２００超の化合物からなるバンクにおいて選択することができた。これらは、このクラスの治療分子の毒性影響を増大させるための潜在的な候補である。これらの化合物の中で、それらのいくつかは、その細胞毒性について既に知られている薬剤であり、いくつかが、抗腫瘍剤としてヒトの臨床診療において使用される細胞毒性剤である。一方で、科学的データおよび臨床データは、従来の抗腫瘍処置において認められる耐性現象に一方において関わる腫瘍幹細胞が存在することを示している。これらの腫瘍「幹細胞」は、「上皮」組織から「中胚葉系」組織への移行の結果である。腫瘍上皮細胞が中胚葉に向かって移行することにより、これらの細胞には、成長での利点、および、腫瘍を形成するためのより大きい能力が与えられる。腫瘍「幹細胞」は、多能性細胞に由来する分化した「ＭＳＣ」細胞と共通する特徴をいくつか有する。実際、「ＭＳＣ」細胞は、中胚葉系組織に向かって発達するための上皮として組織化される多能性細胞に由来する。分化期間中に、「ＭＳＣ」細胞は上皮タイプから中胚葉タイプへの移行を受ける。さらに、「ＭＳＣ」細胞は、腫瘍「幹」細胞によってもまた発現されるマーカーＣＤ４４を高いレベルで発現する。これらの議論により、多能性細胞に由来する「ＭＳＣ」細胞はインビトロにおける「腫瘍幹」細胞のモデルを表すと考えることが可能である。その場合、記載されたスクリーニングは、腫瘍「幹」細胞に対抗する特異的活性を有する化合物を単離することを可能にする。スタチンの毒性を特異的に高める分子を選び出すスクリーニングにより、その抗腫瘍能を増大させるために、また、「腫瘍幹」細胞を標的とするためにスタチンと連携されなければならない分子を明確にするための合理的な戦略を確立することが可能である。
本発明の方法によって作製される細胞を、メバロン酸の存在下または非存在下、メバロン酸合成の阻害剤の存在下または非存在下で使用することにより、下記のための化合物のハイ・スループット・スクリーニングが可能になる：
・メバロン酸の合成を阻害すること
・ＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼの阻害剤の二次的影響を弱めること
・筋肉毒性影響を有する薬物相互作用を防止すること
・筋萎縮を軽減すること
・ＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼを阻害し、薬物の併用をそれらの抗腫瘍活性のために、具体的には腫瘍「幹」細胞に対して明確化する細胞毒性影響を可能にすること。
上記により選び出された化合物の治療適用は非常に広い（例えば、高コレステロール血症、様々な筋萎縮、同様にまた、腫瘍疾患）。
実施例１ アスコルビン酸と組み合わされたＦＧＦ２は、多能性間質細胞（ＭＳＣ）の特徴を有するヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）に由来する分化したＭＳＣ細胞またはＭＳＣタイプの細胞を作製するための技術のロバストネスおよび効率を改善する。
序論
多能性間質細胞、すなわち、ＭＳＣが、約１０年前に他と区別されている。ＩＳＣＴ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ、国際細胞治療学会）はこれらの細胞をいくつかのタイプの基準（下記）に基づいて定義する：
・機能的基準：培養および基質（例えば、培養プラスチックなど）における成長
・同一性基準：ＣＤ４５およびＣＤ３４の発現がないこと、ならびに、ＣＤ７３、ＣＤ２９およびＣＤ４４の発現
・骨形成性の軟骨細胞系譜および脂肪系譜における分化能。
最初の段階では、ＭＳＣ細胞が骨髄から単離された。続いて、これらの細胞が、多くの組織（例えば、脂肪組織、末梢血、肝臓、肺、筋肉、胎盤、羊水または臍帯血など）から部分精製された。ＭＳＣが、組織修復（骨修復を含む）、免疫調節、血管形成応答の制御、および、腫瘍の様々な現象に関与する。
これらの特徴は、ＭＳＣを、筋骨格領域における毒物学研究のための、また、新しい治療経路を種々の分野（整形外科、血管疾患、炎症性疾患、ガンおよび遺伝子移入）において発見するための不可欠な細胞ツールにする。
しかしながら、ヒト組織からの幹細胞の単離および作製には、下記のような多くの制限がある：
・ヒト組織サンプルの入手性
・組織のそれぞれのために適合化されなければならない単離条件および作製条件
・限定された成長能
・表現型の不安定性
・個体間の変動性
ヒト多能性幹細胞の存在は、正常なヒト細胞を何ら制限なく入手するという可能性をもたらす。２つのタイプの多能性細胞、すなわち、胚性幹細胞（ｈＥＳ）および誘導幹細胞（ｉＰＳ）が存在する。多能性細胞が持つ本質的特徴は、制限を何ら伴わない自己再生の能力、および、全生物体を構成するすべての細胞タイプへの分化の可能性である。
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）を使用することの、Ｊ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎの研究（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ他、１９９８）以後の可能性により、非常に多くの可能性が広がっており、この場合、それらのいくつかが臨床的意味合いを有し得る。制限を何ら伴わない自己再生の能力、および、成体生物を構成するすべての細胞タイプへの分化の能力である両方の本質的特徴は、これらの細胞を極めて有用なツールにしている。実験的には、ヒト胚性幹細胞は、多くのタイプの細胞（心臓細胞、平滑筋細胞、神経細胞、ケラチノサイト、造血細胞、インスリン産生細胞）の分化手法および単離の開発を可能にしている。
Ａ）ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）に由来するＭＳＣに共通する特徴を有するＭＳＣタイプの細胞を単離および作製するための手順の説明。
細胞が未分化のｈＥＳ細胞から作製される。
作製条件は下記の通りである。それらの形態学的特徴によって特定され得る未分化細胞の塊が、これらの細胞を作製するための細胞材料の根幹である。
１）ｈＥＳ細胞の形態学によって認識される塊の機械的移植
ａ．ｈＥＳ細胞ディッシュをＥＢ培地（表１を参照のこと）に変える；
ｂ．ニードルで筋をつけ、その後、凝集物を剥がす。２９Ｇのニードルが１ｍＬのシリンジに取り付けられる。形態学的分化の兆候を何ら有しないコロニーを選択する。数１０個のコロニーがそれにより単離される。これらのコロニーは、それらの生存性を評価するためにトリパンブルーの存在下で計数される；
ｃ．ペレットを押しつぶすことなく、ペレットを１５ｍＬのチューブにおいて形成するために、９００ｒｐｍで１分間遠心分離する；
ｄ．ペレットを１ｍＬのＥＢ培地に取り出す。細胞凝集物を部分的に解離させるために吸い上げ、排出する。凝集物のサイズは数１０個の細胞の程度でなければならない；
ｅ．トリパンブルー計数：凝集物の数および生存性を求める。
２）ＭＳＣ細胞の選抜および増殖：
ｆ．特定の数の凝集物（数十個の凝集物）が、ＥＢ培地において、ゼラチン処理の培養ディッシュに播種される。５０個〜２００個の凝集物が１つの２５ｃｍ２フラスコにつき播種される；
