JP2013505236A - HIV-1 antibody - Google Patents
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Abstract
本発明は、一般的に、ＨＩＶ−１特異的抗体に、そして特に、ｇｐ４１膜近位外部領域（ＭＰＥＲ）をターゲットとする広範囲中和性ＨＩＶ−１特異的抗体に対する該抗体に関する。本発明はまた、細胞培養系、より具体的には、慢性リンパ球性白血病Ｂ細胞を不死化する方法、およびこうした細胞のクローンから抗ウイルス抗体を単離する方法にも関する。 The present invention relates generally to HIV-1 specific antibodies, and in particular to broadly neutralizing HIV-1 specific antibodies that target the gp41 membrane proximal outer region (MPER). The present invention also relates to cell culture systems, and more particularly to methods for immortalizing chronic lymphocytic leukemia B cells and methods for isolating antiviral antibodies from clones of such cells.
Description
本出願は、どちらもその全内容が本明細書に援用される、２００９年９月１６日出願の米国仮出願第６１／２７２，３４９号および２００９年１０月５日出願の米国仮出願第６１／２４８，７９６号に優先権を請求する。 No. 61 / 272,349, filed Sep. 16, 2009, and US Provisional Application No. 61, filed Oct. 5, 2009, both of which are incorporated herein in their entirety. Request priority to / 248,796.
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金番号第ＡＩ０６７８５４−０５号および助成金番号第ＵＯ１ ＡＩ０６７８５４−０２のもとに米国政府の援助を受けて作成された。米国政府は、本発明において特定の権利を有する。 This invention was made with grant support from the US Government under grant number AI066784-05 and grant number UO1 AI067854-02 awarded by the National Institutes of Health. The US government has certain rights in this invention.
技術分野
本発明は、一般的に、ＨＩＶ−１特異的抗体に、そして特に、ｇｐ４１膜近位外部領域（ＭＰＥＲ）をターゲットとする広範囲中和性ＨＩＶ−１特異的抗体に関する。
TECHNICAL FIELD The present invention relates generally to HIV-1 specific antibodies, and in particular to broadly neutralizing HIV-1 specific antibodies that target the gp41 membrane proximal outer region (MPER).
本発明はまた、細胞培養系、より具体的には、慢性リンパ球性白血病Ｂ細胞を不死化する方法、およびこうした細胞のクローンから抗ウイルス抗体を単離する方法にも関する。 The present invention also relates to cell culture systems, and more particularly to methods for immortalizing chronic lymphocytic leukemia B cells and methods for isolating antiviral antibodies from clones of such cells.
Ｔ細胞および単核食細胞のＨＩＶ−１感染を強力に阻害するヒト抗体を利用する戦略の開発は、ＨＩＶ−１感染の治療および防止のため、高い優先度を持つ（Ｍａｓｃｏｌａら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７９：１０１０３−１０１０７（２００５））。ｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＩＶ−１を広範囲に中和可能であり、そしてｉｎ ｖｉｖｏでＳＨＩＶ感染から非ヒト霊長類を防御可能である、ｇｐ１６０に対するいくつかのまれなヒト・モノクローナル抗体（ｍＡｂ）が単離されてきている（Ｍａｓｃｏｌａら， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ６：２０７−２１０（２０００）、Ｂａｂａら， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ６：２００−２０６（２０００））。これらのｍＡｂには、ｇｐ４１の膜近位外部領域（ＭＰＥＲ）に対する抗体２Ｆ５および４Ｅ１０（Ｍｕｓｔｅｒら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６７：６６４２−６６４７（１９９３）； Ｓｔｉｅｇｌｅｒら， ＡＩＤＳ Ｒｅｓ． ＆ Ｈｕｍ． Ｒｅｔｒｏ． １７：１７５７−１７６５（２００１）、Ｚｗｉｃｋら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７５：１０８９２−１０９０５（２００１））、ｇｐ１２０のＣＤ４結合部位に対するＩｇＧ１ｂ１２（Ｒｏｂｅｎら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６８：４８２１−４８２８（１９９４））、ならびにｇｐ１２０高マンノース残基に対するｍＡｂ ２Ｇ１２（Ｓａｎｄｅｒｓら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７６：７２９３−７３０５（２００２））が含まれる。 The development of strategies that utilize human antibodies that potently inhibit HIV-1 infection of T cells and mononuclear phagocytes has a high priority for the treatment and prevention of HIV-1 infection (Mascola et al., J. Virol). 79: 10103-10107 (2005)). Several rare human monoclonal antibodies (mAbs) against gp160 have been isolated that can extensively neutralize HIV-1 in vitro and can protect non-human primates from SHIV infection in vivo. (Mascola et al., Nat. Med. 6: 207-210 (2000), Baba et al., Nat. Med. 6: 200-206 (2000)). These mAbs include antibodies 2F5 and 4E10 against the membrane proximal external region (MPER) of gp41 (Muster et al., J. Virol. 67: 6642-6647 (1993); Stiegler et al., AIDS Res. & Hum. Retro. 17). : 1757-1765 (2001), Zwick et al., J. Virol.75: 10892-10905 (2001)), IgG1b12 against the CD4 binding site of gp120 (Roben et al., J. Virol. 68: 4821-4828 (1994)), As well as mAb 2G12 (Sanders et al., J. Virol. 76: 7293-7305 (2002)) against the gp120 high mannose residue.
ＨＩＶ−１は、中和抗体から回避するためのいくつかの有効な戦略を発展させてきており、これには中和エピトープのグリカン遮蔽（Ｗｅｉら， Ｎａｔｕｒｅ ４２２：３０７−３１２（２００３））、中和抗体結合に対するエントロピーバリア（Ｋｗｏｎｇら， Ｎａｔｕｒｅ ４２０：６７８−６８２（２００２））、および非中和抗体による抗体反応のマスキングまたは転換（Ａｌａｍら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ８２：１１５−１２５（２００８））が含まれる。熱心な研究にもかかわらず、ｇｐ１２０ ＣＤ４結合部位またはｇｐ４１の膜近位領域のいずれかに対する広範囲中和抗体が、動物またはヒトのいずれにおいてもルーチンに誘導されないのはなぜであるかは謎のままである。 HIV-1 has developed several effective strategies to avoid neutralizing antibodies, including glycan shielding of neutralizing epitopes (Wei et al., Nature 422: 307-312 (2003)), Entropy barrier to neutralizing antibody binding (Kwon et al., Nature 420: 678-682 (2002)), and masking or conversion of antibody responses by non-neutralizing antibodies (Alam et al., J. Virol. 82: 115-125 (2008)) ) Is included. Despite intense research, it remains a mystery why broadly neutralizing antibodies to either the gp120 CD4 binding site or the membrane proximal region of gp41 are not routinely induced in either animals or humans It is.
広範囲中和抗体を誘導するのが困難であるのはなぜかに関する１つの手がかりは、上記ｍＡｂがすべて、珍しい特性を有するという事実の中に見出されうる。ｍＡｂ ２Ｇ１２は、宿主グリコシルトランスフェラーゼによって合成され、そして修飾され、そして従って、自己炭水化物と認識される可能性がある炭水化物に対するものである（Ｃａｌａｒｅｓｅら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １０２：１３３７２−１３３７７（２００５））。２Ｇ１２はまた、連結されたＶＨドメイン交換二量体に組み立てられるＦａｂを持つユニークな抗体でもある（Ｃａｌａｒｅｓｅら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３００：２０６５−２０７１（２００３））。２Ｆ５および４Ｅ１０はどちらも、長いＣＤＲ３ループを持ち、そして宿主脂質を含む多数の宿主抗原と反応する（Ｚｗｉｃｋら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７５：１０８９２−１０９０５（２００１）、Ａｌａｍら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎ． １７８：４４２４−４４３５（２００７）、Ｚｗｉｃｋら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７８：３１５５−３１６１（２００４）、Ｓｕｎら， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２８：５２−６３（２００８））。同様に、ＩｇＧ１ｂ１２もまた、長いＣＤＲ３ループを持ち、そしてｄｓＤＮＡと反応する（Ｈａｙｎｅｓら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０８：１９０６−１９０８（２００５）、Ｓａｐｈｉｒｅら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９３：１１５５−１１５９（２００１））。これらの発見を、自己免疫疾患患者において臨床的ＨＩＶ−１感染がまれであるという知見（ＰａｌａｃｉｏｓおよびＳａｎｔｏｓ， Ｉｎｔｅｒ． Ｊ． ＳＴＤ ＡＩＤＳ １５：２７７−２７８（２００４））と合わせると、広範囲反応性中和抗体のいくつかの種は、免疫寛容機構による下方制御のために作製されないという仮説が生じた（Ｈａｙｎｅｓら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０８：１９０６−１９０８（２００５）、Ｈａｙｎｅｓら， Ｈｕｍ． Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ １４：５９−６７（２００５））。この仮説の帰結として、自己免疫疾患患者には、防御に相関するものとしてのあるタイプの中和抗体を持つ、「曝露され、そして感染していない」被験体がいる可能性もある（Ｋａｙ， Ａｎｎ． Ｉｎｔｅｒ． Ｍｅｄ． １１１：１５８−１６７（１９８９））。ｇｐ４１のＭＰＥＲの２Ｆ５エピトープ領域をターゲットとする広範囲中和性抗体を持つ患者が定義されてきている（Ｓｈｅｎら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ８３：３６１７−２５（２００９））。 One clue as to why it is difficult to induce broadly neutralizing antibodies can be found in the fact that all of the mAbs have unusual properties. mAb 2G12 is synthesized and modified by host glycosyltransferases and is therefore against carbohydrates that may be recognized as self-carbohydrates (Calarese et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 13372). 13377 (2005)). 2G12 is also a unique antibody with Fab assembled into a linked VH domain exchange dimer (Calarese et al., Science 300: 2065-2071 (2003)). Both 2F5 and 4E10 have a long CDR3 loop and react with a number of host antigens including host lipids (Zwick et al., J. Virol. 75: 10892-10905 (2001), Alam et al., J. Immun. 178). : 4424-4435 (2007), Zwick et al., J. Virol. 78: 3155-3161 (2004), Sun et al., Immunity 28: 52-63 (2008)). Similarly, IgG1b12 also has a long CDR3 loop and reacts with dsDNA (Haynes et al., Science 308: 1906-1908 (2005), Saphire et al., Science 293: 1155-1159 (2001)). When combined with the finding that clinical HIV-1 infection is rare in patients with autoimmune disease (Palacios and Santos, Inter. J. STD AIDS 15: 277-278 (2004)) The hypothesis arises that some species of Japanese antibodies are not made for down-regulation by the immune tolerance mechanism (Haynes et al., Science 308: 1906-1908 (2005), Haynes et al., Hum. Antibodies 14: 59-67). (2005)). As a consequence of this hypothesis, patients with autoimmune disease may have “exposed and uninfected” subjects with certain types of neutralizing antibodies as correlated with protection (Kay, Ann. Inter. Med. 111: 158-167 (1989)). Patients with broadly neutralizing antibodies that target the 2F5 epitope region of MPER of gp41 have been defined (Shen et al., J. Virol. 83: 3617-25 (2009)).
