JP2013505014A - ウラン（ｖｉ）還元に関与するタンパク質の単離 - Google Patents

ウラン（ｖｉ）還元に関与するタンパク質の単離 Download PDF

Info

Publication number
JP2013505014A
JP2013505014A JP2012529395A JP2012529395A JP2013505014A JP 2013505014 A JP2013505014 A JP 2013505014A JP 2012529395 A JP2012529395 A JP 2012529395A JP 2012529395 A JP2012529395 A JP 2012529395A JP 2013505014 A JP2013505014 A JP 2013505014A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
uranium
reduction
contaminated
bioremediation
thermus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2012529395A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2013505014A5 (ja
Inventor
エロル ダンカン カソン
ヘールデン エスタ ファン
リゼル アン ピアテル
アビサ ギャネンドラ ジュグダフェ
マルワイク ジャクリーン ファン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of the Free State
Original Assignee
University of the Free State
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of the Free State filed Critical University of the Free State
Publication of JP2013505014A publication Critical patent/JP2013505014A/ja
Publication of JP2013505014A5 publication Critical patent/JP2013505014A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A62—LIFE-SAVING; FIRE-FIGHTING
    • A62D—CHEMICAL MEANS FOR EXTINGUISHING FIRES OR FOR COMBATING OR PROTECTING AGAINST HARMFUL CHEMICAL AGENTS; CHEMICAL MATERIALS FOR USE IN BREATHING APPARATUS
    • A62D3/00—Processes for making harmful chemical substances harmless or less harmful, by effecting a chemical change in the substances
    • A62D3/02—Processes for making harmful chemical substances harmless or less harmful, by effecting a chemical change in the substances by biological methods, i.e. processes using enzymes or microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01G—COMPOUNDS CONTAINING METALS NOT COVERED BY SUBCLASSES C01D OR C01F
    • C01G43/00—Compounds of uranium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Geology (AREA)
  • General Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Emergency Management (AREA)
  • Business, Economics & Management (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Processing Of Solid Wastes (AREA)

Abstract

本発明は、ウラン（VI）のウラン（IV）への還元に関与するタンパク質の単離及び特性評価に関する。本発明は、ウラン（VI）のウラン（IV）への還元における単離されたタンパク質の使用に及び、さらに、Ｕ（VI）源で汚染された用地のバイオレメディエーション又は少なくとも部分的なレメディエーションのための方法に及ぶ。本発明は、その第１の態様によれば、ウラン（VI）源におけるウラン（VI）のウラン（IV）への還元に関与する、サーマス・スコトダクタス株ＳＡ−０１由来の単離されたポリペプチドであって、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。

