JP2013179849A - Laccase and method for producing epitheaflagallin using the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ラッカーゼ及びそれを用いたエピテアフラガリンの製造方法に関する。本発明は、より詳細には、新規なラッカーゼ、新規なラッカーゼをコードするポリ核酸化合物、このポリ核酸化合物を含む形質転換体等、新規なラッカーゼの製造方法、新規なラッカーゼを用いたエピテアフラガリンの製造方法に関する。 The present invention relates to a laccase and a method for producing epiteaflagalin using the same. More specifically, the present invention relates to a novel laccase, a polynucleic acid compound encoding the novel laccase, a transformant containing the polynucleic acid compound, and the like, a method for producing the novel laccase, and an epitheafraga using the novel laccase. The present invention relates to a method for producing phosphorus.
茶カテキンあるいはそれを含有する緑茶は、既に多くの機能性を示す研究報告がなされており、有用な機能性食品として認められている。茶カテキンの主成分は、エピカテキン(EC)、エピガロカテキン(EGC)、エピカテキンガレート(ECg)、エピガロカテキンガレート(EGCg)の4種類であり、特に緑茶エキスはEGCg等の渋み成分の含有量が多い。 Tea catechins or green tea containing them have already been reported as useful functional foods, with many reports showing functionality. The main components of tea catechin are epicatechin (EC), epigallocatechin (EGC), epicatechin gallate (ECg), epigallocatechin gallate (EGCg), especially green tea extract is an astringent ingredient such as EGCg. High content.
緑茶カテキンを没食子酸の存在下、ラッカーゼで酸化させるとエピテアフラガリン3-Ｏ-ガレート(ETFGg)などのエピテアフラガリン類の含量を高めることができる。これは緑茶カテキンに含まれるEGCgの持つピロガロール基と没食子酸からベンゾトロポロン環が形成され、ETFGgが生産される為である。 Oxidation of green tea catechins with laccase in the presence of gallic acid can increase the content of epithea fragalins such as epithea fragalin 3-O-gallate (ETFGg). This is because the benzotropolone ring is formed from the pyrogallol group of EGCg contained in green tea catechin and gallic acid, and ETFGg is produced.
ETFGgなどのエピテアフラガリン類は、高い抗酸化能、膵リパーゼ阻害による中性脂肪吸収抑制作用、糖の吸収抑制作用、がん転移抑制作用など、生活習慣病やメタボリックシンドロームを抑制する優れた機能が確認されている（例えば、特許文献１）。さらに口腔関連では、虫歯、歯周病予防作用を示すことが明らかになっている（例えば、特許文献２、３）。 Epitheaflagalins such as ETFGg have excellent anti-oxidant ability, suppress neutral fat absorption by inhibiting pancreatic lipase, suppress absorption of sugar, suppress cancer metastasis, etc., and suppress lifestyle-related diseases and metabolic syndrome The function has been confirmed (for example, Patent Document 1). Furthermore, in the oral cavity, it has been revealed that it has a caries and periodontal disease prevention effect (for example, Patent Documents 2 and 3).
本発明者らは、先に、食品に直接利用できるエピテアフラガリン及びエピテアフラガリン-3-Ｏ-ガレートの簡便な製造方法、並びにこの製造方法を利用したエピテアフラガリン及びエピテアフラガリン-3-Ｏ-ガレートを含有する飲料の製造方法を提供した（特許文献４、非特許文献１）。この方法は、食品として使用が認められている各種ポリフェノールオキシダーゼや食品添加物として認められている没食子酸を利用して、緑茶等の風味を損なうことなくエピテアフラガリン類を製造する方法である。 The present inventors previously described a simple method for producing epithea fragalin and epithea fragalin-3-O-gallate that can be directly used in foods, and epithea fragalin and epithea fragaga using this production method. A method for producing a beverage containing phosphorus-3-O-gallate was provided (Patent Document 4, Non-Patent Document 1). This method uses various polyphenol oxidases approved for use as foods and gallic acid recognized as a food additive to produce epithea fragalins without impairing the flavor of green tea or the like. .
特許文献１及び非特許文献１に記載の方法は、ポリフェノールオキシダーゼとしてラッカーゼを用いる。特許文献１及び非特許文献１では、ラッカーゼとして市販のラッカーゼダイワY120(トラメテス(Trametes)属由来、大和化成株式会社)を用いていた。本発明者らは、この酵素を用いて、エピテアフラビン類高含有茶エキスの商品化を目的として、緑茶エキスからのエピテアフラガリン類の製造について検討した。しかし、上記ラッカーゼダイワY120を用いる方法は、実用的なレベルでは、エピテアフラビン類の生産性が低いことが判明した。 The methods described in Patent Document 1 and Non-Patent Document 1 use laccase as polyphenol oxidase. In Patent Document 1 and Non-Patent Document 1, a commercially available laccase Daiwa Y120 (derived from the genus Trametes, Daiwa Kasei Co., Ltd.) was used as the laccase. The present inventors examined the production of epithea fragalins from green tea extract for the purpose of commercializing epiteaflavin-rich tea extracts using this enzyme. However, it has been found that the method using Laccase Daiwa Y120 has low productivity of epitheaflavins at a practical level.
そこで本発明は、緑茶カテキンを没食子酸の存在下、酸化させてエピテアフラガリン3-Ｏ-ガレート(ETFGg)などのエピテアフラガリン類の含量を高める方法において、生産性が高い新たなラッカーゼを提供すること、さらにはこのラッカーゼを用いたエピテアフラガリン及びエピテアフラガリン-3-Ｏ-ガレートの製造方法、並びにこの製造方法を利用したエピテアフラガリン及びエピテアフラガリン-3-Ｏ-ガレートを含有する飲料の製造方法を提供することにある。 Accordingly, the present invention provides a new laccase having high productivity in a method for oxidizing green tea catechins in the presence of gallic acid to increase the content of epitheafragalins such as epitheafragalin 3-O-gallate (ETFGg). In addition, a method for producing epiteafragalin and epitheafragalin-3-O-gallate using the laccase, and epitheafragalin and epitheafragalin-3-using the production method are provided. The object is to provide a method for producing a beverage containing O-gallate.
上記課題を解決すべく、約１５０株の菌体から、上記反応に適した新たなラッカーゼのスクリーニングを行った。その結果、担子菌類に属する菌体から、上記課題を解決できる新たなラッカーゼを見出して本発明を完成させた。 In order to solve the above problems, a new laccase suitable for the above reaction was screened from about 150 bacterial cells. As a result, the present invention was completed by finding a new laccase capable of solving the above problems from bacterial cells belonging to basidiomycetes.
本発明によれば、緑茶カテキンを没食子酸の存在下、酸化させてエピテアフラガリン3-Ｏ-ガレート(ETFGg)などのエピテアフラガリン類の含量を高める方法において使用できる、生産性が高い新たなラッカーゼを提供することができる。さらに本発明によれば、このラッカーゼを用い、高い生産性での、エピテアフラガリン及びエピテアフラガリン-3-Ｏ-ガレートの製造方法、並びにこの製造方法を利用したエピテアフラガリン及びエピテアフラガリン-3-Ｏ-ガレートを含有する飲料の製造方法の提供が可能である。 According to the present invention, green tea catechin is oxidized in the presence of gallic acid, and can be used in a method for increasing the content of epitheafragalins such as epitheafragalin 3-O-gallate (ETFGg), which has high productivity. New laccase can be provided. Furthermore, according to the present invention, there is provided a method for producing epitheaflavalin and epiteafragalin-3-O-gallate with high productivity using this laccase, as well as epitheafragalin and epithelium using this production method. It is possible to provide a method for producing a beverage containing theaflavalin-3-O-gallate.
＜新規ラッカーゼのスクリーニング＞
151株の担子菌及び糸状菌を購入し、探索対象とした(実施例の表３)。
全151株中、37株は培養がうまくいかず菌体が生育しなかったため、酵素液の抽出及び活性測定を行うことが出来なかった。残りの114株については培養した菌体の抽出液についてラッカーゼ活性を測定した。そのうち70株にラッカーゼ活性がみられた。その中でも特に、トラメテス・ベルシカラー（Trametes versicolor）、トラメテス・オリエンタリス（Trametes orientalis）、アガリカス・ビスポラス（Agaricus bisporus）由来の菌体の抽出液が強いラッカーゼ活性を示した。
<Screening of new laccase>
151 strains of basidiomycetes and filamentous fungi were purchased and searched (Table 3 in the Examples).
Of all 151 strains, 37 strains could not be cultured and the bacterial cells did not grow, so the enzyme solution could not be extracted and the activity could not be measured. For the remaining 114 strains, the laccase activity of the cultured bacterial cell extract was measured. Among them, 70 strains showed laccase activity. Among them, in particular, extracts of cells derived from Trametes versicolor, Trametes orientalis, and Agaricus bisporus showed strong laccase activity.
これらの高活性を示した株が変換実験に適していると考え、この測定結果を元に、EGCg及び緑茶エキスを用いたETFGgの生産を行った。その結果、ETFGgの生産性が高かった10株を選択した。この結果(実施例の表４)から、ヘリシウム・コラロイデス（Hericium coralloides）由来の酵素が緑茶カテキンを効率的に変換するのに適していると考えH.コラロイデス(coralloides)より、目的のラッカーゼを精製し、その諸性質の決定を行った。その結果、151株のラッカーゼ生産菌の中から、唯一、本発明の新規ラッカーゼが得られた。 Based on these measurement results, ETFGg was produced using EGCg and green tea extract, considering that these high activity strains were suitable for conversion experiments. As a result, 10 strains with high ETFGg productivity were selected. From this result (Table 4 in the Examples), the enzyme derived from Helicium coralloides is considered to be suitable for efficiently converting green tea catechins, and the target laccase is purified from H. coralloides. The properties were determined. As a result, the novel laccase of the present invention was obtained from 151 strains of laccase-producing bacteria.
＜新規ラッカーゼ>
本発明の新規ラッカーゼは、下記の理化学的性質を有する、ラッカーゼである。
（i）分子量：67.2kDa（SDS-PAGE）
（ii）サブユニット構造：単量体
（iii）至適pH：pH4.5
（iv）天然型酵素のN末端アミノ酸配列：
Ala - Ile - Gly - Pro - Val - Thr - Asp - Leu - His - Ile （配列番号９）
<New laccase>
The novel laccase of the present invention is a laccase having the following physicochemical properties.
(I) Molecular weight: 67.2kDa (SDS-PAGE)
(Ii) Subunit structure: monomer (iii) Optimum pH: pH 4.5
(Iv) N-terminal amino acid sequence of natural enzyme:
Ala-Ile-Gly-Pro-Val-Thr-Asp-Leu-His-Ile (SEQ ID NO: 9)
本発明の新規ラッカーゼは、さらに下記の理化学的性質を有することができる。
（iv）熱安定性：安定温度は50℃以下(pH 6.0、30分)
（v）pH安定性：pH4.0〜9.0では安定
The novel laccase of the present invention can further have the following physicochemical properties.