本発明は、少なくとも部分的に、広範囲中和活性を与える、Ｓｈｅｎら（Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ８３：３６１７−２５（２００９））の患者由来の２Ｆ５様ｍＡｂを同定するよう設計された研究から生じる。これらの研究は、ＨＩＶ−１感染個体由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来の、酵母またはファージ上にディスプレイされる抗体断片（ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、Ｆａｂ）からライブラリーを調製することを伴った。２Ｆ５エピトープを含有するペプチドで、ならびにｇｐ１４０で、ライブラリーをパニングし、そしてスクリーニングした。ペプチドに特異的に結合する抗体が同定され、こうした結合は、２Ｆ５で競合された。 The present invention arises, at least in part, from studies designed to identify 2F5-like mAbs from patients of Shen et al. (J. Virol. 83: 3617-25 (2009)) that confer extensive neutralizing activity. These studies involved preparing libraries from antibody fragments (scFv, scFab, Fab) displayed on yeast or phage from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from HIV-1 infected individuals. . The library was panned and screened with peptides containing the 2F5 epitope, as well as with gp140. Antibodies that specifically bind to the peptide were identified and such binding was competed with 2F5.
一般的に、本発明は、ＨＩＶ−１特異的抗体に関する。より具体的には、本発明は、ｇｐ４１ ＭＰＥＲをターゲットとする広範囲中和性ＨＩＶ−１特異的抗体に、そして該抗体を用いて、ＨＩＶ−１感染を治療し、そしてかつ防止する方法に関する。本発明はまた、慢性リンパ球性白血病Ｂ細胞を不死化する方法に、そしてこうした細胞のクローンから抗ウイルス抗体を単離する方法にも関する。 In general, the present invention relates to HIV-1 specific antibodies. More specifically, the present invention relates to a broadly neutralizing HIV-1 specific antibody targeting gp41 MPER and to a method for treating and preventing HIV-1 infection using the antibody. The present invention also relates to a method for immortalizing chronic lymphocytic leukemia B cells and to a method for isolating antiviral antibodies from clones of such cells.
本発明の目的および利点は、以下の説明から明らかとなるであろう。 Objects and advantages of the present invention will become apparent from the following description.
本発明は、１つの態様において、被験体細胞（例えばＴ細胞）のＨＩＶ−１による感染を阻害する方法に関する。本発明はまた、初期ウイルス負荷を制御し、そしてＣＤ４＋ Ｔ細胞プールを保持し、そしてＣＤ４＋ Ｔ細胞破壊を防止する方法にも関する。該方法は、被験体（例えばヒト被験体）に、２Ｆ５エピトープに結合するＨＩＶ−１特異的抗体（２Ｆ５以外）、またはその結合断片を、該抗体またはその断片が感染を阻害するような量および条件下で投与する工程を含む。 In one aspect, the invention relates to a method of inhibiting infection of a subject cell (eg, a T cell) with HIV-1. The invention also relates to a method of controlling the initial viral load and retaining the CD4 + T cell pool and preventing CD4 + T cell destruction. The method comprises subjecting a subject (eg, a human subject) an HIV-1 specific antibody (other than 2F5) that binds to the 2F5 epitope, or a binding fragment thereof, in an amount such that the antibody or fragment thereof inhibits infection and Administering under conditions.
本発明に従って、被験体または被験体の免疫系／細胞とＨＩＶ−１が接触する前に、あるいは脆弱性細胞の感染後に、抗体を投与してもよい。接触前または接触直後の投与は、被験体の脆弱性細胞（例えばＴ細胞）の感染の阻害を最大限にしうる。 In accordance with the present invention, the antibody may be administered before HIV-1 is contacted with the subject or the subject's immune system / cell or after infection of vulnerable cells. Administration before or immediately after contact may maximize the inhibition of infection of the subject's vulnerable cells (eg, T cells).
本発明で使用するのに好ましい１つの抗体は、表１に示すようなＭ６６抗体の可変重鎖および可変軽鎖配列を有するｍＡｂである。ＨＩＶ−１感染個体由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来の酵母またはファージ上にディスプレイされる抗体断片（ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、Ｆａｂ）からライブラリーを調製した。２Ｆ５エピトープを含有するペプチド（図１を参照されたい、「ＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬＥＬＤ−ＫＷＡＳＬＷＮ」）で、ならびにｇｐ１４０で、ライブラリーをパニングし、そしてスクリーニングした。ペプチドに特異的に結合する抗体が同定され、こうした結合は、２Ｆ５で競合された。Ｍ６６抗体は、クレードＢ由来の４つの試験した単離体のうち４つを中和した。Ｍ６６の最も近い対応する生殖系列可変重鎖（ＶＨ）遺伝子は、ＩＧＨＶ５−５１＊０１であり、そしてその重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）は、２Ｆ５のもの（２４残基）と匹敵する長さ（２３アミノ酸残基）である。Ｍ６６ ＶＨ遺伝子の体細胞超変異の度合いは、２Ｆ５のものより低い。Ｍ６６抗体の可変重鎖および可変軽鎖遺伝子およびアミノ酸配列を表１に示す。表２には、同定されるＣＤＲ領域の詳細が含まれる。 One preferred antibody for use in the present invention is a mAb having the variable heavy and variable light chain sequences of the M66 antibody as shown in Table 1. Libraries were prepared from antibody fragments (scFv, scFab, Fab) displayed on yeast or phage derived from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from HIV-1 infected individuals. The library was panned and screened with a peptide containing the 2F5 epitope (see FIG. 1, “QQEKNEQELLELD-KWASLWN”), as well as with gp140. Antibodies that specifically bind to the peptide were identified and such binding was competed with 2F5. M66 antibody neutralized four of the four tested isolates from clade B. The closest corresponding germline variable heavy chain (VH) gene of M66 is IGHV5-51 * 01 and its heavy chain complementarity determining region (CDR) is comparable in length to that of 2F5 (24 residues) (23 amino acid residues). The degree of somatic hypermutation of the M66 VH gene is lower than that of 2F5. The variable heavy and variable light chain genes and amino acid sequences of the M66 antibody are shown in Table 1. Table 2 contains details of the identified CDR regions.
表１ Table 1
表２ Table 2
本発明で使用するための別の好ましい抗体は、表３に示すＭ６６．６抗体のような可変重鎖および可変軽鎖配列を有するｍＡｂである。Ｍ６６．６抗体の同一性の詳細を実施例３に提供する。 Another preferred antibody for use in the present invention is a mAb having variable heavy and variable light chain sequences, such as the M66.6 antibody shown in Table 3. Details of the identity of the M66.6 antibody are provided in Example 3.
表３ Table 3
上述のように、損なわれていない抗体またはその断片（例えば抗原結合断片）を本発明の方法で用いてもよい。例示的な機能性断片（領域）には、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片が含まれる。一本鎖抗体もまた用いてもよい。適切な断片および一本鎖抗体を調製するための技術が当該技術分野に周知である（例えば、ＵＳＰ５，８５５，８６６； ５，８７７，２８９； ５，９６５，１３２； ６，０９３，３９９； ６，２６１，５３５； ６，００４，５５５； ７，４１７，１２５および７，０７８，４９１、ならびにＷＯ ９８／４５３３１を参照されたい）。本発明にはまた、具体的に開示される抗体（および断片）の結合特性を保持する変異体を含む、本明細書開示の抗体の変異体（および断片）、および本方法において該変異体を用いる方法も含まれる。例えば、本発明には、ｇｐ４１ ＭＰＥＲに選択的に結合し、そして表２および図４に示すような１またはそれより多いＣＤＲを含む、単離ヒト抗体またはその断片が含まれる。本発明に従って療法的に使用可能なＭ６６およびＭ６６．６の修飾には、Ｍ６６、Ｍ６６．６ ＶＨおよびＶＬ鎖のＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＧ１、２、３または４型が含まれる。 As noted above, intact antibodies or fragments thereof (eg, antigen-binding fragments) may be used in the methods of the invention. Exemplary functional fragments (regions) include scFv, Fv, Fab ′, Fab and F (ab ′) 2 fragments. Single chain antibodies may also be used. Techniques for preparing suitable fragments and single chain antibodies are well known in the art (eg, USP 5,855,866; 5,877,289; 5,965,132; 6,093,399; 6 , 261, 535; 6,004, 555; 7,417, 125 and 7,078, 491 and WO 98/45331). The invention also includes variants (and fragments) of the antibodies disclosed herein, including variants that retain the binding properties of the specifically disclosed antibodies (and fragments), and The method used is also included. For example, the invention includes an isolated human antibody or fragment thereof that selectively binds to gp41 MPER and contains one or more CDRs as shown in Table 2 and FIG. Modifications of M66 and M66.6 that can be used therapeutically according to the present invention include IgA, IgM and IgG1, 2, 3 or 4 types of M66, M66.6 VH and VL chains.
