JP2013198448A - METHOD FOR QUANTIFYING AMINO ACID USING AMINOACYL tRNA SYNTHASE - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、生体、食品等由来の試料において、アミノ酸を測定する方法に関する。より詳細には、アミノ酸をアミノアシルtRNA合成酵素（AARS）と(アミノアシルAMP)-AARS複合体分解試薬存在下で反応させ、その生成物を定量することにより、試料中のアミノ酸の含有量を測定する方法に関するものである。 The present invention relates to a method for measuring amino acids in a sample derived from a living body, food, or the like. More specifically, amino acid content in a sample is measured by reacting an amino acid in the presence of an aminoacyl tRNA synthetase (AARS) and (aminoacylAMP) -AARS complex degradation reagent and quantifying the product. It is about the method.
血中をはじめとする生体試料中のアミノ酸濃度の定量は様々な疾病検出のマーカーとなり、その定量法の開発は医療的見地から強く望まれている。アミノ酸濃度の酵素的定量法は、その迅速さ・簡便さなど機器分析より優れた特長を有し、実際の医療現場で各種疾病検出を行うのに適した手法とされる。 Quantification of amino acid concentration in biological samples including blood serves as a marker for detection of various diseases, and development of a quantification method is strongly desired from a medical point of view. The enzymatic quantification method of amino acid concentration has features superior to instrumental analysis such as quickness and simplicity, and is a method suitable for detecting various diseases in an actual medical field.
アミノアシルtRNA合成酵素（AARS）は、特定の1種類のアミノ酸とATPとtRNAを基質とし、アミノアシルtRNAとAMPとピロリン酸を生成する酵素である。タンパク質構成アミノ酸それぞれに対応したAARSが存在する。以下、各アミノ酸に対応するAARSについて、アミノ酸名と「RS」をつなげて表記する。例えば、アラニンに対応するAARSは「AlaRS」、システインに対応するAARSは「CysRS」と表記する。 Aminoacyl-tRNA synthetase (AARS) is an enzyme that produces aminoacyl-tRNA, AMP, and pyrophosphate using a specific type of amino acid, ATP, and tRNA as substrates. There exists AARS corresponding to each protein constituting amino acid. Hereinafter, the AARS corresponding to each amino acid is described by connecting the amino acid name and “RS”. For example, AARS corresponding to alanine is expressed as “AlaRS”, and AARS corresponding to cysteine is expressed as “CysRS”.
AARSはアミノ酸に対してきわめて高い基質特性を示すことが知られている。この酵素による反応は、以下の2段階反応からなる。 AARS is known to exhibit very high substrate properties for amino acids. This enzyme reaction consists of the following two-step reaction.
なお、上記反応式のように「(アミノアシルAMP)-AARS複合体」が形成されること、またこの複合体は強固であり、tRNA非存在下ではAARSが複合体としてトラップされたままになることなどは、非特許文献1などで知られている。また非特許文献1には、上記複合体にヒドロキシルアミンを添加すると、複合体が分解してアミノ酸ヒドロキサム酸とAMPが生成することも記載されている。 In addition, the “(aminoacylAMP) -AARS complex” is formed as in the above reaction formula, and this complex is strong, and AARS remains trapped as a complex in the absence of tRNA. Is known in Non-Patent Document 1, etc. Non-Patent Document 1 also describes that when hydroxylamine is added to the complex, the complex is decomposed to produce amino acid hydroxamic acid and AMP.
非特許文献2では、微量のtRNAを添加し、試料中アミノ酸のうち一部を上記反応式1および2で反応させるアミノ酸定量法が報告されている。 Non-Patent Document 2 reports an amino acid quantification method in which a small amount of tRNA is added and a part of amino acids in a sample is reacted according to the above reaction formulas 1 and 2.
特許文献1および特許文献2では、tRNAは添加せず、試料中アミノ酸のうち一部を上記反応式1に類似した反応のみで反応させるアミノ酸定量法が報告されている。 Patent Documents 1 and 2 report an amino acid quantification method in which tRNA is not added and a part of amino acids in a sample is reacted only by a reaction similar to the above reaction formula 1.
AARSはアミノ酸に対してきわめて高い基質特性を示すことが知られており、アミノ酸定量用酵素として有望な酵素である。 AARS is known to exhibit extremely high substrate properties for amino acids, and is a promising enzyme for amino acid quantification.
非特許文献2の定量法は、試料とATPとtRNAと放射性ラベルした測定対象アミノ酸を混合した後、AARSと作用させ、生成したアミノアシルtRNAをビーズに吸着させ、その放射線量を測定することで測定対象アミノ酸を定量する手法である。非特許文献2の定量法では、生成物中に取り込まれたラベル済アミノ酸の存在比を算出するため、放射性同位体の使用は不可避である。そのためこの定量法は、放射性同位体の取り扱いが可能な環境でしか用いることができない。またこの定量法では、ビーズによる吸着・分離など、煩雑な工程も必要となってしまう。さらにこの定量法では、反応液にtRNAを最大0.5 mg/mlという高濃度で添加している。しかし、これを測定対象アミノ酸に対応したtRNAのモル濃度に換算すると、30 (μg)÷60 (μl)÷30,000 (g/mol)÷20＝0.8 μMとなる（tRNAの分子量を30,000とし、各アミノ酸に対応する20種のtRNAが等量ずつ含まれていると仮定した場合）。得られる反応生成物のモル濃度は上記濃度以下となるが、放射性同位体を用いずにこのような微量な化合物を定量するのは難しい。よって非特許文献２のようにtRNAを添加する手法では、ごく微量の反応生成物を検出せざるを得ないため、放射性同位体の使用は不可避だといえる。 The quantification method of Non-Patent Document 2 is measured by mixing the sample, ATP, tRNA and the radiolabeled amino acid to be measured, then reacting with AARS, adsorbing the generated aminoacyl tRNA to the beads, and measuring the radiation dose. This method quantifies the target amino acid. In the quantification method of Non-Patent Document 2, the use of radioisotopes is inevitable because the abundance ratio of labeled amino acids incorporated into the product is calculated. Therefore, this quantification method can only be used in an environment in which radioactive isotopes can be handled. In addition, this quantitative method requires complicated steps such as adsorption and separation with beads. Furthermore, in this quantification method, tRNA is added to the reaction solution at a high concentration of 0.5 mg / ml at the maximum. However, when converted to the molar concentration of tRNA corresponding to the amino acid to be measured, 30 (μg) ÷ 60 (μl) ÷ 30,000 (g / mol) ÷ 20 = 0.8 μM (the molecular weight of tRNA is 30,000, and each (Assuming that 20 types of tRNA corresponding to amino acids are contained in equal amounts). Although the molar concentration of the reaction product obtained is below the above concentration, it is difficult to quantify such a trace amount of compound without using a radioisotope. Therefore, in the method of adding tRNA as in Non-Patent Document 2, it is inevitable to use a radioisotope because a very small amount of reaction product must be detected.
特許文献1 および特許文献2 の定量法は、アミノ酸とATPとAARSのみを反応させ（以降、「tRNA非添加条件」とする）、生成物を検出する手法である。本定量法ではtRNAが存在しないため、上記反応式2は進行しえないと考えられる。 The quantification methods of Patent Document 1 and Patent Document 2 are methods for detecting a product by reacting only amino acids, ATP, and AARS (hereinafter referred to as “tRNA non-addition conditions”). In this quantification method, since tRNA does not exist, it is considered that the above reaction formula 2 cannot proceed.
特許文献1 および特許文献2においては、反応式1のような(アミノアシルAMP)-AARS複合体の存在は論じられておらず、AARSは以下の反応式1’を触媒するものとして述べられている。反応式1’のように反応が進み、かつ平衡は完全に右に傾いていると仮定した場合、アミノ酸と同等なモル数のピロリン酸が生成し、ピロリン酸定量によりアミノ酸定量が可能と考えられる。しかしいずれの特許文献でも、反応式1ではなく反応式1’が進むという主張の根拠は示されていない。 In Patent Document 1 and Patent Document 2, the existence of the (aminoacylAMP) -AARS complex as shown in Reaction Scheme 1 is not discussed, and AARS is described as catalyzing the following Reaction Scheme 1 ′. . Assuming that the reaction proceeds as shown in Reaction Formula 1 'and the equilibrium is completely tilted to the right, pyrophosphoric acid with the same number of moles as amino acid is produced, and it is considered that amino acid quantification is possible by pyrophosphoric acid quantification. . However, none of the patent documents shows the grounds for claiming that reaction formula 1 'proceeds instead of reaction formula 1.
本発明者らは、特許文献１および特許文献２と同様に、tRNA非添加条件で測定を行った。しかし、少なくとも発明者らが用いた検出法では、有意なピロリン酸生成を検出することができなかった（実施例5、ヒドロキシルアミン非添加サンプル参照）。有意なピロリン酸生成が見られなかった原因としては、実際に起きている反応は上記反応式1’ではなく、上記反応式1であることが考えられる。反応式1では、アミノ酸が1分子反応すると共に、AARSが複合体形成のために1分子消費される。そのため、少なくとも試料中アミノ酸以上のモル濃度のAARSを系に添加しない限り、試料中アミノ酸量と同等量のピロリン酸を生成させることは原理上不可能である。 In the same manner as in Patent Document 1 and Patent Document 2, the present inventors performed the measurement under the tRNA non-addition condition. However, at least the detection method used by the inventors could not detect significant pyrophosphate production (see Example 5, Sample without hydroxylamine). The reason why no significant pyrophosphate production was observed is that the reaction actually occurring is not the above reaction formula 1 'but the above reaction formula 1. In Reaction Scheme 1, one molecule of amino acid reacts and one molecule of AARS is consumed for complex formation. Therefore, it is impossible in principle to produce pyrophosphoric acid in an amount equivalent to the amount of amino acids in the sample unless at least a molar concentration of AARS equal to or higher than the amino acids in the sample is added to the system.
本発明者らの実施例5において、反応液中のAARS濃度は約9 μM程度であり、アミノ酸濃度に比べて顕著に低い。また特許文献１および特許文献２、非特許文献2においても、測定対象アミノ酸以上のモル濃度のAARSを系に添加したという記述はない。特許文献2の段落[0024]では、0〜100 μMアミノ酸を定量する際のAARS濃度は10 μMであり、アミノ酸濃度以上のAARSは添加していないと言える。よって特許文献1および特許文献2の手法において、仮に反応式1が最大限進行したと仮定しても、試料中アミノ酸のうちごく一部しか反応に用いられ得ず、生成物もまた少量であると考えるのが妥当である。これを否定するようなデータは上記特許文献中に示されていない。 In Example 5 of the present inventors, the AARS concentration in the reaction solution is about 9 μM, which is significantly lower than the amino acid concentration. In Patent Document 1, Patent Document 2, and Non-Patent Document 2, there is no description that AARS having a molar concentration higher than the measurement target amino acid is added to the system. In paragraph [0024] of Patent Document 2, it can be said that the AARS concentration at the time of quantifying 0-100 μM amino acids is 10 μM, and no AARS higher than the amino acid concentration is added. Therefore, in the methods of Patent Document 1 and Patent Document 2, even if it is assumed that Reaction Formula 1 has progressed to the maximum extent, only a small part of the amino acids in the sample can be used for the reaction, and the product is also small. It is reasonable to think. Data which denies this is not shown in the above patent document.
