JP2013188156A - New yeast and method for producing ethanol using the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、高温及び低pHでのグルコースからのエタノール発酵性に優れ, 且つ, 優れた凝集性を有する、Schizosaccharomyces japonicusに属する新規酵母に関する。
また、本発明は、当該酵母を用いたエタノールの製造方法に関する。
The present invention relates to a novel yeast belonging to Schizosaccharomyces japonicus, which is excellent in ethanol fermentability from glucose at high temperature and low pH and has excellent aggregation properties.
The present invention also relates to a method for producing ethanol using the yeast.
・バイオエタノール生産の困難性
エタノールは、自動車用のガソリン燃料に添加できる理想的な燃料である。特に、バイオマスから製造されるバイオエタノールは、二酸化炭素の排出削減に直結するガソリン添加剤である。
現状では、バイオエタノール製造に用いられる原料としては、サトウキビ, ビート等の作物に含まれる糖分や、トウモロコシ等の食用作物の澱粉が主に用いられている。
しかし、これらは農業資源作物であるため、非常に高価であり、エタノールの大規模製造用の原料として使用することは困難である。
-Difficulty in bioethanol production Ethanol is an ideal fuel that can be added to gasoline fuel for automobiles. In particular, bioethanol produced from biomass is a gasoline additive that directly leads to a reduction in carbon dioxide emissions.
At present, as raw materials used for bioethanol production, sugar contained in crops such as sugar cane and beet and starch of edible crops such as corn are mainly used.
However, since these are agricultural resource crops, they are very expensive and difficult to use as raw materials for large-scale production of ethanol.
そこで、間伐材等の木質系バイオマスや、稲わらなどの草本系バイオマスが、低コストでのバイオエタノール生産原料として注目されている。これらは、原料自体が低価格であり、大量に入手できる再生可能な原料であるからである。
しかし、これらバイオマスの主成分は、セルロース, ヘミセルロース, ペクチンであり、その構成糖への分解技術が進められている（例えば、特許文献1 参照）。
また、これらを構成する糖としては、6炭糖類であるグルコース, フルクトースの他に、5炭糖類であるアラビノース, ラムノース, キシロース等も多く含まれる。
そこで、バイオエタノールの安価安定供給のためには、これらの糖類から効率良くエタノールを生産する技術開発が求められている。
Therefore, woody biomass such as thinned wood and herbaceous biomass such as rice straw are attracting attention as raw materials for producing bioethanol at low cost. This is because the raw material itself is a low-priced, renewable material that can be obtained in large quantities.
However, the main components of these biomasses are cellulose, hemicellulose, and pectin, and a technique for decomposing them into constituent sugars has been advanced (for example, see Patent Document 1).
In addition to glucose and fructose, which are hexoses, saccharides constituting these include pentoses such as arabinose, rhamnose, and xylose.
Therefore, in order to stably supply bioethanol at a low cost, technological development for efficiently producing ethanol from these saccharides is required.
・二段階発酵法の実用化への課題
糖類からエタノールを効率良く生産できる手段としては、酵母による発酵が有効である。しかし、酵母の種類には、これらのうち6炭糖類の単糖類を基質として効率よくエタノール発酵するものが多く知られているが、同時に5炭糖類からのエタノール発酵を効率良く行える種類（菌株）は、現在知られていない。
例えば、6炭糖類であるグルコースを効率よくエタノール発酵できる酵母としては、Saccharomyces属が良く知られているが、5炭糖類からはエタノール発酵することが出来ない。
一方、Pichia stipitisやCandida shihataeは、5炭糖類であるキシロースからエタノール発酵できる酵母であるが、6炭糖類であるグルコースからの発酵効率は極めて低い。
また、遺伝子組み換えや変異体の作出技術により、6炭糖類と5炭糖類の両方に対する発酵性を有するSaccharomyces cerevisiae、Zymomonus属の細菌、大腸菌などが作出されているが（例えば、特許文献2,3等 参照）、発酵能やエタノール耐性が不十分であり、実用に耐える微生物は存在しない。
・ Problems for practical application of the two-stage fermentation method Fermentation with yeast is effective as a means for efficiently producing ethanol from saccharides. However, many types of yeast are known to efficiently ferment ethanol using 6-carbon monosaccharides as substrates, but at the same time, types that can efficiently perform ethanol fermentation from 5-carbons (strain) Is not currently known.
For example, Saccharomyces genus is well known as a yeast that can efficiently ethanol ferment glucose, which is a six-carbon sugar, but ethanol fermentation cannot be performed from a five-carbon sugar.
On the other hand, Pichia stipitis and Candida shihatae are yeasts that can be ethanol-fermented from xylose, which is a pentose, but the fermentation efficiency from glucose, which is a hexose, is extremely low.
Furthermore, Saccharomyces cerevisiae, bacteria of the genus Zymomonus, Escherichia coli, etc. having fermentability to both 6- and 5-carbon sugars have been produced by genetic recombination and mutant production techniques (for example,
そこで、本願発明者は、本願出願前において、セルロース系バイオマスの糖化液に対して2種類の酵母を用いた二段階発酵法を開発した（特許文献4 参照）。
当該方法では、一段階目の発酵（一次発酵）で6炭糖類発酵性酵母を用いて6炭糖類をエタノールに変換し、得られた発酵液をガスストリッピング法でエタノールを回収する。そして、その後さらに5炭糖類発酵性酵母を用いて二段階目の発酵（二次発酵）を行い、5炭糖類をエタノールに変換する方法である。
しかしながら、当該二段階発酵法では、一次発酵を通常のSaccharomyces属酵母の至適発酵温度である28℃で行う必要があるため、発酵に伴う温度上昇から発酵中に冷却を行う必要がある。
また、当該方法では、一次発酵が終了した後、二次発酵の発酵を開始する前に、ガスストリッピングによるエタノール除去工程が必要であり、操作が煩雑となっていた。
また、当該方法では、一次発酵が終了した後に、一次発酵の酵母を分離する必要があり、凝集性酵母を用いる必要性がある。しかし、凝集性酵母のエタノール生産性は低い傾向があり、生産効率の点で課題があった。
従って、当該二段階発酵法を実用化するためには、さらなる改良が望まれているのが現状である。
Therefore, the inventor of the present application has developed a two-stage fermentation method using two types of yeast with respect to a saccharified solution of cellulosic biomass before the filing of the present application (see Patent Document 4).
In this method, in the first stage fermentation (primary fermentation), hexose is converted to ethanol using hexose fermentable yeast, and ethanol is recovered from the obtained fermentation broth by gas stripping. And after that, the second stage fermentation (secondary fermentation) is further performed using pentose fermentable yeast, and the pentose is converted to ethanol.
However, in the two-stage fermentation method, it is necessary to perform primary fermentation at 28 ° C., which is the optimum fermentation temperature for normal yeasts of the genus Saccharomyces, and therefore cooling must be performed during the fermentation due to the temperature rise accompanying fermentation.
Moreover, in the said method, before the fermentation of secondary fermentation was started after primary fermentation was complete | finished, the ethanol removal process by gas stripping was required, and operation became complicated.
Moreover, in the said method, after primary fermentation is complete | finished, it is necessary to isolate | separate the yeast of primary fermentation, and it is necessary to use a cohesive yeast. However, ethanol productivity of the flocculent yeast tends to be low, and there is a problem in terms of production efficiency.
Therefore, in order to put the two-stage fermentation method into practical use, further improvement is desired at present.
本発明では、上記課題を解決するため、高温でのグルコースからのエタノール発酵性に優れ, 且つ, 優れた凝集性を有する新規酵母を提供することを目的とする。
具体的には、バイオマス原料からのエタノール製造に適した二段階発酵法において、一次発酵（6炭糖類からのエタノール発酵）に適した酵母を提供することを目的とする。
In order to solve the above problems, an object of the present invention is to provide a novel yeast having excellent ethanol fermentability from glucose at high temperature and excellent aggregability.
Specifically, an object of the present invention is to provide a yeast suitable for primary fermentation (ethanol fermentation from 6-carbon sugars) in a two-stage fermentation method suitable for ethanol production from biomass raw materials.
本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、高温でのグルコースからのエタノール生産性に優れ, 且つ, 優れた凝集性を有するSchizosaccharomyces japonicusに属する新規酵母SS4-5株を見出した。
なお、当該SS4-5株は、雑菌の繁殖を抑制できる低pH条件においても、優れたエタノール発酵性を有する菌株であった。
As a result of intensive studies, the present inventor has found a novel yeast strain SS4-5 belonging to Schizosaccharomyces japonicus, which is excellent in ethanol productivity from glucose at high temperature and has excellent aggregation properties.
The SS4-5 strain was a strain having excellent ethanol fermentability even under low pH conditions that could suppress the propagation of miscellaneous bacteria.
本発明は、これらの知見に基づいてなされたものである。
〔請求項1〕に係る本発明は、以下(1)〜(6)に記載の菌学的性質を有することを特徴とする、Schizosaccharomyces japonicusに属する酵母、に関するものである。
(1) グルコースからのエタノール発酵において、以下に記載の性質を有する性質。
(1-1) 37〜44℃にて至適にエタノール発酵できる性質。
(1-2) pH3〜7にて至適にエタノール発酵できる性質。
(1-2) エタノール発酵時に凝集する性質。
(2) 26SrDNA-D1/D2領域の塩基配列として、配列番号1に記載の塩基配列, 又は, 配列番号1に記載の塩基配列と97％以上の相同性を示す塩基配列, をゲノムDNA中に有する性質。
(3) 以下に記載の資化性及び非資化性を有する性質。
(3-1) グルコース, シュークロース, マルトース, 又はラフィノースを資化できる性質。
(3-2) ガラクトース, L-ソルボース, D-グルコサミン, D-リボース, D-キシロース, L-アラビノース, D-アラビノース, L-ラムノース, トレハロース, αメチル-D-グルコシド, セロビオース, サリシン, メリビオース, ラクトース, メレチトース, 可溶性デンプン, グリセロール, エリスリトール, リビトール, D-グルコン酸, エタノール, 硝酸, 又はL-リジンを資化できない性質。
(4) 以下に記載のエタノール発酵性及び非発酵性を有する性質。
(4-1) グルコース, シュークロース, 又はマルトースを基質としてエタノール発酵できる性質。
(4-2) ガラクトース又はラクトースを基質としてエタノール発酵できない性質。
(5) YM平板培地において25℃で3日間培養後に形成されたコロニーが、以下に記載の形態を示す性質。
(5-1) 周縁が全縁であり、周縁部が扁平で中央部がクッション形である性質
(5-2) 表面が平滑であり、バター様で湿性のある性質。
(5-3) コロニーの色調が白色からクリーム色である性質。
(6) 以下に記載の細胞的性質を有する性質。
(6-1) 栄養細胞が亜球形から円筒形である性質。
(6-2) 分裂によって増殖する性質。
(6-3) 子嚢胞子の形状が球形である性質。
〔請求項2〕に係る本発明は、Schizosaccharomyces japonicus SS4-5株（受託番号NITE P-1197）である酵母、に関するものである。
〔請求項3〕に係る本発明は、グルコースからのエタノール発酵において、以下(A)〜(C)に記載の菌学的性質を有することを特徴とする、Schizosaccharomyces japonicus SS4-5株（受託番号NITE P-1197）に由来する変異体である酵母、に関するものである。
(A) 37〜44℃にて至適にエタノール発酵できる性質。
(B) pH3〜7にて至適にエタノール発酵できる性質。
(C) エタノール発酵時に凝集する性質。
〔請求項4〕に係る本発明は、請求項1〜3に記載のいずれかの酵母を用いてエタノール発酵を行うことを特徴とする、エタノールの製造方法、に関するものである。
〔請求項5〕に係る本発明は、前記エタノール発酵における発酵基質の原料として、バイオマス原料の糖化液を用いることを特徴とする、請求項4に記載の製造方法、に関するものである。
〔請求項6〕に係る本発明は、前記エタノール発酵をpH2〜6の条件で行うことを特徴とする、請求項4又は5に記載のエタノールの製造方法、に関するものである。
〔請求項7〕に係る本発明は、前記エタノール発酵を35〜45℃の温度条件で行い, 且つ, 前記発酵によって生成したエタノールを発酵と同時に蒸留回収することを特徴とする、請求項4〜6のいずれかに記載のエタノールの製造方法、に関するものである。
〔請求項8〕に係る本発明は、前記エタノール発酵を行った後、さらに5炭糖類の糖類に対するエタノール発酵性を有する微生物を用いて二次発酵を行うことを特徴とする、請求項4〜7のいずれかに記載のエタノールの製造方法、に関するものである。
The present invention has been made based on these findings.