(Iv) Thermal stability: stable temperature is 50 ° C or less (pH 6.0, 30 minutes)
(V) pH stability: stable at pH 4.0-9.0
本発明の新規ラッカーゼは、ヘリシウム・コラロイデス(Hericium coralloides)NBRC 7716が起源である。ヘリシウム・コラロイデス(Hericium coralloides)NBRC 7716は市販の菌である。本発明の新規ラッカーゼは、没食子酸の存在下、エピガロカテキンに作用してエピテアフラガリンを生成するラッカーゼである。さらに、本発明の新規ラッカーゼは、没食子酸の存在下、エピガロカテキン3-Ｏ-ガレートに作用してエピテアフラガリン3-Ｏ-ガレートを生成するラッカーゼである。 The novel laccase of the present invention originates from Hericium coralloides NBRC 7716. Hericium coralloides NBRC 7716 is a commercially available fungus. The novel laccase of the present invention is a laccase that acts on epigallocatechin in the presence of gallic acid to produce epitheaflagalin. Furthermore, the novel laccase of the present invention is a laccase that acts on epigallocatechin 3-O-gallate in the presence of gallic acid to produce epitheaflagalin 3-O-gallate.
上記本発明のラッカーゼと既存のラッカーゼの理化学的性質を以下の表に示す。表に示すように、至適pHは似ているが、分子量及びN末端配列は、本発明のラッカーゼのアミノ酸配列の何れの部分にも全く一致しない。これらの事実から、両者は異なる酵素だと判断できる。本発明のラッカーゼと既存のラッカーゼとは異なる酵素である。 The physicochemical properties of the laccase of the present invention and the existing laccase are shown in the following table. As shown in the table, the optimum pH is similar, but the molecular weight and N-terminal sequence do not match any part of the amino acid sequence of the laccase of the present invention. From these facts, it can be judged that they are different enzymes. The laccase of the present invention is different from the existing laccase.
本発明の新規ラッカーゼは、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質である。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加してなるアミノ酸配列からなり、かつ、ラッカーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列と90%以上同一のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ラッカーゼ活性を有するタンパク質
The novel laccase of the present invention is the following protein (a), (b) or (c).
(A) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (b) an amino acid sequence obtained by deleting, substituting or adding one to several amino acid sequences in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and laccase activity (C) a protein comprising an amino acid sequence having an amino acid sequence 90% or more identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having laccase activity
上記ラッカーゼ活性は、没食子酸の存在下、エピガロカテキンに作用してエピテアフラガリンを生成する活性であることができる。また、上記ラッカーゼ活性は、没食子酸の存在下、エピガロカテキン3-Ｏ-ガレートに作用してエピテアフラガリン3-Ｏ-ガレートを生成する活性であることができる。 The laccase activity may be an activity that acts on epigallocatechin in the presence of gallic acid to produce epitheaflagalin. The laccase activity can be an activity that acts on epigallocatechin 3-O-gallate in the presence of gallic acid to produce epitheaflagalin 3-O-gallate.
本発明の新規ラッカーゼは、既知のラッカーゼでアミノ酸配列が報告されているものの中で、その同一性が最も高いものレンティヌラ・エドデス（Lentinula edodes）由来lcc6ラッカーゼでも、同一性は77％である。アラインメントの結果は図8に示す。従って、この点でも新しいラッカーゼである。 The novel laccase of the present invention has 77% identity even with lcc6 laccase derived from Lentinula edodes, which has the highest identity among the known laccases whose amino acid sequences have been reported. The alignment results are shown in FIG. Therefore, this is also a new laccase.
本発明は、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質をコードするポリ核酸
化合物を包含する。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加してなるアミノ酸配列からなり、かつ、ラッカーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列と90%以上同一のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ラッカーゼ活性を有するタンパク質
The present invention includes polynucleic acid compounds encoding the following proteins (a), (b) or (c).
(A) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (b) an amino acid sequence obtained by deleting, substituting or adding one to several amino acid sequences in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and laccase activity (C) a protein comprising an amino acid sequence having an amino acid sequence 90% or more identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having laccase activity
本発明は、さらに、以下の（ｄ）又は（ｅ）に示すポリヌクレオチドを含むポリ核酸化合物を包含する。
（ｄ）配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号１に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、ラッカーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
The present invention further includes a polynucleic acid compound containing the polynucleotide shown in the following (d) or (e).
(D) a polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 (e) hybridizing with a polynucleotide consisting of a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 under stringent conditions, and a laccase enzyme Polynucleotide encoding a protein having activity
（１）本発明のポリ核酸化合物
本発明のポリ核酸化合物は、下記の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリ核酸化合物である。
（ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有し、ラッカーゼ活性を有するアミノ酸配列；
（ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、ラッカーゼ活性を有するアミノ酸配列；又は
（ｃ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ラッカーゼ活性を有するアミノ酸配列；
(1) Polynucleic acid compound of the present invention The polynucleic acid compound of the present invention is a polynucleic acid compound encoding a protein having the following amino acid sequence (a), (b) or (c).
(A) an amino acid sequence having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing and having laccase activity;
(B) an amino acid sequence having a deletion, substitution and / or addition of one to several amino acids in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing and having laccase activity; or (c) An amino acid sequence having an amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 in the sequence table and having laccase activity;
本発明のポリ核酸化合物の具体例としては、以下の（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）に示す塩基配列を有するポリ核酸化合物が挙げられる。
（ｄ）配列表の配列番号１に示す塩基配列を有し、ラッカーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（ｅ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、ラッカーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（ｆ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイスする塩基配列を有し、ラッカーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
Specific examples of the polynucleic acid compound of the present invention include polynucleic acid compounds having the base sequences shown in the following (d), (e) or (f).
(D) a base sequence encoding a protein having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and having laccase activity;
(E) a base sequence encoding a protein having a base sequence having a deletion, substitution and / or addition of one to several bases in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and having laccase activity;
(F) encodes a protein having a base sequence that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and having laccase activity Base sequence
本発明において、「ラッカーゼ活性」とは、没食子酸の存在下、エピガロカテキンに作用してエピテアフラガリンを生成する活性であることができる。または上記ラッカーゼ活性は、没食子酸の存在下、エピガロカテキン3-Ｏ-ガレートに作用してエピテアフラガリン3-Ｏ-ガレートを生成する活性であることができる。
本発明のポリ核酸化合物は、例えば、ヘリシウム・コラロイデス(Hericium coralloides)NBRC 7716から単離できる。
In the present invention, the “laccase activity” can be an activity that acts on epigallocatechin in the presence of gallic acid to produce epitheaflagalin. Alternatively, the laccase activity may be an activity that acts on epigallocatechin 3-O-gallate in the presence of gallic acid to produce epitheaflagalin 3-O-gallate.
The polynucleic acid compound of the present invention can be isolated from, for example, Hericium coralloides NBRC 7716.
本明細書で言う「１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。 The range of “1 to several” in the “amino acid sequence having 1 to several amino acid deletions, substitutions and / or additions” as used herein is not particularly limited. For example, 1 to 20, preferably Means 1 to 10, more preferably 1 to 7, further preferably 1 to 5, particularly preferably about 1 to 3.
本明細書で言う「配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列」における同一性は、９０％以上であれば特に限定されないが、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％、特に好ましくは９５％以上である。 The identity in the “amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing” is not particularly limited as long as it is 90% or more, but more preferably 80% or more, more preferably 85% or more, further preferably 90%, particularly preferably 95% or more.
本明細書で言う「１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から４０個、好ましくは１から３０個、より好ましくは１から２０個、より好ましくは１から１０個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。 The range of “1 to several” in the “base sequence having deletion, substitution and / or addition of 1 to several bases” as used herein is not particularly limited, but for example, 1 to 40, preferably Means 1 to 30, more preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, further preferably 1 to 5, and particularly preferably about 1 to 3.
上記した「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０MのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡ等を挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第２版等に記載されている方法に準じて行うことができる。 The above-mentioned “hybridizes under stringent conditions” means a DNA base sequence obtained by using a DNA as a probe and using a colony hybridization method, a plaque hybridization method, a Southern blot hybridization method, or the like. For example, after hybridization at 65 ° C. in the presence of 0.7 to 1.0 M NaCl using a filter on which DNA derived from colonies or plaques or a fragment of the DNA is immobilized, 0. Examples include DNA that can be identified by washing a filter under a condition of 65 ° C. using a 1-2 × SSC solution (1 × SSC solution is 150 mM sodium chloride, 15 mM sodium citrate). Hybridization can be performed according to the method described in Molecular Cloning 2nd edition.
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の同一性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有するＤＮＡが挙げられる。 Examples of DNA that hybridizes under stringent conditions include DNA having a certain degree of identity with the base sequence of DNA used as a probe, for example, 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90%. More preferably, DNA having an identity of 93% or more, particularly preferably 95% or more, and most preferably 98% or more is mentioned.
本発明のポリ核酸化合物の取得方法は特に限定されない。本明細書中の配列表の配列番号１および２に記載したアミノ酸配列及び塩基配列の情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いてヘリシウム・コラロイデス(Hericium coralloides)NBRC 7716のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより本発明のポリ核酸化合物（遺伝子）を単離することができる。ｃＤＮＡライブラリーは、本発明のポリ核酸化合物を発現している細胞から常法により作製することができる。 The method for obtaining the polynucleic acid compound of the present invention is not particularly limited. Appropriate probes and primers are prepared based on the amino acid sequence and nucleotide sequence information shown in SEQ ID NOs: 1 and 2 of the sequence listing in the present specification, and using them, cDNA of Helicium coralloides NBRC 7716 The polynucleic acid compound (gene) of the present invention can be isolated by screening the library. A cDNA library can be prepared from cells expressing the polynucleic acid compound of the present invention by a conventional method.
ＰＣＲ法により本発明のポリ核酸化合物を取得することもできる。上記したｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号１に記載した塩基配列を増幅できるように設計した１対のプライマーを用いてＰＣＲを行う。ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒〜１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）からなる反応工程を1サイクルとして、例えば３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件などを挙げることができる。次いで、増幅されたＤＮＡ断片を、大腸菌等の宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。 The polynucleic acid compound of the present invention can also be obtained by PCR. Using the above cDNA library as a template, PCR is carried out using a pair of primers designed to amplify the base sequence described in SEQ ID NO: 1. PCR reaction conditions can be set as appropriate. For example, one cycle of a reaction step consisting of 94 ° C. for 30 seconds (denaturation), 55 ° C. for 30 seconds to 1 minute (annealing), and 72 ° C. for 2 minutes (extension) For example, after 30 cycles, a condition of reacting at 72 ° C. for 7 minutes can be exemplified. The amplified DNA fragment can then be cloned into a suitable vector that can be amplified in a host such as E. coli.
