JP2013224867A - Mass spectrometry of sugar peptide - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ライフサイエンス分野及び質量分析分野に属する。具体的には、本発明は、糖ペプチドの質量分析法に関する。特に本発明は、糖ペプチドの質量分析による構造解析法に関する。 The present invention belongs to the life science field and the mass spectrometry field. Specifically, the present invention relates to a mass spectrometry method for glycopeptides. In particular, the present invention relates to a method for structural analysis of a glycopeptide by mass spectrometry.
糖ペプチドの構造解析法においては、糖ペプチドをＭＳ／ＭＳに供して糖鎖開裂由来のフラグメントイオンを検出し、N-グリカン結合ペプチドの特徴的な開裂を示すトリプレットピーク（120Da及び83Daの質量差で出現する３本のピーク）によって、GlcNAcのみが結合した糖ペプチドのイオンを認識し、このイオンをプリカーサイオンとしてＭＳ３に供してペプチド鎖開裂由来のフラグメントイオンを検出することによって、ペプチド配列情報を取得する（非特許文献１）。 In the structure analysis method of glycopeptides, glycopeptides are subjected to MS / MS to detect fragment ions derived from glycosylation, and triplet peaks (120Da and 83Da mass difference indicating characteristic cleavage of N-glycan-binding peptides). 3 peaks appearing in Fig. 3) , the peptide of the peptide sequence information is detected by recognizing the ion of the glycopeptide bound only to GlcNAc and using this ion as a precursor ion to MS 3 to detect fragment ions derived from peptide chain cleavage. (Non-Patent Document 1).
また、ペプチドの構造解析法においては、ペプチジルアルギニンデイミナーゼによりアルギニン残基を修飾することで開裂の優先傾向の改良を行うことができたことが知られている（非特許文献２）。ペプチドの配列解析手法においては他にも、アセチルアセトンを用いてアルギニン残基を修飾する方法（非特許文献３）、マロンジアルデヒドを用いてアルギニン残基を修飾する方法（非特許文献４）、又はカルボキシペプチダーゼによりC末端のアルギニン残基を除去する方法（非特許文献５）により、開裂の優先傾向の改良を行うことができたことが知られている。 In addition, in the peptide structure analysis method, it is known that the priority of cleavage could be improved by modifying the arginine residue with peptidylarginine deiminase (Non-patent Document 2). In addition to the peptide sequence analysis method, other methods include acetylacetone to modify arginine residues (Non-patent Document 3), malondialdehyde to modify arginine residues (Non-patent Document 4), or It is known that the priority of cleavage can be improved by a method of removing the C-terminal arginine residue with carboxypeptidase (Non-patent Document 5).
従来の糖ペプチドの構造解析法においては、糖ペプチドのペプチド鎖にアルギニン残基がある場合、アルギニン残基のグアニジノ基にプロトンが強く親和して局在するため、糖鎖開裂に由来するフラグメントイオン及びペプチド鎖の開裂に由来するフラグメントイオンが生じにくく、構造解析が困難である。
この効果は、グアニジノ基を持たない糖ペプチドにグアニジノ基を付加した場合に、グアニジノ基を持たない糖ペプチドでは生じていた糖鎖開裂由来のフラグメントイオンやペプチド鎖開裂由来のフラグメントイオンが、グアニジノ基を付加することで生じにくくなることからも確認される。また、糖ペプチドにラベル化剤で修飾を施すことで正電荷を固定した場合に、修飾前（正電荷固定化前）の糖ペプチドでは生じていた糖鎖開裂由来のフラグメントイオンやペプチド鎖開裂由来のフラグメントイオンが、修飾により正電荷を固定することで生じにくくなることも確認された。これらのことは、開裂効率低下の原因が、分子の切断に必要なプロトンの供給ができなくなっていることにあることを示唆する。
In conventional glycopeptide structural analysis methods, if there is an arginine residue in the peptide chain of the glycopeptide, protons are strongly affinityd and localized to the guanidino group of the arginine residue. In addition, fragment ions derived from peptide chain cleavage are less likely to occur, and structural analysis is difficult.
This effect is due to the fact that when a guanidino group is added to a glycopeptide without a guanidino group, the fragment ion derived from the sugar chain cleavage or the fragment ion derived from the peptide chain cleavage generated in the glycopeptide without the guanidino group is converted into a guanidino group. It is also confirmed from the fact that it becomes difficult to generate by adding. In addition, when a positive charge is fixed by modifying the glycopeptide with a labeling agent, the fragment ion or peptide chain cleavage derived from the sugar chain cleavage that occurred in the glycopeptide before modification (before positive charge fixation) It was also confirmed that the fragment ions are less likely to be generated by fixing a positive charge by modification. These suggest that the cause of the reduction in cleavage efficiency is that the supply of protons necessary for molecular cleavage cannot be performed.
そこで本発明の目的は、アルギニン残基を有する糖ペプチドの質量分析において、糖ペプチド解析に必要な開裂を生じさせることができる方法を提供することにある。 Therefore, an object of the present invention is to provide a method capable of causing cleavage necessary for glycopeptide analysis in mass spectrometry of glycopeptides having arginine residues.
本発明者らは、糖ペプチドにおけるアルギニン残基のグアニジノ基のプロトンアフィニティを低下させプロトンがグアニジノ基に局在化しないように前処理することによって、上記本発明の目的が達成されることを見出し、本発明を完成するに至った。 The inventors of the present invention have found that the object of the present invention can be achieved by reducing the proton affinity of the guanidino group of the arginine residue in the glycopeptide and pretreating the proton so as not to localize to the guanidino group. The present invention has been completed.
本発明は、以下の発明を含む。
（１）
グアニジノ基を有する糖ペプチドを、前記グアニジノ基の改変又は前記グアニジノ基の除去に供し、前記グアニジノ基を有しない糖ペプチドを得る前処理工程と、
前記グアニジノ基を有しない糖ペプチドを質量分析に供し、糖鎖開裂由来のフラグメントイオンを得る質量分析工程とを含む、糖ペプチドの質量分析法。
The present invention includes the following inventions.
(1)
A pretreatment step of obtaining a glycopeptide having no guanidino group by subjecting a glycopeptide having a guanidino group to modification of the guanidino group or removal of the guanidino group;
A mass spectrometry method for glycopeptide, comprising: subjecting a glycopeptide having no guanidino group to mass spectrometry to obtain a fragment ion derived from glycosylation.
上記（１）における糖鎖開裂由来のフラグメントイオンの具体例は、前記グアニジノ基を有しない糖ペプチドの分子量関連イオンから生じるプロダクトイオンであり、より具体的には、前記グアニジノ基を有しない糖ペプチドのペプチド鎖の全体と糖鎖の一部とから構成されるプロダクトイオンである。 Specific examples of fragment ions derived from glycosylation in (1) above are product ions generated from molecular weight related ions of glycopeptides not having the guanidino group, and more specifically, glycopeptides not having the guanidino group Product ions composed of the entire peptide chain and a part of the sugar chain.
（２）
前記グアニジノ基の改変が、一般式Ｒ１ＣＯＣＲ２Ｒ３ＣＯＲ４（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ、同一又は異なっていてよいＨ又は炭素数１〜８のアルキル基である）で表されるジケトンを用いたピリミジン環への変換又はペプチジルアルギニンデイミナーゼを用いた脱イミン化によって行われる、（１）に記載の方法。
(2)
The modification of the guanidino group is a general formula R 1 COCR 2 R 3 COR 4 (R 1 , R 2 , R 3 and R 4 are each H or C 1-8 alkyl groups which may be the same or different. The method according to (1), which is performed by conversion to a pyrimidine ring using a diketone represented by (A) or deimination using a peptidylarginine deiminase.
（３）
前記グアニジノ基の除去が、アルギニン残基の除去によって行われる、（１）に記載の方法。
(3)
The method according to (1), wherein the guanidino group is removed by removing an arginine residue.
（４）
前記アルギニン残基が糖鎖結合部位よりＣ末端側に存在し、前記アルギニン残基の除去がカルボキシペプチダーゼを用いて行われる、（３）に記載の方法。
(4)
The method according to (3), wherein the arginine residue is present on the C-terminal side from the sugar chain binding site, and the arginine residue is removed using carboxypeptidase.
（５）
前記アルギニン残基が糖鎖結合部位よりＮ末端側に存在し、前記アルギニン残基の除去が、トリプシン、ＡｒｇＣからなる群から選ばれる酵素を用いて行われる、（３）に記載の方法。
(5)
The method according to (3), wherein the arginine residue is present on the N-terminal side from the sugar chain binding site, and the arginine residue is removed using an enzyme selected from the group consisting of trypsin and ArgC.