ｇ．最初の交換が４８時間後に行われ、その後、２日〜３日毎に行われる。２つの培養条件が試験される。第１の条件のもとでは、増殖因子の供給源がウシ胎児血清に限定される（ＥＢ培地）。第２の条件については、ＦＧＦ２（１０ｎｇ／ｍｌ）および１ｍｍのアスコルビン酸２−リン酸がウシ胎児血清に加えられる。この培地はＥＢＭＯＤと呼ばれる。
ｈ．４日〜５日の後、細胞が凝集物から現れ、基質に結合し、分裂を開始する。
ｉ．１０日目〜１５日目の間で、細胞が、ＥＤＴＡと組み合わされるトリプシンの溶液を使用することによって移植される。
ｊ．遠心分離による培養培地での洗浄および計数の後、細胞が、１ｃｍ２あたり２，０００個の細胞から１０，０００個の細胞に及ぶ密度でゼラチン処理の支持体に播種される。
ｋ．最初の移植が５日目〜１０日目の間で行われる。
この手順の範囲内において、本発明者らは、ＥＢと呼ばれた培地と、ＦＧＦ２が１０μｇ／ｍｌの濃度で加えられ、かつ、アスコルビン酸２−リン酸（ＡＡ２Ｐ）が１ｍＭの濃度で加えられた培地ＥＢＭｏｄとの２つの培養培地を比較した。ＥＢ培地の組成が表１に示される。
Figure 2013534823
 本研究のために、ｈＥＳ胚性幹細胞のＷＴ４（ＫＣＬ−００２），ＸＹを使用した。このｈＥＳ細胞株は、Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｍｉｎｇｅｒ（Ｗｏｌｆｓｏｎ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ａｇｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｋｉｎｇ’ｓ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｌｏｎｄｏｎ）によって単離された。この細胞株は、ＵＫ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ（ＵＫ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ）に由来する。類似する結果が、ＳＡ０１胚性幹細胞を用いて得られる。この手順はまた、病理学的モデルを表す変異を有する胚性幹細胞に対して適用可能である。
Ｂ）ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）に由来する多能性間質細胞（ＭＳＣ）の特徴をともに有するＭＳＣタイプの分化した細胞の作製。
培地の２つの条件を、前記で記載される手順に従って得られる細胞の作製および特徴づけに関して分析した。この場合、ＭＳＣタイプの分化した細胞はＷＴ４ヒト胚性幹細胞に由来した。結果が２つの下記の表に示される。
Figure 2013534823
Figure 2013534823
 両方の培地条件のもとでは、両方の培養条件のもとで増えることができる接着性細胞を得ることが可能である。ＦＧＦおよびアスコルビン酸２−リン酸の非存在下においては、単離された細胞の数がはるかにより少ない。これらの細胞は、数回の細胞分裂の後、老化し、これらの条件のもとで効率的に増幅することができない。得られた細胞の量は、ＦＧＦおよびアスコルビン酸２−リン酸を含有する培地の存在下では実質的により多くなっている。後者の条件のもとでは、細胞数が、対数での倍数で数単位、増大し得る。この変更の導入はまた、ＭＳＣタイプの細胞のための作製時間の短縮化を可能にする。これらの条件のもとにおいて、ヒト胚性幹細胞に由来する約１００個の凝集物から、著しい複製能（約３０回を超える細胞分裂）を有する１０８個の細胞を２３日以内の培養で作製することが可能である。これらの変更は、老化段階に入るこれらの細胞の能力を変化させておらず、このことは、上記により作製された細胞の形質転換されていない性質を示していることに留意しなければならない。これらの条件のもとでは、ＭＳＣ細胞を、すべてのヒトの正常な胚性幹細胞を用いて作製すること、または、変異を有するＭＳＣ細胞を作製することが可能であることに留意しなければならない。この方法は、スタイネルト病に罹患した胚からの胚性幹細胞について首尾よく適用された。これらの条件は、ヒト胚性幹細胞に由来するＭＳＣタイプの分化した細胞を作製するための方法のロバストネスを増大させるという可能性をもたらす。
Ｃ）ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）に由来するＭＳＣタイプの分化した細胞のフローサイトメトリーによる特徴づけ。
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）から本作製方法によって作製される分化した細胞の特徴づけをフローサイトメトリーによって行った。この一般的な技術は、細胞の表面に存在する分子の定性的および定量的な分析を、特異的な抗体を使用することによって可能にする。この工程のために、全能性状態に関連する膜マーカーに対する抗体、および、ＭＳＣ細胞のマーカーに対する抗体を使用した。上記により作製された細胞は、全能性状態に関連する抗原ＴＲＡ１−６０をその表面に発現しない。類似する結果が、全能性の他のマーカー（例えば、ＳＳＥＡ３およびＴＲＡ１−８０など）に対する抗体に関して得られる。したがって、これらは、胚性幹細胞のその特異的な多能性を失っている細胞である。一方で、これらの細胞は、ＭＳＣ細胞に関連するマーカー（例えば、ＣＤ７３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１６６およびＣＤ１０５など）を発現する。得られた結果が表４に示される。
Figure 2013534823
 本作製方法によって作製される細胞は、ＣＤ７３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１６６およびＣＤ１０５のマーカーについて９５％超にまで均質である。これらの結果はＦＧＦ２およびＡＡ２Ｐの存在によって変化しない。上記により作製された細胞は、それらの表面マーカーについてＭＳＣ細胞の主要な特徴を有する。
Ｄ）培養培地におけるＦＧＦ２およびアスコルビン酸２−リン酸の組み合わされた存在は、本発明の方法によって作製される細胞における成長能およびＳＳＥＡ４の発現を増大させる。
本発明の方法に従う単離された細胞の成長能に対するＦＧＦ２およびアスコルビン酸２−リン酸の役割を、ヒト胚性幹細胞ＳＡ０１に由来する細胞に関して分析した。細胞が、２０％ウシ胎児血清の存在下（コントロール条件）、ならびに、ＦＧＦ２およびアスコルビン酸２−リン酸（ＡＡ２Ｐ）の存在下または非存在下で培養される。老化に入る前に得られた細胞の最大数を表す結果が下記の表５に示される。
Figure 2013534823
 ＦＧＦ２およびＡＡ２Ｐの組み合わされた存在は、蓄積した最大細胞量を対数での倍数で約１２ほど増大させるという可能性をもたらす。ＦＧＦ２およびアスコルビン酸は個々には、細胞量の増大に対する影響ははるかにより小さく、ＦＧＦ２については対数での倍数で５を少し下回っており、アスコルビン酸２−リン酸については対数での倍数で６を少し下回っている。ＦＧＦ２およびアスコルビン酸の影響は、蓄積した細胞の最大細胞量に対して明らかに相乗的である。