試料中アミノ酸に対してごく少量の生成物しか生じない場合、特許文献1で用いられている蛍光法やセンサ電極などによる高感度検出系が不可欠となり、吸光度法など広く用いられている検出系では検出不可能となる。また高感度検出系を用いた場合でも、感度の低下や測定値のばらつき、バックグラウンド値の上昇など様々な問題点の原因となる。 When only a very small amount of product is generated with respect to amino acids in a sample, a high-sensitivity detection system such as the fluorescence method or sensor electrode used in Patent Document 1 is indispensable. It becomes impossible to detect. Even when a high-sensitivity detection system is used, it causes various problems such as a decrease in sensitivity, variation in measured values, and an increase in background value.
以上のように、AARSを用いた公知のアミノ酸定量法は、放射性同位体を用いた煩雑な工程を必要とすること、また試料中アミノ酸のうちごく一部しか反応しえないことなどの問題点を有しており、広く使用されるには至っていなかった。 As described above, the known amino acid quantification method using AARS requires a complicated process using a radioisotope, and only a part of the amino acids in the sample can react. Have not been widely used.
本発明者らは、tRNA非添加条件下のAARS反応液において有意なピロリン酸生成が見られない一方で、(アミノアシルAMP)-AARS複合体を分解する試薬を添加することで、試料中アミノ酸と同等量のピロリン酸が生成することを見出した。そこで、反応液中のほぼ全量のアミノ酸を上記反応式1と複合体分解反応で反応させることを特徴とする高感度かつ誤差の少ないアミノ酸定量が可能であることを見出し、本発明を完成させた。 While the present inventors did not show significant pyrophosphate formation in the AARS reaction solution under the tRNA non-addition condition, by adding a reagent that decomposes the (aminoacylAMP) -AARS complex, It was found that an equivalent amount of pyrophosphate was produced. Accordingly, the present inventors have found that it is possible to perform highly sensitive and error-free amino acid quantification characterized by reacting almost the entire amount of amino acids in the reaction solution with the above reaction formula 1 and complex decomposition reaction, and completed the present invention. .
本発明は、以下を提供する。
[1] アミノ酸、およびアデノシン三リン酸（ATP）に、そのアミノ酸に対応するアミノアシルtRNA合成酵素（AARS）を、(アミノアシルAMP)-AARS複合体分解試薬存在下で作用させ、反応生成物を得る工程（A）；および
工程（A)の生成物のいずれかを定量する工程（B）
を含み、得られた生成物量に基づいてアミノ酸量を決定する、アミノ酸を定量する方法。
[2] tRNA非存在下で行われる、[1]に記載の方法。
[3] 複合体分解試薬が、アミン類またはカルバニオンである、[1] または[2]に記載の方法。
[4] 複合体分解試薬が、ヒドロキシルアミン、ヒドラジンまたはメチルアミンである、[3]に記載の方法。
[5] 工程（B)における生成物の定量が、吸光度を測定することにより行われる、[1]〜[4]のいずれか一に記載の方法
[6] 工程（B）において定量される生成物が、ピロリン酸であり、ピロリン酸の定量が、ピロリン酸に、ピロリン酸ピルビン酸ジキナーゼ（PPDK）を作用させる工程を経るものである、[1]〜[5]のいずれか一に記載の方法。
[7] 試料中のアミノ酸を定量するために実施され、試料が血液由来である、[1]〜[6]のいずれか一に記載の方法。
[8] 一の試料中の2種類以上のアミノ酸を定量するための[1]〜[7]のいずれか一に記載の方法であって、
定量対象アミノ酸の各々に対応したAARSを準備し、
AARS以外の他の必要成分を含んだ反応試薬を準備し、
反応試薬と試料とを混合し、
混合物を、少なくとも対象アミノ酸の種類の数に分割し、そして
各分割物に異なるAARSを添加する
工程を含む、方法。
[9] AARSが好熱性生物由来であり、工程（A）を、50℃以上で行う、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
The present invention provides the following.
[1] Reaction of amino acid and adenosine triphosphate (ATP) with aminoacyl-tRNA synthetase (AARS) corresponding to the amino acid in the presence of (aminoacylAMP) -AARS complex degradation reagent to obtain a reaction product Quantifying any of the products of step (A); and step (A) (B)
And determining the amount of amino acid based on the amount of product obtained.
[2] The method according to [1], which is performed in the absence of tRNA.
[3] The method according to [1] or [2], wherein the complex decomposition reagent is an amine or a carbanion.
[4] The method according to [3], wherein the complex decomposition reagent is hydroxylamine, hydrazine, or methylamine.
[5] The method according to any one of [1] to [4], wherein the product in step (B) is quantified by measuring absorbance.
[6] The product to be quantified in the step (B) is pyrophosphate, and the quantification of pyrophosphate undergoes a step of allowing pyrophosphate pyruvate dikinase (PPDK) to act on pyrophosphate, [1 ] The method as described in any one of [5].
[7] The method according to any one of [1] to [6], which is performed to quantify amino acids in a sample, and the sample is derived from blood.
[8] The method according to any one of [1] to [7], for quantifying two or more amino acids in one sample,
Prepare AARS corresponding to each amino acid to be quantified,
Prepare a reaction reagent containing other necessary components other than AARS,
Mix the reaction reagent and sample,
Dividing the mixture into at least the number of amino acid types of interest and adding a different AARS to each fraction.
[9] The method according to any one of claims 1 to 8, wherein AARS is derived from a thermophilic organism and step (A) is performed at 50 ° C or higher.
本発明は、非特許文献2に記載の定量法と比較して以下のように優れた点を有する。
・放射性同位体およびその検出機器を用いないため、一般的な設備・環境で利用可能である
・酵素反応後のビーズによる吸着・分離などの煩雑な工程が必要なく、反応液と試料を混合後はそのまま測定可能である
・非特許文献２に記載の定量法では、ビーズによる吸着以降の工程を除いても2時間を要するのに対し、本発明は10分程度で測定可能である
The present invention has the following excellent points as compared with the quantitative method described in Non-Patent Document 2.
・ Because no radioisotope and its detection equipment are used, it can be used in general facilities and environments. ・ After mixing reaction solution and sample without complicated steps such as adsorption / separation by beads after enzyme reaction Can be measured as it is. The quantitative method described in Non-Patent Document 2 requires 2 hours even if the steps after adsorption with beads are excluded, whereas the present invention can measure in about 10 minutes.
本発明は、特許文献１および特許文献２に記載の定量法と比較して以下のように優れた点を有する。
・試料中アミノ酸と同等量の生成物が得られるため、高感度・高精度な定量が可能である
・蛍光試薬やセンサ電極を用いなくとも、通常の吸光度測定で検出が可能である
・特許文献１の段落0075では40分、特許文献２の段落0024では55分を測定に要するのに対し、本発明は10分程度で測定可能である。
The present invention has the following excellent points as compared with the quantitative methods described in Patent Document 1 and Patent Document 2.
・ Since the product is obtained in the same amount as the amino acid in the sample, high-sensitivity and high-accuracy quantification is possible. ・ Detection can be performed by ordinary absorbance measurement without using fluorescent reagents or sensor electrodes. In the first paragraph 0075, 40 minutes are required for the measurement, and in the second paragraph 0024 of Patent Document 2, 55 minutes are required for the measurement.
本発明のアミノ酸定量法は、アミノ酸、およびアデノシン三リン酸（ATP）に、そのアミノ酸に対応するアミノアシルtRNA合成酵素（AARS）を、(アミノアシルAMP)-AARS複合体分解試薬存在下で作用させ、反応生成物を得る工程（A）；および工程（A)の生成物のいずれかを定量する工程（B）を含み、得られた生成物量に基づいてアミノ酸量を決定する、アミノ酸を定量する方法である。 In the amino acid quantification method of the present invention, an aminoacyl tRNA synthetase (AARS) corresponding to an amino acid and adenosine triphosphate (ATP) is allowed to act in the presence of a (aminoacylAMP) -AARS complex degradation reagent, A method for quantifying an amino acid, comprising the step (A) of obtaining a reaction product; and the step (B) for quantifying any of the products of the step (A), wherein the amino acid amount is determined based on the obtained product amount It is.
本発明により、定量することができるアミノ酸は、対応するAARSが存在するものである。AARSが入手可能であれば、いずれのアミノ酸であっても本発明で定量することができる。例えば、タンパク質を構成する20種類のアミノ酸、すなわち、L-アラニン、L-システイン、L-アスパラギン酸、L-グルタミン酸、L-フェニルアラニン、グリシン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-リジン、L-ロイシン、L-メチオニン、L-アスパラギン、L-プロリン、L-グルタミン、L-アルギニン、L-セリン、L-スレオニン、L-バリン、L-トリプトファン、L-チロシンは、本発明により定量できるアミノ酸である。本発明においては、アミノ酸に関し、「L-」を省略して記載することがあるが、当業者であれば、AARSとの関係を参酌し、そのアミノ酸がL体に限られるか否かを適宜判断することができる。また、本発明においては、通常の表記法に従って、アミノ酸を3文字で表記することがある。 The amino acids that can be quantified according to the present invention are those in which the corresponding AARS is present. If AARS is available, any amino acid can be quantified in the present invention. For example, the 20 amino acids that make up proteins, namely L-alanine, L-cysteine, L-aspartic acid, L-glutamic acid, L-phenylalanine, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-lysine, L- Leucine, L-methionine, L-asparagine, L-proline, L-glutamine, L-arginine, L-serine, L-threonine, L-valine, L-tryptophan, and L-tyrosine are amino acids that can be quantified according to the present invention. is there. In the present invention, the amino acid may be described by omitting “L-”, but those skilled in the art can appropriately determine whether or not the amino acid is limited to the L form in consideration of the relationship with AARS. Judgment can be made. In the present invention, amino acids may be represented by 3 letters in accordance with a normal notation.
〔工程A〕
本発明の工程（A）では、アミノ酸、およびアデノシン三リン酸（ATP）に、そのアミノ酸に対応するアミノアシルtRNA合成酵素（AARS）を、(アミノアシルAMP)-AARS複合体分解試薬存在下で作用させ、反応生成物を得る。
[Process A]
In the step (A) of the present invention, an aminoacyl tRNA synthetase (AARS) corresponding to an amino acid and adenosine triphosphate (ATP) is allowed to act in the presence of a (aminoacylAMP) -AARS complex degradation reagent. To obtain a reaction product.
本発明においては、測定対象となるアミノ酸に対応したAARSを用いる。必要なAARSは、市販されていればそれを用いることができ、また当業者であれば、入手可能な適切な資源を利用して、遺伝子実験技術等を用いて適宜調製することができる。AARSの遺伝子実験技術による調製は、タンパク質の調製に関する当業者によく知られた一般的な手法を適用することができ、また本明細書の実施例に記載した手順、条件を参考に、調製することができる。 In the present invention, AARS corresponding to the amino acid to be measured is used. Necessary AARS can be used as long as it is commercially available, and those skilled in the art can appropriately prepare it using genetic experimental techniques and the like using appropriate available resources. For the preparation of AARS using genetic experimental techniques, general techniques well known to those skilled in the art regarding protein preparation can be applied, and the preparation is performed with reference to the procedures and conditions described in the examples of this specification. be able to.
