JP2013530683A

JP2013530683A - 血管新生能力の評価方法

Info

Publication number: JP2013530683A
Application number: JP2013506759A
Authority: JP
Inventors: マーティン−レンドン，エンカ; ワット，スザンヌ
Original assignee: NHS Blood and Transplant
Current assignee: NHS Blood and Transplant
Priority date: 2010-04-29
Filing date: 2011-04-28
Publication date: 2013-08-01
Also published as: US20130108594A1; GB201007159D0; EP2563933A1; WO2011135380A1

Abstract

本発明は、細胞試料または組織試料における血管新生シグネチャを特定する方法、血管新生治療法の効能を予測する方法、血管新生能力を予測する予見モデルの作成方法、血管治療に用いる薬剤を特定する方法、ならびに治療剤および治療用途を提供するものである。【選択図】図１

Description

本発明は、虚血、特に冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、発作もしくは脳虚血、創傷癒合、または腎臓、肺もしくは肝臓の虚血に関連のある何らかの虚血症状または障害に関する。特に、本発明は、被検者の血管新生能力、または被検者から単離された細胞の血管新生能力を評価する方法、およびその評価に基づき適切な治療計画を採用する方法、ならびに治療法に関する。

虚血性心疾患（ＩＨＤ）は、心筋への血液供給の低下を特徴とし、通常は冠状動脈疾患（ＣＡＤ）に起因する疾患である。ＩＨＤの場合、アテローム性動脈硬化によって、脂肪性物質、線維性物質、または石灰化物質の沈着物が動脈内部に蓄積する過程にて、心筋に血液を供給する動脈が狭細化する。アテローム性動脈硬化は、心臓の筋肉への血流を低下させ、筋肉から酸素を奪い、狭心症、心筋梗塞および鬱血性心不全につながる。心臓組織は、ヒト体内の他の多くの組織とは異なり、自己修復能力が限られているため、心筋への虚血障害は、回復不能な心筋組織喪失につながり、さらには左室機能の障害、そして最終的には心不全にまで至る可能性がある。経皮的冠動脈介入（ＰＣＩ）や冠状動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）などの治療介入的な血管新生処置が利用でき、これらの確立済み治療オプションによって、心筋梗塞（ＭＩ）後の患者の短期生存率が改善されるにもかかわらず、疾患の進行や後期段階における心不全の発症は妨げられない。心不全を患う患者の数は増加し続けており、このことは相変わらず世界中で死亡率および羅病率を高める主因となっている。こうした理由から、臨床研究は、損傷を受けた組織の補充や再生、および血管再生の改善によって病徴を抑制し、さらには疾患の進行を制限または停止することに専念する傾向にある。

末梢動脈疾患（ＰＡＤ）は、主に下肢に影響を及ぼすアテローム性動脈硬化、炎症、塞栓症または血栓形成に起因する、血液供給低下によっても特徴づけられる。影響を受けた動脈は、動脈を狭細化する脂肪沈着、または線維物質もしくは石灰化物質の蓄積の徴候を呈する。その原因としては、喫煙、糖尿病、異脂肪血症、高血圧、およびその他の心臓血管危険因子が挙げられる。ＣＡＤの場合と同様、血管再生は患者のクオリティオブライフを改善するものでなければならないが、ＰＡＤの重症例では血管再生だけは充分でなく、肢を切断することが唯一の解決策となる場合もある。

関節硬化または糖尿病のどちらかの影響で表面に広範な火傷または慢性損傷を起こし、それが原因で患者の血管再生に遅発性創傷癒合を伴った場合は、重大な問題にもなる。

血管再生体組織または神経組織は、発作、または局所的もしくは大域的な脳虚血による損傷を受ける。脳虚血が起こると、代謝要求を満たそうとして脳への血流が不足する結果になる。虚血は、脳代謝の変調、代謝速度の低下、およびエネルギー危機につながり、後で視覚、発語および運動の障害を招く恐れもある。

血管新生は、器官または損傷を受けた組織に血液を供給すべく、新しい血管を形成する自然治癒過程である。この過程は毛細管出芽を伴い、先在する脈管構造から新しい微小血管が形成されることにつながる。心臓では、血管新生によって、側枝と呼ばれる新しい血管が産生されて成長し、動脈の閉塞を迂回して、虚血の危険に曝された心筋組織への代替血液供給源となり得る。機械的因子、化学的因子、または分子的因子のうちの１つ以上が、血管を新生させるトリガーになる場合もある。内皮細胞は、物理的力に反応して、血管新生の機械的信号を分子的信号に変換できる。例えば、運動の最中に血流が増大した場合や、心筋に対する剪断応力および延伸が増した場合は、成長因子の増産を介して血管新生が刺激され得る。

低酸素（酸素圧が低い状態）または虚血に陥った場合は当然、血管新生が刺激される。低酸素中は、転写因子の低酸素誘導性因子（ＨＩＦ）が、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）遺伝子などの低酸素性応答要素（ＨＲＥ）に結合し、そのＨＲＥの発現を増強し細胞から放出させる。ＶＥＧＦを循環させ、次いで内皮細胞の表面上のＶＥＧＦレセプターに結合すると、信号形質導入経路が刺激され、結果として血管が新生される。低酸素によってマクロファージが刺激されて、血小板由来増殖因子、ならびに線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）１および２を含む種々の因子が放出され、さらに血管新生が刺激されることもあり得る。ＶＥＧＦと同様にＦＧＦも、血管新生の過程において細胞外基質の消化に重要なタンパク質分解酵素（プラスミノーゲン活性化因子およびメタロプロテイナーゼを含む）の内皮細胞の合成を刺激する。

炎症プロセスを通じて血管新生がトリガーされることもあり得る。心筋に虚血障害が起こると続いてマクロファージ、単核細胞および血小板が流入し、ＶＥＧＦおよびＦＧＦの発現を刺激する能力を有するサイトカインおよびレセプターが放出され得る。

血管新生成長因子の発現においては機械的、化学的および分子的因子が関与して虚血を上向き調節するが、こうした自然な代償的機序では、どのような患者においても（特に狭心症などのＩＨＤの病徴を呈する患者においては）新しい血管が充分には生成されない。冠状動脈疾患を伴う患者のなかには、側副循環の発達が不良な人もいれば良好な人もいる。側副循環の発達が不良な患者に関しては、血管新生サイトカインの産生が不充分であるか、それらのサイトカイン対する反応が減衰している可能性のあることが示唆されてきた（Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ｓ．Ｂ．，ａｎｄＩｓｎｅｒ，Ｊ．Ｍ；ＡｎｎａｌｓｏｆＩｎｔｅｒｎａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ２００２；１３６（１）：５４−７１）。血管新生サイトカインの発現および血管新生反応に影響する因子はいくつかが知られており、これらの因子はいくぶん、患者ごとに側副血管の発達に対する反応に差が見られる原因となっている。例えば、高齢化によっても、また糖尿病や高コレステロール血症などの他の医療条件の存在によっても、ＶＥＧＦの発現レベルの減少および血管新生反応の低下の可能性のあることが、動物試験によって立証されている（ＲｉｖａｒｄＡ．，ｅｔａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１９９９；９９：１１１−２０；ＲｉｖａｒｄＡ．，ｅｔａｌ．，ＡｍＪＰａｔｈｏｌ．１９９９；１５４：３５５−６３；ＣｏｕｆｆｉｎｈａｌＴ，２００２Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１９９９；９９：３１８８−９８）。これらの因子は多くの場合、患者における冠状動脈疾患の進行に関与する。そうした患者の多くは高齢で、しかも糖尿病、高コレステロール血症、または虚血を患っているか他の不特定な特性を持つために、血管新生サイトカインの上向き調節を制限されてしまう（Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ｓ．Ｂ．，ａｎｄＩｓｎｅｒ，ｓｕｐｒａ）。ＶＥＧＦ調節は、年齢およびその他の病状を越えて個人間で差があることが示唆されてきた。ＶＥＧＦ発現レベルに関しては、側枝の成長の良好な患者は、側枝の成長の不良な患者と比較して、単核細胞での低酸素反応率が高かった（ＳｃｈｕｌｔｚＡ．，ｅｔａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１９９９；１００：５４７−５２）。ＩＨＤ中の側副循環の成長程度は、医療因子および遺伝因子の数の作用を受け、個人間で差が見られる。

血管新生を治療に利用することによって、血組織における虚側枝血管の成長を増強または促進し得る。また、血管新生は、血管新生術（特に、ＰＣＩおよびＣＡＢＧ）などのハイリスク介入治療の代替としても利用できる。あるいは手術と組み合わせて利用することで血管再生をより完全なものにすることができる。血管新生は、発作または脳虚血を患う患者における虚血組織の血管再生を改善する目的に利用されている。また、ＰＡＤ患者において症状が重篤化した場合および患者が火傷、関節硬化、または糖尿病に起因した遅発性創傷癒合を伴う場合に肢の切断を回避する目的にも血管新生が利用されている（概要については、Ｗａｔｔｅｔａｌ．，２０１１；ＣｒｉｔｓｅｒａｎｄＹｏｄｅｒ２０１０；Ｍａｒｔｉｎ−Ｒｅｎｄｏｎｅｔａｌ．，２００９を参照）。

複雑な血管系としては成人の出産後のものが挙げられる。出生後生活の生理的および病的状態においては、概ね血管新生が維持されている。新規血管の形成は、（ｉ）一般的には、虚血に対する反応によって、先在する血管から内皮細胞（ＥＣ）の血管が新生するか出芽を生じ、（ｉｉ）骨髄にある内皮始原細胞から成熟ＥＣの血管が新生または新規分化し、（ｉｉｉ）先在する細動脈において動脈が新生するか内腔の寸法が増加することによって遂げられる（Ｆｉｓｃｈｅｒｅｔａｌ．，２２０６）。

治療的な血管新生は、虚血組織内の側枝血管（冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）の成長、脳虚血など）、および遅発性の創傷癒合を促進し得る（概要については、Ｗａｔｔｅｔａｌ２０１１；ＣｒｉｔｓｅｒａｎｄＹｏｄｅｒ２０１０；Ｍａｒｔｉｎ−Ｒｅｎｄｏｎｅｔａｌ．，２００９を参照）。循環内皮前駆体および内皮コロニー形成細胞（ＥＣＦＣ）／遅発性生成内皮細胞は、通常の成体ヒト末梢血内に概して稀にしか存在しないため、血液内の血管新生促進細胞や非血管新生細胞といった他の細胞とよりも見つけづらい（Ｅｓｔｅｓｅｔａｌ．２０１０）。

タンパク質、遺伝子、または細胞療法を使用することで、血管新生を増強し得る。タンパク質療法ではＶＥＧＦやｂＦＧＦなどの生育因子を患者に投与するのに対して、遺伝子療法ではそれらの生育因子のみ対象に発現を持続可能にするか阻害し得る。細胞療法では、損傷を受けた心臓組織を修復し血管新生を促進する際、胚性幹（ＥＳ）細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）、心臓、内皮、臍帯血もしくは末梢血、または骨髄由来幹細胞、および始原細胞の投与を伴う。幹細胞は、自己再生能力、および多岐にわたる特殊な細胞種（損傷を受けた心臓組織の修復や新規血管の形成に必要とされる細胞種を含む）への分化能力によって特徴づけられる。始原細胞は、幹細胞と同様に細胞種への分化能力を有するが、分化の度合いはより高度でしかも既に特定の細胞種への分化に特化している。骨髄および血液からの幹細胞および始原細胞は、臨床試験において心筋梗塞の急性期および慢性期での治療に利用されてきており、左室機能の修復に対して緩慢ながらも好ましい有益な効果をもたらす。他方、幹細胞および始原細胞療法の正確な作用機構は完全には理解されていないが、細胞は虚血組織に対する内皮始原細胞（ＥＰＣ）の組み込みによる血管質の増加、心筋細胞の生成、心臓リモデリングの調整、および／またはサイトカイン、およびまたは他の因子（心臓修復を促進し得る因子や、患部における線維形成を制限し得る因子）のパラクリン様式での産生を通して心臓機能に有益な影響をもたらし得ると思料されている（Ｍａｒｔｉｎ−ＲｅｎｄｏｎＥ．，ｅｔａｌ．，ＴｒａｎｓｆｕｓｉｏｎＭｅｄｉｃｉｎｅ２００９；１９：１５９−１７１）。血管新生治療中に観測される個体同士の間の反応は、側副循環の自然な発達に見られる個体同士の間の変形態様と一貫性を持つが、遺伝的および後成的な理由（単一ヌクレオチド多型、ｍｉｃｒｏＲＮＡ発現、ＤＮＡメチル化のパターンなど）により、バリエーションを生じる場合もある。

虚血および／または治療的血管新生が起こす血管新生反応は、いくつかの因子により個体同士の間で差異を生じる場合がある。このような多様性が公知となっているため、何らかの虚血症状または虚血関連の障害（特に、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、発作もしくは脳虚血、創傷癒合、または腎臓、肺もしくは肝臓の虚血）を有する患者における側副循環の自然な発達の度合い、および治療的血管新生に対する何らかの反応の度合いの予測が可能であることが望ましい。この予測に基づき、患者に応じた適切な治療計画を患者ごとに設計し得る。

国際公開第２００４／０５３０８５号パンフレットには、マウスモデルにおいて実験的に虚血を誘発させ（大腿動脈を結紮して虚血を引き起こし）遺伝子の発現パターンを研究することによって血管新生に関係する遺伝子を同定する方法が開示されている。開示された本方法は、内転筋から総ＲＮＡを分離するステップと、ｃＤＮＡを作製するステップと、ｃＤＮＡを遺伝子アレイにハイブリダイズするステップとを含む。非虚血マウスから作製されたｃＤＮＡに関係する遺伝子発現レベルとの比較に基づき、血管新生に関与する遺伝子が同定された。
この公告では、虚血の人工モデルにおけるマウスの血管新生遺伝子の発現に焦点を当てている。