上述の抗体およびその断片を組成物（例えば医薬組成物）として配合してもよい。適切な組成物は、医薬的に許容されうるキャリアー（例えば水性媒体）中に溶解されるかまたは分散された抗体（または抗体断片）を含んでもよい。組成物は、無菌であってもよいし、そして注射可能型であってもよい。抗体（およびその断片）は、また、皮膚または粘膜に対する局所投与に適した組成物として配合されてもよい。こうした組成物は、液体、軟膏、クリーム、ゲルおよびペーストの形を取ってもよい。適切な組成物を調製する際に、標準的配合技術を用いてもよい。性交後膣洗浄として、またはコンドームとともに投与するように、抗体を配合してもよい。 You may mix | blend the above-mentioned antibody and its fragment as a composition (for example, pharmaceutical composition). A suitable composition may comprise an antibody (or antibody fragment) dissolved or dispersed in a pharmaceutically acceptable carrier (eg, an aqueous medium). The composition may be sterile and may be injectable. The antibody (and fragments thereof) may also be formulated as a composition suitable for topical administration to the skin or mucosa. Such compositions may take the form of liquids, ointments, creams, gels and pastes. Standard formulation techniques may be used in preparing the appropriate composition. The antibody may be formulated for vaginal lavage after sexual intercourse or for administration with a condom.
本発明の抗体および抗体断片は、例えば、以下の環境において、予防のための該抗体の有用性を示す：
ｉ）ＨＩＶ−１感染に対して予期される曝露が知られる環境において、本明細書記載の抗体（またはその結合断片）を、消毒剤（ｍｉｃｒｏｂｉｏｃｉｄｅ）として予防的に（例えばＩＶまたは局所的に）投与してもよく、
ｉｉ）レイプ被害者、または商業的風俗店従業員、またはコンドーム保護を伴わないあらゆる異性愛者間の感染で生じるものなどの、曝露が知られるかまたは推測される環境において、本明細書記載の抗体（またはその断片）を、曝露後予防剤として、例えばＩＶまたは局所的に投与してもよく、
ｉｉｉ）急性ＨＩＶ感染（ＡＨＩ）の環境において、本明細書記載の抗体（またはその結合断片）を、初期ウイルス負荷を制御し、そしてＣＤ４＋ Ｔ細胞プールを保持し、そしてＣＤ４＋ Ｔ細胞破壊を防止する、ＡＨＩに関する治療として、投与してもよく、そして
ｉｖ）小児が授乳されている間の母子感染環境において用いてもよい。
The antibodies and antibody fragments of the invention show the utility of the antibodies for prevention, for example, in the following environment:
i) Prophylactically (eg, IV or topically) an antibody (or binding fragment thereof) described herein as a disinfectant in an environment where the expected exposure to HIV-1 infection is known May be administered,
ii) in environments where exposure is known or suspected, such as those arising from infection between rape victims, commercial sex shop employees, or any heterosexual person without condom protection The antibody (or fragment thereof) may be administered as a post-exposure prophylactic agent, eg IV or topically,
iii) In an environment of acute HIV infection (AHI), an antibody (or binding fragment thereof) described herein controls the initial viral load and retains the CD4 + T cell pool and prevents CD4 + T cell destruction It may be administered as a treatment for AHI, and iv) may be used in a mother-to-child transmission environment while the child is breastfeeding.
適切な用量範囲は、例えば、抗体、そして配合物の性質および投与経路に依存しうる。当業者は過度の実験を伴わずに、最適用量を決定可能である。１０ｎｇ〜２０μｇ／ｍｌの範囲の抗体用量が適切でありうる。 The appropriate dosage range can depend, for example, on the antibody and the nature of the formulation and the route of administration. Persons of ordinary skill in the art can determine optimum dosages without undue experimentation. Antibody doses ranging from 10 ng to 20 μg / ml may be appropriate.
別の態様において、本発明は、Ｂ慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）細胞レパートリー由来のモノクローナル抗ウイルス抗体の産生を可能にする細胞培養系を提供する。本発明のこの態様に従って、ＥＢＶ感染後、培養中でＢ−ＣＬＬ細胞を増殖させるフィーダー細胞として、マクロファージ細胞を用いる。 In another aspect, the present invention provides a cell culture system that allows the production of monoclonal antiviral antibodies from the B chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) cell repertoire. In accordance with this aspect of the invention, macrophage cells are used as feeder cells for growing B-CLL cells in culture after EBV infection.
Ｂ−ＣＬＬ細胞の不死化クローンを生成する際に使用するのに適したプロトコルの特定の例を図８に示す。一般的に、マクロファージ細胞株（例えばげっ歯類マクロファージ細胞株）をフィーダーとして用いる。好ましいマクロファージ細胞株はマウス株Ｊ７７４Ａ．１である。Ｊ７７４Ａ．１マクロファージ細胞は、ハイブリドーマ増殖およびクローニングに適した増殖因子を産生することが示されてきている（ＲａｔｈｊｅｎおよびＧｅｃｚｙ， Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ５：２５５−２６１（１９８６））。Ｊ７７４Ａ．１細胞から調製した馴化培地は、ハイブリドーマ生存性を増進させるために広く用いられてきている。Ｔ細胞ならびにＥＢＶ感染Ｂ細胞と、フィーダーとしてのＪ７７４Ａ．１細胞株を同時培養すると、ｉｎ ｖｉｔｒｏでアポトーシス細胞のクリアランスが補助されることもまた示されてきている（Ｋａｇａｎら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６９：４８７−４９９（２００２））。 A specific example of a protocol suitable for use in generating immortalized clones of B-CLL cells is shown in FIG. In general, a macrophage cell line (eg, a rodent macrophage cell line) is used as a feeder. A preferred macrophage cell line is the mouse strain J774A. 1. J774A. One macrophage cell has been shown to produce growth factors suitable for hybridoma growth and cloning (Rathjen and Geczy, Hybridoma 5: 255-261 (1986)). J774A. Conditioned media prepared from one cell has been widely used to enhance hybridoma viability. T cells as well as EBV infected B cells and J774A. It has also been shown that co-culture of one cell line assists the clearance of apoptotic cells in vitro (Kagan et al., J. Immunol. 169: 487-499 (2002)).
本発明に従って、マクロファージ細胞株を放射線照射に供して、フィーダー細胞の成長を防止する。最適γ照射用量は、例えば、細胞株を試験して、細胞増殖を完全に阻害するのに必要な最低用量（例えば約４，０００Ｒａｄ）を決定することによって、実験的に決定可能である。次いで、放射線照射細胞を培養容器内に分配してもよい（例えば９６ウェルプレートを用いる場合、約５０，０００細胞／ウェル（約１００μｌ／ウェル）を分配してもよい）。放射線照射細胞の最適数は、異なる密度で細胞を試験することによって、実験的に決定可能である。 In accordance with the present invention, the macrophage cell line is subjected to radiation to prevent feeder cell growth. The optimal gamma irradiation dose can be determined empirically, for example, by examining the cell line and determining the lowest dose (eg, about 4,000 Rad) required to completely inhibit cell proliferation. Irradiated cells may then be dispensed into culture vessels (eg, about 50,000 cells / well (about 100 μl / well) may be dispensed when using a 96-well plate). The optimal number of irradiated cells can be determined empirically by testing the cells at different densities.
標準的技術を用いて、Ｂ−ＣＬＬ細胞のＥＢＶ感染を達成してもよい。例えば、標準的技術を用いて、ＣＬＬ患者由来の血液試料から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離してもよく、次いで、細胞を完全培地（例えば図９を参照されたい）中で洗浄して、そして例えばＰＳ２００６およびシクロスポリンＡを含む完全培地中に懸濁してもよい。先に記載される方法（Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａら， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． １８：５２３−５２８（２００７））に従って、Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ−９）アゴニストであるＰＳ２００６を添加して、Ｂ細胞を刺激してもよい。シクロスポリンＡを添加して、いかなるＥＢＶ−Ｂ細胞特異的細胞傷害性Ｔ細胞反応を抑制してもよい。ＥＢＶ−Ｂ細胞刺激能を試験することによって、最適濃度を実験的に決定してもよい。 Standard techniques may be used to achieve EBV infection of B-CLL cells. For example, using standard techniques, peripheral blood mononuclear cells (PBMC) may be isolated from a blood sample from a CLL patient, and then the cells are washed in complete medium (see, eg, FIG. 9). And may be suspended in a complete medium containing, for example, PS2006 and cyclosporin A. Stimulating B cells by adding PS2006, a Toll-like receptor 9 (TLR-9) agonist, according to the method described previously (Lanzavecchia et al., Curr. Opin. Biotech. 18: 523-528 (2007)). May be. Cyclosporine A may be added to suppress any EBV-B cell specific cytotoxic T cell response. The optimal concentration may be determined experimentally by testing the ability to stimulate EBV-B cells.