上記したプローブ又はプライマーの調製、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、並びに目的ポリ核酸化合物のクローニングなどの操作は当業者に既知の方法を用いて行うことができる。 Operations such as preparation of the probe or primer, construction of the cDNA library, screening of the cDNA library, and cloning of the target polynucleic acid compound can be performed using methods known to those skilled in the art.
また、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、ラッカーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリ核酸化合物；並びに配列表の配列番号１に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、ラッカーゼをコードする塩基配列を有するポリ核酸化合物（以下、これらのポリ核酸化合物を変異ポリ核酸化合物と称する）については、配列番号１〜１２に記載のアミノ酸配列および塩基配列の情報に基づいて、化学合成、遺伝子工学的手法又は突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することができる。 A polynucleic acid compound having an amino acid sequence having a deletion, substitution and / or addition of one to several amino acids in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 of the sequence listing and encoding a protein having laccase activity; A polynucleic acid compound having a base sequence having a deletion, substitution and / or addition of one to several bases in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and having a base sequence encoding laccase (hereinafter, these The polynucleic acid compound is referred to as a mutant polynucleic acid compound) based on the amino acid sequence and nucleotide sequence information shown in SEQ ID NOs: 1 to 12 to those skilled in the art such as chemical synthesis, genetic engineering techniques or mutagenesis. It can be produced by any known method.
例えば、配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法等を用いて行うことができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用である。 For example, the DNA having the base sequence described in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing can be performed by using a method of contacting with a mutagen drug, a method of irradiating with ultraviolet rays, a genetic engineering method, or the like. Site-directed mutagenesis, which is one of genetic engineering techniques, is useful because it can introduce a specific mutation at a specific position.
（２）本発明のタンパク質
本発明のタンパク質は、下記の何れかのアミノ酸配列を有する。
（ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有し、ラッカーゼ活性を有するアミノ酸配列；
（ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、ラッカーゼ活性を有するアミノ酸配列；又は
（ｃ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ラッカーゼ活性を有するアミノ酸配列；
(2) Protein of the present invention The protein of the present invention has any of the following amino acid sequences.
(A) an amino acid sequence having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing and having laccase activity;
(B) an amino acid sequence having a deletion, substitution and / or addition of one to several amino acids in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing and having laccase activity; or (c) An amino acid sequence having an amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 in the sequence table and having laccase activity;
本発明のタンパク質はラッカーゼ活性を有するタンパク質である。ラッカーゼ活性については前記の通りである。 The protein of the present invention is a protein having laccase activity. The laccase activity is as described above.
本発明のタンパク質の取得方法は特に制限されず、化学合成により合成したタンパク質でもよいし、遺伝子組換え技術により作製した組換えタンパク質でもよい。
組換えタンパク質を作製する場合には、先ず、本明細書の上記（１）に記載した当該タンパク質をコードするポリ核酸化合物（ＤＮＡ）を取得する。このＤＮＡを適当な発現系に導入することにより、本発明のタンパク質を産生することができる。発現系でのタンパク質の発現については本明細書中後記する。
The method for obtaining the protein of the present invention is not particularly limited, and may be a protein synthesized by chemical synthesis or a recombinant protein produced by a gene recombination technique.
When producing a recombinant protein, first, a polynucleic acid compound (DNA) encoding the protein described in (1) of the present specification is obtained. By introducing this DNA into an appropriate expression system, the protein of the present invention can be produced. The expression of the protein in the expression system will be described later in this specification.
さらに本発明は、上記本発明のポリ核酸化合物を発現可能に含有する組換えベクター、この組換えベクターを含む形質転換体を包含する。 Furthermore, the present invention includes a recombinant vector containing the above-described polynucleic acid compound of the present invention in an expressible manner, and a transformant containing this recombinant vector.
（３）本発明の組換えベクター
本発明のポリ核酸化合物は適当なベクター中に挿入して使用することができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立的に複製するベクター（例えばプラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。
好ましくは、本発明で用いるベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて本発明のポリ核酸化合物は、転写に必要な要素（例えば、プロモーター等）が機能的に連結されている。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。
(3) Recombinant vector of the present invention The polynucleic acid compound of the present invention can be used by inserting it into an appropriate vector. The type of vector used in the present invention is not particularly limited. For example, the vector may be a self-replicating vector (for example, a plasmid), or may be integrated into the host cell genome when introduced into the host cell. It may be replicated together with other chromosomes.
Preferably, the vector used in the present invention is an expression vector. In the expression vector, the polynucleic acid compound of the present invention is functionally linked to elements necessary for transcription (for example, a promoter and the like). A promoter is a DNA sequence that exhibits transcriptional activity in a host cell, and can be appropriately selected depending on the type of host.
細菌細胞で作動可能なプロモータとしては、バチルス・ステアロテルモフィルス・マルトジェニック・アミラーゼ遺伝子(Bacillus stearothermophilus maltogenic amylase gene)、バチルス・リケニホルミスαアミラーゼ遺伝子(Bacillus licheniformis alpha-amylase gene)、バチルス・アミロリケファチエンス・BANアミラーゼ遺伝子(Bacillus amyloliquefaciens BAN amylase gene)、バチルス・サブチリス・アルカリプロテアーゼ遺伝子(Bacillus subtilis alkaline protease gene)もしくはバチルス・プミルス・キシロシダーゼ遺伝子(Bacillus pumilus xylosidase gene)のプロモータ、またはファージ・ラムダのＰR若しくはＰLプロモータ、大腸菌のlac、trp若しくはtacプロモータなどが挙げられる。 Promoters that can operate in bacterial cells include Bacillus stearothermophilus maltogenic amylase gene, Bacillus licheniformis alpha-amylase gene, and Bacillus amyloliquefati. Enns-BAN amylase gene (Bacillus amyloliquefaciens BAN amylase gene), Bacillus subtilis alkaline protease gene (Bacillus subtilis alkaline protease gene) or promoters of the Bacillus pumilus-xylosidase gene (Bacillus pumilus xylosidase gene) or phage lambda, P R or P L promoters, lac of E.coli, such as trp or tac promoter and the like.
哺乳動物細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＳＶ４０プロモータ、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモータ、またはアデノウイルス２主後期プロモータなどがある。昆虫細胞で作動可能なプロモータの例としては、ポリヘドリンプロモータ、Ｐ１０プロモータ、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性タンパクプロモータ、バキュウロウイルス即時型初期遺伝子１プロモータ、またはバキュウロウイルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモータ等がある。酵母宿主細胞で作動可能なプロモータの例としては、酵母解糖系遺伝子由来のプロモータ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモータ、ＴＰＩ１プロモータ、ＡＤＨ2-4cプロモータなどが挙げられる。糸状菌細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＡＤＨ３プロモータまたはｔｐｉＡプロモータなどがある。 Examples of promoters that can operate in mammalian cells include the SV40 promoter, the MT-1 (metallothionein gene) promoter, or the adenovirus 2 major late promoter. Examples of promoters operable in insect cells include polyhedrin promoter, P10 promoter, autographa caliornica polyhedrosic basic protein promoter, baculovirus immediate early gene 1 promoter, or baculovirus 39K delayed early gene. There are promoters. Examples of a promoter operable in a yeast host cell include a promoter derived from a yeast glycolytic gene, an alcohol dehydrogenase gene promoter, a TPI1 promoter, an ADH2-4c promoter, and the like. Examples of promoters that can operate in filamentous fungal cells include the ADH3 promoter or the tpiA promoter.
また、本発明のポリ核酸化合物は必要に応じて、適切なターミネータに機能的に結合されてもよい。本発明の組換えベクターは更に、ポリアデニレーションシグナル(例えばＳＶ４０またはアデノウイルス５Ｅ１ｂ領域由来のもの)、転写エンハンサ配列（例えばＳＶ４０エンハンサ）などの要素を有していてもよい。
本発明の組換えベクターは更に、該ベクターが宿主細胞内で複製することを可能にするＤＮＡ配列を具備してもよく、その一例としてはＳＶ４０複製起点（宿主細胞が哺乳類細胞のとき）が挙げられる。
Moreover, the polynucleic acid compound of the present invention may be functionally bound to an appropriate terminator as necessary. The recombinant vector of the present invention may further have elements such as a polyadenylation signal (for example, derived from SV40 or adenovirus 5E1b region), a transcription enhancer sequence (for example, SV40 enhancer) and the like.
The recombinant vector of the present invention may further comprise a DNA sequence that allows the vector to replicate in the host cell, an example of which is the SV40 origin of replication (when the host cell is a mammalian cell). It is done.
本発明の組換えベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはシゾサッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等のようなその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、または例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン若しくはヒグロマイシンのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。本発明のポリ核酸化合物、プロモータ、および所望によりターミネータおよび／または分泌シグナル配列をそれぞれ連結し、これらを適切なベクターに挿入する方法は当業者に周知である。 The recombinant vector of the present invention may further contain a selection marker. Selectable markers include, for example, genes that lack their complement in host cells such as dihydrofolate reductase (DHFR) or Schizosaccharomyces pombe TPI genes, or such as ampicillin, kanamycin, tetracycline, chloramphenicol, Mention may be made of drug resistance genes such as neomycin or hygromycin. Methods for linking the polynucleic acid compounds of the present invention, promoters, and optionally terminators and / or secretory signal sequences, respectively, and inserting them into appropriate vectors are well known to those skilled in the art.
（４）本発明の形質転換体及びそれを用いた組換えタンパク質の製造
本発明のポリ核酸化合物又は組換えベクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。
本発明のポリ核酸化合物または組換えベクターを導入される宿主細胞は、本発明のポリ核酸化合物を発現できれば任意の細胞でよく、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞等が挙げられる。
(4) Production of transformant of the present invention and recombinant protein using the transformant A transformant can be produced by introducing the polynucleic acid compound of the present invention or a recombinant vector into a suitable host.
The host cell into which the polynucleic acid compound or recombinant vector of the present invention is introduced may be any cell as long as it can express the polynucleic acid compound of the present invention, and examples thereof include bacteria, yeasts, fungi, and higher eukaryotic cells.
細菌細胞の例としては、バチルスまたはストレプトマイセス等のグラム陽性菌又は大腸菌等のグラム陰性菌が挙げられる。これら細菌の形質転換は、プロトプラスト法、または公知の方法でコンピテント細胞を用いることにより行えばよい。
哺乳類細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞またはＣＨＯ細胞等が挙げられる。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入されたＤＮＡ配列を発現させる方法も公知であり、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。
Examples of bacterial cells include Gram positive bacteria such as Bacillus or Streptomyces or Gram negative bacteria such as E. coli. Transformation of these bacteria may be performed by using competent cells by a protoplast method or a known method.