（６）
前記質量分析を、ポストソース分解、衝突誘起解離、赤外多光子解離又は光誘起解離によって行う、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）
前記質量分析工程において、ペプチド鎖開裂由来のフラグメントイオンを得ることをさらに含む、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
上記（７）におけるペプチド鎖開裂由来のフラグメントイオンは、前記グアニジノ基を有しない糖ペプチドの分子量関連イオンから、及び／又は当該分子量関連イオンから生じたプリカーサイオンから生じるプロダクトイオンであり、より具体的には、前記グアニジノ基を有しない糖ペプチドのペプチド鎖の一部と糖鎖の一部とから構成されるプロダクトイオンである。
(6)
The method according to any one of (1) to (5), wherein the mass spectrometry is performed by post-source decomposition, collision-induced dissociation, infrared multiphoton dissociation, or photo-induced dissociation.
(7)
The method according to any one of (1) to (6), further comprising obtaining a fragment ion derived from peptide chain cleavage in the mass spectrometry step.
The fragment ion derived from peptide chain cleavage in (7) above is a product ion generated from a molecular weight related ion of a glycopeptide not having the guanidino group and / or a precursor ion generated from the molecular weight related ion. Is a product ion composed of a part of the peptide chain of the glycopeptide not having the guanidino group and a part of the sugar chain.
（８）
前記糖鎖開裂由来のフラグメントイオンに基づいて糖鎖配列決定を行う工程をさらに含む、（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）
前記ペプチド鎖開裂由来のフラグメントイオンに基づいてアミノ酸配列決定を行う工程をさらに含む、（７）又は（８）に記載の方法。
(8)
The method according to any one of (1) to (7), further comprising a step of determining a sugar chain sequence based on a fragment ion derived from the sugar chain cleavage.
(9)
The method according to (7) or (8), further comprising a step of determining an amino acid sequence based on a fragment ion derived from the peptide chain cleavage.
本発明により、グアニジノ基を有する糖ペプチドの質量分析において、糖ペプチド解析に必要な開裂を生じさせることができる方法が可能になる。
より具体的には、糖ペプチドをグアニジノ基非存在の糖ペプチドに変換することでプロトンの局在状態が解消されるため、プロトンが遊離し、さらにＭＳ／ＭＳ解析時に糖鎖部分やペプチド鎖部分に移動することで、開裂に必要なプロトンが供給される。その結果、糖ペプチド解析に必要なフラグメントイオンを生じさせることができる。
The present invention enables a method capable of causing cleavage necessary for glycopeptide analysis in mass spectrometry of a glycopeptide having a guanidino group.
More specifically, by converting the glycopeptide to a glycopeptide without a guanidino group, the localized state of the proton is eliminated, so that the proton is liberated, and the sugar chain portion or peptide chain portion is further analyzed during MS / MS analysis. The proton necessary for the cleavage is supplied by moving to. As a result, fragment ions necessary for glycopeptide analysis can be generated.
［１．糖ペプチド］
本発明の解析対象となる糖ペプチドは、ペプチド部にグアニジノ基を有する。グアニジノ基は、一般的にアルギニン残基の側鎖中に存在するものであるが、アルギニン残基の存在以外の態様、例えばアミノ酸残基において変異や人為的修飾により生じているものであってもよい。
[1. Glycopeptide]
The glycopeptide to be analyzed in the present invention has a guanidino group in the peptide portion. A guanidino group is generally present in the side chain of an arginine residue, but may be present in a mode other than the presence of an arginine residue, for example, an amino acid residue resulting from mutation or artificial modification. Good.
グアニジノ基を有するアミノ酸残基（以下、代表してアルギニン残基と記載する。その他のグアニジノ基含有アミノ酸残基の場合も同様。）のペプチド部における位置としては特に限定されず、Ｃ末端であってもよいし、Ｃ末端以外の配列中であってもよい。Ｃ末端にアルギニン残基が存在する場合の糖ペプチドの例としては、例えばトリプシンのようなアルギニン残基のＣ末端側で切断を行う酵素を用いた糖タンパク質の消化物が挙げられる。
アルギニン残基がＣ末端以外の配列中に存在する場合、糖鎖結合部位よりＣ末端側の内部配列中、糖鎖結合部位よりＮ末端側の内部配列中、及びＮ末端のいずれであってもよい。Ｃ末端以外の配列中にアルギニン残基が存在する場合の糖ペプチドの例としては、アルギニン残基のＣ末端側で切断を行う酵素以外の酵素を用いた糖タンパク質の消化物が挙げられる。
The position in the peptide portion of an amino acid residue having a guanidino group (hereinafter referred to as a representative arginine residue; the same applies to other guanidino group-containing amino acid residues) is not particularly limited, and it is at the C-terminus. It may be in a sequence other than the C-terminal. Examples of glycopeptides in the presence of an arginine residue at the C-terminus include glycoprotein digests using enzymes that cleave at the C-terminus of arginine residues, such as trypsin.
When the arginine residue is present in a sequence other than the C-terminal, it may be any of the internal sequence on the C-terminal side from the sugar chain binding site, the internal sequence on the N-terminal side from the sugar chain binding site, and the N-terminal. Good. An example of a glycopeptide when an arginine residue is present in a sequence other than the C-terminus is a digest of glycoprotein using an enzyme other than the enzyme that cleaves at the C-terminal side of the arginine residue.
また、糖ペプチドは、ＭＳ解析におけるペプチド鎖を含むイオンを容易に認識する観点から、アスパラギン結合型糖ペプチドであることが好ましい。
なお、ペプチド部は、例えば糖タンパク質を消化して得られる程度の鎖長を有するものであることが好ましい。例えば、４〜３０残基程度の鎖長でありうる。
The glycopeptide is preferably an asparagine-linked glycopeptide from the viewpoint of easily recognizing ions containing peptide chains in MS analysis.
In addition, it is preferable that a peptide part has a chain length of the grade obtained by digesting glycoprotein, for example. For example, the chain length may be about 4 to 30 residues.
［２．グアニジノ基を有しない糖ペプチドへの変換］
糖ペプチドは、グアニジノ基を改変するか、又はグアニジノ基を除去することによって、オリジナルのグアニジノ基を有しない糖ペプチドへ変換される。
グアニジノ基を改変する場合、グアニジノ基よりもプロトンアフィニティが低い基へ変換すればよい。グアニジノ基は極めて塩基性が高いため、改変を行えば大抵、塩基性が下がり、プロトンアフィニティが低くなる。
[2. Conversion to glycopeptide without guanidino group]
The glycopeptide is converted to a glycopeptide without the original guanidino group by modifying the guanidino group or removing the guanidino group.
When the guanidino group is modified, it may be converted to a group having a proton affinity lower than that of the guanidino group. Since guanidino groups are extremely basic, modification often results in lower basicity and lower proton affinity.
［２−１．グアニジノ基の改変］
グアニジノ基の改変の一例としては、グアニジノ基をピリミジン環へ変換する態様が挙げられる。
この態様においては、Ｒ１ＣＯＣＲ２Ｒ３ＣＯＲ４で表されるジケトンを改変のための試薬として用いることができる。上記一般式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ、同一又は異なっていてよいＨ又は炭素数１〜８のアルキル基である。Ｒ１及びＲ４が同一であることが好ましく、Ｒ２及びＲ３が同一であることが好ましい。
以下に、ジケトンとしてアセチルアセトンを用いたグアニジノ基改変の一例を示す。以下において、ペプチド鎖部分は模式的に示し、アスパラギン残基、アルギニン残基及びグアニジノ基改変後のアミノ酸残基のみ、それぞれイタリック体のＮ、Ｒ及びＲ’で示す。アスパラギン結合糖鎖も模式的に示す。一方、アルギニン残基Ｒ及びグアニジノ基改変後のアミノ酸残基Ｒ’においては側鎖構造を具体的に表示している（以後においても同様）。
[2-1. Modification of guanidino group]
As an example of modification of the guanidino group, there is an embodiment in which the guanidino group is converted into a pyrimidine ring.
In this embodiment, a diketone represented by R 1 COCR 2 R 3 COR 4 can be used as a reagent for modification. In the formula, R 1, R 2, R 3 and R 4 are each the same or may be different H or alkyl group having 1 to 8 carbon atoms. R 1 and R 4 are preferably the same, and R 2 and R 3 are preferably the same.
An example of guanidino group modification using acetylacetone as a diketone is shown below. In the following, the peptide chain portion is schematically shown, and only asparagine residues, arginine residues, and amino acid residues after modification of the guanidino group are indicated by italicized N, R, and R ′, respectively. An asparagine-linked sugar chain is also schematically shown. On the other hand, the side chain structure is specifically indicated for the arginine residue R and the amino acid residue R ′ after modification of the guanidino group (the same applies hereinafter).