国際公開第２００８／１１８８４６号パンフレットには、インビボでの腫瘍の血管新生能力を予測する方法が開示されている。本方法は、患者試料からの悪性細胞を培養するステップと、細胞培養試験にてＶＥＧＦ／ＶＰＦ、ｂＦＧＦ／ＦＧＦ−２、IＬ−８／ＣＸＣＬ８、ＥＧＦ、Ｆｌｔ−３リガンド、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＡ／ＢＢ、ＩＰ−１０／ＣＸＣＬ１０、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＶＥＧＦＲ、ＨＩＦ１−α、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−２、ＴＧＦ−α、ＴＮＦ−α、トロンボスポンジン（ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ）およびアンギオゲニン（Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）の存在および／またはレベルを確認するステップとを含む。次いで、腫瘍の血管新生シグネチャを、抗血管新生治療計画および試料が採取された患者の臨床結果と照合した。この公告は、腫瘍の血管新生に関する。

Ｓｍｉｔｈらによるレポート（Ｓｍｉｔｈｅｔａｌ．２００７）には、心不全を患って心臓移植を受けた患者の左室生検からの心筋細胞集塊由来細胞（ＣＤＣ）の分離方法、および培養方法が開示されている。開示された本方法は、穏やかな酵素処理剤で心臓生検を処理するステップと、フィブロネクチンでコーティングしたプレートで外植片を平板培養するステップと、外植片から生成細胞を収集するステップと、特定の条件下で細胞を培養して心筋細胞集塊を形成するステップと、フィブロネクチンでコーティングしたプレート上で心筋細胞集塊由来細胞をさらに伸張するステップとを含む。本方法はまた、ＣＤＣをフローサイトメトリーおよび他の標準免疫蛍光法で特徴づけるステップと、急性心筋梗塞の齧歯動物モデルにおいて齧歯動物の心臓機能改善能力をＣＤＣの移植により立証するステップとを含む。これらの試験に基づき、ヒトＣＤＣの治療能力が評価されると共に、これらの細胞が心臓機能を改善する機序が示唆された。本公告は、特定の患者コホートにおける左心室からのｃ−ｋｉｔ陽性細胞を多く含むＣＤＣの単離に焦点を当て、これらのｃ−ｋｉｔ陽性始原細胞が内皮細胞、血管細胞および心筋細胞への分化によって心臓を修復し得ることを立証しようと意図している。

本発明は、何らかの虚血症状を患う被検者または虚血に関連する問題を抱える被検者（特に冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、発作もしくは脳虚血、遅発性創傷癒合、および腎臓、肺もしくは肝臓の虚血を患う被検者）の血管新生能力を予測する方法を提供する。本発明はまた、内皮細胞を伸張する方法を提供し、それゆえに、何らかの虚血症状の治療方法を提供する。

本発明の第１の態様によれば、被検者から採取されたエキソビボ細胞試料または組織試料を用い、（ａ）試料について血管新生関連因子の発現レベルを試験するステップとを含む、細胞試料または組織試料の血管新生シグネチャを特定する方法が提供されている。

因子は、血管新生促進タンパク質、抗血管新生タンパク質、または細胞間相互作用もしくは細胞外基質の析出に関与するタンパク質であってもよい。

血管新生関連因子は、ＡＤＡＭＴＳ−１（トロンボスポンジンモチーフ（ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎｍｏｔｉｆｓ）１を有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ）、アンギオゲニン（Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）、アンギオポエチン−１（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１）、アンギオスタチン（Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、ＢＭＰ−１（骨形成タンパク質１）、ＥＧＦ（上皮細胞成長因子）、ＥＧ−ＶＥＧＦ（内分泌腺由来血管内皮成長因子）、エンドスタチン（Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、ＦＧＦａ（ヒト酸性線維芽細胞成長因子）、ＦＧＦｂ（ヒト塩基性線維芽細胞成長因子）、ＰＤＧＦ−ＡＡ（血小板由来成長因子−ＡＡ）、ＰＤＧＦ−ＡＢ（血小板由来成長因子−ＡＢ）、プロラクチン（Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ）、ＴＩＭＰ−１（メタロプロテイナーゼ組織阻害剤１）、プロコラーゲンＩ型、およびｕＰＡ（尿プラスミノーゲン活性化因子）からなる群から選択され得る。

本方法は、少なくとも１種、少なくとも２種、または少なくとも３種の血管新生関連因子の発現レベルに関する試験を含んでもよい。血管新生シグネチャは、定量的または半定量的測定であってもよい。

本方法は、アポトーシス、細胞周期プロセス、細胞表面プロセス、細胞間相互作用、細胞移動、中心体プロセス、細胞接着、細胞増殖、細胞骨格プロセス、成長因子およびレセプター、膜／インテグリン／シグナルトランスダクション、増殖マーカー、表面抗原マーカー、ならびに転写因子分子マーカーに関連する他の血管新生関連因子の発現レベルに関する試験をさらに含んでいてもよい。

血管新生関連因子の発現レベルは、１つ以上の対照群または基準発現レベルと比較し得る。この血管新生関連因子は、同じ被検者または別の被検者からのものでもよいし、何らかの処理の前、最中または後のものでもよい。上述のレベルは、１つ以上の対照試料（例えば、細胞培養）について定量されたレベル、１つ以上の対照試料（例えば、細胞培養）について定量されたレベル、または管新生とは無関係な１つ以上の制御因子について定量されたレベルと比較することができる。これらの比較は当該技術分野において公知である。本方法は、（ｂ）ステップ（ａ）で決定された結果を基準発現レベルと比較するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）での比較結果を基に被検者の血管新生促進能力を予測するステップとをさらに含んでもよい。

基準発現レベルは、同じ被検者からの別の組織から採取されるか、または別の被検者からの同じもしくは別の組織から採取されるエキソビボ試料中の因子の発現レベル試験から導き出すことができる。組織は、脂肪組織、心臓組織、血管組織、または造血組織であり得る。例えば、基準レベルは、特定の血管新生治療法に応答するかもしくは応答しないことが既知である患者から取り出されたか、特定の疾患の進行もしくは血管新生の表現型を有する患者（例えば、血管新生促進能力が低い患者）から取り出された、培養細胞もしくは組織から分泌される特定の血管新生関連因子のレベルとしてもよく、または何らかの虚血症状もしくは虚血関連の障害（特に、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、発作もしくは脳虚血、創傷癒合、腎虚血、肺虚血、または肝臓虚血）を患いかつ側副循環の自然な発達が皆無であるか充分でない被検者の血管新生関連因子のレベルとしてもよい。インビボアッセイ、インビトロアッセイ、または他の機能的血管新生アッセイにおいて基準発現レベルは、血管新生と相関している限り、１人以上の別々の被検者の血管新生促進能力に関連する定義済み発現レベルまたは平均発現レベルとしてよい。最も単純な実施形態においては、本方法を用い、特定の血管新生関連因子の発現レベルを定量するステップと、発現レベルを血管新生能力に機能的に連係された基準レベルと比較するステップによって、被検者の血管新生促進能力の予測が可能になる。これらの因子のレベルの差異は、少なくとも約１．５倍であるが２、５、１０、２０、または５０倍以上にもなり得る場合、一般に有意となる。付加的な対照群は、血管新生と関連のない１つ以上の因子のレベルの試験を含む。

好適な実施形態では、本方法を用いることにより、虚血症状または虚血関連の障害（特に冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、発作もしくは脳虚血、創傷癒合、または腎臓、肺もしくは肝臓の虚血）を患うヒト被検者の血管新生能力を予測し得る。発現レベルは、疾患状態、病因、疾患の進行、または危険因子（糖尿病、高血圧、高脂血症、年齢、性別、肥満、体格指数、喫煙、心臓機能、薬物使用など）と相関し得る。

血管新生促進能力は、血液供給の改善を要する組織における血管の成長を刺激する傾向として定義される。虚血を患う被検者において、本方法は被検者が側副循環または側枝を呈する確率を予測できる。

本出願人は、ＡＤＡＭＴＳ−１、アンギオゲニン（Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）、アンギオポエチン−１（Ａｎｇｉｏｐｏｉｔｉｎ−１）、アンギオスタチン（Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、ＥＧＦ、ＥＧ−ＶＥＧＦ、エンドスタチン（Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、プロラクチン（Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ）、ＴＩＭＰ−１、プロコラーゲンＩ型、およびｕＰＡのうち１種以上のレべル増加が、基準レベルと比較して、血管新生促進能力と負の相関を持つことを実験的に定量した。これらの因子は、抗血管新生因子である（すなわち、低度の血管新生促進能力と関連がある）と見なされる。本出願人は、心臓由来細胞の血管新生を支持する能力と、それらの細胞における一部の細胞外基質成分（例えば、プロコラーゲンＩ型）の発現との間には、逆相関があることもさらに確認した。そのうえ、細胞増殖と血管新生促進能力との間の相関も観測された。

本出願人は、ＦＧＦａ、ＦＧＦｂ、および骨形成タンパク質（ＢＭＰ）−１のうちの１種以上のレべル増加が、基準レベルと比較して血管新生促進能力と正の相関を持つことを実験的に定量した。これらの因子は、血管新生促進因子である（すなわち、高度な血管新生促進能力と関連がある）と見なされる。

細胞または組織の血管新生能力を評価する際、および適切な血管新生促進療法または抗血管新生療法を選択する際には、血管新生シグネチャを使用できる。

本発明の第２の態様では、血管新生治療法の効能を予測する方法が提供されている。この方法は、被検者から採取されたエキソビボ細胞試料または組織試料を用い、被検者から採取されたエキソビボ細胞試料または組織試料の血管新生促進能力を定量するステップと、血管新生促進能力を、血管新生治療計画および被検者の結果に相関するモデルプロファイルと照合するステップとを含む。したがって、本予測的方法では、被検者から採取された細胞または組織の血管新生能力に基づき、適切な処理方針を考案し得る。

血管新生促進能力が良好すなわち高度であると予測された被検者に対しては、標準を超える治療介入（例えば、薬剤、ＰＣＩ、またはＣＡＢＧ）が必要ないと考えられる。血管新生促進能力が低度すなわち不良であると予測された被験者に対しては、治療的血管新生または他の治療計画を、標準治療の補足として提示し得る。

ある実施態様においては本発明の方法は、数種（例えば、２、３、または４種）の血管新生関連因子について試験し、場合によっては１種以上（例えば２種）の抗血管新生の血管新生関連因子についても試験する。

一部の実施形態においては、コンピュータのアルゴリズムを用い、血管新生促進能力をモデルプロファイルと比較できる。

好適な実施形態では、本方法を用いることにより、何らかの虚血症状または虚血関連の障害（特に冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、発作もしくは脳虚血、創傷癒合、または腎臓、肺もしくは肝臓の虚血）を患うヒト被検者の、血管新生療法に対する臨床反応を予測し得る。モデルプロファイルは、疾患状態、病因、疾患の進行、または危険因子（糖尿病、高血圧、高脂血症、年齢、性別、肥満、体格指数、喫煙、心臓機能、薬物使用など）と相関し得る。本方法は、被検者の治療的な血管新生に対する反応、または今後疾患が進行する危険度について確率を提供し得る。

第３の態様において本発明は、血管新生能力を予測する予見モデルの作成方法を提供している。この作成方法は、複数の被検者から採取されたエキソビボ細胞試料または組織試料を用い、（ａ）各試料について、ＡＤＡＭＴＳ−１、アンギオゲニン（Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）、アンギオポエチン−１（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１）、アンギオスタチン（Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、ＢＭＰ−１、ＥＧＦ、ＥＧ−ＶＥＧＦ、エンドスタチン（Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、ＦＧＦａ、ＦＧＦｂ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、プロラクチン（Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ）、ＴＩＭＰ−１、プロコラーゲンＩ型、およびｕＰＡからなる群から選択される少なくとも３種の血管新生関連因子の発現レベルを試験するステップと、（ｂ）各試料を機能アッセイで試験するステップと、（ｃ）ステップ（ａ）の結果をステップ（ｂ）の結果と照合するステップとを含む。

１種以上の血管新生関連因子の発現レベルに関して各試料の血管新生能力を機能的に評価することによって、各因子の基準発現レベルを定量し、血管新生と相関させることができる。アッセイは、インビトロおよび／またはインビボ血管新生アッセイであってよい。ＰａｓｓａｎｉｔｉＡ．，ｅｔａｌ．（ＬａｂＩｎｖｅｓｔ．１９９２Ｏｃｔ；６７（４）：５１９−２８）に述べられているように、インビボ血管新生アッセイは、免疫不全マウスのマトリゲルインプラントの使用に基づくものであってもよい。基底膜タンパク質（マトリゲル）の抽出物は、マウスの皮下に移植されたときに、ゲルに再組成され得る。移植に先立って、マトリゲルに例えば内皮細胞や支持細胞を播種してもよい。新しい血管は、マウス血管と結合するようにインビボで形成される。マトリゲルには血管新生因子または阻害剤も添加できる。次いで、血管数または血管密度を評価するための免疫組織化学的分析に向けて、マトリゲルプラグを除去できる。