ＳＳＥＡ４（膜マーカー）が、多能性細胞、および、異なる組織（例えば、骨髄、脂肪組織または神経組織など）から得られるある数の前駆体細胞において発現される。
これらの異なる条件のもとで培養される細胞におけるＳＳＥＡ４の存在を、ＳＳＥＡ４に対する特異的な抗体を使用することによってフローサイトメトリーにより分析した。結果が下記の表６に示される。
Figure 2013534823
 ＦＧＦ２およびアスコルビン酸２−リン酸のどちらも、ＳＳＥＡ４の発現を著しく増大させない。一方で、両方の分子の組み合わせはＳＳＥＡ４の量を３．７倍増大させる。この蛍光レベルは、ヒト多能性細胞に関して認められる蛍光レベルに匹敵する。ＦＧＦ２およびアスコルビン酸２−リン酸の組み合わされた存在は、蓄積した細胞の最大数およびＳＳＥＡ４の発現レベルを複合様式で増大させた。
Ｅ）本発明の方法に従って作製されるＭＳＣタイプの細胞は正常な核型を有する。
「ＭＳＣ」細胞の核型が中期での染色体に関して分析され、その核型は、ＦＧＦ２およびＡＡ２Ｐの存在下および非存在下において、何ら検出される異常を伴わないことが判明した。
Ｆ）本発明の方法に従って作製されるＭＳＣタイプの細胞は骨形成能を有する。
骨形成性の培地においては、本発明の方法に従って作製されるＭＳＣタイプの細胞は骨組織の機能を発現することができる。デキサメタゾン、Ｂ−グリセロリン酸を含む培地における１４日間の培養の後、本発明の方法に従って作製されるＭＳＣタイプの細胞はアルカリホスファターゼを発現し、石灰化結節を形成する。石灰化結節が特異的な組織化学的技術（フォン・コッサ染色）によって明らかにされる。
Ｇ）ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）に由来するＭＳＣタイプの分化した細胞を凍結すること。
上記により作製された細胞は、細胞を凍結することによって保存することができる。凍結用培地は下記の通りである：９０％の血清および１０％のＤＭＳＯ。ＦＧＦ２およびＡＡ２Ｐの存在下における培地で作製された細胞の凍結を、７代目の継代培養で、かつ、１０６個／ｍｌの濃度で実施した。
両方の条件のもとで作製されるＭＳＣ細胞は凍結によって非常に効率的に保存される。凍結はＭＳＣ細胞の成長特徴を変化させない。これらの凍結技術は、非常に多数の細胞を、それらの生物学的特徴を変化させることなく貯蔵するという可能性をもたらす。
Ｈ）結論
ｈＥＳ細胞に由来する分化したＭＳＣ細胞を増幅するための培地におけるＦＧＦ２およびアスコルビン酸２−リン酸の存在は下記の可能性をもたらす：
・分化した細胞を胚性幹細胞から作製するための技術のロバストネスを増大させること
・これらの細胞の作製を促進させること
・作製された細胞の最大数を増大させること
・増殖能を増大させること
・正常な核型を有する細胞を得ること
・ＳＳＥＡ４を全能性細胞および前駆体細胞のマーカーとして特異的に発現すること。
ＦＧＦ２およびアスコルビン酸２−リン酸の存在下における培地で作製される細胞は、ＭＳＣ細胞に関連する下記のような特徴を有する：
・基質への接着
・大きいが、有限の成長能
・何ら検出可能な異常を伴わない核型
・凍結による保存
・ＣＤ７３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１６６、ＣＤ１０５のマーカーについての発現の均質性
・骨形成能
実施例２．アスコルビン酸と連携させられるＦＧＦ２は、ＭＳＣ細胞の特徴を有するヒト多能性細胞（ｉＰＳ）に由来するＭＳＣタイプの分化した細胞を作製するための技術のロバストネスおよび効率を改善する。
Ａ）ＭＳＣの特徴と共通する特徴を有する細胞を誘導多能性ヒト細胞（ＩＰＳ）から単離および作製するための手順の説明。
ｉＰＳ４６０３Ｃｌ５およびｉＰＳ４６０３ＰＣｌＡのｉＰＳ細胞を、下記の遺伝子を導入する山中の手法を使用することによってヒト初代線維芽細胞から作製した：Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃＭｙｃおよびＫｌｆ４。遺伝子移入を、モロニータイプのレトロウイルスを用いて行った。ウイルス形質導入を、これら４つの遺伝子のそれぞれを有する４つのウイルスによる同時感染によって行った。バルプロ酸による処理は初期化の効率における増大を可能にした。形質導入後、細胞を、ヒト多能性細胞の出現を促進させるカルシウム培地において、マウス胚性線維芽細胞からなる栄養組織の存在下で培養する。多能性ヒト細胞を成長させるための特異的培地の必須構成成分はＦＧＦ２である。培地を２４時間毎に変える。２週間〜３週間の後、多能性細胞の特徴を有する最初のコロニーが視認される。その後、これらのコロニーを単離し、装置によって移植する。その後、２つの集団が形成される：モノクローナルな集団（ｉＰＳ ｉＰＳ４６０３Ｃｌ５）およびポリクローナルな集団（ｉＰＳ４６０３ＰＣｌＡ）。上記により単離された細胞は下記の特徴を有する：
・初期化のために使用された形質導入外因性遺伝子の消滅
・全能性マーカー（ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ１−６０）の発現
・正常な核型
・多能性状態をＦＧＦ２の存在下での培地において維持しながらの成長能
・胚の本体（外胚葉、内胚葉、中胚葉）を形成した後での分化能。
これらの細胞は誘導多能性細胞（ｉＰＳ細胞）の特徴を有する。したがって、これらの細胞を、ＭＳＣタイプの細胞を作製するために使用した。
作製条件は下記の通りである。それらの形態学的特徴によって特定され得る未分化細胞の塊が、これらの細胞を作製するための細胞材料の根幹である。
１）ｈＥＳ細胞の形態学によって認識される塊の機械的移植
ｌ．ｉＰＳ細胞ディッシュをＥＢ培地（表１を参照のこと）に変える；
ｍ．ニードルで筋をつけ、その後、凝集物を剥がす。２９Ｇのニードルが１ｍＬのシリンジに取り付けられる。形態学的分化の兆候を何ら有しないコロニーを選択する。数１０個のコロニーをそれにより単離する。これらのコロニーは、それらの生存性を評価するためにトリパンブルーの存在下で計数される。
ｃ．ペレットを押しつぶすことなく、ペレットを１５ｍＬのチューブにおいて形成するために、９００ｒｐｍで１分間遠心分離する；
ｏ．ペレットを１ｍＬのＥＢ培地に取り出す。細胞の凝集物を部分的に解離させるために吸い上げ、排出する。凝集物のサイズは数１０個の細胞の程度でなければならない。
ｐ．トリパンブルー計数：凝集物の数および生存性を求める。
２）ＭＳＣタイプの細胞の選抜および増殖
ｑ．特定の数の凝集物（数十個の凝集物）が、ＥＢ培地において、ゼラチン処理の培養ディッシュに播種される。５０個〜２００個の凝集物が１つの２５ｃｍ２フラスコにつき播種される。
ｒ．最初の交換が４８時間後に行われ、その後、２日〜３日毎に行われる。２つの培養条件が試験される。第１の条件のもとでは、増殖因子の供給源がウシ胎児血清に限定される（ＥＢ培地）。第２の条件については、ＦＧＦ２（１０ｎｇ／ｍｌ）および１ｍＭのアスコルビン酸２−リン酸がウシ胎児血清に加えられる。この培地はＥＢＭＯＤと呼ばれる。
ｓ．４日〜５日の後、細胞が凝集物から現れ、基質に結合し、分裂を開始する。
ｔ．１０日目〜１５日目の間で、細胞が、ＥＤＴＡと組み合わされるトリプシンの溶液を使用することによって移植される。