ジケトンは、例えば糖ペプチドの１０〜１００，０００当量用いることができる。反応条件は、用いるジケトンによって当業者が適宜決定することができる。例えば上記一般式でＲがアルキル基であるジケトンの場合、塩基性（例えばｐＨ９以上）条件下、５０〜９５℃で１〜１００時間反応させることができる。また例えば上記一般式でＲ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４がＨであるジケトン（すなわちマロンジアルデヒド）の場合、等価体である１，１，３，３−テトラメトキシプロパンを使用し、強酸性（例えばｐＨ２．０以下）条件下、２０〜５０℃で０．１〜２時間反応させることができる。 The diketone can be used, for example, 10 to 100,000 equivalents of glycopeptide. The reaction conditions can be appropriately determined by those skilled in the art depending on the diketone used. For example, in the case of a diketone in which R is an alkyl group in the above general formula, the reaction can be performed at 50 to 95 ° C. for 1 to 100 hours under basic (for example, pH 9 or more) conditions. For example, in the case of a diketone (ie, malondialdehyde) in which R 1 , R 2 , R 3 and R 4 are H in the above general formula, the equivalent 1,1,3,3-tetramethoxypropane is used, The reaction can be carried out at 20 to 50 ° C. for 0.1 to 2 hours under strongly acidic conditions (for example, pH 2.0 or less).
グアニジノ基の改変の他の一例としては、グアニジノ基を脱イミン化する態様が挙げられる。具体的には、アルギニン残基はシトルリン残基に変換される。この態様においては、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）を用いることができる。以下に、ＰＡＤを用いたグアニジノ基改変の一例を示す。この態様においては、グアニジノ基改変後のアミノ酸残基Ｒ’は、すなわちシトルリン残基である。また、改変後の糖ペプチドにおいては、最もプロトンアフィニティが高くなる部分としてＮ末端アミノ基を具体的に表示している（以後においても同様）。 As another example of the modification of the guanidino group, an embodiment in which the guanidino group is deiminated can be mentioned. Specifically, arginine residues are converted to citrulline residues. In this embodiment, peptidyl arginine deiminase (PAD) can be used. An example of guanidino group modification using PAD is shown below. In this embodiment, the amino acid residue R ′ after modification of the guanidino group is a citrulline residue. In the modified glycopeptide, the N-terminal amino group is specifically indicated as the portion having the highest proton affinity (the same applies hereinafter).
反応条件は、当業者が適宜決定することができる。例えば、カルシウムイオン存在下、且つｐＨ６．５〜８．５の条件下、２０〜７０℃で０．５〜１６時間反応させることができる。
より具体的なプロトコルの例を以下に挙げる。
糖ペプチドを、100mM Tris-HCl(pH 7.6)、10mM CaCl2及び2mM DTTを含む溶液20μLに溶解する。1μLのPeptidyl Arginine Deiminase 4 (PAD4) (human recombinant)溶液(Cayman Chemical Company)を添加し37℃で5時間反応させる。反応後、Zip-Tipを用いて精製を行う。（この後、10mg/mLのMDPNA (Methanediphosphonic acid)を含む5mg/mL DHB溶液と混合し、MALDI-MS解析を行うことができる。）
Reaction conditions can be appropriately determined by those skilled in the art. For example, the reaction can be performed at 20 to 70 ° C. for 0.5 to 16 hours in the presence of calcium ions and under conditions of pH 6.5 to 8.5.
Examples of more specific protocols are given below.
The glycopeptide is dissolved in 20 μL of a solution containing 100 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM CaCl 2 and 2 mM DTT. 1 μL of Peptidyl Arginine Deiminase 4 (PAD4) (human recombinant) solution (Cayman Chemical Company) is added and reacted at 37 ° C. for 5 hours. After the reaction, purification is performed using Zip-Tip. (After this, it can be mixed with a 5 mg / mL DHB solution containing 10 mg / mL MDPNA (Methanediphosphonic acid) and subjected to MALDI-MS analysis.)
［２−２．グアニジノ基の除去］
グアニジノ基の除去は、アルギニン残基の除去によって行われることができる。
アルギニン残基が糖鎖結合部位よりＣ末端側にある場合は、カルボキシペプチダーゼを用いてアルギニン残基を除去することができる。
より具体的には、アルギニン残基がＣ末端にある場合は、当該Ｃ末端のアルギニン残基１残基を除去することができるカルボキシペプチダーゼＢを用いることが好ましい。以下に、カルボキシペプチダーゼＢを用いたグアニジノ基除去の一例を示す。
[2-2. Removal of guanidino group]
Removal of the guanidino group can be performed by removal of an arginine residue.
When the arginine residue is on the C-terminal side from the sugar chain binding site, the arginine residue can be removed using carboxypeptidase.
More specifically, when the arginine residue is at the C-terminal, it is preferable to use carboxypeptidase B that can remove one C-terminal arginine residue. An example of guanidino group removal using carboxypeptidase B is shown below.
アルギニン残基が糖鎖結合部位よりＣ末端側の内部配列中にある場合は、適宜、Ｃ末端から複数のアミノ酸残基を１残基ずつ除去することができるエキソペプチダーゼを用いることができる。このようなエキソペプチダーゼとしては、アルギニン残基を除去できないものを除いて、当業者が適宜選択することができる。例えば、カルボキシペプチダーゼＹなどを用いることができる。この場合、アルギニン残基の除去がなされた時点で反応を完了させてよい。 When the arginine residue is in the internal sequence on the C-terminal side from the sugar chain binding site, an exopeptidase that can remove a plurality of amino acid residues from the C-terminal one by one can be used as appropriate. Such exopeptidases can be appropriately selected by those skilled in the art, except for those that cannot remove arginine residues. For example, carboxypeptidase Y can be used. In this case, the reaction may be completed when the arginine residue is removed.
アルギニン残基が糖鎖結合部位よりＮ末端側にある場合は、アルギニン残基のＣ末端側を切断することができる酵素を当業者が適宜選択することができる。例えば、トリプシン、ＡｒｇＣ及びクロストリパインなどが挙げられる。これによって、アルギニン残基からＮ末端側のペプチド鎖が除去される。以下に、このような酵素を用いたグアニジノ基除去の一例を示す。 When the arginine residue is on the N-terminal side from the sugar chain binding site, those skilled in the art can appropriately select an enzyme capable of cleaving the C-terminal side of the arginine residue. For example, trypsin, ArgC, clostripain, etc. are mentioned. This removes the N-terminal peptide chain from the arginine residue. An example of guanidino group removal using such an enzyme is shown below.
グアニジノ基の除去における反応条件は、用いる酵素の種類に応じて当業者が容易に選択することができる。
より具体的なプロトコルの例を以下に挙げる。
糖ペプチド1nmolを、25μLの100mM NaHCO3溶液に溶解する。10pmolのTrypsin溶液を添加し、37℃で１時間反応させる。反応後、サイズ排除クロマトグラフィを用いて精製を行う。（この後、10mg/mLのMDPNA (Methanediphosphonic acid)を含む5mg/mL DHB溶液と混合し、MALDI-MS解析を行うことができる。）
The reaction conditions for removing the guanidino group can be easily selected by those skilled in the art depending on the type of enzyme used.
Examples of more specific protocols are given below.
1 nmol of glycopeptide is dissolved in 25 μL of 100 mM NaHCO 3 solution. Add 10 pmol Trypsin solution and react at 37 ° C. for 1 hour. After the reaction, purification is performed using size exclusion chromatography. (After this, it can be mixed with a 5 mg / mL DHB solution containing 10 mg / mL MDPNA (Methanediphosphonic acid) and subjected to MALDI-MS analysis.)
［３．質量分析］
上記の方法によって得られたグアニジノ基を有さない糖ペプチドは、質量分析工程に供される。質量分析工程においては、糖鎖開裂由来のフラグメントイオンと、ペプチド鎖開裂由来のフラグメントイオンとを得る。
［３−１．イオン化法］
質量分析におけるイオン化法としては、具体的には、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（Matrix Assisted Laser Desorption Ionization; MALDI）法及びエレクトロスプレーイオン化（Electrospray ionization; ESI）法が挙げられる。
[3. Mass spectrometry]
The glycopeptide having no guanidino group obtained by the above method is subjected to a mass spectrometry step. In the mass spectrometry step, a fragment ion derived from sugar chain cleavage and a fragment ion derived from peptide chain cleavage are obtained.
[3-1. Ionization method]
Specific examples of ionization methods in mass spectrometry include Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) and Electrospray ionization (ESI) methods.
［３−２．開裂法］
質量分析における開裂法としては、具体的にはポストソース型である。イオン化法に応じて当業者によって適宜選択されるが、より具体的には、ポストソース分解（Post Source Decay; PSD）、衝突誘起解離（Collision Induced Dissociation; CID）、赤外多光子解離（infraredmultiphoton dissociation；IRMPD）、及び光誘起解離（photo‐induced
dissociation；PID）によるものが挙げられる。本発明においては、糖ペプチド分子のグアニジノ基を改変又は除去することにより、PSD、CID、IRMPD、及びPIDなどによる開裂において生じる開裂部位の優先傾向を減少させることが可能であるため、これらの開裂法が有用である。
[3-2. Cleavage method]
Specifically, the cleavage method in mass spectrometry is a post-source type. Depending on the ionization method, it is appropriately selected by those skilled in the art. More specifically, Post Source Decay (PSD), Collision Induced Dissociation (CID), and infrared multiphoton dissociation (Infrared multiphoton dissociation) ; IRMPD) and photo-induced dissociation
dissociation (PID). In the present invention, by modifying or removing the guanidino group of the glycopeptide molecule, it is possible to reduce the preferential tendency of the cleavage site generated by cleavage by PSD, CID, IRMPD, PID, etc. The method is useful.
