JP2013162752A - Method for quantifying amino acid using pyrophosphate quantification - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ピロリン酸をピロリン酸ピルビン酸ジキナーゼ（PPDK）によって反応させ、生成物であるピルビン酸を定量することで、アデノシン三リン酸（ATP）や無機リン酸が共存する反応系に適したピロリン酸定量法に関するものである。また本発明は、メチオニンをアデノシルメチオニン合成酵素（AdoMetS）、シトルリンをアルギニノスクシネート合成酵素（ASS）、アルギニンをアルギニンデイミナーゼ（ADI）とASSによって反応させ、生成したピロリン酸を上記ピロリン酸定量法で測定することにより、上記アミノ酸を定量する方法に関するものである。 The present invention is suitable for a reaction system in which adenosine triphosphate (ATP) and inorganic phosphate coexist by reacting pyrophosphate with pyrophosphate pyruvate dikinase (PPDK) and quantifying the product pyruvate. The present invention relates to a pyrophosphate determination method. The present invention also provides a reaction of methionine with adenosylmethionine synthase (AdoMetS), citrulline with argininosuccinate synthase (ASS), arginine with arginine deiminase (ADI) and ASS, and the resulting pyrophosphate is treated with the above pyrophosphate. The present invention relates to a method for quantifying the amino acid by measuring with a quantitative method.
本発明は、先天性代謝異常症のスクリーニングなどの医療分野、タンパク質加水分解物の分析などの生化学分野、及び食品又は化粧品における成分検査などの食品又は化粧品関連分野等で有用である。 INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention is useful in the medical field such as screening for inborn errors of metabolism, the biochemical field such as analysis of protein hydrolysates, and the food or cosmetic related field such as component inspection in food or cosmetics.
血中をはじめとする生体試料中のアミノ酸は様々な疾病検出のためのマーカーとなり、その定量法の開発は医療的見地から強く望まれている。また、酵素を用いたアミノ酸の定量法は、選択性が高く、穏和な条件で迅速に行うことができるという優れた特長を有しており、実際の医療現場で多数の試料に対して行うのに適した手法であると考えられている。特に、メチオニンはホモシスチン尿症患者において高濃度蓄積することが知られており、臨床においてはマス・スクリーニングのための重要なバイオマーカーとなる。また、シトルリンとアルギニンは尿素回路中の代謝物の一つであり、シトルリン尿症やアルギナーゼ欠損症をはじめとする尿素回路代謝異常のバイオマーカーとなる。これらのアミノ酸の簡易・迅速な定量方法は、上記疾病検出のためのマス・スクリーニングへの適用も期待される。 Amino acids in blood and other biological samples serve as markers for detecting various diseases, and the development of quantitative methods is strongly desired from a medical standpoint. In addition, the amino acid quantification method using an enzyme has an excellent feature that it is highly selective and can be carried out quickly under mild conditions. It is considered to be a method suitable for In particular, methionine is known to accumulate at high concentrations in patients with homocystinuria and is an important biomarker for mass screening in the clinic. Citrulline and arginine are one of the metabolites in the urea cycle and serve as biomarkers for abnormal urea cycle metabolism including citrulline urine disease and arginase deficiency. The simple and rapid method for quantifying these amino acids is expected to be applied to mass screening for the detection of the above diseases.
メチオニンの酵素的定量法としては、メチオニンガンマリアーゼを用いた定量法（非特許文献1）が知られており、また機能改変フェニルアラニン脱水素酵素を用いた定量法（特許文献1）がホモシスチン尿症のマス・スクリーニングに有効であることが知られている。しかしながら、メチオニンガンマリアーゼを用いた方法では、アンモニアもメチオニンと同様に検出されてしまう。血中でアンモニアは一般に20〜50μM存在しており、これは血中Met濃度と同等以上のオーダーである。また血中アンモニア濃度は、運動やタンパク質摂取などによっても変動するので、この手法による血液試験は、アンモニアの影響を大きく受けてしまう。またメチオニンガンマリアーゼは、メチオニン以外にもシステイン、ホモシステイン等の含硫アミノ酸に対しても反応性を有する。これら含硫アミノ酸を有するサンプルにおいては、この定量法によりメチオニンを選択的に定量することは困難である。さらに機能改変型フェニルアラニン脱水素酵素は、メチオニン以外に、他の分岐鎖アミノ酸と反応性を有するため、分岐鎖アミノ酸除去の前処理が必要となる。 As an enzymatic quantification method for methionine, a quantification method using methionine gamma lyase (Non-patent Document 1) is known, and a quantification method using a function-modified phenylalanine dehydrogenase (Patent Document 1) is homocystinuria. It is known to be effective for mass screening. However, in the method using methionine gamma lyase, ammonia is detected in the same manner as methionine. In the blood, ammonia is generally present in an amount of 20-50 μM, which is on the order of equal to or higher than the blood Met concentration. In addition, blood ammonia concentration varies depending on exercise, protein intake, etc., so blood tests using this technique are greatly affected by ammonia. In addition to methionine, methionine gamma lyase has reactivity with sulfur-containing amino acids such as cysteine and homocysteine. In samples having these sulfur-containing amino acids, it is difficult to selectively quantify methionine by this quantification method. Furthermore, since the functionally modified phenylalanine dehydrogenase has reactivity with other branched chain amino acids in addition to methionine, a pretreatment for removing the branched chain amino acids is required.