ｕ．遠心分離による培養培地での洗浄および計数の後、細胞が、１ｃｍ２あたり２，０００個の細胞から１０，０００個の細胞に及ぶ密度でゼラチン処理の支持体に播種される。
ｖ．最初の移植が５日目〜１０日目の間で行われる。
この手順の範囲内において、本発明者らは、ＥＢと呼ばれた培地と、ＦＧＦ２が１０μｇ／ｍｌの濃度で加えられ、かつ、アスコルビン酸２−リン酸が１ｍＭの濃度で加えられた培地ＥＢＭｏｄとの２つの培養培地を比較する。ＥＢ培地の組成が表１に示される。
Figure 2013534823
 Ｂ）多能性間質細胞（ＭＳＣ）の特徴を示す分化した細胞の、誘導多能性ヒト細胞（ｉＰＳ）からの作製。
両方の培地条件を、実施例１で記載される手順と同一である手順に従うことによって得られる細胞の作製および特徴づけに関して分析した。
１０日目以降において、認められる細胞の数は、ＦＧＦおよびアスコルビン酸２−リン酸の存在下での培地の方が大きい。この傾向が培養期間中において確認される。得られた結果が下記の表に示される。
Figure 2013534823
Figure 2013534823
 両方の培地条件のもとでは、両方の培養条件のもとで増えることができる接着性細胞を得ることが可能である。しかしながら、得られた細胞の量は、ＦＧＦおよびアスコルビン酸２−リン酸を含有する培地の存在下での方が多いことに留意しなければならない。後者の条件のもとでは、細胞数が、対数での倍数で数単位、増大し得る。この変更の導入はまた、ＭＳＣタイプの細胞を作製するための時間の短縮化を可能にする。後者の条件のもとにおいて、ヒト胚性幹細胞に由来する約１００個の凝集物から、著しい複製能（約３０回を超える細胞分裂）を有する１０８個の細胞を２２日以内の培養で作製することが可能である。
ＦＧＦ２およびアスコルビン酸２−リン酸の非存在下では、単離された細胞の数がはるかにより少ない。３週間の培養の後では、得られた細胞の数は１／２０である。５０日間の培養の後では、差が１０５である。約２０回の細胞分裂の後において、これらの条件のもとで作製された細胞は老化する。
ｉＰＳ細胞のクローンを用いて得られるこれらの結果は、ｉＰＳ細胞のポリクローナル集団と確認される。ポリクローナル集団を持ち手得られる結果は類似している。
Ｃ）誘導多能性ヒト細胞（ＩＰＳ）に由来するＭＳＣタイプの細胞の特徴をともに有する分化した細胞を凍結すること。
上記により作製された細胞は凍結によって保存することができる。凍結用培地は下記の通りである：９０％の血清および１０％のＤＭＳＯ。ＥＢＭｏｄ培地で作製された細胞の凍結を、７代目の継代培養で、かつ、１０６個／ｍｌの濃度で実施した。生存性がトリパンブルーによる排除試験によって測定される。
両方の条件のもとで作製されたＭＳＣ細胞は凍結によって非常に効率的に保存される。凍結はＭＳＣ細胞の成長特徴を変化させない。これらの凍結技術は、非常に多数の細胞を、それらの生物学的特徴を変化させることなく貯蔵するという可能性をもたらす。
Ｄ）本発明の方法に従って作製されるＭＳＣ細胞は正常な核型を有する。
ＭＳＣ細胞の核型が中期での染色体に関して分析され、その核型は、ＦＧＦ２およびＡＡ２Ｐの存在下および非存在下において、何ら検出される異常を伴わないことが判明した。
Ｅ）誘導多能性ヒト細胞（ｉＰＳ）から得られる多能性間質細胞「ＭＳＣ」の特徴をともに有する分化した細胞のフローサイトメトリーによる特徴づけ。
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）から本作製方法によって作製される分化した細胞の特徴づけをフローサイトメトリーによって行った。この最新の技術は、細胞の表面に存在する分子の定性的および定量的な分析を、特異的な抗体を使用することによって可能にする。この工程のために、全能性状態に関連する膜のマーカーに対する抗体、および、ＭＳＣ細胞のマーカーに対する抗体を使用した。上記により作製された細胞は、全能性状態に関連する抗原ＴＲＡ１−６０をその表面に発現しない。その他の全能性マーカー（ＳＳＥＡ３およびＴＲＡ１−８０など）は類似する結果を与える。したがって、これらは、胚性幹細胞のその特異的な多能性を失っている細胞である。一方で、これらの細胞は、ＭＳＣ細胞に関連するマーカー（例えば、ＣＤ７３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１６６およびＣＤ１０５など）を発現する。
得られた結果が表１０に示される。
Figure 2013534823
 本作製方法によって作製された細胞は、ＣＤ７３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１６６およびＣＤ１０５のマーカーについて９３％超にまで均質である。上記により作製された細胞は、それらの表面マーカーについてＭＳＣ細胞の主要な特徴を有する。
同一の結果が、ポリクローナルなｉＰＳ細胞の集団に関して得られる。上記により記載された手順は、Ｔｈｏｍｐｓｏｎによって記載される技術により得られるｉＰＳ細胞を使用することによって、類似する結果を伴うが、分化したＭＳＣ細胞を得るという可能性をもたらす。したがって、記載される方法の効率は初期化技術に依存しない。
Ｆ）培養培地におけるＦＧＦ２およびアスコルビン酸２−リン酸の組み合わされた存在は、本発明の方法によって作製される細胞による成長能およびＳＳＥＡ４の発現を増大させる。
ＳＳＥＡ４（膜マーカー）が、多能性細胞、および、異なる組織（例えば、骨髄、脂肪組織または神経組織など）から得られるある数の前駆体細胞において発現される。
これらの異なる条件のもとで培養される細胞におけるＳＳＥＡ４の存在を、ＳＳＥＡ４に対する特異的な抗体を使用することによってフローサイトメトリーにより分析した。ヒト線維芽細胞から誘導された多能性細胞に由来する細胞（ｉＰＳ ｉＰＳ４６０３Ｃｌ５）を用いて得られた結果が下記の表に示される：
Figure 2013534823
 ＦＧＦ２およびアスコルビン酸２−リン酸の組み合わせの存在は、ＳＳＥＡ４を発現する細胞の数、および、平均蛍光強度を増大させる。
ＦＧＦ２およびアスコルビン酸２−リン酸の組み合わされた存在は、蓄積した細胞の最大数およびＳＳＥＡ４の発現レベルを一緒に増大させる。
Ｇ）本発明の方法に従って作製されるＭＳＣタイプの細胞は骨形成能を有する。
骨形成性の培地においては、本発明の方法に従って作製されるＭＳＣタイプの細胞は骨組織の機能を発現することができる。デキサメタゾン、Ｂ−グリセロリン酸を含む培地における１４日間の培養の後、本発明の方法に従って作製されるＭＳＣタイプの細胞はアルカリホスファターゼを発現し、石灰化結節を形成する。石灰化結節が特異的な組織化学的技術（フォン・コッサ染色）によって明らかにされる。
Ｈ）結論
細胞を増幅するための培地におけるＦＧＦ２およびアスコルビン酸２−リン酸の存在は下記の可能性をもたらす：
・分化した細胞を誘導多能性細胞（ｉＰＳ）から作製するための技術のロバストネスを増大させること
・これらの細胞の作製を促進させること
・作製された細胞の数を増大させること
・増殖能を、それらの老化能を変化させることなく増大させること
・正常な核型を有する細胞を得ること
・ＳＳＥＡ４（全能性細胞および前駆体細胞のマーカー）の特異的な発現。
