JP2013527126A - ヒドロキシチロソール化合物 - Google Patents

Abstract

Ｃ−ＣカップリングまたはＣ−Ｏ−Ｃカップリングのいずれかによって形成されるヒドロキシチロソールポリマーが提供される。好ましいポリマーは、Ｃ−Ｃカップリングによって形成され、ダイマーは、次の構造（式Ｉ）を有する。本発明の化合物は、抗酸化性質を有することがわかっており、これらの抗酸化剤組成物における使用は、本発明のさらなる局面を構成する。

Description

この発明は、ヒドロキシチロソールに由来する化合物およびこれらの抗酸化剤組成物における使用に関する。

ヒドロキシチロソールは、強力な抗酸化性質を有するフィトケミカルである。それは、そのエレノール酸エステルであるオレウロペインの形態で、およびそのままの形態でオリーブ油中に存在する。ヒドロキシチロソールは、実施可能な値段で商業的に入手可能であり、酵素反応を用いて製造するか、または抽出することができる。

この発明の目的は、新たなヒドロキシチロソール由来化合物、特に、ヒドロキシチロソールよりも優れた抗酸化性質を有する化合物を提供することである。

この発明に従うと、Ｃ−ＣカップリングまたはＣ−Ｏ−Ｃカップリングのいずれかによって形成されるヒドロキシチロソールポリマーが提供される。
本発明のさらなる特徴によると、ポリマーは、ダイマー、トリマーおよび、より大きなオリゴマーの１つ以上であり、ポリマーは、好ましくはＣ−Ｃカップリングによって形成され、ダイマーは、次の構造

を有し、トリマーは、次の構造

を有する。

本発明は、ヒドロキシチロソールポリマーを含む抗酸化剤組成物も提供する。
本発明のさらなる特徴によると、ポリマーは、Ｃ−Ｃカップリングによって形成され、ポリマーは、ヒドロキシチロソールダイマー、ヒドロキシチロソールトリマーおよびヒドロキシチロソールオリゴマーの１つ以上であり、ダイマーおよびトリマーは、好ましくは、上に定義した構造を有し、組成物は、皮膚への使用に好適であり、組成物は、クリーム、ローションまたはスプレーの形態であり、組成物は、ヒトまたは動物の皮膚への使用に好適であり、代替的には、組成物は医薬であり、医薬は、１種類以上の他の有効成分または賦形剤を含む。

本発明はさらに、ヒドロキシチロソールポリマーの抗酸化剤としての使用を提供する。
本発明のさらなる特徴によると、ポリマーは、Ｃ−Ｃカップリングによって形成され、ポリマーは、ダイマー、トリマーまたはオリゴマーであり、ダイマーおよびトリマーは、好ましくは、上に定義した構造を有し、ヒドロキシチロソールダイマーは、皮膚への使用に好適な組成物において、代替的には医薬において、ＵＶ保護剤として使用され、薬剤は、任意の他の好適な有効成分および賦形剤を含み、医薬は、非経口投与剤または経口投与剤、特に、錠剤およびカプセル剤の形態である。

本発明はさらに、触媒としてラッカーゼを用いてヒドロキシチロソールを重合化することを含む、ヒドロキシチロソールポリマーの調製方法を提供する。
本発明のさらなる特徴によると、アセトン、メタノールもしくはエタノールなどの水混和性有機溶媒、または酢酸エチルなどの水非混和性溶媒を含有する反応媒体が、水性緩衝液とともに１０％〜７０％の範囲の百分率（体積対体積）で用いられる。

本発明のさらなる特徴によると、５０Ｕラッカーゼ：１ｇヒドロキシチロソール〜１０００Ｕラッカーゼ：１ｇヒドロキシチロソールの（存在するラッカーゼの量に対する）基質濃度比の範囲が使用され、ラッカーゼは、遊離または固定化された形態で使用される。
図面を例示としてのみ参照して、本発明を説明する。

２０％メタノール中での白色腐朽菌（Ｔ．ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ）から得られたラッカーゼによるヒドロキシチロソールのバイオ変換を示すＨＰＬＣプロファイルである。 ２０％メタノールを含有する反応媒体中でのラッカーゼによるヒドロキシチロソールのバイオ変換から得られたポリマーの存在を示す、図１中の生成物５５のＬＣ−ＭＳプロファイルである。 ２０％メタノールを含有する反応媒体中でのラッカーゼによるヒドロキシチロソールのバイオ変換から得られたダイマー生成物（質量３０６）の存在を示す、図１中の生成物５７のＬＣ−ＭＳプロファイルである。 ２０％メタノールを含有する反応媒体中でのラッカーゼによるヒドロキシチロソールのバイオ変換から得られたオリゴマー化合物の存在を示す、図１中の保持時間７．６０分の生成物５９のＬＣ−ＭＳプロファイルである。 ２０％メタノールを含有する反応媒体中でのラッカーゼによるヒドロキシチロソールのバイオ変換から得られたオリゴマー化合物の存在を示す、図１中の保持時間９．７９分の生成物６０のＬＣ−ＭＳプロファイルである。 ラッカーゼによるヒドロキシチロソールのバイオ変換を示すＨＰＬＣプロファイルを示す図である。Ａ：５０％アセトンを含有する反応媒体、主な生成物はダイマー、保持時間３．４０分。Ｂ：５０％メタノールを含有する反応媒体、主な生成物は生成物５９、保持時間７．３３分。Ｃ：５０％酢酸エチルを含有する反応媒体、主な生成物は、保持時間９．１２分のピークにより表わされる生成物６０。 ＲＯＳアッセイ結果を表わす棒グラフである。 ヒドロキシチロソールのＢａｘ発現に対する効果を求めるためのウエスタンブロットの結果を表わす図である。 ヒドロキシチロソールのＢｃｌ−２発現に対する効果を求めるためのウエスタンブロットの結果を表わす図である。 ヒドロキシチロソールのＡＩＦ発現に対する効果を求めるためのウエスタンブロットの結果を表わす図である。 ポリマー化合物５７のＢａｘ発現に対する効果を求めるためのウエスタンブロットの結果を表わす図である。 ポリマー化合物５７のＢｃｌ−２発現に対する効果を求めるためのウエスタンブロットの結果を表わす図である。 ポリマー化合物５７のＡＩＦ発現に対する効果を求めるためのウエスタンブロットの結果を表わす図である。 抗酸化剤のＢａｘ発現に対する効果を求めるためのウエスタンブロットの結果の分析を示す棒グラフである。 抗酸化剤のＢｃｌ−２発現に対する効果を求めるためのウエスタンブロットの結果の分析を示す棒グラフである。 抗酸化剤のＡＩＦ発現に対する効果を求めるためのウエスタンブロットの結果の分析を示す棒グラフである。