シトルリンの定量法としては、シトルリンをジアセチルモノオキシムと反応させ、生成物の発色を検出する手法が知られているが（非特許文献2）、尿素やその類縁化合物もシトルリンと同様に反応してしまうため、尿素を多量に含むような生体試料に対しては利用できない。また、酸性・高温でのインキュベーションという煩瑣な操作を要すること、停止法であるため、経時的なシトルリン生成をモニタリングできない等の問題を有している。そして、シトルリンの定量のために酵素を用いる手法は、未だ知られていない。 As a method for quantifying citrulline, a method is known in which citrulline is reacted with diacetylmonooxime to detect color development of the product (Non-Patent Document 2), but urea and its related compounds react similarly to citrulline. Therefore, it cannot be used for a biological sample containing a large amount of urea. In addition, there are problems such as requiring a cumbersome operation of incubation at an acidic / high temperature, and a method of stopping, so that citrulline production over time cannot be monitored. And the method of using an enzyme for the determination of citrulline is not yet known.
アルギニンの酵素的定量法としては、アルギナーゼとウレアーゼを用いた定量法（特許文献2）が知られている。この定量法では、尿素やアンモニアもアルギニンと同様に検出されてしまうことから、これらを含む生体試料に対しては利用できない。 As an enzymatic quantification method for arginine, a quantification method using arginase and urease (Patent Document 2) is known. In this quantitative method, urea and ammonia are also detected in the same manner as arginine, and therefore cannot be used for biological samples containing these.
一方、ピロリン酸の酵素的定量法として、ピロフォファターゼによってピロリン酸から無機リン酸を生成させ、無機リン酸を各種検出法で定量する手法がある（I-a）。この原理を利用したものとして、Invitrogen社からPiPer Pyrophosphate Assay Kitが、Probe社からEnzChek Pyrophosphate Assay Kitが市販されている。しかしながら、この測定法は、無機リン酸もピロリン酸と同様に検出してしまうため、無機リン酸を夾雑物質として含む試料に対しては利用することができない。また、ピロリン酸の酵素的定量法としては、ATPスルフリラーゼ又はPPDKによってピロリン酸からATPを生成させ、ATPを各種検出法で定量する手法（I-b）がある（特許文献3及び4）。この原理に基づくものとして、Lanza Rockland社からPPiLight Inorganic Pyrophosphate Assay Kitが市販されている。ここでのATPの検出には、ルシフェラーゼによる発光法、又はサイクリングアッセイ法が用いられる。しかしながら、原理上、ATPを夾雑物質として含む試料に対しては実施不可能であり、また発光法での検出は、発光が時間経過と共に急激に減衰するため、高価な発光測定機器を用いて厳密な測定環境で測定を行う必要がある。サイクリングアッセイによる検出は、高感度である一方で、吸光度をモニタリングし、厳密な反応速度を算出する必要がある等、測定は煩瑣になる。なお、この原理に基づく測定には、ATPを含有する試料中でも測定可能なように改良した手法も知られている（特許文献5参照）が、これは前処理としてATP除去を行い、その後ピロリン酸定量を行うという工程を採用するものである。そのため、反応系からATPを除去してしまっても問題のない場合であれば適用できるが、ATPを共存させておきたい反応系では利用することができない。 On the other hand, as an enzymatic quantification method for pyrophosphate, there is a method in which inorganic phosphate is generated from pyrophosphate by pyrophosphatase and the inorganic phosphate is quantified by various detection methods (I-a). Using this principle, the PiPer Pyrophosphate Assay Kit is commercially available from Invitrogen and the EnzChek Pyrophosphate Assay Kit is commercially available from Probe. However, this measurement method cannot be used for a sample containing inorganic phosphoric acid as a contaminant because inorganic phosphoric acid is also detected in the same manner as pyrophosphoric acid. Further, as an enzymatic quantification method for pyrophosphate, there is a method (I-b) in which ATP is produced from pyrophosphate using ATP sulfurylase or PPDK, and ATP is quantified by various detection methods (Patent Documents 3 and 4). Based on this principle, PPiLight Inorganic Pyrophosphate Assay Kit is commercially available from Lanza Rockland. For detection of ATP, a luminescence method using luciferase or a