JP2013233113A - Method for producing cell with improved tolerance to physical load - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、物理的負荷への耐性が向上した細胞の製造方法、及びそれにより製造される物理的負荷への耐性が向上した細胞に関する。 The present invention relates to a method for producing a cell having improved resistance to a physical load and a cell having improved resistance to a physical load produced thereby.
近年、新たな医療として再生医療が注目され、細胞を三次元組織化するための様々な方法が提案されている（例えば、特許文献１）。一方、組織工学や再生医療の分野では、組織レベルの操作に加えて細胞レベルでの操作が行われている。 In recent years, regenerative medicine has attracted attention as a new medicine, and various methods for three-dimensional organization of cells have been proposed (for example, Patent Document 1). On the other hand, in the fields of tissue engineering and regenerative medicine, operations at the cell level are performed in addition to operations at the tissue level.
しかしながら、細胞の種類や操作によっては、遠心分離などの物理的負荷により細胞膜が脆弱化して破壊され、細胞の内容物が漏出するダメージをうけたり、細胞が死滅したりするという問題があった。このため、物理的負荷への耐性が向上した細胞が求められている。そこで、本発明は、物理的負荷への耐性が向上した細胞の製造方法を提供する。 However, depending on the type and operation of the cell, there has been a problem that the cell membrane is weakened and broken by a physical load such as centrifugation, and the contents of the cell are damaged and the cell is killed. For this reason, cells with improved resistance to physical loads are desired. Thus, the present invention provides a method for producing cells with improved resistance to physical loads.
本発明は、一又は複数の実施形態において、物理的負荷への耐性が向上した細胞の製造方法であって、浮遊している細胞に溶液Ａ又は溶液Ｂを接触させて前記細胞をコーティングするコーティング層Ａ又はコーティング層Ｂを形成するステップを、コーティング層ＡとＢとが交互に形成されるように４ステップ又はそれ以上行うことを含み、前記溶液Ａの含有物と前記溶液Ｂの含有物との組み合わせが、ＲＧＤ配列を有するタンパク質若しくは高分子と前記ＲＧＤ配列を有するタンパク質若しくは高分子と相互作用するタンパク質若しくは高分子との組み合わせ、又は、正の電荷を有するタンパク質若しくは高分子と負の電荷を有するタンパク質若しくは高分子との組み合わせである、物理的負荷への耐性が向上した細胞の製造方法（以下、「本発明の製造方法」ともいう）に関する。 In one or a plurality of embodiments, the present invention relates to a method for producing a cell having improved resistance to a physical load, wherein the cell is coated by bringing solution A or solution B into contact with floating cells. Forming the layer A or the coating layer B includes performing four or more steps such that the coating layers A and B are alternately formed, the content of the solution A and the content of the solution B; A combination of a protein or polymer having an RGD sequence and a protein or polymer interacting with the protein or polymer having the RGD sequence, or a protein or polymer having a positive charge and a negative charge. A method for producing a cell having improved resistance to physical load, which is a combination with a protein or polymer having Also referred to) related to the production method "of the present invention.
本発明は、一又は複数の実施形態において、本発明の製造方法により製造される物理的負荷への耐性が向上した細胞に関する。 In one or a plurality of embodiments, the present invention relates to a cell having improved resistance to a physical load produced by the production method of the present invention.
本発明によれば、物理的負荷への耐性が向上した細胞を提供できる。 According to the present invention, it is possible to provide a cell having improved resistance to a physical load.
本発明は、浮遊している細胞に溶液Ａ又は溶液Ｂを接触させて細胞表面にコーティング層Ａ及びコーティング層Ｂを交互に形成するステップを少なくとも４ステップ行うことにより、細胞の物理的負荷への耐性が向上するとの知見に基く。 In the present invention, the solution A or the solution B is brought into contact with floating cells to alternately form the coating layer A and the coating layer B on the cell surface, thereby performing a physical load on the cell. Based on the finding that resistance is improved.
本発明により、物理的負荷への耐性が向上された細胞が得られるというメカニズムの詳細については不明であるが以下のように推定される。図１に示すように、表面がコーティングされていない細胞は、遠心分離等の物理的負荷が付与されると、細胞膜が脆弱化して破壊され、例えば、細胞内容物（例えば、乳酸脱水素酵素等）が細胞外に放出（漏出）されたり、細胞が死滅したりする。これに対し、溶液Ａ又は溶液Ｂを交互に接触させるステップを少なくとも４ステップ行って細胞表面にコーティング層Ａ及びコーティング層Ｂを交互に形成することにより、細胞膜の脆弱化が防がれ、細胞の物理的負荷への耐性が向上すると推定される。ただし、これらの推測は本発明を限定するものではない。なお、以下、コーティング層Ａとコーティング層Ｂとを含めて単に「コーティング層」という場合もある。 The details of the mechanism by which cells with improved resistance to physical load can be obtained by the present invention are unknown, but are estimated as follows. As shown in FIG. 1, when a physical load such as centrifugation is applied to a cell whose surface is not coated, the cell membrane is weakened and destroyed. For example, cell contents (for example, lactate dehydrogenase and the like) ) Is released (leaked) out of the cell, or the cell is killed. In contrast, by alternately forming the coating layer A and the coating layer B on the cell surface by performing at least four steps of alternately contacting the solution A or the solution B, the weakening of the cell membrane is prevented, and the cell It is estimated that resistance to physical load is improved. However, these assumptions do not limit the present invention. Hereinafter, the coating layer A and the coating layer B may be simply referred to as “coating layer”.
本明細書において「物理的負荷」とは、機械的ストレス及び/又は力学的刺激であって、限定されない一又は複数の実施形態において、細胞の成育環境では通常与えられない機械的ストレス及び/又は力学的刺激が挙げられる。物理的負荷としては、限定されない一又は複数の実施形態において、振動、衝撃、応力、及び遠心力等が挙げられる。また、本明細書において「物理的負荷への耐性が向上した細胞」とは、限定されない一又は複数の実施形態において、本発明の製造方法により形成されるコーティング層を有さない細胞と比較して、同様の物理的負荷を与えた後の細胞の生存率が高い細胞、又は、細胞内容物の漏出が少ない細胞をいう。 As used herein, "physical load" refers to mechanical stress and / or mechanical stimulation, and in one or more non-limiting embodiments, mechanical stress and / or that is not normally applied in a cell growth environment. Mechanical stimulation can be mentioned. The physical load includes vibration, impact, stress, centrifugal force, and the like in one or more embodiments that are not limited. In addition, in the present specification, “cells with improved resistance to physical load” in one or more non-limiting embodiments, compared with cells that do not have a coating layer formed by the production method of the present invention. A cell having a high survival rate after being given the same physical load or a cell with little leakage of cell contents.
本明細書において「浮遊している細胞」とは、限定されない一又は複数の実施形態において、細胞が基材等やその他の細胞と接着せず、１個１個の細胞が独立して存在していることをいう。本明細書において「浮遊している細胞に溶液Ａ又は溶液Ｂを接触」とは、浮遊した状態の細胞を溶液Ａ又は溶液Ｂと接触させることのみならず、溶液Ａ又は溶液Ｂと接触させることにより細胞が浮遊した状態になることを含む。本明細書において「細胞をコーティングするコーティング層Ａ（又はＢ）を形成する」とは、細胞表面に溶液Ａ（又は溶液Ｂ）の含有物が吸着し、被膜状の構造を形成することを含む。 In the present specification, the “floating cell” means that in one or a plurality of non-limiting embodiments, the cell does not adhere to a substrate or other cells, and each cell exists independently. It means that In this specification, “contacting the suspended cells with the solution A or the solution B” means not only bringing the suspended cells into contact with the solution A or the solution B but also bringing them into contact with the solution A or the solution B. This includes that the cell is in a floating state. In the present specification, “forming a coating layer A (or B) for coating cells” includes adsorbing the contents of solution A (or solution B) on the cell surface to form a film-like structure. .
［物理的負荷への耐性が向上した細胞の製造方法］
本発明は、一又は複数の実施形態において、物理的負荷への耐性が向上した細胞の製造方法であって、浮遊している細胞に溶液Ａ又は溶液Ｂを接触させて前記細胞をコーティングするコーティング層Ａ又はコーティング層Ｂを形成するステップを、コーティング層ＡとＢとが交互に形成されるように４ステップ又はそれ以上行うことを含む、物理的負荷への耐性が向上した細胞の製造方法に関する。
[Method for producing cells with improved resistance to physical load]
In one or a plurality of embodiments, the present invention relates to a method for producing a cell having improved resistance to a physical load, wherein the cell is coated by bringing solution A or solution B into contact with floating cells. The present invention relates to a method for producing a cell with improved resistance to a physical load, comprising performing the step of forming a layer A or a coating layer B for 4 steps or more so that the coating layers A and B are alternately formed. .