ＦＧＦ２およびアスコルビン酸２−リン酸の存在下における培地で作製される細胞は、ＭＳＣ細胞に関連する下記のような特徴を有する：
・基質への接着
・大きいが、有限の成長能
・凍結による保存
・ＣＤ７３、ＣＤ２９、ＣＤ４４およびＣＤ１６６のマーカーについての発現の均質性
・骨形成能
実施例３：ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）に由来するＭＳＣタイプの分化した細胞、すなわち、ハイ・スループット・スクリーニング技術のための筋肉組織の予測可能な毒性学のためのツール。
Ａ）ヒト筋肉前駆体細胞（ＭＰＣ）：予測可能な毒性学のためのツール。
ヒト筋肉前駆体細胞（ＭＰＣ）は筋肉毒性の良好な指標物である。実際、ＭＰＣの細胞成長が成長培地におけるスタチンの存在によって阻害される。この阻害は用量依存的である。メバロン酸の存在はこの阻害を完全に生じさせることができる。したがって、この阻害が、ＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼの阻害を介して、すなわち、メバロン酸（コレステロールの合成における前駆体）の産生に関わる酵素の阻害を介して達成される。この細胞試験システムにより、ヒトの臨床診療において使用されている各種スタチンの毒性が試験されている。得られた結果が特許において示される：ＰＣＴ国際公開第２００４／００５５１７４号における培養組成物、培養方法およびそれらの使用。
１μＭの濃度において、上記スタチンのすべてが筋肉細胞については毒性を有する。この毒性はまた、スタチンのタイプに依存する。セリビスタチン（ｃｅｒｉｖｉｓｔａｔｉｎ）が、試験された濃度のすべてにおいてより大きい毒性を有する。これらの結果は、その著しい筋肉毒性のために市場から撤退されたセリビスタチンの著しい毒性を示している臨床観察結果との良好な相間関係にある。したがって、ＭＰＣを使用するこの細胞試験（バイオアッセイ）は、筋肉の毒性学のための予測可能な価値を有する。しかしながら、ＭＰＣ細胞の生物学的特徴に関連づけられる、このタイプのバイオアッセイに対する固有的な制限が存在する。ＭＰＣ細胞は、バッチ毎の変動、限定的な複製能、および、継代培養期間中の表現型の不安定性を有する、筋肉組織から単離されたヒト初代細胞である。
Ｂ）予測可能な毒性学のためのツールとしての、ヒト胚性幹細胞に由来するＭＳＣタイプの分化した細胞。
したがって、目標が、ＭＰＣ細胞を、再現性のある方法で大量に作製することができ、かつ、ＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼの阻害剤に対する感受性を有する細胞により置き換えることである。多能性ヒト細胞（ｈＥＳおよびｉＰＳ）に由来するＭＳＣタイプの分化した細胞を、数に関して何ら制限されることなく作製することができる（実施例１を参照のこと）。表２は、これらの細胞が、ＭＰＣ細胞に関して認められる対スタチン感受性に近い対スタチン感受性を有することを示している。「ＭＳＣ」ＳＡＭＵ４３と称される、ｈＥＳ細胞（ＳＡ０１）に由来するＭＳＣタイプの分化した細胞が、メバロン酸の存在下および非存在下、Ｍｅｖｏｌｉｎ（ロボスタチン（Ｌｏｖｏｓｔａｔｉｎ））およびＳｉｍｖａｓｔａｔｉｎ（シンバスタチン）の増大する用量とともに培養される。７日間の培養の後、細胞が固定され、染色され、その後、画像分析によって計数される。得られた結果が下記の表に示される：
Figure 2013534823
 「ＭＳＣ」ＳＡＭＵ４３細胞は用量依存的様式でスタチンに対して感受性である。ＭＰＣの場合と同様に、メバロン酸の存在により、スタチンの毒性が防止される。したがって、認められた毒性は、メバロン酸（コレステロールの前駆体）の合成の阻害に起因する。したがって、胚性幹細胞に由来するＭＳＣタイプの分化した細胞を、メバロン酸合成の阻害剤の細胞毒性を評価するために使用することが可能である。したがって、胚性幹細胞に由来するＭＳＣタイプのこれらの分化した細胞は、このタイプの細胞試験のための無限の供給源である。
Ｃ）胚性幹細胞に由来するＭＳＣタイプの分化した細胞：スクリーニングのためのツール。
ハイ・スループット・スクリーニング技術の開発では、細胞を、生物学的機能を変化させることなくマルチウエルにおいて培養し、かつ、自動化可能な読み取りシステムを有するという可能性が要求される。ＡＴＰ量決定（ｄｏｓａｇｅ）により、細胞数を自動測定することが可能であるにちがいない。
この試験では、光放射が細胞のＡＴＰの量に比例している。下記の実験では、ＡＴＰの量と、細胞数との関係を確認することができた。増大する細胞数が、画像分析によるか、または、ＡＴＰの量決定のどちらによってでも分析された。細胞が９６ウエルのマルチウエルにおいて培養された。１０２個の細胞〜１０４個の細胞が画像分析によって、および、ＡＴＰ量の量決定によって分析された。
良好な直線性が、画像分析によって求められる細胞数と、発光による検出ＡＴＰの量との間に存在し、０．９８３１という優れたＲ２を有する。したがって、ＡＴＰ量による細胞数の決定が可能である。この取り組みは、細胞数の自動化された読み取りを可能にする。同様の結果が、ミトコンドリア活性の追跡を使用することによって得られる。ｈＥＳ細胞に由来するＭＳＣタイプの分化した細胞（「ＭＳＣ」ＷＴ）を、Ｂｒａｖｏタイプの分配ロボットを使用することによって、ウエルあたり２，０００個の細胞の濃度で、事前にゼラチン処理された３８４マルチウエルに播種した。細胞の量を、２０％のウシ胎児血清を含有する培養培地においてシンバスタチンの存在下または非存在下での７２時間の培養の後、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏｗによって評価した。得られた結果が表４に示される。
Figure 2013534823
 シンバスタチンは２μＭで分化細胞に対して毒性であり、「ＤＭＳＯ／スタチン」比が２を超える。変動係数は非常に大きくなく、２．９〜１５．９の間である。
毒性はシンバスタチンに限定されるのではなく、２つの他のスタチンに関してもまた認められる。これらの場合のすべてにおいて、この毒性がメバロン酸によってなくなる。このことは、この阻害が、ＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼ（メバロン酸の合成に関わる酵素）を阻害するように達成されることを示している。この実験については、ｈＥＳ細胞（ＳＡ０１）に由来する分化した「ＭＳＣ」ＳＡ０１細胞が、分配ロボットを使用することによって３８４ウエルプレートで試験され、細胞生存性が、７２時間の培養の後、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏｗによって測定された。得られた結果が表５に示され、何ら処理を伴わない得られた結果の百分率として表される。
Figure 2013534823
 これら３つの試験されたスタチンはこれらの細胞に対して毒性を有しており、また、これらの場合のすべてにおいて、メバロン酸の存在により、この毒性がなくなる。フルバスタチンは毒性がシンバスタチンよりも大きいこと、および、後者は毒性がロボスタチンよりも大きいことにもまた留意しなければならない。これらの結果は、ＭＰＣを用いて得られた結果と非常に類似している。