なお、AARSのうち大腸菌由来GlnRS, GluRS, ArgRSに関しては、tRNAと結合し、活性化されないと上記反応式1が進行しない場合があることが知られている。これらのAARSを用いる際には、工程(A)において、tRNAを添加すればよい。なおtRNAは、測定対象アミノ酸と同等に高いモル濃度にする必要はなく、AARSと同等に低いモル濃度添加すれば十分である。tRNA の調製のための方法は、当業者にはよく知られている（例えば、『基礎生化学実験法第4巻 核酸・遺伝子実験』日本生化学会編に記載の方法、等）。 In addition, it is known that Eln coli-derived GlnRS, GluRS, and ArgRS among AARSs may not proceed with the above reaction formula 1 unless they bind to tRNA and are activated. When using these AARSs, tRNA may be added in step (A). Note that tRNA does not need to have a molar concentration as high as that of the amino acid to be measured, and it is sufficient to add a molar concentration as low as that of AARS. Methods for the preparation of tRNA are well known to those skilled in the art (for example, the method described in “Basic Biochemical Experimental Method Vol. 4 Nucleic Acid / Gene Experiment” edited by the Japanese Biochemical Society).
tRNAを用いる場合、定量しようとする対象アミノ酸に対応したtRNA以外の異種のtRNA、mRNA、rRNAの混入は特に悪影響を与えないと考えられるので、全RNA抽出液を用いることが、上記3種いずれのAARSを用いる場合においても、有用であろう。 When tRNA is used, it is considered that contamination with heterologous tRNA, mRNA, rRNA other than tRNA corresponding to the target amino acid to be quantified does not have an adverse effect. Even when using AARS, it will be useful.
本発明で「AARS」というときは、特に記載した場合を除き、特定の種より生産されるものに限られない。定量しようとする対象アミノ酸に特異的または選択的に作用することができ、(アミノアシルAMP)-AARS複合体を形成しうるものであればよい。AARSに関し、「対応するアミノ酸」というときは、そのAARSが特異的または選択的に作用するアミノ酸を指す。 In the present invention, “AARS” is not limited to those produced from a specific species, unless otherwise specified. Any substance that can act specifically or selectively on the target amino acid to be quantified and can form an (aminoacylAMP) -AARS complex may be used. With respect to AARS, “corresponding amino acid” refers to an amino acid on which the AARS acts specifically or selectively.
本発明に用いるAARSは、自然界に存在する天然型であってもよく、遺伝子改変を行った改変型であってもよい。また、本発明に用いるAARSは、AARSをコードする遺伝子を大腸菌や他の生物を宿主として発現させて得られた、組み換え酵素であってもよい。 The AARS used in the present invention may be a natural type existing in nature or a modified type obtained by genetic modification. AARS used in the present invention may be a recombinant enzyme obtained by expressing a gene encoding AARS using Escherichia coli or another organism as a host.
本発明に用いることのできるAARSの調製方法は、特に制限されず、化学合成により合成したタンパク質でもよいし、遺伝子組換え技術により作製した組換えタンパク質でもよい。組換えタンパク質を作製する場合には、当該タンパク質をコードする遺伝子をDNAとして取得し、適当な発現系に導入することにより、上記AARSを産生することができる。典型的なAARSの調整方法は、適切な生物種より抽出したゲノムDNAから該当する遺伝子をPCRにて増幅し、pETまたはpUCなどのプラスミドに組み込んだベクターを構築したのち、それによりBL21、JM109などの宿主菌株を形質転換し、培養することである。これら以外の他の公知の方法も、適宜用いることができる。 The method for preparing AARS that can be used in the present invention is not particularly limited, and may be a protein synthesized by chemical synthesis or a recombinant protein produced by a gene recombination technique. When producing a recombinant protein, the AARS can be produced by obtaining a gene encoding the protein as DNA and introducing it into an appropriate expression system. A typical method for adjusting ARS is to amplify the corresponding gene from genomic DNA extracted from an appropriate species by PCR, construct a vector that is incorporated into a plasmid such as pET or pUC, and then use BL21, JM109, etc. Is transformed and cultured. Other known methods other than these can also be used as appropriate.
本発明には、(アミノアシルAMP)-AARS複合体分解試薬を用いる。本発明ではこの試薬のことを単に「複合体分解試薬」ということもある。 In the present invention, an (aminoacylAMP) -AARS complex decomposing reagent is used. In the present invention, this reagent may be simply referred to as “complex decomposing reagent”.
本発明で「、(アミノアシルAMP)-AARS複合体分解試薬」または「複合体分解試薬」というときは、特に記載した場合を除き、 (アミノアシルAMP)-AARS複合体を分解してAARSを遊離型に再生することができるものをいう。複合体分解試薬の例は、アミン類またはカルバニオンであり、より特定された例は、ヒドロキシルアミン、ヒドラジンまたはメチルアミンである。 In the present invention, “(aminoacylAMP) -AARS complex decomposing reagent” or “complex decomposing reagent” is used unless otherwise specified, and the (aminoacylAMP) -AARS complex is decomposed to release AARS in a free form. Anything that can be regenerated. Examples of complex degradation reagents are amines or carbanions, more specific examples are hydroxylamine, hydrazine or methylamine.
本発明に用いられる複合体分解試薬の好適な例の一つは、ヒドロキシルアミン（NH2OH）である。ヒドロキシルアミンは、本発明において下記の反応を進行させる。 One suitable example of the complex decomposition reagent used in the present invention is hydroxylamine (NH 2 OH). Hydroxylamine proceeds the following reaction in the present invention.
上記反応においてヒドロキシルアミンは、アミノアシルAMPのカルボキシル基の炭素に求核反応することにより、(アミノアシルAMP)-AARS複合体の分解を引き起こす。 In the above reaction, hydroxylamine causes degradation of the (aminoacylAMP) -AARS complex by nucleophilic reaction with carbon of the carboxyl group of aminoacylAMP.
本発明においては、ヒドロキシルアミンと同様の反応を起こすことができ、かつ(アミノアシルAMP)-AARS複合体の基質ポケットまでアクセスできる求核試薬であれば、複合体分解試薬として好適に用いることができる。このような例として、ヒドラジン（H2NNH2）およびメチルアミン（CH3NH2）が挙げられる。 In the present invention, any nucleophilic reagent capable of causing the same reaction as hydroxylamine and accessing the substrate pocket of the (aminoacylAMP) -AARS complex can be suitably used as a complex decomposition reagent. . Examples of such include hydrazine (H 2 NNH 2 ) and methylamine (CH 3 NH 2 ).
工程（A）では、他にアデノシン三リン酸（ATP）を用いる。 In step (A), adenosine triphosphate (ATP) is also used.
工程（A）での反応生成物は、例えば、ピロリン酸であり、上述のようにヒドロキシルアミンを用いる場合は、アミノ酸ヒドロキサム酸である。 The reaction product in the step (A) is, for example, pyrophosphoric acid, and when using hydroxylamine as described above, it is an amino acid hydroxamic acid.
〔工程B〕
本発明の工程（B）では、工程（A)の生成物のいずれかを定量する。
工程（A)の生成物として、ピロリン酸を定量する場合、ピロリン酸を定量するための種々の方法が本発明のために適用できる。ピロリン酸測定のための好ましい態様の1つは、工程（A）と同じ系中で実施できる方法である。
[Process B]
In step (B) of the present invention, any of the products of step (A) is quantified.
When pyrophosphate is quantified as the product of step (A), various methods for quantifying pyrophosphate can be applied for the present invention. One of the preferred embodiments for measuring pyrophosphate is a method that can be carried out in the same system as in step (A).
工程（A）と同じ系中で実施できるピロリン酸測定方法の例としては、ピルビン酸ジキナーゼ（PPDK）を用い、ピロリン酸からピルビン酸を生成し、 (1) ピルビン酸を乳酸脱水素酵素（LDH）と反応させる手法が挙げられる（実施例3参照）。または、(2)ピルビン酸をピルビン酸酸化酵素およびペルオキシダーゼと反応させる手法が挙げられる。これらのピロリン酸の定量方法は、無機リン酸やATPの共存に影響を受けず、またAARSの基質であるATPをAMPから再生することができるという特長を有する。なお、PPDK、LDH、ピルビン酸酸化酵素、ペルオキシダーゼは、それぞれ以下に示す反応を触媒する。 As an example of a pyrophosphate measurement method that can be performed in the same system as in step (A), pyruvate dikinase (PPDK) is used to generate pyruvate from pyrophosphate. (1) Pyruvate is converted to lactate dehydrogenase (LDH )) (See Example 3). Alternatively, (2) a method of reacting pyruvate with pyruvate oxidase and peroxidase can be mentioned. These pyrophosphoric acid quantification methods are not affected by the coexistence of inorganic phosphoric acid and ATP, and have the feature that ATP, which is a substrate for AARS, can be regenerated from AMP. PPDK, LDH, pyruvate oxidase, and peroxidase catalyze the following reactions, respectively.
上記以外のピロリン酸定量法としては、ピロリン酸をピロフォスファターゼと反応させて無機リン酸に変換し、無機リン酸を各種手法で定量する方法が挙げられる。無機リン酸定量法としては、例えば、モリブデンブルー法が挙げられる（実施例4参照）。これは、リン酸を酸性条件下でモリブデン酸アンモニウムと還元剤と反応させることにより生成する色素を分光光度的に定量する手法である。なお、ピロフォスファターゼは以下に示す反応を触媒する。 Other pyrophosphoric acid quantification methods include a method in which pyrophosphoric acid is reacted with pyrophosphatase to convert to inorganic phosphoric acid, and inorganic phosphoric acid is quantified by various techniques. An example of the inorganic phosphoric acid quantification method is the molybdenum blue method (see Example 4). This is a technique for spectrophotometrically quantifying a dye produced by reacting phosphoric acid with ammonium molybdate and a reducing agent under acidic conditions. Pyrophosphatase catalyzes the following reaction.
なお、上記以外のピロリン酸定量法としては、ATPスルフリラーゼなどの酵素によってピロリン酸からATPを生成させ、ルシフェラーゼなどを用いてATPを定量する手法が知られている。しかしこのピロリン酸定量法では、AARSの基質として添加してあるATPにより、ピロリン酸が過剰に見積もられてしまうことがあり、またルシフェラーゼなどによってATPが枯渇しAARSの反応が進行しなくなることがある。よって上記方法のようにATP生成に基づくピロリン酸定量法については、本発明のAARSとの共役系に用いる場合は、特別な配慮が必要であろう。なお、ATPスルフリラーゼは以下に示す反応を触媒する。 As other pyrophosphate quantification methods, a method is known in which ATP is produced from pyrophosphate using an enzyme such as ATP sulfurylase, and ATP is quantified using luciferase or the like. However, in this pyrophosphate assay, pyrophosphate may be overestimated by ATP added as a substrate for AARS, and ATP may be depleted by luciferase and the ARS reaction may not proceed. is there. Therefore, when the pyrophosphate quantification method based on ATP generation as in the above method is used in the conjugate system with AARS of the present invention, special consideration will be required. ATP sulfurylase catalyzes the following reaction.
工程(B)で測定可能な工程（A)の反応液生成物としては、 (アミノアシルAMP)-AARS複合体の分解産物が挙げられる。例えば、複合体分解試薬としてヒドロキシルアミンを使用した場合には、分解産物としてアミノ酸ヒドロキサム酸とAMPが生じるが、これらのいずれかを測定してもよい。AMPの定量は、例えば、HPLCを用いることによる。ヒドロキサム酸の定量は、例えば、酸性条件下で塩化鉄と反応させ、540 nmの吸光度を測定することで、分光光度的に実施できる。 Examples of the reaction liquid product in step (A) that can be measured in step (B) include degradation products of (aminoacylAMP) -AARS complex. For example, when hydroxylamine is used as a complex decomposition reagent, amino acid hydroxamic acid and AMP are generated as decomposition products, and any of these may be measured. Quantification of AMP is by using, for example, HPLC. The determination of hydroxamic acid can be carried out spectrophotometrically by, for example, reacting with iron chloride under acidic conditions and measuring the absorbance at 540 nm.