図面の参照による詳細な説明
本発明は、ヒドロキシチロソールモノマーから形成されるポリマーを提供する。以下により詳細に説明するように、ポリマーは、Ｃ−ＣカップリングまたはＣ−Ｏ−Ｃカップリングのいずれかによって形成され得、ラッカーゼを用いたヒドロキシチロソールの酸化によって製造され得る。

一実施形態に従うと、生体触媒としてチロシナーゼを用いて合成し、次に、まず分取ＴＬＣプレートによって精製したヒドロキシチロソールを、２０％メタノールを含有する酢酸ナトリウム緩衝液媒体中、白色腐朽菌（Ｔ．ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ）から得られたラッカーゼにより酸化した。図１に示すように、反応をＨＰＬＣにより監視した。６時間後、ヒドロキシチロソール（保持時間４．８分のピークにより表わされる）の８０％変換率が得られ、６つの生成物ピークが観察された。これらのピークは、ヒドロキシチロソール−ラッカーゼ反応のさまざまな生成物を表わした。

図２〜図５に示すように、ＬＣ−ＭＳを用いて、新たな生成物ピークの同定が得られた。保持時間２．４５分の生成物はポリマー生成物５５として表示された。そのＬＣ−ＭＳプロファイルを図２に示す。全ピーク面積の２７％を占める生成物５５は、ヒドロキシチロソールの８つのモノマー（１２０２．５ｍ／ｚ）からなっていた。これらはＣ−Ｃ結合またはＣ−Ｏ結合のいずれかによって結合されている。

保持時間３．８分の生成物は生成物５７として表示され、全ピーク面積の３９％を占めていた。そのＬＣ−ＭＳプロファイルを図３に示す。ヒドロキシチロソールの２つのモノマー（３０６．０８ｍ／ｚ）を含有すること、従ってダイマー生成物を形成することがわかった。

保持時間７．６分の生成物は生成物５９として表示され、全ピーク面積の１％を占めていた。生成物５９のＬＣ−ＭＳプロファイルを図４に示す。保持時間９．７９分の生成物は、全ピーク面積の２０％を占めており、生成物６０として表示された。そのＬＣ−ＭＳプロファイルを図５に示す。生成物５９および生成物６０のいずれも、ヒドロキシチロソールのオリゴマー生成物であると見られる。

有機溶媒の選択は、ヒドロキシチロソール−ラッカーゼ反応の選択性に影響を及ぼす。このことは、５０％アセトン、５０％メタノールまたは５０％酢酸エチルを含有する酢酸ナトリウム反応媒体（２相系）中、ラッカーゼによるヒドロキシチロソールの酸化を行なうことによって説明される。表１は、さまざまな反応混合物のＨＰＬＣによる検出結果を示す。その結果から、反応により製造されたポリマー生成物の性質が、用いる有機溶媒の種類によって異なることがわかるであろう。

表１に示すように、ヒドロキシチロソールのダイマーである生成物５７は、５０％アセトンを含有する反応混合物中、収率５２％を有する主な生成物である。同じ反応混合物からの他の生成物（５５、５９および６０）の収率は、約３％で非常に低い。

５０％メタノールを含有する反応媒体については、得られた主なポリマーは生成物５９であり、酢酸エチルを含有する反応混合物については、生成物６０が、製造された主なポリマーである。

アセトン、酢酸エチルまたは５０％メタノールを含有する反応混合物中でのポリマー生成物５５を表わすピークの強度は、２０％メタノールを含有する反応における同じピークと比較して、大きく減少していることに注目できる。

ポリマー生成物の形成は、反応媒体中の有機溶媒の量の増加とともに減少することがわかる。これは、有機溶媒が、溶液中の分子の疎水的相互作用を減少させることに起因している。したがって、得られた結果は、有機溶媒がヒドロキシチロソール−ラッカーゼ反応生成物の性質に対し影響を及ぼすことを明らかに示す。ラッカーゼによるヒドロキシチロソールのバイオ変換を示すＨＰＬＣプロファイルを図６に示し、ヒドロキシチロソール−ラッカーゼ反応生成物の概要を表２に記載する。