cycling assay method is used. However, in principle, it cannot be performed on a sample containing ATP as a contaminant, and detection by the luminescence method is strictly performed using an expensive luminescence measuring instrument because luminescence attenuates rapidly over time. It is necessary to perform measurement in an appropriate measurement environment. While detection by a cycling assay is highly sensitive, the measurement is cumbersome because it is necessary to monitor the absorbance and calculate the exact reaction rate. In addition, for the measurement based on this principle, there is also known an improved method so that it can be measured even in a sample containing ATP (see Patent Document 5), but this is performed by removing ATP as a pretreatment, and then pyrophosphoric acid. A process of performing quantification is adopted. Therefore, it can be applied if there is no problem even if ATP is removed from the reaction system, but it cannot be used in a reaction system in which ATP is desired to coexist.
さらに、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼによりピロリン酸からヒポキサンチンを生成し、ヒポキサンチンを定量する手法（I-c）も知られている（特許文献6）。この手法は反応基質に無機リン酸及びATPを含まず、これら化合物の存在に影響を受けずにピロリン酸を測定することができる。しかしながら、この手法では、ピロリン酸消費と共にATPを再生することができない。 Furthermore, a technique (I-c) for producing hypoxanthine from pyrophosphate by hypoxanthine phosphoribosyltransferase and quantifying hypoxanthine is also known (Patent Document 6). This technique does not include inorganic phosphate and ATP in the reaction substrate, and pyrophosphate can be measured without being affected by the presence of these compounds. However, this technique cannot regenerate ATP with pyrophosphate consumption.
血漿をはじめとする生体試料中は、無機リン酸や尿素をはじめとする各種の夾雑物質を多量に含み、対象物質の分析法は、これらの夾雑物質の影響を受けないことが求められる。 A biological sample such as plasma contains a large amount of various contaminants such as inorganic phosphate and urea, and the analysis method of the target substance is required not to be affected by these contaminants.
一方、測定対象物質と共にATPを基質としてピロリン酸を生成する酵素は、その基質特異性の高さや、発エルゴン反応であるATP加水分解により高い反応性を有することから、測定用酵素としてきわめて有望である。そして、このようなピロリン酸生成酵素を生体試料分析に適用する前提として、ピロリン酸を定量する必要があり、このピロリン酸定量のための方法には、下記が求められる。
・無機リン酸を多量に含む生体試料でも実施可能であること。
・ATPを基質とするピロリン酸生成酵素と共役させるため、ATPの存在下で実施可能なこと。
・酵素反応の生成物蓄積の回避及び基質再生のため、ピロリン酸からATPを再生できること。
On the other hand, an enzyme that generates pyrophosphate using ATP as a substrate together with the substance to be measured is very promising as an enzyme for measurement because of its high substrate specificity and high reactivity due to ATP hydrolysis, which is an ergonomic reaction. is there. And as a premise to apply such pyrophosphate-generating enzyme to biological sample analysis, it is necessary to quantify pyrophosphate, and the following is required for a method for this pyrophosphate quantification.
-It can be carried out on biological samples containing a large amount of inorganic phosphoric acid.
-It can be carried out in the presence of ATP because it is conjugated with pyrophosphate synthase using ATP as a substrate.
・ ATP can be regenerated from pyrophosphate to avoid accumulation of product of enzyme reaction and substrate regeneration.