インビトロアッセイにて、心筋細胞集塊、血管内皮、および血管新生促進支持細胞の形成能力を試験することもできる。アッセイには、ヒト内皮細胞（例えば、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）もしくはヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ））、または内皮始原細胞（ＥＰＣ）の使用を含めてもよいし、あるいはＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、臍帯血もしくは末梢血などの造血系組織、成体の血管、または微小循環系から採取された、内皮コロニー形成細胞（ＥＣＦＣ）の使用を含めてもよい。これらの細胞は、内皮培地内の臍帯、臍帯血、ウォートンジェリー（Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓＪｅｌｌｙ）、末梢血、骨髄、皮膚、脂肪組織、又は心臓もしくは骨格筋由来の細胞から採取された間葉系幹細胞、間質細胞または支持細胞と共培養でき、この共培養により脈管管状構造の形成が可能になる。内皮細胞、血液細胞、または骨髄細胞（例えば、同意したドナーからのもの）を血管形成の対照群として使用してもよい。

第４の態様において本発明は、血管治療に用いる薬剤を特定する方法を提供する。この方法は、被検者から採取されたエキソビボ細胞試料または組織試料を用い、（ａ）試料を薬剤に接触させるステップと、（ｂ）その試料について、ＡＤＡＭＴＳ−１、アンギオゲニン（Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）、アンギオポエチン−１（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１）、アンギオスタチン（Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、ＢＭＰ−１、ＥＧＦ、ＥＧ−ＶＥＧＦ、エンドスタチン（Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、ＦＧＦａ、ＦＧＦｂ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、プロラクチン（Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ）、ＴＩＭＰ−１、プロコラーゲンＩ型、およびｕＰＡからなる群から選択される少なくとも３種の血管新生関連因子の存在および／またはレベルを試験するステップと、（ｃ）血管新生関連因子の発現の存在および／またはレベルを、薬剤に接触していない試料における同じ血管新生関連因子の発現の存在および／またはレベルと比較するステップとを含む。薬剤の存在下にて１種以上の血管新生関連因子を発現させたときの統計的に有意な変化を、候補薬剤の不在下での発現レベルと比較相対すると、血管新生を調整した際の薬剤の活性がわかる。薬剤の存在下における１つ以上の血管新生促進の血管新生関連因子の発現の増加を、薬剤の不在下での発現レベルと比較相対すると、薬剤が血管新生促進活性を有することがわかる。薬剤の存在下における１つ以上の血管新生促進の血管新生関連因子の発現の減少を、薬剤の不在下での発現レベルと比較相対すると、薬剤が抗血管新生活性を有することがわかる。本方法は、薬剤と接触させた細胞試料または組織試料から血管新生関連因子発現プロファイルを採取するステップと、採取された発現プロファイルを基準血管新生関連因子発現プロファイルと比較し、候補薬剤が血管新生促進活性または阻害活性のどちらを有するかを判定するステップとを含むことができる。発現プロファイルは、転写プロファイルまたはタンパク質プロファイルであってよい。

本発明は、上述の何れか方法を実施するためのキットも提供する。

本発明は、薬剤をスクリーニングして血管新生を調整した際の活性を確認するためのキットもさらに提供する。このキットは核酸プライマーのセット、ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブ、または１種以上の血管新生関連因子に特異的な１種以上の抗体を含む。アレイの表面に試薬が存在してもよい。キットは、基準発現レベルまたは１つ以上のモデルプロファイルと、取扱説明書とをさらに含んでもよい。

細胞試料または組織試料は、健常な被検者の生検標本から採取してもよいし、何らかの虚血症状または虚血関連の障害（特に冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、発作もしくは脳虚血、創傷癒合、または腎臓、肺もしくは肝臓の虚血）を患い治療を必要する被検者の生検標本から採取してもよい。試料を被検者の心臓組織、骨格筋、血管、微小循環系もしくは関連する血管組織、脂肪組織、臍帯、臍帯血、末梢血、または骨髄から採取してもよいし、被検者の胚性細胞、または従来技術において知られている標準方法で生成されたｉＰＳ細胞もしくは細胞株から採取してもよい。試料は、心房生検、心室生検、骨格筋生検または静脈血管もしくは動脈血管からの生検、微小血管組織、または脂肪組織であってよく、血管再生手続き、心臓手術、もしくはＰＣＩ中に、または皮膚置換、創傷癒合、または脂肪組織移動中に採取し得るものである。試料は、静脈血または動脈末梢血から採取してもよい。試料は、心臓系、骨格系、脂肪組織、内皮系もしくは間質系の支持細胞、間葉系もしくは造血系の幹細胞、または始原細胞を含んでいてもよい。試料は、当該技術分野において公知である上述の何れかの標準方法により採取されたｉＰＳ細胞を含んでいてもよい。

心臓細胞は、心臓由来の始原細胞もしくは幹細胞、心筋細胞もしくは関連する心臓間質細胞、線維芽細胞、血管細胞、またはｉＰＳ細胞由来の心臓細胞であり得る。基準発現レベルを提供するために、骨髄由来の間葉系幹細胞または造血系幹細胞を対照群細胞として用いることもできる。あらゆる態様において、当該技術分野で知られている従来の技術を用い、何らかの試料から細胞を単離し伸張できる。比較のために、２つ以上の試料を被検者から採取してもよいし、いくつかの異なる組織から採取してもよい。

血管新生関連因子の発現レベルは、細胞培地または細胞抽出物で定量できる。試験は、基準発現レベルとの比較、または血管新生治療計画および被検者の結果に相関するモデルプロファイルとの比較を容易にする、定量的または半定量的結果を提供するものであることが好ましい。試験は、細胞内の因子、または細胞培地に分泌された因子の存在および／または発現レベルを測定するステップを含んでもよい。この測定では、抗体ベースのアッセイ（例えば、ウェスタンブロッティングや免疫細胞化学）などの何らかの適当なアッセイを用いることができるが、ＥＬＩＳＡなどの定量的イムノアッセイを用いるのが好ましい。様々なのタンパク質のレベルをＥＬＩＳＡ法で測定するためのキット（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ製など）が市販されており、例えば『Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ』（ＨａｒｌｏｗａｎｄＬａｎｅＥｄｓ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ）に開示されているように、周知の技術を用いてＥＬＩＳＡ法を展開できる。このようなＥＬＩＳＡ法で使用される抗体は市販のものであってもよいし、または周知の方法を用いて作製されたものであってもよい。

試験は、ＲＴ−ＰＣＲや等温核酸増幅などの定量的ｍＲＮＡ増幅方法、またはその変種を用い、遺伝子発現レベルをｍＲＮＡレベルで測定するステップを含んでいてもよい。これらの方法を実施するためのシステムも市販されており、例えばＴａｑＭａｎシステム（ＲｏｃｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｙｓｔｅｍ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）やＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒシステム（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）が挙げられる。ＲＴ−ＰＣＲに用いる適切なプライマーを考案する方法、および関連する方法は、当該技術分野において周知である。血管新生関連因子またはその他の因子のタンパク質発現レベルは、定量的ＲＴ−ＰＣＲによってｍＲＮＡレベルと相関させることができる。

１種以上の血管新生関連因子の発現を研究する場合、核酸アレイを用いることもできる。とりわけ、アレイによって多数の遺伝子の発現を同時に分析する方法が提供される。現在、このような方法は当該技術分野において公知であり、市販のシステムとしては、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（ＳａｎｔａＣｌａｒａ，ＣＡ）、Ｉｎｃｙｔｅ（ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）、ＲｅｓｅａｒｃｈＧｅｎｅｔｉｃｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）、Ａｇｉｌｅｎｔ（ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）などがある。本発明は、ポリヌクレオチドプローブのアレイをさらに提供する。このアレイは、少なくとも１つの表面と複数の別個のポリヌクレオチドプローブとを有する支持体を含んで構成される。各ポリヌクレオチドプローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下でＡＤＡＭＴＳ−１、アンギオゲニン（Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）、アンギオポエチン−１（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎｓ−１）、アンギオスタチン（Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、ＢＭＰ−１、ＥＧＦ、ＥＧ−ＶＥＧＦ、エンドスタチン（Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、ＦＧＦａ、ＦＧＦｂ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、プロラクチン（Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ）、ＴＩＭＰ−１、プロコラーゲンＩ型、およびｕＰＡからなる群から選択される一連の血管新生関連因子の遺伝子産物にハイブリダイズする。

タンパク質発現レベルの定量分析方法としては、他にも、同位体コード化親和性標識試薬、ＭＡＬＤＩＴＯＦ／ＴＯＦタンデム型質量分析、２次元ゲル／質量分析法技術などのプロテオミクス技術が挙げられる。好適な一実施形態においては、細胞抽出物を用いて、１種以上の血管新生関連因子に特異的な捕捉抗体を含有するプロテオームアレイ（例えば、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓから入手されたＰｒｏｔｅｏｍｅＰｒｏｆｉｌｅｒＡｒｒａｙ）をプローブすることもできる。本発明は、ＡＤＡＭＴＳ−１、アンギオゲニン（Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）、アンギオポエチン−１（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１）、アンギオスタチン（Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、ＢＭＰ−１、ＥＧＦ、ＥＧ−ＶＥＧＦ、エンドスタチン（Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、ＦＧＦａ、ＦＧＦｂ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、プロラクチン（Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ）、ＴＩＭＰ−１、プロコラーゲンＩ型、およびｕＰＡからなる群から選択される１種以上の血管新生関連因子に特異的な抗体のアレイをさらに提供する。

試験に先立ち、従来の分離および分化技術を使用して、組織から細胞を単離してもよい。細胞は細胞培養で伸張するのが好ましい。本発明に係る方法は、各被検者から採取された試料からの細胞の培養を含む。細胞培養からの細胞を血管新生の作用薬または拮抗剤に曝してもよい。細胞を正常酸素圧または低酸素培養条件下で維持してもよい。低酸素および正常酸素圧の培養条件下で細胞を順次または並列に血管新生の作用薬または拮抗剤に曝して維持してもよく、また両方における血管新生関連因子の発現レベルを試験してもよい。低酸素条件または環境は、酸素が約０．５％〜約１５％、好ましくは酸素が約１％〜約５％であってもよい。正常酸素圧条件は、酸素が約１８％〜約２３％、好ましくは約２１％の条件を含む。

好適な実施態様においては、被検者から採取された細胞を培養にて伸張し、その細胞での１種以上の血管新生関連因子の発現レベルを試験する。

比較的少数の因子についてのみ発現を研究し、それらの因子のほとんどまたは全てにおける発現の変化を観測して、血管新生促進能力に関して信頼性の高い予測を提供する必要のある場合もある。例えば、３つの因子についてのみ発現レベルを試験することで、３つの因子全てにおける発現の変化に基づいて、血管新生促進能力を確実に予測できる。５つの因子の発現レベルを試験することで、少なくとも４つの因子の発現の変化に基づいて、血管新生促進能力について信頼性の高い予測を得ることができる。より多くの血管新生関連因子の発現レベルを試験し、発現における何らかの異質性を克服して、それにより信頼性を高め、血管新生促進能力を予測できることが好ましい本発明に係る方法は、ＡＤＡＭＴＳ−１、アンギオゲニン（Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）、アンギオポエチン−１（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１）、アンギオスタチン（Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、ＢＭＰ−１、ＥＧＦ、ＥＧ−ＶＥＧＦ、エンドスタチン（Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、ＦＧＦａ、ＦＧＦｂ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、プロラクチン（Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ）、ＴＩＭＰ−１、プロコラーゲンＩ型、およびｕＰＡのうちの少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１１種、少なくとも１２種、少なくとも１３種、少なくとも１４種、少なくとも１５種、または全てについて発現レベルに関する試験を含んでもよい。

被検者は好ましくはヒトであるが、ヒト以外の哺乳類動物であってもよい。被検者は、健常でもよいし、虚血、および特に冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、発作もしくは脳虚血、創傷癒合、または腎臓、肺もしくは肝臓の虚血に関連のある何らかの虚血症状または障害を患っていてもよい。

血管新生促進能力が低いすなわち不良であると判定もしくは予測された被検者については、その細胞および伸張した後代細胞の血管新生促進能力を改善することが望ましい。その細胞および伸張した後代細胞は、好ましくは、心臓、もしくは骨格筋肉、血管、脂肪組織、ウォートンジェリー（Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓＪｅｌｌｙ）、臍帯、臍帯血、末梢血もしくは骨髄由来の細胞、幹細胞、始原細胞、ＥＳ細胞、またはｉＰＳ細胞である。血管新生促進能力を改善する方策としては、低酸素プレコンディショニング、薬剤、低分子またはペプチド治療、および／または遺伝子組み換えが挙げられる。

本発明は、細胞の血管新生促進能力を改善するための方法も提供する。この方法は、被検者から採取された細胞および／または培養にて伸張した細胞の、エキソビボ個体群を処理するステップを含む。この処理には、（ｉ）低酸素プレコンディショニング、（ｉｉ）薬理学的治療、（ｉｉｉ）組み換えポリペプチド、および（ｉｖ）遺伝子組み換えのうちの１つ以上を使用する。

細胞の血管新生促進能力を改善するための方法が提供されている。この方法は、被検者から採取されたエキソビボ細胞試料または組織試料を用い、（ａ）試料について、ＡＤＡＭＴＳ−１、アンギオゲニン（Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）、アンギオポエチン−１（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１）、アンギオスタチン（Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、ＢＭＰ−１、ＥＧＦ、ＥＧ−ＶＥＧＦ、エンドスタチン（Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、ＦＧＦａ、ＦＧＦｂ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、プロラクチン（Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ）、ＴＩＭＰ−１、プロコラーゲンＩ型、およびｕＰＡからなる群から選択される少なくとも３種の血管新生関連因子の発現レベルを試験するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）で決定された結果を基準発現レベルと比較するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）における比較の結果に基づいて被検者の血管新生促進能力を予測し、細胞培養における試料からの細胞を任意に伸張するステップと、（ｄ）（ｉ）低酸素プレコンディショニング、（ｉｉ）薬理学的治療、（ｉｉｉ）組み換えポリペプチド、および（ｉｖ）遺伝子組み換えのうちの１種以上を使用して細胞を処理するステップとを含む。

