JP2013516980A - 核酸の細胞内伝達のための方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
a/該動物の細胞を有効量の少なくとも1の活性コルチコステロイドと接触させる段階、及び
b/段階a/において処理された該動物の細胞を有効量の少なくとも1の単離された裸の細胞と接触させる段階、
を含み、該段階a/は5分間〜2時間の範囲の時間の期間の間、実行され、直ちに段階b/が行われる、
方法に関する。
a/該生物学的組織又は器官を有効量の少なくとも1の活性コルチコステロイドと接触させる段階、及び
b/段階a/において処理された該生物学的組織又は器官を有効量の少なくとも1の単離された裸の細胞と接触させる段階;
を含み、該段階a/は5分間〜2時間の範囲の時間の期間の間、実行され、直ちに段階b/が行われる
方法に関する。
a/少なくとも1のコルチコステロイド、
b/少なくとも1の単離された裸の細胞、及び
c/5分間〜2時間、該コルチコステロイドで該動物を処理する第一段階、及び、該処理された動物の細胞を該単離された裸の核酸と接触させる第二段階、該第二段階は、該第一段階の直後に行われる、を含む少なくとも1の指示
を含む該キットにもまた関する。
本発明に従う方法は、少なくとも1の動物細胞、特に単離された動物細胞、又は1の生物学的組織、特に1の単離された生物学的組織、を、有効量の少なくとも1のコルチコステロイドと接触させる少なくとも1の第一段階a/を含む。
a/該目の組織又は細胞を有効量の少なくとも1の活性コルチコステロイドと接触させる段階、及び
b/段階a/において処理された該目の組織又は細胞を、該タンパク質をエンコードしている、有効量の少なくとも1の単離された裸の核酸と接触させる段階、
該段階a/は5分間〜2時間、実行され、直ちに段階b/が行われ、
該タンパク質が発現される、
を含む方法に従って目の組織又は細胞に伝達される、該方法である。
a/該目の組織又は細胞を有効量の少なくとも1の活性コルチコステロイドと接触させる段階、及び
b/段階a/において処理された該目の組織又は細胞を、有効量の少なくとも1の単離された裸の核酸と接触させる段階;
該段階a/は5分間〜2時間、実行され、直ちに段階b/が行われ、目を目の病気から保護する、
を含む方法に従って、該目の組織又は該目の細胞に伝達される、該方法にもまた関する。
a/該目の組織又は細胞を有効量の少なくとも1の活性コルチコステロイドと接触させる段階、及び
b/段階a/において処理された該目の組織又は細胞を、有効量の少なくとも1の単離された裸の核酸と接触させる段階、
該段階a/は5分間〜2時間、実行され、直ちに段階b/が行われる、
を含む方法に従って目の組織又は目の細胞へ伝達される、該方法である。
特定の実施態様に従うと、本発明に適する、動物の細胞又は生物学的組織は、非コンピテント細胞又は組織又は低位にコンピテントな細胞又は組織であり得る。
コルチコステロイドは、副腎皮質において製造されるステロイドホルモンの種類であり、化学構造に基づいて、一般的に4つの種類に分類される。
本発明において使用される核酸は、関心のある、即ち生物学的性質を示す任意の核酸であり得る。
本発明は、動物の細胞への、特に遺伝子治療のための、少なくとも1の単離された裸の核酸の細胞内伝達のためのキットにおいて、
a/少なくとも1のコルチコステロイド、
b/少なくとも1の単離された裸の核酸、及び
c/5分間〜2時間、該コルチコステロイドで該動物の細胞を処理する第一段階、及び、該処理された動物の細胞を該単離された裸の核酸と接触させる第二段階、該第二段階は、該第一段階の直後に行われる、を含む少なくとも1の指示、
を含む上記キットにもまた関する。
本発明は、個体において、特に遺伝子治療のために、単離された裸の核酸の細胞内伝達を促進するための活性剤として、医薬品組成物の製造のために少なくとも1のコルチコステロイドを使用することにもまた関する。