しかしながらこれらの要件を満たすピロリン酸定量法は知られておらず、したがって上記ピロリン酸生成酵素を利用したアミノ酸の測定が実用化されるには至っていない。 However, a pyrophosphate determination method that satisfies these requirements is not known, and therefore, measurement of amino acids using the pyrophosphate synthase has not been put to practical use.
本発明者らは、PPDKをピロリン酸と反応させ、生成するピルビン酸をピルビン酸脱水素酵素又はピルビン酸酸化酵素と反応させることで、無機リン酸やATPの共存に影響を受けず、またATPを再生可能なピロリン酸定量が可能であることを見出した。 By reacting PPDK with pyrophosphate and reacting the resulting pyruvate with pyruvate dehydrogenase or pyruvate oxidase, the present inventors are not affected by the coexistence of inorganic phosphate and ATP, and ATP It was found that pyrophosphoric acid quantification capable of regenerating was possible.
さらに、AdoMetSをメチオニンと反応させ、生成するピロリン酸を上記ピロリン酸定量系で測定することで、メチオニン選択的な定量が前処理なしで可能であることを見出し、メチオニン定量系として完成させた。またASSをシトルリンと反応させ、生成するピロリン酸を上記ピロリン酸定量系で測定することで、シトルリン選択的な定量が穏和な条件で可能であることを見出し、シトルリン定量系として完成させた。さらに、ADIをアルギニンと反応させ、生成するシトルリンを上記シトルリン定量系で測定することで、アルギニン選択的な定量が可能であることを見出し、アルギニン定量系として完成させた。 Furthermore, AdoMetS was reacted with methionine, and the pyrophosphoric acid produced was measured with the above-described pyrophosphoric acid quantification system, thereby finding that methionine selective quantification was possible without pretreatment, and the methionine quantification system was completed. In addition, the inventors determined that citrulline selective quantification was possible under mild conditions by reacting ASS with citrulline and measuring the resulting pyrophosphate with the above-described pyrophosphate quantification system, and completed the citrulline quantification system. Furthermore, it was found that arginine selective quantification was possible by reacting ADI with arginine and measuring the produced citrulline with the above-mentioned citrulline quantification system, and completed the arginine quantification system.
本発明は、以下を提供する：
[1] ピロリン酸に、アデノシン一リン酸（AMP）及びホスホエノールピルビン酸（PEP）存在下で、ピロリン酸ピルビン酸ジキナーゼ（PPDK）を作用させて、アデノシン三リン酸（ATP）リン酸、及びピルビン酸を生成させる工程；及び
生成されたピルビン酸を定量する工程
を含み、得られたピルビン酸量に基づいてピロリン酸量を決定する、ピロリン酸を定量する方法。
[2] ピルビン酸を定量する工程が、
ピルビン酸に、（i）乳酸脱水素酵素、（ii）ピルビン酸酸化酵素、（iii）ピルビン酸脱炭酸酵素及びアルコール脱水素酵素、又は（iv）ピルビン酸脱炭酸酵素及びアルデヒド脱水素酵素を作用させる工程を経るものである、[1]に記載の方法。
[3] 試料中のピロリン酸を定量するための方法であり、試料がATP又はリン酸を含んでいてもよい、[1]に記載の方法。
[4] 試料が、血液由来である、[3]に記載の方法。
[5] 対象物質を定量する方法であって：
対象物質に、対象物質の変換と共にATPを基質としてピロリン酸を生成しうる酵素を作用させて、ピロリン酸を生成させる工程；
生成されたピロリン酸に、AMP及びホスホエノールピルビン酸（PEP）存在下で、PPDKを作用させ、ATP、リン酸、及びピルビン酸を生成させる工程；及び
生成されたピルビン酸を定量する工程
を含み、得られたピルビン酸量に基づいて対象物質量を決定する、対象物質を定量する方法。
[6] メチオニンに、ATP存在下で、アデノシルメチオニン合成酵素（AdoMetS）を作用させて、アデノシルメチオニン、及びピロリン酸を生成させる工程；
生成されたピロリン酸に、AMP及びホスホエノールピルビン酸（PEP）存在下で、PPDKを作用させ、ATP、リン酸、及びピルビン酸を生成させる工程；及び
生成されたピルビン酸を定量する工程
を含み、得られたピルビン酸量に基づいてメチオニン量を決定する、メチオニンを定量する方法。
[7] シトルリンに、アスパラギン酸及びATP存在下で、アルギニノスクシネート合成酵素（ASS）を作用させて、AMP、アルギノコハク酸、及びピロリン酸を生成させる工程；
生成されたピロリン酸に、AMP及びPEP存在下で、PPDKを作用させ、ATP、リン酸、及びピルビン酸を生成させる工程；及び
生成されたピルビン酸を定量する工程
を含み、得られたピルビン酸量に基づいてシトルリン量を決定する、シトルリンを定量する方法。
[8] アルギニンに、アルギニンデイミナーゼ（ADI）を作用させて、アンモニア、及びシトルリンを生成させる工程：
生成されたシトルリンに、ASSを作用させ、AMP、アルギノコハク酸、及びピロリン酸を生成させる工程；
生成されたピロリン酸に、AMP及びPEP存在下で、PPDKを作用させ、ATP、リン酸、及びピルビン酸を生成させる工程；及び
生成されたピルビン酸を定量する工程
を含み、得られたピルビン酸量に基づいてアルギニン量を決定する、アルギニンを定量する方法。
[9] [6]に記載のメチオニンを定量する方法に用いるためのキットであって、ATP、AdoMetS、AMP、PEP、PPDKを、単独又はいずれか2種以上の混合物を含むとして含む、キット。