Description

本発明は、ウラン（VI）のウラン（IV）への還元に関与するタンパク質の単離及び特性評価に関する。本発明は、ウラン（VI）のウラン（IV）への還元における単離されたタンパク質の使用に及び、さらに、Ｕ（VI）源で汚染された用地のバイオレメディエーション又は少なくとも部分的なレメディエーションのための方法に及ぶ。
過去１０年間に、いかなる条件が生き物に適合するかに関する我々の概念は顕著に変化した。以前の人間中心の自然観は、新しい微生物及びそのゲノムを入手する能力を制限してきたが、地球上、さらには地下（４ｋｍを超える）、又は氷点下の温度や高レベルの放射線の殆どあらゆる環境が、それに特別に適応した生命体を含有し得るとの発見によって、微生物の生物多様性が非常に重要であるという考えが理解されるようになった。
微生物界の最も驚異的な特色の１つは、ここ数十年の間に（化学）工業によって開発された最も有毒で一見扱いの難しい物質であっても、通常、いずれかの微生物によって分解できると判明したことである。微生物は、汚染された環境における金属等、多種多様の化学物質と遭遇する可能性があり、そのためこれらの金属と相互作用するとしても不思議はない（Nies, D.H., and Silver, S. (1995) Ion efflux systems involved in bacterial metal resistances. Journal of Industrial Microbiology 14: 186-199）。
汚染された環境から単離されたＵ（VI）耐性菌は、還元（一般に、細菌による）又はバイオソープション（通常、真菌による）のいずれかにより、有毒なＵ（VI）を環境から首尾よく除去する能力を保有することが示された（Van Heerden, E., Opperman, D.J., Bester, P.A., van Marwijk, J., Cason, E.D., Litthauer, D., Piater, L.A. and Onstott, T.C. (2008) Metabolic promiscuity from the deep subsurface: A story of Survival or Superiority. Proceedings of SPIE - The International Society for Optical Engineering 7097:70970S）。
近年、微生物による金属の還元は、このような転換が無機及び有機種両方の循環に決定的な役割を果たし得るため関心を集め、したがって、実用化の可能性を有する新規の刺激的な研究分野を開拓した（Anderson, R.T., Fleisher, M.Q. and LeHuray, A.P. (1998) Concentration, oxidation state, and particulate flux of uranium in the Black sea. Geochimica et Cosmochimica Acta. 53: 2215-2224、Rooney-Varga, J., Anderson, R.T., Fraga, J.L., Ringleberg, D. and Lovley, D.R. (1999) Microbial communities associated with anaerobic benzene degradation in a petroleum- contaminated aquifer. Applied and Environmental Microbiology. 65:3056-3063、D.R. Lovely and J.R. Lloyd (2000) Microbes with a metal for bioremediation, Nat. Biotechnol. 18, pp. 600-601、Anderson, R.T., Vrionis, H.A., Ortiz-Bernad, I., Resch, C.T., Long, P.E., Dayvault, R., Karp, K., Marutzky, S, Metzler, D.R., Peacock, A., White, D.C., Lowe, M. and Lovley, D.R. (2003) Stimulating the in situ activity of Geobacter species to remove uranium from the groundwater of a uranium-contaminated aquifer. Applied Environmental Microbiology. 69:5884-5891、Lovley, D.R., Holmes, D.E. and Nevin, K.P. (2004) Dissimilatory Fe(III) and Mn(IV) reduction. Advances in Microbial Physiology. 49:219-286）。異化型金属還元細菌（ＤＭＲＢ）は、Ｈ２又は有機物の酸化と種々の多価金属の還元とを共役させることにより、嫌気増殖を支えるためのエネルギーを獲得することを示した。この代謝は、嫌気条件下における有機物の完全な無機化、又は金属汚染物質の沈殿及び固定化を生じさせ得る（Sani, R.K., B. Peyton, W. Smith, W. Apel, and J. Petersen. (2002) Dissimilatory reduction of Cr(VI), Fe(III), and U(VI) by Cellulomonas isolates”. Appl. Microbiol. Biotechnol. 60:192-199）。
ウラン汚染された用地のバイオレメディエーションのために、元素化学は、過去２０年間多くの注目を集めてきたアプローチを提案する。ウランの酸化状態は、その安定性、移動性及びバイオアベイラビリティに決定的である。ウランの酸化型又は六価（VI）状態は、高度に可溶性、したがって移動性であるが、還元型又は四価（IV）状態は、相対的に不溶性である。廃棄物において、ウランは、主としてウラニルイオン（ＵＯ２ ２＋）の可溶性塩として存在する。ウラニルイオンが、Ｕ（VI）酸化状態からＵ（IV）等、より低酸化状態へと還元されると、溶解度が低下して固定化されるようになる。
Ｕ（VI）を還元することが当技術分野において知られている細菌のリストは伸び続けている。サーマス・スコトダクタス（Thermus scotoductus）ＳＡ−０１をＵ（VI）と共に嫌気的にインキュベートすると、Ｕ（VI）は溶液から析出するようになり、これはサーマス・スコトダクタスＳＡ−０１がＵ（VI）を還元する能力を有することを示唆する。研究は、サーマス・スコトダクタスＳＡ−０１が、嫌気条件下、電子供与体として乳酸塩を用いると、３０時間未満で０．２５ｍＭ Ｕ（VI）溶液のほぼ１００％を還元する能力を有することも示した（Van Heerden, E., Opperman, D.J., Bester, P.A., van Marwijk, J., Cason, E.D., Litthauer, D., Piater, L.A. and Onstott, T.C. (2008) Metabolic promiscuity from the deep subsurface: A story of Survival or Superiority. Proceedings of SPIE - The International Society for Optical Engineering 7097:70970S）。
Nies, D.H., and Silver, S. (1995) Ion efflux systems involved in bacterial metal resistances. Journal of Industrial Microbiology 14: 186-199 Van Heerden, E., Opperman, D.J., Bester, P.A., van Marwijk, J., Cason, E.D., Litthauer, D., Piater, L.A. and Onstott, T.C. (2008) Metabolic promiscuity from the deep subsurface: A story of Survival or Superiority. Proceedings of SPIE - The International Society for Optical Engineering 7097:70970S Anderson, R.T., Fleisher, M.Q. and LeHuray, A.P. (1998) Concentration, oxidation state, and particulate flux of uranium in the Black sea. Geochimica et Cosmochimica Acta. 53: 2215-2224 Rooney-Varga, J., Anderson, R.T., Fraga, J.L., Ringleberg, D. and Lovley, D.R. (1999) Microbial communities associated with anaerobic benzene degradation in a petroleum- contaminated aquifer. Applied and Environmental Microbiology. 65:3056-3063 D.R. Lovely and J.R. Lloyd (2000) Microbes with a metal for bioremediation, Nat. Biotechnol. 18, pp. 600-601 Anderson, R.T., Vrionis, H.A., Ortiz-Bernad, I., Resch, C.T., Long, P.E., Dayvault, R., Karp, K., Marutzky, S, Metzler, D.R., Peacock, A., White, D.C., Lowe, M. and Lovley, D.R. (2003) Stimulating the in situ activity of Geobacter species to remove uranium from the groundwater of a uranium-contaminated aquifer. Applied Environmental Microbiology. 69:5884-5891 Lovley, D.R., Holmes, D.E. and Nevin, K.P. (2004) Dissimilatory Fe(III) and Mn(IV) reduction. Advances in Microbial Physiology. 49:219-286 Sani, R.K., B. Peyton, W. Smith, W. Apel, and J. Petersen. (2002) Dissimilatory reduction of Cr(VI), Fe(III), and U(VI) by Cellulomonas isolates". Appl. Microbiol. Biotechnol. 60:192-199
しかし、Ｕ（VI）還元に関係する機序及びこれらの機序に関係するタンパク質については殆ど分かっておらず、よって、いかなるタンパク質（単数又は複数）がウラン還元に関与するかについての確実な証拠は、依然として不十分である。
本明細書の目的において、「ポリペプチド」は、ペプチド結合により結合した２以上のアミノ酸を含むペプチド又はタンパク質を意味するものと理解される。
本発明は、その第１の態様によれば、ウラン（VI）源におけるウラン（VI）のウラン（IV）への還元に関与する、サーマス・スコトダクタス株ＳＡ−０１由来の単離されたポリペプチドであって、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
単離されたポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル解析によって示される、７０ｋＤａの分子量を有する均質なタンパク質であることを特徴とする。
本発明は、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴＰ解析によって明らかにされる、ペプチドＡＢＣトランスポーター、ペプチド結合タンパク質である単離されたポリペプチドをさらに提供する。
本出願人は、本明細書において同定された単離されたポリペプチドが、２以上の機能、即ちペプチドＡＢＣトランスポーター、ペプチド結合タンパク質の機能及びウラン還元酵素の機能を実施できると確信する。このようなタンパク質は通例、当技術分野において「二重機能（moonlighting）タンパク質」と言う。