CID、IRMPD及びPIDを実施可能な質量分析装置としては、衝突室、又は、衝突室の機能を持つ四重極もしくはイオントラップを有する質量分析装置が挙げられる。具体的には、イオントラップ型質量分析計、三連四重極型質量分析計、四重極飛行時間型質量分析計、四重極−イオントラップ型質量分析計、四重極−フーリエ変換型質量分析計、四重極−オービトラップ型質量分析計が挙げられる。
PSDを実施可能な質量分析装置としては、具体的には飛行時間型質量分析計が挙げられる。グアニジノ基が改変又は除去された糖ペプチドのイオン化の際に弱い塩基性残基にプロトンを供給することでモバイルプロトンの生成率を促進するPSD測定は、特にMALDI-TOF-MSにおいて好ましい。
Examples of a mass spectrometer capable of performing CID, IRMPD, and PID include a collision chamber or a mass spectrometer having a quadrupole or ion trap that functions as a collision chamber. Specifically, ion trap mass spectrometer, triple quadrupole mass spectrometer, quadrupole time-of-flight mass spectrometer, quadrupole-ion trap mass spectrometer, quadrupole-Fourier transform type Examples include a mass spectrometer and a quadrupole-orbitrap mass spectrometer.
Specific examples of mass spectrometers that can perform PSD include time-of-flight mass spectrometers. PSD measurement that promotes the generation rate of mobile protons by supplying protons to weakly basic residues during ionization of glycopeptides with modified or removed guanidino groups is particularly preferred in MALDI-TOF-MS.
［３−３．質量分析適用例］
本発明の質量分析は、とりわけ糖ペプチドの構造解析に適用されることが好ましい。糖ペプチド構造解析においては、アミノ酸配列決定及び／又は糖鎖配列決定が行われる。
一方、本発明の質量分析は、糖ペプチドの構造解析を行わない分析にも適用されることができる。そのような分析としては、Multiple Reaction Monitoring (MRM)による定量等、種々の定量分析が挙げられる。
[3-3. Application example of mass spectrometry]
The mass spectrometry of the present invention is particularly preferably applied to the structural analysis of glycopeptides. In glycopeptide structure analysis, amino acid sequence determination and / or sugar chain sequence determination are performed.
On the other hand, the mass spectrometry of the present invention can also be applied to analysis that does not perform structural analysis of glycopeptides. Such analysis includes various quantitative analyzes such as quantification by multiple reaction monitoring (MRM).
［３−４．糖鎖開裂由来フラグメントイオン］
［３−４−１．糖鎖開裂由来フラグメントイオンの具体例］
糖鎖開裂由来フラグメントイオンは、分子量関連イオンから生じる。糖鎖開裂由来のフラグメントイオンは、分子量関連イオンのペプチド鎖全体を少なくとも含む。ペプチド鎖全体を少なくとも含むプロダクトイオンは、分子量関連イオンのペプチド鎖部分で切断が生じていないプロダクトイオンであり、分子量関連イオンにおけるアミノ酸残基数と同じ数のアミノ酸残基を有する。
[3-4. Fragment ion derived from sugar chain cleavage]
[3-4-1. Specific example of fragment ion derived from sugar chain cleavage]
Fragment ions derived from glycosylation are generated from molecular weight related ions. Fragment ions derived from glycosylation include at least the entire peptide chain of molecular weight related ions. The product ion including at least the entire peptide chain is a product ion that is not cleaved at the peptide chain portion of the molecular weight related ion, and has the same number of amino acid residues as the number of amino acid residues in the molecular weight related ion.
ペプチド鎖全体を少なくとも含むプロダクトイオンの具体例として、まず、糖鎖構造を決定するためのプロダクトイオンが挙げられる。これは、分子量関連イオンにおける構成糖間の結合が切断されることにより生じるものであり、ペプチド鎖に糖が１個、２個、３個、及び／又は（ｎ−１）個（ｎは分子量関連イオンが有する構成糖の数を表す整数）結合した構造を有する糖ペプチドプロダクトイオンである。このような糖ペプチドプロダクトイオンにおいては、糖の環構造が開裂していてもよい。
好ましい態様においては、糖鎖部分から構成糖が１個ずつ脱落し構成糖間のすべての結合が切断されることにより、糖鎖構造決定に必要なすべてのプロダクトイオンを得ることができる。
As a specific example of the product ion including at least the entire peptide chain, first, a product ion for determining a sugar chain structure may be mentioned. This is caused by cleaving the bond between the constituent sugars in the molecular weight related ions, and the peptide chain has 1, 2, 3, and / or (n-1) sugars (n is the molecular weight). An integer representing the number of constituent sugars that the related ion has) a glycopeptide product ion having a linked structure. In such a glycopeptide product ion, the sugar ring structure may be cleaved.
In a preferred embodiment, all the product ions necessary for determining the sugar chain structure can be obtained by dropping the constituent sugars one by one from the sugar chain part and cleaving all the bonds between the constituent sugars.
ペプチド鎖全体を少なくとも含むプロダクトイオンの具体例として、次に、ペプチド鎖に糖が１個結合した構造を有する糖ペプチドプロダクトイオンを識別するための指標となるプロダクトイオンが挙げられる。具体的には、ペプチド鎖に糖（一例を挙げるとＮ−アセチルグルコサミン）が１個結合したプロダクトイオンの低質量側に検出されうる、当該糖が環開裂した構造がペプチド鎖に結合したプロダクトイオン、及び糖鎖を含まないペプチド鎖のみからなるプロダクトイオンである。
ペプチド鎖に糖が１個結合した構造を有する糖ペプチドプロダクトイオンと、その低質量側の２種のプロダクトイオンとを含む合計３種のプロダクトイオンが、トリプレットピークとして、特定の質量差で生じる特徴的なパターンで検出されうる。この特徴的なパターンで検出されたトリプレットピークを指標として、ペプチド鎖に糖が１個結合した構造を有する糖ペプチドプロダクトイオンを識別し、識別された当該プロダクトイオンの相対的な検出強度を考慮して、後述のアミノ酸配列決定のためのプリカーサイオンとして選択されるべきプロダクトイオンを決定することができる。
Specific examples of product ions that include at least the entire peptide chain include product ions that serve as indices for identifying glycopeptide product ions having a structure in which one sugar is bonded to the peptide chain. Specifically, a product ion in which a structure in which the sugar is ring-cleavage bonded to the peptide chain can be detected on the low mass side of the product ion in which one sugar (for example, N-acetylglucosamine) is bonded to the peptide chain. And a product ion consisting only of a peptide chain not containing a sugar chain.
A feature that a total of three types of product ions, including a glycopeptide product ion having a structure in which one sugar is bonded to a peptide chain and two types of product ions on the low mass side, are generated as a triplet peak with a specific mass difference. Can be detected in a typical pattern. Using the triplet peak detected in this characteristic pattern as an index, glycopeptide product ions having a structure in which one sugar is bonded to the peptide chain are identified, and the relative detection intensity of the identified product ions is considered. Thus, a product ion to be selected as a precursor ion for determining an amino acid sequence described later can be determined.
あるいは、当該トリプレットピークを構成するプロダクトイオンのうち、糖が環開裂した構造がペプチド鎖に結合したプロダクトイオンが十分な強度で検出されない場合がある。この場合、ペプチド鎖に糖が１つ結合した糖ペプチドイオンと、ペプチド鎖のみからなるプロダクトイオンとの合計２種のイオンを指標とすることもできる。すなわちこの合計２種のイオンを指標として、ペプチド鎖に糖が１個結合した構造を有する糖ペプチドプロダクトイオンを識別し、識別された当該プロダクトイオンの相対的な検出強度を考慮して、後述のアミノ酸配列決定のためのプリカーサイオンを選択することができる。 Alternatively, among the product ions that constitute the triplet peak, a product ion in which a structure in which a ring of a sugar is cleaved is bonded to a peptide chain may not be detected with sufficient intensity. In this case, a total of two types of ions, that is, a glycopeptide ion in which one sugar is bonded to the peptide chain and a product ion consisting of only the peptide chain can be used as an index. That is, using these two types of ions as indices, glycopeptide product ions having a structure in which one sugar is bonded to the peptide chain are identified, and the relative detection intensity of the identified product ions is taken into account, which will be described later. Precursor ions for amino acid sequencing can be selected.