[10] [7]に記載のシトルリンを定量する方法に用いるためのキットであって、ATP、ASS、AMP、PEP、PPDKを、単独又はいずれか2種以上の混合物として含む、キット。
[11] [8]に記載のアルギニンを定量する方法に用いるためのキットであって、ATP、ASS、ADI、AMP、PEP、PPDKを、単独又はいずれか2種以上の混合物として含む、キット。
The present invention provides the following:
[1] Pyrophosphate pyruvate dikinase (PPDK) is allowed to act on pyrophosphate in the presence of adenosine monophosphate (AMP) and phosphoenolpyruvate (PEP), and adenosine triphosphate (ATP) phosphate, and A method for quantifying pyrophosphate, comprising the steps of: generating pyruvic acid; and quantifying the generated pyruvic acid, and determining the amount of pyrophosphate based on the amount of pyruvic acid obtained.
[2] The step of quantifying pyruvic acid is
(I) lactate dehydrogenase, (ii) pyruvate oxidase, (iii) pyruvate decarboxylase and alcohol dehydrogenase, or (iv) pyruvate decarboxylase and aldehyde dehydrogenase on pyruvate The method according to [1], wherein the method undergoes a step of
[3] The method according to [1], which is a method for quantifying pyrophosphate in a sample, and the sample may contain ATP or phosphoric acid.
[4] The method according to [3], wherein the sample is derived from blood.
[5] A method for quantifying target substances:
A step of generating pyrophosphate by causing an enzyme capable of generating pyrophosphate using ATP as a substrate along with the conversion of the target substance to the target substance;
A step of allowing PPDK to act on the produced pyrophosphate in the presence of AMP and phosphoenolpyruvate (PEP) to produce ATP, phosphate, and pyruvate; and a step of quantifying the produced pyruvate A method for quantifying a target substance, wherein the target substance amount is determined based on the obtained amount of pyruvic acid.
[6] A step of causing adenosylmethionine synthase (AdoMetS) to act on methionine in the presence of ATP to produce adenosylmethionine and pyrophosphate;
A step of allowing PPDK to act on the produced pyrophosphate in the presence of AMP and phosphoenolpyruvate (PEP) to produce ATP, phosphate, and pyruvate; and a step of quantifying the produced pyruvate A method for quantifying methionine, wherein the amount of methionine is determined based on the amount of pyruvic acid obtained.
[7] The step of causing argininosuccinate synthase (ASS) to act on citrulline in the presence of aspartic acid and ATP to produce AMP, arginosuccinic acid, and pyrophosphoric acid;
A step of allowing PPDK to act on the produced pyrophosphate in the presence of AMP and PEP to produce ATP, phosphoric acid and pyruvic acid; and a step of quantifying the produced pyruvic acid, A method for quantifying citrulline, wherein the amount of citrulline is determined based on the amount.
[8] A step of causing arginine to act on arginine deiminase (ADI) to produce ammonia and citrulline:
A step of causing ASS to act on the produced citrulline to produce AMP, arginosuccinic acid, and pyrophosphoric acid;
A step of allowing PPDK to act on the produced pyrophosphate in the presence of AMP and PEP to produce ATP, phosphoric acid and pyruvic acid; and a step of quantifying the produced pyruvic acid, A method for quantifying arginine, wherein the amount of arginine is determined based on the amount.