上に示すように、ヒドロキシチロソール反応は、有機溶媒の使用によって強く影響を受ける。ヒドロキシチロソール−ラッカーゼ反応において重合化を制御する能力は、その化合物の構造に起因し得る。チロソールとヒドロキシチロソールとの違いは、ヒドロキシチロソールにおいて増加した極性／親水性、および増加した立体サイズである。化合物の増加した極性により、反応性はより高くなり得るが、この効果は、増加した立体障害、および有機溶媒によって招かれる減少した疎水的相互作用によって取消され得る。たとえば、２つのヒドロキシチロソールラジカルがカップリングしてダイマー構造を形成する点で、パラ−ヒドロキシル基近くでのチロソールのヒドロキシル化によって、いくらかの立体障害が生じる可能性があるが、このダイマーにおける空間的制限により、より多くのラジカルを結合することは立体的に困難となり得る。したがって、反応媒体における、有機溶媒の効果、すなわち、分子の疎水的相互作用の減少とともに、立体効果により、低分子量化合物が製造される可能性があった。立体効果および疎水的相互作用の効果の他に、ヒドロキシチロソールの重合化を制御する能力は、次の事項にも起因し得る。（ａ）ヒドロキシル基が、ラジカル中間体中の不対電子の非局在化を変更し得るため、おそらく、ラジカルが安定化されて、より低分子量の生成物が生じる、または（ｂ）チロソールおよびヒドロキシチロソールのラジカル中間体もまた、有機溶媒と異なって相互作用し得るため、異なる生成物が得られる。

ヒドロキシチロソールのラッカーゼとの反応が、チロソール−ラッカーゼ反応と比較してより制御可能である点で、ヒドロキシチロソールにおける追加的なヒドロキシル基の存在は重大な影響を及ぼす。その構造的な構成に起因するチロソールの高い反応性は、先行技術に報告された多くのラッカーゼ重合化反応と一貫している。したがって、ラッカーゼ基質の構造的な構成が、生成されるラジカルの反応性に影響を及ぼすと推測され得る。さらに、反応媒体中のこれらのラジカルの相互作用は、用いる有機溶媒の性質によって影響され得る。このことは、所望のポリマー生成物を選択する目的で、反応媒体を設計または操作し得ることを証明している。これは、所望のポリマー生成物を選択的に製造し得、精製プロセスを最適化し得ることを意味する。

ヒドロキシチロソールのポリマーのうち、ダイマーおよびトリマーは、この発明の特定の焦点となる。以下、これらを「ダイマー」または「ダイマー化合物」および「トリマー」または「トリマー化合物」とそれぞれ呼ぶ。ダイマーおよびトリマーのいずれもＣ−ＣカップリングまたはＣ−Ｏ−Ｃカップリングのいずれかによって形成され得る。具体的には、Ｃ−Ｃカップリングによって形成されるダイマーおよびトリマーが、本発明と特に関連性があり、これらの構造は、現時点では次のようであると考えられる。

および

上記の通り、ダイマー化合物およびトリマー化合物のいずれも、有機溶媒のバリエーション、水性緩衝液の比および基質対酵素の比を含む反応条件に依存して、生体触媒であるラッカーゼにより触媒される反応におけるヒドロキシチロソールの重合化によって製造される。以下の例によりプロセスをさらに説明する。

ラッカーゼによるヒドロキシチロソールの酸化によるポリマーの製造
ラッカーゼ（８０Ｕ）およびヒドロキシチロソール（１ｇ）を酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，０．１Ｍ，２００ｍｌ）およびメタノール（２００ｍｌ）に加えた。反応をホイルで覆い、１８０ｒｐｍ、３０℃で振とうした。サンプルを周期的に採取し、ＨＰＬＣで分析した。Ｃ１８ウォーターズ社（２５０ｍｍ×４．６ｎｍ）逆相カラムおよびＵＶ検出器を２８０ｍｍで用い、ＨＰＬＣ分析に用いた移動相は、流速１ｍｌ／分のメタノール：酢酸：Ｈ_２Ｏ（２０：２．５：８０）であった。メルク日立Ｄ７００型データソフトウェアのＨＰＬＣマネージャを用いてピークを分析した。百分率の変換率は、反応サンプルのピーク面積をコントロールのピーク面積と比較することによって得た。反応の生成物を、トルエン：酢酸エチル：ギ酸溶液（５：４：１）溶離液によるＴＬＣ分析によって監視した。

反応混合物と同等量の酢酸エチルを用いて、反応混合物から有機生成物を回収した。混合物を激しく振とうし、その後、混合物を分離させた。有機部分を回収して、ロータリエバポレータを用いて乾燥し、次に、メタノールに再懸濁した。サンプルをフラッシュクロマトグラフィ（トルエン：酢酸エチル：ギ酸溶液（５：４：１）溶離液）を用いて精製した。精製した生成物をロータリエバポレータを用いて再度回収し、サンプルをｄ−クロロホルムに溶解して、^１Ｈ−ＮＭＲ分析した。^１Ｈ−ＮＭＲは、３００ＭＨｚでｄ−クロロホルムにより行なった。

得られた生成物５７（以下、ポリマー化合物５７と呼ぶ）は、ＴＬＣでＲｆ値０．３およびＭＳによる分子量３０６を有する。ダイマーおよびトリマーについて、提案される可能な構造を以下に示す。

生成物は、関与するカップリング反応の検討により説明され得る。塩基性条件下では、フェノキシラジカルカップリングによりＣ−Ｏ−Ｃカップリング（生成物Ｂ）が生じ、酸性条件下では、それによりＣ−Ｃカップリング（生成物Ａ）が生じる。中性条件下（緩衝液を用いる）では、これらのカップリング反応のいずれも５０％の発生率である。そのため、ここでは両方のカップリング方法が提供される。

しかし、Ｃ−Ｃ結合ダイマーおよびトリマーの方が、Ｃ−Ｏ−Ｃ結合ダイマーおよびトリマーよりも、より顕著に高い抗酸化活性を示すと見られることが注目され、次の抗酸化アッセイにおいて用いたのは、Ｃ−Ｃ結合ポリマー化合物５７である。