Examples of mammalian cells include HEK293 cells, HeLa cells, COS cells, BHK cells, CHL cells, or CHO cells. Methods for transforming mammalian cells and expressing DNA sequences introduced into the cells are also known, and for example, electroporation method, calcium phosphate method, lipofection method and the like can be used.
酵母細胞の例としては、サッカロマイセスまたはシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)またはサッカロマイセス・クルイベリ(Saccharomyces kluyveri)等が挙げられる。酵母宿主への組換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。 Examples of yeast cells include cells belonging to Saccharomyces or Schizosaccharomyces, such as Saccharomyces cerevisiae or Saccharomyces kluyveri. Examples of the method for introducing a recombinant vector into a yeast host include an electroporation method, a spheroblast method, and a lithium acetate method.
他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、またはトリコデルマに属する細胞である。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、ＤＮＡ構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことができる。ＤＮＡ構築物の宿主染色体への組み込みは、公知の方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えにより行うことができる。 Examples of other fungal cells are cells belonging to filamentous fungi such as Aspergillus, Neurospora, Fusarium, or Trichoderma. When filamentous fungi are used as host cells, transformation can be performed by integrating the DNA construct into the host chromosome to obtain a recombinant host cell. Integration of the DNA construct into the host chromosome can be performed according to known methods, for example, by homologous recombination or heterologous recombination.
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることができる。 When insect cells are used as the host, the recombinant gene transfer vector and baculovirus are co-introduced into the insect cells to obtain the recombinant virus in the insect cell culture supernatant, and then the recombinant virus is further infected with the insect cells. The protein can be expressed.
バキュロウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー(W. H. Freeman and Company)、ニューヨーク(New York)、(1992)〕、Trichoplusia niの卵巣細胞であるＨｉＦｉｖｅ(インビトロジェン社製)等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法又はリポフェクション法等を挙げることができる。
As the baculovirus, for example, Autographa californica nuclear polyhedrosis virus, which is a virus that infects Coleoptera insects, can be used.
Insect cells include Sf9, Sf21 [Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, WH Freeman and Company, New York, Spodoptera frugiperda ovarian cells. (1992)], HiFive (manufactured by Invitrogen), which is an ovarian cell of Trichoplusia ni, can be used.
Examples of the method for co-introducing a recombinant gene introduction vector into insect cells and the baculovirus for preparing a recombinant virus include the calcium phosphate method and the lipofection method.
上記の形質転換体は、導入されたポリ核酸化合物の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養する。形質転換体の培養物から、本発明のタンパク質を単離精製するには、通常のタンパク質の単離、精製法を用いればよい。
例えば、本発明のタンパク質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル(DEAE)セファロース等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF(ファルマシア社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィ一法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
The transformant is cultured in an appropriate nutrient medium under conditions that allow expression of the introduced polynucleic acid compound. In order to isolate and purify the protein of the present invention from the culture of the transformant, ordinary protein isolation and purification methods may be used.
For example, when the protein of the present invention is expressed in a dissolved state in the cell, after the culture is completed, the cell is collected by centrifugation, suspended in an aqueous buffer, and then disrupted by an ultrasonic crusher or the like. A cell-free extract is obtained. From the supernatant obtained by centrifuging the cell-free extract, an ordinary protein isolation and purification method, that is, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, Anion exchange chromatography using a resin such as diethylaminoethyl (DEAE) Sepharose, cation exchange chromatography using a resin such as S-Sepharose FF (Pharmacia), resin such as butyl sepharose and phenyl sepharose Use a hydrophobic chromatography method, gel filtration method using molecular sieve, affinity chromatography method, chromatofocusing method, electrophoresis method such as isoelectric focusing etc. alone or in combination to obtain a purified preparation be able to.
＜ラッカーゼの製造方法＞
本発明のラッカーゼの製造方法は、ヘリシウム・コラロイデス(Hericium coralloides)NBRC 7716を培養し、その培養物からラッカーゼを採取することを含む方法、及び、上記本発明の形質転換体を培養し、得られる培養物からラッカーゼを採取することを含む方法である。ヘリシウム・コラロイデス(Hericium coralloides)NBRC 7716または上記本発明の形質転換体の培養は、例えば、実施例に記載のラッカーゼ生産菌の探索の項における培養条件を参照して実施できる。さらに、培養物からのラッカーゼの採取は、同項の酵素液の抽出を参照して実施できる。
<Method for producing laccase>
The method for producing laccase of the present invention is obtained by culturing Helicium coralloides NBRC 7716, collecting laccase from the culture, and culturing the transformant of the present invention. A method comprising collecting laccase from a culture. The culture of Helicium coralloides NBRC 7716 or the above-described transformant of the present invention can be performed, for example, with reference to the culture conditions in the section for searching for laccase-producing bacteria described in the Examples. Further, laccase can be collected from the culture with reference to the extraction of the enzyme solution in the same section.
＜エピテアフラガリン類の製造方法＞
本発明のエピテアフラガリン類の製造方法は、エピガロカテキン及び／又はエピガロカテキン3-Ｏ-ガレートに、没食子酸の存在下、本発明のラッカーゼまたはタンパク質を作用させて、それぞれエピテアフラガリン及び／又はエピテアフラガリン3-Ｏ-ガレートを得ることを含む。
本発明のエピテアフラガリン類を含有する飲料の製造方法は、茶抽出物に、没食子酸を添加し、本発明のラッカーゼまたはタンパク質を作用させて、前記茶抽出物に含まれるエピガロカテキン及び／又はエピガロカテキン3-Ｏ-ガレートの少なくとも一部をそれぞれエピテアフラガリン及び／又はエピテアフラガリン3-Ｏ-ガレートに変換することを含む。
本発明のエピテアフラガリン類を含有する飲料の製造方法において、茶抽出物は、緑茶抽出物、ウーロン茶抽出物、又は紅茶抽出物であることがきる。
<Method for producing epitea fragalins>
In the method for producing epiteaalagalins of the present invention, epigallocatechin and / or epigallocatechin 3-O-gallate is allowed to act on the laccase or protein of the present invention in the presence of gallic acid, respectively. To obtain phosphorus and / or epiteafragalin 3-O-gallate.
The method for producing a beverage containing the epitheaflavalins of the present invention comprises adding gallic acid to a tea extract, allowing the laccase or protein of the present invention to act, and epigallocatechin contained in the tea extract and And / or converting at least a portion of epigallocatechin 3-O-gallate to epitheaflagalin and / or epiteafragalin 3-O-gallate, respectively.
In the method for producing a beverage containing epithea fragalins of the present invention, the tea extract can be a green tea extract, an oolong tea extract, or a black tea extract.
本発明のエピテアフラガリン類を含有する飲料の製造方法は、本発明のエピテアフラガリン類の製造方法の一態様である。以下、エピガロカテキン及び/又はエピガロカテキンガレートが茶抽出物に含まれている場合、即ち、エピテアフラガリン類を含有する飲料の製造方法を例に説明する。エピテアフラガリン類の製造方法については、エピガロカテキン及び/又はエピガロカテキンガレートが茶抽出物を、エピガロカテキン及び/又はエピガロカテキンガレートを含有する原料または原料溶液、と読み替えて実施することができる。 The manufacturing method of the drink containing the epitea fragalin of this invention is one aspect | mode of the manufacturing method of the epitea fragalin of this invention. Hereinafter, a case where epigallocatechin and / or epigallocatechin gallate is contained in a tea extract, that is, a method for producing a beverage containing epiteafragalins will be described as an example. About the manufacturing method of epitea fragalins, epigallocatechin and / or epigallocatechin gallate is read as a tea extract or a raw material or raw material solution containing epigallocatechin and / or epigallocatechin gallate. be able to.
本発明において、茶抽出物は、エピガロカテキン及び/又はエピガロカテキンガレートを含有する物であれば特に制限はない。茶抽出物としては、例えば、緑茶抽出物、ウーロン茶抽出物、または紅茶抽出物を挙げることができる。 In the present invention, the tea extract is not particularly limited as long as it contains epigallocatechin and / or epigallocatechin gallate. Examples of the tea extract include green tea extract, oolong tea extract, and black tea extract.
緑茶抽出物
緑茶は、ツバキ属（Camellia）植物の葉の抽出物であり、主にCamellia sinensis、Camellia assamicaの新芽を原料として、それを乾燥させたものである。緑茶抽出物としては、例えば、ＳＤ緑茶エキスパウダーＮｏ．１６７１４（三栄源エフ・エフ・アイ株式会社）、カメリアエキス４０Ｒ（太陽化学株式会社）などを挙げることができる。また、抽出法としては、原料を熱水、含水アルコール、グリセリン水溶液、酢酸エチル等にて抽出し、精製・濃縮し、噴霧乾燥または凍結乾燥する方法がある。
Green tea extract Green tea is an extract of the leaves of Camellia plants, which are mainly dried from Camellia sinensis and Camellia assamica sprouts. Examples of the green tea extract include SD Green Tea Extract Powder No. 16714 (San-Ei Gen FFI Co., Ltd.), Camellia Extract 40R (Taiyo Chemical Co., Ltd.), and the like. As an extraction method, there is a method in which the raw material is extracted with hot water, hydrous alcohol, glycerin aqueous solution, ethyl acetate or the like, purified and concentrated, and spray-dried or freeze-dried.
ウーロン茶抽出物
ウーロン茶は、緑茶抽出物と同様の茶葉を一定時間発酵させ、その後加熱して発酵を停止したものである（半発酵茶）。ウーロン茶抽出物としては、例えば、ＦＤウーロン茶エキスパウダーＮｏ．１６２９７（三栄源エフ・エフ・アイ株式会社）などを挙げることができる。また、抽出法としては、原料を熱水、含水アルコール、グリセリン水溶液、酢酸エチル等にて抽出し、精製・濃縮し、噴霧乾燥または凍結乾燥する方法がある。
Oolong tea extract Oolong tea is obtained by fermenting tea leaves similar to green tea extract for a certain period of time and then heating to stop fermentation (semi-fermented tea). As the oolong tea extract, for example, FD oolong tea extract powder No. 16297 (San-Eigen FFI Co., Ltd.). As an extraction method, there is a method in which the raw material is extracted with hot water, hydrous alcohol, glycerin aqueous solution, ethyl acetate or the like, purified and concentrated, and spray-dried or freeze-dried.