本発明のこの態様に従って、次いで、ＥＢＶ懸濁物を細胞懸濁物に添加する。約３７℃で（例えば約１〜約２４時間、好ましくは約４時間）インキュベーションした後、例えばＰＳ２００６を含む完全培地中にＥＢＶ感染細胞を再懸濁して、放射線照射したマクロファージ細胞とともに、培養容器内に分配して、そして約３７℃でインキュベーションしてもよい。培地を定期的に交換し、そしてＥＢＶ感染細胞が十分に増殖したら（例えば感染約３〜約４週後）、例えばＥＬＩＳＡを用いて抗体産生を評価してもよい。次いで、例えば、図１０に記載するものなどのハイブリドーマ細胞融合法を用いて、ＣＬＬ細胞由来のＩｇＭ産生ハイブリドーマ細胞株を産生し、そしてクローニングしてもよい（一般的に、図１１を参照されたい）。３つのモノクローナルＢ−ＣＬＬハイブリドーマ細胞株が、ＣＬＬ２４６（ＶＨ１−６９、非突然変異症例）、ＣＬＬ１０７５（ＶＨ１−６９、突然変異症例）、およびＣＬＬ４９３（ＶＨ１−６９、非突然変異症例）から得られている（図１２および１３を参照されたい）。 In accordance with this aspect of the invention, the EBV suspension is then added to the cell suspension. After incubation at about 37 ° C. (eg about 1 to about 24 hours, preferably about 4 hours), EBV-infected cells are resuspended in complete medium containing, for example, PS2006, and irradiated with macrophage cells in a culture vessel And may be incubated at about 37 ° C. The medium is changed periodically and once the EBV-infected cells have grown sufficiently (eg, about 3 to about 4 weeks after infection), antibody production may be assessed using, for example, an ELISA. A hybridoma cell fusion method such as that described in FIG. 10, for example, can then be used to produce and clone an IgM-producing hybridoma cell line derived from CLL cells (see generally FIG. 11). ). Three monoclonal B-CLL hybridoma cell lines were obtained from CLL246 (VH1-69, non-mutant case), CLL1075 (VH1-69, mutant case), and CLL493 (VH1-69, non-mutant case) (See FIGS. 12 and 13).
上記方法に従って不死化されたＢ−ＣＬＬ細胞から産生される療法抗体（例えば抗ＨＩＶ抗体、抗Ｃ型肝炎抗体または抗インフルエンザ抗体）、またはその断片（例えば抗原結合断片−例示的な機能性断片（領域）には、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）’２断片が含まれる）を、組成物（例えば医薬組成物）として配合してもよい。適切な組成物は、医薬的に許容されうるキャリアー（例えば水性媒体）中に溶解されるかまたは分散された抗体（または抗体断片）を含んでもよい。組成物は無菌であってもよく、そして注射可能型であってもよい。抗体（およびその断片）は、また、皮膚または粘膜に対する局所投与に適した組成物として配合されてもよい。こうした組成物は、液体、軟膏、クリーム、ゲル、ペーストまたはエアロゾルの形を取ってもよい。適切な組成物を調製する際に、標準的配合技術を用いてもよい。 A therapeutic antibody (eg, an anti-HIV antibody, anti-hepatitis C antibody or anti-influenza antibody) produced from B-CLL cells immortalized according to the above method, or a fragment thereof (eg, antigen-binding fragment-exemplary functional fragment ( (Region) may include scFv, Fv, Fab ′, Fab and F (ab) ′ 2 fragments) as a composition (eg, pharmaceutical composition). A suitable composition may comprise an antibody (or antibody fragment) dissolved or dispersed in a pharmaceutically acceptable carrier (eg, an aqueous medium). The composition may be sterile and may be injectable. The antibody (and fragments thereof) may also be formulated as a composition suitable for topical administration to the skin or mucosa. Such compositions may take the form of liquids, ointments, creams, gels, pastes or aerosols. Standard formulation techniques may be used in preparing the appropriate composition.
抗ＨＩＶ抗体およびその断片は、例えば、以下の環境において、予防のための該抗体の有用性を示す：
ｉ）ＨＩＶ−１感染に対して予期される曝露が知られる環境において、本明細書記載の抗体（またはその結合断片）を、消毒剤として予防的に（例えばＩＶまたは局所的に）投与してもよく、
ｉｉ）レイプ被害者、または商業的風俗店従業員、またはコンドーム保護を伴わないあらゆる異性愛者間の感染で生じるものなどの、曝露が知られるかまたは推測される環境において、本明細書記載の抗体（またはその断片）を、曝露後予防剤として、例えばＩＶまたは局所的に投与してもよく、
ｉｉｉ）急性ＨＩＶ感染（ＡＨＩ）の環境において、本明細書記載の抗体（またはその結合断片）を、初期ウイルス負荷を制御し、そしてＣＤ４＋ Ｔ細胞プールを保持し、そしてＣＤ４＋ Ｔ細胞破壊を防止する、ＡＨＩに関する治療として、投与してもよく、そして
ｉｖ）小児が授乳されている間の母子感染環境において用いてもよい。
Anti-HIV antibodies and fragments thereof show the utility of the antibodies for prevention, for example, in the following environment:
i) In an environment where the expected exposure to HIV-1 infection is known, the antibody (or binding fragment thereof) described herein is administered prophylactically (eg, IV or topically) as a disinfectant. Well,
ii) in environments where exposure is known or suspected, such as those arising from infection between rape victims, commercial sex shop employees, or any heterosexual person without condom protection The antibody (or fragment thereof) may be administered as a post-exposure prophylactic agent, eg IV or topically,
iii) In an environment of acute HIV infection (AHI), an antibody (or binding fragment thereof) described herein controls the initial viral load and retains the CD4 + T cell pool and prevents CD4 + T cell destruction It may be administered as a treatment for AHI, and iv) may be used in a mother-to-child transmission environment while the child is breastfeeding.
上述のような、抗Ｃ型肝炎抗体および抗インフルエンザ抗体、またはその断片を用いて、それぞれ、Ｃ型肝炎感染およびインフルエンザ感染を治療するかまたは防止してもよい。 Anti-hepatitis C and anti-influenza antibodies, or fragments thereof, as described above may be used to treat or prevent hepatitis C infection and influenza infection, respectively.
適切な用量範囲は、例えば、抗体、配合物の性質、投与経路、および患者（例えばヒト患者）に応じる可能性もある。当業者は過度の実験を伴わずに、最適用量を決定可能である。１０ｎｇ〜２０μｇ／ｍｌの範囲の抗体用量が適切でありうる。 Appropriate dose ranges may depend on, for example, the antibody, the nature of the formulation, the route of administration, and the patient (eg, a human patient). Persons of ordinary skill in the art can determine optimum dosages without undue experimentation. Antibody doses ranging from 10 ng to 20 μg / ml may be appropriate.
本発明の特定の側面は、以下の限定されない実施例に、より詳細に記載されうる（米国仮特許出願第６１／２７２，３４９号および第６１／２４８，７６９号、Ｓｈｅｎら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ８３（８）：３６１７−２５ Ｅｐｕｂ ２００９、ＺｈｕおよびＤｉｍｉｔｒｏｖ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５２５：１２９−１４２（２００９）、ＤｉｍｉｔｒｏｖおよびＭａｒｋｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５２５：１−２７（２００９）、Ｚｈａｎｇら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ８２（１４）：６８６９−６８７９（２００８）、Ｐｒａｂａｋａｒａｎら， Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ５５：３３−９７（２００７）、Ｐｅｒｅｚら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ８３（１５）：７３９７−７４１０（２００９）もまた参照されたい）。（Ｃｈａｎら， Ｂｌｏｏｄ ９７： １０２３−１０２６（２００１）； Ｇｏｒｎｙら， Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４６：９１７−９２６（２００９））もまた参照されたい）。
Certain aspects of the invention can be described in more detail in the following non-limiting examples (US
実施例１
急性感染の患者および２Ｆ５様抗体を持つ患者由来のＩｇＭおよびＩｇＧライブラリーを生成し、そしてハイスループット（４５４）配列決定および他の方法によって分析した。２つの時点（４０日および８ヶ月）の急性感染患者の血液から得たＩｇＧライブラリー由来のＨＩＶ−１特異的抗体を同定した。これらの抗体は、高アフィニティでエンベロープ糖タンパク質（Ｅｎｖ）に結合したが、９つの偽ウイルス団を中和しなかった。４０日の試料由来の抗体は、８ヶ月の時点では見出されず、そして８ヶ月の試料由来の抗体は、４０日で優勢なＥｎｖに結合しなかった。同じ患者由来の骨髄由来ライブラリーのパニングは、いかなる抗体の選択も生じなかった。
Example 1
IgM and IgG libraries from acutely infected patients and patients with 2F5-like antibodies were generated and analyzed by high-throughput (454) sequencing and other methods. HIV-1 specific antibodies from an IgG library obtained from the blood of acutely infected patients at two time points (40 days and 8 months) were identified. These antibodies bound to the envelope glycoprotein (Env) with high affinity, but did not neutralize the 9 pseudovirons. No antibody from the 40 day sample was found at 8 months, and the antibody from the 8 month sample did not bind to the dominant Env at 40 days. Panning of bone marrow derived libraries from the same patient did not result in selection of any antibodies.