本発明の製造方法は、コーティング層Ａを形成するステップとコーティング層Ｂを形成するステップとを交互に行い、それらのステップの合計（「コーティング層Ａを形成するステップの回数」と「コーティング層Ｂを形成するステップの回数」との合計）が４ステップ以上となるように細胞を溶液Ａ又は溶液Ｂに交互に接触させる。 In the manufacturing method of the present invention, the step of forming the coating layer A and the step of forming the coating layer B are alternately performed, and the total of these steps (the “number of steps of forming the coating layer A” and the “coating layer B”) is performed. The cells are alternately brought into contact with the solution A or the solution B so that the total number of the “number of steps to form” becomes 4 steps or more.
本発明の製造方法において、溶液Ａの含有物と溶液Ｂの含有物との組み合わせは、ＲＧＤ配列を有するタンパク質若しくは高分子（以下、「ＲＧＤ配列を有する物質」ともいう）と前記ＲＧＤ配列を有するタンパク質若しくは高分子と相互作用するタンパク質若しくは高分子（以下、「相互作用を有する物質」ともいう）との組み合わせ、又は、正の電荷を有するタンパク質若しくは高分子（以下、「正の電荷を有する物質」ともいう）と負の電荷を有するタンパク質若しくは高分子（以下、「負の電荷を有する物質」ともいう）との組み合わせである。 In the production method of the present invention, the combination of the content of Solution A and the content of Solution B has the RGD sequence and the protein or polymer having RGD sequence (hereinafter also referred to as “substance having RGD sequence”). A combination with a protein or polymer that interacts with a protein or polymer (hereinafter also referred to as “substance having interaction”), or a protein or polymer that has a positive charge (hereinafter referred to as “substance with a positive charge”). ”) And a negatively charged protein or polymer (hereinafter also referred to as“ negatively charged substance ”).
（ＲＧＤ配列を有する物質）
ＲＧＤ配列を有する物質とは、細胞接着活性を担うアミノ酸配列である「Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ」（ＲＧＤ）配列をするタンパク質又は高分子をいう。本明細書において「ＲＧＤ配列を有する」とは、元来ＲＧＤ配列を有するものでもよいし、ＲＧＤ配列が化学的に結合されたものでもよい。ＲＧＤ配列を有する物質は、生分解性であることが好ましい。
(Substance having RGD sequence)
A substance having an RGD sequence refers to a protein or polymer having an “Arg-Gly-Asp” (RGD) sequence, which is an amino acid sequence responsible for cell adhesion activity. In the present specification, “having an RGD sequence” may originally have an RGD sequence, or may have a RGD sequence chemically bound thereto. The substance having the RGD sequence is preferably biodegradable.
ＲＧＤ配列を有するタンパク質としては、例えば、従来公知の接着性タンパク質、又はＲＧＤ配列を有する水溶性タンパク質等が挙げられる。接着性タンパク質としては、例えば、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、カドヘリン、又はコラーゲン等が挙げられる。ＲＧＤ配列を有する水溶性タンパク質としては、例えば、ＲＧＤ配列を結合させたコラーゲン、ゼラチン、アルブミン、グロブリン、プロテオグリカン、酵素、又は抗体等が挙げられる。 Examples of the protein having an RGD sequence include conventionally known adhesive proteins or water-soluble proteins having an RGD sequence. Examples of the adhesive protein include fibronectin, vitronectin, laminin, cadherin, and collagen. Examples of the water-soluble protein having an RGD sequence include collagen, gelatin, albumin, globulin, proteoglycan, enzyme, or antibody to which the RGD sequence is bound.
ＲＧＤ配列を有する高分子としては、例えば、天然由来高分子、又は合成高分子が挙げられる。ＲＧＤ配列を有する天然由来高分子としては、例えば、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、α−ポリリジン又はε−ポリリジン等のポリアミノ酸、キチン又はキトサン等の糖等が挙げられる。ＲＧＤ配列を有する合成高分子としては、例えば、直鎖型、グラフト型、くし型、樹状型、又は星型等のＲＧＤ配列を有するポリマー又は共重合体が挙げられる。ポリマー又は共重合体としては、例えば、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリアミド、又はこれらの共重合体、ポリエステル、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−ポリアクリル酸）、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリエチレンオキサイド、ポリε−カプロラクタム、ポリアクリルアミド、又はポリ（メタクリル酸メチル−γ−ポリメタクリル酸オキシエチレン）等が挙げられる。 Examples of the polymer having an RGD sequence include a naturally-derived polymer or a synthetic polymer. Examples of the naturally-derived polymer having an RGD sequence include water-soluble polypeptides, low-molecular peptides, polyamino acids such as α-polylysine or ε-polylysine, and sugars such as chitin or chitosan. Examples of the synthetic polymer having an RGD sequence include polymers or copolymers having an RGD sequence such as a linear type, graft type, comb type, dendritic type, or star type. Examples of the polymer or copolymer include polyurethane, polycarbonate, polyamide, or a copolymer thereof, polyester, poly (N-isopropylacrylamide-co-polyacrylic acid), polyamidoamine dendrimer, polyethylene oxide, polyε-caprolactam. , Polyacrylamide, or poly (methyl methacrylate-γ-polyoxymethacrylate).
ＲＧＤ配列を有する物質は、これらの中でも、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、カドヘリン、ポリリジン、エラスチン、ＲＧＤ配列を結合させたコラーゲン、ＲＧＤ配列を結合させたゼラチン、キチン、又はキトサンが好ましく、より好ましくはフィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、ポリリジン、ＲＧＤ配列を結合させたコラーゲン、又はＲＧＤ配列を結合させたゼラチンである。 Among these, the substance having the RGD sequence is preferably fibronectin, vitronectin, laminin, cadherin, polylysine, elastin, collagen to which the RGD sequence is bound, gelatin, chitin or chitosan to which the RGD sequence is bound, and more preferably fibronectin. , Vitronectin, laminin, polylysine, collagen to which RGD sequences are bound, or gelatin to which RGD sequences are bound.
（相互作用する物質）
相互作用する物質とは、ＲＧＤ配列を有する物質と相互作用するタンパク質若しくは高分子をいう。本明細書において「相互作用する」とは、例えば、静電的相互作用、疎水性相互作用、水素結合、電荷移動相互作用、共有結合形成、タンパク質間の特異的相互作用、及び又はファンデルワールス力等により、化学的及び又は物理的にＲＧＤ配列を有する物質と相互作用する物質とが結合、接着、吸着又は電子の授受が可能な程度に近接することを意味する。相互作用する物質は、生分解性であることが好ましい。
(Interacting substances)
The substance that interacts refers to a protein or polymer that interacts with a substance having an RGD sequence. In this specification, “interact” means, for example, electrostatic interaction, hydrophobic interaction, hydrogen bond, charge transfer interaction, covalent bond formation, specific interaction between proteins, and / or van der Waals. It means that a substance that interacts with a substance having an RGD sequence chemically and / or physically by force or the like is close enough to be able to bind, adhere, adsorb, or exchange electrons. The interacting substance is preferably biodegradable.
ＲＧＤ配列を有する物質と相互作用するタンパク質としては、例えば、コラーゲン、ゼラチン、プロテオグリカン、インテグリン、酵素、又は抗体等が挙げられる。ＲＧＤ配列を有する物質と相互作用する高分子としては、例えば、天然由来高分子、又は合成高分子が挙げられる。ＲＧＤ配列を有する物質と相互作用する天然由来高分子としては、例えば、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、ポリアミノ酸、エラスチン、ヘパリン、ヘパラン硫酸又はデキストラン硫酸等の糖、及びヒアルロン酸等が挙げられる。ポリアミノ酸としては、例えば、α−ポリリジン又はε−ポリリジン等のポリリジン、ポリグルタミン酸、又はポリアスパラギン酸等が挙げられる。ＲＧＤ配列を有する物質と相互作用する合成高分子としては、例えば、直鎖型、グラフト型、くし型、樹状型、又は星型等のＲＧＤ配列を有するポリマー又は共重合体が挙げられる。ポリマー又は共重合体としては、例えば、ポリウレタン、ポリアミド、ポリカーボネート、又はこれらの共重合体、ポリエステル、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリエチレングリコール−グラフト−ポリアクリル酸、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−ポリアクリル酸）、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリエチレンオキサイド、ポリε−カプロラクタム、ポリアクリルアミド、ポリ（メタクリル酸メチル−γ−ポリメタクリル酸オキシエチレン）等が挙げられる。 Examples of the protein that interacts with a substance having an RGD sequence include collagen, gelatin, proteoglycan, integrin, enzyme, or antibody. Examples of the polymer that interacts with a substance having an RGD sequence include a naturally-derived polymer or a synthetic polymer. Examples of naturally-derived polymers that interact with a substance having an RGD sequence include water-soluble polypeptides, low-molecular peptides, polyamino acids, sugars such as elastin, heparin, heparan sulfate or dextran sulfate, and hyaluronic acid. . Examples of the polyamino acid include polylysine such as α-polylysine or ε-polylysine, polyglutamic acid, or polyaspartic acid. Examples of the synthetic polymer that interacts with a substance having an RGD sequence include a polymer or copolymer having an RGD sequence such as a linear type, graft type, comb type, dendritic type, or star type. Examples of the polymer or copolymer include polyurethane, polyamide, polycarbonate, or a copolymer thereof, polyester, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polyethylene glycol-graft-polyacrylic acid, poly (N-isopropylacrylamide-co). -Polyacrylic acid), polyamidoamine dendrimer, polyethylene oxide, polyε-caprolactam, polyacrylamide, poly (methyl methacrylate-γ-polyoxymethacrylate) and the like.