本発明において、発明者らは追加の化学的若しくは生物学的ベクター又は物理的技術の必要なしに、非コンピテント又は低位にコンピテントな細胞又は組織に、裸の単離された核酸を特異的にトランスファーする、新規な細胞内伝達方法を設計した。緑の蛍光タンパク(GFP)、ルシフェラーゼ(Luc)、ベータ−ガラクトシダーゼ又はhTNFR−Is/mIgGlキメラタンパク質をエンコードするプラスミドが使用されて、トランスフェクション後の遺伝子発現を追跡し、感染させた。
動物
6〜7週齢の150〜200gのメスのルイスラット(エレヴァージュ ジャンヴィエール、ル ジェネスト サン アイル フランス)又は1歳の、株C56BL6J p50のヌルマウスが使用された。実験は、目及び視覚研究における動物の使用のためのARVO声明に従って行われた。
本実験において使用されたコルチコステロイドは、薬学的特殊品のKENACORT(商標)、デキサメタゾン(DEX),トリアムシノロンアセトニド(TA)及び合成コルチコイド酢酸アネコルタブ(AA)であった。これらのコルチコイドはフランス国、ファラヴィエール、サン−クエンチン、シグマ−アルドリッチから、そしてDEX及びTAはアルコン(フォートワース、テキサス、USA)から得られた。コルチコイドステロイドは水で希釈され2又は20mg/mlの濃度で使用された。IVT注射及び毛様筋における注射には、10μlの体積が使用された。骨格筋における注射には、マウス及びラットにおいてそれぞれ30μl及び100μlの体積が使用された。
pVAX2は、プロモーターがpCMVβプラスミドプロモーターにより置きかえられているpVAXlプラスミド(インビトロジェン)からなる。pCMVP(クロンテク)がEcoRIで消化され、次に、Klenowフラグメントにより平滑末端化され、最後にBamHIにより消化された。得られた、CMVプロモーターに対応する629bpのフラグメントはアガロースゲル電気泳動後に精製された。このプロモーターは、Hindl−BamHI pVAXlフラグメントにリゲートされて、pVAX2を与えた。
注射
毛様筋のエレクトロトランスファーのために使用されたプロトコルは、国際公開第2006/123243号パンフレットに記載されており、該公報は、参照により本明細書に取り込まれる。
pEGFP−Clのトランスフェクション後8日目において、目は除核され、4%のパラホルムアルデヒドにおいて1時間固定され、lxPBSにおいてすすがれ、OCT(最適切断温度)化合物に埋め込まれ、低温切断された(8μm)。矢状の10μmの薄片が行われた(光学軸に平行)。薄片は、蛍光顕微鏡(ライカ、スイス)で調べられ、たくさんのマイクロ写真が全ての薄片について一定の露出で撮影された。
pVAX2−lucの眼内注射を受けたラットは、処理後7日目に殺された。目は除核され、作動する顕微鏡下で解剖され、神経網膜及びRPE/脈絡膜複合体は除去され、液体窒素中で瞬間凍結され、試験されるまで−80℃において保存された。
目の媒体におけるhTNFR−Isの生産は、毛様筋へのpVAX2 hTNFR−Is/mlgGlの注射後7日目において評価された。右及び左の目からの目の媒体が得られ、各目について別々に評価された。反対側、処理されていない目、からの目の媒体がhTNFR−Isのレベルの対照として使用された。
脛骨前部骨格筋においてpVAXl−LacZの注射を受けたラットは、処理から5日目において殺された。該骨格筋は除去され、リン酸塩で緩衝された生理食塩水(PBS)中の2%のホルムアルデヒド及び0.2%のグルタールアルデヒドにおいて4℃において1時間固定された。それらは、PBSにおいて3回すすがれ、5mMのK3Fe(CN)6、5mMのK4Fe(CN)6、2mMのMgCl2,及び0.02%のNP−40を含むPBSにおいて、1mg/mlのlX−gal(5−ブロモ−4−クロロ−3−インドイルガラクトピラノシド;シグマ−アルドリッチ,サンクエンチン−ファラヴィエール、フランス)とともに室温において終夜インキュベーションされた。PBSで洗浄した後、筋肉の外側からの直接イメージングが、数値化されたカメラ(numerized camera)(クールピクス:ニコン、フナック、パリ、フランス)を使用して実行された。