本明細書において同定された単離されたポリペプチドはジスルフィド結合を保有し、これは還元剤によって開裂するとＵ（VI）還元のための核形成部位を供給する。
本発明は、その第２の態様によれば、配列番号２のヌクレオチド配列を含む、配列番号１のアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子を提供する。
参照を容易にするために、本明細書において参照され本明細書と共に出願した配列表に含有されるアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を下にも記す。配列番号１に表記されている下線部のアミノ酸は、このポリペプチドをペプチドＡＢＣトランスポーター、ペプチド結合タンパク質として同定するために用いたＮ末端アミノ酸配列を表す。
配列番号１
MetArgLysValGlyLysLeuAlaValPheGlyLeuAlaAlaLeuGlyLeuAlaLeuAlaGlyProGlnAspAsnSerLeuValIleGlyAlaSerGlnGluProArgValLeuAlaGlyAspPheLeuSerIleIleSerAsnGlnSerIleLysLeuGluIleGluGlnTyrLeuPheAlaProLeuIleGlyPheAsnAlaAsnSerGluAsnPheProValLeuValThrGluValProThrArgGlnAsnGlyArgLeuArgValThrAspIleGlyGlyGlyLysLysArgLeuGluMetAspLeuThrIleArgProAspAlaArgTrpSerAspGlyLysProIleThrThrGluAspValAlaPheTyrTyrGluValGlyLysAlaLysGlyMetProValLeuAsnProAspTyrTrpGluArgValAsnLeuArgValArgAspAlaArgAsnPheThrValIlePheGluProAlaTyrTyrTyrAspThrTyrGlyGlyThrTyrGlySerProIleGlyTyrAlaProLysHisIleMetGlyAlaGluTrpGluLysValLysAlaAlaAlaArgAsnLeuAspProAspLysAspAlaGluArgLeuAsnGluLeuTyrArgAsnPhePheLeuLysPheAlaThrProGlnAlaLeuAsnArgGlyAlaMetValTyrSerGlyAlaPheLysLeuArgArgTrpValProGlyAsnSerIleGluMetGluArgAsnProAsnPheProIleLysProGluGlyGlyGluSerArgTyrValGlnArgValValTyrArgPheIleGlnAsnThrAsnSerLeuLeuValAlaValLeuGlyGlySerIleAspAlaThrSerSerValSerLeuThrPheAspGlnGlyArgSerArgGlnLeuThrSerArgAlaProGlyArgPheAspIleTrpPheValProGlyAlaIleTrpGluHisIleAspValAsnLysPheGluAsnCysGlnAlaValArgAspLeuGlyLeuAsnAspValArgThrArgArgAlaLeuLeuHisAlaLeuAsnArgGluGlyLeuValLysAlaPhePheAspGlyLeuGlnProValAlaHisThrTrpIleAlaProValAsnProLeuPheAsnProAsnValArgLysTyrGluPheAspLeuLysLysAlaGluAlaLeuLeuAlaGluMetGlyTrpArgLysGlyProAspGlyIleLeuGlnArgThrValGlyGlyArgThrValArgPheGluIleGluPheValThrThrAlaGlyAsnAlaIleArgGluArgThrGlnGlnPhePheAlaGluAspLeuLysLysIleGlyIleAlaValLysIleAsnAsnAlaProSerAlaValValPheAlaAspAspTyrIleGlnArgAlaSerGluCysLysTrpThrGlyLeuPheGluPheAlaTrpValSerAsnLeuAlaGluAspGlySerLeuPheGlnTyrLysAsnLeuAsnThrGlyAlaIleMetValProThrLysGluAsnAsnTyrGlnGlyGlnAsnIleGlyGlyTrpArgAsnAspGluPheAspArgLeuThrSerGlnGlyValLeuGluPheAspGluAlaArgArgLysGlnLeuPheTrpArgAlaGlnGluIleTrpAlaGluGluLeuProAlaLeuProLeuTyrPheArgAlaAsnProTyrValValArgLysGlyLeuValAsnTyrValAlaSerAlaTyrAlaGlyGlyTyrGlyTyrProGlyTrpAsnAlaTrpGluIleGlyTrpGluSerArgGlyAlaValLysLysTrpAspGlnAlaLysTyrAlaLeuSerValLys
配列番号２
ATGAGAAAAGTAGGCAAGCTGGCTGTATTCGGTTTAGCCGCCCTGGGCTTGGCCCTGGCGGGGCCCCAGGACAACAGCCTGGTCATAGGGGCTTCGCAGGAGCCCCGGGTTCTGGCGGGGGACTTCCTAAGCATCATCTCCAACCAGTCCATCAAGTTGGAGATCGAGCAGTACCTCTTCGCCCCCCTCATCGGTTTCAACGCCAACAGCGAAAACTTTCCCGTGCTGGTCACCGAGGTG
CCCACCCGGCAAAACGGGCGTTTGCGGGTGACGGACATCGGCGGGGGCAAGAAGCGCTTGGAGATGGACCTCACCATCCGGCCCGATGCCCGCTGGTCCGACGGCAAGCCCATCACCACCGAGGATGTGGCCTTCTACTACGAGGTGGGCAAGGCCAAGGGGATGCCGGTGCTCAACCCGGACTACTGGGAGCGGGTGAACCTCCGGGTCAGGGACGCCCGCAACTTCACCGTGATCTTT
GAGCCCGCCTACTACTACGACACCTACGGCGGCACCTACGGCTCCCCCATCGGCTACGCTCCCAAGCACATCATGGGCGCCGAGTGGGAGAAGGTGAAAGCGGCGGCCCGGAACCTGGATCCCGATAAGGATGCGGAGAGGCTCAACGAGCTCTACCGCAACTTCTTCCTCAAGTTCGCCACTCCCCAGGCCCTAAACCGGGGAGCCATGGTCTACTCGGGGGCCTTCAAGCTGCGGCGC
TGGGTGCCGGGGAACTCCATTGAGATGGAGCGGAACCCCAACTTCCCCATCAAGCCCGAGGGTGGGGAGAGCCGGTACGTGCAGAGGGTGGTCTACCGCTTCATCCAGAACACCAACTCCCTCCTGGTGGCCGTCCTGGGCGGGAGCATTGACGCCACCTCCAGCGTCTCCCTCACCTTTGACCAAGGCCGTAGCCGCCAGCTCACCTCCCGGGCCCCTGGCCGCTTTGACATCTGGTTC
GTGCCCGGGGCCATCTGGGAGCACATTGACGTCAACAAGTTTGAGAACTGCCAGGCGGTCCGCGACTTGGGCCTGAACGACGTCCGCACCCGTCGGGCCCTCCTCCACGCTCTGAACCGCGAGGGGTTGGTCAAGGCCTTCTTTGACGGCCTCCAGCCCGTGGCCCACACCTGGATCGCCCCCGTCAACCCCCTCTTCAACCCCAATGTGCGGAAGTACGAGTTTGACCTGAAGAAGGCG
GAGGCGCTCTTGGCGGAGATGGGCTGGAGGAAGGGGCCGGACGGCATCCTTCAGCGCACCGTGGGTGGCCGCACCGTGCGCTTTGAGATTGAGTTCGTCACCACCGCGGGCAACGCTATCCGGGAGCGCACCCAGCAGTTCTTCGCCGAGGACCTGAAGAAGATCGGCATCGCCGTCAAGATCAATAACGCCCCCAGCGCCGTGGTCTTCGCCGACGACTACATCCAGCGGGCCAGCGAG
TGCAAGTGGACCGGGCTGTTTGAGTTCGCTTGGGTTTCCAACCTGGCCGAGGATGGCTCCCTCTTCCAGTACAAGAACCTGAACACCGGGGCCATCATGGTGCCCACCAAGGAGAACAACTACCAGGGGCAGAACATCGGCGGCTGGCGCAACGACGAGTTTGACCGTCTGACGAGCCAGGGTGTCCTGGAGTTTGACGAGGCCAGGCGGAAGCAGCTCTTCTGGAGGGCCCAGGAGATC
TGGGCCGAGGAGCTGCCTGCCTTGCCCCTCTACTTCCGCGCTAACCCCTACGTGGTGCGGAAGGGCCTGGTCAACTACGTGGCCAGCGCTTACGCGGGCGGCTACGGTTACCCCGGCTGGAACGCTTGGGAGATCGGCTGGGAGAGCCGCGGCGCCGTGAAGAAGTGGGACCAGGCGAAGTACGCTCTTTCCGTCAAGTAA
本発明の一実施形態において、本明細書において同定されたポリペプチドは、サーマス・スコトダクタス株ＳＡ−０１の培養物から単離、回収及び精製される。このような回収及び精製に適した例示的な手順として、当技術分野において公知且つ記載されている種類のカラムクロマトグラフィー法及び分子ふるいの技法が挙げられる。本発明は、その一実施形態において、ニッケルアフィニティーカラムクロマトグラフィーとそれに続くゲル濾過により達成されるタンパク質の精製を提供する。本発明は、その代替的な一実施形態において、熱変性とそれに続くゲル濾過により精製されるタンパク質を提供する。
代替的な一実施形態において、配列番号１のポリペプチドは、宿主細胞において該ポリペプチドをコードする配列番号２のヌクレオチド配列を発現させることにより組換えにより生成される。発現ベクターを活用し、配列番号２のヌクレオチド配列を含有する核酸分子は、宿主細胞にトランスフェクトされ発現されてよい。
このように、本発明はまた、配列番号２のヌクレオチド配列を包含するベクター、１又は２以上の組換え発現ベクターにより遺伝子操作された宿主細胞及び本明細書において同定された配列番号１のポリペプチドの、当技術分野においてよく知られた組換え技法による生成に関する。
本発明は、
ａ）配列番号２の核酸分子を宿主細胞にトランスフェクトするステップと、
ｂ）宿主細胞を培養して、宿主細胞において配列番号１のポリペプチドを発現させるステップとを包含し、
ｃ）配列番号１のポリペプチドを単離及び精製するステップを包含してもよい、
ウラン（VI）源におけるウラン（VI）のウラン（IV）への還元に関与する、本明細書において同定された少なくとも１種類のポリペプチドを生成するための方法をさらに提供する。
また、本発明によれば、上述の宿主細胞から得られたＵ（VI）耐性遺伝子又はその任意のＵ（VI）耐性機能部分で形質転換された微生物が提供される。
本発明の目的において、ウラン還元酵素活性は、六価ウランの減少を測定することにより決定される。ウラン還元酵素活性は、２−（５−ブロモ−２−ピリジルアゾ）−５−ジエチルアミノフェノールを用いて分光光度的に測定される。
本発明は、その第３の態様によれば、Ｕ（VI）源で汚染された用地のバイオレメディエーション又は少なくとも部分的なバイオレメディエーションのための方法であって、サーマス・スコトダクタス株ＳＡ−０１の増殖を刺激してそこに存在するＵ（VI）源におけるＵ（VI）をＵ（IV）へと還元するために、汚染された用地に電子供与体を導入するステップを含む、又はＵ（VI）汚染された用地から環境媒体を取り出し、このような環境媒体に電子供与体を十分な期間導入して、サーマス・スコトダクタス株ＳＡ−０１に、そこに存在するＵ（VI）源におけるＵ（VI）をＵ（IV）へと還元させるステップを含む方法を提供する。
本発明の一実施形態において、サーマス・スコトダクタス株ＳＡ−０１は、南アフリカ北西州のウィットウォータースランド盆地（Witwatersrand Basin）北西部周縁に位置する、Western Deep Levels社によって運営されるムポネン（Mponeng）鉱山に由来する、又はこの用地から得られた環境媒体に由来する。
本明細書の目的において、用語「環境媒体」は、固体及び液体廃棄物、土壌、堆積物、水塊又はそれらの１若しくは２以上の組合せを意味する。