さらなる分析：ラッカーゼによる基質の酸化
第２の反応において、反応混合物は、ヒドロキシチロソール（４ｍｌメタノール中≒０．００２ｇ）、酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０（４ｍｌ）およびラッカーゼ（１．６Ｕ）を含有していた。反応は、オービタルシェーカーを用いて１８０ｒｐｍで振とうさせつつ、３０℃で１４時間行なった。酸化生成物をＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳにより分析した。

酸化生成物のＨＰＬＣ分析
反応混合物に同等量の酢酸エチルを加えて、混合物から有機層を回収した。混合物を激しく振とうさせ、次に、静置して分離させ、有機層を回収して、Ｌ７１００ポンプ、Ｐ−７２００オートサンプラーおよびＬ−７４００ＵＶ検出器を備えるメルク−日立ＬａＣｈｒｏｍＨＰＬＣシステム（ドイツ，メルク）で分析した。生成物の同定および定量分析は、１ｍｌ／分の流速および２５℃のオーブン温度でのイソクラチック溶離により、アセトニトリル、０．１％酢酸および脱イオン化水（２０：２．５：８０）を溶媒として用いて、ＰＦＰ（２）カラム（ＬＵＮＡ２５０×４．６０ｍｍ，５μｍ，フェノメネクス，ドイツ）で、逆相ＨＰＬＣによって行なった。

酸化生成物のＬＣ−ＭＳ分析
ウォーターズ社Ｕｌｔｉｍａ ＥＳＩ Ｑ−ＴＯＦ質量分析計につなげた、２成分溶媒マネージャおよびオートサンプラーを備えたウォーターズ社Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステムにより、ＬＣ−ＭＳを行なった。上記のイソクラチック条件（０．１％酢酸の代わりに０．１％ギ酸を用いた以外）および、次の直線勾配：９５％溶媒Ａおよび５％溶媒Ｂ（０〜２分）、２０％Ａおよび８０％Ｂ（２〜２５分）、１００％Ｂ（２５〜３０分）、９５％Ａおよび５％Ｂ（３０〜４０分）（ここで、溶媒Ａは０．１％ギ酸であり、溶媒Ｂはアセトニトリルである）を用いて、まず生成物を分離した。質量分析計を−３．７ｋＶのキャピラリ電圧および３５Ｖのコーン電圧により、陰イオン化モードで動作させた。ソース温度は１２０℃、脱溶媒和温度は３７０℃であった。脱溶媒ガスフローおよびコーンガスフロー（ともにＮ_２）は、それぞれ３７０Ｌ／ｈおよび５０Ｌ／ｈであった。質量は、１５０〜１４５０ａｍｕでスキャンし、データを収集して、ＭａｓｓＬｙｎｘ ｖ．４．０ソフトウェア（ウォーターズ社）を用いて処理した。器具は、ＮａＦ溶液を用いて較正した。

ＬＣ−ＭＳ結果は、ｍ／ｚ３０３．２，ｔ_Ｒ＝１３．９７分（酸化されたダイマー，［Ｍ］＝３０４）、ｍ／ｚ３０９．２，ｔ_Ｒ２６．００（ダイマー、［Ｍ］＝３０８），およびｍ／ｚ３５３．２，ｔ_Ｒ２５．７１（ギ酸付加物）で主なシグナルを示した。ベンゼン環上のヒドロキシル基は、オルトまたはパラ配向性を有し、エーテル結合と比較すると、Ｃ−Ｃ結合の安定性および５−５結合の低い生成熱により、遊離Ｃ−５位置を有する分子は通常、５−５結合を介してダイマー化する。さらに、ヒドロキシチロソール構造は、５−５結合および４−Ｏ−５結合を介してオリゴマーを形成することが知られているリグニンモノマーと類似している。これらの事柄およびＬＣ−ＭＳ結果を考慮すると、ポリマーの構造は以下のようであると求められた。

５，５′−ビス（２−ヒドロキシエチル）−[１，１′−ビフェニル］−２，２′，３，３′−テトラオール
ｍ／ｚ：３０６．１１（１００．０％），３０７．１１（１７．５％），３０８．１２（１．５％），３０８．１１（１．２％）

抗酸化アッセイによる抗酸化活性の測定
ヒドロキシチロソールポリマーの抗酸化活性は、インビトロの抗酸化アッセイを用いて測定することができる。ＤＰＰＨ、ＦＲＡＰ、およびＬＤＬアッセイの３つの異なる抗酸化アッセイを用いて、インビトロでのポリマー化合物５７の活性が提示された。ＤＰＰＨおよびＦＲＡＰアッセイは、親水的抗酸化アッセイであり、いずれも推定抗酸化剤の電子を供与する能力を証明する。ＤＰＰＨアッセイは、推定抗酸化剤の、ＲＯＳを安定化させるための水素供与能力を証明する。ＦＲＡＰアッセイは、推定抗酸化剤の鉄（ＩＩＩ）還元能力を証明する。ＬＤＬアッセイは、推定抗酸化剤の、ＲＯＳにより引起される脂質過酸化を阻害する能力を証明する疎水的抗酸化アッセイである。

２，２−ジフェニル−１−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）ラジカルを用いたポリマー化合物５７の抗酸化能力の評価
ＤＰＰＨアッセイは、抗酸化剤によるＤＰＰＨラジカルの還元後の５１５ｎｍでの吸光度の変化に基づく。推定抗酸化剤の抗酸化活性は、溶液の色が消えたときの吸光度の減少を監視することによって測定する。このアッセイにおいては、試験抗酸化剤とＤＰＰＨラジカルとの間の反応を定常状態に達するまで継続させる。定常状態に達したときに急冷したラジカルの量は、抗酸化能および抗酸化剤の濃度に依存する。