〔反応条件〕
工程（A）において使用するAARSの量は、本発明のピロリン酸の定量が実施できれば特に限定されず、試料に含まれるピロリン酸の存在量、使用する装置、PPDKの純度や種類に応じて適宜決定することができる。使用するAARSの量は、反応を数十分以内に終了させたい場合は、下限は、0. 05 mU/ml以上であることが好ましく、0.1 U/ml以上であることがより好ましく、0.5 mU/ml以上であることがさらに好ましい。反応をより速やかに進行させたい場合は、より多くの量をもちいてもよい。またいずれの場合であっても上限は経済性等の観点から定めてもよく、10 U/ml以下とすることができ、5 U/ml以下であってもよく、1 U/ml以下であってもよい。なお、本発明に関し、反応系における成分の濃度を示すときは、特に記載した場合を除き、その濃度値は、反応系における終濃度としての値である。
[Reaction conditions]
The amount of AARS used in step (A) is not particularly limited as long as the quantification of pyrophosphate of the present invention can be carried out, and is appropriately determined according to the amount of pyrophosphate contained in the sample, the apparatus used, and the purity and type of PPDK. Can be determined. The amount of AARS to be used is preferably 0.05 mU / ml or more, more preferably 0.1 U / ml or more, and 0.5 mU when the reaction is desired to be completed within tens of minutes. More preferably, it is at least / ml. If it is desired to proceed the reaction more rapidly, a larger amount may be used. In either case, the upper limit may be determined from the viewpoint of economy, etc., and may be 10 U / ml or less, may be 5 U / ml or less, and may be 1 U / ml or less. May be. In the present invention, when the concentration of a component in the reaction system is indicated, the concentration value is a value as a final concentration in the reaction system unless otherwise specified.
本発明においては、複合体分解試薬の使用により、AARSが再生される。したがって、AARSの量は、AARSが酵素として機能可能な量であればよく、定量しようとする対象アミノ酸の量未満であってもよい。本発明者らの検討によると、2 μMのTyrRS存在下で200 μM Tyrの定量が可能であった。このことから、μMオーダー以下のAARS、またはアミノ酸に対し1%以下のモル濃度の比較的少ない量のAARSでも、本発明は実施可能である。 In the present invention, AARS is regenerated by using a complex decomposing reagent. Therefore, the amount of AARS is not limited as long as AARS can function as an enzyme, and may be less than the amount of the target amino acid to be quantified. According to the study by the present inventors, it was possible to quantify 200 μM Tyr in the presence of 2 μM TyrRS. Therefore, the present invention can be practiced even with AARS of the order of μM or less, or with a relatively small amount of AARS having a molar concentration of 1% or less with respect to amino acids.
工程（A）においては、複合体分解試薬が使用される。複合体分解試薬としてヒドロキシルアミンを用いる場合（なお、本発明で複合体分解試薬としてヒドラジンを用いるというときは、特に記載した場合を除き、ヒドラジンを塩として用いる場合も含む。他の複合体分解試薬を用いる場合も同じ。）、その量は、反応を数十分以内に終了させたい場合は、下限は、5ｍ Ｍ以上であることが好ましく、50 ｍＭ以上であることがより好ましく、400 ｍＭ以上であることがさらに好ましい。反応時間を要してもよければ、より少ない量で実施することができる。またいずれの場合であっても上限量は、取扱い上の安全性、経済性等の観点から定めてもよく、8000 ｍＭ以下とすることができ、4000 ｍＭ以下とすることができ、2000 ｍＭ以下とすることができる。 In the step (A), a complex decomposing reagent is used. When hydroxylamine is used as a complex-decomposing reagent (in the present invention, when hydrazine is used as a complex-decomposing reagent, hydrazine is used as a salt unless otherwise specified. Other complex-decomposing reagents The amount of the lower limit is preferably 5 mM or more, more preferably 50 mM or more, and 400 mM or more when the reaction is desired to be completed within several tens of minutes. More preferably. If reaction time is required, it can be carried out in a smaller amount. In any case, the upper limit may be determined from the viewpoint of safety in handling, economy, etc., and can be 8000 mM or less, can be 4000 mM or less, and can be 2000 mM or less. It can be.
複合体分解試薬としてヒドラジンまたはメチルアミンを用いる場合、本発明者らの検討によると、それぞれ反応家における終濃度が400 mM、20 mMであれば、アミノ酸が定量できることが確認されている。したがって、これらの複合体分解試薬を用いる場合は、その有効性が確認された濃度の1/100倍以上、より特定すると1/10倍以上の濃度で、好適に実施することができるであろう。なおいずれの場合であっても、上限量は、取扱い上の安全性、経済性等の観点から定めてもよく、8000 ｍＭ以下とすることができ、4000 ｍＭ以下とすることができ、2000 ｍＭ以下とすることができる。 When hydrazine or methylamine is used as the complex decomposition reagent, according to the study by the present inventors, it has been confirmed that amino acids can be quantified if the final concentrations in the reactant are 400 mM and 20 mM, respectively. Therefore, when using these complex-degrading reagents, it would be possible to carry out the present invention preferably at a concentration of 1/100 times or more, more specifically 1/10 or more times the concentration at which the effectiveness was confirmed. . In any case, the upper limit may be determined from the viewpoint of safety in handling, economy, etc., and can be 8000 mM or less, can be 4000 mM or less, and 2000 mM. It can be as follows.
なお、複合体分解試薬として比較的反応性が高いものを選択する場合は、反応系へは、反応直前に混合した方が、悪影響が出ないと考えられる。当業者であれば、このような点にも配慮して、工程（A)を計画することが容易であろう。本発明者らの検討によると、ヒドロキシルアミンを用いた場合、ヒドロキシルアミンを他の成分と混合し、約10分経過した程度では、問題になるような影響は見られなかった。 When selecting a complex-decomposing reagent having a relatively high reactivity, it is considered that there is no adverse effect in the reaction system if it is mixed immediately before the reaction. Those skilled in the art will be able to plan the process (A) in consideration of these points. According to the study by the present inventors, when hydroxylamine was used, there was no significant effect when about 10 minutes had passed after mixing the hydroxylamine with other components.
工程（A）において使用するATPの量は、当業者であれば、他の成分濃度や反応条件を勘案して、適宜設計することができる。通常、工程（A)においては、測定しようとするアミノ酸の濃度以上の濃度のATPを要するから、ATPの濃度は少なくとも、本発明で測定可能なアミノ酸濃度の下限値である5 μM以上である。 A person skilled in the art can appropriately design the amount of ATP used in the step (A) in consideration of other component concentrations and reaction conditions. Usually, in the step (A), ATP having a concentration equal to or higher than the concentration of the amino acid to be measured is required. Therefore, the concentration of ATP is at least 5 μM which is the lower limit of the amino acid concentration that can be measured in the present invention.
一方で、工程（A)とピロリン酸ピルビン酸ジキナーゼ（PPDK）を用いる工程（B1）とを同じ系内で実施する場合、理論的にはそれより低濃度のATPでも問題ないと考えられる。この観点からは、ATPの濃度の下限は、0.002ｍＭ以上であることが好ましく、0.02ｍＭ以上であることがより好ましく、0.2ｍＭ以上であることがさらに好ましい。 On the other hand, when the step (A) and the step (B1) using pyrophosphate pyruvate dikinase (PPDK) are carried out in the same system, it is theoretically considered that there is no problem even at a lower concentration of ATP. From this viewpoint, the lower limit of the concentration of ATP is preferably 0.002 mM or more, more preferably 0.02 mM or more, and further preferably 0.2 mM or more.
ATPの濃度の上限は、いずれの場合であっても200ｍＭ以下とすることができ、20ｍＭ以下であることが好ましく、2ｍＭ以下であることがより好ましい。 In any case, the upper limit of the concentration of ATP can be 200 mM or less, preferably 20 mM or less, and more preferably 2 mM or less.
工程（B)を、工程（A）と同じ系中でのピロリン酸測定のための工程として実施し、かつ、ピロリン酸ピルビン酸ジキナーゼ（PPDK）によりピロリン酸からピルビン酸を生成させ、 ピルビン酸を乳酸脱水素酵素（LDH）と反応させる場合（「工程（B1）」とする。）、使用するPPDKの量は、本発明のピロリン酸の定量が実施できれば特に限定されず、試料に含まれるピロリン酸の存在量、使用する装置、PPDKの純度や種類に応じて適宜決定することができる。使用するPPDKの量は、下限は、0.001U/ml以上であることが好ましく、0.005U/ml以上であることがより好ましく、0.01U/ml以上であることがさらに好ましい。またいずれの場合であっても上限は、10U/ml以下であることが好ましく、5U/ml以下であることがより好ましく、1U/ml以下であることがさらに好ましい。 Step (B) is carried out as a step for measuring pyrophosphate in the same system as in Step (A), and pyruvate is produced from pyrophosphate using pyrophosphate pyruvate dikinase (PPDK). When reacting with lactate dehydrogenase (LDH) (referred to as “step (B1)”), the amount of PPDK used is not particularly limited as long as the pyrophosphate of the present invention can be quantified, and pyrroline contained in the sample is used. It can be appropriately determined according to the amount of acid present, the apparatus used, and the purity and type of PPDK. The lower limit of the amount of PPDK used is preferably 0.001 U / ml or more, more preferably 0.005 U / ml or more, and further preferably 0.01 U / ml or more. In any case, the upper limit is preferably 10 U / ml or less, more preferably 5 U / ml or less, and further preferably 1 U / ml or less.
工程（B1）は、PEP等の高エネルギーリン酸化合物の存在下で実施される。存在するPEPの量は、下限は0.01ｍＭ以上であることが好ましく、0.025ｍＭ以上であることがより好ましく、0.05ｍＭ以上であることがさらに好ましい。またいずれの場合であっても上限は、20ｍＭ以下であることが好ましく、10ｍＭ以下であることがより好ましく、5ｍＭ以下であることがさらに好ましい。 Step (B1) is performed in the presence of a high-energy phosphate compound such as PEP. The lower limit of the amount of PEP present is preferably 0.01 mM or more, more preferably 0.025 mM or more, and even more preferably 0.05 mM or more. In any case, the upper limit is preferably 20 mM or less, more preferably 10 mM or less, and further preferably 5 mM or less.
工程（B1）は、AMPの存在下で実施される。存在するAMPの量は、下限は、0.01ｍＭ以上であることが好ましく、0.025ｍＭ以上であることがより好ましく、0.05ｍＭ以上であることがさらに好ましい。またいずれの場合であっても上限は、20ｍＭ以下であることが好ましく、10ｍＭ以下であることがより好ましく、5ｍＭ以下であることがさらに好ましい。 Step (B1) is performed in the presence of AMP. The lower limit of the amount of AMP present is preferably 0.01 mM or more, more preferably 0.025 mM or more, and even more preferably 0.05 mM or more. In any case, the upper limit is preferably 20 mM or less, more preferably 10 mM or less, and further preferably 5 mM or less.