本発明の一実施形態において、Ｕ（VI）源は、ＵＯ２（ＣＨ３ＣＯＯ）２．２Ｈ２Ｏ及びＵＯ２（ＮＯ３）２からなる群から選択される。本発明のウラン源は前述に限定されず、よっていかなる適切な六価ウラン源であってもよいことが理解されるであろう。
本発明の一実施形態において、還元は好気条件下及び／又は嫌気条件下において行われる。好ましくは、還元型Ｕ（IV）が酸化されてＵ（VI）になるのを妨げるように、還元は嫌気条件下において行われる。
本明細書において先に述べた通り、Ｕ（VI）のＵ（IV）への還元は、電子供与体により惹起される。電子供与体は、当技術分野において公知且つ記載されている種類のいずれの適切な電子供与体であってもよいことが理解されるであろう。本発明の一実施形態において、電子供与体は、Ｈ２、還元型キノン（特に、ヒドロキノン）、酢酸塩、乳酸塩、クエン酸、及びピルビン酸塩からなる群から選択される。
先述の方法は、インサイチュ（in situ）、エクスサイチュ（ex situ）又はその両方で実施され得る、六価Ｕ源で汚染された用地のバイオレメディエーション又は少なくとも部分的なバイオレメディエーションに用いることができる。
本発明は、その第４の態様によれば、ウラン（VI）源におけるウラン（VI）のウラン（IV）への還元における、本明細書において同定され、特徴付けられた配列番号１の単離されたポリペプチドの使用を提供する。
その上、本発明は、Ｕ（VI）汚染された用地又はＵ（VI）汚染された環境媒体のバイオレメディエーション又は少なくとも部分的なバイオレメディエーションにおける、サーマス・スコトダクタス株ＳＡ−０１の使用を提供する。
本発明は、さらに、Ｕ（VI）汚染された用地又はＵ（VI）汚染された環境媒体のバイオレメディエーション又は少なくとも部分的なバイオレメディエーションにおける、レメディエーション又は少なくとも部分的にレメディエーションされるべきＵ（VI）汚染された用地又はＵ（VI）汚染された環境媒体に由来するサーマス・スコトダクタス株ＳＡ−０１の使用を提供する。
また、本発明によれば、Ｕ（VI）汚染された用地又はＵ（VI）汚染された環境媒体のバイオレメディエーション又は少なくとも部分的なバイオレメディエーションにおける、上述の宿主細胞から得られたＵ（VI）耐性遺伝子又はその任意のＵ（VI）耐性機能部分で形質転換された微生物の使用が提供される。
本発明の上述及び他の目的、特徴及び利点は、当業者であれば、本発明の詳細な説明を読み進むことにより明らかになるであろう。
様々な濃度のウランにおけるサーマス・スコトダクタスの増殖曲線を表示するグラフである。播種におけるＴＹＧ培地（■）並びに０．２５ｍＭ（▲）、０．５ｍＭ（▼）、０．７５ｍＭ（◆）、１．０ｍＭ（●）、１．２５ｍＭ（□）及び１．５ｍＭ（△）Ｕ（VI）を補正したＴＹＧ培地（ｔ＝０）。 特定の希釈ウラン試料の光学密度読み取り値対、特定の希釈ウラン試料の公知のＵ（VI）濃度の検量線を表示するグラフである。 非増殖条件下におけるＴ．スコトダクタスＳＡ−０１によるウラン（VI）の還元を示すグラフである。０．２５ｍＭ Ｕ（VI）及び電子供与体として１０ｍＭ乳酸塩を含有するアッセイ溶液と共にある対数期後期に収集された細胞（■）、０．２５ｍＭ Ｕ（VI）を含有し電子供与体を含有しない、対数期後期に収集された細胞の対照アッセイ溶液（▲）、０．２５ｍＭ Ｕ（VI）及び電子供与体として１０ｍＭ乳酸塩を含有するアッセイ溶液と共にある対数期初期に収集された細胞（▼）、０．２５ｍＭ Ｕ（VI）を含有し電子供与体を含有しない、対数期初期に収集された細胞の対照アッセイ溶液（◆）、０．２５ｍＭ Ｕ（VI）及び電子供与体として１０％水素を含有するアッセイ溶液と共にある対数期後期に収集された細胞（●）、オートクレーブした細胞を伴い電子供与体を伴わない対照アッセイ溶液（□）、電子供与体として１０ｍＭ乳酸塩（△）及び１０％水素（▽）を伴い、細胞を欠く対照アッセイ溶液。 透析し、電子供与体として１０％Ｈ２ガス及びヒドロキノンでパージした後の、Ｔ．スコトダクタスＳＡ−０１から得られた膜及び周辺質画分の組合せのウラン（VI）還元活性を表示するグラフである。 ウラン（VI）還元活性に係るSuper-Q Toyopearlの溶出プロファイルを表示するグラフである。 ウラン（VI）還元活性に係るSP Toyopearlの溶出プロファイルを表示するグラフである。 単離されたウラン還元酵素タンパク質を表示するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル解析の図である。 様々なｐＨ値におけるウラン（VI）の還元を表示するグラフである。ｐＨ値（■）５．５、（▲）６．０、（▼）６．５、（△）ｐＨ７．０、（◆）５．５タンパク質不含対照、（●）ｐＨ６．０タンパク質不含対照、（□）ｐＨ６．５タンパク質不含対照、（▽）ｐＨ７．０タンパク質不含対照。 様々なｐＨ値におけるウラン（VI）の還元を表示するグラフである。ｐＨ値（▲）７．５、（■）８．０、（▼）８．５、（◆）９．０、（□）ｐＨ７．５タンパク質不含対照、（●）ｐＨ８．０タンパク質不含対照、（△）ｐＨ８．５タンパク質不含対照、（▽）ｐＨ９．０タンパク質不含対照。 ブランク速度を差し引いた、５５℃（■）及び６５℃（▲）におけるウラン（VI）の還元を表示するグラフである。
次に、本開示の主題は、代表的な実施形態が示されている添付の実施例を参照することにより以下により十分に記載されている。しかし、本開示の主題は様々な形態に具体化することができ、本明細書において説明されている実施形態に限定されると解釈するべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が完璧且つ完全となり、実施形態の範囲が当業者に十分に伝わるよう提供される。
［実施例］
次のステップに従って本発明を実施した。
サーマス・スコトダクタスＳＡ−０１の増殖
本明細書において用いられている好熱性細菌サーマス・スコトダクタス株ＳＡ−０１は、Western Deep Levels社によって運営される南アフリカ北西州のウィットウォータースランド盆地北西部周縁に位置するムポネン金鉱のおよそ３．２ｋｍの深さで試料採取した地下水から、Kieftらによって１９９９年に単離された。
ＡＴＣＣ受託番号７００９１０（American Type Culture Collection）において寄託されたサーマス・スコトダクタスＳＡ−０１をグリセロールストックから固体ＴＹＧ培地上にプレーティングし、２４時間６５℃で増殖させた。次に、これを固体ＴＹＧ培地上に再度プレーティングし、２４時間６５℃で増殖させた。次に、プレートからのループ１掻きの増殖菌を５０ｍｌの液体ＴＹＧ培地に播種することにより前接種菌液を調製した。これを８時間６５℃で増殖させ、その後１０ｍｌの増殖菌を９０ｍｌの液体ＴＹＧ培地に移した。次に、これを８時間６５℃で増殖させ、その後５ｍｌの増殖菌を９５ｍｌの液体ＴＹＧ培地に移した。
生物が対数期後期まで増殖するのに必要な時間として、８時間を事前に決定した。
図１から分かるように、サーマス・スコトダクタスＳＡ−０１は、最大１．２５ｍＭのウラン濃度において増殖する能力を有する。しかし、前記の図からさらに分かるように、１．２５ｍＭを超えるウラン濃度の増加は、サーマス・スコトダクタスＳＡ−０１が効果的に増殖する能力を減少させる。
Ｕ（VI）の分光光度的決定
あらゆる試薬は、分析試薬グレードのものを用いた。標準液の調製には脱イオン蒸留水を用いた。ＵＯ２（ＣＨ３ＣＯＯ）２．２Ｈ２Ｏを水に溶解することにより１００ｍＭ溶液を調製した。調製した溶液を暗所で保存し、系列希釈に用いた。５−Ｂｒ−ＰＡＤＡＰを用いてこの試薬をエタノールに溶解することによって０．０５％溶液を調製した。１ｇのＮａＦ及び１３ｇのスルホサリチル酸（sulphosalicyclic acid）を４０ｍｌの水に溶解することによって錯化リガンド溶液（ｐＨ７．８）を調製し、次にＮａＯＨでｐＨを調整し、溶液を１００ｍｌになるよう希釈した。１４ｇのＴＥＡを８０ｍｌの水に希釈することによってバッファー溶液（ｐＨ７．８）を調製し、次に過塩素酸でｐＨを調整し、溶液を一晩放置した。使用前に、過塩素酸でバッファー溶液のｐＨを７．８に調整し、溶液を１００ｍｌになるよう希釈した。光学密度測定は全て、Spectronic（登録商標）Genesys（商標）5において６００ｎｍで行った（Johnson, D.A. and Florence, T.M. (1971) Spectrophotometric determination of uranium(VI) with 2-(5-bromo-2-pyridylazo)-5-diethylaminophenol. Analitica Chimica. Acta. 53:73-79）。
ストック溶液を水で希釈することによってＵ（VI）希釈液を作製した。２５μｌの錯化溶液を含有する１．５ｍｌエッペンドルフチューブに１００μｌのＵ（VI）希釈液を入れた。上の溶液に１００μｌのバッファー溶液及び８０μｌのＢｒ−ＰＡＤＡＰ溶液を添加し、６２０μｌのエタノール及び７５μｌの水により調合した。この有色の溶液を約２時間静置し、試薬ブランクに対する５７８ｎｍの吸光度を測定した（Johnson, D.A. and Florence, T.M. (1971) Spectrophotometric determination of uranium(VI) with 2-(5-bromo-2-pyridylazo)-5-diethylaminophenol. Analitica Chimica. Acta. 53:73-79）。
図２に表示されている通り、特定の希釈された試料の光学密度読み取り値対、特定の希釈された試料の公知のＵ（VI）濃度をプロットすることにより検量線を作成した。
非増殖条件下におけるサーマス・スコトダクタスＳＡ−０１によるＵ（VI）還元
増殖標準化接種菌液からＴ．スコトダクタスＳＡ−０１細胞を収集した。細胞を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．０で３回洗浄し、細胞懸濁液をＯ２不含Ｎ２でパージした。アッセイ開始のために、アッセイ溶液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．０中の酢酸ウラニルに加え電子供与体として乳酸Ｎａ）を含有するチューブに終濃度０．２５ｍＭ Ｕ（VI）及び１０ｍＭ電子供与体となるよう培養物の試料を添加し、後述する解析に付した。この操作は、全て嫌気チャンバー内で行って、還元型Ｕ（IV）が酸化されてＵ（VI）になるのを妨げた。細胞不含対照と共に電子供与体不含対照も調製した。
六価ウランの減少を測定することによりウラン還元酵素活性を決定した。２−（５−ブロモ−２−ピリジルアゾ）−５−ジエチルアミノフェノールを用いてＵ（VI）を分光光度的に解析した（Johnson, D.A. and Florence, T.M. (1971) Spectrophotometric determination of uranium(VI) with 2-(5-bromo-2-pyridylazo)-5-diethylaminophenol. Analitica Chimica. Acta. 53:73-79）。
サーマスＳＡ−０１をＵ（VI）と嫌気的にインキュベートすると、細胞ペレット中に形成した黒色沈殿物に示唆されるように、Ｕ（IV）は溶液から析出するようになる（Haas, J.R. and Northup, A. (2004) Effects of aqueous complexation on reductive precipitation of uranium by Shewanella putrefaciens. Geochemical Transactions. 5:41-48）。図３から分かるように、大部分のウラン（VI）は２０時間足らずの内にＵ（IV）へと転換し、これは文献中の以前の記載と一致した（Kieft, T.L., Fredrickson, J.K., Onstott, T.C., Gorby, Y.A., Kostandarithes, H.M., Bailey, T.J., Kennedy, D.W., Li, S.W., Plymale, A.E., Spadoni, C.M. and Gray, M.S. (1999) Dissimilatory reduction of Fe(III) and other electron acceptors by a Thermus isolate. Applied Environmental Microbiology. 65:1214-1221）。
電子供与体なしであっても、細胞は依然として六価ウランを還元できることが観察された。細胞不含対照において化学的還元は観察されず、これは還元が細胞活性に起因するものに違いないことを示す。