The present invention according to [Claim 1] relates to a yeast belonging to Schizosaccharomyces japonicus, characterized by having the mycological properties described in (1) to (6) below.
(1) Properties having the following properties in ethanol fermentation from glucose.
(1-1) The property of optimal ethanol fermentation at 37-44 ° C.
(1-2) The property of optimal ethanol fermentation at pH 3-7.
(1-2) The nature of aggregation during ethanol fermentation.
(2) As the nucleotide sequence of the 26SrDNA-D1 / D2 region, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or the nucleotide sequence showing 97% or more homology with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in genomic DNA Properties that have.
(3) Properties having assimilation and non-assimilability as described below.
(3-1) Properties that can assimilate glucose, sucrose, maltose, or raffinose.
(3-2) Galactose, L-sorbose, D-glucosamine, D-ribose, D-xylose, L-arabinose, D-arabinose, L-rhamnose, trehalose, α-methyl-D-glucoside, cellobiose, salicin, melibiose, Properties that cannot assimilate lactose, meletitose, soluble starch, glycerol, erythritol, ribitol, D-gluconic acid, ethanol, nitric acid, or L-lysine.
(4) Properties having ethanol fermentability and non-fermentability as described below.
(4-1) A property that enables ethanol fermentation using glucose, sucrose, or maltose as a substrate.
(4-2) The property that ethanol fermentation cannot be performed using galactose or lactose as a substrate.
(5) The property that the colonies formed after 3 days of culturing at 25 ° C. in a YM plate medium exhibit the following forms.
(5-1) The property that the periphery is all edges, the periphery is flat and the center is cushioned
(5-2) Smooth surface, butter-like and wet properties.
(5-3) The property that the color of the colony is white to cream.
(6) Properties having cellular properties described below.
(6-1) The nature of vegetative cells from subspherical to cylindrical.
(6-2) Proliferation by division.
(6-3) The nature of the ascospore is spherical.
The present invention according to [Claim 2] relates to a yeast that is Schizosaccharomyces japonicus SS4-5 strain (Accession No. NITE P-1197).
The present invention according to [Claim 3] is characterized by having the mycological properties described in the following (A) to (C) in ethanol fermentation from glucose, Schizosaccharomyces japonicus SS4-5 strain (Accession No.) NITE P-1197), which is a mutant derived from NITE P-1197).
(A) Properties capable of optimal ethanol fermentation at 37-44 ° C.
(B) Properties capable of optimal ethanol fermentation at pH 3-7.
(C) The property of aggregation during ethanol fermentation.
The present invention according to [Claim 4] relates to a method for producing ethanol, characterized in that ethanol fermentation is performed using the yeast according to any one of Claims 1 to 3.
The present invention according to [Claim 5] relates to the production method according to
The present invention according to [Claim 6] relates to the method for producing ethanol according to
The present invention according to [Claim 7] is characterized in that the ethanol fermentation is performed under a temperature condition of 35 to 45 ° C., and ethanol produced by the fermentation is distilled and recovered simultaneously with the fermentation. 6. The method for producing ethanol according to any one of 6 above.
The present invention according to [Claim 8] is characterized in that, after performing the ethanol fermentation, secondary fermentation is further performed using a microorganism having ethanol fermentability with respect to saccharides of pentoses. 7. The method for producing ethanol according to any one of 7 above.
本発明によれば、高温及び低pHでのグルコースからのエタノール発酵性に優れ, 且つ, 優れた凝集性を有する、Schizosaccharomyces japonicusに属する新規酵母を提供することを可能とする。 According to the present invention, it is possible to provide a novel yeast belonging to Schizosaccharomyces japonicus, which is excellent in ethanol fermentability from glucose at high temperature and low pH and has excellent aggregation properties.
本発明では、当該酵母の性質により、通常のSaccharomyces属やSchizosaccharomyces属の酵母の発酵（至適発酵温度28℃）では必須であった冷却を行うことなく、グルコースからのエタノール生産を行うことが可能とする。
また、本発明では、発酵を行いながら同時に生成されたエタノールを蒸留で回収することを可能とする。
また、本発明では、発酵後の酵母と発酵液の分離を容易に行うことが可能となる。これにより、回収した酵母菌体を用いて連続発酵を行うことも可能となる。
また、本発明では、雑菌の繁殖が抑制される低pH条件でのエタノール生産が可能となる。
In the present invention, due to the properties of the yeast, ethanol production from glucose can be performed without cooling, which was essential in the fermentation of normal Saccharomyces or Schizosaccharomyces yeasts (optimum fermentation temperature 28 ° C). And
Moreover, in this invention, it enables it to collect | recover by ethanol the ethanol produced | generated simultaneously with performing fermentation.
Moreover, in this invention, it becomes possible to isolate | separate easily yeast after fermentation and a fermented liquor. Thereby, it is also possible to perform continuous fermentation using the recovered yeast cells.
Further, in the present invention, ethanol production can be performed under a low pH condition in which propagation of various bacteria is suppressed.
本発明では、バイオマスの糖化液からのエタノール生産に優れた二段階発酵法を、効率良く行うことを可能とする。
具体的には、一次発酵（6炭糖類からのエタノール発酵）と同時に生成したエタノールを蒸留することが可能とし、ガスストリッピングによるエタノール除去工程を行うことなく、二次発酵（別途酵母による5炭糖類からのエタノール発酵）が可能とする。
また、一次発酵終了後の発酵液からの分離を非常に簡便に行うことが可能となる。
In the present invention, it is possible to efficiently perform a two-stage fermentation method excellent in ethanol production from a saccharified liquid of biomass.
Specifically, the ethanol produced at the same time as the primary fermentation (ethanol fermentation from 6 carbon sugars) can be distilled, and secondary fermentation (separately produced 5 charcoal by yeast) without performing the ethanol removal step by gas stripping. Ethanol fermentation from sugar).
Further, separation from the fermentation broth after completion of primary fermentation can be performed very simply.
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、グルコースからのエタノール発酵、特にバイオマス原料からのエタノール製造に適した二段階発酵法に適した新規酵母に関する発明である。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The present invention relates to a novel yeast suitable for a two-stage fermentation method suitable for ethanol fermentation from glucose, particularly ethanol production from biomass raw materials.
〔新規酵母の菌学的性質〕
・分類
本発明の酵母は、Schizosaccharomyces japonicusに属する酵母である。ここで、Schizosaccharomyces属とは、子嚢菌類に属する分裂酵母の一種である。
本発明の酵母としては、具体的には、26SrRNA遺伝子の一部である26SrDNA-D1/D2領域として、Schizosaccharomyces japonicusに属する菌株と同一の26SrDNA-D1/D2領域を、ゲノムDNA中に有するものである。
具体的には、配列番号1に記載の塩基配列と97％以上, 好ましくは98％以上, さらには99％以上の相同性を示す26SrDNA-D1/D2領域を、ゲノムDNA中に有する酵母である。
最も好ましくは、配列番号1に記載の塩基配列と完全一致する26SrDNA-D1/D2領域を、ゲノムDNA中に有する酵母である。
[Mycological properties of new yeast]
-Classification The yeast of the present invention belongs to Schizosaccharomyces japonicus. Here, the genus Schizosaccharomyces is a kind of fission yeast belonging to ascomycetes.
As the yeast of the present invention, specifically, a 26SrDNA-D1 / D2 region that is a part of the 26SrRNA gene has the same 26SrDNA-D1 / D2 region in the genomic DNA as the strain belonging to Schizosaccharomyces japonicus. is there.
Specifically, a yeast having a 26SrDNA-D1 / D2 region in the genomic DNA having a homology of 97% or more, preferably 98% or more, more preferably 99% or more with the base sequence described in SEQ ID NO: 1. .
Most preferably, the yeast has a 26SrDNA-D1 / D2 region in the genomic DNA that completely matches the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
・形態的特徴
本発明の酵母の栄養細胞は、亜球形から円筒形の形状を有し、分裂によって増殖する性質を有するものである。また、子嚢胞子の形成能を有し、当該子嚢胞子の形状は球形である。
-Morphological features The vegetative cells of the yeast of the present invention have a subspherical to cylindrical shape, and have the property of proliferating by division. Moreover, it has the ability to form ascospores, and the shape of the ascospores is spherical.
また、本発明の酵母のコロニー（YM平板培地において25℃で3日間培養後に形成されたコロニー）の形態は、コロニーの周縁が全縁であり、周縁部が扁平で中央部がクッション形である形状を有するものである。
また、当該コロニーの表面は平滑であり、バター様で湿性のある性質を有するものである。
また、当該コロニーの色調は、白色からクリーム色を呈するものである。
Moreover, the form of the colony of the yeast of the present invention (colony formed after culturing at 25 ° C. for 3 days in a YM flat plate medium) is the entire periphery of the colony, the periphery is flat, and the center is a cushion shape It has a shape.
Moreover, the surface of the colony is smooth, butter-like, and has a wet nature.