[9] A kit for use in the method for quantifying methionine according to [6], comprising ATP, AdoMetS, AMP, PEP, PPDK alone or as a mixture of any two or more thereof.
[10] A kit for use in the method for quantifying citrulline according to [7], comprising ATP, ASS, AMP, PEP, PPDK alone or as a mixture of any two or more thereof.
[11] A kit for use in the method for quantifying arginine according to [8], comprising ATP, ASS, ADI, AMP, PEP, PPDK alone or as a mixture of any two or more thereof.
本発明のピロリン酸定量法は、無機リン酸又はATPの存在下でも定量能に影響を受けないため、血液のような夾雑物の多い試料中で実施することができる。また、PPDKを用いているため、ATPを基質としてピロリン酸を生成する酵素との共役系では、ピロリン酸からATPを再生することができる。本発明は、反応終了後、定量のためのシグナル強度の変化が少ない系とすることができ、また吸光度検出による系とすることができるため、簡便に、また発光検出器のような高価な専用機器のない測定環境でも実施することができる。 Since the pyrophosphate quantification method of the present invention is not affected by the quantification ability even in the presence of inorganic phosphate or ATP, it can be carried out in a sample having a lot of impurities such as blood. In addition, since PPDK is used, ATP can be regenerated from pyrophosphate in a conjugate system with an enzyme that generates pyrophosphate using ATP as a substrate. Since the present invention can be a system with little change in signal intensity for quantification after completion of the reaction and can be a system based on absorbance detection, it can be used simply and expensively as a luminescence detector. It can also be implemented in a measurement environment without equipment.
本発明のメチオニン定量法は、メチオニン以外のアミノ酸又はアンモニアを含む試料と対象として、前処理なしに実施することができる。また停止法ではなく、試料中のほぼすべてのメチオニンをピロリン酸相当量として定量することができるため、経時的にメチオニン生成をモニタリングすることが容易である。 The methionine quantification method of the present invention can be carried out without any pretreatment on samples and objects containing amino acids other than methionine or ammonia. In addition, since it is not a stopping method, almost all methionine in a sample can be quantified as an equivalent amount of pyrophosphate, so it is easy to monitor methionine production over time.
本発明のシトルリン定量法は、シトルリン以外のアミノ酸又は尿素を含む試料を対象として、前処理なしに実施することができる。また、高温でのインキュベーションは不要であり、また経時的にシトルリン生成をモニタリングすることが容易である。 The citrulline determination method of the present invention can be carried out without pretreatment on a sample containing an amino acid other than citrulline or urea. In addition, incubation at high temperatures is not necessary, and it is easy to monitor citrulline production over time.
本発明のアルギニン定量法は、アルギニン及びシトルリン以外のアミノ酸、尿素又はアンモニアを含む試料を対象として、前処理なしに実施することができる。 The arginine quantification method of the present invention can be carried out without pretreatment on a sample containing amino acids other than arginine and citrulline, urea or ammonia.
本発明は、新規なピロリン酸の定量方法を提供し、またそれを利用したメチオニンの定量方法、シトルリンの定量方法、及びアルギニンの定量方法を提供する。 The present invention provides a novel method for quantifying pyrophosphate, and a methionine quantification method, citrulline quantification method, and arginine quantification method using the same.
本発明で、対象物質に関し「定量（する）」というときは、特に記載した場合を除き、その対象物質の量を測定することをいい、その量は、絶対量のほか、試料中の濃度として測定されることもある。 In the present invention, the term “quantitative” for a target substance means that the amount of the target substance is measured unless otherwise specified. The amount is not only an absolute amount but also a concentration in a sample. Sometimes measured.
＜ピロリン酸の定量方法＞
本発明のピロリン酸の定量方法は：
ピロリン酸に、金属イオン、AMP及びホスホエノールピルビン酸（PEP）存在下で、PPDKを作用させて、ATP、リン酸、及びピルビン酸を生成させる工程(I-A)；及び
生成されたピルビン酸を定量する工程(I-B)
を含み、得られたピルビン酸量に基づいてピロリン酸量を決定するものである。
<Quantitative method of pyrophosphate>
The method for quantifying pyrophosphate of the present invention is:
A process in which PPDK is allowed to act on pyrophosphate in the presence of metal ions, AMP and phosphoenolpyruvate (PEP) to produce ATP, phosphate, and pyruvate (IA); and the amount of pyruvate produced is determined Process (IB)
The amount of pyrophosphate is determined based on the amount of pyruvic acid obtained.