なお、ペプチド鎖に糖が１個結合したプロダクトイオンが、糖が２個以上結合した他のプロダクトイオンに比べて十分に強い強度で検出されている場合、糖が１個結合したプロダクトイオンをプリカーサイオンとして選択することができる。ペプチド鎖に糖が１個結合したプロダクトイオンよりも、糖が２個以上（２個〜（ｎ−１）個）結合した他のプロダクトイオンの方が十分に強い強度で検出されている場合、糖が２個以上結合した他のプロダクトイオンをプリカーサイオンとして選択することができる。 In addition, when the product ion in which one saccharide is bonded to the peptide chain is detected with a sufficiently strong intensity compared to other product ions in which two or more saccharides are bonded, the product ion in which one saccharide is bonded is used as a precursor. It can be selected as an ion. When other product ions in which two or more sugars (2 to (n-1)) are bonded are detected with a sufficiently strong intensity rather than product ions in which one sugar is bonded to the peptide chain, Other product ions to which two or more sugars are bonded can be selected as precursor ions.
［３−４−２．糖鎖開裂由来フラグメントイオンの検出態様］
ここで、質量分析に供される糖ペプチド分子が、本発明と異なりグアニジノ基を有する場合（グアニジノ基改変非処理の場合）は、分子量関連イオンの糖鎖全体と、酸性アミノ酸残基をＣ末端に有する構造と、を有する糖ペプチドプロダクトイオンが特異的に生じる。
例えば質量分析に供されるペプチド分子が、グアニジノ基を有するアミノ酸残基をＣ末端に有するものである場合、分子量関連イオンの開裂においては、糖鎖の開裂が起こりにくくなる。このため、糖鎖構造解析に有用な糖鎖開裂由来フラグメントイオンを十分に生じさせることができない。
また例えば、質量分析に供されるペプチド分子が、グアニジノ基を有するアミノ酸残基をペプチド鎖内部に有するものである場合、分子量関連イオンの開裂においては、酸性アミノ酸残基のＣ末端でのペプチド鎖開裂が特異的に起こることにより、分子量関連イオンの糖鎖全体と、ペプチド鎖の一部であって酸性アミノ酸残基をＣ末端に有する構造と、を含む糖ペプチドプロダクトイオンが特異的に生じる。このイオンは、糖鎖構造解析のための糖鎖開裂由来フラグメントイオンの質量範囲内に検出されるため、糖鎖開裂由来フラグメントイオンとの区別が困難であり、糖鎖構造解析の障害となる。
[3-4-2. Detection mode of fragment ion derived from sugar chain cleavage]
Here, when the glycopeptide molecule to be subjected to mass spectrometry has a guanidino group unlike the present invention (in the case of guanidino group modification non-treatment), the entire sugar chain of molecular weight related ions and acidic amino acid residues are converted to C-terminal. A glycopeptide product ion having the structure
For example, when a peptide molecule subjected to mass spectrometry has an amino acid residue having a guanidino group at the C-terminus, the cleavage of the sugar chain is less likely to occur in the cleavage of the molecular weight related ion. For this reason, the fragment ion derived from sugar chain cleavage useful for sugar chain structure analysis cannot be sufficiently generated.
In addition, for example, when the peptide molecule subjected to mass spectrometry has an amino acid residue having a guanidino group inside the peptide chain, the peptide chain at the C-terminus of the acidic amino acid residue is used for cleavage of the molecular weight related ion. When the cleavage occurs specifically, a glycopeptide product ion including the entire sugar chain of the molecular weight-related ion and a structure that is a part of the peptide chain and has an acidic amino acid residue at the C-terminus is specifically generated. Since this ion is detected within the mass range of the fragment ion derived from the sugar chain cleavage for the analysis of the sugar chain structure, it is difficult to distinguish from the fragment ion derived from the sugar chain cleavage, which is an obstacle to the analysis of the sugar chain structure.
一方、本発明の方法においては、質量分析に供される糖ペプチド分子はグアニジノ基を有しないように前処理されているため、糖鎖開裂由来のフラグメントイオンの生じ方がグアニジノ基改変非処理の場合と異なる。
例えば質量分析に供されるペプチド分子が、グアニジノ基を有するアミノ酸残基をＣ末端に有するものである場合、分子量関連イオンの開裂においては、糖鎖開裂由来イオンが生じやすくなる。つまり、本発明の方法は、グアニジノ基改変非処理の場合に観察されるような、分子量関連イオンの糖鎖全体と酸性アミノ酸残基をＣ末端に有する構造と、を有する糖ペプチドプロダクトイオンの発生の特異性を失わせるため、糖鎖構造解析に有用な多くのフラグメントイオンを生じさせることができる。
また例えば、質量分析に供されるペプチド分子が、グアニジノ基を有するアミノ酸残基をペプチド鎖内部に有するものである場合、糖鎖構造解析の障害となるイオン（グアニジノ基改変非処理の場合に糖鎖構造解析の障害となる上述のイオンに相当するイオンであり、具体的には、分子量関連イオンの糖鎖全体と、ペプチド鎖の一部であって酸性アミノ酸残基をＣ末端に有する構造と、を含む糖ペプチドプロダクトイオン）は実質的に検出されない。仮に検出されたとしても、その検出強度は、糖鎖構造解析のための糖鎖開裂由来フラグメントイオン（より具体的には、糖鎖構造解析に使用される糖鎖解析由来フラグメントイオンのうち最も検出強度が低いもの）の検出強度の２０％以下、好ましくは１０％以下である。このように、糖鎖構造解析に有用な糖鎖開裂由来フラグメントイオンと糖鎖構造解析の障害となるフラグメントイオンとの好ましくない混在状態を招来しないため、糖鎖開裂由来フラグメントイオンの識別が当業者にとって容易となり、糖鎖構造解析の障害が回避される。以上のように、本発明においては、糖鎖構造解析の障害となるイオンの検出抑制が、糖鎖構造解析のための糖鎖開裂由来フラグメントイオンの検出を特異的なものにしている。
On the other hand, in the method of the present invention, since the glycopeptide molecule to be subjected to mass spectrometry is pretreated so as not to have a guanidino group, the generation of fragment ions derived from sugar chain cleavage is not treated with guanidino group modification. Not the case.
For example, when a peptide molecule subjected to mass spectrometry has an amino acid residue having a guanidino group at the C-terminal, ions derived from sugar chain cleavage are likely to occur in the cleavage of molecular weight related ions. That is, the method of the present invention generates a glycopeptide product ion having the entire sugar chain of a molecular weight-related ion and a structure having an acidic amino acid residue at the C-terminus, as observed in the case of guanidino group modification non-treatment. Therefore, many fragment ions useful for sugar chain structure analysis can be generated.
In addition, for example, when a peptide molecule to be subjected to mass spectrometry has an amino acid residue having a guanidino group inside the peptide chain, an ion that is an obstacle to the analysis of the sugar chain structure (a saccharide in the case of guanidino group modification non-treatment) An ion corresponding to the above-mentioned ion that hinders chain structure analysis, specifically, the entire sugar chain of a molecular weight-related ion, a structure that is part of a peptide chain and has an acidic amino acid residue at the C-terminus , Glycopeptide product ions) are not substantially detected. Even if detected, the detected intensity is the most detected fragment ion derived from sugar chain cleavage for sugar chain structure analysis (more specifically, the fragment ion derived from sugar chain analysis used for sugar chain structure analysis). The intensity of detection is 20% or less, preferably 10% or less. As described above, since the unfavorable mixed state of fragment ions that are useful for sugar chain structure analysis and fragment ions that impede sugar chain structure analysis is not caused, identification of fragment ions that are derived from sugar chain cleavage can be performed by those skilled in the art. For the glycan structure, and the obstacle of the sugar chain structure analysis is avoided. As described above, in the present invention, detection suppression of ions that hinders sugar chain structure analysis makes detection of fragment ions derived from sugar chain cleavage for sugar chain structure analysis specific.
［３−５．ペプチド鎖開裂由来フラグメントイオン］
ペプチド鎖開裂由来フラグメントイオンは、分子量関連イオンの開裂により、上記の糖鎖開裂由来フラグメントイオンと同時に生じることができる。この場合におけるペプチド鎖開裂由来フラグメントイオンは、分子量関連イオンのペプチド鎖の一部と、１個又は２個の糖と、を有する。ペプチド鎖開裂由来フラグメントイオンにおいては、糖の環構造が開裂していてもよい。
上記の場合におけるペプチド鎖開裂由来フラグメントイオンは、糖の数が１個又は２個と少ないため、同時に検出されている糖鎖開裂由来フラグメントイオンの質量域より低質量側に検出される。このため、上記のペプチド鎖開裂由来フラグメントイオンは、糖鎖開裂由来フラグメントイオンとはマススペクトル上で明確に区別されることができる。
[3-5. Fragment ions derived from peptide chain cleavage]
The fragment ion derived from peptide chain cleavage can be generated simultaneously with the above fragment ion derived from sugar chain cleavage by cleavage of molecular weight related ions. The fragment ion derived from peptide chain cleavage in this case has a part of the peptide chain of molecular weight related ions and one or two sugars. In the fragment ion derived from peptide chain cleavage, the sugar ring structure may be cleaved.