Moreover, the color tone of the said colony exhibits a cream color from white.
・エタノール発酵性
本発明の酵母は、6炭糖類であるグルコースを基質として優れたエタノール発酵能を有する酵母である。具体的には、通常のエタノール生産に用いられるSaccharomyces属やSchizosaccharomyces属の酵母と同程度の高い発酵効率とエタノール耐性を有する。
なお、本発明の新規酵母は、発酵が進行しエタノール濃度が高くなった場合でも、優れたエタノール耐性と発酵性を有する。
-Ethanol fermentability The yeast of this invention is yeast which has the ethanol fermentability which was excellent using glucose which is 6 carbon sugars as a substrate. Specifically, it has the same high fermentation efficiency and ethanol tolerance as the yeasts of the genus Saccharomyces and Schizosaccharomyces used for normal ethanol production.
The novel yeast of the present invention has excellent ethanol resistance and fermentability even when fermentation progresses and the ethanol concentration becomes high.
また、本発明の酵母は、グルコース（Glc）以外の糖源であってもシュークロース（Glc-Fruの二糖類）, マルトース（Glc-Galaの二糖類の一種）からエタノール発酵する性質を有する。また、弱いながらメリビオース（Gala-Glcの二糖類の一種）, ラフィノース（Fru-Gala-Glcの三糖類の一種）に対する発酵性も有する。
なお、本発明の酵母は、バイオマス原料の糖化液に含まれるグルコース等についても、好適に発酵基質とすることができる。
Further, the yeast of the present invention has the property of ethanol fermentation from sucrose (Glc-Fru disaccharide) and maltose (a kind of Glc-Gala disaccharide) even if it is a sugar source other than glucose (Glc). In addition, although it is weak, it has fermentability to melibiose (a kind of Gala-Glc disaccharide) and raffinose (a kind of Fru-Gala-Glc trisaccharide).
In addition, the yeast of this invention can be used as a fermentation substrate suitably also about glucose etc. which are contained in the saccharified liquid of a biomass raw material.
一方、本発明の酵母は、6炭糖類であってもガラクトース（Gala）からのエタノール発酵性を有さない。また、ラクトース（Glc-Galaの二糖類の一種）の発酵性も有さない。
また、5炭糖類に属する単糖類全般（D-リボース, D-キシロース, L-アラビノース, D-アラビノース, L-ラムノース等）についての資化性が全くないことから、これらに対する発酵性も有さない。
On the other hand, the yeast of the present invention does not have ethanol fermentability from galactose (Gala) even if it is a 6-carbon sugar. In addition, it does not have the fermentability of lactose (a kind of Glc-Gala disaccharide).
Also, since there is no assimilation of all monosaccharides belonging to the five carbon sugars (D-ribose, D-xylose, L-arabinose, D-arabinose, L-rhamnose, etc.), they also have fermentability to these. Absent.
・各種資化性
本発明の酵母は、炭素源としてグルコース, シュークロース, マルトース, ラフィノースに対する資化性を有する。
一方、炭素源として、ガラクトース, L-ソルボース, D-グルコサミン, D-リボース, D-キシロース, L-アラビノース, D-アラビノース, L-ラムノース, トレハロース, αメチル-D-グルコシド, セロビオース, サリシン, メリビオース, ラクトース, メレチトース, 可溶性デンプン, グリセロール, エリスリトール, リビトール, D-グルコン酸, エタノールについては、全く資化性を有さない。
また、窒素源として、硝酸（無機態窒素化合物）, L-リジン（有機態窒素化合物であるアミノ酸）に対する資化性を有さない。
-Various assimilation ability The yeast of this invention has assimilation ability with respect to glucose, sucrose, maltose, raffinose as a carbon source.
On the other hand, as carbon sources, galactose, L-sorbose, D-glucosamine, D-ribose, D-xylose, L-arabinose, D-arabinose, L-rhamnose, trehalose, α-methyl-D-glucoside, cellobiose, salicin, melibiose , Lactose, meretitol, soluble starch, glycerol, erythritol, ribitol, D-gluconic acid, and ethanol have no assimilation.
In addition, it has no assimilation ability for nitric acid (inorganic nitrogen compound) and L-lysine (amino acid which is an organic nitrogen compound) as a nitrogen source.
・高温発酵性
本発明の酵母は、通常のSaccharomyces属やSchizosaccharomyces属の酵母（至適発酵温度：28℃）では生育及びエタノール発酵しえない高温条件において、至適に生育し且つエタノール発酵をする性質を有する。
具体的には、35〜44℃、好ましくは37℃〜44℃、さらには40〜43℃、特には42℃付近で
至適生育性及び至適エタノール発酵性を有する酵母である。
なお、当該酵母は、前記至適範囲より低温や高温であっても、菌の活性自体は落ちるが生育や発酵自体は可能である。
例えば、至適範囲より低温である35℃未満（例えば20℃以上〜35℃未満）においても、生育及びエタノール発酵自体は可能である。また、前記至適範囲より高温である44℃より高い温度（例えば44℃より高い温度〜46℃以下）においても、生育及びエタノール発酵自体は可能である。
-High temperature fermentability The yeast of the present invention grows optimally and undergoes ethanol fermentation under high temperature conditions where normal yeasts of the genus Saccharomyces and Schizosaccharomyces (optimum fermentation temperature: 28 ° C) cannot grow and undergo ethanol fermentation. Have properties.
Specifically, it is a yeast having optimum growth and optimum ethanol fermentability at 35 to 44 ° C., preferably 37 to 44 ° C., more preferably 40 to 43 ° C., particularly around 42 ° C.
In addition, even if the said yeast is low temperature and high temperature from the said optimal range, although the activity of fungi itself falls, growth and fermentation itself are possible.
For example, growth and ethanol fermentation itself are possible even at a temperature lower than 35 ° C. (for example, 20 ° C. or higher and lower than 35 ° C.), which is lower than the optimum range. Further, growth and ethanol fermentation itself are possible even at a temperature higher than 44 ° C., which is higher than the optimum range (for example, a temperature higher than 44 ° C. to 46 ° C. or lower).
・低pH発酵性
本発明の酵母は、酸性〜中性付近であるpH3〜7、好ましくはpH4〜7、さらに好ましくはpH5〜7において、至適に生育及びエタノール発酵する性質を有する酵母である。
即ち、本発明の新規酵母の当該至適pH域は、通常の酵母では生育・発酵に適さない低pH域（具体的にはpH3〜4）であっても、高い生育性や発酵性を示す酵母である。
Low pH fermentability The yeast of the present invention is a yeast having the property of optimal growth and ethanol fermentation at an acidic to neutral pH of 3 to 7, preferably
That is, even if the optimum pH range of the novel yeast of the present invention is a low pH range (specifically
・凝集性
本発明の酵母は、上記のような優れたエタノール発酵性を有するにも関わらず、優れた凝集性を有する酵母である。
ここで凝集性とは、静置状態の培養（発酵）中において、細胞が相互作用により凝集塊を形成し、沈降する性質を指すものである。
具体的には、本発明の酵母は、発酵中は発生した二酸化炭素の気泡により浮遊する傾向があるものの、発酵終了後は、発酵タンクの下に凝集して完全に沈殿する性質を有する。
なお、自然界に存在する凝集性酵母には、エタノール発酵性が不十分なものがほとんどであり、高いエタノール発酵性と凝集性の両方の形質を有する酵母は極めて稀である。
-Aggregation property Although the yeast of this invention has the above-mentioned outstanding ethanol fermentability, it is a yeast which has the outstanding aggregability.
Here, the aggregating property refers to a property in which cells form an agglomerate by interaction and settle during the stationary culture (fermentation).
Specifically, although the yeast of the present invention tends to float due to bubbles of carbon dioxide generated during fermentation, it has the property of agglomerating under the fermentation tank and completely precipitating after the end of fermentation.
In addition, most of the flocculating yeasts existing in nature have insufficient ethanol fermentability, and yeasts having both high ethanol fermentability and flocculation characteristics are extremely rare.
〔SS4-5菌株〕
本発明の酵母として具体的な菌株としては、「Schizosaccharomyces japonicus SS4-5株」を挙げることができる。当該SS4-5菌株は、秋田県内の土壌から分離された菌株である。
なお、当該菌株は、2012年1月27日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構（千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）に、受託番号 NITE P-1197としてSS4-5の名称で寄託が認められた菌株である。
[SS4-5 strain]
Specific examples of the strain of the present invention include “Schizosaccharomyces japonicus SS4-5 strain”. The SS4-5 strain is a strain isolated from soil in Akita Prefecture.
In addition, the name of the strain is SS4-5 as trustee number NITE P-1197 to the National Institute of Technology and Evaluation (2-5-8 Kazusa-Kamashita, Kisarazu-shi, Chiba) on January 27, 2012. The strain was deposited in
なお、本発明においては、SS4-5菌株に基づいて作出された変異体菌株であっても、SS4-5菌株の特徴的な性質である、(i)上記高温にて至適にエタノール発酵できる性質, (ii)上記酸性から中性にて至適にエタノール発酵できる性質, (iii)エタノール発酵時に凝集する性質を有する菌株であれば、本発明の酵母に含まれる。
例えば、上記記載した菌学的性質の一部が異なるものや、上記菌学的性質以外の性質を有するSS4-5菌株由来の変異体菌株も、本発明の酵母に含まれる。
In the present invention, even a mutant strain produced based on the SS4-5 strain, which is a characteristic property of the SS4-5 strain, can be optimally fermented with ethanol at the above high temperature. The yeast of the present invention includes any of the following strains: (ii) a strain capable of optimally fermenting ethanol from acid to neutral and (iii) aggregating during ethanol fermentation.
For example, mutant strains derived from the SS4-5 strain having some of the above-described mycological properties different from those described above and having properties other than the above mycological properties are also included in the yeast of the present invention.
〔エタノール製造〕
本発明では、上記酵母を用いてエタノール発酵を行うことにより、効率的にエタノール製造を行うことが可能となる。
[Ethanol production]
In the present invention, ethanol can be efficiently produced by performing ethanol fermentation using the yeast.
・発酵条件
本発明のエタノール製造方法では、上記酵母を用いることにより、発酵温度を35〜45℃,好ましくは37〜44℃, 特には40〜44℃の高温条件で発酵を行うことが可能となる。
これにより、当該エタノール製造においては、発酵熱の冷却を行うことなく、エタノール発酵を行うことが可能となる。
また、当該エタノール製造において、当該高温条件にて発酵を行うことにより、生成したエタノールを発酵と同時に蒸留回収することが可能となる。即ち、発酵と蒸留の同時操作が可能となる。
また、ここでの蒸留操作は、減圧条件にて行うことが効率の点で好適であるが、40℃以上で発酵を行う場合、常圧条件でも好適にエタノール蒸留が可能である。
Fermentation conditions In the ethanol production method of the present invention, by using the above yeast, fermentation can be performed at a high temperature of 35 to 45 ° C, preferably 37 to 44 ° C, particularly 40 to 44 ° C. Become.