ｈＥＳ細胞に由来する「ＭＳＣ」細胞を実験的に立証するために、本発明者らは小分子のバンク（Ｐｒｅｓｔｗｉｃｋバンク）をスクリーニングした。このバンクは、ヒトの臨床診療において使用される製造物の大多数を表す１，２００超の分子からなる。物質が２．５μＭの濃度で使用される。細胞が、２ｍＭの濃度でのメバロン酸の存在下または非存在下、事前にゼラチン処理された９６ウエルまたは３８４ウエルのマルチプレートに播種される。２４時間後、バンクの化合物がＶｅｌｏｃｉｔｙタイプのロボットによって分配される。ウエルあたりのＡＴＰの量が、バンクからの化合物を加えた７２時間後、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏｗから求められる。スクリーニング基準が下記の通りであった：
・メバロン酸の非存在下における３５％超の毒性
・メバロン酸の存在下における２０％未満の毒性。
３つの異なるスクリーニング試験が行われた。第１のスクリーニングについては、ＭＳＣ細胞がｈＥＳヒト細胞ＳＡ０１に由来した。試験が、２０％のウシ胎児血清を含有する培養培地の存在下、９６ウエルの２８枚のマルチウエルにおいて行われた。Ｚ因子の平均が０．４７であった。これらの条件のもとでは、試験された１，２００超に関して１１個の分子を単離することができた（これらには、バンクに存在する３つのスタチン（ロボスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン）が含まれる）。
第２のスクリーニングが、ヒト胚性幹細胞の別の系統に由来するＭＳＣ細胞（ＶＵＢ０１系統）を使用することによって行われた。この試験では、細胞が３８４ウエルのマルチプレートに播種された。スクリーニングの条件は前回のスクリーニング条件のようにされた。平均Ｚ’因子が０．５５であった。この様式で選び出された分子の数は１５個であった（これらには、バンクに存在する３つのスタチンが含まれる）。第３のスクリーニングが、第１のスクリーニングの細胞と同じ細胞により３８４ウエルのプレートにおいて行われた。この場合、Ｚ’因子が０．５９であった。この様式で選び出された分子の数は３個であった（これらには、バンクに含有される３つのスタチンが含まれる）。
これら３つの独立したスクリーニングにおける得られた結果が例示され、下記の表にまとめられる。
Figure 2013534823
 本発明者らがそれぞれのスクリーニングにおいて再び見出した分子はもっぱら、バンクに含有される３つのスタチンであった。したがって、ヒト胚性幹細胞に由来する「ＭＳＣ」細胞を使用するこのバイオアッセイの条件は、メバロン酸の合成を阻害する分子を高感度かつロバストな様式でスクリーニングするという可能性をもたらすという結論を引き出すことができる。胚性幹細胞に由来するＭＳＣ細胞はハイ・スループット・スクリーニングのための優れたツールである。これらの性質が、ｈＥＳ細胞に由来するＭＳＣのすべてに関して認められる。
Ｄ）結論
ヒト胚性幹細胞に由来するＭＳＣタイプの分化した細胞は、ＭＰＣ細胞と同じタイプの対スタチン感受性を有しており、かつ、筋肉組織について毒性を有する製造物をスクリーニングするための、また、メバロン酸合成の阻害剤のためのハイスループット技術のために好適である、ロバストで、高感度で、かつ、特異的なツールである。
実施例４：ハイ・スループット・スクリーニング技術のための筋肉組織の予測可能な毒性学のためのツールとしての、ヒト誘導多能性細胞（ｉＰＳ）に由来するＭＳＣタイプの分化した細胞。
胚性幹細胞の本質的特徴（何ら限定されない自己再生、および、生物体全体を構成する細胞タイプのすべてへの分化能の可能性）をともに有する誘導多能性細胞ｉＰＳは、作製することがより容易であり、かつ、規制上の問題をあまり引き起こさない。これらの性質は、これらの細胞およびそれらの誘導体をハイ・スループット・スクリーニング技術のための良好な候補にする。
Ａ）ヒト誘導多能性幹細胞に由来する分化したＭＳＣ細胞：ハイ・スループット・スクリーニングにおける予測可能な毒性学のためのツール。
ハイ・スループット・スクリーニング技術の開発では、細胞を、生物学的機能を変化させることなくマルチウエルにおいて培養し、かつ、自動化可能な読み取りシステムを有するという可能性が要求される。ＡＴＰの量決定により、細胞数を自動測定することができるにちがいない。
この試験では、光放射が細胞のＡＴＰの量に比例している。予備的実験は、ＡＴＰの量と、細胞数との関係を確認するという可能性をもたらした。このタイプの試験では、ＡＴＰの測定された量が細胞の数を表す。
ヒト誘導多能性幹細胞ｉＰＳに由来する分化した「ＭＳＣ」細胞が、３８４ウエルの中にウエルあたり２，０００個の細胞の密度で播種され、２μＭの濃度でのシンバスタチンの存在下および非存在下において７２時間培養された。異なる下記の培養条件が試験された：
・培養培地およびアスコルビン酸２−リン酸
・培養培地および１％のウシ胎児血清
・培養培地および１０％のウシ胎児血清
・培養培地および２０％のウシ胎児血清。
本実験の目標が、試験のロバストネスを調べること、および、この試験を行うための最適な条件を明確化することの両方であった。
数字での結果が下記の表に示される：
Figure 2013534823
 試験された条件のすべてのもとにおいて、シンバスタチンはこれらの細胞に対する大きい毒性影響を有する（６０％を超える）。この毒性は、筋肉前駆体細胞（ＭＰＣ）に関して認められる毒性と非常に類似している。実験条件のすべてのもとにおいて、サイズ効果の統計学的指標であるＺ’因子が、これらの試験がハイ・スループット・スクリーニングのために使用され得ることを示す０．６０を超えていることにもまた留意しなければならない。一方で、このタイプの試験を、動物血清が何ら存在しない合成培地において実施することが可能である。この場合、認められた毒性が６３％であり、Ｚ’因子が０．７６である。この試験のための最適な培養条件が、１％のウシ胎児血清の存在下での培地である。これらの条件のもとにおいて、低下した細胞数が９３％あり、Ｚ’因子が０．７８である。
ｉＰＳ細胞に由来する「ＭＳＣ」細胞を実験的に立証するために、本発明者らは小分子のバンク（Ｐｒｅｓｔｗｉｃｋバンク）をスクリーニングした。このバンクは、ヒトの臨床診療において使用される製造物の大多数を表す１，２００超の分子からなる。物質が２．５μＭの濃度で使用される。手順の概略的例示が付録１に示される。細胞が、２ｍＭの濃度でのメバロン酸の存在下および非存在下、事前にゼラチン処理された９６ウエルまたは３８４ウエルのマルチプレートに播種される。２４時間後、バンクの化合物がＶｅｌｏｃｉｔｙタイプのロボットによって分配される。ウエルあたりのＡＴＰの量が、バンクの化合物を加えた７２時間後、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏｗ試験によって求められる。スクリーニング基準が下記の通りであった：
・メバロン酸の非存在下における８０％超の毒性
・メバロン酸の存在下における５０％未満の毒性