本方法により採取可能な１個体以上の細胞が提供されている。

本方法は、処理した細胞を被検者に移植するステップをさらに含んでもよい。

本発明は、虚血症状または虚血に関連する疾患（特に冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、発作もしくは脳虚血、創傷癒合、または腎臓、肺もしくは肝臓の虚血）の治療における血管新生促進能力を改善した細胞の使用方法をさらに提供する。

好適な実施形態では、心臓、もしくは骨格筋肉、血管、脂肪組織、ウォートンジェリー（Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓＪｅｌｌｙ）、臍帯、臍帯血、末梢血もしくは骨髄由来の細胞、幹細胞、始原細胞、ＥＳ細胞、またはｉＰＳ細胞を約１％〜約５％の酸素濃度（低酸素）で培養し、幹細胞増殖または分化能力を増強し得る。細胞を組成物と接触させてもよい。それによって、ＡＤＡＭＴＳ−１、アンギオゲニン（Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）、アンギオポエチン−１（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１）、アンギオスタチン（Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、ＥＧＦ、ＥＧ−ＶＥＧＦ、エンドスタチン（Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、プロラクチン（Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ）、ＴＩＭＰ−１、プロコラーゲンＩ型、およびｕＰＡのうちの１種以上の発現の減少、および／またはＦＧＦａ、ＦＧＦｂおよびＢＭＰ−１のうちの１種以上の発現の増大が可能になる。組成物は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ分子、ＲＮＡｉ分子、ｍＲＮＡと結合してトリプレックスを形成するオリゴヌクレオチド、もしくは細胞内に転写されアンチセンスオリゴヌクレオチドを産生するＤＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ＲＮＡｉ、またはｍＲＮＡと結合してトリプレックスを形成するオリゴヌクレオチドを含有してもよい。これらの含有物は何れも、ライブラリからまたはライブラリスクリーニングを通して採取し得る。組成物は、抗血管新生タンパク質に結合する、抗体もしくは可溶タンパク質レセプター（例えば、ヒト抗体やヒト可溶タンパク質レセプター）、またはそれらの組み合わせを含有してもよい。

細胞を培養中に１種以上のＡＣＥ阻害薬、ＡＣＥレセプター拮抗剤、スタチンもしくは何らかの他の薬剤、または活性因子と接触させてもよい。これにより、細胞数を増加させ、生存を増強し、血管新生促進活性を改善し得る。

本発明においては、特定の血管新生関連因子の発現を定量する方法が提供されている。この定量によって、被検者が側副循環を呈する確率の予測することも、あるいは自然にまたは血管新生療法に応答して微小循環を増進させることが可能になる。

さらなる態様において本発明は、インビトロおよび／またはインビボで内皮細胞およびＥＣＦを伸張するための方法を提供する。この方法は、胎児、新生児もしくは成体の臍帯、臍帯血、末梢血もしくは微小循環系などの組織からのＥＣもしくはＥＣＦＣ、ＥＳ由来もしくはｉＰＳ由来の内皮細胞、またはＥＣＦＣを処理するステップを含み、細胞数を増大させるか細胞生存を支持する血管新生関連因子を単独で用いるかまたは複数組み合わせて用いる。そのような因子はＡＤＡＭＴＳ−１、アンギオゲニン（Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）、アンギオポエチン−１（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１）、アンギオスタチン（Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、ＥＧＦ、ＥＧ−ＶＥＧＦ、エンドスタチン（Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、ＦＧＦａ、ＦＧＦｂ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、プロラクチン（Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ）、ＴＩＭＰ−１、プロコラーゲンＩ型、およびｕＰＡの１つであってよく、好ましくは、ＢＭＰ−１またはＢＭＰ−１および他の血管新生関連因子の組み合わせ（例えば、ＡＤＡＭＴＳ−１、アンギオゲニン（Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）、アンギオポエチン−１（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１）、アンギオスタチン（Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、ＥＧＦ、ＥＧ−ＶＥＧＦ、エンドスタチン（Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、ＦＧＦａ、ＦＧＦｂ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、プロラクチン（Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ）、ＴＩＭＰ−１、プロコラーゲンＩ型、およびｕＰＡ）である。

本方法は、エキソビボでの培養時、または組み換えＢＭＰ−１タンパク質もしくはポリペプチドの送達時に、側副血管成長の増強を必要とする場合、何らかの虚血症状または虚血関連の障害（特に冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、発作もしくは脳虚血、創傷癒合、または腎臓、肺もしくは肝臓の虚血）に対する血管新生促進療法または治療として、内皮細胞を組み換えＢＭＰ−１ポリペプチドまたはタンパク質で処理するステップを含んでもよい。治療の遂行は、組み換えＢＭＰ−１タンパク質を徐々に放出されるようカプセル化するステップ、ＢＭＰ−１をナノ粒子の形で送達するステップ、またはカプセルを生体／人工組織移植片もしくはコーティングステントに移植するステップとを含んでもよい。

本方法はまた、ＢＭＰ−１を一時的にまたは安定して発現させるために、プラスミドＤＮＡ、またはアデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、アデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏａｓｓｏｃｉａｔｅｖｉｒｕｓ）、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、またはレンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ）ベースのベクターなどのウイルスベクターの何れかを用い、最適な遺伝子発現のために偏在性または誘導性プロモータの制御下で内皮細胞またはＥＣＦＣを遺伝的に修飾するステップを含んでもよい。

本方法は、内皮細胞またはＥＣＦＣを、胎児、新生児もしくは成体の臍帯、臍帯血、末梢血、微小血管系などの組織、ＥＳ由来もしくはｉＰＳ由来の内皮細胞、またはＥＣＦＣから選択される何れかの組織からの間葉系もしくは間質支持細胞から採取される上澄みまたは調整培地で処理するステップを含んでもよい。支持細胞は好ましくは、ＢＭＰ−１を一時的にまたは安定して発現させるために、上述のベクターの１つを用い、最適な遺伝子発現のために偏在性または誘導性プロモータの制御下で遺伝的に修飾されるか、またはＢＭＰ−１の発現を一時的にまたは安定して増加させるための薬剤で処理される。

本方法はまた、ＢＭＰ−１またはＢＭＰ−１と血管新生促進因子との組み合わせを発現させるために遺伝的に修飾または処理された細胞を処理剤として、損傷を受けた組織に直接送達するステップを含んでもよい。これにより、内皮細胞の数もしくは生存率をインサイチュで増加させ得るか、または側副血管の成長を増強し得る。

本方法は、虚血、特に冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、発作もしくは脳虚血、創傷癒合、または腎臓、肺もしくは肝臓の虚血に関連のある何らかの虚血症状または障害において側副成長を改善するか、または微小循環系の健全性を改善するステップを含んでもよい。

出生後に内皮始原細胞（ＥＰＣ）およびＥＣＦＣが少数発生した場合、それらの細胞を治療血管新生の目的に多量に生成することが課題となる。エキソビボで伸張したＥＰＣまたはＥＣＦＣを、エンジニアリング済みの移植片もしくはステントに組み込んだ状態で自家移植することによって、何らかの虚血症状または虚血関連の障害（特に冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、発作もしくは脳虚血、創傷癒合、または腎臓、肺もしくは肝臓の虚血）における虚血組織の血管再生を促進し得る。ＥＰＣおよびＥＣＦＣは、細胞療法としてまた血管再生のファクトリとして、肢虚血の救急および治癒の促進、または１種以上の血管新生促進因子の送達の用途に用いることができる。これらの細胞は、支持細胞と組み合わせて組織工学的用途に用い、微小循環系を作製し得る。支持細胞（例えば、骨髄特異的もしくは組織特異的な間葉系始原細胞、または間質細胞）は、１種以上の血管新生関連因子媒体として単独で使用でき、これにより、血管新生療法中にＥＣおよびＥＣＦＣの増殖および／または生存、ならびに新しい血管の形成を誘発し得る。これらの支持細胞は、自家細胞由来または同種異系細胞由来であり得る。最後に、損傷を受けた血管の再内皮化および内皮健全性の単独維持の目的に、エキソビボで伸張したＥＣおよびＥＣＦＣを、組織移植片もしくはステントに用いることもできる。

本発明のさらなる態様においては、何らかの虚血症状の治療または血管新生療法で用いられる薬剤調製における、伸張したＥＣおよびＥＣＦＣの使用が提供されている。虚血症状は、例えば、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、発作もしくは脳虚血、創傷癒合、および腎臓、肺もしくは肝臓の虚血を含む。

伸張した細胞は、ＢＭＰ−１およびその他の血管新生関連因子（例えば、ＡＤＡＭＴＳ−１、アンギオゲニン（Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）、アンギオポエチン−１（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１）、アンギオスタチン（Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、ＢＭＰ−１、ＥＧＦ、ＥＧ−ＶＥＧＦ、エンドスタチン（Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、ＦＧＦａ、ＦＧＦｂ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、プロラクチン（Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ）、ＴＩＭＰ−１、プロコラーゲンＩ型、およびｕＰＡ）のファクトリとしても使用できる。伸張した細胞は、生体移植片、無細胞移植片、人工組織移植片またはコーティングステントに播種してもよい。伸張した細胞は再内皮化の用途にも使用し得る。

処理済みまたは遺伝的に修飾された支持細胞（間葉系細胞や間質細胞など）は、単独で、またはＥＣおよびＥＣＦＣと組み合わせて、生体移植片または無細胞移植片または人工組織移植片またはコーティングステントに播種してもよい。

本発明のさらなる態様においては、何らかの虚血症状治療用の薬剤の調製における、血管新生関連因子（例えば、ＢＭＰ−１、またはＢＭＰ−１および他の血管新生関連因子の組み合わせ）の使用が提供されている。治療には、ポリペプチドまたは組み換えタンパク質を虚血組織に直接に投与するステップを含めてもよい。ＢＭＰ−１、またはＢＭＰ−１および他の血管新生関連因子の組み合わせは、生体移植片または無細胞移植片または人工組織移植片またはコーティングステントの一部として供給し得る。ＢＭＰ−１、またはＢＭＰ−１および他の血管新生関連因子の組み合わせは、支持細胞である細胞を介して送達し得る。支持細胞は、骨髄、臍帯血、ウォートンジェリー（ＷｈａｒｔｏｎｓＪｅｌｌｙ）、血管周囲、脂肪組織、心臓組織細胞、微小血管由来の間葉系／間質細胞、成体および胎児の皮線維芽細胞、胚性幹（脱Ｓ）細胞、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）由来の支持間質細胞を含む。

本発明のさらなる態様によれば、何らかの虚血症状治療用の薬剤調製における、伸張したＥＣまたはＥＣＦＣの使用が提供されている。虚血症状は、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、発作、脳虚血、創傷癒合、肝臓虚血、肺虚血、または腎虚血から選択できることが好ましい。

好ましい実施態様においては、ＡＤＡＭＴＳ−１、アンギオゲニン（Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）、アンギオポエチン−１（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１）、アンギオスタチン（Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、ＢＭＰ−１、ＥＧＦ、ＥＧ−ＶＥＧＦ、エンドスタチン（Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、ＦＧＦａ、ＦＧＦｂ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、プロラクチン（Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ）、ＴＩＭＰ−１、プロコラーゲンＩ型、およびｕＰＡから選択される血管新生関連因子が生成されるように、ＥＣまたはＥＣＦＣを修飾してもよい。

好都合にも、虚血症状を有する被検者の再内皮化を、ＥＣまたはＥＣＦＣによって容易にすることができる。

投与の経路としては、局所、薄膜、経皮パッチ、筋肉注射、冠動脈内、静脈内注入、または動脈内注入が挙げられる。

本発明の他の態様においては、ＢＭＰ−１ポリペプチドや薬理学的に許容される賦形剤などの血管新生関連因子、希釈液、または担体を含む、製薬用組成物が提供されている。血管新生関連因子はカプセル化によって、徐放または速放が可能になる。当該技術で知られている何らかの適当な成分を、製薬用組成物の調製に用いることもできる。

ＢＭＰ−１、またはＢＭＰ−１および他の血管新生関連因子の組み合わせを用いることによって、間葉系細胞もしくは間質細胞などの血管新生促進支持細胞の生存を増強し得る。

組成物は、伸張したＥＣもしくはＥＣＦＣ、およびＢＭＰ−１のうちの１種以上、またはＢＭＰ−１および他の血管新生促進因子のうちの１種以上と、薬理学的に許容される希釈液、担体または賦形剤とを含んで構成してもよい。

好ましくは、組成物は固体、液体または懸濁液の形態であり、短期間または長期間にわたって徐々に放出されるように処方できる。

本発明の別の態様においては、ＢＭＰ−１、またはＢＭＰ−１および１種以上の他の血管新生関連因子の組み合わせを医療的治療または療法に使用できる。この種の治療は、虚血症状の治療を含み得る。

好ましくは、虚血症状は、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、発作、脳虚血、創傷癒合、肝臓虚血、肺虚血、または腎虚血から選択される。

組成物または処理剤は、何らかの適当な形態で投与し得る。ＢＭＰ−１ペプチドなどの活性成分を、従来の薬理学的に許容される担体、賦形剤、結合剤、安定剤などと混合することによって、適当な投与形態を調整し得る。注入の形態で投与するときは、薬理学的に許容される緩衝剤、可溶化剤、等張薬剤などを添加してもよい。注入の形態で投与するときは、薬理学的に許容される緩衝剤、可溶化剤、等張薬剤などを添加してもよい。

投与量は、病徴、年齢、身体重量、投与形態、投与回数などに応じて変化し得るが、成人の場合、１日あたり０．０００１〜３０００ｍｇの範囲であり得る。一括して投与してもよいし、またはいくつかの用量単位に分けてもよい。患者の必要性に従って投与量を増やしてもまたは減らしてもよい。