紅茶抽出物
紅茶は、緑茶抽出物と同様の茶葉を強発酵させ、その後加熱して発酵を停止したものである（強発酵茶）。紅茶抽出物としては、例えば、ＳＤ紅茶エキスパウダーＮｏ．１６６９１（三栄源エフ・エフ・アイ株式会社）などを挙げることができる。また、抽出法としては、原料を熱水、含水アルコール、グリセリン水溶液、酢酸エチル等にて抽出し、精製・濃縮し、噴霧乾燥または凍結乾燥する方法がある。
Black tea extract Black tea is obtained by strongly fermenting tea leaves similar to the green tea extract and then heating to stop fermentation (strongly fermented tea). Examples of the black tea extract include SD black tea extract powder No. 16691 (Saneigen FFI Co., Ltd.). As an extraction method, there is a method in which the raw material is extracted with hot water, hydrous alcohol, glycerin aqueous solution, ethyl acetate or the like, purified and concentrated, and spray-dried or freeze-dried.
茶抽出物の例を以下の表２に示す。但し、これらの茶抽出物は一例であり、これらに限定されるものではない。 Examples of tea extracts are shown in Table 2 below. However, these tea extracts are examples, and are not limited to these.
本発明の方法では、茶抽出物に含まれるエピガロカテキン及びエピガロカテキンガレートの総量に対してモル比で１〜１０の没食子酸を添加することが適当である。好ましくはエピガロカテキン及びエピガロカテキンガレートの総量に対してモル比で２〜５の没食子酸を添加する。 In the method of the present invention, it is appropriate to add 1 to 10 gallic acid in a molar ratio with respect to the total amount of epigallocatechin and epigallocatechin gallate contained in the tea extract. Preferably, gallic acid having a molar ratio of 2 to 5 is added to the total amount of epigallocatechin and epigallocatechin gallate.
ラッカーゼは、本発明のラッカーゼである。 Laccase is the laccase of the present invention.
ラッカーゼは遊離の酵素または固定化酵素であることができる。ラッカーゼは遊離の酵素である場合、ラッカーゼは没食子酸を添加した茶抽出物に所定量添加し、所定時間、所定温度で変換反応を行う。ラッカーゼの所定量とは、例えば、茶抽出物を0.5(w/v)%〜15(w/v)%を含む溶液1mlに対して0.1〜2.0U（DMPを用いた活性）の範囲である。 Laccase can be a free enzyme or an immobilized enzyme. When laccase is a free enzyme, a predetermined amount of laccase is added to a tea extract to which gallic acid has been added, and a conversion reaction is performed at a predetermined temperature for a predetermined time. The predetermined amount of laccase is, for example, in the range of 0.1 to 2.0 U (activity using DMP) with respect to 1 ml of a solution containing 0.5 (w / v)% to 15 (w / v)% of tea extract. .
尚、茶抽出物にどの程度のエピガロカテキン及び/又はエピガロカテキンガレートが含有されているかは、茶抽出物により異なる。例えば、エピガロカテキンとエピガロカテキンガレートの総和が20(w/w)%以上と称されているSD緑茶エキスパウダーでは、エピガロカテキンが約10(w/w)％、エピガロカテキンガレートが約13(w/w)％ほど含まれている。従って、例えば茶抽出物を1%含む溶液は、エピガロカテキンが約1mg/ml、エピガロカテキンガレートが約1.3mg/mlになる。 Note that how much epigallocatechin and / or epigallocatechin gallate is contained in the tea extract varies depending on the tea extract. For example, in SD green tea extract powder, the sum of epigallocatechin and epigallocatechin gallate is said to be 20 (w / w)% or more, epigallocatechin is about 10 (w / w)%, epigallocatechin gallate is About 13 (w / w)% is included. Thus, for example, a solution containing 1% tea extract has about 1 mg / ml epigallocatechin and about 1.3 mg / ml epigallocatechin gallate.
変換反応についての所定時間とは、例えば、10分〜15時間、所定温度とは２０〜６０℃の範囲である。ラッカーゼによる変換反応後に、茶抽出物を加熱して酵素を失活させることをさらに含む。加熱条件は、７０〜９０℃で２〜１０分とすることが適当である。 The predetermined time for the conversion reaction is, for example, 10 minutes to 15 hours, and the predetermined temperature is in the range of 20 to 60 ° C. After the conversion reaction with laccase, the method further comprises heating the tea extract to inactivate the enzyme. The heating condition is suitably 2 to 10 minutes at 70 to 90 ° C.
ラッカーゼは固定化酵素であることもできる。固定化酵素を用いる場合、ラッカーゼによる変換反応は、固定化酵素を、没食子酸を添加した茶抽出物に添加して行うことができる。変換反応の時間及び温度は、例えば、１０〜２４０分、所定温度とは２０〜６０℃の範囲である。変換反応後に茶抽出物から固定化酵素を除去する。除去は、例えば、固定化酵素を濾過することで行うことができる。 Laccase can also be an immobilized enzyme. When an immobilized enzyme is used, the conversion reaction with laccase can be performed by adding the immobilized enzyme to a tea extract to which gallic acid has been added. The time and temperature of the conversion reaction are, for example, 10 to 240 minutes, and the predetermined temperature is in the range of 20 to 60 ° C. After the conversion reaction, the immobilized enzyme is removed from the tea extract. The removal can be performed, for example, by filtering the immobilized enzyme.
ラッカーゼは固定化酵素である場合、ラッカーゼによる変換反応は、固定化酵素を充填した容器に没食子酸を添加した茶抽出物を通すことで行うこともできる。茶抽出物の流通の条件は、温度を２０〜６０℃の範囲とし、固定化酵素との接触時間を例えば、１０〜２４０分の範囲とすることで行うことができる。 When laccase is an immobilized enzyme, the conversion reaction by laccase can also be performed by passing a tea extract to which gallic acid is added into a container filled with the immobilized enzyme. The circulation conditions of the tea extract can be performed by setting the temperature in the range of 20 to 60 ° C. and the contact time with the immobilized enzyme in the range of 10 to 240 minutes, for example.
ラッカーゼによる変換反応は、茶抽出物に酸素または空気を通気しながら行うことができる。酸素または空気を通気することで、変換反応を促進することができる。酸素または空気の通気条件は例えば、０．２〜１０ Ｌ／Ｌ／ｍｉｎとすることができる。さらに、通気の効果を高めるために、反応液を攪拌しながら通気を行うこともできる。 The conversion reaction with laccase can be performed while oxygen or air is passed through the tea extract. The conversion reaction can be promoted by ventilating oxygen or air. The ventilation condition of oxygen or air can be, for example, 0.2 to 10 L / L / min. Furthermore, in order to enhance the aeration effect, aeration can be performed while stirring the reaction solution.
ラッカーゼによる変換反応は、茶抽出物に含まれる少なくとも一部のエピガロカテキン及び/又はエピガロカテキンガレートを、それぞれエピテアフラガリン及び/又はエピテアフラガリン-3-Ｏ-ガレートに変換するように実施する。目的によっては、エピガロカテキン及び/又はエピガロカテキンガレートの全量がエピテアフラガリン及び/又はエピテアフラガリン-3-Ｏ-ガレートに変換するように、没食子酸の添加量や反応条件を選択することができる。 The conversion reaction with laccase is such that at least a portion of epigallocatechin and / or epigallocatechin gallate contained in the tea extract is converted to epitheaflagalin and / or epitheafragalin-3-O-gallate, respectively. To implement. Depending on the purpose, the amount of gallic acid added and the reaction conditions are selected so that the total amount of epigallocatechin and / or epigallocatechin gallate is converted to epitheafragalin and / or epitheafragalin-3-O-gallate. can do.
ラッカーゼによる変換反応は、茶抽出物に没食子酸を添加して行うが、茶抽出物には、ラッカーゼ活性のｐＨ依存性を考慮して、ｐＨ調整を目的として緩衝剤を添加することもできる。但し、変換反応生成物は、そのまま飲料として利用されることを考慮すると、緩衝剤としては、例えば、リン酸及びその塩類、クエン酸及びその塩類などを用いることが好ましい。勿論、緩衝剤を添加せずに、ラッカーゼによる変換反応を行うこともできる。 The conversion reaction with laccase is carried out by adding gallic acid to the tea extract, but a buffer may be added to the tea extract for the purpose of pH adjustment in consideration of the pH dependence of the laccase activity. However, considering that the conversion reaction product is used as a beverage as it is, it is preferable to use, for example, phosphoric acid and its salts, citric acid and its salts, etc. as the buffer. Of course, the conversion reaction by laccase can also be performed without adding a buffer.
本発明の製造方法により得られる飲料は、そのまま飲料として利用することができる。本発明の製造方法により得られる飲料は、具体的には、茶飲料であり、茶飲料としては、例えば、緑茶飲料、緑茶風飲料、ウーロン茶飲料、ウーロン茶風飲料、紅茶飲料、または紅茶風飲料を挙げることができる。本発明の製造方法により得られる飲料は、エピテアフラガリン類を、例えば、0.001〜1.0質量%含有するものであることができる。 The beverage obtained by the production method of the present invention can be used as a beverage as it is. The beverage obtained by the production method of the present invention is specifically a tea beverage, and examples of the tea beverage include a green tea beverage, a green tea beverage, a oolong tea beverage, a oolong tea beverage, a tea beverage, or a tea beverage. Can be mentioned. The beverage obtained by the production method of the present invention can contain, for example, 0.001 to 1.0% by mass of epithea fragalins.
さらに、本発明の製造方法により得られる飲料は、そのまま飲料として利用することもできるが、没食子酸存在下で茶抽出物をラッカーゼで処理した液を、抽出・精製または濃縮を行い、噴霧乾燥または凍結乾燥し、整粒によりエキス粉末を調製する。こうした濃縮溶液またはエキス粉末を各種形態の食品およびヘルスケア製品の原料として供することもできる。 Furthermore, the beverage obtained by the production method of the present invention can be used as it is as a beverage, but a solution obtained by treating a tea extract with laccase in the presence of gallic acid is extracted, purified or concentrated, and spray dried or Freeze-dry and extract powder is prepared by sizing. Such concentrated solutions or extract powders can also be used as raw materials for various forms of food and health care products.
濃縮溶液またはエキス粉末を適用できる食品としては、例えば、ガム、菓子、キャンデー、サプリメント等を挙げることができる。濃縮溶液またはエキス粉末を適用できるヘルスケア製品としては、例えば、口腔洗浄液、歯磨きペースト等を挙げることができる。 Examples of foods to which the concentrated solution or extract powder can be applied include gums, confectionery, candy, and supplements. Examples of the health care product to which the concentrated solution or the extract powder can be applied include an oral cleaning liquid and a toothpaste.