Thereby, in the said ethanol manufacture, it becomes possible to perform ethanol fermentation, without cooling fermentation heat.
Moreover, in the said ethanol manufacture, by performing fermentation on the said high temperature conditions, it becomes possible to distill and collect the produced | generated ethanol simultaneously with fermentation. That is, simultaneous operation of fermentation and distillation becomes possible.
The distillation operation here is preferably performed under reduced pressure conditions from the viewpoint of efficiency. However, when fermentation is performed at 40 ° C. or higher, ethanol distillation can be suitably performed even under normal pressure conditions.
本発明のエタノール製造では、本発明の酵母を 106〜1010 個/mL, 好ましくは108〜109 個/mLとなるように植菌し、発酵を行うことで、通常3〜24時間、好ましくは6〜12時間で、培地中のグルコース等（6炭糖類）からのエタノールへの変換を完全に行うことが可能である。
なお、当該エタノール発酵は、嫌気でおこなわれるため、酸素の供給は必要としない。
In the ethanol production of the present invention, the yeast of the present invention is inoculated so as to be 10 6 to 10 10 cells / mL, preferably 10 8 to 10 9 cells / mL, and fermentation is usually performed for 3 to 24 hours. The conversion from glucose or the like (6-carbon sugar) in the medium to ethanol can be completely performed preferably in 6 to 12 hours.
In addition, since the said ethanol fermentation is performed anaerobically, supply of oxygen is not required.
本発明のエタノール製造方法では、上記酵母を用いることにより、雑菌の繁殖を抑制することが可能な低pH条件での発酵が可能となる。
具体的には、pH2〜6, 好ましくはpH2.5〜5, 最も好ましくはpH3〜4の低pH条件にて発酵を行うことで、雑菌の繁殖を抑えつつ、効率的なエタノール生産を行うことが可能となる。
In the ethanol production method of the present invention, by using the above yeast, fermentation under low pH conditions capable of suppressing the propagation of miscellaneous bacteria becomes possible.
Specifically, by performing fermentation under low pH conditions of
・発酵原料
本発明のエタノール製造に用いる原料としては、グルコース, シュークロース, マルトースを含む液体であれば如何なるものも用いることができるが、本発明の酵母の発酵基質に適したグルコース（6炭糖類）を多く含む液体を用いることが望ましい。
-Fermentation raw material As the raw material used in the ethanol production of the present invention, any liquid containing glucose, sucrose, and maltose can be used, but glucose suitable for the yeast fermentation substrate of the present invention (6-carbon sugars) It is desirable to use a liquid containing a large amount of).
また、本発明では、原料としてサトウキビ等の糖液やトウモロコシ等の穀物の澱粉糖化液を用いることができるが、具体的には、農業資源でない‘リグノセルロース系のバイオマス原料’の糖化液（セルラーゼやペクチナーゼ等で処理した液）を用いることが、資源の有効利用の点で著しく好適である。なお、当該糖化液には、グルコース等の6炭糖類とキシロース等の5炭糖類が多く含まれる。 In the present invention, a sugar solution such as sugar cane or a starch saccharified solution such as corn can be used as a raw material. Specifically, a saccharified solution (cellulase) of a “lignocellulose-based biomass raw material” that is not an agricultural resource. Or a solution treated with pectinase or the like is extremely preferable in terms of effective use of resources. The saccharified solution contains a large amount of hexoses such as glucose and pentoses such as xylose.
ここでバイオマス原料としては、具体的には、エリアンサスの乾燥地上部、稲わら、ススキ、スイッチグラス、ネピアグラス、麦わら、トウモロコシ茎葉、スイートソルガム、牧草類、ミスカンサス、ギニアグラス、パンゴラグラス等の草本系バイオマス原料、；スギ、ヤナギ、ユーカリ、ポプラ、パームヤシ、松、竹等の木本系バイオマス原料、；を挙げることができる。また、廃棄対象となる、規格外の農作物や、サトウキビ絞り粕（バガス）、建設現場からの木材廃材、パルプ製造における廃液（黒液）、食品廃棄物、下水汚泥等を挙げることもできる。
これらのうち、エリアンサス、スイートソルガム、稲わらは、高い乾物生産性を有し、バイオエタノール原料として好適である。
Specific examples of biomass raw materials include Elianthus dry ground, rice straw, Japanese pampas grass, switchgrass, napiergrass, straw, corn stover, sweet sorghum, pastures, Miscanthus, Guineagrass, Pangolagrass, etc. Herbaceous biomass materials; woody biomass materials such as cedar, willow, eucalyptus, poplar, palm palm, pine, bamboo, and the like. In addition, non-standard crops to be discarded, sugarcane squeezed straw (bagasse), wood waste from construction sites, waste liquid (black liquor) in pulp production, food waste, sewage sludge, and the like can also be mentioned.
Of these, Elianthus, sweet sorghum and rice straw have high dry matter productivity and are suitable as bioethanol raw materials.
・操作性
本発明のエタノール製造方法では、上記酵母の凝集性により、発酵後の発酵液と菌体の分離が極めて容易に行うことができる。
そのため、実際の製造ラインにおいて、発酵後のタンク下から酵母のみを取り出し、発酵液と分離することが容易でなる。
また、発酵スケールが小さい場合は、デカンテーション等によって、簡便に行うことも可能となる。
なお、当然であるが、遠心操作やフィルター等での回収操作で行うことも可能である。
-Operability In the ethanol production method of the present invention, the fermentation broth after fermentation and the bacterial cells can be separated very easily due to the cohesiveness of the yeast.
Therefore, in an actual production line, it is easy to take out only yeast from the bottom of the tank after fermentation and separate it from the fermentation broth.
In addition, when the fermentation scale is small, it can be easily performed by decantation or the like.
Of course, it is also possible to carry out by a centrifugal operation or a collecting operation with a filter or the like.
これにより、本発明のエタノール製造方法では、回収した菌体を利用した繰り返しの連続発酵（回分発酵）が可能となる。
また、回収した発酵液に含まれる別の糖類（例えば、キシロース等）ついて、別の発酵微生物を用いた二次発酵を行うことも容易となる。
なお、通常の凝集性のない酵母を用いた場合では、発酵終了後も発酵液に浮遊しているため遠心分離等の煩雑な操作が必要となり、簡便には分離操作を行うことができない。
Thereby, in the ethanol manufacturing method of the present invention, repeated continuous fermentation (batch fermentation) using the recovered cells is possible.
Moreover, it becomes easy to perform secondary fermentation using another fermenting microorganism with respect to another saccharide (for example, xylose etc.) contained in the collected fermentation broth.
In addition, in the case of using a normal non-aggregating yeast, since it remains floating in the fermentation broth after the end of fermentation, a complicated operation such as centrifugation is required, and the separation operation cannot be performed simply.
・二段階発酵法
本発明のエタノール製造において、原料として上記バイオマス原料の糖化液を用いる場合、二段階発酵法で行うことが望ましい。
本発明における二段階発酵法では、一次発酵で本発明の酵母を用いてグルコース等（6炭糖類）をエタノールに変換し、得られた発酵液に対して、さらに別の微生物（5炭糖類発酵性微生物）を用いて二次発酵を行い、5炭糖類をエタノールに変換する方法である。
-Two-stage fermentation method In the ethanol production of the present invention, when the saccharified solution of the biomass raw material is used as a raw material, it is desirable to perform the two-stage fermentation method.
In the two-stage fermentation method of the present invention, glucose or the like (6-carbon sugar) is converted into ethanol using the yeast of the present invention in primary fermentation, and another microorganism (5-carbon sugar fermentation) is added to the obtained fermentation broth. Is a method of converting pentose to ethanol using secondary fermentation.
ここで、本発明の酵母を用いて行う一次発酵は、上記の如く高温条件にて行って、発酵と蒸留を同時進行で行うことが好適である。
また、当該態様では、発酵液中のエタノール濃度を減少させることができるため、ガスストリッピングによるエタノール除去工程を行うことなく、二次発酵を行うことが可能となる。
Here, the primary fermentation performed using the yeast of the present invention is preferably performed under high temperature conditions as described above, and fermentation and distillation are performed simultaneously.
Moreover, in the said aspect, since the ethanol concentration in fermentation liquid can be reduced, it becomes possible to perform secondary fermentation, without performing the ethanol removal process by gas stripping.
また、本発明の二段階発酵法では、一次発酵終了後における本発明の酵母菌体と発酵液からの分離を、上記のように簡便な操作にて行い、二次発酵に繋げることが可能となる。 Moreover, in the two-stage fermentation method of the present invention, it is possible to separate the yeast cells of the present invention from the fermentation broth after the completion of the primary fermentation by a simple operation as described above, and lead to secondary fermentation. Become.
なお、ここで、二次発酵に用いる微生物としては、5炭糖類発酵性の微生物であれば如何なるものを用いることができる。好ましくは、5炭糖類発酵性酵母であるPichia属の酵母を用いることが望ましく、具体的には、P. stipitis SS39-1株, P. stipitis NITE-P598株 等を用いるのが好適である。
Here, any microorganism can be used as the microorganism used for the secondary fermentation as long as it is a pentose-fermenting microorganism. Preferably, a yeast belonging to the genus Pichia, which is a pentose-fermenting yeast, is desirably used. Specifically, P. stipitis SS39-1 strain, P. stipitis NITE-P598 strain and the like are preferably used.
以下、試験例および実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明の範囲はこれらにより限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although a test example and an Example are given and this invention is demonstrated, the scope of the present invention is not limited by these.
〔分析例1〕『各種濃度測定』
(1)「エタノール濃度の測定」
以下の試験例及び実施例において、エタノール濃度の測定は、アルコール分析器（アルコメイト：理研計器(株)）を用いて測定した。
なお、測定値は、液量％(v/v), 又は, 液量あたりの重量含量（g/L）で示した。
[Analysis Example 1] “Measurement of various concentrations”
(1) "Measurement of ethanol concentration"
In the following test examples and examples, the ethanol concentration was measured using an alcohol analyzer (alcomate: Riken Keiki Co., Ltd.).
In addition, the measured value was shown by the liquid volume% (v / v) or the weight content per liquid volume (g / L).