経口投与に適当な組成物としては、固体製剤、例えば、錠剤、粒子含有カプセル、液体含有カプセル、粉末含有カプセル、トローチ剤（液体充填のものを含む）、咀嚼物、マルチ粒子、ナノ粒子、ゲル剤、固溶体、リポソーム、フィルム、腔坐剤、スプレー剤および液体製剤が挙げられる。液体製剤としては、懸濁液、溶液、シロップおよびエリキシル剤が挙げられる。液体製剤は、例えば、サッシェから固体を再組成することによっても調整できる。

経口的に投与可能な組成物は、錠剤、カプセル、香錠、ペレット剤、丸薬、トローチ剤粉末、顆粒などの経口固体組成物の形態であってもよい。組成物は、患者の舌に接触して溶ける固体の形態であってもよく、例えば、崩壊錠の形態のものである。経口組成物としては、日常的に使ううえでより好都合な、賦形されたものが好ましい。

経口投与のための固体形態は通常、単位用量で提示され、補助剤、結合剤、希釈液、崩壊剤、分散剤、賦形剤、充填材、錠剤形成剤、滑剤、着色剤、香味料、減湿剤、湿潤剤、湿潤剤などの従来の添加剤を含有する。

丸薬、ペレットおよび錠剤は、当該技術分野における周知の方法に従ってコーティングしてもよい。経口固体製剤としては、腸溶コーティングを有する錠剤または顆粒などの従来の徐放性製剤が挙げられる。

適当な充填材としては、セルロース、マンニトール、ラクトース、その他の類似の薬剤が挙げられる。適当な崩壊剤としては、澱粉、ポリビニルピロリドン、デンプングリコール酸ナトリウムなどの澱粉誘導体が挙げられる。適当な潤滑油としては、例えば、ステアリン酸マグネシウムが挙げられる。薬理学的に許容される適当な湿潤剤としては、ドデシル硫酸ナトリウムが挙げられる。

固体の経口組成物は、混合物で調整され、調合、充填、錠剤形成などの従来の方法で調整し得る。反復的な調合操作によって、大量の充填材を用いた組成物全体に、活性剤を分散できる。そのような操作は当然、当該技術分野において慣用されている。

非経口投与に適当な組成物としては、注入可能な水溶液、不融性水溶液、または油性の配合物、混合物、懸濁液、溶液、エマルジョン、および低粘度のゲル調製が挙げられる。非経口投与のための組成物は、速放および／または放出調整が可能になるように処方してもよい。放出調整製剤は、遅延放出、持続放出、パルス状放出、放出制御、ターゲット放出、およびプログラム放出を含む。

組成物はまた、懸濁剤などの補助剤（例えば、メチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アルミニウムステアラートゲル、水素添加脂）、乳化剤（例えば、レシチン、モノオレイン酸ソルビタン、またはアカシア）、防腐剤（例えば、メチルｐ−ヒドロキシベンゾアート、プロピルｐ−ヒドロキシベンゾアート、ソルビン酸）、ポリソルベート（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０）、必要に応じて従来の着色剤および湿潤剤、ならびに蔗糖、ラクトース、澱粉などの不活性希釈剤を含有してもよい。

本発明の他の態様においては、伸長したＥＣもしくはＥＣＦＣ、またはＡＤＡＭＴＳ−１、アンギオゲニン（Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）、アンギオポエチン−１（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１）、アンギオスタチン（Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、ＢＭＰ−１、ＥＧＦ、ＥＧ−ＶＥＧＦ、エンドスタチン（Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、ＦＧＦａ、ＦＧＦｂ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、プロラクチン（Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ）、ＴＩＭＰ−１、プロコラーゲンＩ型、およびｕＰＡなどの血管新生関連因子のうちの１種以上を含む医療インプラントが提供されている。ＥＣまたはＥＣＦＣは、本発明に記載されている方法で調製してもよい。

インプラントは人工組織移植、ステント生体組織移植片、無細胞組織移植片、経皮パッチ、または薄膜であってよい。

インプラントは、ＢＭＰ−１またはＢＭＰ−１および１種以上の他の血管新生関連因子の組み合わせから選択される、血管新生関連因子を含むことが好ましい。

以下、次の図面および実施例のみを挙げ、本発明を例示によって説明する。

図１は、心臓由来細胞の特性を示す図である。図１Ａは、フィブロネクチンでコーティングしたプレート上で培養された外植片、心筋細胞集塊、および心筋細胞集塊由来の細胞（ＣＤＣ）の典型画像である。図１Ｂは、虚血性心疾患を患う患者２８人の心房性および心室生検からのフェーズブライト（ｐｈａｓｅ−ｂｒｉｇｈｔ）細胞の数を示した図である。図１Ｃは、心房および心室生検で得られた心筋細胞集塊の典型画像である。図１Ｄは、フローサイトメトリーで定量された細胞表面マーカーの発現を示した図である。図１Ｅは、２人の患者から得られたＣＤＣ（ＣＤＣ１およびＣＤＣ２）の骨、脂肪および軟骨の形成分化を示す典型画像であり、骨髄間葉原種（ＢＭＳＣ）と比較して示してある。図１Ｆは、ＧＡＴＡ４の発現を示した図である。図１Ｇは、ＡＣＴＡ２（α−平滑筋アクチン）の発現を示した図である。これらは、５人の患者における心臓細胞マーカーおよび平滑筋細胞マーカーの例としてＲＴ−ＰＣＲ法で評価された。ハウスキーピング遺伝子の発現は、β−２−ミクログロブリンに対する相対パーセンテージ（％）で報告されている。骨髄間葉間質細胞（ＢＭＳＣ）、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、臍帯血（ＵＢＣ）ＣＤ１３３陽性細胞、およびヒト心臓からの総ｍＲＮＡが、ＲＴ−ＰＣ分析用の対照群として用いられた。図２は、インビトロにおける心筋細胞集塊由来細胞の血管新生促進能力を示す図である。図２Ａは、ＧＦＰ標識ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）と骨髄間葉系幹細胞（ＢＭＳＣ）との共培養を示す典型画像である。図２Ｂは、ＧＦＰ標識ＨＵＶＥＣと心筋細胞集塊由来細胞（ＣＤＣ）との共培養を示す画像である。図２Ｃは、ＧＦＰ標識ＣＤＣとＢＭＳＣとの共培養を示す画像である。図２Ｄは、血管新生促進能力が「強い」患者２６（Ｐｔ２６）のＣＤＣで支持された血管の典型画像である。図２Ｅは、血管新生促進能力が「弱い」患者２５（Ｐｔ２５）のＣＤＣで支持された血管の典型画像である。図２Ｆは、例証のため患者１０および患者１４（Ｐｔ１０およびＰｔ１４）のプロコラーゲンＩ型免疫反応性（赤）および核（青）と、ＣＤＣの血管新生能力とを対照して示した典型画像である。図２Ｇは、患者１０人から採取されたＣＤＣ内のプロコラーゲンＩ型免疫反応性が、「弱い」群と「強い」群との間で有意に異なることを示した図である。図３は、虚血性心疾患患者からの心臓由来細胞（ＣＤＣ）の血管新生促進能力を示す図である。図３Ａは、インビトロにおける脈管構造の典型画像である。図３Ｂは、患者から採取されたＣＤＣ内の骨形成タンパク質（ＢＭＰ）１タンパク質（上図）および骨髄由来の間葉間質細胞（ＢＭＳＣ）の、ウェスタンブロットによる各発現レベルを示した図である。図３Ｃは、対照群細胞ＢＭＳＣと比較した、ＣＤＣ内のＢＭＰ−１の相対的発現レベルを示した図である。図４は、ＢＭＰ１活性の阻害による血管新生の低下を示した図である。図４Ａは、ＢＭＰ１特異的阻害剤の非存在下（対照群−白いバー）または存在下（阻害剤を用いた群−濃いバー）での血管新生を相対的に示した図である。図４Ｂは、ＢＭＰ１阻害剤の存在下および非存在下における１４日目の共培養の典型画像である。図５は、ｓｉＲＮＡによりＢＭＰ１をノックダウンした場合の血管形成の抑制を示した図である。図５Ａは、非標的対照群（対照群−白いバー）または特異的ＢＭＰ１（濃いバー）のｓｉＲＮＡオリゴで処理された群との細胞内の血管新生を相対的に示した図である。図５Ｂは、４日目に採取された血管網の典型画像である。図６は、細胞の血管新生促進の可能性と負の相関を持つ血管新生因子の差次的発現を示した図である。図６Ａは、ＡＤＡＭＴＳ−１の図である。図６Ｂは、アンギオゲニン（Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）の図である。図６Ｃは、アンギオポエチン−１（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１）の図である。図６Ｄは、アンギオスタチン（Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）の図である。図６Ｅは、ＥＧＦの図である。図６Ｆは、ＥＧ−ＶＥＧＦの図である。図６Ｇは、エンドスタチン（Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）の図である。図６Ｈは、ＰＤＧＦ−ＡＡの図である。図６Ｉは、ＰＤＧＦ−ＡＢの図である。図６Ｊは、プロラクチン（Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ）の図である。図６Ｋは、ＴＩＭＰ−１の図である。図６Ｌは、ｕＰＡの図である。図７は、血管新生タンパク質の差次的発現は、心臓由来細胞（ＦＧＦａおよびＦＧＦｂ）の血管新生促進能力と正の相関を持つことを示した図である。図７Ａは、ＦＧＦａの図である。図７Ｂは、ＦＧＦｂの図である。図８は、種々の供与源から内皮コロニー形成細胞（ＥＣＦＣ）／遅発生成細胞を示す図である。コラーゲンでコーティングしたプレートに単核細胞を塗布して、臍帯血（ＵＣＢ）および成体の末梢血（ＰＢ）からＥＣＦＣ／遅発生成細胞が採取された。図８Ａは、内皮様コロニーの図である。図８Ｂは、内皮様コロニーを計数しプラスチック製クローニングリングで単離して、培養にてさらに経路２まで伸張したことを示す図である。図８Ｃは、ＨＵＶＥＣなどの内皮細胞の特性を示す玉石状の単層として成長するＥＣＦＣ／遅発生成細胞を示す図である。図８Ｄは、ＵＣＢおよび成体ＰＢから採取されたＥＣＦＣの比較分析を示す図である。この比較分析は、成体ＰＢから単離されたＥＣＦＣ／遅発生成細胞の数がＵＣＢからの細胞の数を下回ることを示している。図９は、ＧＦＰおよびＢＭＰ１の発現に使用されるＨＩＶベースのレンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ）ベクター系の概略図である。図９Ａは、緑色蛍光タンパク質を発現するレンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ）ベクターゲノム（ＬＶ−ＧＦＰ）または骨形成タンパク質−１（ＬＶ−ＢＭＰ１）を発現するレンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ）ベクターゲノムの図である。図９Ｂは、レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ）パッケージングベクターの図である。図９Ｃは、ＶＳＶ−Ｇエンベロープ構造の図である。図９Ｄは、３種のプラスミド同時トランスフェクション方法を用いてＬＶ−ＧＦＰ粒子およびＬＶ−ＢＭＰ１粒子を生成し、標的細胞に対して標準方法を用いて滴定するようすを示した図である。図１０は、内皮細胞をエキソビボで伸張する方法を示した図である。ＵＣＢから採取されたＨＵＶＥＣやＥＣＦＣ／遅発生成細胞などの内皮細胞は、ＧＦＰを発現するレンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ）ベクターで標識されている。図１０Ａは、ＧＦＰ標識細胞が、心臓由来間質細胞（ＣＤＣ；図Ａ）またはＬＶ−ＢＭＰ１で形質導入された骨髄由来間葉間質細胞（ＢＭＳＣ；図Ａ）のどちらかの支持細胞と共培養されたことを、漸増して示した感染多重度（ＭＯＩ１〜１０）の各々にて例示した図である。支持細胞がＢＭＰ１を発現した培養において「緑の」ＨＵＶＥＣの数は、擬形質導入細胞（ＭＯＩ＝０）と比較して、有意に増加した。形質導入された細胞の総ゲノムＤＮＡからのＬＶゲノム内に存在するＷＰＲＥ要素に対応する５６４塩基対のＤＮＡ断片を増幅することによって、ＬＶ−ＢＭＰ１ゲノムが細胞宿主染色体に挿入されたかどうかの確認が行われた。図１０Ｂは、ＷＰＲＥが形質導入細胞内には存在するが擬形質導入細胞（ＭＯＩ＝０）内に存在しないことからＬＶ−ＢＭＰ１ゲノムの組み込みが確認されることを示す図である。インテグレーションアッセイでは、β−アクチン遺伝子の２０８塩基対のＤＮＡ断片の増幅を対照群として用いた。予期したとおり、形質導入された細胞により発現されたＢＭＰ１タンパク質の量は増加した。図１０Ｃは、ＬＶ−ＢＭＰＩで形質導入されたヒトＢＭＳＣまたはＣＤＣの総細胞抽出物をＢＭＰ１特異抗体と共に精査し、ＨＲＰ標識二次抗体を使用してウェスタンブロッティングで検出したことを示す図である。ウェスタンブロットでは装填対照群としてα−チューブリン（α−ｔｕｂｕｌｉｎ）が使用された。図１１は、内皮細胞の代謝の上昇を示す図である。漸増して示したＭＯＩ（１〜１０）の各々にて、ＬＬＶ−ＢＭＰ１で形質導入された細胞からの調整培地でＨＵＶＥＣを２〜４日間インキューベートし、形質導入されなかった対照群と比較した。細胞は、ＭＴＴと共に３〜４時間インキューベートされた後、ＤＭＳＯでインキューベートされた。５７０ｎｍでの吸光度を処理済みおよび未処理のＨＵＶＥＣで測定した。５７０ｎｍでの吸光度の増加に伴い、細胞はＢＭＰ−１の存在下で培養したときに代謝速度の上昇を呈した。図１２は、内皮化促進を示す図である。漸増して示したＭＯＩ（１〜１０）の各々にて、ＬＬＶ−ＢＭＰ１で形質導入された細胞からの調整培地でＨＵＶＥＣを２〜４日間インキューベートし、形質導入されなかった対照群と比較した。次いで、細胞を回収し、計数した。細胞周期分析用に、細胞は透過処理され、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）およびＤＡＰＩで染色された。細胞内のＤＮＡ含量は、フローサイトメトリーで分析された。細胞周期のＧ１期、Ｓ期、またはＧ２／Ｍ期における細胞の比率（％）が定量された。細胞増殖アッセイ用に、処理済みおよび未処理の細胞が７０％エタノールで固定され、アイソタイプ対照抗体またはＫｉ６７抗体で染色された。ＨＵＶＥＣへのＫｉ６７の組み込みは、フローサイトメトリーで分析された。