工程(I-A)は、被検試料中のピロリン酸を、PPDK、金属イオン、AMP及びPEPとともに、インキュベーションすることで行なうことができる。PPDKが触媒するこの反応は、以下の反応式で表される。 Step (I-A) can be performed by incubating pyrophosphate in the test sample with PPDK, metal ions, AMP and PEP. This reaction catalyzed by PPDK is represented by the following reaction formula.
なお、本発明で「リン酸」というときは、特に記載した場合を除き、無機リン酸（H3PO4）を指す。リン酸は、オルトリン酸ということもある。 In the present invention, “phosphoric acid” refers to inorganic phosphoric acid (H 3 PO 4 ) unless otherwise specified. Phosphoric acid is sometimes referred to as orthophosphoric acid.
本発明に用いるPPDKは、上記の反応について触媒作用を示す酵素であれば由来、酵素名、ＥＣ番号、又は製造方法等により限定されない。例えば、Propionibacterium属由来のもの、又はThermoproteus属由来のもの、より特定すれば、Propionibacterium freudenreichii（Pf）由来のものか、又はThermoproteus tenax（Tt）由来のものを、好適に用いることができる。Pf由来のPPDKは、バクテリア由来のものとしてよく研究された酵素の一つである。大腸菌発現系での発現量が多く期待でき、またglycerolと混合した状態では4℃で安定に保存でき、また凍結融解を繰り返しても顕著な活性の減少が見られないという点で、優れている。Tt由来のPPDKは、Ttが超好熱性生物であることから、常温での精製が可能であり、かつ高温でも変性せず、使用可能であることが期待できる点で優れている。より具体的には、Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii NBRC12426株由来のものか、又はThermoproteus tenax NBRC100435株由来のものを、好適に用いることができる。 The PPDK used in the present invention is not limited by origin, enzyme name, EC number, production method, or the like as long as it is an enzyme that exhibits a catalytic action for the above reaction. For example, those derived from the genus Propionibacterium , those derived from the genus Thermoproteus , more specifically those derived from Propionibacterium freudenreichii (Pf) or those derived from Thermoproteus tenax (Tt) can be preferably used. Pf-derived PPDK is one of the well-studied enzymes derived from bacteria. It is excellent in that it can be expected to express a lot in the E. coli expression system, can be stably stored at 4 ° C when mixed with glycerol, and there is no significant decrease in activity even after repeated freezing and thawing. . PPt derived from Tt is excellent in that Tt is a hyperthermophilic organism and can be purified at room temperature and can be used without being denatured even at high temperature. More specifically, those derived from Propionibacterium freudenreichii subsp. Shermanii NBRC12426 strain or those derived from Thermoproteus tenax NBRC100435 strain can be preferably used.
使用するPPDKの量は、本発明のピロリン酸の定量が実施できれば特に限定されず、試料に含まれるピロリン酸の存在量、使用する装置、PPDKの純度や種類に応じて適宜決定することができる。使用するPPDKの量は、下限は、0.001U/ml以上であることが好ましく、0.005U/ml以上であることがより好ましく、0.01U/ml以上であることがさらに好ましい。またいずれの場合であっても上限は、10U/ml以下であることが好ましく、5U/ml以下であることがより好ましく、1U/ml以下であることがさらに好ましい。 The amount of PPDK to be used is not particularly limited as long as the pyrophosphate of the present invention can be quantified, and can be appropriately determined according to the amount of pyrophosphate contained in the sample, the apparatus to be used, and the purity and type of PPDK. . The lower limit of the amount of PPDK used is preferably 0.001 U / ml or more, more preferably 0.005 U / ml or more, and further preferably 0.01 U / ml or more. In any case, the upper limit is preferably 10 U / ml or less, more preferably 5 U / ml or less, and further preferably 1 U / ml or less.