(2)「エタノール収率の算出」
以下の試験例及び実施例において、「培地中のグルコースの全てをエタノールに変換した場合の理論値（初発グルコースに0.51を乗じた値）」に対する「実際に発酵後に実測されたエタノール量」の割合を、式(1)を用いて算出し、グルコースからのエタノール収率（％）とした。
また、キシロースからのエタノール収率（％）についても、式(2)を用いて同様に算出した。
(2) `` Ethanol yield calculation ''
In the following test examples and examples, the ratio of “the amount of ethanol actually measured after fermentation” to “theoretical value when all glucose in the medium is converted to ethanol (the value obtained by multiplying the initial glucose by 0.51)” Was calculated using the formula (1), and was defined as the ethanol yield (%) from glucose.
Further, the ethanol yield (%) from xylose was calculated in the same manner using the formula (2).
(3)「糖類濃度の測定」
以下の試験例及び実施例において、グルコース濃度の測定は、JKインターナショナルFキットグルコースを用いた酵素法により測定した。また、キシロース濃度の測定は、メガザイム社キシロースキットを用いた酵素法により測定した。
また、これらの測定値は、重量％(w/v)で示した。
(3) `` Measurement of sugar concentration ''
In the following test examples and examples, the glucose concentration was measured by an enzymatic method using JK International F kit glucose. The xylose concentration was measured by an enzymatic method using a megazyme xylose kit.
Moreover, these measured values were shown by weight% (w / v).
〔試験例1〕『一次スクリーニング』
様々な微生物源から、高温でのエタノール生産性に優れた酵母の分離を行った。
[Test Example 1] "Primary screening"
Yeasts with excellent ethanol productivity at high temperatures were separated from various microbial sources.
(1) 「微生物源のスクリーニング」
秋田県内の土壌, 腐葉土, 花等を微生物源として採集し、それぞれ1gを試験管に取り、滅菌した水道水10mLを加えて懸濁した。
この懸濁液1mLを、YPD液体培地（酵母エキス1％, ポリペプトン2％, グルコース2％）10mLの入った試験管に加えて、37℃で2日間静置培養した。
その後、微生物の増殖が確認された試験管の培養液をサンプリングし、培養液中に含まれるエタノール濃度を測定した。そして、エタノール含有量が特に高かった培養液を選定した。
なお、ここで培養液中から検出されたエタノールは、YPD培地中のグルコースから微生物によって生産されたものと考えられる。
(1) “Screening of microbial sources”
Soil, humus, and flowers in Akita Prefecture were collected as microbial sources, 1 g each was taken into a test tube, and 10 mL of sterilized tap water was added and suspended.
1 mL of this suspension was added to a test tube containing 10 mL of YPD liquid medium (yeast extract 1%, polypeptone 2%,
Thereafter, the culture solution in a test tube in which the growth of microorganisms was confirmed was sampled, and the ethanol concentration contained in the culture solution was measured. A culture solution with a particularly high ethanol content was selected.
In addition, it is thought that ethanol detected from the culture solution here was produced by microorganisms from glucose in the YPD medium.
その結果、上記微生物源を添加した培養液のうち、土壌や腐葉土を添加した7種類の培養液から、高濃度のエタノール生成が確認された。
これらの培養液中には、エタノール発酵としては高温条件である37℃において、エタノール生産可能な微生物が含まれていると推測された。
As a result, high-concentration ethanol production was confirmed from seven types of culture liquids to which soil and humus soil were added, among the culture liquids to which the microorganism source was added.
These culture solutions were presumed to contain microorganisms capable of producing ethanol at 37 ° C., which is a high temperature condition for ethanol fermentation.
(2) 「菌の分離」
上記で選定した培養液を滅菌水で希釈し、YPD寒天培地に塗布し、37℃のインキュベーター中でプレート培養した。
培養開始から2日後に培地上にコロニーの形成が認められた。これらのうち、カビ以外でかつ形状が大きな酵母のコロニーを各微生物源について6個ずつ選定し（7種類の微生物源からなので計42個）、表1に記載の菌株として分離した。
(2) "Isolation of bacteria"
The culture solution selected above was diluted with sterilized water, applied to a YPD agar medium, and plated in a 37 ° C. incubator.
Colony formation was observed on the medium 2 days after the start of the culture. Among these, 6 colonies of yeasts other than molds and large in shape were selected for each microbial source (42 from a total of 7 microbial sources) and isolated as the strains listed in Table 1.
〔試験例2〕『二次スクリーニング』
試験例1で分離した酵母42菌株について、高温でのエタノール生産性と凝集性に優れた菌株の選定を行った。
[Test Example 2] “Secondary screening”
For the 42 yeast strains isolated in Test Example 1, strains excellent in ethanol productivity and aggregation at high temperatures were selected.
(1)「前培養」
50mL試験管に、無菌濾過したYPD液体培地（酵母エキス1％, ポリペプトン2％, グルコース5％）20mLを入れ、上記1次スクリーニングで選定した酵母菌株を1白金耳接種した。これを、恒温振盪培養装置にて37℃, 回転数80rpmの条件で24時間振盪培養した。
(1) Pre-culture
20 mL of sterile filtered YPD liquid medium (1% yeast extract, 2% polypeptone, 5% glucose) was placed in a 50 mL test tube, and 1 platinum loop of the yeast strain selected in the primary screening was inoculated. This was cultured with shaking in a constant temperature shaking culture apparatus at 37 ° C. and a rotation speed of 80 rpm for 24 hours.
(2)「温度による増殖能の評価」
次いで、上記(1)で調製した前培養液1mLを、YPD液体培地（酵母エキス1％, ポリペプトン2％, グルコース10％, pH6.4）10mLの入った試験管に加えて、37℃, 40℃, 45℃の各温度で2日間静置培養を行った。
培養後の増殖度合いについて、目視にて4段階で評価した。結果を表1に示した。なお、表中において、「+++」は顕著に増殖した、；「++」は通常に増殖した、；「+」は若干増殖、；「-」は全く増殖しない、；をそれぞれ示した。
(2) "Evaluation of growth ability by temperature"
Next, 1 mL of the preculture solution prepared in (1) above is added to a test tube containing 10 mL of YPD liquid medium (yeast extract 1%, polypeptone 2%,
The degree of growth after the culture was visually evaluated in four stages. The results are shown in Table 1. In the table, “+++” indicates prominent growth; “++” indicates normal growth; “+” indicates slight growth; “-” indicates no growth; .
(3)「エタノール生産性の評価」
上記(2)における37℃での静置培養液（発酵液）について、エタノール濃度を測定した。
また、測定値から、培地中グルコースからのエタノール収率（％）を算出した。これらの結果を表1に示した。
(3) "Evaluation of ethanol productivity"
The ethanol concentration of the stationary culture solution (fermented solution) at 37 ° C. in the above (2) was measured.
Moreover, the ethanol yield (%) from glucose in the medium was calculated from the measured value. These results are shown in Table 1.
(4)「凝集能の評価」
また、上記(2)における37℃での静置培養液（発酵液）について、試験管内における酵母の凝集性の有無を観察し、目視にて3段階で評価した。結果を表1に示した。なお、表中において、「++」は凝集した、；「+」は若干凝集した、；「-」は全く凝集しなかった、；をそれぞれ示した。
(4) "Evaluation of aggregation ability"
In addition, the stationary culture solution (fermentation solution) at 37 ° C. in (2) above was observed for the presence or absence of yeast cohesiveness in a test tube and evaluated visually in three stages. The results are shown in Table 1. In the table, “++” indicates aggregation, “+” indicates a slight aggregation, and “−” indicates no aggregation at all.
(5)「総合評価」
上記評価結果を総合的に判断して、SS4-3株, SS4-4株, SS4-5株, SS4-6株の4菌株には、高温でのエタノール生産性が高いことに加えて、発酵時に凝集性を有する優れた性質がある酵母であることが示された。
(5) "Comprehensive evaluation"
Based on the overall evaluation of the above evaluation results, the four strains SS4-3, SS4-4, SS4-5, and SS4-6 have high ethanol productivity at high temperatures and fermentation. It has been shown to be a yeast with excellent properties that sometimes have clumping properties.
〔試験例3〕『三次スクリーニング』
試験例2で選抜されたSS4-3株, SS4-4株, SS4-5株, SS4-6株の菌株について、エリアンサス（バイオマス原料）を糖化した液に対するエタノール生産性を評価した。
[Test Example 3] “Third screening”
Regarding the SS4-3 strain, SS4-4 strain, SS4-5 strain, and SS4-6 strain selected in Test Example 2, ethanol productivity with respect to a solution obtained by saccharifying Eliansus (biomass raw material) was evaluated.
(1)「エリアンサス糖化液の調製」
乾燥したエリアンサスを、カッターミル及びハンマーミルを用い、平均粒径約200μmとなるように粉砕した。次に、粉砕したエリアンサスを液体アンモニアに導入し、100℃, 6.3MPaのアンモニア中で処理を行った。
アンモニア処理後、pHを4.5に調整し、スラリー濃度5％のバイオマス懸濁液を得た。当該バイオマス懸濁液に糖化用酵素としてCelluclast 1.5 L及びNovozyme 188（共に登録商標, ノボザイムズ社製）を添加し、37℃で酵素糖化を行った。
酵素糖化後の懸濁液は、遠心分離及び濾過により固液分離し、得られた溶液をロータリーエバポレーターによりキシロース濃度が3％以上になるように濃縮し、‘エリアンサス糖化液’とした。
なお、得られた糖化液中のグルコース濃度は6.6％、キシロース濃度は3.2％であった
(1) "Preparation of Elianthus saccharified solution"
The dried Eliansus was pulverized using a cutter mill and a hammer mill to an average particle size of about 200 μm. Next, the ground Elianthus was introduced into liquid ammonia and treated in ammonia at 100 ° C. and 6.3 MPa.
After the ammonia treatment, the pH was adjusted to 4.5 to obtain a biomass suspension having a slurry concentration of 5%. Celluclast 1.5 L and Novozyme 188 (both registered trademarks, manufactured by Novozymes) were added to the biomass suspension as saccharification enzymes, and enzymatic saccharification was performed at 37 ° C.
The suspension after enzymatic saccharification was subjected to solid-liquid separation by centrifugation and filtration, and the resulting solution was concentrated by a rotary evaporator so that the xylose concentration became 3% or more to obtain an “Eliansus saccharified solution”.
The glucose concentration in the obtained saccharified solution was 6.6%, and the xylose concentration was 3.2%.
(2)「エリアンサス糖化液からのエタノール生産性の評価」
試験例2(1)で調製したSS4-3株, SS4-4株, SS4-5株, SS4-6株の前培養液1mLを、それぞれエリアンサス糖化液10mLの入った試験管に加えて、37℃で2日間静置培養を行った。
そして、得られた静置培養液（発酵液）について、エタノール濃度を測定した。
(2) "Evaluation of ethanol productivity from Elianthus saccharified solution"
Add 1mL of preculture solution of SS4-3 strain, SS4-4 strain, SS4-5 strain, SS4-6 strain prepared in Test Example 2 (1) to each test tube containing Elianthus saccharified solution 10mL, Static culture was performed at 37 ° C. for 2 days.