実験が完了した後、用いた細胞を一晩酸素に曝露したところ、黒色沈殿物は消失した。空気に曝露した後にウラン（VI）決定も行ったところ、試料中の大部分のＵ（IV）が酸化してＵ（VI）になっていたことが判明した。ウラン錯体、例えばＵ（VI）リン酸塩型の錯体が生物沈殿又は生物濃縮により形成されても、好気条件下においてＵ（VI）の再出現をもたらさないため、この結果はＵ（VI）のＵ（IV）への還元が起こったことを示唆する。
様々な電子供与体によるウラン（VI）還元
細胞全体のウラン（VI）還元に最も効果的な電子供与体を決定するため、最適であると決定した電子供与体を用いて種々の還元アッセイを実行した。この点において、Ｈ２、還元型キノン（特に、ヒドロキノン）、酢酸塩、乳酸塩、クエン酸、及びピルビン酸塩を用いた。各電子供与体は、一定量の還元当量（いくつかの電子供与体は他よりも多くの還元当量）を生成することができるが、ウラン（VI）還元は、生成された還元当量と直接的には共役しないことが観察された。よって、特定の電子供与体が、ウラン（VI）還元において何らかの有意な効果を有するわけではないと結論することができる。
様々なｐＨ及び温度値におけるウラン（VI）還元
５〜９のｐＨ範囲にわたって、非増殖条件下における細胞全体のウラン（VI）還元を実行した。細胞全体のウラン（VI）還元活性はより中性のｐＨを好むと思われ、最大活性はｐＨ７〜８の間において観察された。非常に低い反応速度が７より低いｐＨ値で観察された。あらゆる適正な対照を評価したため、この結果は、このｐＨの領域においてアッセイが機能しないという事実によるものであろう。
３５℃〜７５℃の範囲にわたって、細胞全体のウラン（VI）還元の至適温度を決定した。温度が、細胞全体の還元において何らかの有意な効果を有するとは思われないことが観察された。
細胞内画分の調製
Kaufmann and Lovley (2001)によって記載された通りに細胞内画分を調製した（Kaufmann, F., and Lovley, D. (2001) Isolation and characterization of a soluble NADPH-dependant Fe(III) reductase from Geobacter sulfurreducens. Journal of Biotechnology. 183: 4468-4467）。増殖８時間の増殖標準化接種菌液からＴ．スコトダクタスＳＡ−０１細胞を収集し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．８で３回洗浄した。次に、２５％（ｗ／ｖ）ショ糖を含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．８中に細胞を再懸濁した。細胞壁溶解を行うため、細胞懸濁液（およそ１ｇ湿重量）にリゾチーム（２０ｍｇ）を添加し、２０分間３７℃で撹拌した。終濃度５ｍＭになるようＮａ２−ＥＤＴＡを添加し、さらに１５分間３７℃で撹拌した。最後に終濃度１３ｍＭとなるようＭｇＣｌ２を添加し、懸濁液を１５分間３７℃で撹拌した。遠心分離（２００００×ｇ、３０分間）により、周辺質画分からスフェロプラストの分離を行った。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．８中にスフェロプラストを再懸濁した。
膜及び細胞質画分を得るため、Gaspard et al., (1998)により記載されたプロトコールを用いた。それぞれ終濃度５μｇ／ｍｌ及び１０μｇ／ｍｌとなるようＤＮＡｓｅ及びＲＮＡｓｅを添加し、プロテアーゼ阻害剤も添加し、氷水浴中でsonifier（Branson Sonic Power社製細胞破壊器B-30）を用いて超音波処理（３回、７５Ｗ、５分間）することにより細胞を破砕した。次に、懸濁液を４℃で遠心分離（４０００×ｇ、１０分間）して、細胞片を除去した。細胞質画分から膜画分を分離するために、上清を遠心分離（１０００００×ｇ、９０分間）した。ペレットを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．８中に再懸濁した。
膜、周辺質及び細胞質画分は全て、Snakeskin（登録商標）プリーツ付き透析チューブ（１００００ＭＷＣＯ）を用いて、２０ｍＭ ＭＯＰＳバッファー、ｐＨ７．０に対し３×２Ｌバッファー交換しつつ４℃で透析した。
細胞内画分におけるＵ（VI）還元活性の決定
電子供与体としてＨ２及び還元型キノンを用いる
画分をＯ２不含Ｎ２／Ｈ２／ＣＯ２（９０％／１０％／１０％）混合ガスでパージし、２ｍＭヒドロキノンを補充して、電子供与体として１０％Ｈ２及び還元型キノンを導入する以外は上述通りに、周辺質及び膜画分をウラン（VI）還元実験法に付した。アッセイ開始のために、酢酸ウラニルを終濃度０．２５ｍＭ Ｕ（VI）となるよう画分の試料に添加し、解析に付した。この操作は全て嫌気チャンバー内で行って、還元型Ｕ（IV）が酸化されてＵ（VI）になるのを妨げた。
周辺質及び膜画分の組合せは、ウラン還元酵素の存在に係り最も有望であることを示したため、Ｕ（VI）還元活性に関してスクリーニングした。ヒドロキノン及びＨ２は、この種のタンパク質の文献において好まれる電子供与体であるため、これらを電子供与体として利用した。
次に、図４に示すグラフを作成したが、これは、透析し、電子供与体として１０％Ｈ２ガス及びヒドロキノンでパージした後の、Ｔ．スコトダクタスＳＡ−０１から得られた膜及び周辺質画分の組合せのウラン（VI）還元活性を表示する。
図４から分かるように、Ｈ２及び還元型キノンの組合せは、最良の還元活性をもたらした。その上、黒味がかった黄色の沈殿物が形成された。周辺質におけるタンパク質は黄色のＵ（VI）沈殿物を析出することが示されているため、形成した沈殿物が完全な黒色ではなかったことは意外ではない。
クロマトグラフィー法による所望のタンパク質の単離方法の至適化
イオン結合した膜タンパク質の抽出
一晩５℃で撹拌することにより、膜ペレットを２０ｍＭ ＭＯＰＳバッファー、ｐＨ７．０中に再懸濁した。２０ｍＭ ＭＯＰＳバッファー、ｐＨ７．０中の１Ｍ ＫＣｌにより、膜画分の体積は２倍になった。次に、溶液を２時間室温で撹拌して表在性膜タンパク質を抽出し、その結果得られた懸濁液を１０００００×ｇにて９０分間４℃で超遠心して膜をペレット化した。ＫＣｌで抽出可能な膜画分（遠心分離ステップから得られる上清）を２０ｍＭ ＭＯＰＳバッファー、ｐＨ７．０に対し３×２Ｌバッファー交換しつつ５℃で透析した。
膜／周辺質画分の単離
透析したＫＣｌ抽出膜画分を周辺質画分と組み合わせ、２０ｍＭ ＭＯＰＳバッファー、ｐＨ７．０で予め平衡化したSuper-Q Toyopearl（８ｃｍ×２．８ｃｍ）カラムにアプライした。Ａ２８０ｎｍ読み取り値が０．０１未満となるまでカラムを２０ｍＭ ＭＯＰＳバッファー、ｐＨ７．０で洗浄した。０〜１．０Ｍ ＮａＣｌ塩勾配、流速５ｍｌ／分をタンパク質の溶出に用いた。
ウラン（VI）還元活性を有すると決定された画分をプールし、Snakeskin（登録商標）プリーツ付き透析チューブ（１００００ＭＷＣＯ）を用いて２０ｍＭ ＭＯＰＳバッファー、ｐＨ７．０に対して４℃で透析した。
次に、図５に示す通り、Super-Q Toyopearlの溶出プロファイルを表示するグラフを作成した。前記の図における丸で囲んだピークは、ウラン（VI）還元活性が生じたことを示唆する。丸で囲んだピークをプールし、透析後にSP Toyopearlにアプライした。
２０ｍＭ ＭＯＰＳバッファー、ｐＨ７．０で予め平衡化したSP Toyopearl（８ｃｍ×２．８ｃｍ）カラムに透析液をアプライした。Ａ２８０ｎｍ読み取り値が０．０１未満となるまで２０ｍＭ ＭＯＰＳバッファー、ｐＨ７．０でカラムを洗浄した。０〜１．０Ｍ ＮａＣｌ塩勾配、流速５ｍｌ／分をタンパク質の溶出に用いた。選択した画分を捕集（１０ｍｌ）し、ウラン（VI）還元活性に関して試験した。
その後、図６に示す通り、SP Toyopearlの溶出プロファイルを表示するグラフを作成した。矢印Ａは画分１１を表し、矢印Ｂは画分１６を表し、矢印Ｃは画分１９を表し、矢印Ｄは画分３３を表す。この図から、画分１６、１９及び３３が、ウラン（VI）還元活性を示唆することが分かる。
SP Toyopearl樹脂によるクロマトグラフィー分離から得られた選択された画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル解析を行った。図７に示す通り、レーンＭは分子量マーカータンパク質を表し、レーン１は画分１１を表し、レーン２は画分１６を表し、レーン３は画分１９を表し、一方、レーン４は画分３３を表す。よって、その結果得られたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル解析は、これら画分の内３画分全てに存在する唯一のタンパク質が、＋／−７０ｋＤａタンパク質であることを示唆した。
未知タンパク質の配列決定
Ｎ末端配列決定法
１０％ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル上に画分１９をローディングし、１００Ｖで泳動した。泳動が完了した後、メーカーの仕様書に従ってゲルをＰＶＤＦメンブレン上にブロッティングした。次に、ブロッティングしたメンブレンをクーマシーブリリアントブルーで染色し、所望のバンドを切り出して配列決定法に回した。
得られた結果は、Ｎ末端配列がXPXDNSLVIGであることを明らかにした。
「DNSLVIG」配列を用いたＮＣＢＩウェブ上のＢＬＡＳＴＰ解析は、次の配列と１００％同一性であるとの結果をもたらした。
（ｉ）サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）ＨＢ２７由来のジペプチド結合タンパク質
（ii）Ｔ．アクアチクス（aquaticus）Ｙ５１ＭＣ２３由来の細胞外溶質結合タンパク質ファミリー５（ＡＢＣ型ジペプチド輸送タンパク質）、及び
（iii）Ｔ．サーモフィラスＨｈｂ８由来のオリゴペプチド結合タンパク質。
これらのタンパク質は全て同一配列であった。
ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴＰ解析から得られたタンパク質の配列を、サーマス・スコトダクタスＳＡ−０１ドラフトゲノムに対してブラスト解析したところ、ペプチドＡＢＣトランスポータータンパク質、ペプチド結合タンパク質と１００％同一性であるとの結果が得られた。また、サーマス・スコトダクタスＳＡ−０１のドラフトゲノム配列に対するＮ末端配列のＢＬＡＳＴＰ解析は、ペプチドＡＢＣトランスポーター、ペプチド結合タンパク質と１００％同一性であるとの結果をもたらした。
したがって、XPXDNSLVIGは、このタンパク質の成熟配列の第１の残基群を表す。ＢＬＡＳＴＰ解析の後、Ｎ末端配列決定法のクロマトグラムから、第１のアミノ酸はＧに相当し、第３の残基はＱに相当すると推定できる。
前述に鑑み、Ｎ末端配列は、GPQDNSLVIGであると推定された。
先述から、ウラン還元に関係するタンパク質が、ペプチドＡＢＣトランスポーター、ペプチド結合タンパク質であると結論することができる。前記タンパク質がウラン還元酵素として二重に機能すると結論してもよい。
ＭＳ／ＭＳ配列決定法
画分１９を１０％ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル上にローディングし、１００Ｖで泳動した。泳動が完了した後、＋／−７０ｋＤａタンパク質のゲルバンドを切り出して凍結乾燥した。次に、ＭＳ／ＭＳ解析のために、凍結乾燥した試料をケープタウンのプロテオミクス・ゲノミクス研究センター（Centre for Proteomic and Genomic Research）に送った。合計９個のトリプシン消化断片のスペクトルを得て、これをMascot Distillerソフトウエアを用いて解析した。
次に、スペクトルの内４個はまた、ペプチドＡＢＣトランスポーター、ペプチド結合タンパク質とアノテートすることができた。
したがって、前述は、当該タンパク質がペプチドＡＢＣトランスポーター、ペプチド結合タンパク質であることの立証となる。
タンパク質発現及び精製
ペプチドＡＢＣトランスポーター、ペプチド結合タンパク質の配列を含有するベクターpET28を当技術分野で公知の方法を用いて構築した。pET28は、ヒスチジンリッチ領域をタンパク質のＮ末端に取り付けるための配列を含有し、これによりタンパク質をニッケルアフィニティーカラムにより精製することができる。
次に、ＡＢＣ／pET28をRosetta-Gami 2(DE3)pLysSコンピテント細胞内に形質転換し、抗生物質、pET28の場合はＫＡＮを含有するＬＢ培地に播種した。次に、細胞を培養し、ＯＤ０．８〜１．０まで増殖させ、１ｍＭ（終濃度）ＩＰＴＧの添加によりタンパク質発現を誘導した。