相互作用する物質は、これらの中でも、ゼラチン、デキストラン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、グロブリン、アルブミン、ポリグルタミン酸、コラーゲン、又はエラスチンが好ましく、より好ましくはゼラチン、デキストラン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、又はコラーゲン、さらに好ましくはゼラチン、デキストラン硫酸、ヘパリン、又はヒアルロン酸である。 Among these, the interacting substance is preferably gelatin, dextran sulfate, heparin, hyaluronic acid, globulin, albumin, polyglutamic acid, collagen, or elastin, more preferably gelatin, dextran sulfate, heparin, hyaluronic acid, or collagen, More preferred is gelatin, dextran sulfate, heparin, or hyaluronic acid.
ＲＧＤ配列を有する物質と相互作用する物質との組み合わせは、特に制限されず、相互作用する異なる物質の組み合わせであればよく、いずれか一方がＲＧＤ配列を含む高分子又はタンパク質であり、他方がこれと相互作用する高分子またはタンパク質であればよい。ＲＧＤ配列を有する物質と相互作用を有する物質との組み合わせとしては、例えば、フィブロネクチンとゼラチン、フィブロネクチンとε−ポリリジン、フィブロネクチンとヒアルロン酸、フィブロネクチンとデキストラン硫酸、フィブロネクチンとヘパリン、フィブロネクチンとコラーゲン、ラミニンとゼラチン、ラミニンとコラーゲン、ポリリジンとエラスチン、ビトロネクチンとコラーゲン、ＲＧＤ結合コラーゲン又はＲＧＤ結合ゼラチンとコラーゲン又はゼラチン等が挙げられる。中でも、フィブロネクチンとゼラチン、フィブロネクチンとε−ポリリジン、フィブロネクチンとヒアルロン酸、フィブロネクチンとデキストラン硫酸、フィブロネクチンとヘパリン、又はラミニンとゼラチンが好ましく、より好ましくはフィブロネクチンとゼラチンである。なお、ＲＧＤ配列を有する物質及び相互作用を有する物質は、それぞれ一種類ずつでもよいし、相互作用を示す範囲で二種類以上をそれぞれ併用してもよい。 The combination of the substance having the RGD sequence and the substance that interacts is not particularly limited as long as it is a combination of different substances that interact with each other, and either one is a polymer or protein containing the RGD sequence, and the other is this. It may be a polymer or protein that interacts with. Examples of combinations of a substance having an RGD sequence and a substance having an interaction include, for example, fibronectin and gelatin, fibronectin and ε-polylysine, fibronectin and hyaluronic acid, fibronectin and dextran sulfate, fibronectin and heparin, fibronectin and collagen, laminin and gelatin Laminin and collagen, polylysine and elastin, vitronectin and collagen, RGD-bound collagen or RGD-bound gelatin and collagen or gelatin, and the like. Among them, fibronectin and gelatin, fibronectin and ε-polylysine, fibronectin and hyaluronic acid, fibronectin and dextran sulfate, fibronectin and heparin, or laminin and gelatin are preferable, and fibronectin and gelatin are more preferable. In addition, the substance which has a RGD arrangement | sequence, and the substance which has interaction may be one each, respectively, and may use 2 or more types together in the range which shows interaction, respectively.
（正の電荷を有する物質）
正の電荷を有する物質とは、正の電荷を有するタンパク質又は高分子をいう。正の電荷を有するタンパク質としては、例えば、水溶性タンパク質が好ましい。水溶性タンパク質としては、例えば、塩基性コラーゲン、塩基性ゼラチン、リゾチーム、シトクロムｃ、ペルオキシダーゼ、又はミオグロビン等が挙げられる。正の電荷を有する高分子としては、例えば、天然由来高分子及び合成高分子が挙げられる。天然由来高分子としては、例えば、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、ポリアミノ酸、キチン又はキトサン等の糖等が挙げられる。ポリアミノ酸としては、ポリ（α−リジン）、ポリ（ε−リジン）等のポリリジン、ポリアルギニン、又はポリヒスチジン等が挙げられる。合成高分子としては、例えば、直鎖型、グラフト型、くし型、樹状型、又は星型等のポリマー又は共重合体が挙げられる。前記ポリマー又は共重合体としては、例えば、ポリウレタン、ポリアミド、ポリカーボネート、又はこれらの共重合体、ポリエステル、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド（ＰＤＤＡ）、ポリアリルアミンハイドロクロライド、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、又はポリアミドアミンデンドリマー等が挙げられる。
(Substance with positive charge)
A substance having a positive charge refers to a protein or polymer having a positive charge. As a protein having a positive charge, for example, a water-soluble protein is preferable. Examples of the water-soluble protein include basic collagen, basic gelatin, lysozyme, cytochrome c, peroxidase, or myoglobin. Examples of the positively charged polymer include naturally-derived polymers and synthetic polymers. Examples of naturally occurring polymers include water-soluble polypeptides, low molecular peptides, polyamino acids, sugars such as chitin or chitosan, and the like. Examples of the polyamino acid include polylysine such as poly (α-lysine) and poly (ε-lysine), polyarginine, and polyhistidine. Examples of the synthetic polymer include linear polymers, graft polymers, comb polymers, dendritic polymers, and star polymers or copolymers. Examples of the polymer or copolymer include polyurethane, polyamide, polycarbonate, or a copolymer thereof, polyester, polydiallyldimethylammonium chloride (PDDA), polyallylamine hydrochloride, polyethyleneimine, polyvinylamine, or polyamideamine dendrimer. Etc.
（負の電荷を有する物質）
負の電荷を有する物質とは、負の電荷を有するタンパク質又は高分子をいう。負の電荷を有するタンパク質としては、例えば、水溶性タンパク質が好ましい。水溶性タンパク質としては、例えば、酸性コラーゲン、酸性ゼラチン、アルブミン、グロブリン、カタラーゼ、β−ラクトグロブリン、チログロブリン、α−ラクトアルブミン、又は卵白アルブミン等が挙げられる。負の電荷を有する高分子としては、天然由来高分子及び合成高分子が挙げられる。天然由来高分子としては、例えば、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、ポリ（βリジン）等のポリアミノ酸、又はデキストラン硫酸等が挙げられる。合成高分子としては、例えば、直鎖型、グラフト型、くし型、樹状型、又は星型等のポリマー又は共重合体が挙げられる。前記ポリマー又は共重合体としては、例えば、ポリウレタン、ポリアミド、ポリカーボネート、及びこれらの共重合体、ポリエステル、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリルアミドメチルプロパンスルホン酸、末端カルボキシ化ポリエチレングリコール、ポリジアリルジメチルアンモニウム塩、ポリアリルアミン塩、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、又はポリアミドアミンデンドリマー等が挙げられる。
(Substance with negative charge)
A substance having a negative charge refers to a protein or polymer having a negative charge. As a protein having a negative charge, for example, a water-soluble protein is preferable. Examples of the water-soluble protein include acidic collagen, acidic gelatin, albumin, globulin, catalase, β-lactoglobulin, thyroglobulin, α-lactalbumin, and egg white albumin. Examples of the negatively charged polymer include naturally derived polymers and synthetic polymers. Examples of naturally derived polymers include water-soluble polypeptides, low molecular peptides, polyamino acids such as poly (β-lysine), dextran sulfate, and the like. Examples of the synthetic polymer include linear polymers, graft polymers, comb polymers, dendritic polymers, and star polymers or copolymers. Examples of the polymer or copolymer include polyurethane, polyamide, polycarbonate, and copolymers thereof, polyester, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polystyrene sulfonic acid, polyacrylamide methylpropane sulfonic acid, and terminal carboxylated polyethylene glycol. , Polydiallyldimethylammonium salt, polyallylamine salt, polyethyleneimine, polyvinylamine, or polyamidoamine dendrimer.