２Ｆ５様抗体を持つ患者由来のＩｇＭ＋ＩｇＧファージおよび酵母ディスプレイライブラリーから新規抗体を選択した。これらの抗体の１つであるＭ６６は、長い（２３残基の）重鎖ＣＤＲ３を有し、そしてそのＶＨ遺伝子は、比較的少数の体細胞突然変異を有する。該抗体は、２Ｆ５エピトープを含有するｇｐ４１ ＭＰＥＲペプチドに特異的に結合し、そして交差反応性にＨＩＶ−１単離体を中和した。他の抗体が性質決定中である。これらの結果は、体液性免疫反応およびワクチン免疫原の設計を理解するために意味を有しうる（図１および２を参照されたい）。 New antibodies were selected from IgM + IgG phage from patients with 2F5-like antibodies and yeast display libraries. One of these antibodies, M66, has a long (23 residue) heavy chain CDR3 and its VH gene has a relatively small number of somatic mutations. The antibody specifically bound to the gp41 MPER peptide containing the 2F5 epitope and neutralized the HIV-1 isolate in a cross-reactive manner. Other antibodies are being characterized. These results can have implications for understanding the humoral immune response and the design of the vaccine immunogen (see FIGS. 1 and 2).
実施例２
カスタムＨＩＶ−１ルミネックスによって、Ｍ６６抗体遺伝子で安定トランスフェクションされた２９３Ｔ細胞由来の上清を、２Ｆ５エピトープに対する結合に関して評価した。上清の連続希釈を、エピトープに対する結合（平均蛍光強度−ＭＦＩの読み取り値）に関して評価した。実験のための陽性対照には、２Ｆ５ ｍＡｂが含まれ、そしてＨＩＶＩＧ力価測定および陰性対照は、モックトランスフェクション上清であった。Ｍ６６抗体に関する結合データを図３に示す。
Example 2
Supernatant from 293T cells stably transfected with M66 antibody gene was evaluated for binding to the 2F5 epitope by custom HIV-1 Luminex. Serial dilutions of the supernatant were evaluated for binding to the epitope (mean fluorescence intensity—MFI reading). The positive control for the experiment included 2F5 mAb and the HIVIG titer and negative control was mock transfection supernatant. Binding data for the M66 antibody is shown in FIG.
実施例３
実験詳細
ｃＤＮＡ、抗体、ｇｐ１４０およびペプチド
登録１２ヶ月後、患者ＳＣ４４から採取したＰＢＭＬから抽出した総ＲＮＡを用いて、ｃＤＮＡを調製した（Ｓｈｅｎら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ８３：３６１７−２５（２００９））。ＨＩＶ−１ ｇｐ４１ Ｍａｂ ２Ｆ５を、ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ， Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ＡＩＤＳ， ＮＩＡＩＤ， ＮＩＨから得た（Ｈｅｒｍａｎｎ Ｋａｔｉｎｇｅｒ）。組換えｇｐ１４０は、Ｃ． Ｂｒｏｄｅｒ（Ｕｎｉｆｏｒｍｅｄ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， メリーランド州ベセスダ）の厚意によって提供された。２Ｆ５エピトープ配列を含有する２つのビオチン化ペプチド（２Ｆ５ペプチド）をパニングおよび結合アッセイに用いた： ＳＰ６２ ＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬＥＬＤＫＷＡＳＬＷＮおよびＳＰ６２スクランブル化ペプチド。これらのペプチドは、Ｐｒｉｍｍ ＢｉｏｔｅｃｈおよびＣＰＣによって、カスタム作製された。西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート化抗ＦＬＡＧタグ抗体およびＨＲＰコンジュゲート化抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス）から購入した。
Example 3
Experimental Details cDNA, Antibody, gp140 and
ファージディスプレイＦａｂライブラリー構築およびライブラリーパニング、スクリーニング
抗体遺伝子レパートリークローニングのためのテンプレートとして、患者ＳＣ４４のＰＢＭＣから調製されたｃＤＮＡを用いて、公表されたプロトコル（Ｚｈｕら， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５２５：１２９−４２， ｘｖ（２００９））に主に従って、ファージディスプレイＦａｂライブラリーを構築した。ビオチン化ペプチドＳＰ６２およびｇｐ１４０タンパク質を用いて、連続パニングを行い、パニングの最初の３周期は、ストレプトアビジン・コンジュゲート化磁気ビーズ上の１μｇのビオチン化ペプチドに対するパニング、そして第四および第五のパニングは、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート上に１μｇ／ウェルでコーティングされたｇｐ１４０（ＪＲＦＬ）に対するパニングであった。ビーズまたはプレートウェル上の結合したファージを直接用いて、対数増殖期のＴＧ１細胞を感染させ、そしてＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージによってレスキューし、そして次の周期のパニングのために増幅した。第五周期のパニング後、１９０の個々のコロニーを摘み取り、そして記載されるようなファージＥＬＩＳＡスクリーニング（Ｚｈｕら， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５２５：１２９−４２， ｘｖ（２００９））において、２ＹＴ培地内に接種した。同定された陽性結合物を配列決定し、そしてユニークなクローンを発現させ、そして精製したＦａｂを予備的性質決定に用いた。
Phage display Fab library construction and library panning, screening Using a cDNA prepared from PBMC of patient SC44 as a template for antibody gene repertoire cloning, published protocols (Zhu et al., Methods Mol. Biol. 525: 129-42, xv (2009)), a phage display Fab library was constructed. Serial panning was performed with biotinylated peptide SP62 and gp140 protein, the first three cycles of panning being panning against 1 μg biotinylated peptide on streptavidin-conjugated magnetic beads, and fourth and fifth panning Was panning against gp140 (JRFL) coated at 1 μg / well on a 96-well ELISA plate. Bound phage on beads or plate wells were used directly to infect exponentially growing TG1 cells and rescued with M13KO7 helper phage and amplified for the next cycle of panning. After the fifth cycle of panning, 190 individual colonies were picked and in phage ELISA screening as described (Zhu et al., Methods Mol. Biol. 525: 129-42, xv (2009)) in 2YT medium. Vaccinated. Identified positive binders were sequenced and unique clones were expressed and purified Fabs were used for preliminary characterization.
軽鎖シャッフリング・ファージディスプレイライブラリーの生成および選択
本質的に記載されるように（Ｚｈｕら， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５２５：１２９−４２， ｘｖ（２００９））、ｍ６６ Ｆａｂ構築物のＦｄ断片をＰＣＲ増幅し、そして重複ＰＣＲを用いて、元来のＦａｂライブラリー構築中に得られた軽鎖遺伝子レパートリーと融合させ、そしてファージミドベクター内にクローニングした。増幅された鎖シャッフリング・ファージライブラリーをアリコットし、そしてＰＢＳ中の５０％グリセロール中、−８０℃で保存した。ファージライブラリーストックの１つのアリコットを標準プロトコルに従って沈殿させ、そしてビオチン化ＭＰＥＲペプチドに対する２周期のパニングに用い、そしてその後、ターゲットとしてＪＲＦＬ ｇｐ１４０を用いるモノクローナルファージＥＬＩＳＡスクリーニングに用いて、ＭＰＥＲペプチドおよびＪＲＦＬ ｇｐ１４０タンパク質両方に交差反応性に結合可能なクローンを単離した。
Generation and selection of light chain shuffling phage display libraries As described essentially (Zhu et al., Methods Mol. Biol. 525: 129-42, xv (2009)), PCR amplification of the Fd fragment of the m66 Fab construct. And duplicate PCR was used to fuse with the light chain gene repertoire obtained during the original Fab library construction and cloned into a phagemid vector. Amplified strand shuffling phage libraries were aliquoted and stored at -80 ° C in 50% glycerol in PBS. One aliquot of the phage library stock is precipitated according to standard protocols and used for two cycles of panning against biotinylated MPER peptides and then used for monoclonal phage ELISA screening using JRFL gp140 as a target, MPER peptide and JRFL gp140 A clone capable of cross-reactive binding to both proteins was isolated.
ＦａｂのＩｇＧ１への変換
重鎖および軽鎖の同時発現を可能にする、Ｄｅｎｎｉｓ Ｂｕｒｔｏｎ（Ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， カリフォルニア州ラホヤ）の厚意によって提供されたｐＤＲ１２内に、ｐＣｏｍｂ３Ｘ中のｍ６６およびｍ６６．６ Ｆａｂをクローニングした。簡潔には、ＸｂａＩおよびＳａｃＩ部位を通じて、重鎖可変領域をまずｐＤＲ１２内にクローニングした。次いで、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位を通じて、完全軽鎖をｐＤＲ１２内にクローニングした。
Conversion of Fab to IgG1 Within pDR12, courtesy of Dennis Burton (The Scripts Research Institute, La Jolla, Calif.), Which allows heavy and light chain co-expression, m66 and m66.6 Fab in pComb3X Was cloned. Briefly, the heavy chain variable region was first cloned into pDR12 through the XbaI and SacI sites. The complete light chain was then cloned into pDR12 through HindIII and EcoRI sites.