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。但し、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
ラッカーゼ生産菌の探索
［実験材料］
富山県農林水産総合技術センター所有菌で15株、米国アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)で1株、製品評価技術基盤機構(NITE)で135株、計151株の担子菌及び糸状菌を購入し、探索対象とした(表３)。
Search for laccase-producing bacteria [Experimental materials]
15 strains of bacteria owned by Toyama Prefectural Agriculture, Forestry and Fisheries Technology Center, 1 strain of American Type Culture Collection (ATCC), 135 strains of National Institute for Product Evaluation Technology (NITE), 151 basidiomycetes and filamentous fungi Purchased and targeted for search (Table 3).
［菌の継代及びフリーズストック］
Potato Dextrose Agar(BD社)スラント培地で継代をおこなった。また、2ml容積のスクリューキャップチューブに10%(v/v)グリセロール1mlとポテトデキストロース液体培地で培養した菌糸塊(2,3個)を入れ、4℃に30分間放置後、-80℃で凍結保存してフリーズストックを作成した。
[Bacteria passage and freeze stock]
Subculture was carried out using Potato Dextrose Agar (BD) slant medium. Place a mycelium (2,3) cultured in a 1 ml 10% (v / v) glycerol and potato dextrose liquid medium into a 2 ml screw cap tube, leave at 4 ° C for 30 minutes, and then freeze at -80 ° C. Saved and created freeze stock.
培養及び抽出条件
［培養条件］
10mlのポテトデキストロース液体培地を入れた試験管に担子菌等を植菌し、25℃で振盪培養(振盪速度180min-11)を行った。次に、形成した菌糸塊をフスマ固体培地(小麦ふすま20g、水道水20ml、0.1M CuSO4 20μl)に植菌し、25℃で培養した。
Culture and extraction conditions [Culture conditions]
Basidiomycete like was inoculated into tubes containing potato dextrose broth 10 ml, and shaking culture was performed at 25 ° C. (shaking speed 180 min -1 1). Next, the formed mycelial mass was inoculated into bran solid medium (wheat bran 20 g, tap water 20 ml, 0.1 M CuSO 4 20 μl) and cultured at 25 ° C.
［酵素液の抽出］
培養後、培地にpH6.0の20mMリン酸カリウム緩衝液(KPB)を50ml加えて薬さじでよく撹拌し、4℃で4時間放置した。その後キッチンペーパーで濾過し、濾液を遠心(10,000rpm、10min、4℃)した。上澄みを取り出し、これを酵素抽出液とした。
[Extraction of enzyme solution]
After culturing, 50 ml of 20 mM potassium phosphate buffer (KPB) pH 6.0 was added to the medium and stirred well with a spoon, and left at 4 ° C. for 4 hours. Thereafter, the mixture was filtered with kitchen paper, and the filtrate was centrifuged (10,000 rpm, 10 min, 4 ° C.). The supernatant was taken out and used as an enzyme extract.
ラッカーゼ活性及びタンパク質濃度の測定
［ラッカーゼ活性測定］
1mM DMPを含む50mM酢酸緩衝液(pH4.5) 990μlに酵素抽出液10μlを加え、25℃で反応させた。この時の波長468nmにおける吸光度の増加を測定した。このDMPの酸化反応によって2,2',6,6'-tetramethoxydibenzo-1,1'-diquinone(分子吸光係数49.6mM-1cm-1)が生成される。なお、酵素1Uは1分間に1μmolの生成物を生産する酵素量とした。
Measurement of laccase activity and protein concentration [Measurement of laccase activity]
10 μl of the enzyme extract was added to 990 μl of 50 mM acetate buffer (pH 4.5) containing 1 mM DMP, and reacted at 25 ° C. At this time, the increase in absorbance at a wavelength of 468 nm was measured. The oxidation reaction of DMP produces 2,2 ′, 6,6′-tetramethoxydibenzo-1,1′-diquinone (molecular extinction coefficient 49.6 mM −1 cm −1 ). Enzyme 1U was defined as the amount of enzyme that produced 1 μmol of product per minute.
［タンパク質濃度の測定］
タンパク質濃度はBradford法によって測定した。タンパク質定量試薬にはProtein Assay Reagent(Bio-Rad社)、スタンダードにはウシ血清アルブミン(BSA)溶液を用いた。
[Measurement of protein concentration]
Protein concentration was measured by the Bradford method. Protein Assay Reagent (Bio-Rad) was used as the protein quantification reagent, and bovine serum albumin (BSA) solution was used as the standard.
ETFGgの生産
［EGCgを用いたETFGgの生産］
エピガロカテキン3-Ｏ-ガレート(EGCg)2.0mg、没食子酸4.8mgと0.13U分(DMPを用いた活性)のラッカーゼダイワまたは酵素抽出液を水に溶解し、全量1mlの反応系とした。これを45℃で振とうしながら酵素反応を行った。時間ごとにサンプルを採取し、等量の50%エタノールを添加し、フィルター濾過(0.45μm)した後、HPLCを用いてETFGgを測定した。なお、活性が0.5U/mL以下の酵素抽出液は濃縮操作後、生産反応を行った。
ETFGg production [ETFGg production using EGCg]
Laccase Daiwa or enzyme extract of epigallocatechin 3-O-gallate (EGCg) 2.0 mg, gallic acid 4.8 mg and 0.13 U (activity using DMP) was dissolved in water to make a total reaction volume of 1 ml. The enzyme reaction was performed while shaking this at 45 ° C. Samples were taken every hour, an equal amount of 50% ethanol was added, and the solution was filtered (0.45 μm), and ETFGg was measured using HPLC. The enzyme extract having an activity of 0.5 U / mL or less was subjected to a production reaction after a concentration operation.
［HPLC分析条件］
以下の条件で分析を行った。
検出器：紫外線吸光光度計(測定波長：210nm)
カラム：CadenzaCD-C18 (75×4.6mm、3μm)
カラム温度：40℃
移動相：A液：0.05mol/l リン酸塩緩衝液(pH 2.3)
/ アセトニトリル混液(10：1)
B液：0.05mol/l リン酸塩緩衝液(pH 2.3)
/ アセトニトリル混液(1：1)
B液濃度：0%(0分)→0%(5分)→35%(21分)→35％(23分)
→0%(25分)→0%(30分)
流量：0.9ml/min
流入量：5μl
[HPLC analysis conditions]
The analysis was performed under the following conditions.
Detector: UV absorptiometer (measurement wavelength: 210nm)
Column: CadenzaCD-C18 (75 × 4.6mm, 3μm)
Column temperature: 40 ° C
Mobile phase: Solution A: 0.05 mol / l phosphate buffer (pH 2.3)
/ Acetonitrile mixture (10: 1)
B solution: 0.05mol / l phosphate buffer (pH 2.3)
/ Acetonitrile mixture (1: 1)
B liquid concentration: 0% (0 minutes) → 0% (5 minutes) → 35% (21 minutes) → 35% (23 minutes)
→ 0% (25 minutes) → 0% (30 minutes)
Flow rate: 0.9ml / min
Inflow volume: 5μl
［緑茶エキスを用いたETFGgの生産］
緑茶エキス10mg(太陽化学、カメリアエキス40R、EGCg 1.63mg含)、没食子酸4.8mgと0.13U分(DMPを用いた活性)のラッカーゼダイワまたは酵素抽出液を水に溶解し、全量1mlの反応系とした。これを45℃で振とうしながら酵素反応を行った。サンプルの調製とHPLC分析条件はEGCgによる実験方法と同様に行った。
[Production of ETFGg using green tea extract]
Dissolve 10 mg of green tea extract (Taiyo Kagaku, Camellia extract 40R, EGCg 1.63 mg), gallic acid 4.8 mg and 0.13 U min (active using DMP) in laccase Daiwa or enzyme extract in water, total volume of 1 ml reaction system It was. The enzyme reaction was performed while shaking this at 45 ° C. Sample preparation and HPLC analysis conditions were the same as the experimental method using EGCg.
［没食子酸の濃度変化に伴うETFGgの生成量の変化］
緑茶エキス10mg(EGCg 1.63mg含)、没食子酸と0.13U分(DMPを用いた活性)のラッカーゼダイワまたはヘリシウム・コラロイデス（Hericium coralloides）由来の酵素抽出液を水に溶解し、全量1mlの反応系とした。没食子酸の濃度は0.8mg/ml、2.4mg/ml、4.8mg/mlと換えて行った。これを45℃で振とうしながら酵素反応を行った。サンプルの調製とHPLC分析条件はEGCgによる実験方法と同様に行った。
[Changes in the amount of ETFGg produced with changes in gallic acid concentration]
Green tea extract 10mg (including EGCg 1.63mg), gallic acid and 0.13U (active using DMP) laccase Daiwa or Hericium coralloides derived enzyme extract dissolved in water, total volume of 1ml reaction system It was. The concentration of gallic acid was changed to 0.8 mg / ml, 2.4 mg / ml, and 4.8 mg / ml. The enzyme reaction was performed while shaking this at 45 ° C. Sample preparation and HPLC analysis conditions were the same as the experimental method using EGCg.
［ラッカーゼ活性測定結果］
全151株中、114株の抽出液のラッカーゼ活性を測定した。（残りの株は培養がうまくいかず生育しなかったため、酵素液の抽出及び活性測定を行うことが出来なかった。）そのうち70株にラッカーゼ活性がみられた。その中でも特にトラメテス・ベルシカラー（Trametes versicolor）、トラメテス・オリエンタリス（Trametes orientalis）、アガリカス・ビスポラス（Agaricus bisporus）由来の抽出液が強いラッカーゼ活性を示した。これらの高活性を示した株が変換実験に適していると考え、この測定結果を元に、EGCg及び緑茶エキスを用いたETFGgの生産を行うことにした。
[Measurement result of laccase activity]
Among all 151 strains, the laccase activity of 114 extracts was measured. (The remaining strains did not grow well and did not grow, so extraction of the enzyme solution and activity measurement could not be performed.) Among them, 70 strains showed laccase activity. Among them, extracts from Trametes versicolor, Trametes orientalis, and Agaricus bisporus showed strong laccase activity. Based on these measurement results, we decided to produce ETFGg using EGCg and green tea extract based on these measurement results.
［EGCgを用いたETFGgの生産］
ラッカーゼ活性測定の結果を元に、高活性を示した株の抽出液を使って変換実験を行った。その結果、ETFGgの生産性が高かった株を以下に示す。
[Production of ETFGg using EGCg]
Based on the results of laccase activity measurement, a conversion experiment was performed using an extract of a strain exhibiting high activity. As a result, the strains with high ETFGg productivity are shown below.