正の電荷を有する物質と負の電荷を有する物質との組み合わせとしては、例えば、ε−ポリリジン塩とポリスルホン酸塩、ε−ポリリジンとポリスルホン酸塩、キトサンとデキストラン硫酸、ポリアリルアミンハイドロクロライドとポリスチレンスルホン酸塩、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドとポリスチレンスルホン酸塩、又はポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドとポリアクリル酸塩等が挙げられ、好ましくはε−ポリリジン塩とポリスルホン酸塩、又はポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドとポリアクリル酸塩である。ポリスルホン酸塩としては、例えば、ポリスルホン酸ナトリウム（ＰＳＳ）等が挙げられる。なお、正の電荷を有する物質及び負の電荷を有する物質は、それぞれ、一種類ずつでもよいし、相互作用を示す範囲で二種類以上をそれぞれ併用してもよい。 Examples of combinations of a positively charged substance and a negatively charged substance include ε-polylysine salt and polysulfonate, ε-polylysine and polysulfonate, chitosan and dextran sulfate, polyallylamine hydrochloride and polystyrene sulfone. Acid salts, polydiallyldimethylammonium chloride and polystyrene sulfonate, polydiallyldimethylammonium chloride and polyacrylate, etc., preferably ε-polylysine salt and polysulfonate, or polydiallyldimethylammonium chloride and polyacrylic acid Acid salt. Examples of the polysulfonate include sodium polysulfonate (PSS). In addition, the substance having a positive charge and the substance having a negative charge may each be one kind, or two or more kinds may be used in combination within a range showing an interaction.
以下に、細胞を、ＲＧＤ配列を有する物質を含有する溶液Ａと接触させた後、ＲＧＤ配列を有する物質に相互作用を有する物質を含有する溶液Ｂと接触させ、この順序でこれらを交互に接触させ、最後に溶液Ａと接触させる方法を例にとり、本発明の製造方法の一例を説明する。 In the following, cells are brought into contact with solution A containing a substance having an RGD sequence, and then contacted with solution B containing a substance having an interaction with the substance having an RGD sequence, and these are alternately contacted in this order. An example of the production method of the present invention will be described by taking a method of bringing the solution A into contact with the solution A as an example.
細胞は、限定されない一又は複数の実施形態において、例えば、培養細胞が挙げられる。培養細胞は、ヒト細胞又はヒト以外の細胞であって、例えば、初代培養細胞、継代培養細胞、及び細胞株細胞等が挙げられる。また、細胞は、一又は複数の実施形態において、例えば、物理的耐性の低い細胞であり、肝ガン細胞が挙げられる。肝ガン細胞としては、例えば、ＨｅｐＧ２細胞、及びＨｕｈ−７細胞等が挙げられ、中でも、物理的耐性が低く、本発明による効果が得られやすい点から、ＨｅｐＧ２細胞が好ましい。細胞はヒト由来の細胞であってもよいし、ヒト以外の由来の細胞であってもよい。 The cell includes, for example, a cultured cell in one or a plurality of non-limiting embodiments. The cultured cells are human cells or non-human cells, and examples thereof include primary cultured cells, subcultured cells, and cell line cells. Moreover, in one or some embodiment, a cell is a cell with low physical tolerance, for example, A liver cancer cell is mentioned. Examples of hepatoma cells include HepG2 cells and Huh-7 cells. Among them, HepG2 cells are preferable because they have low physical resistance and can easily achieve the effects of the present invention. The cells may be human-derived cells or non-human-derived cells.
まず、細胞を溶液Ａと接触させる。これにより細胞表面に細胞をコーティングするコーティング層Ａが形成される。細胞と溶液Ａとの接触は、例えば、細胞を溶液Ａに浸漬すること、細胞に溶液Ａを塗布、滴下又は噴霧すること等により行うことができる。中でも、操作が容易であるという理由から溶液Ａに細胞を浸漬させることにより、細胞と溶液Ａとの接触を行うことが好ましい。 First, cells are brought into contact with solution A. Thereby, the coating layer A which coats a cell on the cell surface is formed. The contact between the cells and the solution A can be performed by, for example, immersing the cells in the solution A, applying, dropping or spraying the solution A on the cells. Especially, it is preferable to contact a cell and the solution A by immersing a cell in the solution A for the reason that operation is easy.
接触条件は、例えば、接触方法、溶液Ａに含まれる含有物及び又は細胞の種類、及び含有液の濃度等に応じて適宜決定できる。接触時間は、例えば、３０秒〜２４時間であり、好ましくは１分〜６０分、より好ましくは１分〜１５分、さらに好ましくは１分〜１０分、さらにより好ましくは１分〜５分である。接触時の雰囲気温度及び又は含有液の温度は、例えば、４〜６０℃であり、好ましくは２０〜４０℃、より好ましくは３０〜３７℃である。 The contact conditions can be appropriately determined according to, for example, the contact method, the type of inclusions and / or cells contained in the solution A, the concentration of the contained liquid, and the like. The contact time is, for example, 30 seconds to 24 hours, preferably 1 minute to 60 minutes, more preferably 1 minute to 15 minutes, still more preferably 1 minute to 10 minutes, and even more preferably 1 minute to 5 minutes. is there. The temperature of the atmosphere at the time of contact and / or the temperature of the contained liquid is, for example, 4 to 60 ° C, preferably 20 to 40 ° C, more preferably 30 to 37 ° C.
溶液Ａは、ＲＧＤ配列を有する物質と、溶媒又は分散媒体（以下、「溶媒等」ともいう）とを含む。溶液ＡにおけるＲＧＤ配列を有する物質の含有量は、例えば、０．０００１〜１質量％が好ましく、より好ましくは０．０１〜０．５質量％、さらに好ましくは０．０２〜０．１質量％である。溶媒としては、水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）及び緩衝液等の水性溶媒が挙げられる。緩衝液としては、例えば、Tris-HCl緩衝液等のＴｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液、HEPES緩衝液、クエン酸−リン酸緩衝液、グリシルグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、Britton-Robinson緩衝液、又はGTA緩衝液等が挙げられる。溶媒のｐＨは、特に制限されず、例えば、３〜１１であり、好ましくは６〜８、より好ましくは７．２〜７．４である。 The solution A includes a substance having an RGD arrangement and a solvent or a dispersion medium (hereinafter also referred to as “solvent etc.”). The content of the substance having an RGD sequence in the solution A is, for example, preferably 0.0001 to 1% by mass, more preferably 0.01 to 0.5% by mass, and still more preferably 0.02 to 0.1% by mass. It is. Examples of the solvent include aqueous solvents such as water, phosphate buffered saline (PBS), and a buffer solution. Examples of the buffer include Tris buffer such as Tris-HCl buffer, phosphate buffer, HEPES buffer, citrate-phosphate buffer, glycylglycine-sodium hydroxide buffer, Britton-Robinson buffer Or GTA buffer. The pH of the solvent is not particularly limited, and is, for example, 3 to 11, preferably 6 to 8, and more preferably 7.2 to 7.4.
溶液Ａは、さらに、必要に応じて、例えば、塩、細胞成長因子、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、生理活性ペプチド、又は医薬組成物等を含有してもよい。医薬組成物としては、例えば、疾患の治療剤、予防剤、抑制剤、抗菌剤、又は抗炎症剤等が挙げられる。塩としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、炭酸水素ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化カリウム、リン酸水素ナトリウム、硫酸マグネシウム、コハク酸ナトリウム等が挙げられる。塩は、一種類でもよいし二種類以上含有していてもよい。溶液Ａの含有液中の塩濃度は、特に制限されないが、例えば、１×１０-6Ｍ〜２Ｍであり、好ましくは１×１０-4Ｍ〜１Ｍ、より好ましくは１×１０-4Ｍ〜０．０５Ｍである。 The solution A may further contain, for example, a salt, a cell growth factor, a cytokine, a chemokine, a hormone, a physiologically active peptide, or a pharmaceutical composition as necessary. Examples of the pharmaceutical composition include a therapeutic agent, preventive agent, inhibitor, antibacterial agent, or anti-inflammatory agent for diseases. Examples of the salt include sodium chloride, calcium chloride, sodium hydrogen carbonate, sodium acetate, sodium citrate, potassium chloride, sodium hydrogen phosphate, magnesium sulfate, sodium succinate and the like. One kind of salt may be contained, or two or more kinds of salts may be contained. Salt concentration containing solution of solution A is not particularly limited, for example, 1 × a 10 -6 M~2M, preferably 1 × 10 -4 M~1M, more preferably 1 × 10 -4 M to 0.05M.