工程（B1）は、金属イオンの存在下で実施されることが好ましい。金属イオンは、マグネシウムイオン、コバルトイオン、またはマンガンイオンのうちいずれかであることができるが、マグネシウムイオンであることが好ましい。使用する金属イオンの量は、例えば、マグネシウムイオンの場合、下限は、AMPの濃度に対して0.1当量以上であることが好ましく、0.2当量以上であることがさらに好ましく、0.4当量以上であることがさらに好ましい。またいずれの場合であっても上限は、10当量以下であることが好ましく、5当量以下であることがより好ましく、2.5当量以下であることがさらに好ましい。最も好ましい濃度はリン酸供与体の0.5〜2当量、例えば1当量である。 The step (B1) is preferably performed in the presence of a metal ion. The metal ion can be any of magnesium ion, cobalt ion, or manganese ion, and is preferably magnesium ion. The amount of metal ions to be used is, for example, in the case of magnesium ions, the lower limit is preferably 0.1 equivalents or more, more preferably 0.2 equivalents or more, more preferably 0.4 equivalents or more with respect to the concentration of AMP. Further preferred. In any case, the upper limit is preferably 10 equivalents or less, more preferably 5 equivalents or less, and even more preferably 2.5 equivalents or less. The most preferred concentration is 0.5 to 2 equivalents, such as 1 equivalent, of the phosphate donor.
工程（B1）での乳酸脱水素酵素の量は、ピロリン酸の定量が実施できれば特に限定されず、試料に含まれるピロリン酸の存在量、使用する装置、酵素の純度や種類に応じて適宜決定することができる。使用する酵素の量は、下限は、0.002U/ml以上であることが好ましく、0.005U/ml以上であることが好ましく、0.01U/ml以上であることがさらに好ましい。またいずれの場合であっても上限は、4U/ml以下であることが好ましく、2U/ml以下であることがより好ましく、1U/ml以下であることがさらに好ましい。 The amount of lactate dehydrogenase in the step (B1) is not particularly limited as long as the pyrophosphate can be quantified, and is appropriately determined according to the amount of pyrophosphate contained in the sample, the apparatus used, the purity and type of the enzyme. can do. The lower limit of the amount of enzyme used is preferably 0.002 U / ml or more, preferably 0.005 U / ml or more, and more preferably 0.01 U / ml or more. In any case, the upper limit is preferably 4 U / ml or less, more preferably 2 U / ml or less, and even more preferably 1 U / ml or less.
工程（B1）はまた、NADHの存在下で実施される。NADH濃度は、低過ぎては吸光度の検出が困難であり、また高過ぎては減少量測定値の正確性が低下する等、影響が比較的大きい。存在するNADHの量は、下限は、0.01ｍＭ以上であることが好ましく、0.02ｍＭ以上であることがより好ましく、0.05ｍＭ以上であることがさらに好ましい。いずれの場合であっても上限は、4ｍＭ以下であることが好ましく、2ｍＭ以下であることがより好ましく、1ｍＭ以下であることがさらに好ましい。 Step (B1) is also performed in the presence of NADH. If the NADH concentration is too low, it is difficult to detect the absorbance. If the NADH concentration is too high, the accuracy of the measurement of the amount of decrease decreases. The lower limit of the amount of NADH present is preferably 0.01 mM or more, more preferably 0.02 mM or more, and even more preferably 0.05 mM or more. In any case, the upper limit is preferably 4 mM or less, more preferably 2 mM or less, and further preferably 1 mM or less.
工程（B1）では、340 nmの吸光度を測定することで、反応進行に伴うNADH減少量を計測し、ピルビン酸生成量が算出される。 In step (B1), the absorbance at 340 nm is measured to measure the amount of decrease in NADH accompanying the progress of the reaction, and the amount of pyruvic acid produced is calculated.
工程（B)を、ピロリン酸測定のための工程として実施し、かつピロリン酸をピロフォスファターゼと反応させて無機リン酸に変換し、無機リン酸を各種手法で定量する場合（「工程（B2）」とする。）、使用するピロフォスファターゼの量は、ピロリン酸の定量が実施できれば特に限定されず、試料に含まれるピロリン酸の存在量、使用する装置、ピロフォスファターゼの純度や種類に応じて適宜決定することができる。使用するピロフォスファターゼの量は、下限は、0.151U/ml以上であることが好ましく、1.5U/ml以上であることがより好ましく、15 U/ml以上であることがさらに好ましい。またいずれの場合であっても上限は、6000U/ml以下であることが好ましく、600 U/ml以下であることがより好ましく、60 U/ml以下であることがさらに好ましい。発色試薬としては、水と濃硫酸を混合後、(NH4)6Mo7O24を溶解した液と、水と濃硫酸を混合後、FeSO4を溶解した液を用いることができる（モリブデンブルー法）。発色試薬の例は、本明細書の実施例の項を参考にすることができる。 When step (B) is carried out as a step for measuring pyrophosphate, pyrophosphate is reacted with pyrophosphatase to convert to inorganic phosphate, and inorganic phosphate is quantified by various methods (“step (B2) The amount of pyrophosphatase to be used is not particularly limited as long as pyrophosphate can be quantified, and is appropriately determined depending on the amount of pyrophosphate contained in the sample, the apparatus to be used, and the purity and type of pyrophosphatase. Can be determined. The lower limit of the amount of pyrophosphatase used is preferably 0.151 U / ml or more, more preferably 1.5 U / ml or more, and further preferably 15 U / ml or more. In any case, the upper limit is preferably 6000 U / ml or less, more preferably 600 U / ml or less, and further preferably 60 U / ml or less. As a coloring reagent, a solution in which (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 is dissolved after mixing water and concentrated sulfuric acid, and a solution in which FeSO 4 is dissolved after mixing water and concentrated sulfuric acid can be used (molybdenum blue). Law). For examples of the coloring reagent, reference can be made to the Examples section of this specification.
工程（A）および工程（B）のための反応温度は、使用する酵素の最適温度等を考慮して適宜設定することができる。本明細書の実施例で示したような酵素を用いる場合、各工程は、室温〜37℃で好適に行うことができる。工程（A）およびPPDKを用いてピロリン酸を測定する工程（B）は、同じ系内で同時に進行させる場合も、反応温度は、使用する酵素の最適温度等を考慮して適宜決定されるが、室温〜37℃、例えば30℃で好適に行うことができる。 The reaction temperature for the step (A) and the step (B) can be appropriately set in consideration of the optimum temperature of the enzyme to be used. When using an enzyme as shown in the Examples of the present specification, each step can be suitably performed at room temperature to 37 ° C. In the step (A) and the step (B) for measuring pyrophosphate using PPDK, the reaction temperature is appropriately determined in consideration of the optimum temperature of the enzyme to be used, etc. The reaction can be suitably performed at room temperature to 37 ° C, for example, 30 ° C.
工程（A）および工程（B）のための反応時間は、被検試料に含まれるアミノ酸量や使用するAARSの量にも拠るが、反応は速やかに進行するものであり、40分以内、例えば約20分以内とすることができる。 The reaction time for the step (A) and the step (B) depends on the amount of amino acid contained in the test sample and the amount of AARS used, but the reaction proceeds rapidly and within 40 minutes, for example, It can be within about 20 minutes.
本発明の好ましい態様の一つにおいては、工程（A）のAARSとして、好熱性生物由来のものを用いる。好熱性生物の例は、Thermus属に属する生物である。このような態様においては、反応を比較的高温で実施することができ、高温で行うことにより、酵素使用量が少なくて済むという利点があると考えられる。このような態様における反応温度は、当業者であれば用いるAARSに応じて適宜設計しうるが、例えば50℃以上であり、60℃以上であることが好ましく、65℃以上であることがさらに好ましい。そして、AARSの使用量は、上で述べた量の1/2以下、より特定すると1/5以下、さらに特定すると1/9以下程度でありうる。 In one of the preferable embodiments of the present invention, those derived from thermophilic organisms are used as the AARS in the step (A). An example of a thermophilic organism is an organism belonging to the genus Thermus. In such an embodiment, the reaction can be carried out at a relatively high temperature, and it is considered that there is an advantage that the amount of enzyme used can be reduced by performing the reaction at a high temperature. The reaction temperature in such an embodiment can be appropriately designed according to the AARS used by those skilled in the art. For example, the reaction temperature is 50 ° C. or higher, preferably 60 ° C. or higher, and more preferably 65 ° C. or higher. . The amount of AARS used can be less than or equal to 1/2 of the amount described above, more specifically 1/5 or less, and more specifically 1/9 or less.
工程（A）を比較的高温で実施する場合、好適に組み合わせることができる工程（B）の例は、上で工程（B2）として示したモリブデンブルー法である。 An example of the step (B) that can be suitably combined when the step (A) is carried out at a relatively high temperature is the molybdenum blue method shown above as the step (B2).
〔本発明の用途等〕
本発明により、5μM 〜200μMのアミノ酸の定量が可能である。
本発明の方法は、試料中のアミノ酸を定量するために用いることができる。試料は、測定対象アミノ酸を含む可能性のある試料であれば、如何なるものでもよく、例えば、生体由来物、例えば、血液、血清、血漿、尿、汗に対して適用することができる。また食品、化粧品、医薬品等を対象に適用することもできる。
[Uses of the present invention, etc.]
According to the present invention, amino acids of 5 μM to 200 μM can be quantified.
The method of the present invention can be used to quantify amino acids in a sample. The sample may be any sample as long as it may contain the amino acid to be measured. For example, the sample can be applied to biological substances such as blood, serum, plasma, urine, and sweat. It can also be applied to foods, cosmetics, pharmaceuticals and the like.
試料には2種類以上のアミノ酸が含まれていてもよく、本発明によれば、それぞれのアミノ酸を定量することができる。一つの試料中の2種類以上のアミノ酸を定量する場合、好ましい態様においては、本発明は、定量対象アミノ酸の各々に対応したAARSを準備し、AARS以外の他の必要成分を含んだ反応試薬を準備し、反応試薬と試料とを混合し、混合物を、少なくとも対象アミノ酸の種類の数に分割し、そして各分割物に異なるAARSを添加する
工程を含む。
The sample may contain two or more amino acids, and according to the present invention, each amino acid can be quantified. When quantifying two or more kinds of amino acids in one sample, in a preferred embodiment, the present invention provides AARS corresponding to each of the amino acids to be quantified, and comprises a reaction reagent containing other necessary components other than AARS. Preparing, mixing the reaction reagent and the sample, dividing the mixture into at least the number of amino acid types of interest, and adding a different AARS to each division.
本発明の方法は、多種類のアミノ酸の迅速な同時定量を可能にし得る。 The method of the present invention may allow rapid simultaneous quantification of multiple types of amino acids.
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.
〔1. AARSの発現系構築〕
Thermotoga maritima MSB8株（NBRC 100826）由来CysRS, HisRS, LysRS, ProRS, SerRS, TrpRS, TyrRSを大腸菌で異種発現させるための発現系を以下のようにして構築した。
NBRCから分譲されたT. maritima由来ゲノムDNAを鋳型として用い、データベース上の各種AARS遺伝子配列（配列番号1〜7）を元に設計したプライマー（配列番号8〜21）を用いてPCRを行い、各遺伝子を増幅した。増幅産物をpET-28aに挿入し、各AARS発現用プラスミドとした。なおプライマー設計の際には、TyrRS遺伝子に関してはNdeIサイトとHindIIIIサイトを付加してN末端にHisタグがつくようにし、それ以外の遺伝子に関してはNcoIサイトとNotIサイトを付加してC末端にHisタグがつくようにした。
[1. Construction of AARS expression system]
An expression system for heterologous expression of CytoRS, HisRS, LysRS, ProRS, SerRS, TrpRS, and TyrRS derived from Thermotoga maritima MSB8 strain (NBRC 100826) in E. coli was constructed as follows.