この結果から、ヘリシウム・コラロイデス（Hericium coralloides）、コリオラス・エロンガタス(Coriolus elongatus）、ヘリシウム・エリナセウム(Hericium erinaceum）の酵素抽出液で酵素反応を行った時、ETFGgの生産性が高いということがわかった。この中でも特に、H.コラロイデス(coralloides)由来のラッカーゼで変換実験を行った時にETFGgの生産性が高かったので、このラッカーゼが緑茶カテキンを効率的に変換するのに適していると考えた。そこで、H.コラロイデス(coralloides)より、目的のラッカーゼを精製することにした。 From this result, it was found that ETFGg is highly productive when enzymatic reaction is performed with enzyme extracts of Hericium coralloides, Coriolus elongatus and Helicium erinaceum. . Among them, in particular, ETFGg productivity was high when a conversion experiment was performed with a laccase derived from H. coralloides, so we thought that this laccase was suitable for efficiently converting green tea catechins. Therefore, it was decided to purify the desired laccase from H. coralloides.
［没食子酸の濃度変化に伴うETFGgの生成量の変化］
反応させる没食子酸の濃度を低下させていくと、ETFGgの生成率はどう変化するのかをH.コラロイデス(coralloides)由来の抽出液とラッカーゼダイワを使用して実験を行った。その結果、ETFGgの生成率はどちらも没食子酸の濃度にほぼ比例して増加するということがわかった(図1)。また、全ての没食子酸濃度においてETFGgの生成率はラッカーゼダイワよりH.コラロイデス(coralloides)の方が優れていた。このH.コラロイデス(coralloides)由来のラッカーゼはラッカーゼダイワY120よりETFGgを約2倍生成できるということがわかった。
[Changes in the amount of ETFGg produced with changes in gallic acid concentration]
An experiment was conducted using an extract derived from H. coralloides and laccase Daiwa to determine how the ETFGg production rate changes as the concentration of gallic acid to be reacted is lowered. As a result, it was found that the production rate of ETFGg increased almost in proportion to the concentration of gallic acid (Fig. 1). In all gallic acid concentrations, ETFGg production was superior to H. coralloides over laccase Daiwa. This laccase derived from H. coralloides was found to be able to produce ETFGg about twice as much as laccase Daiwa Y120.
ヘリシウム(Hericium）属由来のラッカーゼは、３種の変換率測定法の何れにおいてもETFGgの生産性が高いことが分かり、特にヘリシウム・コラロイデス（Hericium coralloides）NBRC 7716株が最も優れた生産性を示した。これは、現在、エピテアフラビン類の生産に用いられているラッカーゼダイワY120よりも約２倍の高生産性を示し、当該ラッカーゼの使用により緑茶カテキンをETFGgに効率的に変換することが可能となった。 Laccase derived from the genus Helicium is found to be highly productive of ETFGg in any of the three conversion rate measurement methods, with Helicium coralloides NBRC 7716 showing the best productivity. It was. This is about twice as high as laccase Daiwa Y120, which is currently used for the production of epitheaflavins, and the use of the laccase enables efficient conversion of green tea catechins to ETFGg. It was.
［酵素精製］
[方法]
300 gの小麦ふすま培地から得られた酵素抽出液を硫酸アンモニウム沈殿法で分画した。40-80 %飽和濃度で得られた沈殿物を集め、40 %飽和濃度硫安を含む20 mM KPB pH 6.0で懸濁した。同じ緩衝液で平衡化したButyl-Toyopearl 650M(東ソー （株)）カラムに酵素液を供した。酵素を40から0 %の飽和濃度硫安の逆濃度勾配により溶出した。透析した画分を同じ緩衝液(20mM KPB pH 6.0)で平衡化したDEAE-Toyopearl 650M(東ソー（株)）カラムに供した。酵素を0から0.5 M NaClの濃度勾配により溶出した。透析した画分を同じ緩衝液(0.3M NaClを含む20mM KPB pH 6.0)で平衡化したCellulofine GCL2000sf(2.0 ×100 cm)(チッソ（株)社製）カラムに供した。透析した画分を同じ緩衝液(MOPS buffer pH 7.0)で平衡化したBioassist Qカラム(東ソー（株)）に供した。酵素を0から0.3 M NaClの濃度勾配により溶出した。
[Enzyme purification]
[Method]
The enzyme extract obtained from 300 g of wheat bran medium was fractionated by ammonium sulfate precipitation. The precipitate obtained at 40-80% saturation was collected and suspended in 20 mM KPB pH 6.0 containing 40% saturation ammonium sulfate. The enzyme solution was applied to a Butyl-Toyopearl 650M (Tosoh Corp.) column equilibrated with the same buffer. The enzyme was eluted with an inverse concentration gradient of saturated ammonium sulfate from 40 to 0%. The dialyzed fraction was applied to a DEAE-Toyopearl 650M (Tosoh Corp.) column equilibrated with the same buffer (20 mM KPB pH 6.0). The enzyme was eluted with a concentration gradient from 0 to 0.5 M NaCl. The dialyzed fraction was applied to a Cellulofine GCL2000sf (2.0 × 100 cm) (manufactured by Chisso Corporation) column equilibrated with the same buffer (20 mM KPB pH 6.0 containing 0.3 M NaCl). The dialyzed fraction was applied to a Bioassist Q column (Tosoh Corp.) equilibrated with the same buffer (MOPS buffer pH 7.0). The enzyme was eluted with a concentration gradient from 0 to 0.3 M NaCl.
[結果]
酵素精製を行った結果、最終的に精製度は162倍、回収率は1.2 %となった(表５)。
また、酵素精製度をSDS-PAGEで確認したところ、最終的に単一なタンパク質として酵素を得ることができた(図２)。
[result]
As a result of enzyme purification, the final purification was 162 times and the recovery rate was 1.2% (Table 5).
Further, when the degree of enzyme purification was confirmed by SDS-PAGE, the enzyme was finally obtained as a single protein (FIG. 2).
SDS-PAGEで約67.2 kDaの位置のバンドの酵素のN末端アミノ酸配列分析を行った。その結果、N末端側より10アミノ酸の配列を決定できた。(配列番号9)
確定アミノ酸
(1) (5) (10)
Ala - Ile - Gly - Pro - Val - Thr - Asp - Leu - His - Ile
この配列は、取得できたｃＤＮＡ配列から得られた配列の23番目から33番目と完全に一致した。また、この配列はヘリシウム・エリナセウム(Hericium erinaceum）の乾燥子実体から報告されたラッカーゼのＮ末端配列：ＡＶＤＤＤＡＥＱＩＰ（非特許文献２）とは全く異なるものであり、既知ラッカーゼとは異なる。
N-terminal amino acid sequence analysis of the enzyme in the band at about 67.2 kDa was performed by SDS-PAGE. As a result, the sequence of 10 amino acids could be determined from the N-terminal side. (SEQ ID NO: 9)
Confirmed amino acids
(1) (5) (10)
Ala-Ile-Gly-Pro-Val-Thr-Asp-Leu-His-Ile
This sequence completely coincided with the 23rd to 33rd sequences obtained from the obtained cDNA sequence. In addition, this sequence is completely different from the N-terminal sequence of laccase reported from the dried fruiting body of Hericium erinaceum: AVDDDAEQIP (Non-patent Document 2), and is different from the known laccase.
［ゲルろ過クロマトグラフィー］
[方法]
本酵素の分子量を決定するためにTSK-Gel G3000sw(東ソー （株)）カラム(7.5 mm I.D. ×30 cm)を用いたHPLC分析を行った。マーカーにはMW-marker(オリエンタル酵母工業（株）社製)を用いた。
[結果]
高いラッカーゼ活性を示す画分にUVクロマトグラムのピークが見られ、そのピークの保持時間は85.3 minだった。MW-markerの検量線から計算したところ、推定分子量は約68,000 Daであった。これはSDS-PAGEの結果とほぼ一致し、モノマーの酵素である事が分かった。
[Gel filtration chromatography]
[Method]
In order to determine the molecular weight of the enzyme, HPLC analysis using a TSK-Gel G3000sw (Tosoh Corp.) column (7.5 mm ID × 30 cm) was performed. As a marker, MW-marker (manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd.) was used.
[result]
A UV chromatogram peak was observed in the fraction showing high laccase activity, and the retention time of the peak was 85.3 min. When calculated from the MW-marker calibration curve, the estimated molecular weight was approximately 68,000 Da. This was almost the same as the result of SDS-PAGE, and was found to be a monomeric enzyme.
諸性質の決定
以下の諸性質の決定については全て、精製したサンプルを酵素液として使用した。
［至適pH］
緩衝液として0.2M 酢酸緩衝液 (pH 3.5-4.5)、0.2M リン酸カリウム緩衝液 (pH5.0-8.5)を用いた。それぞれ25℃で反応させて、活性測定を行った。その結果、至適pHは4.5であることがわかった(図３)。
Determination of properties All the following properties were determined using purified samples as enzyme solutions.
[Optimum pH]
0.2 M acetate buffer (pH 3.5-4.5) and 0.2 M potassium phosphate buffer (pH 5.0-8.5) were used as buffers. Each was reacted at 25 ° C., and the activity was measured. As a result, it was found that the optimum pH was 4.5 (FIG. 3).
［熱安定性］
温度は氷上及び30〜70℃の間で、10℃刻みで行った。緩衝液として0.2M リン酸カリウム緩衝液(pH 6.0)を用い、それぞれの温度でプレインキュベートしておいた。さらに酵素液を加えて、30分間インキュベートを行った。その後、反応温度25℃で、0.05M 酢酸緩衝液(pH4.5)とDMPを用いて残存活性を測定した。その結果、安定温度は50℃以下(pH 6.0、30分)であることがわかった(図４)。
[Thermal stability]
The temperature was on ice and between 30-70 ° C in 10 ° C increments. A 0.2 M potassium phosphate buffer (pH 6.0) was used as a buffer and preincubated at each temperature. Furthermore, the enzyme solution was added and incubated for 30 minutes. Thereafter, the residual activity was measured using 0.05 M acetate buffer (pH 4.5) and DMP at a reaction temperature of 25 ° C. As a result, it was found that the stable temperature was 50 ° C. or lower (pH 6.0, 30 minutes) (FIG. 4).
［pH安定性］
緩衝液として0.1M citrate-NaOH (pH 3.0-5.0)、0.1M リン酸カリウム(pH 6.0-8.0)、0.1M Gly-NaOH (pH 9.0-11.0)を用いた。それぞれの緩衝液に酵素液を加えて、4℃で3時間及び15時間インキュベートを行った。その後、反応温度25℃で、0.05M 酢酸緩衝液 (pH4.5)とDMPを用いて残存活性を測定した。その結果、pH安定性は4.0〜9.0であることがわかった(図５)。
[PH stability]
As a buffer solution, 0.1M citrate-NaOH (pH 3.0-5.0), 0.1M potassium phosphate (pH 6.0-8.0), 0.1M Gly-NaOH (pH 9.0-11.0) were used. Enzyme solutions were added to each buffer and incubated at 4 ° C. for 3 hours and 15 hours. Thereafter, the residual activity was measured using a 0.05 M acetate buffer (pH 4.5) and DMP at a reaction temperature of 25 ° C. As a result, the pH stability was found to be 4.0 to 9.0 (FIG. 5).