And the ethanol concentration was measured about the obtained stationary culture solution (fermentation liquid).
その結果、これらの中でも特に‘SS4-5株’には、エリアンサス糖化液に対するエタノール生産性が特に高いことが示された。
このことから、SS4-5株を用いることによって、バイオマス処理物であるエリアンサス糖化液から、バイオエタノール生産を極めて効率的にできることが示された。
なお、SS4-4株とSS4-5株とのエタノール生産量の経時変化を比較した結果を、図1に示した。
As a result, it was shown that, among these, “SS4-5 strain” in particular has a particularly high ethanol productivity with respect to Elianthus saccharified solution.
This indicates that by using SS4-5 strain, bioethanol production can be made extremely efficient from the Elianthus saccharified solution, which is a processed biomass.
Fig. 1 shows the results of comparison of changes in ethanol production over time between the SS4-4 strain and the SS4-5 strain.
〔試験例4〕『SS4-5株の菌学的性質』
上記選抜したSS4-5株酵母について、以下の試験により菌学的性質を調べた。
[Test Example 4] “Mycological properties of SS4-5 strain”
The above selected SS4-5 strain yeast was examined for mycological properties by the following test.
(1)「コロニーの形態的性質」
YM平板培地において、25℃で3日間培養後のコロニーの形態を観察した。コロニーの詳細な形態は表2に示す性質であった。
(1) "Morphological properties of colonies"
In YM plate medium, the morphology of the colonies after culturing at 25 ° C. for 3 days was observed. The detailed morphology of the colonies was the property shown in Table 2.
(2)「微視的観察」
顕微鏡下において微視的観察を行うため、SS4-5株をYM平板培地上で25℃下において培養を行った。
観察の結果、培養開始3日目の栄養細胞は、亜球形から円筒形であり、増殖は分裂によって行われること（分裂酵母であること）が確認された。
また、培養開始1ヶ月経過した後では、YM平板培地上に球形の子嚢胞子の形成が認められた。
(2) `` Microscopic observation ''
In order to perform microscopic observation under a microscope, the SS4-5 strain was cultured at 25 ° C. on a YM plate medium.
As a result of the observation, it was confirmed that the vegetative cells on the 3rd day from the start of the culture were subspherical to cylindrical, and that proliferation was carried out by division (fission yeast).
In addition, after one month from the start of culture, spherical ascospore formation was observed on the YM plate medium.
(3)「炭素源資化性試験」
SS4-5株の各種炭素源の資化性を調べ、結果を表3に示した。なお、表中において、「++」は資化性あり、；「+」は弱い資化性、；「-」は資化性なし、；を示す。
(3) “Carbon source utilization test”
The availability of various carbon sources of SS4-5 strain was examined, and the results are shown in Table 3. In the table, “++” indicates assimilability; “+” indicates weak assimilability; “-” indicates no assimilability;
その結果、SS4-5株は、グルコース、シュークロース、マルトース、ラフィノースに対する資化性を有することが確認された。この結果から、グルコース資化性を確認された。
なお、SS4-5株は、ヘミセルロースやペクチンの構成糖であるリボース、キシロース、アラビノースに対する資化性を示さなかった。
As a result, it was confirmed that the SS4-5 strain has assimilability to glucose, sucrose, maltose, and raffinose. From this result, glucose utilization was confirmed.
The SS4-5 strain did not show assimilation to ribose, xylose and arabinose, which are constituent sugars of hemicellulose and pectin.
(4)「糖類発酵性試験」
SS4-5株の各種糖類からのエタノール発酵性を調べ、結果を表4に示した。なお、表中において、「++」は発酵性あり、；「+」は弱い発酵性、；「-」は発酵性なし、；を示す。
(4) “Sugar Fermentability Test”
Ethanol fermentability from various saccharides of SS4-5 strain was examined, and the results are shown in Table 4. In the table, “++” indicates fermentability; “+” indicates weak fermentability; “-” indicates no fermentability;
その結果、SS4-5株は、グルコース, シュークロース, マルトースからのエタノール発酵能を有することが示された。また、メリビオース, ラフィノースからも弱い発酵性を有することが示された。
この結果から、SS4-5株には、グルコースからエタノール生産が可能であることが確認された。
また、各種糖類からのいずれの発酵中においても、SS4-5株は凝集性を示すことが確認された。
As a result, it was shown that the SS4-5 strain has ethanol fermentation ability from glucose, sucrose, and maltose. Melibiose and raffinose were also found to have weak fermentability.
From this result, it was confirmed that ethanol can be produced from glucose in the SS4-5 strain.
In addition, it was confirmed that the SS4-5 strain exhibited aggregability during any fermentation from various saccharides.
(5)「窒素源資化性試験」
SS4-5株の各種窒素源の資化性を調べ、結果を表5に示した。なお、表中において、「++」は資化性あり、；「+」は弱い資化性、；「-」は資化性なし、；を示す。
(5) Nitrogen source utilization test
The utilization of various nitrogen sources in SS4-5 strain was examined, and the results are shown in Table 5. In the table, “++” indicates assimilability; “+” indicates weak assimilability; “-” indicates no assimilability;
その結果、SS4-5株は、無機態窒素である硝酸、有機態窒素（アミノ酸）であるL-リジンの両方に対して、資化性を示さなかった。 As a result, the SS4-5 strain did not assimilate both nitric acid, which is inorganic nitrogen, and L-lysine, which is organic nitrogen (amino acid).
(6)「温度耐性試験」
SS4-5株について、37℃, 40℃, 42℃, 45℃での増殖能を調べることにより、温度耐性を調べた。試験は、試験例2(2)と同様の方法に準じて行い、培養後の増殖度合いを目視にて3段階で評価した。
なお、対照として、通常のエタノール生産に用いるSaccharomyces cerevisiae（至適発酵温度28℃）でも同様にして試験を行った。結果を表6に示した。
なお、表中において、「++」は増殖した、；「+」は若干増殖した、；「-」は全く増殖しなかった、；をそれぞれ示す。
(6) "Temperature resistance test"
The SS4-5 strain was examined for temperature resistance by examining the growth ability at 37 ° C, 40 ° C, 42 ° C, and 45 ° C. The test was performed according to the same method as in Test Example 2 (2), and the degree of proliferation after culture was visually evaluated in three stages.
As a control, Saccharomyces cerevisiae (optimum fermentation temperature 28 ° C.) used for normal ethanol production was also tested in the same manner. The results are shown in Table 6.
In the table, “++” indicates proliferation; “+” indicates slight proliferation; “-” indicates no proliferation;
その結果、SS4-5株は、40℃でも好適な増殖を示し、さらに42℃でも増殖性を有することが確認された。
一方、通常のエタノール生産に用いる酵母であるS. cerevisiaeでは、37℃以上では全く増殖しないことが確認された。
As a result, it was confirmed that the SS4-5 strain showed a suitable growth even at 40 ° C. and further had a growth ability even at 42 ° C.
On the other hand, it was confirmed that S. cerevisiae, a yeast used for normal ethanol production, did not grow at all at 37 ° C or higher.
〔試験例5〕『SS4-5株の種同定』
上記選抜したSS4-5株の種の同定を行った。
[Test Example 5] “Speciation identification of SS4-5 strain”
The species of the selected SS4-5 strain was identified.
(1)「形態観察」
簡易形態観察の結果、SS4-5株は、Schizosaccharomyces japonicusの形態学的特徴（Kutzman, 2011）と一致する形態的特徴を有することが示された。
(1) Morphological observation
As a result of simple morphological observation, it was shown that the SS4-5 strain has morphological characteristics consistent with the morphological characteristics of Schizosaccharomyces japonicus (Kutzman, 2011).
(2)「26SrDNA-D1/D2領域塩基配列の決定」
SS4-5株を試験例2(1)と同様にしてYPD液体培地にて振盪培養した後、回収した菌体からのDNA抽出を行った。
そして、26SrDNA-D1/D2領域のユニバーサルプライマーセット（配列番号2,3で示すプライマーセット）を用いてPCRを行い、PCR産物をダイレクトシーケンスして、SS4-5株の26SrDNA-D1/D2領域の塩基配列（配列番号1）を決定した。
(2) "Determining the nucleotide sequence of 26SrDNA-D1 / D2 region"
The SS4-5 strain was shake-cultured in a YPD liquid medium in the same manner as in Test Example 2 (1), and then DNA was extracted from the collected cells.
Then, PCR was performed using the universal primer set of the 26SrDNA-D1 / D2 region (primer set shown by SEQ ID NO: 2 and 3), the PCR product was directly sequenced, and the 26SrDNA-D1 / D2 region of the SS4-5 strain was The base sequence (SEQ ID NO: 1) was determined.
次いで、決定した塩基配列についてのBLAST相同性検索を行った。
アポロンDB-FUに対するBLASTサーチ（Altshul, 1997）の結果、SS4-5株の26SrDNA-D1/D2領域の塩基配列は、子嚢菌系の分裂酵母の一種であるSchizosaccharomyces japonicusの基準株であるNRRL Y1361T株の26SrDNA-D1/D2領域塩基配列（Accession number：U94943）と、完全一致する（100％の相同性を有する）ことが示された。
Subsequently, a BLAST homology search was performed on the determined base sequence.
As a result of BLAST search (Altshul, 1997) for Apollon DB-FU, the nucleotide sequence of the 26SrDNA-D1 / D2 region of SS4-5 strain is NRRL Y1361T, which is a reference strain of Schizosaccharomyces japonicus, a kind of ascomycetous fission yeast. It was shown to be completely identical (having 100% homology) with the 26S rDNA-D1 / D2 region nucleotide sequence (Accession number: U94943) of the strain.
また、GenBank/DDBJ/EMBLのデーターベースに対するBLASTサーチの結果、SS4-5株の26SrDNA-D1/D2領域の塩基配列は、S. japonicusの26SrDNA-D1/D2領域として登録されている多数の塩基配列に対して、97.8〜100％の相同性を有することが示された。 As a result of BLAST search against the GenBank / DDBJ / EMBL database, the base sequence of the 26SrDNA-D1 / D2 region of the SS4-5 strain is a large number of bases registered as the 26SrDNA-D1 / D2 region of S. japonicus. It was shown to have 97.8-100% homology to the sequence.
(3)「種の同定」
これらの結果から総合的に判断し、SS4-5株はSchizosaccharomyces japonicusに帰属する新規の酵母菌株であると判断された。そこで、当該菌株をSchizosaccharomyces japonicus SS4-5株と命名した。
なお、当該菌株は、2012年1月27日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構（千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）に、受託番号 NITE P-1197としてSS4-5の名称で寄託が認められた菌株である。
(3) `` Identification of species ''
Judging comprehensively from these results, the SS4-5 strain was determined to be a novel yeast strain belonging to Schizosaccharomyces japonicus. Therefore, the strain was named Schizosaccharomyces japonicus SS4-5 strain.