Using T. maritima- derived genomic DNA distributed from NBRC as a template, PCR was performed using primers (SEQ ID NOs: 8 to 21) designed based on various AARS gene sequences (SEQ ID NOs: 1 to 7) on the database, Each gene was amplified. The amplified product was inserted into pET-28a and used as each AARS expression plasmid. When designing primers, add a NdeI site and a HindIIII site for the TyrRS gene so that a His tag is attached to the N-terminus, and for other genes, add an NcoI site and a NotI site and add His to the C-terminus. Added a tag.
Thermus thermophilus HB8株由来IleRS, MetRS, TyrRS（配列番号22〜24）の大腸菌での異種発現のためには、RIKEN BioResource Center、DNA Bankから提供されたThermus thermophilus遺伝子発現プラスミドセットを使用した。 Thermus thermophilus HB8 strain derived IleRS, MetRS, for heterologous expression in E. coli TyrRS (SEQ ID NO: 22-24) used a RIKEN BioResource Center, Thermus thermophilus gene expression plasmid set provided by DNA Bank.
〔2. AARSの発現、精製〕
各発現用プラスミドで大腸菌BL21 (DE3)株を形質転換し、大量発現株として用いた。各発現株を37℃の振盪培養でOD600が0.6〜0.8に達するまで培養し、IPTGを終濃度0.5 mMになるように添加することで発現誘導をかけた。発現誘導後30℃で4時間振盪培養を行い、集菌した。菌体を超音波破砕し、可溶性画分に目的酵素が得られた。
[2. AARS expression and purification]
E. coli BL21 (DE3) strain was transformed with each expression plasmid and used as a large expression strain. Each expression strain was cultured by shaking culture at 37 ° C. until the OD 600 reached 0.6 to 0.8, and expression was induced by adding IPTG to a final concentration of 0.5 mM. After induction of expression, the cells were cultured by shaking at 30 ° C. for 4 hours and collected. The cells were sonicated and the target enzyme was obtained in the soluble fraction.
上記の破砕液上清をGEヘルスケア社製Ni Sepharoseカラムにロードし、20 mM Tris-HCl (pH 7.0), 50 mM imidazole溶液で洗浄後、20 mM Tris-HCl (pH 7.0), 500 mM imidazole溶液で溶出させることによって目的酵素を精製・回収した。上記の酵素液は、必要に応じて、透析や限外濾過によりimidazoleの除去やバッファーの交換、濃縮を行ってから使用した。 The above lysate supernatant was loaded onto a GE Healthcare Ni Sepharose column, washed with 20 mM Tris-HCl (pH 7.0), 50 mM imidazole solution, then 20 mM Tris-HCl (pH 7.0), 500 mM imidazole. The target enzyme was purified and recovered by elution with a solution. The above enzyme solution was used after removing imidazole, exchanging the buffer and concentrating by dialysis or ultrafiltration as necessary.
〔3. PPDKとLDHの共役によるAARS活性測定法〕
測定対象アミノ酸を含む検体と、下記の組成のアミノ酸定量用反応液を混合した。混合液を30℃に静置して、AARS、PPDKおよびLDH反応を進行させ、340 nmの吸光度の減少量を測定した。混合液の液量は200 μlになるようにし、96穴マイクロプレートに分注後、マイクロプレートリーダーで吸光度を測定した。
アミノ酸定量用反応液：20 mM Tris-HCl (pH 7.0), 10 mM MgCl2, 10 mM NH4Cl, 0.3 mM PEP, 0.3 mM NADH, 0.2 mM ATP, 0.2 mM AMP, 70 mU/ml PPDK, 50 U/ml LDH, AARS（濃度は検体との混合後の終濃度）
[3. AARS activity measurement method by conjugation of PPDK and LDH]
A sample containing the amino acid to be measured was mixed with an amino acid quantification reaction solution having the following composition. The mixture was allowed to stand at 30 ° C., AARS, PPDK and LDH reactions were allowed to proceed, and the decrease in absorbance at 340 nm was measured. The liquid volume of the mixture was adjusted to 200 μl, dispensed into a 96-well microplate, and the absorbance was measured with a microplate reader.
Reaction solution for amino acid quantification: 20 mM Tris-HCl (pH 7.0), 10 mM MgCl 2 , 10 mM NH 4 Cl, 0.3 mM PEP, 0.3 mM NADH, 0.2 mM ATP, 0.2 mM AMP, 70 mU / ml PPDK, 50 U / ml LDH, AARS (concentration is final concentration after mixing with sample)
〔4. モリブデンブルー反応によるAARS活性測定法〕
測定対象アミノ酸を含む検体と、下記の組成のアミノ酸定量用反応液を混合した。混合液を30℃に静置して、AARS反応を進行させた。上記混合液33 μlと水66 μl、300 U/ml酵母由来ピロフォスファターゼ溶液1 μlを混合後、室温で20分間静置してピロフォスファターゼ反応を進行させた。その後、下記の組成の発色液A 100 μlと発色液B 30 μlを混合してから5分間室温で静置し、マイクロプレートリーダーで700 nmまたは900 nmの吸光度を測定した。
アミノ酸定量用反応液：20 mM Tris-HCl (pH 7.0), 5 mM MgCl2, 2 mM ATP, AARS（濃度は検体との混合後の終濃度）
発色液A: 水と濃硫酸を3：1で混合後、(NH4)6Mo7O24・4H2Oを0.066 g/ml溶かした溶液
発色液B: 水と濃硫酸を10000：7で混合後、FeSO4・7H2Oを145 mg/ml溶かした溶液
〔5. 70℃でのAARS活性測定法〕
測定対象アミノ酸を含む検体と、下記の組成のアミノ酸定量用反応液を混合した。混合液を70℃に静置して、AARS反応を進行させた。上記混合液600 μlと1 M 2-メルカプトエタノール溶液60 μl、下記の発色液240 μlを混合してから20分間室温で静置し、光路長1 cmのキュベットで580 nmの吸光度を吸光度計で測定した。
アミノ酸定量用反応液：20 mM HEPES-NaOH (pH 8.0), 5 mM MgCl2, 0.5 mM ATP, AARS（濃度は検体との混合後の終濃度）
発色液：水と濃硫酸を6：1で混合後、(NH4)6Mo7O24・4H2Oを0.025 g/ml溶かした溶液
[4. Method for measuring AARS activity by molybdenum blue reaction]
A sample containing the amino acid to be measured was mixed with an amino acid quantification reaction solution having the following composition. The mixture was allowed to stand at 30 ° C. to allow the AARS reaction to proceed. After mixing 33 μl of the above mixed solution, 66 μl of water, and 1 μl of 300 U / ml yeast-derived pyrophosphatase solution, the mixture was allowed to stand at room temperature for 20 minutes to allow the pyrophosphatase reaction to proceed. Thereafter, 100 μl of color developing solution A having the following composition and 30 μl of color developing solution B were mixed and allowed to stand at room temperature for 5 minutes, and the absorbance at 700 nm or 900 nm was measured with a microplate reader.
Reaction solution for amino acid determination: 20 mM Tris-HCl (pH 7.0), 5 mM MgCl 2 , 2 mM ATP, AARS (concentration is the final concentration after mixing with the sample)
Coloring solution A: After mixing water and concentrated sulfuric acid at a ratio of 3: 1, (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 · 4H 2 O dissolved in 0.066 g / ml Color developing solution B: Water and concentrated sulfuric acid at 10000: 7 After mixing, a solution of FeSO 4 · 7H 2 O dissolved in 145 mg / ml [5. Method for measuring AARS activity at 70 ° C]
A sample containing the amino acid to be measured was mixed with an amino acid quantification reaction solution having the following composition. The mixture was allowed to stand at 70 ° C. to allow the AARS reaction to proceed. Mix 600 μl of the above mixture, 60 μl of 1 M 2-mercaptoethanol solution, and 240 μl of the color developing solution below, then let stand for 20 minutes at room temperature, and measure the absorbance at 580 nm with a cuvette with an optical path length of 1 cm. It was measured.
Reaction solution for amino acid determination: 20 mM HEPES-NaOH (pH 8.0), 5 mM MgCl 2 , 0.5 mM ATP, AARS (concentration is the final concentration after mixing with the sample)
Coloring solution: A solution in which 0.025 g / ml of (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 · 4H 2 O was dissolved after mixing water and concentrated sulfuric acid at a ratio of 6: 1.
〔6. ヒドロキシルアミン添加効果の検証〕
〔3〕に示したAARS活性測定法を用い、反応液中に各種濃度のヒドロキシルアミンを添加した際の活性測定を行った。AARSにはThermotoga由来TyrRSを用いた。検体には、混合後の終濃度が0, 25, 50, 100, 150 μMとなるような標準Tyr溶液を用いた。ヒドロキシルアミンは、混合後の終濃度が0, 50, 100, 200, 400, 600, 800, 1000 mMとなるように反応液に添加した。なおこれ以降の実施例で用いたヒドロキシルアミンは、事前に塩酸を添加してpH 7.0に中和したものを指す。TyrRSは終濃度125 μg/ml（10 mU/ml）となるように反応液に添加した。各種濃度のTyrとヒドロキシルアミンを含む検体・反応液を混合した後速やかにマイクロプレートリーダーにセットし、340 nmの吸光度のモニタリングを開始した。各ヒドロキシルアミン濃度条件のサンプルグループ内で、0 mM Tyrサンプルとの吸光度差を算出してプロットしたところ、図1に示すような経時的変化が得られた。
[6. Verification of hydroxylamine addition effect]
Using the AARS activity measurement method shown in [3], activity was measured when various concentrations of hydroxylamine were added to the reaction solution. Thermotoga-derived TyrRS was used for AARS. As a specimen, a standard Tyr solution having a final concentration of 0, 25, 50, 100, 150 μM after mixing was used. Hydroxylamine was added to the reaction solution so that the final concentration after mixing was 0, 50, 100, 200, 400, 600, 800, 1000 mM. In addition, the hydroxylamine used in the following Examples refers to the thing neutralized to pH 7.0 by adding hydrochloric acid beforehand. TyrRS was added to the reaction solution to a final concentration of 125 μg / ml (10 mU / ml). Samples and reaction liquids containing various concentrations of Tyr and hydroxylamine were mixed and immediately set in a microplate reader, and monitoring of absorbance at 340 nm was started. When the difference in absorbance with the 0 mM Tyr sample was calculated and plotted within the sample group under each hydroxylamine concentration condition, changes with time as shown in FIG. 1 were obtained.
ヒドロキシルアミンを50, 100, 200, 400, 600, 800 mM添加した条件下では、Tyr濃度に依存し、AARS・PPDK・LDHの共役反応に由来すると思われる吸光度変化が観察された。この反応は、サンプル混合後5分〜1時間以上続き、その後は一定の吸光度差に落ちついた。ヒドロキシルアミン400 mM以下サンプルでは、ヒドロキシルアミン濃度が高いサンプルほど吸光度差が落ちつくまでの時間が短かった。ヒドロキシルアミン400 mM以上のサンプルでは、吸光度差が落ちつくまでの時間に有意な差はいられなかった。 Under conditions where hydroxylamine was added at 50, 100, 200, 400, 600, and 800 mM, a change in absorbance, which was thought to be caused by the conjugation reaction of AARS, PPDK, and LDH, was observed depending on the Tyr concentration. This reaction lasted from 5 minutes to 1 hour or more after sample mixing, and then settled to a certain absorbance difference. For samples with hydroxylamine of 400 mM or less, the time until the difference in absorbance settled was shorter for samples with a higher hydroxylamine concentration. For samples with hydroxylamine of 400 mM or more, there was no significant difference in the time until the absorbance difference settled.