それぞれのサンプルの１００μｌ（１ｍｇ／３ｍｌ）を３．９ｍｌＤＰＰＨ溶液（メタノール中２５ｍｇ／Ｌ）に加えた。５１５ｎｍでの吸光度の減少を、反応が定常状態に達するまで、Ｕｎｉｃａｍ社ＵＶ可視分光光度計を用いて監視した。

下記の表３の結果から、ラジカルスカベンジング活性を標準アスコルビン酸（１００％）と比較すると、ヒドロキシチロソールおよびポリマー化合物５７のいずれもＤＰＰＨラジカルに対して有効なラジカルスカベンジャーであることがわかった。

ＦＲＡＰアッセイを用いたポリマー化合物５７の抗酸化活性の評価
ＦＲＡＰアッセイは、フェロイン類似体であるトリピリジルトリアジンのＦｅ錯体である、Ｆｅ（ＴＰＴＺ）^３＋を酸性媒体中で強い青色のＦｅ^２＋に還元する抗酸化剤の能力を測定する。結果は、吸光度の５９３ｎｍでの増加に伴って得られ、この場合、抗酸化標準物質のアスコルビン酸と相対して表わされ得る。

それぞれのサンプルの１ｍｌ（１ｍｇ／３ｍｌ）を２．５ｍｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，５００ｍＭ）に加え、２．５ｍｌフェリシアン化カリウムを加えた。その後、５０℃で２０分間インキュベーションした。１０％（ｖ／ｖ）トリクロロ酢酸を加えて反応を停止した。次に、２．５ｍｌの水を２．５ｍｌの反応に加えた。塩化鉄（０．５ｍｌ）を加えた。反応を３０分間静置した後、吸光度を７００ｎｍで読取った。

ポリマー化合物５７は、３６３ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸と同等の抗酸化活性を示した。基質（ヒドロキシチロソールおよびフェルラ酸）と比較して、３分の１の生成物の濃度しか用いなかったにも関わらず、基質とほぼ同等の抗酸化活性が得られた。ポリマー化合物５７の還元性質は、それが水素原子を供与することによって惹起される、遊離ラジカル鎖切断性質と関連付けられる。

（ＬＤＬ）アッセイを用いて抗酸化剤の抗酸化活性を評価
低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の酸化を、Ｎａｒｄｉｎｉら（１９９５年）により開発された方法に従って行なった。ＬＤＬは、２００倍体積のｐＨ７のＰＢＳにおいて、暗所で１８時間透析した。ブラッドフォード法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ ｍｅｔｈｏｄ）により求めた１００μｇ／ｍｌのＬＤＬを、５０μｍ試験抗酸化剤の存在下および非存在下、３７℃で４時間、５μＭのＣｕＣｌ_２により酸化した。共役ジエン形成は、Ｕｎｉｃａｍ社ＵＶ−可視分光光度計を用いて２３４ｎｍで分光学的に測定した。

ポリマー化合物５７のＬＤＬ酸化を阻害する抗酸化能力は、酸化を惹起するために、銅により事前に処置したＬＤＬを含有する反応混合物にポリマー化合物５７を加えることによって評価した。化合物の抗酸化能力は、２３４ｎｍでのジエン共役による吸光度の増加に基づいて測定した。

ポリマー化合物５７は、吸光度を減少させる効果を示すため、標準物質であるアスコルビン酸と相対するさまざまな度合で、脂質過酸化によるジエン共役を防止することができる。

脂質過酸化により、過酸化の連鎖反応を介してジエン共役が形成される。２つの化合物は、この連鎖反応を防止することができ、鎖切断抗酸化剤であるといえる。

さまざまな濃度のポリマー化合物５７のヒト皮膚細胞（ＨａＣａＴｓ）のＨａＣａＴｓ細胞生存率に対する効果
理想的には、抗酸化剤の有効性を試験するために、化合物は、細胞を伴う生物学的モデルに適用される必要がある。角化細胞（ＨａＣａＴｓ）は、ほとんどの太陽放射線誘発皮膚癌の標的であり、正常な代謝、病態生理学的プロセスおよび過剰な細胞源に由来する数多くの酸化体に晒されることから、角化細胞を用いた。ポリマー化合物５７の推定抗酸化活性を試験するために、細胞をＵＶＡに晒し、効果を測定した（すなわち、増加したＲＯＳ産生、アポトーシスタンパク質）。

ポリマー化合物５７の細胞毒性を評価するために、ＸＴＴアッセイを行なった。アッセイは、生細胞の黄色ＸＴＴテトラゾリウム塩をオレンジ色フォルマザンに還元する能力に基づく。オレンジ色フォルマザンは、次に、４５０ｎｍの吸光度で測定される。ＨａＣａＴｓを濃度の増加するポリマー化合物５７とともに１晩インキュベートした。細胞生存率は、ＸＴＴ溶液を加え、３７℃で４時間インキュベートし、次に、４５０ｎｍで吸光度を読取ることによって評価した。

１０００μＭより高い濃度は、細胞生存率に顕著な減少を引起した。ポリマー化合物５７は、２００〜５００μＭの濃度では細胞生存率に悪影響を示さなかったが、５００μＭより高い濃度では、細胞生存率に顕著な減少が生じた。
抗酸化剤の効果をさらに探索するために、用量および時間反応研究を行なって、ポリマー化合物５７の長期的な効果を求めた。ＨａＣａＴｓ細胞は、前段落に記載されたように、２４時間のインキュベーション期間、ＨａＣａＴｓに無毒性であることが判明したポリマー化合物５７の濃度範囲の存在下で成長させた。２４時間の期間にわたって無毒性であることが判明した濃度はすべて、３日間の期間にわたっても無毒性であることが判明した。３日間の期間にわたって、細胞は、細胞損失がないことを示す標準シグモイド細胞成長曲線を提示し、これらの濃度を以降のすべての実験用に用いた。