結果は、平均±平均の標準偏差(SEM)として表現される。データーは、ノンパラメトリックなマン−ホイットニーU試験を使用して比較された。P<0.05が統計的に有意であると考えられる。
KENACORT(商標)は、硝子体内の(IVT)注射の後の網膜への裸のプラスミドの伝達及び遺伝子発現を改良する
神経網膜及びRPE−脈絡膜複合体の細胞、及び一般的な目の細胞はトランスフェクトすることが非常に困難であり、裸の核酸に関して非コンピテントであることが公知である(他の細胞、例えば横毛筋細胞と対照的である)。これらの細胞は補助的なトランスフェクション技術、核酸のトランスフェクションを許す、例えば化学的又は生物学的なベクター又はエレクトロトランスファーを必要とすることが公知である。
コルチコステロイドによる前処理は、裸のプラスミドの細胞内伝達及び遺伝子発現を誘発することができる
0.45%NaClの10μl中の10μgの裸のpVAX2−Lucが麻酔をかけられたラットの一方の目の硝子体内に注射された(反対側の目は対照として使用された)。
コルチコステロイドでの予備処理又は続いてETが行われた後のpEGFPClのトランスフェクションに続く、網膜及び虹彩におけるEGFPの発現の位置確認
0.45%のNaCl中の10μlにおける裸のpEGFPClの10μgが麻酔をかけられたラットの一方の目の硝子体内に注射された(反対側の目は対照として使用された)。
コルチコステロイドの筋肉内前注射に付された毛様筋のトランスフェクションにおける、水性体液中のhTNFR−Is/mlgGlキメラタンパク質の細胞内伝達及び発現の改良
TA又はAAの筋肉内前注射に付された毛様筋のトランスフェクションにおける、細胞内伝達及び、水性体液中におけるルシフェラーゼの発現の改良
TA又はAAでの筋肉内前注射に付されたラット又はマウスの前脛骨筋(横毛筋)における細胞内伝達及びルシフェラーゼの発現
Claims (15)
- 単離された生物学的組織又は器官への、少なくとも1の単離された裸の核酸の細胞内伝達のための方法において、少なくとも以下の段階、
a/該組成器又は器官を有効量の少なくとも1の活性コルチコステロイドと接触させる段階、及び
b/段階a/において処理された該組織又は器官を有効量の少なくとも1の単離された裸の核酸と接触させる段階、
を含み、該段階a/は5分間〜2時間の期間、実行され、直ちに段階b/が行われる
上記方法。 - 段階a/の期間が、10〜90分、特に10〜60分、特に15〜45分、より特に15〜30分である、請求項1に記載の方法。
- 該生物学的組織又は器官が非コンピテント細胞を含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 該単離された組織又は器官が、平滑筋組織特に毛様筋、横毛筋、網膜組織、RPE/脈絡膜複合体組織、脳組織、皮膚上皮、真皮、血管内皮、角膜内皮、角膜上皮、グリアの網膜組織、光受容体細胞、ケラトサイトを含む組織、及び上皮肺組織からなる群から選択される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の組織。
- 該コルチコステロイドが、ハイドロコルチゾン、コルチゾン、チクソコルトール、コルチコステロン、プレドニソロン、プレドニソン、トリアムシノロン、モメタソン、アムシノニド、ブデソニド、デソニド、フルオシノニド、フルオシノロン、ハルシノニド、ベタメタゾン、デキサメタゾン、アクロメタゾン、プレドニカルベート、クロベタソン、クロベタソール、フルオコルトロン、フルプレドニデン、フルオメトロン、アネコルタブ、それらの誘導体及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 