一方ヒドロキシルアミン非添加条件では、TyrRS・PPDK・LDHの共役反応由来と思われる吸光度変化は見られなかった。この条件下でのサンプル間の吸光度差はわずかであり、マイクロプレートウェルの汚れや実験操作による誤差の範疇に留まる。よってTyrRS反応の進行を上記検出系で観察するためには、ヒドロキシルアミン添加が不可欠であることが示された。 On the other hand, under the conditions where hydroxylamine was not added, there was no change in absorbance that was thought to originate from the conjugation reaction of TyrRS / PPDK / LDH. The difference in absorbance between samples under these conditions is slight, and remains within the range of errors due to contamination of the microplate wells and experimental operations. Therefore, it was shown that the addition of hydroxylamine is indispensable for observing the progress of the TyrRS reaction with the above detection system.
本実施例のヒドロキシルアミン非添加条件は、特許文献１および特許文献２で用いられている反応条件と同じ原理である。似た条件であるにも関わらず、上記特許文献ではAARS反応による有意なピロリン酸生成が検出されたのに対し、本実施例では検出不可能であった。このような結果の相違の原因は不明であるが、一つには、検出法の違いによるものである可能性も考えられる。すなわち、本実施例では吸光度法による検出を行っているのに対し、上記特許文献ではセンサ電極または蛍光法による検出を行っており、検出法の感度の違いによって検出の可否が変わるのかもしれない。いずれにしても本実施例の結果から、少なくとも本実施例のような検出系を用いる場合においては、ヒドロキシルアミン非添加では検出不可能であったAARS反応によるピロリン酸生成が、ヒドロキシルアミン添加によって検出可能になることを明らかにした。 The hydroxylamine non-addition conditions in this example are the same principle as the reaction conditions used in Patent Document 1 and Patent Document 2. In spite of similar conditions, significant pyrophosphate production by AARS reaction was detected in the above-mentioned patent document, but it was not detectable in this example. The cause of such a difference in results is unknown, but one possibility is that it may be due to a difference in detection method. That is, in the present embodiment, detection is performed by the absorbance method, whereas in the above-mentioned patent document, detection is performed by the sensor electrode or the fluorescence method, and the possibility of detection may vary depending on the sensitivity of the detection method. . In any case, from the results of this example, at least in the case of using the detection system as in this example, pyrophosphate generation by AARS reaction, which could not be detected without addition of hydroxylamine, was detected by addition of hydroxylamine. Clarified that it will be possible.
図1で示したデータから、測定20分後の吸光度差を縦軸、Tyr濃度を横軸として、各ヒドロキシルアミン濃度毎に検量線を作成すると、図2のようになる。ヒドロキシルアミン濃度200, 400, 600, 800, 1000 mM条件で、吸光度差とTyr濃度の間の相関係数は、それぞれ0.9952, 0.9998, 0.9998, 0.9988, 0.9995となった。いずれも検量線として高い直線性を有していると言え、本反応系により精度の高いTyr定量が可能であることが示された。 From the data shown in FIG. 1, a calibration curve is created for each hydroxylamine concentration with the absorbance difference 20 minutes after measurement as the vertical axis and the Tyr concentration as the horizontal axis, as shown in FIG. Under the conditions of hydroxylamine concentration of 200, 400, 600, 800, and 1000 mM, the correlation coefficients between the absorbance difference and the Tyr concentration were 0.9952, 0.9998, 0.9998, 0.9988, and 0.9995, respectively. It can be said that both have high linearity as a calibration curve, and it was shown that Tyr quantification with high accuracy is possible by this reaction system.
測定20分後以外の各タイムポイントでも同様に検量線を作成して相関係数を算出し、横軸を時間として相関係数をプロットすると、図3のようになった。いずれのヒドロキシルアミン濃度においても、時間経過と共に相関係数が上昇して安定する傾向が見られた。相関係数が安定するまでに要する時間は、400 mM以下のヒドロキシルアミンサンプルでは高濃度ほど短くなり、それ以上の濃度では有意な差が見られなかった。高濃度のヒドロキシルアミンが悪影響を及ぼさない系であれば、より高濃度のヒドロキシルアミンを添加することで速やかに反応を完了させられることが示された。 A calibration curve was similarly created at each time point other than 20 minutes after measurement to calculate the correlation coefficient, and the correlation coefficient was plotted with the horizontal axis as time, as shown in FIG. At any hydroxylamine concentration, there was a tendency that the correlation coefficient increased with time and stabilized. The time required for the correlation coefficient to stabilize became shorter for higher concentrations of hydroxylamine samples of 400 mM or less, and no significant difference was observed at higher concentrations. It was shown that the reaction can be completed quickly by adding a higher concentration of hydroxylamine if the concentration of hydroxylamine does not adversely affect the system.
〔7. PPDKとLDHの共役によるアミノ酸検量線作成〕
〔3〕に示したAARS活性測定法を用い、検体として標準Cys, Lys, Ser, Tyr溶液を用いたときの検量線を作成した。上記アミノ酸の濃度は、終濃度0〜200 μMになるように調製した。ヒドロキシルアミン濃度は、Tyr検量線サンプルで200 mM、Cys、Lys、Ser検量線サンプルで1000 mMとした。Thermotoga由来CysRS, LysRS, SerRS, TyrRS, Thermus由来TyrRSはそれぞれ終濃度0.2（7 mU/ml）, 0.1（10 mU/ml）, 0.2（8 mU/ml）, 0.4（40 mU/ml）, 0.1 mg/mlとなるように反応液に添加した。
[7. Preparation of amino acid calibration curve by conjugation of PPDK and LDH]
Using the AARS activity measurement method shown in [3], a calibration curve was prepared when standard Cys, Lys, Ser, and Tyr solutions were used as specimens. The amino acid concentration was adjusted to a final concentration of 0 to 200 μM. The hydroxylamine concentration was 200 mM for the Tyr calibration curve sample and 1000 mM for the Cys, Lys, and Ser calibration curve samples. Thermotoga-derived CysRS, LysRS, SerRS, TyrRS, and Thermus-derived TyrRS are final concentrations of 0.2 (7 mU / ml), 0.1 (10 mU / ml), 0.2 (8 mU / ml), 0.4 (40 mU / ml), 0.1 It added to the reaction liquid so that it might become mg / ml.
Thermotoga由来AARSを用いたとき、各アミノ酸について図4〜7のような検量線が得られた。いずれの検量線でも高い直線性を有することが示された。この結果から、本定量法によりTyrだけでなくCys、Lys、Serについても定量可能であることを明らかにした。なおいずれの反応液でも、ヒドロキシルアミン非添加時には有意な吸光度変化は見られなかった。 When Thermotoga-derived AARS was used, a calibration curve as shown in FIGS. 4 to 7 was obtained for each amino acid. All calibration curves were shown to have high linearity. From this result, it was clarified that this assay can quantify not only Tyr but also Cys, Lys, and Ser. In any reaction solution, no significant change in absorbance was observed when hydroxylamine was not added.
上記アミノ酸の代わりにピロリン酸を加えた場合も同様に検量線が作成可能であるが、Lys, Ser, Tyr検量線の傾き（基質mMあたりの吸光度変化量）は、ピロリン酸検量線の傾きの80％以上となった。このことは、検体中のアミノ酸の80%以上が反応に用いられ、同モルのピロリン酸を生成したことを示している。なおCys検量線の傾きは他の検量線に比べてやや低くなっているが、これは検体中のシステインの一部が空気酸化によりシスチンに変わってしまい、システインの実濃度が低下していたためだと考えられる。 A calibration curve can be created in the same way when pyrophosphate is added instead of the above amino acids, but the slope of the Lys, Ser, Tyr calibration curve (absorbance change per substrate mM) is the slope of the pyrophosphate calibration curve. More than 80%. This indicates that 80% or more of the amino acids in the sample were used in the reaction to produce the same mole of pyrophosphate. Note that the slope of the Cys calibration curve is slightly lower than other calibration curves, because part of the cysteine in the sample was changed to cystine by air oxidation, and the actual concentration of cysteine was reduced. it is conceivable that.
またThermus由来TyrRSを用いたとき、図8のような検量線が得られた。Thermotoga由来TyrRSを用いたときと同様に直線性の高い検量線が得られ、Thermotoga以外の生物種由来AARSでも定量が可能であることが示された。 When the Thermus-derived TyrRS was used, a calibration curve as shown in FIG. 8 was obtained. A calibration curve with high linearity was obtained in the same manner as when Thermotoga-derived TyrRS was used, and it was shown that quantification was also possible with AARS derived from species other than Thermotoga.
〔8. モリブデンブルー法によるアミノ酸検量線作成〕
〔4〕に示したAARS活性測定法を用い、検体として標準His, Pro, Trp溶液を用いたときの検量線を作成した。上記アミノ酸の濃度は、終濃度0〜80 μMになるように調製した。HisRS, ProRS, TrpRSはそれぞれ終濃度0.1, 0.2 ,0.1 mg/mlとなるように反応液に添加した。
[8. Preparation of amino acid calibration curve by molybdenum blue method]
Using the AARS activity measurement method shown in [4], a calibration curve was prepared when standard His, Pro, and Trp solutions were used as specimens. The amino acid concentration was adjusted to a final concentration of 0 to 80 μM. HisRS, ProRS, and TrpRS were added to the reaction solution to final concentrations of 0.1, 0.2, and 0.1 mg / ml, respectively.
各アミノ酸について図9〜11のような検量線が得られた。検出限界に近い低濃度のアミノ酸サンプルであったため相関係数は図4〜7の系に比べて劣るが、検量線として使用に耐える直線性を示した。よって、本定量法によりHis, Pro, Trpについても定量可能であること、また〔3〕に示したピロリン酸定量法以外の手法を用いても定量可能であることを明らかにした。なおいずれの反応液でも、ヒドロキシルアミン非添加時には有意な吸光度変化は見られなかった。 Calibration curves as shown in FIGS. 9 to 11 were obtained for each amino acid. The correlation coefficient was inferior to that of the systems shown in FIGS. 4 to 7 because it was a low-concentration amino acid sample close to the detection limit. Therefore, it was clarified that His, Pro, and Trp can also be quantified by this quantification method, and can be quantified by using a method other than the pyrophosphate quantification method shown in [3]. In any reaction solution, no significant change in absorbance was observed when hydroxylamine was not added.
〔9. 70℃インキュベーションによるアミノ酸検量線作成〕
〔5〕に示したAARS活性測定法を用い、検体として標準Ile, Met, Tyr溶液を用いたときの検量線を作成した。AARSには、Thermus由来IleRS, MetRS, TyrRSを用いた。各AARSはそれぞれ終濃度0.01, 0.08, 0.08 mg/mlとなるように反応液に添加した。上記アミノ酸の濃度は、終濃度0〜100 μMになるように調製した。また複合体分解試薬として、ヒドロキシルアミンを終濃度400 mM添加した。
[9. Preparation of amino acid calibration curve by 70 ℃ incubation]
Using the AARS activity measurement method shown in [5], a calibration curve was prepared when standard Ile, Met, Tyr solutions were used as specimens. For AARS, Thermus-derived IleRS, MetRS, and TyrRS were used. Each AARS was added to the reaction solution so as to have final concentrations of 0.01, 0.08, and 0.08 mg / ml, respectively. The amino acid concentration was adjusted to a final concentration of 0 to 100 μM. Further, hydroxylamine was added at a final concentration of 400 mM as a complex decomposition reagent.