放射によるＲＯＳの産生に対するポリマー化合物５７の効果を解明するためのＲＯＳアッセイ
培養したヒト皮膚細胞のＵＶＡ放射は、Ｈ_２Ｏ_２および他のＲＯＳ（活性酸素種）の過剰に上昇したレベルを招き、Ｈ_２Ｏ_２が主な種である。細胞にＵＶＡを照射した後、産生されたＨ_２Ｏ_２は、ジヒドロローダミン（ＤＨＲ１２３）を用いて検出することができる。ジヒドロローダミンは、ペルオキシダーゼの存在下でＨ_２Ｏ_２と反応することが示されており、細胞内Ｈ_２Ｏ_２の検出のためのプローブとして広く用いられている。したがって、蛍光活性化セルソータ（ＦＡＣＳ）機で読取られる平均蛍光（ＭＦ）は、細胞内Ｈ_２Ｏ_２産生を示す。ポリマー化合物５７が放射によるＲＯＳの過剰発現に及ぼす効果を解明するために、角化細胞におけるＨ_２Ｏ_２産生を測定した。まず、細胞をさまざまな濃度のポリマー化合物５７により処置し、ＵＶＡを放射し、次に、ＤＨＲ１２３染料に晒した。

データは、ポリマー化合物５７が、用量依存的にＵＶＡにより誘発されたＨ_２Ｏ_２産生を阻害することを示した。結果は、ポリマー化合物５７が、２００μＭの濃度で、１００％平均蛍光のコントロールに対して、ＲＯＳレベルを８７〜１００％平均蛍光の正常な生理レベルまで低下させたことを示す。３３３μＭの濃度で、ポリマー化合物５７は、８５％の平均蛍光を有するＲＯＳ低下効果を示した。

この結果は、ポリマー化合物５７が、遊離ラジカルスカベンジング経路を介して細胞内Ｈ_２Ｏ_２の過剰産生を防止し得る、強力なラジカルスカベンジング活性を有することを直接的に証明する。この研究は、ＵＶにより誘発されるＲＯＳに対するポリマー化合物５７の保護効果が、ＲＯＳによって惹起される反応に対する干渉を介して起こり得ることを示唆している。この干渉は、これらの中間体（ＲＯＳ）を直接中和し、スーパーオキシドおよび／または過酸化水素の形成を防止すること、または、細胞の抗酸化系を再生することによることのいずれかの可能性がある。というのも、ＵＶ放射は、細胞の防御に関与する抗酸化剤を欠乏させると考えられるためである。

図７に示す結果は、ヒドロキシチロソールおよびポリマー化合物５７の分子量の増加（それぞれＭＷ１５３および３０６）と相関する、ＲＯＳ減少の度合の増加があったことを示している。したがって、重合化の効果は、Ｈ_２Ｏ_２レベルが正常な生理レベルとなるような抗酸化活性の増加であったことが示唆され得る。

要するに、これらの試験は、ポリマー化合物５７がＵＶＡ放射後の角化細胞に対する強力な保護剤であることを示す。

ＨａＣａＴｓにおけるＵＶＡにより誘発されるアポトーシスに対するポリマー化合物５７の効果のウエスタンブロット分析を用いた評価
アポトーシスは、正常な細胞のターンオーバー、適切な発達、免疫系の機能、化学物質により誘発される細胞死およびＵＶＲ過剰暴露を含む、さまざまなプロセスの必要不可欠な一部と見なされる、細胞のプログラム死のプロセスを指す。壊死は、アポトーシスに代わるものであり、細胞が受動的な犠牲者となり、エネルギ非依存的な様式の死を辿る、毒性プロセスと見なされる。本願の目的のために、ＵＶＡ過剰暴露により誘発される細胞死の様式としてのアポトーシスに着目した。

アポトーシスは、外因性経路または内因性経路を介して起こり得る。外因性経路は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のメンバーに関与する、膜貫通型受容体媒介相互作用に関与する。内因性経路はミトコンドリアにより惹起される現象であるため、この研究の関心材料である。内因性経路は、カスパーゼ依存的または非依存的に進行し得る。カスパーゼ非依存的なルートは、ＡＩＦと呼ばれるタンパク質に関与し、このタンパク質は、ミトコンドリアから放出されると、核へと直接的に移動し、アポトーシスを誘発する。代替的なカスパーゼ依存的ルートは、Ｂｃｌ−２ファミリーのタンパク質のメンバーに関与する。このファミリーのタンパク質には、ミトコンドリア膜の透過性を調節する役割があり、アポトーシス促進性または抗アポトーシス性のいずれかであり得、Ｂｃｌ−２は抗アポトーシス性であり、Ｂａｘはアポトーシス促進性である。細胞のアポトーシス刺激に対する感受性は、アポトーシス促進性（Ｂａｘ）と抗アポトーシス性（Ｂｃｌ−２）タンパク質とのバランスに依存する。これらのタンパク質の比は、細胞の「アポトーシス状態」を示唆すると思われる。Ｂａｘが過剰であると、細胞はアポトーシスに対しより感受性が高くなり、Ｂｃｌ−２が過剰であると、細胞はアポトーシスに対しより耐性が高くなる。ＵＶＡ照射によるポリマー化合物５７およびヒドロキシチロソールによって媒介される抗アポトーシス効果の性質を求めるために、Ｂａｘ／Ｂｃｌ−２比をウエスタンブロット分析を用いて研究した。