該単離された組織又は器官が、平滑筋組織特に毛様筋、網膜組織、RPE/脈絡膜複合体組織からなる群から選択され、該コルチコステロイドが、トリアムシノロン、アネコルタブ、それらの誘導体、特にトリアムシノロンアセトニド又は酢酸アネコルタブ、及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 該単離された組織又は器官が、横毛筋であり、該コルチコステロイドが、デキサメタゾン及びその誘導体、特にデキサメタゾンリン酸ナトリウム塩からなる群から選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 該単離された裸の核酸が、cDNA,gDNA,合成DNA、人工DNA,組み換えDNA、mRNA,tRNA,siRNA,miRNA,shRNA、触媒的RNA,アンチセンスRNA,ウィルスRNA,ペプチド核酸、及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 動物の細胞への、特に遺伝子治療のための、少なくとも1の単離された裸の核酸の細胞内伝達のためのキットにおいて、
a/少なくとも1のコルチコステロイド、
b/少なくとも1の単離された裸の細胞、及び
c/5分間〜2時間、該コルチコステロイドで該動物を処理する第一段階、及び、該処理された動物の細胞を該単離された裸の核酸と接触させる第二段階、該第二段階は、該第一段階の直後に行われる、を含む少なくとも1の指示、
を含む上記キット。 - 該指示が、該コルチコステロイドで処理されるのに適する動物の細胞のリストをさらに言及している、請求項9に記載のキット。
- 個体において、特に遺伝子治療のための、単離された裸の核酸の細胞内伝達を促進するための活性剤としての医薬品組成物の製造のために、少なくとも1のコルチコステロイドを使用する方法において、該医薬品組成物は単離された裸の核酸を個体に投与する5分間〜2時間前に、該個体に投与されることを意図されている方法。
- 該組成物が目への投与のために意図されている、請求項11に記載の方法。
- 該組成物が、目の増殖性の病気、目の神経変性の病気、例えば任意のタイプの阻害された網膜のジストロフィー、目の感染症、目又は眼内の炎症の病気、例えば結膜炎、角膜炎、角膜内皮炎、ぶどう膜炎、脈絡膜炎、網膜炎、網脈絡膜炎、前部及び中間部ぶどう膜炎、及び炎症性の目のニューロパシー、網膜退化、特に遺伝的な網膜のジストロフィー又は網膜色素変性、周辺網膜退化、黄斑退化、例えば乾燥年齢に関連する黄斑退化、局部貧血及び新血管増殖性の病気、例えば網膜症、特に未熟児の網膜症及び糖尿病性の網膜症、網膜の血管の病気、目の局部貧血症、及び他の血管の異状,年齢に関係する黄斑退化を伴う黄斑浮腫、糖尿病性の網膜症,眼内の炎症又は網膜のジストロフィー、脈絡叢の異常及び腫瘍、硝子体の異常,グリアの増殖例えば増殖性の硝子体の網膜症及び糖尿病性の前網膜の血管形成に関連するグリアの増殖、血管形成,緑内障,開放隅角緑内障,新血管の緑内障,網膜前膜ともまた呼ばれる黄斑ひだ,網膜の皺,前黄斑線維,及びセロハン黄斑障害から選択される病気を予防する及び/又は治療すること意図されている、請求項11又は12に記載の方法。
- 該コルチコステロイドが、トリアムシノロン、アネコルタブ、及びそれらの誘導体、特にトリアムシノロンアセトニド又は酢酸アネコルタブ及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項12又は13に記載の方法。
- 個体において、特に遺伝子治療のための、単離された裸の核酸の細胞内伝達を促進するための活性剤としての医薬品組成物におけるコルチコステロイドであって、該医薬品組成物は該単離された裸の核酸を該個体に投与する5分間〜2時間前に、該個体に投与されることを意図されている、上記コルチコステロイド。
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