各アミノ酸について、図12〜図14のような検量線が得られた。この結果から、本定量法によりIle、Metについても定量可能であることを明らかにした。また同時に、工程Aにおける反応温度は30℃に限られず、70℃などの高温にも設定可能であることを明らかにした。さらに、30℃で反応を行った〔6〕と比較すると、Thermus由来TyrRSについては1オーダー低い酵素濃度で定量可能となった。好熱性生物由来AARSに関しては、70℃など高温下で反応を行うことにより、酵素使用量が少なくて済むという利点があると考えられる。 A calibration curve as shown in FIGS. 12 to 14 was obtained for each amino acid. From this result, it was clarified that Ile and Met can be quantified by this quantification method. At the same time, it was clarified that the reaction temperature in step A is not limited to 30 ° C, but can be set to a high temperature such as 70 ° C. Furthermore, thermus-derived TyrRS can be quantified at an enzyme concentration one order lower than [6], which was reacted at 30 ° C. Regarding AARS derived from thermophilic organisms, it is considered that there is an advantage that the amount of enzyme used can be reduced by carrying out the reaction at a high temperature such as 70 ° C.
〔10. 各AARSの基質特異性〕
Thermotoga由来CysRS, HisRS, LysRS, ProRS, SerRS, TrpRS, TyrRSについて、〔4〕に示したAARS活性測定法を用い、検体として各種アミノ酸の標準溶液のいずれかを用いたときのピロリン酸生成の有無を検証した。各AARSはそれぞれ終濃度0.3（8 mU/ml）, 0.1, 0.2（3 mU/ml）, 0.2, 0.1（1 mU/ml）, 0.1, 0.2（20 mU/ml） mg/mlとなるように反応液に添加した。Tyrは終濃度1 mM、それ以外のアミノ酸は終濃度5 mMとなるように反応液を調製した。ヒドロキシルアミン濃度は、いずれも終濃度1000 mMとなるように添加した。
またThermus由来MetRSとTyrRSについて、〔5〕に示したAARS活性測定法を用い、検体として各種アミノ酸の標準溶液のいずれかを用いたときのピロリン酸生成の有無を検証した。各アミノ酸は終濃度200 μMとなるように反応液を調製した。ヒドロキシルアミンは終濃度400 mMとなるように添加した。
[10. Substrate specificity of each AARS]
For Thermotoga-derived CysRS, HisRS, LysRS, ProRS, SerRS, TrpRS, TyrRS, whether or not pyrophosphate was produced when using any of the standard solutions of various amino acids as a specimen using the AARS activity measurement method shown in [4] Verified. Each AARS has a final concentration of 0.3 (8 mU / ml), 0.1, 0.2 (3 mU / ml), 0.2, 0.1 (1 mU / ml), 0.1, 0.2 (20 mU / ml) mg / ml Added to the reaction. The reaction solution was prepared so that Tyr had a final concentration of 1 mM and other amino acids had a final concentration of 5 mM. The hydroxylamine concentration was added so that the final concentration was 1000 mM.
Thermus-derived MetRS and TyrRS were examined for the presence or absence of pyrophosphate formation using any of the standard solutions of various amino acids as a specimen using the AARS activity measurement method shown in [5]. The reaction solution was prepared so that each amino acid had a final concentration of 200 μM. Hydroxylamine was added to a final concentration of 400 mM.
各AARSとアミノ酸の組み合わせを含む反応液での活性検出の有無を、表1に示す。＋は活性が検出されたこと、−は活性が検出されなかったことを表す。各AARSは、対応する一種類のアミノ酸に対してのみ活性を示した。この結果から、これらのAARSを用いた定量系により各アミノ酸種に対し選択性の高い定量が可能であることを明らかにした。 Table 1 shows the presence or absence of activity detection in a reaction solution containing each AARS and amino acid combination. + Represents that the activity was detected, and − represents that the activity was not detected. Each AARS showed activity only for one corresponding amino acid. From these results, it was clarified that quantification using these AARSs enables quantification with high selectivity for each amino acid species.
〔11. 各種複合体分解試薬の効果〕
〔5〕に示したAARS活性測定法を用い、複合体分解試薬としてヒドラジンまたはメチルアミンを添加したときの検量線を作成した。AARSには、Thermus由来TyrRSを終濃度0.01 mg/mlとなるように反応液に添加した。Tyrは終濃度0〜100 μMになるように調製した。また、ヒドラジンとメチルアミンはそれぞれ終濃度400 mM、20 mMとなるように添加した。
[11. Effects of various complex degradation reagents]
Using the AARS activity measurement method shown in [5], a calibration curve was prepared when hydrazine or methylamine was added as a complex degradation reagent. For AARS, Thermus-derived TyrRS was added to the reaction solution to a final concentration of 0.01 mg / ml. Tyr was prepared to a final concentration of 0 to 100 μM. Further, hydrazine and methylamine were added to final concentrations of 400 mM and 20 mM, respectively.
測定20分後の吸光度差を縦軸、Tyr濃度を横軸として、各複合体分解試薬毎に検量線を作成した。ヒドラジンを用いた場合を図15に、メチルアミンを用いた場合を図16に示した。いずれも検量線として高い直線性を有していると言え、本反応系により精度の高いアミノ酸定量が可能であることが示された。 A calibration curve was prepared for each complex decomposition reagent, with the absorbance difference 20 minutes after measurement as the vertical axis and the Tyr concentration as the horizontal axis. The case of using hydrazine is shown in FIG. 15, and the case of using methylamine is shown in FIG. It can be said that both have high linearity as a calibration curve, and it was shown that this reaction system enables highly accurate amino acid quantification.
アミノ酸分析は食品の品質管理や様々な疾病検出のマーカーとして用いられ、産業上広い分野で需要のある技術と言える。多種類のアミノ酸分析を行うためには、HPLCなどの機器分析を用いるという選択肢しかほぼないのが現状である。しかし機器分析は高価・大規模な分析機器を要し、現場で迅速な測定を行うことは困難である。また、現場での測定ではなく依頼分析を行う場合は、サンプル分析をはじめ保管や輸送のため高額な費用を要することから、その利用はごく限られた範囲に留まっている。 Amino acid analysis is used as a marker for food quality control and detection of various diseases, and can be said to be a technology in demand in a wide range of industrial fields. At present, there is almost no choice but to use instrumental analysis such as HPLC in order to perform various types of amino acid analysis. However, instrumental analysis requires expensive and large-scale analytical instruments, and it is difficult to perform quick measurements on site. In addition, when request analysis is performed instead of on-site measurement, the use of sample analysis, storage, and transportation is expensive, so its use is limited to a limited range.
上記のような機器分析法と異なり、本発明の手法は酵素的定量法であり、高価な専用分析機器を要さない。また、放射性同位体や蛍光法など高感度検出系を必要とする従来の酵素的定量法とも異なり、より幅広い環境で容易に実施可能な定量法と言える。本発明の実施により、多種類のアミノ酸を迅速に測定することが可能である。例えば、AARS活性測定溶液と検体を混合後に分注し、それぞれに異なる種類のAARSを混合することで、多種類のアミノ酸の同時定量を容易に行うことができる。また本手法がマイクロプレートリーダーなどのハイスループットな測定機器で実施可能であることも、本明細書の実施例で示されている。 Unlike the instrumental analysis method as described above, the method of the present invention is an enzymatic quantification method and does not require expensive dedicated analytical instruments. In addition, unlike conventional enzymatic quantification methods that require highly sensitive detection systems such as radioisotopes and fluorescence methods, it can be said to be a quantification method that can be easily performed in a wider range of environments. By carrying out the present invention, it is possible to rapidly measure many kinds of amino acids. For example, by simultaneously dispensing the AARS activity measurement solution and the specimen and mixing them with different types of AARS, simultaneous determination of many types of amino acids can be easily performed. It is also shown in the examples of the present specification that the present technique can be implemented with a high-throughput measuring instrument such as a microplate reader.
配列番号1：Thermotoga由来CysRS
配列番号2：Thermotoga由来HisRS
配列番号3：Thermotoga由来LysRS
配列番号4：Thermotoga由来ProRS
配列番号5：Thermotoga由来SerRS
配列番号6：Thermotoga由来TrpRS
配列番号7：Thermotoga由来TyrRS
配列番号8：プライマー CysRS F
配列番号9：プライマー CysRS R
配列番号10：プライマー HisRS F
配列番号11：プライマー HisRS R
配列番号12：プライマー LysRS F
配列番号13：プライマー LysRS R
配列番号14：プライマー ProRS F
配列番号15：プライマー ProRS R
配列番号16：プライマー SerRS F
配列番号17：プライマー SerRS R
配列番号18：プライマー TrpRS F
配列番号19：プライマー TrpRS R
配列番号20：プライマー TyrRS F
配列番号21：プライマー TyrRS R
配列番号22：Thermus由来IleRS
配列番号23：Thermus由来MetRS
配列番号24：Thermus由来TyrRS
SEQ ID NO: 1: CysRS from Thermotoga
Sequence number 2: Hismoto origin HisRS
SEQ ID NO: 3: LysRS from Thermotoga
SEQ ID NO: 4: Thermotoga-derived ProRS
Sequence number 5: Sermotoga origin SerRS
SEQ ID NO: 6: Thermotoga-derived TrpRS
Sequence number 7: TyrRS derived from Thermotoga
Sequence number 8: Primer CysRS F
Sequence number 9: Primer CysRS R
Sequence number 10: Primer HisRS F
Sequence number 11: Primer HisRS R
Sequence number 12: Primer LysRS F
Sequence number 13: Primer LysRS R
Sequence number 14: Primer ProRS F
Sequence number 15: Primer ProRS R
Sequence number 16: Primer SerRS F
Sequence number 17: Primer SerRS R
Sequence number 18: Primer TrpRS F
Sequence number 19: Primer TrpRS R
Sequence number 20: Primer TyrRS F
Sequence number 21: Primer TyrRS R
Sequence number 22: Thermus origin IleRS
SEQ ID NO: 23: Thermus-derived MetRS
Sequence number 24: Thermus origin TyrRS
Claims (9)
工程（A)の生成物のいずれかを定量する工程（B）
を含み、得られた生成物量に基づいてアミノ酸量を決定する、アミノ酸を定量する方法。 A process of obtaining a reaction product by reacting an amino acid and adenosine triphosphate (ATP) with an aminoacyl-tRNA synthetase (AARS) corresponding to the amino acid in the presence of a (aminoacylAMP) -AARS complex degradation reagent (A ); And quantifying any of the products of step (A) (B)
And determining the amount of amino acid based on the amount of product obtained.
定量対象アミノ酸の各々に対応したAARSを準備し、
AARS以外の他の必要成分を含んだ反応試薬を準備し、
反応試薬と試料とを混合し、
混合物を、少なくとも対象アミノ酸の種類の数に分割し、そして
各分割物に異なるAARSを添加する
工程を含む、方法。 A method according to any one of claims 1 to 7 for quantifying two or more amino acids in one sample,
Prepare AARS corresponding to each amino acid to be quantified,
Prepare a reaction reagent containing other necessary components other than AARS,
Mix the reaction reagent and sample,
Dividing the mixture into at least the number of amino acid types of interest and adding a different AARS to each fraction.
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