In addition, the name of the strain is SS4-5 as trustee number NITE P-1197 to the National Institute of Technology and Evaluation (2-5-8 Kazusa-Kamashita, Kisarazu-shi, Chiba) on January 27, 2012. The strain was deposited in
〔実施例1〕『高温条件でのエタノール生産』
SS4-5株を用いて、発酵との同時蒸留が可能な高温条件（44℃）でのエタノール生産が可能かを検証した。
[Example 1] "Ethanol production under high temperature conditions"
Using SS4-5 strain, it was verified whether ethanol production was possible under high temperature conditions (44 ℃) where simultaneous distillation with fermentation was possible.
(1)「前培養」
500mL三角フラスコに、YPD液体培地（酵母エキス1％, ポリペプトン2％, グルコース2％）100mLを入れ、オートクレーブで121℃, 15分間滅菌した。当該液体培地にSS4-5株を1白金耳植菌し、これを、恒温振盪培養装置にて37℃, 回転数120rpmの条件で24時間振盪培養した。
(1) Pre-culture
A 500 mL Erlenmeyer flask was charged with 100 mL of YPD liquid medium (yeast extract 1%, polypeptone 2%,
(2)「エタノール生産性の評価」
上記方法で得られた前培養液について、無菌的に3,000rpmで遠心分離を行って、沈殿した菌体を回収し、YPD液体培地（酵母エキス1％, ポリペプトン2％, グルコース7％, pH6.4）100mLの入った500mL三角フラスコに入れた。
これを44℃、80rpmにて振盪培養することでエタノール発酵を行い、経時的にエタノール濃度を測定した。結果を図2に示した。
(2) “Evaluation of ethanol productivity”
The preculture solution obtained by the above method is aseptically centrifuged at 3,000 rpm to collect the precipitated cells, and YPD liquid medium (yeast extract 1%, polypeptone 2%, glucose 7%, pH 6. 4) Place in a 500 mL Erlenmeyer flask containing 100 mL.
This was subjected to ethanol fermentation by shaking culture at 44 ° C. and 80 rpm, and the ethanol concentration was measured over time. The results are shown in FIG.
その結果、44℃で約22時間の発酵により、約32g/L(w/v)のエタノールが生成されることが示された。当該培地中グルコースからのエタノール収率は約89.6％であった。
このことから、SS4-5株を用いることによって、通常の酵母ではエタノール発酵が不可能である44℃という高温条件（発酵との同時蒸留が可能な温度条件）においても、効率的なエタノール生産が可能であることが示された。
As a result, it was shown that about 32 g / L (w / v) of ethanol was produced by fermentation at 44 ° C. for about 22 hours. The ethanol yield from glucose in the medium was about 89.6%.
Therefore, by using the SS4-5 strain, efficient ethanol production can be achieved even under high temperature conditions of 44 ° C (temperature conditions that allow simultaneous distillation with fermentation) where ethanol fermentation is not possible with normal yeast. It was shown to be possible.
〔実施例2〕『低pH条件でのエタノール生産』
SS4-5株を用いて、雑菌の増殖抑制に有効な低pH条件でのエタノール生産が可能かを検証した。
[Example 2] "Ethanol production under low pH conditions"
Using SS4-5 strain, it was verified whether ethanol production was possible under low pH conditions effective in suppressing the growth of various bacteria.
(1)「前培養」
500mL三角フラスコに、YPD液体培地（酵母エキス1％, ポリペプトン2％, グルコース2％）100mLを入れ、オートクレーブで121℃, 15分間滅菌した。当該液体培地にSS4-5株を1白金耳植菌し、これを、恒温振盪培養装置にて37℃, 回転数120rpmの条件で24時間振盪培養した。
(1) Pre-culture
A 500 mL Erlenmeyer flask was charged with 100 mL of YPD liquid medium (yeast extract 1%, polypeptone 2%,
(2)「エタノール生産性の評価」
YPD液体培地として、pHを3, 4, 5, 6, 7にそれぞれ調製したYPD液体培地を用いたことを除いては、実施例1(2)に記載の方法と同様にして44℃でのエタノール発酵を行い、経時的にエタノール濃度を測定した。結果を図3に示した。
(2) “Evaluation of ethanol productivity”
As the YPD liquid medium, except that the YPD liquid medium adjusted to
その結果、pH5〜7の条件においては、ほぼエタノール生産性に差違はなく、44℃で約23時間の発酵により、約30〜31g/L(w/v)のエタノールが生成されることが示された。当該培地中グルコースからのエタノール収率は約84.0〜86.8％であった。
また、pH3の条件では、約23時間の発酵により、約28g/L(w/v)のエタノールが生成されることが示された。当該培地中グルコースからのエタノール収率は約78.4％であった。
As a result, under the conditions of pH 5-7, there is almost no difference in ethanol productivity, and it is shown that about 30-31 g / L (w / v) ethanol is produced by fermentation at 44 ° C for about 23 hours. It was done. The ethanol yield from glucose in the medium was about 84.0-86.8%.
Moreover, it was shown that about 28 g / L (w / v) ethanol was produced by fermentation for about 23 hours under the condition of pH3. The ethanol yield from glucose in the medium was about 78.4%.
このことから、SS4-5株を用いることで、pH3〜4という強い酸性条件（雑菌の増殖抑制に有効条件）でのエタノール生産が可能であり、発酵速度は緩やかになるものの中性付近の条件と同レベルのエタノール生産が可能であることが示された。
Therefore, by using SS4-5 strain, ethanol production is possible under strong acidic conditions of
〔実施例3〕『エリアンサス糖化液からの高温でのエタノール生産』
SS4-5株を用いて、エリアンサス（バイオマス原料）を糖化した液からの高温条件でのエタノール生産が可能かを検証した。
[Example 3] "Ethanol production from Elianthus saccharified solution at high temperature"
Using SS4-5 strain, we verified whether it is possible to produce ethanol under high temperature conditions from a solution obtained by saccharifying Eliansus (biomass raw material).
(1)「前培養」
実施例1(1)に記載の方法と同様にして振盪培養を行い、SS4-5株の培養液100mLを調製した。
(1) Pre-culture
Shaking culture was performed in the same manner as described in Example 1 (1) to prepare 100 mL of the SS4-5 strain culture solution.
(2)「エタノール生産性の評価」
YPD液体培地の代わりに、試験例3(1)で調製したエリアンサス糖化液（グルコース濃度6.6％、キシロース濃度3.2％）を用いたことを除いては、実施例1(2)に記載の方法と同様にして、44℃でのエタノール発酵を行い、経時的にエタノール濃度を測定した。結果を図4に示した。
(2) “Evaluation of ethanol productivity”
The method described in Example 1 (2) except that the Elianth saccharified solution (glucose concentration 6.6%, xylose concentration 3.2%) prepared in Test Example 3 (1) was used instead of the YPD liquid medium. In the same manner as above, ethanol fermentation at 44 ° C. was performed, and the ethanol concentration was measured over time. The results are shown in FIG.
その結果、44℃で約17時間の発酵により約27.5g/L(w/v)のエタノールが生成されることが示された。当該培地中グルコースのエタノール収率は約81.7％であった。
このことから、SS4-5株を用いることによって、44℃という高温条件においても、エリアンサス糖化液中のグルコースからエタノール生産が可能であることが示された。
As a result, it was shown that about 27.5 g / L (w / v) of ethanol was produced by fermentation at 44 ° C. for about 17 hours. The ethanol yield of glucose in the medium was about 81.7%.
From this, it was shown that ethanol can be produced from glucose in the Elianthus saccharified solution by using the SS4-5 strain even under a high temperature condition of 44 ° C.
〔実施例4〕『エタノールの連続生産』
SS4-5株を用いて、高温条件でのエタノール連続生産が可能かを検証した。
[Example 4] "Continuous production of ethanol"
Using SS4-5 strain, it was verified whether ethanol can be continuously produced under high temperature conditions.
(1)「前培養」
実施例1(1)に記載の方法と同様にして振盪培養を行い、SS4-5株の培養液100mLを調製した。
(1) Pre-culture
Shaking culture was performed in the same manner as described in Example 1 (1) to prepare 100 mL of the SS4-5 strain culture solution.
(2)「連続繰り返し発酵によるエタノール生産性の評価」
上記方法で得られた前培養液について、無菌的に3,000rpmで遠心分離を行って、沈殿した菌体を回収し、YPD液体培地（酵母エキス1％, ポリペプトン2％, グルコース7％, pH6.4）100mLの入った500mL三角フラスコに入れた。
これを42℃, 80rpmにて振盪培養することで約22時間のエタノール発酵を行った。その後、約22時間ごとに培地交換を行い（5回目の発酵の時のみ約5時間で交換を行い）、合計9回連続して、繰り返しエタノール生産を行った。
また、発酵中においては、経時的にエタノール濃度を測定した。結果を図5に示した。
(2) "Evaluation of ethanol productivity by continuous repeated fermentation"
The preculture solution obtained by the above method is aseptically centrifuged at 3,000 rpm to collect the precipitated cells, and YPD liquid medium (yeast extract 1%, polypeptone 2%, glucose 7%, pH 6. 4) Place in a 500 mL Erlenmeyer flask containing 100 mL.
This was subjected to ethanol fermentation for about 22 hours by shaking culture at 42 ° C. and 80 rpm. Thereafter, the medium was changed about every 22 hours (only about the 5th fermentation was changed in about 5 hours), and ethanol production was repeated 9 times in total.
During fermentation, the ethanol concentration was measured over time. The results are shown in FIG.
その結果、培地交換を連続的に繰り返して発酵を行った場合においても、グルコースからエタノールを効率良く生産できることが示された。また、少なくとも9回の連続発酵が可能であることが示された。
これは、SS4-5株の優れた凝集性により奏される効果であり、培地交換の際の菌体ロスが顕著に防止できることが実証された。
As a result, it was shown that ethanol can be efficiently produced from glucose even when fermentation is performed by continuously repeating medium exchange. It was also shown that at least 9 continuous fermentations are possible.
This is an effect exerted by the excellent aggregability of the SS4-5 strain, and it was proved that the cell loss at the time of medium exchange can be remarkably prevented.
〔実施例5〕『二段階発酵法への応用』
SS4-5株と、Pichia stipitis SS39-1株（キシロースからのエタノール生産能を有する酵母）を用いて、2段階発酵法によるエタノール生産が可能かを検証した。
[Example 5] “Application to two-stage fermentation”
Using the SS4-5 strain and the Pichia stipitis SS39-1 strain (yeast capable of producing ethanol from xylose), it was verified whether ethanol production by a two-stage fermentation method was possible.