実施例１
ヒト心臓幹細胞／始原細胞の単離、伸張および特徴付け
ヒト心臓始原細胞を単離し、事前に細胞単離を行わずにその心筋細胞集塊形成能力を介してエキソビボで伸張させた。規定されたプロトコールに従い、オフポンプ心臓手術を受けた患者からの組織生検（心房および心室）から細胞を単離した（（Ｓｍｉｔｈ，Ｂａｒｉｌｅｅｔａｌ．２００７）、および図１Ａを参照）。平板培養後の７〜１４日、フェーズブライト（Ｐｈａｓｅ−ｂｒｉｇｈｔ）細胞を、間質様細胞の単層を通じて脱落させた。これらの細胞は、サイトカインの存在下で培養すると、心筋細胞集塊と呼ばれる３次元構造を形成する。フェーズブライト（Ｐｈａｓｅ−ｂｒｉｇｈｔ）細胞の数、および心筋細胞集塊の数および寸法は、平板培養された細胞の数の関数として記録された。集団倍加時間および心筋細胞集塊由来の細胞（ＣＤＣ）の細胞成長速度を定量し、フローサイトメトリーで表現型解析を実行した（図１Ｄを参照）。心房（黒）および心室（グレー）の生検で得られたＣＤＣは、造血（ＣＤ４５）および内皮（ＣＤ３１）マーカーの発現を欠くが、ＣＤ９０およびＣＤ１０５（間葉マーカー）に対して陽性であった。一部の細胞は、ＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）、幹細胞マーカーも発現した。心筋細胞集塊の形成能力および血管新生促進能力を共に有する心臓由来細胞を、心房生検で富化されたことを確認し、その後で心室試料と比較した。２人の患者からの分化ＣＤＣ（骨、脂肪、および軟骨の形成系列）は外観上、対照群である骨髄間葉原種（ＢＭＳＣ）と類似していた（図１Ｅ）。ＧＡＴＡ４の発現（図１Ｆ）およびＡＣＴＡ２（α−平滑筋アクチン、図１Ｇ）の発現を、５人の患者における心臓細胞マーカーおよび平滑筋細胞マーカーの例としてＲＴ−ＰＣＲ法で評価した。ハウスキーピング遺伝子の発現は、β−２−ミクログロブリンに対する相対パーセンテージ（％）で報告された。骨髄間葉間質細胞（ＢＭＳＣ）、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、臍帯血（ＵＢＣ）ＣＤ１３３陽性細胞、およびヒト心臓からの総ｍＲＮＡが、ＲＴ−ＰＣＲ分析用の対照群として用いられた。

結果から、心筋細胞集塊形成細胞がヒト心臓の心房内で富化されたことと、これらの細胞が系列特異的マーカー発現および分化能力の点で間葉原種に似ていることが立証された。

実施例２
血管網の形成または支持に関する評価
ＣＤＣの血管および間葉能力を、血液または骨髄から誘導されたＥＰＣ／ＭＳＣと比較し、これを血管新生の確立済みインビトロモデルを使用して調査した（Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．，２００９）。ヒト内皮細胞を、低感染多重度（ＭＯＩ１〜３）にて、ＧＦＰ細胞を発現するＶＳＶ−Ｇ偽型レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ）ベクターで形質導入し、細胞増殖に有害な影響を及ぼすことなしに形質導入効率が９５％を超えるようにした（Ｍａｒｔｉｎ−Ｒｅｎｄｏｎ、結果は非公開）。形質導入された細胞は、内皮成長生育培地で１４日間支持細胞と共培養された。これにより、脈管管状構造の形成が可能になる。この期間中に管状構造の成長が監視された。ＡｎｇｉｏＳｙｓソフトウェアパッケージ（ＴＳＣ生物製剤）を使用して、形成された細管の数、細管の総数、細管の平均長さ、および接合部の数を定量した。

結果（図２）は、ＢＭＳＣが、インビトロの血管（図２Ａ）に似た管状構造の形成を支持し得ることを示している。ＣＤＣは血管形成も支持し得る（図２Ｂおよび図２Ｃ）が、患者の試料同士の間では有意な差異が観測された。血管新生促進能力が「強い」患者２６（Ｐｔ２６）のＣＤＣで支持された血管、および血管新生促進能力が「弱い」患者２５（Ｐｔ２５）のＣＤＣで支持された血管の各典型画像をそれぞれ、図２Ｄおよび図２Ｅに示す。

実施例３
プロコラーゲンＩ型の発現および血管新生能力
血管新生能力の強い患者および弱い患者におけるプロコラーゲンＩ型の発現を調査する実験にて、それらの患者間で発現に差異を生じたことが立証された（図２Ｆおよび図２Ｇ）。患者１０人から採取されたＣＤＣ内のプロコラーゲンＩ型免疫反応性は、「弱い」群と「強い」群とで有意に異なる（図２Ｇ）。これらの結果は、ヒトＣＤＣがインビトロでの脈管構造の形成を支持すること、さらにはその血管新生促進能力が、細胞外基質成分の発現および析出と反比例的に相関することを立証している。

実施例４
虚血性心疾患患者からの心臓由来細胞（ＣＤＣ）の血管新生促進能力
さらに実験を実施し、虚血性心疾患患者１０人からそれぞれ単離された心臓由来細胞の血管新生促進能力を調査した。１０人の患者から採取された骨髄由来間葉細胞（ＢＭＳＣ）およびＣＤＣを、内皮生育培地でＧＦＰ標識ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）と１４日間共培養した。血管形成を１４日間にわたってモニターし、ＮｉｋｏｎＴＥ３００顕微鏡およびＰＣＩソフトウェアを使用して画像を撮影した。Ａｎｇｉｏｓｙｓソフトウェア（ＴＣＳＣｅｌｌｗｏｒｋｓ，ＵＫ）を使用して、細管の数、接合部および細管の総長さを数量化した。患者の細胞を、血管新生促進能力に応じて、２つの別個の群（強い群および弱い群）に分類した。患者２、８、１０、２３および２６から取り出されたＣＤＣが、強い血管新生能力を示したのに対して、患者１３、１４、２５、２７および２８から取り出されたＣＤＣは弱い血管新生能力を示した（図３Ａ）。

実施例５
骨形成タンパク質１の発現および血管新生促進能力
虚血性心疾患患者１０人から採取されたＣＤＣ、およびＢＭＳＣの各々にて、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）１タンパク質の発現を調査した。上記と同じ条件の下で細胞を生育し、細胞溶菌液を調合した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上には総タンパク約３０μｇを装填した。タンパク質をナイロン製膜、ならびに抗ヒトＢＭＰ−１抗体（Ｒ＆Ｄシステム）および抗チューブリン抗体でプローブされた膜へ移した（図３Ｂ）。

図３Ｃに示すように、ＢＭＰ１タンパク質の相対濃度をデンシトメトリーで測定した。患者の試料中のＢＭＰ１タンパク質レベルを、健常ドナー（白いバー）からのＢＭＳＣ中のＢＭＰ１発現レベルに正規化した。患者１０人のうちの９人において、血管新生促進能力とＢＭＰ１タンパク質レベルとの間に、正相関が認められた。概して、血管新生促進能力の強いＣＤＣ（黒いバー）のＢＭＰ−１レベルは、中央値レベルに等しいかそれを上回った（約７５％以上は横線でマークされた）。対照的に、血管新生促進能力の弱いＣＤＣ（グレーのバー）は、中央値を下回るＢＭＰ１タンパク質レベルを示した。Ｐｔ２８は例外である。以上の結果をまとめると、慢性虚血性心疾患患者から採取されたＣＤＣにおける血管新生促進能力と、その細胞内のＢＭＰ１タンパク質レベルとの間には相関があることが示される。

阻害剤を使用して、血管新生に対するＢＭＰ１の影響をさらに調査した。上記と同様に、２人の患者（Ｐｔ０５およびＰｔ０７）から採取されたＢＭＳＣおよびＣＤＣを、内皮生育培地で１４日間ＧＦＰ標識ＨＵＶＥＣと共培養した。培養菌を１０ｕＭのＢＭＰ１阻害剤で１４日間処理した。培地を３日ごとに入れ替えて、新鮮な阻害剤を添加した。Ａｎｇｉｏｓｙｓソフトウェアを使用して、細管の数、接合部、および細管の総長さを上記のように数量化した。阻害剤（（＊）ｐ＜０．０５）で処理された細胞内の細管、接合部および細管長さが有意な低下を呈した場合の、健常なドナーおよび２人の患者の結果を、図４Ａに示す。ＢＭＰ１阻害剤の非存在下および存在下での共培養１４日目の典型画像を、図４Ｂに示す。ＢＭＰ１活性を阻害すると、血管新生に悪影響が及ぶ。ＢＭＰ１阻害剤で処理された後の細胞において血管形成能力の低下が認められたことは、ＢＭＰ１が、血管形成を抑制する因子の１つであることを示す。

血管新生に対するＢＭＰ１の影響を、小さい阻害性ＲＮＡを使用して、さらに調査した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを製造元の指示に従い使用して、２人の患者から（Ｐｔ０５およびＰｔ０７）採取された健常ドナーおよびＣＤＣからのＢＭＳＣを、ｓｉＲＮＡオリゴでトランスフェクションした。約２４時間のポスト形質移入にて、４日間および７日間、細胞が内皮生育培地でＧＦＰ標識ＨＵＶＥＣと共培養された。非標的対照群（対照群−白いバー）または特異的ＢＭＰ１（濃いバー）のｓｉＲＮＡオリゴのどちらかで処理された細胞内の相対的な血管新生を、図５Ａに示す。ＢＭＰ１のｓｉＲＮＡ（（＊）ｐ＜０．０５）で処理された培地では、非標的対照群のｓｉＲＮＡで処理された培地と比較して、細管、接合部および細管長さが有意な低下を呈した図５Ｂに、４日目で採取した血管網の典型画像を示す。ｓｉＲＮＡの発現が一時的であったため、４日間および７日間に限定して培養をモニターした。このため、この血管網および図４Ｂに示す網（１４日目で採取された）が成長しなかったことは、注目に値する。にもかかわらず、管状構造が形成されたことは明らかであった。血管新生促進細胞におけるＢＭＰ１の発現の特異的減少によって、血管新生が減衰した。このことは、ＢＭＰ１が心臓における血管新生の調整因子の１つとなり得ることを示唆している。

実施例６
さらなる血管新生因子の発現および血管新生促進能力
データは、少なくとも２つの患者群（血管新生能力が「高度の」患者群と「低度の」患者群）が存在し得ることを示唆している。データを総括すると、心臓由来細胞の血管新生を支持する能力と、それらの細胞における一部の細胞外基質成分（例えば、プロコラーゲンＩ型）の発現との間には、逆相関があると思われる（図２）。また、細胞増殖と血管新生促進能力との間にも相関が存在する（Ｍａｒｔｉｎ−Ｒｅｎｄｏｎ、結果は非公開）。

管状構造の成長を支持するため、血管新生促進能力の「良好」な患者と「不良」患者のそれぞれからの心臓由来細胞を、標準条件下にて内皮生育培地で生育した。次いで、細胞を遠心し、前述したように細胞溶菌液を調合した。総タンパクは標準技術で数量化された。タンパク質アレイをプローブするために、細胞溶菌液（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ製のＰｒｏｔｅｏｍｅＰｒｏｆｉｌｅｒアレイ）を使用した。ここで、５５種の血管新生関連タンパク質に対して選択された捕捉抗体は、ニトロセルロース膜上に複製して観測された。非特異的に結合する抗体に対しては、膜をブロックした後、約１００ｇの総タンパクでインキューベートした。次いで、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ（Ｓｔｒｅｐ−ＨＲＰ））および化学発光検出試薬を使用して、膜上に固定された捕捉抗体に結合した検体複合体が検出された。生成された化学発光信号は、結合された検体の量に直接相関していた。陽性信号をＸ線フィルム上に現像し、画像分析ソフトウェアを用いてさらにスキャンし、数量化した。各血管新生関連のタンパク質を表す複製スポット対の信号を平均し、形態陰性対照スポットから信号を減じることによって、平均ピクセル密度（ＭＰＤ）を定量した。得られた結果を図６および７に示す。ＡＤＡＭＴＳ−１（図６Ａ）、アンギオゲニン（Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）（図６Ｂ）、アンギオポエチン−１（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１）（図６Ｃ）、アンギオスタチン（Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）（図６Ｄ）、ＥＧＦ（図６Ｅ）、ＥＧ−ＶＥＧＦ（図６Ｆ）、エンドスタチン（Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）（図６Ｇ）、ＰＤＧＦ−ＡＡ（図６Ｈ）、ＰＤＧＦ−ＡＢ（図６Ｉ）、プロラクチン（Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ）（図６Ｊ）、ＴＩＭＰ−１（図６Ｋ）、ｕＰＡ（図６Ｌ）の発現は、細胞の血管新生促進能力と負の相関を持つ（すなわち、これらの因子の発現は、弱い血管新生能力を呈する細胞においてより顕著であった）。ＦＧＦａ（図７Ａ）およびＦＧＦｂ（図７Ｂ）の発現は、心臓由来細胞血管新生促進能力と正の相関を持つ（すなわち、これらの因子の発現は、強い血管新生能力を呈する細胞においてより顕著であった）。