［基質特異性］
基質としてDMP、ABTS、4-アミノアンチピリン（下記参照）を用いた。反応温度25℃で、緩衝液として0.05M 酢酸緩衝液 (pH4.5)を用いて活性を測定した。
＜基質＞
DMP： 1mM 2,6‐ジメトキシフェノール
ABTS： 2mM 2,2'-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)
4-アミノアンチピリン： 83.3mMフェノール、3mM 4-アミノアンチピリン
[Substrate specificity]
DMP, ABTS, 4-aminoantipyrine (see below) was used as a substrate. The activity was measured at a reaction temperature of 25 ° C. using 0.05 M acetate buffer (pH 4.5) as a buffer.
<Substrate>
DMP: 1mM 2,6-dimethoxyphenol
ABTS: 2mM 2,2'-Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)
4-Aminoantipyrine: 83.3 mM phenol, 3 mM 4-aminoantipyrine
H.コラロイデス(coralloides)由来のラッカーゼの基質特異性を調べるために、DMP、ABTS及び4-アミノアンチピリンを基質に用いて、活性測定を行った。H.コラロイデス(coralloides)由来のラッカーゼとラッカーゼダイワを比較し、基質特異性を検討した結果を表６に示す。 In order to investigate the substrate specificity of laccase derived from H. coralloides, activity was measured using DMP, ABTS and 4-aminoantipyrine as substrates. Table 6 shows the results of examining substrate specificity by comparing laccase derived from H. coralloides with laccase Daiwa.
［遺伝子クローニング］
[方法]
ポテトデキストロース液体培地で菌を培養した後、集菌し、液体窒素下、乳鉢と乳棒ですり潰した。トリス飽和フェノールを用いてすり潰した菌体からゲノムDNAを抽出した。
total RNAを抽出するために、小麦ふすま培地で菌を培養した。培養した菌体を小麦ふすまごと液体窒素下、乳鉢と乳棒ですり潰した。ある程度すり潰した後、グラスビーズ(0.5 mm)を加え、さらにすり潰した。TRIZOL(R) 試薬(ライフテクノロジーズジャパン（株）社製)を用いてすり潰した菌体からtotal RNAを抽出した。RACE法によってラッカーゼをコードする遺伝子配列を取得した。SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit(タカラバイオ（株）社製)を用いて5'-RACE及び3'-RACEを行った。
[Gene cloning]
[Method]
Bacteria were cultured in a potato dextrose liquid medium, then collected and ground with a mortar and pestle under liquid nitrogen. Genomic DNA was extracted from cells ground with tris-saturated phenol.
In order to extract total RNA, the fungus was cultured in wheat bran medium. The cultured cells were ground with wheat bran and liquid nitrogen with a mortar and pestle. After grinding to some extent, glass beads (0.5 mm) were added and further ground. Total RNA was extracted from the TRIZOL (R) reagent (Life Technologies Japan Co., Ltd.) ground bacterial cells using. A gene sequence encoding laccase was obtained by the RACE method. 5'-RACE and 3'-RACE were performed using SMARTer ™ RACE cDNA Amplification Kit (manufactured by Takara Bio Inc.).
精製酵素のN末端アミノ酸配列及びラッカーゼの銅結合部位II(銅結合部位I〜IVの２番目)の配列を基に、オリゴヌクレオチドプライマーLAC-N-ter-1 (5'-CCNGTNACNGAYYTNCAYAT-3')（配列番号３）とLAC-copper2-com (5'-RTGRCTRTGRTACCARAANG-3') （配列番号４）を合成した。これらのプライマーを用いてゲノムDNAを鋳型にPCRを行い、ラッカーゼ遺伝子の部分配列を取得した。取得した配列を基にオリゴヌクレオチドプライマーlcc2-N2F (5'-CAATGTCATCAATGAACTGACGG-3') （配列番号５）を合成した。このプライマーとSMARTerTM RACE cDNA Amplification Kitを用いてtotal RNAを鋳型に3'-RACE PCRを行った。得られた配列を基にオリゴヌクレオチドプライマーlcc2-cdna-N5R (5'-GACCAGCAGTCACGGATACAAC-3') （配列番号６）を合成した。このプライマーを用いて5'-RACE PCRを行った。 Oligonucleotide primer LAC-N-ter-1 (5'-CCNGTNACNGAYYTNCAYAT-3 ') based on the N-terminal amino acid sequence of the purified enzyme and the sequence of copper binding site II (second of copper binding sites I to IV) of laccase (SEQ ID NO: 3) and LAC-copper2-com (5′-RTGRCTRTGRTACCARAANG-3 ′) (SEQ ID NO: 4) were synthesized. Using these primers, PCR was performed using genomic DNA as a template to obtain a partial sequence of the laccase gene. Based on the obtained sequence, an oligonucleotide primer lcc2-N2F (5′-CAATGTCATCAATGAACTGACGG-3 ′) (SEQ ID NO: 5) was synthesized. Using this primer and SMARTer ™ RACE cDNA Amplification Kit, 3′-RACE PCR was performed using total RNA as a template. Based on the obtained sequence, an oligonucleotide primer lcc2-cdna-N5R (5′-GACCAGCAGTCACGGATACAAC-3 ′) (SEQ ID NO: 6) was synthesized. 5′-RACE PCR was performed using this primer.
3'-RACE及び5'-RACEによって得られた配列を基にオリゴヌクレオチドプライマー
lcc2-fullcDNA-Nend (5'-GTTCGAGGTCTTTCACCCCTAG-3') （配列番号７）とlcc2-fullcDNA-Cend (5'-GCAACCTACAACTTTGCACGTAT-3') （配列番号８）を合成した。このプライマーを用いてtotal RNAを鋳型にRT-PCRを行い、全長cDNAを取得した。
Oligonucleotide primers based on sequences obtained by 3'-RACE and 5'-RACE
lcc2-fullcDNA-Nend (5′-GTTCGAGGTCTTTCACCCCTAG-3 ′) (SEQ ID NO: 7) and lcc2-fullcDNA-Cend (5′-GCAACCTACAACTTTGCACGTAT-3 ′) (SEQ ID NO: 8) were synthesized. Using this primer, RT-PCR was performed using total RNA as a template to obtain a full-length cDNA.
[結果]
取得した全長cDNA（配列番号１）は1925 bpであり、コーディング領域は1533 bpである(図６)。コーディング領域がコードするアミノ酸配列（配列番号２）(図７)の分子量は55,171.2である。ヘリシウム・コラロイデス(Hericium coralloides) NBRC 7716株培養液から精製した酵素の測定分子量（67.2 kDa: SDS-PAGEのデータ及び、68 kDa:ゲルろ過でのデータ）との差異は、糖鎖の付加に起因するものと推定される。
[result]
The obtained full-length cDNA (SEQ ID NO: 1) is 1925 bp, and the coding region is 1533 bp (FIG. 6). The molecular weight of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) (FIG. 7) encoded by the coding region is 55,171.2. The difference between the measured molecular weight of the enzyme purified from the culture solution of Hericium coralloides NBRC 7716 (67.2 kDa: SDS-PAGE data and 68 kDa: gel filtration data) is due to the addition of sugar chains Presumed to be.
本発明は、ラッカーゼに関する分野および茶カテキンに関連する分野に有用である。 The present invention is useful in the fields related to laccase and related to tea catechins.
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ ヘリシウム・コラロイデス(Hericium coralloides) NBRC 7716 ラッカーゼＤＮＡ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２ ヘリシウム・コラロイデス(Hericium coralloides) NBRC 7716 ラッカーゼＰＲＴ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３〜８ プライマー
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９ ヘリシウム・コラロイデス(Hericium coralloides) NBRC 7716 ラッカーゼN末端アミノ酸配列
SEQ ID NO: 1 Hericium coralloides NBRC 7716 laccase DNA
SEQ ID NO: 2 Hericium coralloides NBRC 7716 Laccase PRT
SEQ ID NO: 3-8 Primer SEQ ID NO: 9 Hericium coralloides NBRC 7716 Laccase N-terminal amino acid sequence
Claims (19)
（i）分子量：67.2kDa（SDS-PAGE）
（ii）サブユニット構造：単量体
（iii）至適pH：pH4.5
（iv）天然型酵素のN末端アミノ酸配列：
Ala - Ile - Gly - Pro - Val - Thr - Asp - Leu - His - Ile Laccase having the following physicochemical properties:
(I) Molecular weight: 67.2kDa (SDS-PAGE)
(Ii) Subunit structure: monomer (iii) Optimum pH: pH 4.5
(Iv) N-terminal amino acid sequence of natural enzyme:
Ala-Ile-Gly-Pro-Val-Thr-Asp-Leu-His-Ile
（v）熱安定性：安定温度は50℃以下(pH 6.0、30分)
（vi）pH安定性：pH4.0〜9.0では安定 Furthermore, the laccase of Claim 1 which has the following physicochemical properties.
(V) Thermal stability: stable temperature is 50 ° C or less (pH 6.0, 30 minutes)
(Vi) pH stability: stable at pH 4.0-9.0
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加してなるアミノ酸配列からなり、かつ、ラッカーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列と90%以上同一のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ラッカーゼ活性を有するタンパク質 The following protein (a), (b) or (c).
(A) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (b) an amino acid sequence obtained by deleting, substituting or adding one to several amino acid sequences in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and laccase activity (C) a protein comprising an amino acid sequence having an amino acid sequence 90% or more identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having laccase activity
（ａ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加してなるアミノ酸配列からなり、かつ、ラッカーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列と90%以上同一のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ラッカーゼ活性を有するタンパク質 A polynucleic acid compound encoding the following protein (a), (b) or (c).
(A) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing (b) from an amino acid sequence in which one to several amino acid sequences are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing And a protein having laccase activity (c) a protein having an amino acid sequence having an amino acid sequence 90% or more identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing and having laccase activity
（ｄ）配列表の配列番号１に示す塩基配列；
（ｅ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、ラッカーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（ｆ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイスする塩基配列を有し、ラッカーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列 The polynucleic acid compound which has a base sequence shown to the following (d), (e) or (f).
(D) the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing;
(E) a base sequence encoding a protein having a base sequence having a deletion, substitution and / or addition of one to several bases in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and having laccase activity;
(F) encodes a protein having a base sequence that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and having laccase activity Base sequence
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