(1)「前培養」
実施例1(1)に記載の方法と同様にして振盪培養を行い、SS4-5株の培養液100mLを調製した。
(1) Pre-culture
Shaking culture was performed in the same manner as described in Example 1 (1) to prepare 100 mL of the SS4-5 strain culture solution.
(2)「エタノール生産性の評価」
上記方法で得られた前培養液について、無菌的に3,000rpmで遠心分離を行って、沈殿した菌体を回収し、YPD液体培地（酵母エキス1％, ポリペプトン2％, グルコース7％, キシロース5％）100mLの入った500mLナス型フラスコに入れた。
これを、44℃でマグネチックスターラーを用いて撹拌しながら培養することで、グルコース（6炭糖類）からのエタノール発酵（一次発酵）を行った。なお、発酵はエバポレーターで減圧蒸留しながら行った。
一次発酵終了後、培養液を無菌的に回収し、得られた培養液を滅菌済みの500mL三角フラスコに入れた。
そこへ、Pichia stipitis SS39-1株を植菌して、28℃, 80rpmにて振盪培養することで、キシロース（5炭糖類）からのエタノール発酵（二次発酵）を行った。
なお、発酵中においては、培地中のエタノール濃度, グルコース濃度, キシロース濃度を経時的に測定した。これらの結果を図6に示した。
(2) “Evaluation of ethanol productivity”
The preculture solution obtained by the above method is aseptically centrifuged at 3,000 rpm to collect the precipitated cells, and YPD liquid medium (yeast extract 1%, polypeptone 2%, glucose 7%,
This was cultured with stirring at 44 ° C. using a magnetic stirrer to perform ethanol fermentation (primary fermentation) from glucose (6-carbon sugar). In addition, fermentation was performed while distilling under reduced pressure with an evaporator.
After completion of the primary fermentation, the culture solution was aseptically collected, and the obtained culture solution was placed in a sterilized 500 mL Erlenmeyer flask.
The Pichia stipitis SS39-1 strain was inoculated there, and the ethanol fermentation (secondary fermentation) from xylose (5-carbon sugar) was performed by shaking culture at 28 degreeC and 80 rpm.
During fermentation, the ethanol concentration, glucose concentration, and xylose concentration in the medium were measured over time. These results are shown in FIG.
その結果、SS4-5株を用いて一次発酵を44℃（高温）で行うことにより、一次発酵（グルコースからの発酵）を行いながら同時にエタノール蒸留できることが示された。
これにより、一次発酵終了後に、培地中からのエタノール除去工程（従来法では必須の工程）を行うことなく、直接二次発酵（キシロースからの発酵）が可能となることが示された。
As a result, it was shown that by performing primary fermentation at 44 ° C. (high temperature) using SS4-5 strain, ethanol distillation can be performed simultaneously with primary fermentation (fermentation from glucose).
Thereby, it was shown that direct secondary fermentation (fermentation from xylose) can be performed without performing an ethanol removal step (indispensable step in the conventional method) from the medium after the end of primary fermentation.
また、本試験においては、一次発酵によるグルコースからのエタノール収率93％であり、二次発酵によるキシロースからのエタノール収率は90％であった。
また、一次発酵完了に要した時間は約6時間であり、二次発酵まで完全に完了した時間は合計約23時間であった。
In this test, the ethanol yield from glucose by primary fermentation was 93%, and the ethanol yield from xylose by secondary fermentation was 90%.
The time required for completing the primary fermentation was about 6 hours, and the time for complete completion of the secondary fermentation was about 23 hours in total.
〔実施例6〕『2段階発酵法への応用』
エリアンサス（バイオマス原料）を糖化した液から、二段階発酵法によるエタノール生産が可能かを検証した。
[Example 6] "Application to two-stage fermentation method"
We verified whether it is possible to produce ethanol by saccharification of Eliansus (biomass raw material) by a two-stage fermentation method.
(1)「前培養」
実施例1(1)に記載の方法と同様にして振盪培養を行い、SS4-5株の培養液100mLを調製した。
(1) Pre-culture
Shaking culture was performed in the same manner as described in Example 1 (1) to prepare 100 mL of the SS4-5 strain culture solution.
(2)「エタノール生産性の評価」
YPD液体培地の代わりに、試験例3(1)で調製したエリアンサス糖化液（グルコース濃度6.6％、キシロース濃度3.2％）を用いたことを除いては、実施例5(2)に記載の方法と同様にして、44℃での一次発酵と28℃での二次発酵を行い、エタノール濃度, グルコース濃度, キシロース濃度を経時的に測定した。結果を図7に示した。
(2) “Evaluation of ethanol productivity”
The method described in Example 5 (2) except that the Elianth saccharified solution (glucose concentration 6.6%, xylose concentration 3.2%) prepared in Test Example 3 (1) was used instead of the YPD liquid medium. In the same manner, primary fermentation at 44 ° C. and secondary fermentation at 28 ° C. were performed, and ethanol concentration, glucose concentration, and xylose concentration were measured over time. The results are shown in FIG.
その結果、エリアンサス糖化液を原料に用いた場合でも、二段階発酵法によるエタノール生産が可能であることが実証された。
また、本試験においては、一次発酵によるグルコースからのエタノール収率は90％であり、二次発酵によるキシロースからのエタノール収率は75％であった。
また、一次発酵完了に要した時間は約7時間であり、二次発酵まで完全に完了した時間は合計約29時間であった。
As a result, it was demonstrated that ethanol production by a two-stage fermentation method is possible even when Elianthus saccharified liquid is used as a raw material.
In this test, the ethanol yield from glucose by primary fermentation was 90%, and the ethanol yield from xylose by secondary fermentation was 75%.
The time required for completing the primary fermentation was about 7 hours, and the time required for complete completion of the secondary fermentation was about 29 hours in total.
本発明により、エタノール製造を極めて効率良く行うことを可能とする、高温発酵性の凝集性新規酵母の提供が可能とする。
これにより本発明は、セルロース系バイオマス原料からのバイオエタノール製造に最適な、二段階発酵法の実用化に貢献する技術となることが期待される。
According to the present invention, it is possible to provide a high-temperature fermentable flocculating novel yeast that enables ethanol production to be carried out extremely efficiently.
Thus, the present invention is expected to be a technology that contributes to the practical application of the two-stage fermentation method, which is optimal for bioethanol production from cellulosic biomass raw materials.
ＮＩＴＥ Ｐ−１１９７ NITE P-1197
Claims (8)
(1) グルコースからのエタノール発酵において、以下に記載の性質を有する性質。
(1-1) 37〜44℃にて至適にエタノール発酵できる性質。
(1-2) pH3〜7にて至適にエタノール発酵できる性質。
(1-2) エタノール発酵時に凝集する性質。
(2) 26SrDNA-D1/D2領域の塩基配列として、配列番号1に記載の塩基配列, 又は, 配列番号1に記載の塩基配列と97％以上の相同性を示す塩基配列, をゲノムDNA中に有する性質。
(3) 以下に記載の資化性及び非資化性を有する性質。
(3-1) グルコース, シュークロース, マルトース, 又はラフィノースを資化できる性質。
(3-2) ガラクトース, L-ソルボース, D-グルコサミン, D-リボース, D-キシロース, L-アラビノース, D-アラビノース, L-ラムノース, トレハロース, αメチル-D-グルコシド, セロビオース, サリシン, メリビオース, ラクトース, メレチトース, 可溶性デンプン, グリセロール, エリスリトール, リビトール, D-グルコン酸, エタノール, 硝酸, 又はL-リジンを資化できない性質。
(4) 以下に記載のエタノール発酵性及び非発酵性を有する性質。
(4-1) グルコース, シュークロース, 又はマルトースを基質としてエタノール発酵できる性質。
(4-2) ガラクトース又はラクトースを基質としてエタノール発酵できない性質。
(5) YM平板培地において25℃で3日間培養後に形成されたコロニーが、以下に記載の形態を示す性質。
(5-1) 周縁が全縁であり、周縁部が扁平で中央部がクッション形である性質
(5-2) 表面が平滑であり、バター様で湿性のある性質。
(5-3) コロニーの色調が白色からクリーム色である性質。
(6) 以下に記載の細胞的性質を有する性質。
(6-1) 栄養細胞が亜球形から円筒形である性質。
(6-2) 分裂によって増殖する性質。
(6-3) 子嚢胞子の形状が球形である性質。 Yeast belonging to Schizosaccharomyces japonicus, characterized by having the mycological properties described in (1) to (6) below.
(1) Properties having the following properties in ethanol fermentation from glucose.
(1-1) The property of optimal ethanol fermentation at 37-44 ° C.
(1-2) The property of optimal ethanol fermentation at pH 3-7.
(1-2) The nature of aggregation during ethanol fermentation.
(2) As the nucleotide sequence of the 26SrDNA-D1 / D2 region, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or the nucleotide sequence showing 97% or more homology with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in genomic DNA Properties that have.
(3) Properties having assimilation and non-assimilability as described below.
(3-1) Properties that can assimilate glucose, sucrose, maltose, or raffinose.
(3-2) Galactose, L-sorbose, D-glucosamine, D-ribose, D-xylose, L-arabinose, D-arabinose, L-rhamnose, trehalose, α-methyl-D-glucoside, cellobiose, salicin, melibiose, Properties that cannot assimilate lactose, meletitose, soluble starch, glycerol, erythritol, ribitol, D-gluconic acid, ethanol, nitric acid, or L-lysine.
(4) Properties having ethanol fermentability and non-fermentability as described below.
(4-1) A property that enables ethanol fermentation using glucose, sucrose, or maltose as a substrate.
(4-2) The property that ethanol fermentation cannot be performed using galactose or lactose as a substrate.
(5) The property that the colonies formed after 3 days of culturing at 25 ° C. in a YM plate medium exhibit the following forms.
(5-1) The property that the periphery is all edges, the periphery is flat and the center is cushioned
(5-2) Smooth surface, butter-like and wet properties.
(5-3) The property that the color of the colony is white to cream.
(6) Properties having cellular properties described below.
(6-1) The nature of vegetative cells from subspherical to cylindrical.
(6-2) Proliferation by division.
(6-3) The nature of the ascospore is spherical.
(A) 37〜44℃にて至適にエタノール発酵できる性質。
(B) pH3〜7にて至適にエタノール発酵できる性質。
(C) エタノール発酵時に凝集する性質。 In the ethanol fermentation from glucose, the mutant derived from Schizosaccharomyces japonicus SS4-5 (accession number NITE P-1197), characterized by having the mycological properties described in (A) to (C) below A certain yeast.
(A) Properties capable of optimal ethanol fermentation at 37-44 ° C.
(B) Properties capable of optimal ethanol fermentation at pH 3-7.
(C) The property of aggregation during ethanol fermentation.
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