Ｂｃｌ−２、ＢａｘおよびＡＩＦの発現を評価するため、細胞を培養して、ポリマー化合物５７およびヒドロキシチロソールの２００〜１０００μＭの間のさまざまな濃度により１８時間処置し、次に、２２．３Ｊ／ｃｍ^２で照射した。タンパク質抽出を行ない、タンパク質をＢＣＡ法を用いて定量化した。シャムコントロールを全体を通して含ませ、いずれも非ＵＶ照射コントロールと大きな差異はなかった。このコントロールの目的は、観察された効果を生じるのはＵＶＡ線だけであり、チャンバ内の熱ではないことを確認するためである。各実験において、α−チューブリンをローディングコントロールとして用いて、結果を正しく定量化したことを確認した。ウエスタンブロット結果はバンドサイズによって定量化されるため、各サンプルが、ロードされたときに同じ量のタンパク質を有することを確認することが重要であり、ローディングコントロールは、これを求める助けをする。タンパク質をローディングコントロールで調べたときに得られるバンドは、そのロードされたサンプル中のタンパク質の量を表わす。ウエスタンブロット分析の結果は、２つの化合物が、濃度依存的に、Ｂａｘ（図８．１、図８．４）およびＡＩＦ（図８．３、図８．６）の発現を大きく低下させ、Ｂｃｌ−２（図８．２、図８．５）の過剰発現を誘発することを示した。なお、時々異なってロードすることもあるため、ＵＶ＋およびＵＶ−は、必ずしも常に同じ順で起こるわけではない。

ヒドロキシチロソールおよびポリマー化合物５７のＵＶＡ誘発アポトーシスに対する効果のウエスタンブロット分析を用いた評価
１０００μＭの濃度のヒドロキシチロソールは、Ｂａｘレベルをコントロールと同じ発現レベルにすることによって（図８．１）、Ｂａｘ発現の最も大きな減少を示した。２００μＭの濃度のポリマー化合物５７は、Ｂａｘレベルを７５％低下させ、一方、他の２つの試験濃度（３３３および５００μＭ）は、Ｂａｘレベルをコントロールに対して８７．５％低下させた（図８．４）。

２００μＭの濃度のヒドロキシチロソールは、コントロールに対して、ＡＩＦの発現レベルを正常レベルにした。最高濃度（１０００μＭ）では、ヒドロキシチロソールは、ＡＩＦレベルをコントロールに対して１５％低下させた（図８．３）。ポリマー化合物５７は、濃度依存的に、ＡＩＦレベルを、２００μＭについては２８％、３３３および５００μＭの濃度については３２％、コントロールに対して低下させた（図８．６）。

ヒドロキシチロソールの存在は、Ｂｃｌ−２の発現を濃度依存的に増加させた。２００および５００μＭの濃度は、コントロールに対してＢｃｌ−２発現を標準発現レベルにした。最高濃度である１０００μＭにより、図８．２に示すように、コントロールに対してＢｃｌ−２発現レベルの７％の増加が生じる。ポリマー化合物５７は、濃度依存的にＢｃｌ−２レベルを増加させ、最高濃度（５００μＭ）は、コントロールに対してＢｃｌ−２レベルを１６％増加させた（図８．５）。抗酸化性化合物が細胞内に受動的に拡散したことにより、抗アポトーシス性細胞内シグナルを引起したことが示唆される。化合物が、前処置され、ＵＶＡを放射した細胞においてＢｃｌ−２遺伝子ファミリーのタンパク質に影響を及ぼしたことは、これらの化合物が、アポトーシスの内因性経路を阻害することによって、放射によるアポトーシスを阻害することを示唆している。結果は、抗酸化剤によるＢｃｌ−２過剰発現が、細胞の抗酸化能を増加させることによって、ミトコンドリア機能を安定化させ、チトクロムｃの放出を阻止すると考えられるメカニズムを示唆している。最近得られた証拠は、Ｂｃｌ−２が、細胞の抗酸化防御を強化することによって、他のオルガネラも保護し得ることを示唆している。このことは明らかに、抗酸化剤による前処置によるＢｃｌ−２の過剰発現によってミトコンドリア膜脱分極が防止された、ＵＶＡにより誘発された抗酸化剤処置細胞の場合に当てはまる。というのも、化合物は、Ｂａｘ発現レベル（減少したミトコンドリア膜透過性）ＡＩＦおよびＲＯＳ形成を低下させることができためである。

異なる濃度のヒドロキシチロソールおよびポリマー化合物５７のタンパク質発現に関する比較
表４および図９．１〜図９．３に示すように、ヒドロキシチロソールおよびポリマー化合物５７の最高濃度が、ＢａｘおよびＡＩＦレベルを低下させ、また、Ｂｃｌ−２の過剰発現を誘発するのに最も有効であった。

ヒドロキシチロソールの最高試験濃度である１０００μＭは、この実験において、発現レベルをコントロールに対して正常な生理発現レベルである１００％とすることによって、コントロール（１００％）に対してＢａｘ発現レベルの最大低下を引起した。ポリマー化合物５７は、その最低試験濃度である２００μＭで、Ｂａｘレベルの最大低下を示した。Ｂａｘレベルは、コントロール（１００％）より７０％低かった。ポリマー化合物５７の最低濃度は、Ｂａｘレベルをコントロール（１００％）に対して８５％減少させた。したがって、ポリマー化合物５７は、基質であるヒドロキシチロソールよりもより大きな抗酸化活性を示すことが結論付けられる。

ヒドロキシチロソールについても同様に、表４および図９．２に示すように、Ｂｃｌ−２レベルの誘発に対して最大の効果を及ぼす濃度は、１０００μＭであり、ポリマー化合物５７については、５００μＭであった。