誘導４時間後、細胞を収集し洗浄した。細胞フレンチプレスに通過させることにより細胞を破砕し、超遠心（１０００００×ｇ、４℃、９０分）により細胞質画分を収集した。次に、その結果得られたpET28由来のタンパク質をニッケルアフィニティーカラムにより精製し、続いてゲル濾過ステップを行った。
組換えＡＢＣタンパク質の特性評価
組換えタンパク質がウラン（VI）を還元する能力を評価した。細胞全体の特徴付けに用いたものと同じ生理化学的パラメータを用いて組換えタンパク質を特徴付けた。
タンパク質中に存在するジスルフィド結合がＵ（VI）還元の核形成部位を提供することを証明するために、チオール部分を還元するための還元剤のアプライが必要とされた。還元剤候補、即ち、ウラン（VI）を用いてアッセイしたジチオスレイトール、亜ジチオン酸ナトリウム及びβ−メルカプトエタノールの中でも、β−メルカプトエタノールは、最も低レベルのウラン（VI）化学的還元を生じさせた。
よって、過剰量のβ−メルカプトエタノールを利用して、実験法の前にタンパク質中に存在するジスルフィド結合を還元した。
ペプチドＡＢＣトランスポーター、ペプチド結合タンパク質のシステイン変異体の作出
Yasara Structure & Whatifを用いてＴ．スコトダクタスＳＡ−０１のＡＢＣトランスポーターペプチド結合タンパク質の相同性モデルを編集した。用いたテンプレートは、Ｔ．サーモフィラスＨＢ８（２Ｄ５Ｗ−Ｂ）のオリゴペプチド結合タンパク質であったが、これはＴ．スコトダクタスＳＡ−０１のＡＢＣトランスポーター、ペプチド結合タンパク質と９０％の同一性（９５％の類似性）を有する。
タンパク質のモデル化によって、タンパク質外部に存在するジスルフィド結合を明らかにでき、これによりβ−メルカプトエタノール等、還元剤の添加によりひとたび結合が還元されるとＵ（VI）還元の核形成部位となる候補が見い出された。
この結合に関与するシステイン残基は、ポジション３３７及び４８１に位置する。したがって、Ｕ（VI）還元におけるシステイン残基の役割を調べるために、部位特異的変異誘発によりシステイン残基をそれぞれアラニンに変異させた。２種のシステイン変異体両方の組合せも考案した。
その後、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて変異タンパク質を精製し、クーマシー染色したゲルにおいて９８％を超える純度を有することが判明した。
デスルホビブリオ・デスルフリカンス（Desulfovibrio desulfuricans）株Ｇ２０由来のチオレドキシン等、システインチオール−ジスルフィド架橋を備える他のタンパク質は、Ｕ（VI）を還元する能力を示した（Li, X and Krumholtz X.R. (2009) Thioredoxin is Involved in U(VI) and Cr(VI) Reduction in Desulfovibrio desulfuricans G20. Journal of bacteriology. 191: 4924-4933）。
その後、３２０μｇ／ｍｌのタンパク質を含有するｐＨ７及び６５℃における反応においてシステイン変異体によるＵ（VI）還元を実行した。
酵素活性におけるシステイン残基の関与
Ｃｙｓ−３３７及びＣｙｓ−４８１変異体は両方とも、野生型と比べてごく僅か又は無視できる程度の活性しか示さなかった。また、二重変異体は有意な活性を示さなかった。これらのアッセイの結果は、Ｃｙｓ−３３７及びＣｙｓ−４８１がＵ（VI）還元に必要とされることを明示する。
ウラン（VI）還元におけるｐＨの効果
要するに、還元型ジスルフィド結合により行われた還元は、硫化水素による還元と考えることができる。Huaら（2006）は、硫化水素によるウラン（VI）の還元は、中性ｐＨ値において至適に起こり、次式により最も良く表すことができることを観察した。
ＵＯ２ ２＋＋ＨＳ−＝ＵＯ２＋Ｓ０＋Ｈ＋ （Hua, B., Xu, H., Terry, J. and Deng, B. (2006) Kinteics of uranium(VI) rduction by hydrogen sulphide in anoxic aqueous systems. Environmental Science and Technology. 49:4666-4671）
最高速度の還元は、７〜８の間のｐＨ値において観察することができ（図８及び９）、これは、硫化物還元の文献における観察と一致する（Hua, B., Xu, H., Terry, J. and Deng, B. (2006) Kinteics of uranium(VI) rduction by hydrogen sulphide in anoxic aqueous systems. Environmental Science and Technology. 49:4666-4671）。７より低く８より高いｐＨ値において、タンパク質を欠く試料におけるβ−メルカプトエタノールによるウラン（VI）の化学的還元速度は非常に高い。この結果は、ジスルフィド結合の還元がｐＨ阻害され、ウラン（VI）を自由に還元するβ−メルカプトエタノールの量が増えたことによるものと思われる。
ウラン（VI）還元における温度の効果
最高速度の還元は、５５℃〜６５℃の間の温度値において観察することができ（図１０）、これは、この生物の至適増殖温度と一致する（Kieft, T.L., Fredrickson, J.K., Onstott, T.C., Gorby, Y.A., Kostandarithes, H.M., Bailey, T.J., Kennedy, D.W., Li, S.W., Plymale, A.E., Spadoni, C.M. and Gray, M.S. (1999) Dissimilatory reduction of Fe(III) and other electron acceptors by a Thermus isolate. Applied Environmental Microbiology. 65:1214-1221）。４５℃より低い温度において、活性は殆ど観察されず、６５℃より高い温度では、タンパク質を欠く試料におけるβ−メルカプトエタノールによるウラン（VI）の化学的還元速度は非常に高かった。
（参考文献）
Nies, D.H., and Silver, S. (1995) Ion efflux systems involved in bacterial metal resistances. Journal of Industrial Microbiology 14: 186-199
Lovley, D.R., Phillips, E.J.P., Gorby, Y.A. and Landa, E.R. (1991) Microbial reduction of uranium. Nature. 350:413-416
Anderson, R.T., Fleisher, M.Q. and LeHuray, A.P. (1998) Concentration, oxidation state, and particulate flux of uranium in the Black sea. Geochimica et Cosmochimica Acta. 53: 2215-2224
Rooney-Varga, J., Anderson, R.T., Fraga, J.L., Ringleberg, D. and Lovley, D.R. (1999) Microbial communities associated with anaerobic benzene degradation in a petroleum- contaminated aquifer. Applied and Environmental Microbiology. 65:3056-3063
Lovley, D.R., Holmes, D.E. and Nevin, K.P. (2004) Dissimilatory Fe(III) and Mn(IV) reduction. Advances in Microbial Physiology. 49:219-286
Anderson, R.T., Vrionis, H.A., Ortiz-Bernad, I., Resch, C.T., Long, P.E., Dayvault, R., Karp, K., Marutzky, S, Metzler, D.R., Peacock, A., White, D.C., Lowe, M. and Lovley, D.R. (2003) Stimulating the in situ activity of Geobacter species to remove uranium from the groundwater of a uranium-contaminated aquifer. Applied Environmental Microbiology. 69:5884-5891
D.R. Lovely and J.R. Lloyd (2000) Microbes with a metal for bioremediation, Nat. Biotechnol. 18, pp. 600-601
Sani, R.K., B. Peyton, W. Smith, W. Apel, and J. Petersen. (2002) Dissimilatory reduction of Cr(VI), Fe(III), and U(VI) by Cellulomonas isolates”. Appl. Microbiol. Biotechnol. 60:192-199
Van Heerden, E., Opperman, D.J., Bester, P.A., van Marwijk, J., Cason, E.D., Litthauer, D., Piater, L.A.and Onstott, T.C. (2008) Metabolic promiscuity from the deep subsurface: A story of Survival or Superiority. Proceedings of SPIE - The International Society for Optical Engineering 7097:70970S,
Haas, J.R. and Northup, A. (2004) Effects of aqueous complexation on reductive precipitation of uranium by Shewanella putrefaciens. Geochemical Transactions. 5:41-48
Kieft, T.L., Fredrickson, J.K., Onstott, T.C., Gorby, Y.A., Kostandarithes, H.M., Bailey, T.J., Kennedy, D.W., Li, S.W., Plymale, A.E., Spadoni, C.M. and Gray, M.S. (1999) Dissimilatory reduction of Fe(III) and other electron acceptors by a Thermus isolate. Applied Environmental Microbiology. 65:1214-1221
Kaufmann, F., and Lovley, D. (2001) Isolation and characterization of a soluble NADPH-dependant Fe(III) reductase from Geobacter sulfurreducens. Journal of Biotechnology. 183: 4468-4467
Johnson, D.A. and Florence, T.M. (1971) Spectrophotometric determination of uranium(VI) with 2-(5-bromo-2-pyridylazo)-5-diethylaminophenol. Analitica Chimica. Acta. 53:73-79
Li, X and Krumholtz X.R. (2009) Thioredoxin is Involved in U(VI) and Cr(VI) Reduction in Desulfovibrio desulfuricans G20. Journal of bacteriology. 191: 4924-4933
Hua, B., Xu, H., Terry, J. and Deng, B. (2006) Kinteics of uranium(VI) rduction by hydrogen sulphide in anoxic aqueous systems. Environmental Science and Technology. 49:4666-4671