実施例７
血液からの内皮コロニー形成細胞（ＥＣＦＣ）の単離
臍帯血（ＵＣＢ）または成体末梢血（ＰＢ）から、ＥＣＦＣ／遅発性生成細胞を単離した。概して、５０〜１２０ｍｌのＵＣＢまたは５０ｍｌのＰＢを使用した。前述したプロトコール（Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．２００９）に従って、ＵＣＢおよびＰＢに存在する単核細胞（ＭＮＣ）分画をフィコール密度勾配遠心分離で単離した。コラーゲンコーティングした６穴ウェルプレートでＭＮＣ類を２×１０^６／ウェルの密度にて平板培養し、ＥＧＭ−２などの内皮生育培地で２〜４週間培養した。内皮様コロニー（図８Ａ）を同定し、計数した。個々のコロニーをプラスチック製のクローニングリングで単離し、内皮生育培地でさらに集密度になるように伸張した（図８Ｂ）。ＵＣＢおよびＰＢのＥＣＦＣは、ＨＵＶＥＣなどの内皮細胞に特徴的な玉石状の単層を形成する（図Ｃ）。ＵＣＢおよび成体のＰＢから採取されたＥＣＦＣの数を図８Ｄに示す。

実施例８
内皮細胞およびＥＣＦＣの伸長方法
実施例７に従って、臍帯（ＨＵＶＥＣ）から、もしくは臍帯血のＭＮＣ分画から、内皮細胞（ＥＣ）および内皮コロニー形成細胞（ＥＣＦＣ）をエキソビボで単離するか、または成体の末梢血（ＥＣＦＣ）ＭＮＣをコラーゲンコーティングしたプレートで平板培養し、支持細胞と共培養した。内皮生育条件での培養中に１種以上の血管新生関連因子、好ましくはＢＭＰ−１にＥＣまたはＥＣＦＣを接触させ、少なくとも１週間またはそれ以上、好ましくは２週間維持し得る。血管新生関連因子を、組み換え型ポリペチドまたはタンパク質として細胞培地に添加してもよいし、支持細胞によって生成してもよい。ＥＣまたはＥＣＦＣを、支持細胞を以前に培養した調整培地に接触してもよい。支持細胞を、ウイルスベクターシステムを使用して短期間または長期間でこの種の因子を生成するように遺伝的に修飾しておくことも、またはこの種の血管新生関連因子の発現を修飾するための薬剤で処理しておくこともできる。

データは、成体ヒトＰＢ内のＥＣおよびＥＣＦＣの数が少ないことを示唆している。治療的血管新生においてＥＣおよびＥＣＦＣを大量に使用するうえでの課題の１つは、これらの細胞をエキソビボで伸張することである。提示されたデータは、支持細胞における血管新生とＢＭＰ−１のタンパク質発現レベルとの間に直接的な正相関があることを示唆している（図３）。ヒトＢＭＰ−１遺伝子のｃＤＮＡは、哺乳類発現ベクターｐＥＺＭ０９中のＬａｂＯｍｉｃｓ（ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）から採取された。ＢＭＰ−１ｃＤＮＡを適切な制限酵素で消化し、親プラスミドから切除し、（ＡｄｒｉａｎＴｈｒａｓｈｅｒ教授の好意により提供された）レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ）ベクター（ＬＶ）ゲノム含有のプラスミドに若干の修正を加えてクローンした。このシステムで、ベクターゲノム内の脾臓フォーカス形成ウイルス（ｓＦＦｖ）プロモータの制御下にて（ヒトＢＭＰ−１ｃＤＮＡを発現した図９Ａ）。上述のＧＦＰに使用したものと同じパッケージングレンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ）ベクタープラスミド（図９Ｂ）および同じＶＳＶ−Ｇ発現プラスミド（図９Ｃ）を使用し、３種のプラスミド同時トランスフェクション方法を用いて、ＬＶ−ＢＭＰ１ウイルス粒子を生成した（図９Ｄ）（Ｓｏｎｅｏｋａｅｔａｌ．，１９９５）。約４８時間のポスト形質移入にて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の上澄みから粒子を採取した（図９Ｄ）。ＬＶ−ＢＭＰ１ウイルス株をＬＶ−ＧＦＰウイルス株と平行して滴定した。約２×１０^６〜２×１０^７／ｍｌの形質導入単位が採取された。骨髄（ＢＭＳＣ）または心臓組織（ＣＤＣ）の何れかから取り出された支持間質細胞を、１〜１０の範囲のＭＯＩの各々にて形質導入した。形質導入から２日後に、支持細胞をＧＦＰ標識ＨＵＶＥＣまたはＵＣＢのＥＣＦＣと２週間共培養した。

支持細胞がＢＭＰ１を発現する培養において、緑色のＥＣＦＣおよびＨＵＶＥＣの数（図１０Ａ）は、擬形質導入された細胞と比較して有意に増加した（図１０Ａ）。

実施例９
内皮細胞の代謝促進
実施例８に記載されているように、漸増して示したＭＯＩ（ＭＯＩ１〜１０）の各々にて、骨髄由来または心臓由来の間葉／間質細胞をＬＶ−ＢＭＰ１粒子で形質導入した。約４８時間のポスト形質導入にて培地を入れ替え、さらに４８時間放置した。形質導入された細胞および形質導入されなかった細胞の調整培地を収集し、その細胞片を低速遠心分離にて取り除き、ＨＵＶＥＣの培養に使用した。ＭＴＴアッセイなどの標準アッセイを使用して、内皮細胞の代謝期が特定された。ＨＵＶＥＣは９６穴ウェルプレートに５００細胞／ウェルにて播種された。２００μｌの調整培地を細胞自体に添加したか、または新鮮な培地と１：１の比率で混合した。ＨＵＶＥＣを調整培地と共に２〜４日間インキューベートし、その後、１ウェルあたり５０μｌのＭＴＴで細胞を処理し、３７℃で３〜４時間インキューベートした。上澄みを吸引し、約１００μｌのＤＭＳＯをウェルに添加した。５７０ｎｍでの吸光度には、対照群と比較した細胞の代謝状態が反映されている。

ＢＭＰ−１で形質導入された細胞の調整培地でＨＵＶＥＣを処理すると、５７０ｎｍでの吸光度が有意に上昇する。このことは、調整培地含有ＢＭＰ−１のＨＵＶＥＣ代謝の上昇を示している（図１１）。

実施例１０
内皮細胞増殖の促進
漸増して示したＭＯＩ（ＭＯＩ１〜１０）の各々にて、骨髄由来または心臓由来間葉／間質細胞をＬＶ−ＢＭＰ１粒子で形質導入した。形質導入細胞および形質導入されなかった細胞の調整培地を使用してＨＵＶＥＣを培養し、ＨＵＶＥＣ増殖に対する影響を定量した。ＨＵＶＥＣを約５×１０４細胞／ウェルとなるように６穴ウェルプレートに播種し、２ｍｌの調整培地と共に３７℃、５％ＣＯ２で２〜４日間インキューベートした。次いで、細胞を回収し、計数した。細胞周期解析用に、細胞を０．１％のＴｒｉｒｏｎＸ−１００で透過処理し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）およびＤＡＰＩで染色した。その際、以前に発行したプロトコール（ＰｏｚａｒｏｗｓｋｉおよびＤａｒｚｙｈｉｅｗｉｃｚ）に従った。ＨＵＶＥＣ処理細胞のＤＮＡ含有量をフローサイトメトリーで分析した（図１２）。典型的なヒストグラムに、細胞周期のＧ１期、Ｓ期、またはＧ２／Ｍ期における細胞のパーセンテージを条件ごとに示す。結果によると、ＢＭＰ−１含有の調整培地で処理されたＨＵＶＥＣがＧ２／Ｍにおける細胞の比率の増加を示したことが示唆される。この比率は、ＭＯＩ＝０の形質導入からの調整培地で処理された細胞における１３．６％から、ＭＯＩ＝１の形質導入からの培地で処理された細胞における１８．１％に増加した。Ｇ２／Ｍにおけるこの増加は、ＭＯＩ＝３および１０の形質導入から培地で細胞を処理した場合に維持される。

細胞増殖を定量するために、第２の方法も使用された。細胞を７０％エタノール中で２時間固定した。細胞をリン酸緩衝食塩水で洗浄し、１００μｌ中１０７細胞／ｍｌとなるように再懸濁させた。次いで、細胞をアイソタイプ対照抗体またはＫｉ６７抗体（両方の抗体はＦＩＴＣと共役されている）と共に３０分間インキューベートした。図１２に示すように、細胞に結合されたるＦＩＴＣ共役Ｋｉ６７をフローサイトメトリーで検出した。結果によると、形質導入された細胞からの調整培地でＨＵＶＥＣを処理した場合に、形質導入されなかった細胞と比較して、Ｋｉ６７陽性細胞のパーセンテージに増加があることが示唆される。以上の結果をまとめると、内皮細胞の代謝、細胞周期の進行、ならびに細胞増殖および／または細胞生存が促進されるのは、これらの細胞をＢＭＰ−１の存在下で培養した場合であることが示唆される。ＥＣまたはＥＣＦＣの代謝を上昇し得る血管新生関連因子は、ＥＣまたはＥＣＦＣに対して増殖を誘発するか、細胞生存を増強する。

参考文献
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８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（ＨａｒｌｏｗａｎｄＬａｎｅＥｄｓ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ）
９）Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ｒ．，Ｂａｒｉｌｅ，Ｌ．，Ｃｈｏ，Ｈ．Ｃ．，Ｌｅｐｐｏ，Ｍ．Ｋ．，Ｈａｒｅ，Ｊ．Ｍ．，Ｍｅｓｓｉｎａ，Ｅ．，Ｇｉａｃｏｍｅｌｌｏ，Ａ．，Ａｂｒａｈａｍ，Ｍ．Ｒ．，ａｎｄＭａｒｂａｎ，Ｅ．ＲｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅＰｏｔｅｎｔｉａｌｏｆＣａｒｄｉｏｓｐｈｅｒｅ−ＤｅｒｉｖｅｄＣｅｌｌｓＥｘｐａｎｄｅｄＦｒｏｍＰｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓＥｎｄｏｍｙｏｃａｒｄｉａｌＢｉｏｐｓｙＳｐｅｃｉｍｅｎｓ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２００７；１１５：８９６−９０８．
１０）Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｆｉｓｈｅｒ，Ｎ．，Ｎｅｗｅｙ，Ｓ．Ｅ．，Ｓｍｙｔｈｅ，Ｊ．，Ｔａｔｔｏｎ，Ｌ．，Ｔｓａｋｎａｋｉｓ，Ｇ．，Ｆｏｒｄｅ，Ｓ．Ｐ．，Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，Ｌ．，Ａｔｈａｎａｓｓｏｐｏｕｌｏｓ，Ｔ．，Ｈａｌｅ，Ｓ．Ｊ．，Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｔｙｌｅｒ，Ｍ．Ｐ．，ａｎｄＷａｔｔ，Ｓ．Ｍ．Ｔｈｅｉｍｐａｃｔｏｆｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆｕｍｂｉｌｉｃａｌｃｏｒｄ−ｄｅｒｉｖｅｄｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓａｎｄｈｙｐｏｘｉａｏｎｖａｓｃｕｌａｒｔｕｂｕｌｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎｖｉｔｒｏ．ＳｔｅｍＣｅｌｌｓＤｅｖ．２００９Ｍａｒ；１８（２）：３５９−７５．
１１）Ｗａｔｔ，Ｓ．Ｍ．，Ａｔｈａｎａｓｓｏｐｏｕｌｏｓ，Ａ．，Ｈａｒｒｉｓ，Ａ．Ｌ．ａｎｄＴｓａｋｎａｋｉｓ，Ｇ．Ｈｕｍａｎｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｓｔｅｍ／ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓ，ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃｆａｃｔｏｒｓａｎｄｖａｓｃｕｌａｒｒｅｐａｉｒ．ＪＲＳｏｃＩｎｔｅｒｆａｃｅ．２０１１，７（Ｓｕｐｐｌ６）：Ｓ７３１ −５１．
１２）ＣｒｉｔｓｅｒＰ．Ｊ．ａｎｄＹｏｄｅｒＭ．Ｃ．Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇｃｅｌｌｒｏｌｅｉｎ
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１３）ＥｓｅｓＭ．Ｌ，ＭｕｎｄＪ．Ａ．，ＩｎｇｒａｍＤ．Ａ．ａｎｄＣａｓｅＪ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓａｎｄｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓｕｂｓｅｔｓｉｎｈｕｍａｎｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄ．Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｃｙｔｏｍ．２０１０，５２：９．３３．１−９．３３．１１．
１４）ＦｉｓｃｈｅｒＣ，ＳｃｈｎｅｉｄｅｒＭ．ａｎｄＣａｒｍｅｉｉｅｔＰ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ
ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄａｒｔｅｒｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ．
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１５）Ｓｏｎｅｏｋａ，Ｙ．；Ｃａｎｎｏｎ，Ｐ．Ｍ．；Ｒａｍｓｄａｌｅ，Ｅ．Ｅ．；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊ．Ｃ；Ｒｏｍａｎｏ，Ｇ．；Ｋｉｎｇｓｍａｎ，Ｓ．Ｍ．ａｎｄＫｉｎｇｓｍａｎ，Ａ．Ｊ ? ｔｒａｎｓｉｅｎｔｔｈｒｅｅ−ｐｌａｓｍｉｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍｆｏｒｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｈｉｇｈｔｉｔｅｒｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｓ’ ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ１９９５，２３（４）：６２８−３３