ついで、コーティング層Ａの形成に使用されなかった物質を除去する。除去は、例えば、遠心分離又は濾過等により行うことができる。遠心分離による除去は、例えば、溶液Ａに細胞を分散させた状態で遠心分離し、ついで上澄みを除去することにより行うことができる。遠心分離条件は、細胞の種類、細胞の濃度、及び溶液Ａに含まれる含有物の組成によって適宜決定できる。 Next, the material that has not been used to form the coating layer A is removed. The removal can be performed by, for example, centrifugation or filtration. The removal by centrifugation can be performed, for example, by centrifuging in a state where the cells are dispersed in the solution A, and then removing the supernatant. Centrifugation conditions can be appropriately determined depending on the type of cells, the concentration of cells, and the composition of inclusions contained in the solution A.
上記物質の除去に加えて、洗浄操作を行うことが好ましい。洗浄は、例えば、遠心分離又は濾過等により行うことができる。遠心分離による洗浄は、例えば、上澄みを除去された細胞に溶媒を添加し、遠心分離及び上澄みの除去をすることにより行うことができる。洗浄に用いる溶媒は、溶液Ａの溶媒と同じであることが好ましい。 In addition to the removal of the substance, it is preferable to perform a washing operation. Washing can be performed, for example, by centrifugation or filtration. Washing by centrifugation can be performed, for example, by adding a solvent to the cells from which the supernatant has been removed, and performing centrifugation and removal of the supernatant. The solvent used for washing is preferably the same as the solvent of the solution A.
ついで、コーティング層Ａが形成された細胞を溶液Ｂに接触させる。接触後、好ましくは、コーティング層Ｂの形成に用いられなかった物質の除去操作、及び洗浄操作を行う。これにより、コーティング層Ａの表面にコーティング層Ｂが形成される。細胞と溶液Ｂとの接触は、ＲＧＤ配列を有する物質に代えて相互作用する物質を使用する以外は、溶液Ａとの接触と同様に行うことができる。 Next, the cell on which the coating layer A is formed is brought into contact with the solution B. After the contact, preferably, a removal operation of a substance not used for forming the coating layer B and a cleaning operation are performed. Thereby, the coating layer B is formed on the surface of the coating layer A. The contact between the cells and the solution B can be performed in the same manner as the contact with the solution A, except that a substance that interacts instead of the substance having the RGD sequence is used.
そして、上記と同様にして、コーティング層Ａ及びＢがそれぞれ形成された細胞と、溶液Ａとの接触、その後のコーティング層Ａの形成に用いられなかった物質の除去、及び洗浄操作、並びに溶液Ｂとの接触、その後の除去操作及び洗浄操作を順次行う。これにより、コーティング層Ａとコーティング層Ｂとが交互に形成された細胞が得られる。 Then, in the same manner as described above, the cells in which the coating layers A and B are respectively formed and contact with the solution A, the removal of substances not used for the subsequent formation of the coating layer A, the washing operation, and the solution B Contact with the substrate, and subsequent removal and cleaning operations are sequentially performed. Thereby, the cell in which the coating layer A and the coating layer B were formed alternately is obtained.
コーティング層Ａ及びＢの形成は、トータルのステップ回数が４ステップ以上行えばよく、好ましくはトータルのコーティング層の厚みが４ｎｍを超えるように前記ステップを繰り返すことであり、より好ましくは５ｎｍ以上、より好ましくは６ｎｍ以上、さらに好ましくは８ｎｍ以上である。上限は特に制限されないが、例えば、１０００ｎｍ以下、好ましくは１００ｎｍ以下、より好ましくは３０ｎｍ以下である。コーティング層Ａ及びＢのトータルの層数は、例えば、３、５、７、９、１１、１３、１５層又はそれ以上の多層であってもよい。なお、コーティング層の厚みは、実施例に基きQCM測定法により求めることができる。 The formation of the coating layers A and B may be performed by a total number of steps of 4 steps or more, preferably by repeating the above steps so that the total coating layer thickness exceeds 4 nm, more preferably 5 nm or more, more Preferably it is 6 nm or more, More preferably, it is 8 nm or more. The upper limit is not particularly limited, but is, for example, 1000 nm or less, preferably 100 nm or less, and more preferably 30 nm or less. The total number of coating layers A and B may be, for example, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 or more layers. The thickness of the coating layer can be determined by the QCM measurement method based on the examples.
このようにして得られた細胞は、優れた物理的耐性を示す。よって、本発明の製造方法により得られた細胞は、例えば、組織工学や再生医療の分野のみならず、細胞の保存及び又は輸送等においても有用である。物理的負荷への耐性が向上した細胞は、三次元組織の製造ではない用途に用いるための細胞であってもよい。また、物理的負荷への耐性が向上した細胞は、物理的負荷による生存率低下が抑制される細胞又は物理的負荷による細胞内容物の漏出が抑制される細胞であってもよい。 The cells thus obtained exhibit excellent physical resistance. Therefore, the cells obtained by the production method of the present invention are useful not only in the fields of tissue engineering and regenerative medicine, but also in storage and / or transportation of cells. The cell with improved resistance to physical load may be a cell for use in applications other than the production of three-dimensional tissue. In addition, the cell having improved resistance to physical load may be a cell in which a decrease in survival rate due to physical load is suppressed or a cell in which leakage of cell contents due to physical load is suppressed.
本発明の物理的負荷への耐性が向上した細胞は、上記の通り、優れた物理的耐性を示す。このため、本発明は、一又は複数の実施形態において、細胞の輸送及び/又は保存のために、本発明の製造方法により物理的負荷への耐性が向上した細胞を製造する方法に関する。 The cell with improved resistance to physical load of the present invention exhibits excellent physical resistance as described above. Therefore, in one or a plurality of embodiments, the present invention relates to a method for producing a cell having improved resistance to a physical load by the production method of the present invention for transporting and / or storing the cell.
［物理的負荷への耐性が向上した細胞］
本発明は、一又は複数の実施形態において、本発明の製造方法により製造される物理的負荷への耐性が向上した細胞（以下、「本発明の物理的負荷への耐性が向上した細胞」ともいう）に関する。本発明の物理的負荷への耐性が向上した細胞は、細胞表面にコーティング層が形成されていることから、例えば、細胞膜の脆弱化が抑制され、遠心分離等の細胞の物理的負荷に対して優れた耐性を示すという効果を好ましくは奏する。
[Cells with improved resistance to physical load]
In one or a plurality of embodiments, the present invention is a cell having improved resistance to a physical load produced by the production method of the present invention (hereinafter referred to as “cell having improved resistance to physical load of the present invention”). Say). The cells having improved resistance to the physical load of the present invention have a coating layer formed on the cell surface, so that, for example, cell membrane weakening is suppressed and the cell is subjected to physical load such as centrifugation. The effect of exhibiting excellent resistance is preferably exhibited.
本発明の物理的負荷への耐性が向上した細胞は、細胞と、細胞表面に形成されたコーティング層Ａとコーティング層Ｂとを含む。コーティング層Ａとコーティング層Ｂとは交互に形成されており、コーティング層のトータルの厚みは、４ｎｍを超えることが好ましい。隣接するコーティング層Ａとコーティング層Ｂとは互いに接するように形成されていることが好ましい。 The cell with improved resistance to a physical load of the present invention includes a cell, and a coating layer A and a coating layer B formed on the cell surface. The coating layer A and the coating layer B are alternately formed, and the total thickness of the coating layer is preferably more than 4 nm. The adjacent coating layer A and coating layer B are preferably formed so as to be in contact with each other.
本発明は、一又は複数の実施形態において、細胞と、前記細胞表面に形成されたコーティング層とを含み、コーティング層の厚みが４ｎｍを超える、物理的負荷への耐性が向上した細胞に関する。コーティング層は、コーティング層Ａとコーティング層Ｂとを含み、前記コーティング層Ａとコーティング層Ｂとは交互に形成されており、コーティング層Ａの成分とコーティング層Ｂとの組み合わせは、ＲＧＤ配列を有するタンパク質若しくは高分子と前記ＲＧＤ配列を有するタンパク質若しくは高分子と相互作用するタンパク質若しくは高分子との組み合わせ、又は、正の電荷を有するタンパク質若しくは高分子と負の電荷を有するタンパク質若しくは高分子との組み合わせである。本実施形態における細胞は、本発明の製造方法により製造することができる。 In one or a plurality of embodiments, the present invention relates to a cell having improved resistance to a physical load, including a cell and a coating layer formed on the cell surface, wherein the thickness of the coating layer exceeds 4 nm. The coating layer includes a coating layer A and a coating layer B. The coating layer A and the coating layer B are alternately formed, and the combination of the component of the coating layer A and the coating layer B has an RGD arrangement. A combination of a protein or polymer and a protein or polymer interacting with the protein or polymer having the RGD sequence, or a combination of a protein or polymer having a positive charge and a protein or polymer having a negative charge It is. The cells in this embodiment can be produced by the production method of the present invention.