Since the peptide chain cleavage-derived fragment ion in the above case has a small number of sugars of 1 or 2, it is detected on the lower mass side than the mass region of the sugar chain cleavage-derived fragment ions detected simultaneously. Therefore, the fragment ion derived from peptide chain cleavage can be clearly distinguished from the fragment ion derived from sugar chain cleavage on a mass spectrum.
ペプチド鎖開裂由来フラグメントイオンは、分子量関連イオンの開裂により生じた糖ペプチドプロダクトイオンをプリカーサイオンとして生じることもできる。より具体的には、ペプチド鎖由来フラグメントイオンは、プリカーサイオンのペプチド鎖の一部と、１個又は２個以上の糖とを有する。ペプチド鎖由来フラグメントイオンにおける糖の数は、プリカーサイオンにおける糖の数と同じであってもよいし、少なくてもよい。また、糖は、環構造が開裂していてもよい。 Peptide chain cleavage-derived fragment ions can also be produced as precursor ions by glycopeptide product ions generated by the cleavage of molecular weight related ions. More specifically, the peptide chain-derived fragment ion has a part of the peptide chain of the precursor ion and one or more sugars. The number of sugars in the peptide chain-derived fragment ion may be the same as or less than the number of sugars in the precursor ion. In addition, the sugar may have a ring structure cleaved.
また、ペプチド鎖開裂由来フラグメントイオンとして、上記の他に、糖を有しないペプチド鎖のみのフラグメントイオンが生じることもある。
以上のペプチド鎖開裂由来フラグメントイオンに基づいて、ペプチド鎖のアミノ酸配列決定を行うことができる。
In addition to the above, as a fragment ion derived from peptide chain cleavage, a fragment ion having only a peptide chain not having a sugar may be generated.
The amino acid sequence of the peptide chain can be determined based on the above fragment ion derived from peptide chain cleavage.
［３−６．構造解析具体例］
図１に、グアニジノ基をピリミジン環に改変した例を挙げ、質量分析において検出されるイオン等と、スペクトルとを模式的に示す。より具体的には、ＭＳ測定において検出される糖ペプチドイオンすなわち分子量関連イオン（Ａ）、ＭＳ測定によって得られたスペクトル（ａ）、分子量関連イオン（Ａ）をプリカーサとして実施したＭＳ／ＭＳ測定における糖ペプチドイオンの開裂（Ｂ）、ＭＳ／ＭＳ測定によって得られたスペクトル（ｂ）、ＭＳ／ＭＳ測定において得られた、ペプチド鎖に糖が１個結合した構造を有する糖ペプチドプロダクトイオンをプリカーサとして実施したＭＳ３測定における糖ペプチドイオンの開裂（Ｃ）、及びＭＳ３測定によって得られたスペクトル（ｃ）を示す。図１においては、ペプチド鎖部分は模式的に示し、アスパラギン残基、グアニジノ基改変後のアミノ酸ン残基及びアスパラギン酸残基のみ、それぞれイタリック体のＮ、Ｒ’及びＤで示す。アスパラギン結合糖鎖も模式的に示す。一方、グアニジノ基改変後のアミノ酸残基Ｒ’においては側鎖の構造を具体的に表示している。さらに、改変後の糖ペプチドにおいては、最もプロトンアフィニティが高くなる部分としてＮ末端アミノ基を具体的に表示している（以後においても同様）。
[3-6. Example of structural analysis]
FIG. 1 gives an example in which a guanidino group is modified to a pyrimidine ring, and schematically shows ions and the like detected in mass spectrometry and a spectrum. More specifically, glycopeptide ions detected in MS measurement, that is, molecular weight related ions (A), spectra obtained by MS measurement (a), and MS / MS measurements performed using molecular weight related ions (A) as precursors. Glycopeptide ion (B), spectrum (b) obtained by MS / MS measurement, and glycopeptide product ion having a structure in which one sugar is bonded to the peptide chain, obtained by MS / MS measurement, as a precursor cleavage of the glycopeptide ions in MS 3 measurements carried out (C), and shows a spectrum (c) obtained by MS 3 measurements. In FIG. 1, the peptide chain portion is schematically shown, and only the asparagine residue, the amino acid residue after modification of the guanidino group, and the aspartic acid residue are indicated by italicized N, R ′, and D, respectively. An asparagine-linked sugar chain is also schematically shown. On the other hand, in the amino acid residue R ′ after modification of the guanidino group, the side chain structure is specifically shown. Furthermore, in the modified glycopeptide, the N-terminal amino group is specifically displayed as the portion having the highest proton affinity (the same applies hereinafter).
この態様においては、グアニジノ基の改変により、改変部におけるプロトンアフィニティがグアニジノ基における場合に比べて低下している。その結果、グアニジノ基であれば当該基に局在して外れにくいプロトンが、改変部から遊離可能な状態のもの（モバイルプロトン）となる。これにより、（Ｂ）に示すように、モバイルプロトンはＭＳ／ＭＳ測定において糖鎖部分に移動することができる。すなわち、開裂に必要なプロトンが糖鎖部分に供給される。その結果、（ｂ）に示すように、ＭＳ／ＭＳ解析では糖鎖開裂由来のフラグメントイオンを得て、糖鎖構造の解析が可能になる。
さらに（Ｃ）に示すように、プロトンはＭＳ３測定においても遊離可能であるため、ペプチド部分に移動することができる。すなわち、開裂に必要なプロトンがペプチド鎖部分に供給される。その結果、（ｃ）に示すように、ＭＳ３解析ではペプチド鎖開裂由来のフラグメントイオンを得て、アミノ酸配列の解析が可能になる。
In this embodiment, modification of the guanidino group lowers the proton affinity at the modified portion as compared to the case of the guanidino group. As a result, in the case of a guanidino group, a proton that is localized at the group and is not easily detached becomes a mobile proton that can be released from the modified portion. Thereby, as shown to (B), a mobile proton can move to a sugar_chain | carbohydrate part in MS / MS measurement. That is, protons necessary for cleavage are supplied to the sugar chain part. As a result, as shown in (b), in the MS / MS analysis, a fragment ion derived from sugar chain cleavage is obtained, and the sugar chain structure can be analyzed.
Furthermore, as shown in (C), protons can be released even in the MS 3 measurement, so that they can move to the peptide moiety. That is, protons necessary for cleavage are supplied to the peptide chain portion. As a result, as shown in (c), in MS 3 analysis, fragment ions derived from peptide chain cleavage are obtained, and the amino acid sequence can be analyzed.
図２に、グアニジノ基を脱イミン化（アルギニン残基をシトルリン残基へ変換）して改変した例を挙げ、図１と同様に、質量分析において検出されるイオン等と、スペクトルとを模式的に示す。
この態様においては、グアニジノ基の改変により、最もプロトンアフィニティの高い部分がＮ末端アミノ基となる。その結果、イオントラップ中では、グアニジノ基であれば当該基に局在して外れにくいプロトンが、Ｎ末端アミノ基から遊離可能な状態のもの（モバイルプロトン）となる。これにより、（Ｂ）に示すように、モバイルプロトンはＭＳ／ＭＳ測定において糖鎖部分に移動することができる。すなわち、開裂に必要なプロトンが糖鎖部分に供給される。その結果、図１における場合と同様、（ｂ）に示すようにＭＳ／ＭＳ測定で糖鎖構造の解析が可能になり、（ｃ）に示すようにＭＳ３測定でペプチド鎖のアミノ酸配列の解析が可能になる。
FIG. 2 shows an example in which a guanidino group is modified by deimination (converting an arginine residue into a citrulline residue). Similar to FIG. 1, ions and the like detected in mass spectrometry and a spectrum are schematically shown. Shown in
In this embodiment, the portion having the highest proton affinity becomes the N-terminal amino group by modification of the guanidino group. As a result, in the ion trap, if it is a guanidino group, a proton that localizes to the group and does not easily come off becomes a mobile proton that can be released from the N-terminal amino group. Thereby, as shown to (B), a mobile proton can move to a sugar_chain | carbohydrate part in MS / MS measurement. That is, protons necessary for cleavage are supplied to the sugar chain part. As a result, the sugar chain structure can be analyzed by MS / MS measurement as shown in (b) as in FIG. 1, and the amino acid sequence of the peptide chain can be analyzed by MS 3 measurement as shown in (c). Is possible.