スクリーニング試験が、ｉＰＳ細胞に由来する「ＭＳＣ」細胞を使用することによって行われた。２，０００個の細胞が、メバロン酸の存在下および非存在下、３８４ウエルの１６枚のプレートに播種された。２４時間後、細胞はＰｒｅｓｔｗｉｃｋバンクからの分子と接触させられた。測定が７２時間の培養の後で行われた。この試験のＺ’因子は０．７０を超えている。
これらの基準により、本発明者らは、バンクに含有される３つだけのスタチンである３つの分子を特定するだけである。これらのデータは、ｉＰＳ細胞に由来するＭＳＣ細胞をハイ・スループット・スクリーニングのために使用することが可能であることを示す。後者の細胞は、胚性幹細胞に由来するＭＳＣ細胞と非常に類似する機能的特徴を有する。
Ｂ）結論
ヒト誘導多能性細胞に由来する分化したＭＳＣ細胞は、ＭＰＣ細胞と同じタイプの対スタチン感受性を有しており、かつ、筋肉組織について毒性を有する製造物のためのハイ・スループット・スクリーニング技術のために好適な細胞ツールである。タイプの細胞により、ハイ・スループット・スクリーニングのために開発された細胞試験はロバストであり、かつ、高感度である。この試験を合成および定義された培地の条件のもとで行うことが可能であることを付け加えなければならない。
実施例５．ハイ・スループット・スクリーニングおよびメバロン酸の代謝：筋萎縮およびガンのための適用。
Ａ）序論
この一連の試験において、目標は、ＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼの阻害剤の毒性影響を改変し得る分子を単離することである。したがって、この様式において、ＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼの阻害剤の毒性影響を軽減することができるか、または、特異的に高めることができることに基づいて分子を選び出すことが可能である。
毒性影響を軽減する分子は、筋肉組織に対するＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼの阻害剤の悪影響を軽減するために、ＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼの阻害剤に関連し得る。一方で、これらの分子は、より広範囲の適用を筋萎縮の保護において有し得る。実際、筋萎縮の大多数においては、アトリゴン（ａｔｒｉｇｏｎ）タンパク質が増大し、これは筋萎縮の起源に関係ないことが示された。さらに、ＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼの阻害剤による細胞の処理はアトロギンの合成を増大させる。したがって、ＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼの阻害剤によって処理される細胞は筋萎縮のインビトロ細胞モデルを形成し得ると考えることは無理のないことである。筋萎縮は、多くの病理（神経筋疾患、ガンまたはＨＩＶ）に伴う極めて一般的な病理である。後者の病理において、萎縮は不良な予後因子である。したがって、筋萎縮を防止すること、または、筋萎縮を軽減させることが、重要な治療目標である。
毒性影響を高める分子は複数の理由のために対象となっている。これらの分子を理解することは、潜在的な毒性影響を防止するために、ＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼの阻害剤とそれらの治療的併用を避けるという可能性をもたらし得る。一方で、ＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼの阻害剤が、抗腫瘍処置におけるそれらの治療可能性を増大させるための抗ガン分子との併用で使用される。ＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼの阻害剤の効果を高める分子を明確化することは、腫瘍疾患を処置するための治療的併用を明確化するための合理的な根拠を提案するという可能性をもたらす。
Ｂ）ＨＭＧ ＣＯＡレダクターゼの阻害剤で処理される多能性細胞由来の分化したＭＳＣ細胞を用いて小分子のバンクをスクリーニングするための原理
多能性細胞に由来するＭＳＣ細胞が、ＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼの阻害剤の存在下で播種され、小分子のバンクにより処理される。この実験では、使用されるＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼの阻害剤は、２μＭの濃度でのシンバスタチンであった。７２時間の培養の後、細胞数が、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏｗ技術によってそれぞれのウエルについて求められる。本技術の実現可能性を実証するために、小分子のＰｒｅｓｔｗｉｃｋバンクが選択された（このバンクは１，２００超の化合物を含有しており、それらについての有効成分の大多数が、実施例２の場合のように、ヒトの臨床診療において使用される）。作業プロセスが付録２に概略化される。
Ｃ）シンバスタチンにより処理されるヒト多能性細胞由来の分化したＭＳＣ細胞に対するスクリーニングの結果
スクリーニング条件は下記の通りであった：
・３８４ウエルの中でウエルあたり２，０００個の細胞
・Ｄ＋１ Ｐｒｅｓｔｗｉｃｋバンクからの化合物による処理
・Ｄ＋１ シンバスタチンによる処理
・Ｄ＋４ Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏｗによる結果の読み取り
このスクリーニングにより、２つのタイプの化合物を特定することが可能である。第１のタイプは保護的役割を有し、ＭＳＣ細胞について、ＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼの阻害剤の毒性を制限する。第２のタイプはスタチンの毒性を悪化させる。
閾値の選択が、サンプルの平均および標準偏差を計算することによって行われた。この方法論により、一連の保護的化合物と、シンバスタチンの毒性を悪化させる一連の化合物とが決定された。
第１の化合物について、下記の結果が得られた。結果が表１４に示される。
Figure 2013534823
 １１個の化合物が、２標準偏差で平均よりも大きい平均を有し、２個の化合物のみが、４標準偏差で平均よりも大きい平均を有する。上記により選択された化合物は、異なる薬物クラス（抗高血圧薬、抗ヒスタミン薬、抗うつ薬または抗コリン作動薬）に属する。したがって、この取り組みを使用することによって、スタチンの毒性影響における軽減を可能にする化合物を単離することが可能であった。上記により単離された分子の第１の適用の１つが、各種スタチンの悪影響を防止し、それにより、それらの臨床適応を拡大する。一方で、これらの分子は、保護的役割を筋萎縮において、すなわち、そのための治療的ツールが依然としてあまりにも縮小させられる非常に一般的な病理において有し得る。実際、メバロン酸合成の阻害剤により処理されるＭＳＣ細胞は、多くの根本的病理（筋ジストロフィー）または二次的病理（筋肉減少症、ガン、ＨＩＶ、加齢）において認められる筋萎縮についての培養ディッシュにおけるモデルを表す。このタイプのスクリーニングは、筋萎縮を軽減するための薬物戦略を明確化することを可能にする。