［細胞の物理的負荷の耐性を向上させる方法］
本発明は、一又は複数の実施形態において、浮遊している細胞に溶液Ａ又は溶液Ｂを接触させて前記細胞をコーティングするコーティング層Ａ又はコーティング層Ｂを形成するステップを、コーティング層ＡとＢとが交互に形成されるように３ステップ又はそれ以上行うことを含み、前記溶液Ａの含有物と前記溶液Ｂの含有物との組み合わせが、ＲＧＤ配列を有するタンパク質若しくは高分子と前記ＲＧＤ配列を有するタンパク質若しくは高分子と相互作用するタンパク質若しくは高分子との組み合わせ、又は、正の電荷を有するタンパク質若しくは高分子と負の電荷を有するタンパク質若しくは高分子との組み合わせである、細胞の物理的負荷への耐性を向上させる方法（以下、「本発明の耐性向上方法」ともいう。）に関する。本発明の耐性向上方法は、本発明の製造方法と同様に行うことができる。
[Method of improving resistance to physical load of cells]
In one or a plurality of embodiments of the present invention, the step of forming the coating layer A or the coating layer B for coating the cells by bringing the solution A or the solution B into contact with the floating cells is performed by coating layers A and B. And a combination of the content of the solution A and the content of the solution B includes a protein or polymer having an RGD sequence and the RGD sequence. To the physical load of the cell, which is a combination of a protein or macromolecule that interacts with a protein or macromolecule possessed, or a combination of a positively charged protein or macromolecule and a negatively charged protein or macromolecule This invention relates to a method for improving the resistance (hereinafter, also referred to as “resistance improvement method of the present invention”). The tolerance improvement method of the present invention can be performed in the same manner as the production method of the present invention.
［キット］
本発明は、一又は複数の実施形態において、本発明の物理的負荷への耐性が向上した細胞の製造方法に使用するキットであって、コーティング層Ａを形成するための溶液Ａと、コーティング層Ｂを形成するための溶液Ｂとを含み、前記溶液Ａの含有物と前記溶液Ｂの含有物との組み合わせが、ＲＧＤ配列を有するタンパク質若しくは高分子と前記ＲＧＤ配列を有するタンパク質若しくは高分子と相互作用するタンパク質若しくは高分子との組み合わせ、又は、正の電荷を有するタンパク質若しくは高分子と負の電荷を有するタンパク質若しくは高分子との組み合わせであるキットに関する。本発明のキットによれば、本発明の物理的負荷への耐性が向上した細胞の製造を行うことができ、また、本発明の物理的負荷への耐性が向上した細胞を容易に得ることができる。
[kit]
In one or a plurality of embodiments, the present invention is a kit for use in the method for producing a cell with improved resistance to a physical load according to the present invention, comprising a solution A for forming a coating layer A, a coating layer A solution B for forming B, and the combination of the content of the solution A and the content of the solution B interacts with the protein or polymer having the RGD sequence and the protein or polymer having the RGD sequence. The present invention relates to a kit that is a combination of a protein or polymer that acts or a combination of a protein or polymer having a positive charge and a protein or polymer having a negative charge. According to the kit of the present invention, it is possible to produce cells with improved resistance to the physical load of the present invention, and to easily obtain cells with improved resistance to the physical load of the present invention. it can.
本発明のキットは、一又は複数の実施形態において、さらに、本発明の製造方法が記載された説明書を含むキットに関する。なお、本発明のキットは、説明書が本発明のキットの同梱されることなくウェブ上で提供される場合も含みうる。 In one or a plurality of embodiments, the kit of the present invention further relates to a kit containing instructions describing the production method of the present invention. The kit of the present invention may include a case where the instructions are provided on the web without the kit of the present invention being included.
以下に、実施例及び比較例を用いて本発明をさらに説明する。但し、本発明は以下の実施例に限定して解釈されない。 Hereinafter, the present invention will be further described using examples and comparative examples. However, the present invention is not construed as being limited to the following examples.
［コーティング層の厚み］
細胞表面に形成されたコーティング層の厚みは、別途、基材上にコーティング層の形成を行い、水晶発振子マイクロバランス（QCM）測定法を用い、行った処理（ステップ）数と形成される厚みとを測定し、その結果から細胞表面へのコーティング層形成時に行ったステップの回数に応じて算出した。QCM測定法を用いた測定は以下のように行った。QCM水晶センサをピランハ溶液で１分間洗浄してから、0.2 mg/mlフィブロネクチン（以下、「FN」ともいう）のTris-HCl(pH=7.4)溶液に３７℃で１分間浸漬し、Tris-HCl(pH=7.4)溶液で洗浄して風乾した後、振動数シフトを測定した（ステップ１）。ついで0.2 mg/mlゼラチン（以下、「Ｇ」ともいう）のTris-HCl(pH=7.4)溶液に３７℃で１分間浸漬し、Tris-HCl(pH=7.4)溶液で洗浄して風乾した後、振動数シフトを測定した（ステップ２）。このステップ１及び２を交互に繰り返すことによりQCM水晶センサにコーティング層を形成すると共に、振動数シフトの測定を行った。得られた振動数シフトに基づき、ステップの回数とそれにより形成されるコーティング層の厚みとを得た。
[Thickness of coating layer]
The thickness of the coating layer formed on the cell surface is separately formed by forming the coating layer on the substrate and using the quartz crystal microbalance (QCM) measurement method and the number of treatments (steps) and the thickness to be formed. Was calculated according to the number of steps performed when forming the coating layer on the cell surface. Measurement using the QCM measurement method was performed as follows. The QCM quartz sensor is washed with a Piranha solution for 1 minute, and then immersed in a 0.2 mg / ml fibronectin (hereinafter also referred to as “FN”) Tris-HCl (pH = 7.4) solution at 37 ° C. for 1 minute. After washing with (pH = 7.4) solution and air drying, the frequency shift was measured (step 1). Then, after being immersed in a Tris-HCl (pH = 7.4) solution of 0.2 mg / ml gelatin (hereinafter also referred to as “G”) for 1 minute at 37 ° C., washed with Tris-HCl (pH = 7.4) solution and air-dried. The frequency shift was measured (step 2). By repeating steps 1 and 2 alternately, a coating layer was formed on the QCM quartz sensor, and the frequency shift was measured. Based on the obtained frequency shift, the number of steps and the thickness of the coating layer formed thereby were obtained.
（実施例１）
［細胞へのコーティング層の形成］
HepG2細胞をプラスチックシャーレ上からトリプシン処理によって回収した。回収した細胞を1×107cell/mlの濃度で0.2mg/mlのフィブロネクチンを含む50mM Tris-HCl(pH=7.4)溶液に分散させ、転倒混和によって緩やかに撹拌しながら1分間分散状態を保った後、2,500rpmの回転数で1分間の遠心分離を行った（FN浸漬操作）。ついで、上澄みを除き、50 mM Tris-HCl(pH=7.4)溶液を加え、細胞を分散させ、転倒混和によって緩やかに撹拌しながら1分間分散状態を保った後、2,500rpmの回転数で1分間の遠心分離を行った（洗浄操作）。上澄みを除き、0.2mg/mlのゼラチンを含む50mM Tris-HCl(pH=7.4)溶液に細胞を分散させ、転倒混和によって緩やかに撹拌しながら、1分間分散状態を保った後、2,500rpmの回転数で1分間の遠心分離を行い（G浸漬操作）、ついで洗浄操作を行った。そして、FN浸漬操作、洗浄操作、Ｇ浸漬操作、及び洗浄操作をこの順番で行った。FN浸漬操作及びＧ浸漬操作は洗浄操作とそれぞれセットで１ステップとし、最終的に、FN浸漬操作を５回、Ｇ浸漬操作を４回、計９ステップ行うことによってFN-Gコート細胞を準備した（コーティング層の厚み：8nm）。
Example 1
[Formation of coating layer on cells]
HepG2 cells were collected from the plastic petri dish by trypsin treatment. Disperse the collected cells in a 50 mM Tris-HCl (pH = 7.4) solution containing 0.2 mg / ml fibronectin at a concentration of 1 × 10 7 cells / ml, and keep the dispersed state for 1 minute with gentle stirring by inversion. After that, centrifugation was performed at 2,500 rpm for 1 minute (FN immersion operation). Next, remove the supernatant, add 50 mM Tris-HCl (pH = 7.4) solution, disperse the cells, keep the dispersion for 1 minute with gentle mixing by inversion, and then rotate for 1 minute at 2,500 rpm. Was centrifuged (washing operation). Remove the supernatant, disperse the cells in 50 mM Tris-HCl (pH = 7.4) solution containing 0.2 mg / ml gelatin, keep the dispersion for 1 minute while gently stirring by inversion, then rotate at 2,500 rpm Centrifugation was performed for 1 minute (G immersion operation) followed by a washing operation. And FN immersion operation, washing | cleaning operation, G immersion operation, and washing | cleaning operation were performed in this order. The FN soaking operation and the G soaking operation each consisted of a washing operation and a set of one step, and finally, FN-G coated cells were prepared by performing FN soaking operation 5 times and G soaking operation 4 times in total 9 steps (Thickness of the coating layer: 8 nm).