図３に、グアニジノ基を除去した例を挙げ、図１と同様に、質量分析において検出されるイオン等と、スペクトルとを模式的に示す。
この態様においては、ペプチド鎖中にグアニジノ基が含まれなくなったため、最もプロトンアフィニティの高い部分がＮ末端アミノ基となる。その結果、イオントラップ中では、グアニジノ基であれば当該基に局在して外れにくいプロトンが、Ｎ末端アミノ基から遊離可能な状態のもの（モバイルプロトン）となる。これにより、（Ｂ）に示すように、モバイルプロトンはＭＳ／ＭＳ測定において糖鎖部分に移動することができる。すなわち、開裂に必要なプロトンが糖鎖部分に供給される。その結果、図１における場合と同様、（ｂ）に示すようにＭＳ／ＭＳ測定で糖鎖構造の解析が可能になり、（ｃ）に示すようにＭＳ３測定でペプチド鎖のアミノ酸配列の解析が可能になる。
FIG. 3 shows an example in which the guanidino group is removed, and schematically shows the ions and the like detected in mass spectrometry and the spectrum as in FIG.
In this embodiment, since the guanidino group is not included in the peptide chain, the portion with the highest proton affinity is the N-terminal amino group. As a result, in the ion trap, if it is a guanidino group, a proton that localizes to the group and does not easily come off becomes a mobile proton that can be released from the N-terminal amino group. Thereby, as shown to (B), a mobile proton can move to a sugar_chain | carbohydrate part in MS / MS measurement. That is, protons necessary for cleavage are supplied to the sugar chain part. As a result, the sugar chain structure can be analyzed by MS / MS measurement as shown in (b) as in FIG. 1, and the amino acid sequence of the peptide chain can be analyzed by MS 3 measurement as shown in (c). Is possible.
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
［実施例１］
糖ペプチドAsialofetuin glycopeptides (127-141)（GP4）（配列番号１）1nmolを25μLの0.1mM NaHCO3水溶液に溶解し、そこに57mMのTandem Mass Tag（TMT；サーモサイエンティフィック社）のアセトニトリル溶液を1.5μL添加した。得られた混合溶液に対して超音波洗浄器を用いて５分間超音波処理した後、50℃で30分間反応をさせた（TMT- Asialofetuin glycopeptides(127-141)の生成）。さらに、100mMのNa2CO3溶液を2μL、アセチルアセトンを3μL添加して、70℃で一晩反応させた（改変TMT- Asialofetuin glycopeptides(127-141)の生成）。サイズ排除クロマトグラフィを用いて改変TMT- Asialofetuin glycopeptides(127-141)の精製を行い、遠心エバポレーターを用いて溶媒を除去した後、適宜希釈し、MALDI-QIT TOF MS (AXIMA-Resonance)を用いたＭＳ解析及びＭＳ／ＭＳ解析を行った。
得られたＭＳ／ＭＳスペクトルを図４に示す。図４においては、改変前のTMT- Asialofetuin glycopeptides(127-141)（TMT-GP4）のスペクトル（図４（ａ））と比較して改変TMT- Asialofetuin glycopeptides(127-141)（altered TMT- GP4）のスペクトル（図４（ｂ））を示している。
[Example 1]
Glycopeptide Asialofetuin glycopeptides (127-141) (GP4) (SEQ ID NO: 1) 1 nmol was dissolved in 25 μL of 0.1 mM NaHCO 3 aqueous solution, and 57 mM Tandem Mass Tag (TMT; Thermo Scientific) acetonitrile solution 1.5 μL was added. The obtained mixed solution was subjected to ultrasonic treatment for 5 minutes using an ultrasonic cleaner, and then reacted at 50 ° C. for 30 minutes (production of TMT-Asialofetuin glycopeptides (127-141)). Furthermore, 2 μL of 100 mM Na 2 CO 3 solution and 3 μL of acetylacetone were added and reacted at 70 ° C. overnight (generation of modified TMT-Asialofetuin glycopeptides (127-141)). Purify the modified TMT-Asialofetuin glycopeptides (127-141) using size exclusion chromatography, remove the solvent using a centrifugal evaporator, dilute as appropriate, and MS using MALDI-QIT TOF MS (AXIMA-Resonance) Analysis and MS / MS analysis were performed.
The obtained MS / MS spectrum is shown in FIG. In FIG. 4, the modified TMT-Asialofetuin glycopeptides (127-141) (altered TMT-GP4) is compared with the spectrum of TMT-Asialofetuin glycopeptides (127-141) (TMT-GP4) before modification (FIG. 4 (a)). ) Spectrum (FIG. 4B).
［実施例２］
Asialofetuin glycopeptides (127-141)（GP4）（配列番号２）1nmolを50μLの1M HCl溶液に溶解させた。この溶液に1.2μLのtetraethoxypropaneを添加して、１時間室温で反応させた（改変PG4の生成）。反応後MilliQで100倍に希釈してZip-Tipで脱塩精製を行った後、10mg/mLのMDPNA (Methanediphosphonic acid)を含む5mg/mL DHB溶液と混合し、MALDI-QIT TOF MS (AXIMA-Resonance)を用いてＭＳ解析、ＭＳ／ＭＳ解析及びＭＳ３解析を行った。
得られたＭＳ／ＭＳスペクトルを図５に、ＭＳ３スペクトルを図６に示す。各図においては、改変前のAsialofetuin glycopeptides (127-141)（GP4）のスペクトル（図５（ａ）、６（ａ））と比較して改変Asialofetuin glycopeptides(127-141)（altered GP4）のスペクトル（図５（ｂ）、６（ｂ））を示している。
[Example 2]
1 nmol of Asialofetuin glycopeptides (127-141) (GP4) (SEQ ID NO: 2) was dissolved in 50 μL of 1M HCl solution. 1.2 μL of tetraethoxypropane was added to this solution and reacted at room temperature for 1 hour (generation of modified PG4). After the reaction, it was diluted 100 times with MilliQ, desalted and purified with Zip-Tip, then mixed with 5 mg / mL DHB solution containing 10 mg / mL MDPNA (Methanediphosphonic acid), and MALDI-QIT TOF MS (AXIMA- MS, MS / MS analysis and MS 3 analysis were performed using Resonance).
The obtained MS / MS spectrum is shown in FIG. 5, and the MS 3 spectrum is shown in FIG. In each figure, the spectrum of the modified Asialofetuin glycopeptides (127-141) (altered GP4) compared to the spectrum of the Asialofetuin glycopeptides (127-141) (GP4) before the modification (FIGS. 5 (a) and 6 (a)) (FIGS. 5B and 6B) are shown.
［実施例３］
Transferrin glycopeptides(603-623)（Transferrin GP2）（配列番号３）1nmolを25μLの100mM NaHCO3溶液に溶解した。この溶液に10pmolのCarboxypeptidase Bを添加し、37℃で１時間反応させた（Transferrin glycopeptides(603-622)（Arg除去 Transferrin GP2）（配列番号４）の生成）。サイズ排除クロマトグラフィを用いて精製を行った後、10mg/mLのMDPNA (Methanediphosphonic acid)を含む5mg/mL DHB溶液と混合し、MALDI-TOF MS(AXIMA-Performance)のLinearモードを用いたＭＳ解析と、MALDI-QIT TOF MS (AXIMA-Resonance)を用いたＭＳ／ＭＳ及びＭＳ３解析を行った。
得られたＭＳスペクトルを図７に、ＭＳ／ＭＳスペクトルを図８に、ＭＳ３スペクトルを図９に示す。各図においては、Transferrin glycopeptides(603-623)（Arg除去前のTransferrin GP2）のスペクトル（図７（ａ）、図８（ａ）、図９（ａ））と比較してArg除去後で得られたTransferrin glycopeptides(603-622)（Arg除去Transferrin GP2）のスペクトル（図７（ｂ）、図８（ｂ）、図９（ｂ））を示している。
[Example 3]
1 nmol of Transferrin glycopeptides (603-623) (Transferrin GP2) (SEQ ID NO: 3) was dissolved in 25 μL of 100 mM NaHCO 3 solution. 10 pmol of Carboxypeptidase B was added to this solution, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 1 hour (production of Transferrin glycopeptides (603-622) (Arg-removed Transferrin GP2) (SEQ ID NO: 4)). After purification using size exclusion chromatography, it is mixed with 5 mg / mL DHB solution containing 10 mg / mL MDPNA (Methanediphosphonic acid), and MS analysis using Linear mode of MALDI-TOF MS (AXIMA-Performance) MS / MS and MS 3 analysis using MALDI-QIT TOF MS (AXIMA-Resonance) was performed.
FIG. 7 shows the obtained MS spectrum, FIG. 8 shows the MS / MS spectrum, and FIG. 9 shows the MS 3 spectrum. In each figure, it is obtained after Arg removal compared to the spectrum of Transferrin glycopeptides (603-623) (Transferrin GP2 before Arg removal) (FIG. 7 (a), FIG. 8 (a), FIG. 9 (a)). The spectra of Transferrin glycopeptides (603-622) (Arg-removed Transferrin GP2) obtained (FIG. 7 (b), FIG. 8 (b), FIG. 9 (b)) are shown.