Claims (20)

  1. ウラン（VI）源におけるウラン（VI）のウラン（IV）への還元に関与する、サーマス・スコトダクタス株ＳＡ−０１由来の単離されたポリペプチドであって、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
  2. ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル解析によって示される、７０ｋＤａの分子量を有する均質なタンパク質であることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴＰ解析によって明らかにされる、ペプチドＡＢＣトランスポーター、ペプチド結合タンパク質である、請求項１に記載のポリペプチド。
  4. Ｕ（VI）源が、ＵＯ２（ＣＨ３ＣＯＯ）２．２Ｈ２Ｏ及びＵＯ２（ＮＯ３）２からなる群から選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
  5. 配列番号２のヌクレオチド配列を含む、配列番号１のアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子。
  6. 請求項５に記載の核酸分子を包含するベクター。
  7. 請求項６に記載のベクターを包含する宿主細胞。
  8. ａ）配列番号２の核酸分子を宿主細胞にトランスフェクトするステップと、
    ｂ）前記宿主細胞を培養して、前記宿主細胞において配列番号１のポリペプチドを発現させるステップとを包含し、
    ｃ）配列番号１の前記ポリペプチドを単離及び精製するステップを包含してもよい、
    ウラン（VI）源におけるウラン（VI）のウラン（IV）への還元に関与する、請求項１〜４のいずれかに記載の少なくとも１種類のポリペプチドを作製するための方法。
  9. 請求項７に記載の宿主細胞から得られたＵ（VI）耐性遺伝子又はその任意のＵ（VI）耐性機能部分で形質転換された微生物。
  10. Ｕ（VI）源で汚染された用地のバイオレメディエーション又は少なくとも部分的なバイオレメディエーションのための方法であって、サーマス・スコトダクタス株ＳＡ−０１の増殖を刺激してそこに存在するＵ（VI）源におけるＵ（VI）をＵ（IV）へと還元するために、汚染された用地に電子供与体を導入するステップを含む、又はＵ（VI）汚染された用地から環境媒体を取り出し、このような環境媒体に電子供与体を十分な期間導入して、サーマス・スコトダクタス株ＳＡ−０１に、そこに存在するＵ（VI）源におけるＵ（VI）をＵ（IV）へと還元させるステップを含む方法。
  11. サーマス・スコトダクタス株ＳＡ−０１が、南アフリカ北西州のウィットウォータースランド盆地北西部周縁に位置するムポネン鉱山に由来する、又はこの用地から得られた環境媒体に由来する、請求項１０に記載の方法。
  12. Ｕ（VI）源が、ＵＯ２（ＣＨ３ＣＯＯ）２．２Ｈ２Ｏ及びＵＯ２（ＮＯ３）２からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
  13. 還元が好気条件下及び／又は嫌気条件下において行われる、請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法。
  14. 還元されたＵ（IV）が酸化されてＵ（VI）になるのを妨げるように、還元が嫌気条件下において行われる、請求項１３に記載の方法。
  15. 電子供与体が、Ｈ２、還元型キノン（ヒドロキノン）、酢酸塩、乳酸塩、クエン酸、及びピルビン酸塩からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
  16. インサイチュ、エクスサイチュ又はその両方で実施され得る、六価Ｕ源で汚染された用地のバイオレメディエーション又は少なくとも部分的なバイオレメディエーションに用いられる、請求項１０〜１５のいずれかに記載の方法。
  17. ウラン（VI）源におけるウラン（VI）のウラン（IV）への還元における、請求項１〜４のいずれかに記載の配列番号１のポリペプチドの使用。
  18. Ｕ（VI）汚染された用地又はＵ（VI）汚染された環境媒体のバイオレメディエーション又は少なくとも部分的なバイオレメディエーションにおける、サーマス・スコトダクタス株ＳＡ−０１の使用。
  19. Ｕ（VI）汚染された用地又はＵ（VI）汚染された環境媒体のバイオレメディエーション又は少なくとも部分的なバイオレメディエーションにおける、レメディエーション又は少なくとも部分的にレメディエーションされるべき前記Ｕ（VI）汚染された用地又は前記Ｕ（VI）汚染された環境媒体に由来するサーマス・スコトダクタス株ＳＡ−０１の使用。
  20. Ｕ（VI）汚染された用地又はＵ（VI）汚染された環境媒体のバイオレメディエーション又は少なくとも部分的なバイオレメディエーションにおける、請求項９に記載の微生物の使用。
JP2012529395A 2009-09-21 2010-09-21 ウラン（ｖｉ）還元に関与するタンパク質の単離 Pending JP2013505014A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ZA200906569 2009-09-21
ZA2009/06569 2009-09-21
PCT/IB2010/054259 WO2011033491A1 (en) 2009-09-21 2010-09-21 Isolation of a protein responsible for uranium (vi) reduction