［ストレス耐性試験］
FN-Gコート細胞を1×107cell/mlの濃度で50 mM Tris-HCl(pH=7.4)溶液に分散させ、転倒混和によって緩やかに撹拌しながら、1分間分散状態を保った後、2,500 rpmの回転数で1分間の遠心分離を行った。上澄みを除き、新しい50mM Tris-HCl(pH=7.4)溶液を加え、細胞を分散させた。この遠心分離を１、２、３、４、６、８又は１０回行い、細胞の生存率を測定することによって、細胞のストレス耐性を評価した。生存率は、遠心分離処理後の細胞をトリパンブルー染色し、血球計算盤を用いた目視計測またはセルカウンターを用いて測定し、測定された全細胞数に占める生細胞の数によって算出した。その結果を図２に示す。
[Stress tolerance test]
FN-G coated cells were dispersed in a 50 mM Tris-HCl (pH = 7.4) solution at a concentration of 1 × 10 7 cell / ml, and kept dispersed for 1 minute while gently stirring by inversion mixing. Centrifugation was performed for 1 minute at a rotation speed of rpm. The supernatant was removed and fresh 50 mM Tris-HCl (pH = 7.4) solution was added to disperse the cells. This centrifugation was performed 1, 2, 3, 4, 6, 8 or 10 times, and the stress resistance of the cells was evaluated by measuring the cell viability. The survival rate was calculated by the number of living cells in the total number of cells measured by trypan blue staining of the cells after the centrifugation treatment, measuring with a visual measurement using a hemocytometer or a cell counter. The result is shown in FIG.
（比較例１）
コーティング層を形成していないHepG2細胞（以下、「非コート細胞」という）を用いた以外は、実施例１と同様にストレス耐性試験を行った。その結果を図２に示す。
(Comparative Example 1)
A stress tolerance test was performed in the same manner as in Example 1 except that HepG2 cells (hereinafter referred to as “non-coated cells”) without a coating layer were used. The result is shown in FIG.
図２は、遠心分離処理の回数と細胞の生存率との関係を示すグラフであって、図２においてマーカーが丸であるグラフが実施例１の結果を示し、三角であるグラフが比較例１の結果を示す。図２に示すように、FN-Gコート細胞は、遠心分離処理を２回以上行った場合、非コート細胞と比較して生存率が高かった。よって、実施例１のFN-Gコート細胞は、物理的負荷への耐性が向上したことが確認できた。 FIG. 2 is a graph showing the relationship between the number of centrifugation treatments and the cell viability. In FIG. 2, the graph in which the marker is a circle shows the result of Example 1, and the graph in which the triangle is a comparative example 1 The results are shown. As shown in FIG. 2, the FN-G coated cells had a higher survival rate than the uncoated cells when the centrifugation treatment was performed twice or more. Therefore, it was confirmed that the resistance to physical load of the FN-G coated cells of Example 1 was improved.
（実施例２）
実施例１と同様の手順で、FN浸漬操作及びＧ浸漬操作をそれぞれ１、２又は４回行った後、FN浸漬操作を１回行うことにより、３種類のFN-Gコート細胞を製造した。得られたFN-Gコート細胞のコーティング層の厚みは、トータル３ステップであるFN-Gコート細胞は4nm、トータル５ステップであるFN-Gコート細胞は5nm、トータル９ステップであるFN-Gコート細胞は7nmであった。これらのFN-Gコート細胞と、比較例１と同様の非コート細胞とを用いて、実施例１と同様の条件で遠心分離処理を数回行い、生存率を測定した。その結果を図３に示す。図３に示すように、コーティング層の厚みが４ｎｍを越えると生存率が向上し、５ｎｍ以上になるとほぼ100%の生存率を示した。よって、コーティング層の厚みが４ｎｍを超えると、細胞のストレス耐性が大幅に向上することが確認できた。
(Example 2)
Three types of FN-G coated cells were produced by performing FN immersion operation and G immersion operation 1, 2 or 4 times, respectively, and then performing FN immersion operation once in the same procedure as in Example 1. The thickness of the coating layer of the obtained FN-G coated cells is 4 nm for FN-G coated cells, which is a total of 3 steps, 5 nm for FN-G coated cells, which is a total of 5 steps, and a FN-G coat for a total of 9 steps. Cells were 7nm. Using these FN-G coated cells and uncoated cells similar to Comparative Example 1, centrifugation was performed several times under the same conditions as in Example 1, and the survival rate was measured. The result is shown in FIG. As shown in FIG. 3, the survival rate was improved when the thickness of the coating layer exceeded 4 nm, and the survival rate was almost 100% when the thickness was 5 nm or more. Therefore, it was confirmed that when the thickness of the coating layer exceeds 4 nm, the stress resistance of the cells is greatly improved.
（実施例３）
HepG2細胞にFN-Gコート又はCol IV-LNコートを行った場合、あるいは細胞にコートをしない場合について、細胞から放出される乳酸脱水素酵素（LDH）の量をLDH活性により求めた。その結果を図４に示す。なお、FN-Gコート細胞（HepG2細胞にFN-Gコートした細胞）は、実施例１と同様の手順で、FN浸漬操作を１回行うことにより製造したもの（FNコート細胞）、あるいはFN浸漬操作とG浸漬操作をそれぞれ１又は２回行った後、FN浸漬操作を１回行うことにより製造したものの合計３種類のFN-Gコート細胞（又はFNコート細胞）を用いた。Col IV-LNコート細胞は、フィブロネクチンに代えてコラーゲン、ゼラチンに代えてラミニンを使用した以外は、FN-Gコート細胞と同様にして製造した。非コート細胞は、FNを含む50mM Tris-HCl(pH=7.4)溶液及びGを含む50mM Tris-HCl(pH=7.4)溶液に代えて50mM Tris-HCl(pH=7.4)溶液を用いた以外は、FN-Gコート細胞と同様にして製造した。乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性は、LDH Cytotoxicity Assay kit（Cayman chemical社）により求めた。
(Example 3)
When HepG2 cells were coated with FN-G or Col IV-LN, or when the cells were not coated, the amount of lactate dehydrogenase (LDH) released from the cells was determined by LDH activity. The result is shown in FIG. The FN-G-coated cells (cells in which HepG2 cells were FN-G-coated) were prepared by performing the FN immersion operation once in the same procedure as in Example 1 (FN-coated cells), or FN-immersed cells. A total of three types of FN-G-coated cells (or FN-coated cells) produced by performing the operation and the G immersion operation once or twice and then performing the FN immersion operation once were used. Col IV-LN coated cells were produced in the same manner as FN-G coated cells except that collagen was used instead of fibronectin and laminin was used instead of gelatin. For non-coated cells, a 50 mM Tris-HCl (pH = 7.4) solution was used instead of a 50 mM Tris-HCl (pH = 7.4) solution containing FN and a 50 mM Tris-HCl (pH = 7.4) solution containing G. The FN-G coated cells were produced in the same manner. Lactate dehydrogenase (LDH) activity was determined using an LDH Cytotoxicity Assay kit (Cayman chemical).
図４に示すように、コート細胞は、非コート細胞と比較して細胞外に放出されるLDHの量が少なかった。よって、細胞表面にコーティング層を形成することによって、細胞膜の緩みを抑制できることが確認できた。 As shown in FIG. 4, the amount of LDH released from the coated cells to the outside of the cells was smaller than that of the non-coated cells. Therefore, it was confirmed that the loosening of the cell membrane can be suppressed by forming a coating layer on the cell surface.
（実施例４）
まず、コーティング層が形成されていない細胞を用いて、実施例１と同様にして遠心分離処理を１、２、４、６、１０、又は１８回行い、生存率を測定した。細胞は、HepG2、Huh-7、Hep3B、PLC/PRF/5、MIA PaCa-2、BxPC-3及びHT-29を用いた。その結果を図５Ａに示す。図５Ａは、遠心分離処理の回数と細胞の生存率との関係を示すグラフである。図５Ａに示すように、遠心分離処理を２回以上行った場合、HepG2細胞の生存率が下がり、遠心分離処理の回数が増えるとともに生存率は減少した。また、遠心分離処理を１０回以上行った場合、Huh-7細胞の生存率が下がった。
Example 4
First, using cells in which a coating layer was not formed, centrifugation was performed 1, 2, 4, 6, 10, or 18 times in the same manner as in Example 1, and the survival rate was measured. The cells used were HepG2, Huh-7, Hep3B, PLC / PRF / 5, MIA PaCa-2, BxPC-3 and HT-29. The result is shown in FIG. 5A. FIG. 5A is a graph showing the relationship between the number of centrifugation processes and the cell survival rate. As shown in FIG. 5A, when centrifugation was performed twice or more, the survival rate of HepG2 cells decreased, and the survival rate decreased as the number of centrifugations increased. Moreover, when the centrifugation process was performed 10 times or more, the survival rate of Huh-7 cells fell.