ＦａｂおよびＩｇＧ１の発現
ｍ６６ Ｆａｂ配列を含有するプラスミドでＨＢ２１５１細胞を形質転換した。単一の新鮮なコロニーを２ＹＴ培地＋１００Ａｇ／ｍＬアンピシリン＋０．２％グルコース内に接種した。Ａ６００＝０．５まで、培養物を２５０ｒｐｍ、３７℃で振盪した。イソプロピル−Ｌ−チオ−ｈ−Ｄ−ガラクトピラノシド（１ｍｍｏｌ／Ｌ）を添加して発現を誘導した。３０℃で一晩増殖させた後、培養物を採取した。細菌を５，０００ｇで１５分間遠心分離した。ポリマイシンＢ（１０，０００単位／ｍＬ）を含むＰＢＳ中にペレットを再懸濁した。室温で４５分間インキュベーションすることによって、可溶性Ｆａｂを周辺質から溶出させた。１５，０００ｇで３０分間、抽出物を清澄化した。ＱｉａｇｅｎのＮｉｋｅｌカラム上での精製のため、透明な上清を回収した。
Expression of Fab and IgG1 HB2151 cells were transformed with a plasmid containing the m66 Fab sequence. A single fresh colony was inoculated in 2YT medium + 100 Ag / mL ampicillin + 0.2% glucose. The culture was shaken at 250 rpm and 37 ° C. until A 600 = 0.5. Isopropyl-L-thio-hD-galactopyranoside (1 mmol / L) was added to induce expression. Cultures were harvested after overnight growth at 30 ° C. Bacteria were centrifuged at 5,000 g for 15 minutes. The pellet was resuspended in PBS containing polymycin B (10,000 units / mL). Soluble Fab was eluted from the periplasm by incubation for 45 minutes at room temperature. The extract was clarified at 15,000 g for 30 minutes. The clear supernatant was collected for purification on Qiagen's Nickel column.
２９３フリースタイル細胞中で、ｍ６６およびｍ６６．６ ＩｇＧ１を発現させた。製造者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の指示に従って、２９３Ｆｅｃｔｉｎを用いて、２９３フリースタイル細胞をトランスフェクションした。トランスフェクション４日後、培養上清を採取した。プロテインＡカラム上で、ＩｇＧ１を精製した。 M66 and m66.6 IgG1 were expressed in 293 freestyle cells. 293 freestyle cells were transfected with 293Fectin according to the manufacturer's instructions (Invitrogen). Four days after transfection, the culture supernatant was collected. IgG1 was purified on a protein A column.
ＥＬＩＳＡ結合アッセイ
ビオチン化ペプチドまたはｇｐ１４０を捕捉するための抗原（ストレプトアビジン）を、ＰＢＳ中、５０ｎｇ／ウェルで、狭小ウェル９６ウェルプレート上に、４℃で一晩コーティングした。ファージＥＬＩＳＡのため、各周期のパニング由来の１０１０のファージを、抗原とインキュベーションした。抗Ｍ１３−ＨＲＰポリクローナル抗体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， ニュージャージー州ピスカタウェイ）を用いて、結合したファージを検出した。可溶性Ｆａｂ結合アッセイのため、抗Ｆｌａｇ ＨＲＰコンジュゲートを用いて、結合を検出した。ＩｇＧ１結合ＥＬＩＳＡのため、ＨＲＰコンジュゲート化ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を検出に用いた。
ELISA binding assay Antigen to capture biotinylated peptide or gp140 (streptavidin) was coated at 50 ng / well in PBS onto narrow well 96 well plates overnight at 4 ° C. For phage ELISA, 10 10 phage from each cycle of panning were incubated with antigen. Bound phage was detected using an anti-M13-HRP polyclonal antibody (Pharmacia, Piscataway, NJ). For soluble Fab binding assays, binding was detected using anti-Flag HRP conjugate. For IgG1 binding ELISA, HRP-conjugated goat anti-human IgG antibody was used for detection.
偽ウイルス中和アッセイ
製造者の指示に従って、ＰｏｌｙＦｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を用いることにより、７０〜８０％集密（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）の２９３Ｔ細胞を、ｐＮＬ４−３．ｌｕｃ．Ｅ−Ｒ−、およびＨＩＶ−１ ＥｎｖをコードするｐＳＶ７ｄ構築物（Ｇ． Ｑｕｉｎｎａｎ， ＵＳＵＨＳ， メリーランド州ベセスダより寄贈）で同時トランスフェクションすることによって、ＨＩＶ−１ Ｅｎｖで偽型化されたウイルスを調製した。２４時間後、遠心分離および０．４５μｍフィルターを通じた細胞培養ろ過によって、偽型化ウイルスを得た。中和のため、異なる濃度の抗体とウイルスを３７℃で１時間混合し、そして次いで、９６ウェルプレートの各ウェル中で増殖させた、≒１．５ｘ１０４ ＨＯＳ−ＣＤ４−ＣＣＲ５（Ｒ５および二重向性ウイルスに用いる）またはＨＯＳ−ＣＤ４−ＣＸＣＲ４細胞に混合物を添加した。Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ， ウィスコンシン州マディソン）およびＬｕｍｉＣｏｕｎｔマイクロプレート・ルミノメーター（Ｔｕｒｎｅｒ Ｄｅｓｉｇｎｓ）を用いることによって、４８時間後に発光を測定した。２つ組ウェルに関する平均相対光単位（ＲＬＵ）を測定した。以下の式：（１−抗体含有ウェルの平均ＲＬＵ／ウイルスのみのウェルの平均ＲＬＵ）ｘ１００によって、阻害パーセントを計算した。
Pseudovirus neutralization assay By using PolyFect transfection reagent (Qiagen) according to the manufacturer's instructions, 70-80% confluent 293T cells were transformed into pNL4-3. luc. Preparation of HIV-1 Env pseudotyped virus by co-transfection with pSV7d constructs encoding ER- and HIV-1 Env (G. Quinnan, USUHS, donated by Bethesda, MD) did. After 24 hours, pseudotyped virus was obtained by centrifugation and cell culture filtration through a 0.45 μm filter. For neutralization, different concentrations of antibody and virus were mixed at 37 ° C. for 1 hour and then grown in each well of a 96-well plate, ≈1.5 × 10 4 HOS-CD4-CCR5 (R5 and double The mixture was added to HOS-CD4-CXCR4 cells). Luminescence was measured after 48 hours by using a Bright-Glo luciferase assay system (Promega, Madison, Wis.) And a LumiCount microplate luminometer (Turner Designs). The average relative light unit (RLU) for duplicate wells was measured. The percent inhibition was calculated by the following formula: (1-mean RLU of antibody-containing wells / average RLU of virus-only wells) × 100.
ＰＢＭＣに基づく中和アッセイ
多周期のウイルス複製後、ＬｕｃＲレポーター遺伝子発現における減少として、ＰＢＭＣアッセイにおいてＨＩＶ−１の中和を測定した。９６ウェルＵ底培養プレート中、総体積１５０μｌのＩＬ−２含有増殖培地中、２つ組で、試験試料の連続３倍希釈（全部で８希釈）とウイルスを３７℃で１時間インキュベーションした。１日齢のＰＨＡ−ＰＢＭＣ（５０μｌのＩＬ−２含有増殖培地中、２ｘ１０５細胞）を各ウェルに添加した。対照ウェルの１セットは、ウイルスを加えた細胞を添加され（ウイルス対照）、そして別のセットは細胞のみを添加された（バックグラウンド対照）。４日間のインキュベーション後、ＶｉｖｉＲｅｎ生細胞基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、レニラ属（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ発光を測定するため、１００μｌの細胞を９６ウェル白色固体プレート（Ｃｏｓｔａｒ）にトランスファーした。
PBMC-based neutralization assay HIV-1 neutralization was measured in the PBMC assay as a decrease in LucR reporter gene expression after multiple cycles of virus replication. In 96 well U-bottom culture plates, virus was incubated for 1 hour at 37 ° C. with serial 3-fold dilutions (total 8 dilutions) of test samples in duplicate in growth medium containing IL-2 in a total volume of 150 μl. One day old PHA-PBMC (2 × 10 5 cells in growth medium containing 50 μl IL-2) was added to each well. One set of control wells was added with cells plus virus (virus control) and another set was added with cells only (background control). After 4 days of incubation, 100 μl of cells were transferred to 96-well white solid plates (Costar) to measure Renilla luciferase luminescence using ViviRen live cell substrate (Promega).
ＴＺＭ／ｂｌおよびＴＺＭ−ｂｌ／ＦｃγＲＩに基づく、偽ウイルス中和アッセイ
ＴＺＭ／ｂｌ細胞およびＦｃγＲＩを発現しているＴＺＭ−ｂｌ細胞に基づく偽ウイルス中和アッセイは、先に、Ｐｅｒｅｚら（Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ８３（１５）：７３９７−７４１０（２００９））に記載された。
Pseudovirus neutralization assay based on TZM / bl and TZM-bl / FcγRI A pseudovirus neutralization assay based on TZM / bl cells and TZM-bl cells expressing FcγRI was previously described by Perez et al. (J. Virol). 83 (15): 7397-7410 (2009)).