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2013505014A true JP2013505014A (ja) 2013-02-14
JP2013505014A5 JP2013505014A5 (ja) 2013-09-26

Family

ID=43427434

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2012529395A Pending JP2013505014A (ja) 2009-09-21 2010-09-21 ウラン（ｖｉ）還元に関与するタンパク質の単離

Country Status (8)

Country Link
US (2) US8685688B2 (ja)
EP (1) EP2480570A1 (ja)
JP (1) JP2013505014A (ja)
KR (1) KR101660686B1 (ja)
AU (1) AU2010296868B2 (ja)
RU (2) RU2527892C2 (ja)
WO (1) WO2011033491A1 (ja)
ZA (1) ZA201201589B (ja)

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5352608A (en) 1992-01-13 1994-10-04 The Board Of Regents, The University Of Texas Bioreduction of metal oxides and oxyanions by photosynthetic bacteria
US7060473B2 (en) 1999-10-28 2006-06-13 Ut-Battelle, Llc Fermentative process for making inorganic nanoparticles
RU2164501C1 (ru) * 2000-07-03 2001-03-27 Шугина Галина Александровна Способ очистки загрязненной подземной воды
AU2002366438A1 (en) 2001-09-14 2003-09-02 Applera Corporation Thermus scotoductus nucleic acid polymerases
WO2007076461A1 (en) 2005-12-22 2007-07-05 Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. Thermostable dna polymerase from thermus scotoductus

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN5012016519; ＰＲＯＣＥＥＤＩＮＧＳ　ＯＦ　ＴＨＥ　ＳＰＩＥ Ｖｏｌ．　７０９７, 20080812, ７０９７０Ｓ-１〜７０９７０Ｓ-１２, ＳＰＩＥ *
JPN5012016520; ＮＡＴＵＲＥ Ｖｏｌ．　３５０，　Ｎｏ．　６３１７, 1991, ｐｐ．４１３-４１６ *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2012116151A (ru) 2013-10-27
RU2527892C2 (ru) 2014-09-10
AU2010296868A1 (en) 2012-04-05
ZA201201589B (en) 2013-08-28
RU2014120152A (ru) 2015-11-27
EP2480570A1 (en) 2012-08-01
KR20120102589A (ko) 2012-09-18
WO2011033491A1 (en) 2011-03-24
US8685688B2 (en) 2014-04-01
US20120276610A1 (en) 2012-11-01
KR101660686B1 (ko) 2016-09-28
US8790915B2 (en) 2014-07-29
AU2010296868B2 (en) 2016-02-18
RU2571221C1 (ru) 2015-12-20
US20140051150A1 (en) 2014-02-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Liermann et al. Production of a molybdophore during metal-targeted dissolution of silicates by soil bacteria
Wang et al. Identification and catalytic residues of the arsenite methyltransferase from a sulfate-reducing bacterium, Clostridium sp. BXM
Kanao et al. Identification of a gene encoding a tetrathionate hydrolase in Acidithiobacillus ferrooxidans
Antonioli et al. Stenotrophomonas maltophilia SeITE02, a new bacterial strain suitable for bioremediation of selenite-contaminated environmental matrices
Magnuson et al. Proteogenomic and functional analysis of chromate reduction in Acidiphilium cryptum JF-5, an Fe (III)-respiring acidophile
Cason et al. Reduction of U (VI) by the deep subsurface bacterium, Thermus scotoductus SA-01, and the involvement of the ABC transporter protein
Ilamaran et al. Biomimetic strategies to design metallic proteins for detoxification of hazardous heavy metal
Sorokin et al. Halapricum desulfuricans sp. nov., carbohydrate-utilizing, sulfur-respiring haloarchaea from hypersaline lakes
Amin et al. Cloning, expression, isotope labeling, and purification of transmembrane protein MerF from mercury resistant Enterobacter sp. AZ-15 for NMR studies
Gupta et al. Photoferrotrophs produce a PioAB electron conduit for extracellular electron uptake. mBio 10: e02668-19
US8790915B2 (en) Isolation of a protein responsible for uranium (VI) reduction
Goff et al. Role of extracellular reactive sulfur metabolites on microbial Se (0) dissolution
WO2013068901A1 (en) Isolation of novel thermophilic bacteria and thermostable enzymes responsible for the bioreduction of platinum (iv) to elemental platinum
Kabiri et al. Effects of selenite and tellurite on growth, physiology, and proteome of a moderately halophilic bacterium
US20140179553A1 (en) Mercury methylation genes in bacteria and archaea
Moller Thermophilic iron reductases from thermus scotoductus
Ilcu Characterization of cytochrome C synthetase CcsBA and latex clearing protein
Pastorella Investigation of the electrochemical activity of chromium tolerant mutants of Geobacter metallireducens
Zhang et al. Niabella digestorum sp. nov., a High Cell-Surface Hydrophobic Bacterium Isolated from Waste Digestion System
BR102016018426A2 (pt) Organismo geneticamente modificado com proteínas derivadas de espécies pertencentes ao gênero crassostrea, processo de biorremediação de um ambiente compreendendo metais pesados, e processo de biomineração de um ambiente compreendendo metais pesados
Burns Molecular mechanisms of microbial iron respiration by Shewanella oneidensis MR-1
Qian Investigation of Fe (III) reduction in Geobacter sulfurreducens characterization of outer surface associated electron transfer components
Qian Characterization of dissimilatory iron reduction by Shewanella oneidensis MR-1
Gao Identification and analysis of proteins and genes responsible for microbial anaerobic nitrate-dependent iron oxidation and overexpression in E. coli of perchlorate reductase
Ngwenya Enzymatic Recovery of Rhodium (III) from Aqueous Solution and Industrial Effluent Using Sulphate Reducing Bacteria: Role of A Hydrogenase Enzyme

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20130724

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20130724

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20141117

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20150409