［参考例１］
アルギニン残基を含む（including Arg）Transferrin glycopeptides(603-623)（GP2）と、アルギニン残基を含まない（not including Arg）Transferrin glycopeptides(402-414)（GP1）（配列番号６）とについてのＭＳ／ＭＳスペクトル及びＭＳ３スペクトルを、それぞれ図１０（ａ）と図１０（ｂ）、及び図１１（ａ）と図１１（ｂ）に示す。なお、図１０（ｂ）及び図１１（ｂ）においては、リジン残基Ｋの側鎖の構造を具体的に表示している（以後において同様）。
アルギニン残基を含まないTransferrin glycopeptides(402-414)では、糖鎖開裂由来のフラグメントイオン及びペプチド鎖開裂由来のフラグメントイオンが出現するのに対し、アルギニン残基を含むTransferrin glycopeptides(603-623)ではフラグメントイオンがあまり得られなかった。
[Reference Example 1]
Transferrin glycopeptides (including Arg) containing arginine residues (603-623) (GP2) and not including Argine residues (not including Arg) Transferrin glycopeptides (402-414) (GP1) (SEQ ID NO: 6) The MS / MS spectrum and the MS 3 spectrum are shown in FIGS. 10 (a) and 10 (b), and FIGS. 11 (a) and 11 (b), respectively. In addition, in FIG.10 (b) and FIG.11 (b), the structure of the side chain of the lysine residue K is displayed concretely (hereinafter the same).
In Transferrin glycopeptides (402-414) that do not contain arginine residues, fragment ions derived from glycosylation and peptide chain cleavage appear, whereas in Transferrin glycopeptides (603-623) that contain arginine residues, Less fragment ions were obtained.
［参考例２］
リジン残基の側鎖アミノ基がグアニジノ基によってラベル化された（guanidino group labeled）Transferrin glycopeptides(402-414)（Transferrin GP1）と、ラベル化されていない（not labeled）Transferrin glycopeptides(402-414)（Transferrin GP1）とについてのＭＳ／ＭＳスペクトルをそれぞれ図１２（ａ）及び図１２（ｂ）に示す。なお、図１２（ａ）においては、ラベル化されたリジン残基をＫ’で表し、ラベル化リジン残基Ｋ’におけるラベル化側鎖の構造を具体的に表示している。
図が示すように、ラベル化によってペプチド鎖にグアニジノ基を含ませると、糖鎖開裂由来のフラグメントイオンの生成が抑制された。従って、グアニジノ基の除去や改変と、ＭＳ／ＭＳにおけるフラグメントイオン生成効率の改善との関係性が示された。
[Reference Example 2]
Transferrin glycopeptides (402-414) (Transferrin GP1) in which the side chain amino group of the lysine residue is labeled with a guanidino group (Transferrin GP1), and Transferrin glycopeptides (402-414) in which it is not labeled The MS / MS spectra for (Transferrin GP1) are shown in FIGS. 12 (a) and 12 (b), respectively. In FIG. 12A, the labeled lysine residue is represented by K ′, and the structure of the labeled side chain in the labeled lysine residue K ′ is specifically displayed.
As shown in the figure, when a guanidino group was included in the peptide chain by labeling, the generation of fragment ions derived from sugar chain cleavage was suppressed. Therefore, the relationship between the removal and modification of the guanidino group and the improvement of the fragment ion generation efficiency in MS / MS was shown.
［参考例３］
ＴＭＰＰ（tris(2,4,6-trimethoxyphenyl)phosphoniumacetyl）基で修飾されたシアリルグルコペプチド（配列番号７）のＭＳ／ＭＳスペクトル及びＭＳ３スペクトルを、それぞれ図１３（ａ）及び図１３（ｂ）に示す。
ＴＭＰＰ基は電荷を固定する性質を有する。図が示すように、ＴＭＰＰで電荷を固定すると、糖鎖（GluNAc以外）の開裂及びペプチド鎖の開裂が生じなくなった。従って、糖鎖及びペプチド鎖の開裂にはプロトンが必要であることが示された。
[Reference Example 3]
The MS / MS spectrum and MS 3 spectrum of a sialylglucopeptide (SEQ ID NO: 7) modified with a TMPP (tris (2,4,6-trimethoxyphenyl) phosphoniumacetyl) group are shown in FIG. 13 (a) and FIG. 13 (b), respectively. Shown in
TMPP groups have the property of fixing charge. As shown in the figure, when the charge was fixed with TMPP, cleavage of the sugar chain (other than GluNAc) and cleavage of the peptide chain did not occur. Therefore, it was shown that protons are required for cleavage of sugar chains and peptide chains.
［実施例４］
糖ペプチドFetuin glycopeptides (127-141)（GP4）（配列番号１）0.1nmolを10μLの50mM NaHCO3水溶液に溶解し、そこに57mMのTandem Mass Tag（TMT；サーモサイエンティフィック社）のアセトニトリル溶液を1μL添加した。得られた混合溶液に対して超音波洗浄器を用いて５分間超音波処理した後、50℃で30分間反応をさせた（TMT- Fetuin glycopeptides(127-141)の生成）。得られた反応液をSpeedVac（サーモサイエンティフィック社）を用いて溶液除去し、その後、20μLのPAD反応用溶液（100mM Tris-HCl pH7.6, 50mM NaCl, 10mM CaCl2, 2mM DTT in water）に溶解した。さらに1μLのPAD4溶液（ケイマンケミカルカンパニー）を添加し、37℃で5時間反応させることにより、アルギニン残基Ｒをシトルリン残基Ｒ’（Ｃｉｔ）に変換した（改変TMT- Fetuin glycopeptides(127-141)の生成）。反応終了後、Zip-Tipを用いて脱塩処理を行い、10mg/mLのMDPNA (Methanediphosphonic acid)を含む5mg/mL DHB溶液(50% Acetonitrile/water 0.1% TFA)と混合し、MALDI-QIT TOF MS (AXIMA-Resonance)を用いたＭＳ／ＭＳ解析及びＭＳ３解析を行った。
得られたＭＳ／ＭＳスペクトルを図１４に示す。図１４においては、改変前のTMT- Fetuin glycopeptides(127-141)のＭＳ／ＭＳスペクトル（図１４（ａ））と比較して改変(Altered) TMT- Fetuin glycopeptides(127-141)のＭＳ／ＭＳスペクトル（図１４（ｂ））を示している。同様に、図１５に、改変前のTMT- Fetuin glycopeptides(127-141)のＭＳ３スペクトル（図１５（ａ））と比較した改変(Altered) TMT- Fetuin glycopeptides(127-141)のＭＳ３スペクトル（図１５（ｂ））を示す。
[Example 4]
Glycopeptide Fetuin glycopeptides (127-141) (GP4) (SEQ ID NO: 1) 0.1 nmol was dissolved in 10 μL of 50 mM NaHCO 3 aqueous solution, and 57 mM Tandem Mass Tag (TMT; Thermo Scientific) acetonitrile solution was dissolved therein. 1 μL was added. The obtained mixed solution was subjected to ultrasonic treatment for 5 minutes using an ultrasonic cleaner, and then reacted at 50 ° C. for 30 minutes (production of TMT-Fetuin glycopeptides (127-141)). Remove the resulting reaction solution using SpeedVac (Thermo Scientific), and then 20 μL of PAD reaction solution (100 mM Tris-HCl pH7.6, 50 mM NaCl, 10 mM CaCl 2 , 2 mM DTT in water) Dissolved in. Further, 1 μL of PAD4 solution (Cayman Chemical Company) was added and reacted at 37 ° C. for 5 hours to convert arginine residue R into citrulline residue R ′ (Cit) (modified TMT-Fetuin glycopeptides (127-141 ) Generation). After completion of the reaction, desalting using Zip-Tip, mixing with 5 mg / mL DHB solution (50% Acetonitrile / water 0.1% TFA) containing 10 mg / mL MDPNA (Methanediphosphonic acid), and MALDI-QIT TOF MS / MS analysis and MS 3 analysis using MS (AXIMA-Resonance) were performed.
The obtained MS / MS spectrum is shown in FIG. In FIG. 14, the MS / MS spectrum of the modified TMT-Fetuin glycopeptides (127-141) is compared with the MS / MS spectrum of the TMT-Fetuin glycopeptides (127-141) before the modification (FIG. 14 (a)). The spectrum (FIG. 14B) is shown. Similarly, in FIG. 15, MS 3 spectra of MS 3 spectra of unmodified TMT- Fetuin glycopeptides (127-141) (FIG. 15 (a)) compared to the modified and (Altered) TMT- Fetuin glycopeptides (127-141 ) (FIG. 15B) is shown.
Claims (9)
前記グアニジノ基を有しない糖ペプチドを質量分析に供し、糖鎖開裂由来のフラグメントイオンを得る質量分析工程とを含む、糖ペプチドの質量分析法。 A pretreatment step of obtaining a glycopeptide having no guanidino group by subjecting a glycopeptide having a guanidino group to modification of the guanidino group or removal of the guanidino group;
A mass spectrometry method for glycopeptide, comprising: subjecting a glycopeptide having no guanidino group to mass spectrometry to obtain a fragment ion derived from glycosylation.
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