つぎに、Huh-7細胞を用いた以外は、実施例１と同様にFN浸漬操作を５回、Ｇ浸漬操作を４回、計９ステップ行うことにより、FN-Gコート細胞を製造し、その生存率及び収率を測定した。また、比較例として、FNを含む50mM Tris-HCl(pH=7.4)溶液及びGを含む50mM Tris-HCl(pH=7.4)溶液に代えて50mM Tris-HCl(pH=7.4)溶液を用いた以外は、実施例１と同様の浸漬操作・遠心分離処理を行うことにより、非コート細胞を準備し、その生存率及び収率を測定した。なお、生存率は、測定された全細胞数に占める生細胞数の割合により求めた。収率は、スタート時の細胞数に対する浸漬・遠心分離処理後の全細胞数の割合により求めた。 Next, except that Huh-7 cells were used, FN-G coated cells were produced by performing FN immersion operation 5 times and G immersion operation 4 times, a total of 9 steps, as in Example 1. Viability and yield were measured. As a comparative example, a 50 mM Tris-HCl (pH = 7.4) solution was used instead of a 50 mM Tris-HCl (pH = 7.4) solution containing FN and a 50 mM Tris-HCl (pH = 7.4) solution containing G. In the same manner as in Example 1, uncoated cells were prepared by immersing and centrifuging, and their survival rate and yield were measured. In addition, the survival rate was calculated | required by the ratio of the number of living cells to the measured total number of cells. The yield was determined by the ratio of the total number of cells after immersion / centrifugation to the number of cells at the start.
その結果を図５Ｂに示す。図５ＢはFN-GコートしたHuh-7細胞及び非コートのHuh-7細胞の生存率と細胞収率とを示すグラフである。図５Ｂに示すように、FN-GコートしたHuh-7細胞は、非コート細胞と比較して生存率及び収率が向上した。よって、Huh-7細胞でも細胞のストレス耐性が向上することが確認できた。 The result is shown in FIG. 5B. FIG. 5B is a graph showing the survival rate and cell yield of FN-G-coated Huh-7 cells and uncoated Huh-7 cells. As shown in FIG. 5B, the viability and the yield of Huh-7 cells coated with FN-G were improved as compared with non-coated cells. Therefore, it was confirmed that the stress tolerance of the cells was improved even in Huh-7 cells.
（実施例５）
FN-Gコート細胞、Col IV-LNコート細胞、PDDA−PSSコート細胞、及び非コート細胞を用いて細胞の生存率及び収率を測定した。生存率及び収率は、実施例４と同様の方法により求めた。なお、Col IV-LNコート細胞は、FNに代えてコラーゲン、Gに代えてラミニンを使用した以外は、FN-Gコート細胞と同様にして製造した（コーティング層の厚み：９ｎｍ）。PDDA−PSSコート細胞は、FNに代えてPDDA、Gに代えてPSSを使用した以外は、FN-Gコート細胞と同様にして製造した（コーティング層の厚み：１４ｎｍ）。非コート細胞は、HepG2細胞を用いた以外は、実施例４と同様にした。その結果を図６に示す。図６Ａは各細胞の生存率を示すグラフであって、図６Ｂはトータルの細胞収率を示すグラフであり、図６Bにおいて白い部分が生存する細胞、黒い部分が死滅した細胞を示す。図６Ａ及びＢに示すように、コート細胞は、コーティング層の組成にかかわらず、いずれも非コート細胞よりも生存率及び収率が高かった。よって、コーティング層の組成にかかわらず細胞の物理的負荷耐性が向上することが確認できた。
(Example 5)
Cell viability and yield were measured using FN-G coated cells, Col IV-LN coated cells, PDDA-PSS coated cells, and uncoated cells. The survival rate and yield were determined by the same method as in Example 4. Col IV-LN coated cells were produced in the same manner as FN-G coated cells except that collagen was used instead of FN and laminin was used instead of G (coating layer thickness: 9 nm). PDDA-PSS coated cells were produced in the same manner as FN-G coated cells except that PDDA was used instead of FN and PSS was used instead of G (coating layer thickness: 14 nm). Uncoated cells were the same as in Example 4 except that HepG2 cells were used. The result is shown in FIG. FIG. 6A is a graph showing the survival rate of each cell, and FIG. 6B is a graph showing the total cell yield. In FIG. 6B, the white part is a living cell and the black part is a dead cell. As shown in FIGS. 6A and B, the coated cells had higher survival rates and yields than the uncoated cells, regardless of the composition of the coating layer. Therefore, it was confirmed that the physical load resistance of the cells was improved regardless of the composition of the coating layer.
このため、本発明は、例えば、化粧品、医薬、製薬等の分野において有用である。 For this reason, this invention is useful in fields, such as cosmetics, a pharmaceutical, a pharmaceutical, etc., for example.
Claims (6)
浮遊している細胞に溶液Ａ又は溶液Ｂを接触させて前記細胞をコーティングするコーティング層Ａ又はコーティング層Ｂを形成するステップを、コーティング層ＡとＢとが交互に形成されるように４ステップ又はそれ以上行うことを含み、
前記溶液Ａの含有物と前記溶液Ｂの含有物との組み合わせが、ＲＧＤ配列を有するタンパク質若しくは高分子と前記ＲＧＤ配列を有するタンパク質若しくは高分子と相互作用するタンパク質若しくは高分子との組み合わせ、又は、正の電荷を有するタンパク質若しくは高分子と負の電荷を有するタンパク質若しくは高分子との組み合わせである、
物理的負荷への耐性が向上した細胞の製造方法。 A method for producing cells with improved resistance to physical load,
The step of forming the coating layer A or the coating layer B for coating the cells by bringing the solution A or the solution B into contact with the suspended cells is performed in four steps or so that the coating layers A and B are alternately formed. Including doing more,
A combination of the content of the solution A and the content of the solution B is a combination of a protein or polymer having an RGD sequence and a protein or polymer interacting with the protein or polymer having the RGD sequence, or A combination of a positively charged protein or polymer and a negatively charged protein or polymer,
A method for producing cells with improved resistance to physical loads.
前記溶液Ａの含有物と前記溶液Ｂの含有物との組み合わせが、ＲＧＤ配列を有するタンパク質若しくは高分子と前記ＲＧＤ配列を有するタンパク質若しくは高分子と相互作用するタンパク質若しくは高分子との組み合わせ、又は、正の電荷を有するタンパク質若しくは高分子と負の電荷を有するタンパク質若しくは高分子との組み合わせである、
細胞の物理的負荷への耐性を向上する方法。 The step of forming the coating layer A or the coating layer B for coating the cells by bringing the solution A or the solution B into contact with the suspended cells is performed in four steps or so that the coating layers A and B are alternately formed. Including doing more,
A combination of the content of the solution A and the content of the solution B is a combination of a protein or polymer having an RGD sequence and a protein or polymer interacting with the protein or polymer having the RGD sequence, or A combination of a positively charged protein or polymer and a negatively charged protein or polymer,
A method to improve the resistance of cells to physical load.
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101815370B1 (en) * | 2016-02-25 | 2018-01-09 | 중앙대학교 산학협력단 | Technology for depositing a multi-layer film on the cell surface |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH09508111A (en) * | 1994-01-13 | 1997-08-19 | ジー．ディー．サール アンド カンパニー | Use of N-alkyl derivatives of 1,5-dideoxy-1,5-imino-D-glucitol for the treatment of hepatitis B virus infection |
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2012
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| JPH09508111A (en) * | 1994-01-13 | 1997-08-19 | ジー．ディー．サール アンド カンパニー | Use of N-alkyl derivatives of 1,5-dideoxy-1,5-imino-D-glucitol for the treatment of hepatitis B virus infection |
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|---|
| JPN6016015383; Ｌａｎｇｍｕｉｒ， （２００５）， Ｖｏｌ． ２１， Ｎｏ． ２， ｐ． ７０５-７０９ * |
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| KR101815370B1 (en) * | 2016-02-25 | 2018-01-09 | 중앙대학교 산학협력단 | Technology for depositing a multi-layer film on the cell surface |
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