患者ＳＣ４４由来の全ＩｇＧ由来ＶＨ遺伝子レパートリーの４５４配列決定
テンプレートとして患者から単離されたｃＤＮＡを用いることによって、ＩｇＧ由来Ｆｄ断片をＰＣＲ増幅した。用いたセンスプライマーは、先に記載され（Ｚｈｕら， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５２５： １２９−４２， ｘｖ（２００９））；アンチセンスプライマーはＩｇＧＲ（５’−ＡＣＴＡＧＴＴＴＴＧＴＣＡＣＡＡＧＡＴＴＴＧＧＧＣＴＣＡＡＣＴＢＴＣＴＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧＴＧ ＴＴＧＣ−３’）であり、これはＩｇＧ１〜４すべてに共有される。５０μｌの体積で２５周期、ＰＣＲを行った。産物をゲル精製し、そして次いで、４５４配列特異的アダプターを含有するプライマー（ＨＦ１２： ５’−ＣＣＡＴＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣＧＴＧＴＣＴＣＣＧＡＣＴＣＡＧＴＡＣＴＧＡＧＣＴＡＧＣＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＣＣＡＴＧＧＣＣ−３’およびＨＲ２： ５’ＣＣＴＡＴＣＣＣＣＴＧＴＧＴＧＣＣＴＴＧＧＣＡＧＴＣＴＣＡＧＧＴＣＡＣＡＡＧＡＴＴＴＧＧＧＣＴ ＣＡＡＣ−３’）を用いた、さらに１２周期の二次ＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして用いた。生じた産物をゲル精製し、そして記載されるように、４５４配列決定に供した（ｗｗｗ．４５４．ｃｏｍ）。
454 sequencing of the whole IgG-derived VH gene repertoire from patient SC44 The IgG-derived Fd fragment was PCR amplified by using cDNA isolated from the patient as a template. The sense primer used was described previously (Zhu et al., Methods Mol. Biol. 525: 129-42, xv (2009)); Is shared by all IgG1-4. PCR was performed for 25 cycles in a volume of 50 μl. The product was gel purified and then primers containing 454 sequence-specific adapters (HF12: 5'-CCATCTCATCCCTGCCGGTCTCCGCACTCAGTACTGAGCTAGCTGCCCCAACCAGCCATGGCCTGTGCTGTGG Used as a template for amplification. The resulting product was gel purified and subjected to 454 sequencing as described (www.454.com).
４５４配列決定を通じて得られたＶＨ遺伝子レパートリーに対して、ｍ６６ＶＨおよび生殖系列Ｖ遺伝子セグメントを用いた、類似性検索
各データベース・エントリーに対して、標準的Ｐｅｒｌ Ｓｔｒｉｎｇ：：Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙモジュール（Ｍａｒｃ ＬｅｈｍａｎｎによるＣＰＡＮ Ｓｔｒｉｎｇ−Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ−１．０４）を適用することによって、ｍ６６ ＶＨ、生殖系列プローブおよびＳＣ４４ ＶＨ遺伝子レパートリーデータベース間の類似性マッチを得た。開始位置１・・ｎにＳｔｒｉｎｇ：：Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙアルゴリズムを連続して適用することによって、各配列比較に関する単一最適スコアを得た。選択した閾値（類似性パーセント）に、またはそれより上に属するスコアを、後の分析のために保持した。
Similarity search using the m66VH and germline V gene segments against the VH gene repertoire obtained through 454 sequencing For each database entry, the standard Perl String :: Similarity module (CPAN String by Marc Lehmann) -Similarity between the m66 VH, germline probe and SC44 VH gene repertoire database was obtained by applying -Similarity-1.04). A single optimal score for each sequence comparison was obtained by sequentially applying the String :: Similarity algorithm to the
結果
ファージディスプレイライブラリーを通じたｍ６６の単離およびアフィニティ成熟
ＭＰＥＲペプチドおよびｇｐ１４０タンパク質に対する５周期のパニング後、モノクローナルファージスクリーニングのため、１９０のランダムクローンを摘み取った。これらの同定された陽性クローンの配列分析によって、ｍ６６と称される１つのユニークなクローンが同定されることが示され、ｍ６６ ＶＨ遺伝子をプローブとして用いて、ＩＭＧＴオンラインデータベースを検索した。図４に示すように、ｍ６６ ＶＨは、ＶＨ５１−１ Ｖ遺伝子から得られ、重鎖Ｖ遺伝子セグメントに８つの突然変異があり；ｍ６６ＶＬはＶＫ−１−３９から得られ、軽鎖Ｖ遺伝子セグメントには３つの突然変異がある。２Ｆ５および４Ｅ１０とは対照的に、ｍ６６ ＶＨおよびＶＬは、その生殖系列先祖から有意に少数の突然変異しか経ておらず、これはｍ６６がなお、抗体成熟プロセスの初期段階にあることを示す可能性もある。重鎖ＣＤＲ３が、多数のチロシンおよび１つのフェニルアラニンを含む２３残基を有することが観察された。
Results Isolation and affinity maturation of m66 through phage display library After 5 cycles of panning against MPER peptide and gp140 protein, 190 random clones were picked for monoclonal phage screening. Sequence analysis of these identified positive clones showed that one unique clone called m66 was identified and the IMGT online database was searched using the m66 VH gene as a probe. As shown in FIG. 4, m66 VH is obtained from the VH51-1 V gene and there are 8 mutations in the heavy chain V gene segment; m66VL is obtained from VK-1-39 and is in the light chain V gene segment. Has three mutations. In contrast to 2F5 and 4E10, m66 VH and VL have undergone significantly fewer mutations from their germline ancestry, which may indicate that m66 is still in the early stages of the antibody maturation process There is also. It was observed that heavy chain CDR3 has 23 residues including multiple tyrosines and one phenylalanine.
ｍ６６の結合アフィニティをさらに改善するため、２ｘ１０８のサイズの軽鎖シャッフリングライブラリーを上記のように構築した。鎖シャッフリングライブラリーをＭＰＥＲペプチドに対して２周期パニングし、その後、ターゲットとしてｇｐ１４０タンパク質を用いてファージＥＬＩＳＡスクリーニングを行った。予期されるように、同じ重鎖を共有するが、同じＶＬサブファミリーからいくつかの突然変異を含む異なる軽鎖と対形成する、６つのユニークなクローンが同定された。ＥＬＩＳＡデータは、これらがすべて、該ペプチドおよびｇｐ１４０の両方に、同様によく結合することを示した（データ未提示）。６つのクローンのうち、軽鎖Ｖ遺伝子セグメント中に９つの突然変異を有するものをｍ６６．６と称し、そしてこれをさらなる性質決定のため、ＩｇＧ１に変換した。 To further improve the binding affinity of m66, a 2 × 10 8 size light chain shuffling library was constructed as described above. The chain shuffling library was panned for two cycles against the MPER peptide, followed by phage ELISA screening using gp140 protein as a target. As expected, six unique clones were identified that shared the same heavy chain but paired with different light chains containing several mutations from the same VL subfamily. ELISA data showed that they all bind equally well to both the peptide and gp140 (data not shown). Of the 6 clones, the one with 9 mutations in the light chain V gene segment was designated m66.6 and was converted to IgG1 for further characterization.
ＭＰＥＲペプチドおよびｇｐ１４０両方に対するｍ６６の特異的結合
図５に示すように、ＭＰＥＲペプチドおよびＪＲＦＬ ｇｐ１４０の両方に対する結合に関して、２Ｆ５ ＩｇＧと、２９３フリースタイル細胞における一過性発現由来の精製ｍ６６．６ ＩｇＧ１を並べて試験した。データは、ｍ６６．６および２Ｆ５ ＩｇＧ１が、ＥＬＩＳＡにおいて、ＭＰＥＲペプチドおよびｇｐ１４０タンパク質の両方に、同様によく結合することを示した。先の報告と一致して、ｍ６６．６および２Ｆ５ ＩｇＧ１はどちらも、ｇｐ１４０タンパク質よりもＭＰＥＲペプチドによりよく結合した。
Specific binding of m66 to both MPER peptide and gp140 As shown in FIG. 5, for binding to both MPER peptide and JRFL gp140, 2F5 IgG and purified m66.6 IgG1 derived from transient expression in 293 freestyle cells. Tested side by side. The data showed that m66.6 and 2F5 IgG1 bind equally well to both the MPER peptide and the gp140 protein in the ELISA. Consistent with previous reports, both m66.6 and 2F5 IgG1 bound to the MPER peptide better than the gp140 protein.
ｍ６６ ＦａｂおよびＩｇＧ１の中和活性
ＭＰＥＲ領域への結合は、必ずしも抗体が中和することを意味しないことが報告されてきている。ｍ６６およびｍ６６．６ ＩｇＧの中和をさらに試験し、そして中和活性を２Ｆ５と並べて比較した。結果は、ｍ６６．６中和幅が２Ｆ５と非常に似ていることを立証した。また、表４に示すように、ｍ６６．６中和は、ｍ６６に比較して劇的に増加するが、ｇｐ１４０タンパク質に対するｍ６６およびｍ６６．６ ＩｇＧの結合活性は非常に類似である（データ未提示）。同様に、ｍ６６．６および２Ｆ５ ＩｇＧ１は、ＭＰＥＲペプチドおよびＪＲＦＬ ｇｐ１４０タンパク質の両方に等しくよく結合するが、総合して、ｍ６６．６の中和能は、中和アッセイのこのセットにおいて、２Ｆ５のものより低い。
Neutralizing activity of m66 Fab and IgG1 It has been reported that binding to the MPER region does not necessarily mean that the antibody is neutralized. The neutralization of m66 and m66.6 IgG was further tested and the neutralizing activity was compared side by side with 2F5. The results demonstrated that the m66.6 neutralization width was very similar to 2F5. Also, as shown in Table 4, m66.6 neutralization is dramatically increased compared to m66, but the binding activity of m66 and m66.6 IgG to gp140 protein is very similar (data not shown) ). Similarly, m66.6 and 2F5 IgG1 bind equally well to both the MPER peptide and JRFL gp140 protein, but overall, the neutralizing capacity of m66.6 is that of 2F5 in this set of neutralization assays. Lower.