ヒドロキシチロソールおよびポリマー化合物５７の抗酸化活性の全体評価
ポリマー化合物５７は、より高いレベルのＢｃｌ−２の過剰発現を誘発したことが観察され、ＡＩＦおよびＢａｘの過剰発現を減少させたため、その前駆物質であるヒドロキシチロソールよりもより強い抗酸化活性を示した。

抗酸化剤は、インビボで広範囲に代謝される結果、親抗酸化剤の代謝された形態が生じる。これらの代謝物の最終的な抗酸化効果により、元の抗酸化剤と比較して、増加した抗酸化活性または減少した抗酸化活性が生じ得る。インビトロの抗酸化アッセイであるＤＰＰＨ、ＦＲＡＰおよびＬＤＬはすべて、ポリマー化合物５７が最高抗酸化活性を有することを示した。同じ傾向が、ＨａＣａＴｓ細胞を用いたＵＶＡ研究においても観察され、この研究においては、ポリマー生成物が、ヒドロキシチロソールモノマーよりもよりよい抗酸化活性を有することがわかっている。このことは、代謝が、親化合物の化学的特性を変更することによってこれらの化合物の抗酸化活性に対して何ら作用を及ぼさなかったことを示唆し、さらに、代謝物が親化合物と相乗的に作用して、ＵＶ放射の細胞毒性を低下させることができたことを示唆している。

ヒドロキシチロソールポリマーの使用
ヒドロキシチロソールポリマー、特に、ダイマー、トリマーおよび、より大きなオリゴマーの抗酸化の性質により、これらは、ＵＶ保護組成物、特に局所的に塗布される製品における使用に非常に好適となる。これらは、化粧用および日焼け用製剤としての皮膚での使用を目的とするクリーム、ローションなどを含む。典型的には、選択されるポリマー、またはポリマーの群が、該製剤において、５〜１５ｍＭの濃度範囲で用いられる。

典型的な製剤は、ポリマーに加えて、水、セトステアリルアルコール、液体および白色ソフトパラフィン（吸収を向上させるため）、ラウリル硫酸ナトリウムまたはドデシル硫酸ナトリウム（皮膚の細胞は脂質膜を有することから、これらは両方とも界面活性剤系であり、脂質の吸収を助ける）、ならびにフェノキシエタノールなどの防腐剤を含み得る。如何なる好適な製剤も用い得ることが明らかである。

さらに、ポリマーを医薬における抗酸化剤有効成分として用いることが提案される。これらは、任意の他の好適な有効成分および賦形剤を含み得、非経口投与剤または経口投与剤、特に錠剤およびカプセル剤の形態であり得る。

１種類以上のポリマーが、他のポリマーよりも高い活性を示し、これらのポリマーが、製剤または医薬において好ましく用いられることが想定される。

本発明の範囲内である、ヒドロキシチロソールポリマーの調製のための他のプロセスが存在することが理解されるであろう。たとえば、反応媒体は、アセトン、メタノールもしくはエタノールなどの水混和性有機溶媒、または、酢酸エチルなどの水非混和性溶媒を、水性緩衝液とともに、１０％〜７０％の範囲の百分率（体積対体積）で含有し得る。さらに、（存在するラッカーゼの量に対する）基質濃度比の範囲は、５０Ｕラッカーゼ：１ｇヒドロキシチロソール〜１０００Ｕラッカーゼ：１ｇヒドロキシチロソールであり得、ラッカーゼは、遊離または固定化された形態で用いられ得る。

Claims (15)

1. ヒドロキシチロソールのＣ−ＣカップリングまたはＣ−Ｏ−Ｃカップリングのいずれかによって形成されるヒドロキシチロソールポリマー。
2. 前記ポリマーは、ダイマー、トリマーまたは、より大きなオリゴマーである、請求項１に記載のヒドロキシチロソールポリマー。
3. 前記ポリマーは、Ｃ−Ｃカップリングによって形成される、請求項１または２に記載のヒドロキシチロソールポリマー。
4. 次の構造：
   

   

   を有する、請求項３に記載のヒドロキシチロソールポリマー。
5. 次の構造：
   

   

   を有する、請求項３に記載のヒドロキシチロソールポリマー。
6. ヒドロキシチロソールのＣ−ＣカップリングまたはＣ−Ｏ−Ｃカップリングのいずれかによって形成されるヒドロキシチロソールポリマーを含有する抗酸化剤組成物。
7. 前記ポリマーは、Ｃ−Ｃカップリングによって形成される、請求項６に記載の抗酸化剤組成物。
8. 前記ポリマーは、ヒドロキシチロソールダイマー、ヒドロキシチロソールトリマーおよび、より大きなヒドロキシチロソールオリゴマーの１つ以上である、請求項６または７に記載の抗酸化剤組成物。
9. ヒトまたは動物の皮膚への使用に好適である、請求項６〜８のいずれかに記載の抗酸化剤組成物。
10. クリーム、ローションまたはスプレーの形態である、請求項８に記載の抗酸化剤組成物。
11. １種類以上の他の有効成分または賦形剤を含有する医薬の形態である、請求項６〜８のいずれかに記載の抗酸化剤組成物。
12. ヒドロキシチロソールのＣ−ＣカップリングまたはＣ−Ｏ−Ｃカップリングのいずれかによって形成されるヒドロキシチロソールポリマーの抗酸化剤としての使用。
13. 前記ポリマーは、Ｃ−Ｃカップリングによって形成される、請求項１１に記載の使用。
14. ヒドロキシチロソールポリマーは、ヒドロキシチロソールダイマー、ヒドロキシチロソールトリマーまたは、より大きなヒドロキシチロソールオリゴマーである、請求項１２または１３に記載の使用。
15. ラッカーゼを触媒として用いてヒドロキシチロソールを重合化することを含む、ヒドロキシチロソールポリマーの調製方法。

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