スタチンの影響を高める第２の一連の化合物について、下記の結果が得られた。結果が表１５に示される。
Figure 2013534823
 ３２個の化合物が、５標準偏差を超えたより小さい平均を有する。これら３２個の化合物の中には、予想外にも、バンクに存在する３つのスタチンが見出される。実際、シンバスタチンの選択された濃度は準最適であり、そして、これらの条件のもとでは、バンクに存在するスタチンが検出されることが予想される。より精細な分析のために、その毒性がシンバスタチンの存在下で高まる化合物を単離することが可能である。実際、３２個の化合物の中で、５個の化合物が、シンバスタチンの非存在下での毒性試験において明らかにされなかった。したがって、認められた毒性をスタチンの存在下で特異的に増大させる化合物を単離することが可能である。これらの分子の中には、抗腫瘍分子と、認識されている筋肉毒性を有する分子とが見出される。この試験により、スタチンに起因にする組織毒性を高める分子を予測することが可能である。この取り組みにより、スタチンの存在下における薬物相互作用に起因する毒性を防止することが可能である。したがって、実施されることになるこの簡便な機能的試験は、すべての新規な分子について、それらが臨床診療に移行する前に体系的に実施され得る。
スクリーニング戦略は下記の通りである。最初のスクリーニングにより、スタチンにより処理される細胞の存在下で毒性を高める分子を単離することが可能になる。その後、逆スクリーニングが、スタチンの非存在下で毒性を有する分子を除くために、最初のスクリーニングから得られる上記により単離された分子に対して行われる。このようにして、スタチンの存在下における毒性の特異性が保証される。この戦略により、５個の選び出された分子の中で、３個が抗腫瘍分子であることは意義深いことである。
Ｃ）結論
細胞源として、ＨＭＧ Ｃｏａレダクターゼの阻害剤（シンバスタチン）により処理される多能性細胞由来の分化したＭＳＣ細胞を使用する開発された細胞試験（バイオアッセイ）は、シンバスタチンの毒性影響から守る分子、および、この影響を悪化させる分子を選び出すことを可能にする。
第１の分子群は、ＨＭＧ Ｃｏａレダクターゼの阻害剤の毒性影響を制限するための治療的適用、および、筋萎縮（主要な病理）を防止するための治療的適用を有し得る。
第２の分子群は、望ましくない薬物相互作用を予測するための毒物学的適用、そして、腫瘍細胞および「腫瘍幹」細胞に対する細胞毒性効果を得るためにＨＭＧ Ｃｏａレダクターゼの阻害剤と併用され得る分子群を決定するための腫瘍処置における治療的適用を有し得る。

Claims (19)

  1. ＭＳＣタイプの細胞をヒト多能性細胞から作製するための方法であって、ヒト多能性細胞を、
    ａ．各種ＦＧＦ、ＨＧＦ、各種ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、各種ヘルグリン（ｈｅｒｕｇｕｌｉｎ）および各種ＶＥＧＦから選択される１つまたは複数の増殖因子、
    ｂ．アスコルビン酸およびその誘導体、ビタミンＥならびにＮ−アセチルシステインから選択される１つまたは複数の抗酸化剤
    を含む培養培地において培養する工程を含む方法。
  2. ＭＳＣタイプの細胞を誘導幹細胞から作製するための方法であって、誘導幹細胞を、
    ａ．各種ＦＧＦ、ＨＧＦ、各種ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、各種ヘルグリン（ｈｅｒｕｇｕｌｉｎ）および各種ＶＥＧＦから選択される１つまたは複数の増殖因子、
    ｂ．アスコルビン酸およびその誘導体、ビタミンＥならびにＮ−アセチルシステインから選択される１つまたは複数の抗酸化剤
    を含む培養培地において培養する工程を含む方法。
  3. 前記培養培地が、
    ａ．ＦＧＦ；および
    ｂ．アスコルビン酸またはその誘導体の１つ
    を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記培養培地が、
    ａ．ＦＧＦ−２；および
    ｂ．アスコルビン酸および／またはアスコルビン酸２−リン酸
    を含むことを特徴とする、請求項３に記載の方法。
  5. 前記培養培地がＦＧＦ２を１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で含み、かつ、アスコルビン酸２−リン酸を１ｍＭの最終濃度で含むことを特徴とする、請求項４に記載の方法。
  6. 前記ＭＳＣタイプの作製された細胞が、ＣＤ７３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１６６またはＣＤ１０５のマーカーのうちの１つまたは複数を発現することを特徴とする、請求項１〜５に記載の方法。
  7. 前記ＭＳＣタイプの作製された細胞がＳＳＥＡ４を発現することを特徴とする、請求項１〜６に記載の方法。
  8. メバロン酸またはコレステロールに影響する医薬化合物を選択するための方法であって、請求項１〜７に記載の方法によって得られる細胞を試験される医薬化合物と接触させるための工程を含む方法。
  9. メバロン酸またはコレステロールの代謝経路を調節する医薬化合物を選択するための方法であって、請求項１〜７に記載の方法によって得られる細胞を試験される医薬化合物と接触させるための工程を含む方法。
  10. メバロン酸の合成を阻害する効果を高める医薬化合物を選択するための方法であって、請求項１〜７に記載の方法によって得られる細胞を試験される医薬化合物と接触させるための工程を含む方法。
  11. メバロン酸の合成を阻害する効果を補う医薬化合物を選択するための方法であって、請求項１〜７に記載の方法によって得られる細胞を試験される医薬化合物と接触させる工程を含む方法。
  12. メバロン酸の合成およびコレステロールの合成の機能的阻害剤である医薬化合物を選択するための方法であって、請求項１〜７に記載の方法によって得られる細胞を試験される医薬化合物と接触させる工程を含む方法。
  13. 筋肉組織に対する毒性効果を有する医薬化合物を選択するための方法であって、請求項１〜７に記載の方法によって得られる細胞を試験される医薬化合物と接触させる工程を含む方法。
  14. 筋萎縮または筋肉減少症から守る医薬化合物を選択するための方法であって、請求項１〜７に記載の方法によって得られる細胞を試験される医薬化合物と接触させる工程を含む方法。
  15. 抗腫瘍性の医薬化合物を選択するための方法であって、請求項１〜７に記載の方法によって得られる細胞を試験される医薬化合物と接触させる工程を含む方法。
  16. 骨組織を修復するための、請求項１〜７に記載の方法によって得られる細胞。
  17. 軟骨を修復するための、請求項１〜７に記載の方法によって得られる細胞。
  18. 白色脂肪細胞または褐色脂肪細胞を得るための、請求項１〜７に記載の方法によって得られる細胞の使用。
  19. 免疫調節細胞を得るための、請求項１〜７に記載の方法によって得られる細胞の使用。
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