表４ 一連のＨＩＶ単離体に対するｍ６６およびｍ６６．６の中和活性 Table 4 Neutralizing activity of m66 and m66.6 against a range of HIV isolates
ＦｃγＲＩ受容体によって仲介されるｍ６６．６ ＩｇＧ１の中和強化
ＭＰＥＲ領域をターゲットとする、２Ｆ５および４Ｅ１０などの広範囲中和抗体が、中和アッセイにおいて、ターゲット細胞上でＦｃγＲＩもまた発現されている場合、はるかにより高い強度で偽ウイルス感染を中和可能であることが繰り返し示されてきている（Ｐｅｒｅｚら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ８３（１５）：７３９７−４１０（２００９）， Ｅｐｕｂ ２００９ Ｍａｙ ２０）。ｍ６６．６もまた同じ特徴を共有するかどうかを試験するため、ｍ６６．６ ＩｇＧ１の中和活性もまた、ＴＺＭ−ｂｌ／ＦｃγＲＩ細胞に対して試験し、ｍ６６Ｆａｂおよび関連しない抗体、ｍ１０２．４を対照として用いた。表５に示すデータは、ｍ６６．６ ＩｇＧ１の中和能が、１０００倍より増加した一方、対照ｍ６６Ｆａｂに関しては増加がまったく観察されなかったことを示し、劇的な増加は、ｍ６６．６ ＩｇＧ１のＦｃ部分が、ターゲット細胞表面上の過剰発現されたＦｃγＲＩに結合したことに起因することが示された。
Enhanced neutralization of m66.6 IgG1 mediated by FcγRI receptor When broadly neutralizing antibodies such as 2F5 and 4E10 targeting the MPER region are also expressed on target cells in neutralization assays It has been repeatedly shown that it is possible to neutralize pseudoviral infection with much higher intensity (Perez et al., J. Virol. 83 (15): 7397-410 (2009), Epub 2009 May 20). To test whether m66.6 also shares the same characteristics, the neutralizing activity of m66.6 IgG1 was also tested against TZM-bl / FcγRI cells, and m66Fab and an unrelated antibody, m102.4, were tested. Used as a control. The data shown in Table 5 shows that the neutralizing capacity of m66.6 IgG1 was increased by a factor of 1000, whereas no increase was observed for the control m66 Fab, a dramatic increase of m66.6 IgG1 It was shown that the Fc portion was due to binding to overexpressed FcγRI on the target cell surface.
表５ ＴＺＭ−ｂｌ／ＦｃγＲＩ細胞のＨＩＶ偽ウイルス感染の強力な中和 Table 5 Strong neutralization of HIV pseudoviral infection of TZM-bl / FcγRI cells
１値は相対発光単位（ＲＬＵ）がウイルス対照ウェル（試験試料なし）に比較して５０％減少した濃度（μｇ／ｍｌ）である。
４５４配列決定および配列分析を通じた、ＩｇＧ特異的ＶＨ遺伝子レパートリー分析
他のｍ６６変異体もまた、このレパートリー中に存在するが、ライブラリー構築およびパニング中に同定されなかったことが予期される。ｍ６６様抗体の存在をさらに確認するため、そしてまたｍ６６のアフィニティ成熟経路を探索するため、患者ＳＣ４４ ＰＢＭＣ由来ｃＤＮＡから増幅されたＳＣ４４ ＩｇＧ特異的ＶＨ遺伝子レパートリーを用いて、４５４ハイスループット配列決定を行い、配列決定実験から総数３９２，１９８のユニークな機能性ＶＨ配列を得た。Ｍ６６ ＶＨをプローブとして用いて、ＶＨ遺伝子レパートリーを検索し、そして上述のような類似性検索を通じて、一連のｍ６６ ＶＨ変異体もまた同定した。これらの配列から作製された系統樹は、ｍ６６ ＶＨがなお、進化プロセスの初期段階にあることを示し（図７）、これは、より遅い時点での抗体に比較して、登録１２ヶ月後の血清抗体のＭＰＥＲペプチド結合活性がなお、比較的中程度であることを示した、先の報告と一致する（Ｓｈｅｎら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ８３：３６１７−２５（２００９））。
One value is the concentration (μg / ml) at which the relative luminescence unit (RLU) is reduced by 50% compared to the virus control well (no test sample).
IgG-specific VH gene repertoire analysis through 454 sequencing and sequence analysis It is expected that other m66 variants were also present in this repertoire but were not identified during library construction and panning. To further confirm the presence of m66-like antibodies, and also to explore the m66 affinity maturation pathway, 454 high-throughput sequencing was performed using the SC44 IgG-specific VH gene repertoire amplified from patient SC44 PBMC-derived cDNA. A total of 392,198 unique functional VH sequences were obtained from sequencing experiments. M66 VH was used as a probe to search the VH gene repertoire, and a series of m66 VH variants were also identified through similarity searches as described above. The phylogenetic tree generated from these sequences shows that m66 VH is still in the early stages of the evolutionary process (FIG. 7), which is 12 months after enrollment compared to antibodies at later time points. Consistent with previous reports that showed that the MPER peptide binding activity of serum antibodies was still relatively moderate (Shen et al., J. Virol. 83: 3617-25 (2009)).
全レパートリーにおけるＶＨ生殖系列遺伝子使用をプロファイリングするため、７つのＶＨサブファミリー、すなわちＶＨ１−６９、ＶＨ２−５、ＶＨ３−２３、ＶＨ４−１、ＶＨ５１−１、ＶＨ６−１およびＶＨ７−１の各々由来の７つの生殖系列遺伝子セグメントをプローブとして用いて、全ＶＨ遺伝子レパートリーに対する類似性検索を行った。各検索由来のすべての配列をプローブに対する類似性に従ってランク付けし、そして図６に示すように類似性パーセントおよび７つのプローブに対してプロットした。この患者から血液試料を採取した特定の時点で、このレパートリー中、ＶＨ５１−１由来遺伝子が、不均衡に拡大されていることが見出された。このファミリーにおいて、やはり多数のｖ遺伝子が、生殖系列配列に対して非常に高い相同性を示し、このうちいくつかは生殖系列配列に同一のＶ遺伝子配列さえ示す。これらのクローンのＨＣＤＲ３がまた、非常に多様な配列を示すという事実（データ未提示）によって、このユニークなＩｇＧレパートリーが、単一Ｂ細胞ではなく、近い関係のＢ細胞プールから得られることも示した。しかし、他のサブファミリー由来の他のＶ遺伝子プローブを用いた他の類似性検索では、こうした現象は観察されなかった。このデータセットは、Ｂ細胞のこの特定のプールが、ＩｇＭ段階での体細胞超変異およびアフィニティ変異を経ずに、Ｂ細胞発達プロセスの極初期段階で活性化され、そしてＩｇＭからＩｇＧのクラススイッチを経ていることを示す可能性もある。これはまた、これらの多重特異性自己反応性抗体が、ｉｎ ｖｉｖｏで、免疫寛容をどのように克服し、そしてＨＩＶに対する広範囲中和抗体に進化するのかを説明する可能性もある。 To profile VH germline gene usage in the entire repertoire, from each of the seven VH subfamilies: VH1-69, VH2-5, VH3-23, VH4-1, VH51-1, VH6-1 and VH7-1 A similarity search was performed on the entire VH gene repertoire using these seven germline gene segments as probes. All sequences from each search were ranked according to similarity to the probe and plotted against percent similarity and 7 probes as shown in FIG. At specific time points when blood samples were taken from this patient, it was found that in this repertoire, the VH51-1-derived genes were expanded disproportionately. In this family, too, many v genes show very high homology to germline sequences, some of which even show V gene sequences that are identical to germline sequences. The fact that the HCDR3 of these clones also display a highly diverse sequence (data not shown) also indicates that this unique IgG repertoire is derived from a closely related B cell pool rather than a single B cell. It was. However, this phenomenon was not observed in other similarity searches using other V gene probes from other subfamilies. This data set shows that this particular pool of B cells is activated at the very early stages of the B cell development process without undergoing somatic hypermutation and affinity mutation at the IgM stage, and an IgM to IgG class switch. There is also a possibility that it has gone through. This may also explain how these multispecific autoreactive antibodies overcome immune tolerance in vivo and evolve into broadly neutralizing antibodies against HIV.
実施例４
図１４に示すように、Ｊ７７４Ａ．１フィーダー細胞は、エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）感染後、Ｂ−ＣＬＬ細胞（ＣＬＬ２４６）の増殖および該細胞からのＩｇＭ産生を増進させる。ＥＢＶとインキュベーションした後、Ｂ−ＣＬＬ細胞を５，０００細胞／ウェルで、（Ａ）Ｊ７７４Ａ．１細胞の非存在下または（Ｂ）放射線照射したＪ７７４Ａ．１細胞の存在下（５０，０００細胞／ウェル）でプレーティングした。感染３週後、ＥＬＩＳＡによってＩｇＭレベルを検出し、そしてμｇ／ｍｌで表した。
Example 4
As shown in FIG. One feeder cell enhances the proliferation and production of IgM from B-CLL cells (CLL246) following Epstein-Barr virus (EBV) infection. After incubation with EBV, B-CLL cells were grown at 5,000 cells / well, (A) J774A. In the absence of 1 cell or (B) irradiated J774A. Plated in the presence of 1 cell (50,000 cells / well). Three weeks after infection, IgM levels were detected by ELISA and expressed in μg / ml.
図１５に示すように、ＣＬＬ２４６細胞は、ＨＩＶ−１ ｇｐ１４０およびＣ型肝炎ウイルスＥ２（ＨＣＶ Ｅ２）エンベロープタンパク質の両方に対するＩｇＭを産生する。試験抗原に対するＩｇＭをＥＬＩＳＡによって検出し、そしてＯＤで表した（図１６もまた参照されたい）。 As shown in FIG. 15, CLL246 cells produce IgM against both HIV-1 gp140 and hepatitis C virus E2 (HCV E2) envelope protein. IgM against the test antigen was detected by ELISA and expressed in OD (see also FIG. 16).
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