Claims

細胞試料または組織試料の血管新生シグネチャを特定する方法において、
被検者から採取されたエキソビボ細胞試料または組織試料を用い、
（ａ）前記試料についてＡＤＡＭＴＳ−１、アンギオゲニン（Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）、アンギオポエチン−１（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１）、アンギオスタチン（Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、ＢＭＰ−１、ＥＧＦ、ＥＧ−ＶＥＧＦ、エンドスタチン（Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、ＦＧＦａ、ＦＧＦｂ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、プロラクチン（Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ）、ＴＩＭＰ−１、プロコラーゲンＩ型、およびｕＰＡからなる群から選択される少なくとも３種の血管新生関連因子の発現レベルを試験するステップ、
を含むことを特徴とする方法。
請求項１に記載の方法において、
（ｂ）ステップ（ａ）で測定された前記結果を基準発現レベルと比較するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）での前記比較結果を基に前記被検者の血管新生促進能力を予測するステップと、
をさらに含むことを特徴とする方法。
請求項２に記載の方法において、
ＡＤＡＭＴＳ−１、アンギオゲニン（Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）、アンギオポエチン−１（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１）、アンギオスタチン（Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、ＥＧＦ、ＥＧ−ＶＥＧＦ、エンドスタチン（Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、プロラクチン（Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ）、ＴＩＭＰ−１、プロコラーゲンＩ型、およびｕＰＡのうちの１種以上のレべル増加が、基準レベルと比較して血管新生促進能力と負の相関を持つことを特徴とする方法。
請求項２に記載の方法において、
ＦＧＦａ、ＦＧＦｂ、ＢＭＰ−１のうちの１種以上のレべル増加が、基準レベルと比較して血管新生促進能力と正の相関を持つことを特徴とする方法。
血管新生治療法の効能を予測する方法において、
請求項２乃至４の何れか１項に記載の方法を使用して被検者の前記血管新生促進能力を測定するステップと、
前記血管新生促進能力を、血管新生治療計画および被検者の結果に相関するモデルプロファイルと照合するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
血管新生能力を予測する予見モデルの作成方法において、
複数の被検者から採取されたエキソビボ細胞試料または組織試料を用い、
（ａ）各試料について、ＡＤＡＭＴＳ−１、アンギオゲニン（Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）、アンギオポエチン−１（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１）、アンギオスタチン（Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、ＢＭＰ−１、ＥＧＦ、ＥＧ−ＶＥＧＦ、エンドスタチン（Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、ＦＧＦａ、ＦＧＦｂ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、プロラクチン（Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ）、ＴＩＭＰ−１、プロコラーゲンＩ型、およびｕＰＡからなる群から選択される少なくとも３種の血管新生関連因子の発現レベルを試験するステップと、
（ｂ）前記各試料をインビトロおよび／またはインビボ血管新生アッセイで試験するステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）の前記結果をステップ（ｂ）の前記結果と照合するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
血管治療に用いる薬剤を同定する方法において、
被検者から採取されたエキソビボ細胞試料または組織試料を用い、
（ａ）前記試料を前記薬剤に接触させるステップと、
（ｂ）前記試料について、ＡＤＡＭＴＳ−１、アンギオゲニン（Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）、アンギオポエチン−１（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１）、アンギオスタチン（Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、ＢＭＰ−１、ＥＧＦ、ＥＧ−ＶＥＧＦ、エンドスタチン（Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、ＦＧＦａ、ＦＧＦｂ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、プロラクチン（Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ）、ＴＩＭＰ−１、プロコラーゲンＩ型、およびｕＰＡからなる群から選択される少なくとも３種の血管新生関連因子の存在またはレベルを試験するステップと、
（ｃ）前記血管新生関連因子の発現の存在および／またはレベルを、前記薬剤に接触していない試料における同じ前記血管新生関連因子の発現の存在および／またはレベルと比較するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
請求項１乃至７の何れか１項に記載の方法において、
前記試料が前記被検者の心臓組織もしくは血管組織、ウォートンジェリー（Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓＪｅｌｌｙ）、臍帯、臍帯血、末梢血、骨髄、胚性細胞、またはｉＰＳ細胞から採取されたものであることを特徴とする方法。
請求項８に記載の方法において、
前記試料が心房生検、心室生検、または静脈血管もしくは動脈血管からの生検であることを特徴とする方法。
請求項８または請求項９に記載の方法において、
前記試料が、骨格系、心臓系、内皮系もしくは間質系の支持細胞、または間葉系もしくは造血系の幹細胞または始原細胞、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を含んで構成されることを特徴とする方法。
請求項１０に記載の方法において、
前記心臓細胞が、心臓由来の始原細胞もしくは幹細胞、心筋細胞もしくは関連する心臓線維芽細胞、または血管細胞であることを特徴とする方法。
請求項１０に記載の方法において、
前記内皮細胞がウォートンジェリー（Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓＪｅｌｌｙ）、臍帯、末梢血、微小血管系、ＥＳまたはｉＰＳ由来の内皮細胞であることを特徴とする方法。
請求項１乃至１２の何れか１項に記載の方法において、
前記試験が前記ＲＮＡレベルおよび／またはタンパク質レベルでの遺伝子発現の測定を含むことを特徴とする方法。
請求項１乃至１３の何れか１項に記載の方法において、
前記試験がＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、または等温核酸増幅を含むことを特徴とする方法。
請求項１乃至１４の何れか１項に記載の方法において、
試験に先立って前記試料からの細胞を細胞培養で伸張することを特徴とする方法。
請求項１乃至１５の何れか１項に記載の方法において、
ＡＤＡＭＴＳ−１、アンギオゲニン（Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）、アンギオポエチン−１（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１）、アンギオスタチン（Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、ＢＭＰ−１、ＥＧＦ、ＥＧ−ＶＥＧＦ、エンドスタチン（Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、ＦＧＦａ、ＦＧＦｂ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、プロラクチン（Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ）、ＴＩＭＰ−１、プロコラーゲンＩ型、およびｕＰＡのうちの少なくとも５種を試験することを特徴とする方法。
請求項１乃至１６の何れか１項に記載の方法において、
ＡＤＡＭＴＳ−１、アンギオゲニン（Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）、アンギオポエチン−１（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１）、アンギオスタチン（Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、ＢＭＰ−１、ＥＧＦ、ＥＧ−ＶＥＧＦ、エンドスタチン（Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、ＦＧＦａ、ＦＧＦｂ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、プロラクチン（Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ）、ＴＩＭＰ−１、プロコラーゲンＩ型、およびｕＰＡを全て試験することを特徴とする方法。
細胞の前記血管新生促進能力を向上させる方法において、
被検者から採取されたエキソビボ細胞試料または組織試料を用い、
（ａ）前記試料について、ＡＤＡＭＴＳ−１、アンギオゲニン（Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）、アンギオポエチン−１（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１）、アンギオスタチン（Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、ＢＭＰ−１、ＥＧＦ、ＥＧ−ＶＥＧＦ、エンドスタチン（Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、ＦＧＦａ、ＦＧＦｂ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、プロラクチン（Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ）、ＴＩＭＰ−１、プロコラーゲンＩ型、およびｕＰＡからなる群から選択される少なくとも３種の血管新生関連因子の発現レベルを試験するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で測定された前記結果を基準発現レベルと比較するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）における比較の結果に基づいて前記被検者の血管新生促進能力を予測し、細胞培養における前記試料からの細胞を任意に伸張するステップと、
（ｄ）低酸素プレコンディショニング、（ｉｉ）薬理学的治療、および（ｉｉｉ）遺伝子組み換えのうちの１つ以上を使用して前記細胞を処理するステップをさらに含むことを特徴とする方法。
請求項１８に記載の方法において、
前記処理した細胞を前記被検者に移植するステップを、さらに含むことを特徴とする方法。
内皮細胞（ＥＣ）および内皮コロニー形成細胞（ＥＣＦＣ）をエキソビボで伸長するための方法において、
内皮生育条件での培養中に、ＥＣおよびＥＣＦＣを１種以上の血管新生関連因子に接触する前記ステップを含むことを特徴とする方法。
請求項２０に記載の方法において、
細胞を少なくとも１週間維持することを特徴とする方法。
請求項２０または２１に記載の方法において、
前記血管新生関連因子が組み換え型ポリペチドまたはタンパク質であることを特徴とする方法。
請求項２０乃至２２の何れか１項に記載の方法において、
支持細胞が提供されることを特徴とする方法。
請求項２３に記載の方法において、
前記支持細胞が、間質細胞、骨髄細胞、心臓組織細胞、臍帯血細胞、ウォートンジェリー（Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓＪｅｌｌｙ）、血管周囲細胞、脂肪組織、微小血管由来の間葉系／間質細胞、成体および胎児の皮線維芽細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）由来の支持間質細胞から選択されることを特徴とする方法。
請求項２３または２４に記載の方法において、
血管新生関連因子を発現するように、前記支持細胞を遺伝的に修飾することを特徴とする方法。
請求項２０乃至２５の何れか１項に記載の方法において、
前記内皮細胞またはＥＣＦＣが胎児、新生児、成人、またはウォートンジェリー（Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓＪｅｌｌｙ）、臍帯、臍帯血、末梢血、大血管もしくは小血管、微小血管系、ＥＳもしくはｉＰＳ由来の内皮細胞、ＵＣＢ、ＰＢ、または脈管系などの組織から採取されることを特徴とする方法。
請求項２６に記載の方法において、
前記細胞は自系または同種異系であることを特徴とする方法。
請求項２０乃至２７の何れか１項に記載の方法において、
前記血管新生関連因子がＡＤＡＭＴＳ−１、アンギオゲニン（Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）、アンギオポエチン−１（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１）、アンギオスタチン（Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、ＢＭＰ−１、ＥＧＦ、ＥＧ−ＶＥＧＦ、エンドスタチン（Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、ＦＧＦａ、ＦＧＦｂ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、プロラクチン（Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ）、ＴＩＭＰ−１、プロコラーゲンＩ型、およびｕＰＡからなる群から選択されることを特徴とする方法。
請求項２０乃至２８の何れか１項に記載の方法において、
前記血管新生関連因子がＢＭＰ−１であるか、またはＢＭＰ−１と１種以上の血管新生関連因子との組み合わせであることを特徴とする方法。
前記虚血症状治療用の前記薬剤調製における、伸張したＥＣまたはＥＣＦＣの使用。
請求項３０に記載の使用において、
前記虚血症状が冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、発作、脳虚血、創傷癒合、肝臓虚血、肺虚血、または腎虚血から選択されることを特徴とする使用。
請求項３０または３１に記載の使用において、
ＡＤＡＭＴＳ−１、アンギオゲニン（Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）、アンギオポエチン−１（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１）、アンギオスタチン（Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、ＢＭＰ−１、ＥＧＦ、ＥＧ−ＶＥＧＦ、エンドスタチン（Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、ＦＧＦａ、ＦＧＦｂ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、プロラクチン（Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ）、ＴＩＭＰ−１、プロコラーゲンＩ型、およびｕＰＡから選択される前記血管新生関連因子が生成されるように、前記ＥＣまたは前記ＥＣＦＣを修飾することを特徴とする使用。
請求項３０乃至３２の何れか１項に記載の使用において、
虚血症状を有する被検者の再内皮化を前記ＥＣまたはＥＣＦＣによって容易にすることを特徴とする方法。
伸張したＥＣもしくはＥＣＦＣ、または血管新生関連因子うちの１種以上を含んで構成されることを特徴とする、医療インプラント。
請求項３４に記載の医療インプラントにおいて、
前記ＥＣまたは前記ＥＣＦＣが請求項２０乃至２９で定義された前記方法で調整されることを特徴とする、医療インプラント。
請求項３３、３４または３５の何れか１項に記載の医療インプラントにおいて、
前記インプラントが人工組織移植、ステント生組織移植片、無細胞組織移植片、経皮パッチ、または薄膜から選択されることを特徴とする、医療インプラント。
請求項３４乃至３６の何れか１項に記載の医療インプラントにおいて、
前記血管新生関連因子がＢＭＰ−１であるか、またはＢＭＰ−１と１種以上の他の血管新生関連因子との組み合わせであることを特徴とする方法。
伸張したＥＣもしくはＥＣＦＣ、およびＢＭＰ−１のうちの１種以上、またはＢＭＰ−１および他の血管新生促進因子のうちの１種以上と、薬理学的に許容される希釈液、担体または賦形剤とを含んで構成されることを特徴とする、製薬用組成物。
請求項３８に記載の製薬用組成物において、
前記組成物が固体、液体または懸濁液の形態であることを特徴とする、製薬用組成物。
請求項３８または３９に記載の製薬用組成物において、
前記組成物が短期または長期にわたって徐々に放出されるように処方されることを特徴とする、製薬用組成物。
医療的治療または療法における、ＢＭＰ−１、またはＢＭＰ−１および１種以上の他の血管新生関連因子の組み合わせの使用。
前記虚血症状治療用の前記薬剤調製における、ＢＭＰ−１、またはＢＭＰ−１および１種以上の他の血管新生関連因子の組み合わせの使用。
請求項４２に記載の使用において、
前記虚血症状が冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、発作、脳虚血、創傷癒合、肝臓虚血、肺虚血、または腎虚血から選択されることを特徴とする使用。