工程(I-A)は、AMPの存在下で実施される。存在するAMPの量は、下限は、0.01ｍＭ以上であることが好ましく、0.025ｍＭ以上であることがより好ましく、0.05ｍＭ以上であることがさらに好ましい。またいずれの場合であっても上限は、20ｍＭ以下であることが好ましく、10ｍＭ以下であることがより好ましく、5ｍＭ以下であることがさらに好ましい。 Step (I-A) is performed in the presence of AMP. The lower limit of the amount of AMP present is preferably 0.01 mM or more, more preferably 0.025 mM or more, and even more preferably 0.05 mM or more. In any case, the upper limit is preferably 20 mM or less, more preferably 10 mM or less, and further preferably 5 mM or less.
工程(I-A)はまた、PEP等の高エネルギーリン酸化合物の存在下で実施される。存在するPEPの量は、下限は0.01ｍＭ以上であることが好ましく、0.025ｍＭ以上であることがより好ましく、0.05ｍＭ以上であることがさらに好ましい。またいずれの場合であっても上限は、20ｍＭ以下であることが好ましく、10ｍＭ以下であることがより好ましく、5ｍＭ以下であることがさらに好ましい。 Step (I-A) is also performed in the presence of a high energy phosphate compound such as PEP. The lower limit of the amount of PEP present is preferably 0.01 mM or more, more preferably 0.025 mM or more, and even more preferably 0.05 mM or more. In any case, the upper limit is preferably 20 mM or less, more preferably 10 mM or less, and further preferably 5 mM or less.
工程(I-A)は、金属イオンの存在下で実施されることが好ましい。金属イオンは、マグネシウムイオン、コバルトイオン、又はマンガンイオンのうちいずれかであることができるが、マグネシウムイオンであることが好ましい。使用する金属イオンの量は、例えば、マグネシウムイオンの場合、下限は、AMPの濃度に対して0.1当量以上であることが好ましく、0.2当量以上であることがさらに好ましく、0.4当量以上であることがさらに好ましい。またいずれの場合であっても上限は、10当量以下であることが好ましく、5当量以下であることがより好ましく、2.5当量以下であることがさらに好ましい。最も好ましい濃度はリン酸供与体の0.5〜2当量、例えば1当量である。 Step (I-A) is preferably carried out in the presence of a metal ion. The metal ion can be any of magnesium ion, cobalt ion, or manganese ion, but is preferably magnesium ion. The amount of metal ions to be used is, for example, in the case of magnesium ions, the lower limit is preferably 0.1 equivalents or more, more preferably 0.2 equivalents or more, more preferably 0.4 equivalents or more with respect to the concentration of AMP. Further preferred. In any case, the upper limit is preferably 10 equivalents or less, more preferably 5 equivalents or less, and even more preferably 2.5 equivalents or less. The most preferred concentration is 0.5 to 2 equivalents, such as 1 equivalent, of the phosphate donor.
工程(I-B)では、反応系中のピルビン酸を定量するが、例えば乳酸脱水素酵素反応を利用することにより実施することができる。乳酸脱水素酵素は、広範な生物種に分布する酵素であり、下記の反応を触媒する。 In the step (I-B), pyruvic acid in the reaction system is quantified. For example, it can be carried out by utilizing a lactate dehydrogenase reaction. Lactate dehydrogenase is an enzyme distributed in a wide range of biological species and catalyzes the following reaction.
本発明には、乳酸脱水素酵素としては、各種の生物由来のものを用いることができる。例えば、ウサギ、ブタ、ウシ、トリ、乳酸菌、又は酵母由来の、各種のものが市販されており、これらのいずれかを好適に用いることができる。 In the present invention, those derived from various organisms can be used as the lactate dehydrogenase. For example, various things derived from rabbits, pigs, cows, birds, lactic acid bacteria, or yeasts are commercially available, and any of these can be suitably used.
使用する乳酸脱水素酵素の量は、本発明のピロリン酸の定量が実施できれば特に限定されず、試料に含まれるピロリン酸の存在量、使用する装置、酵素の純度や種類に応じて適宜決定することができる。使用する酵素の量は、下限は、0.002U/ml以上であることが好ましく、0.005U/ml以上であることが好ましく、0.01U/ml以上であることがさらに好ましい。またいずれの場合であっても上限は、4U/ml以下であることが好ましく、2U/ml以下であることがより好ましく、1U/ml以下であることがさらに好ましい。 The amount of lactate dehydrogenase to be used is not particularly limited as long as the pyrophosphate of the present invention can be determined, and is appropriately determined according to the amount of pyrophosphate contained in the sample, the apparatus to be used, and the purity and type of the enzyme. be able to. The lower limit of the amount of enzyme used is preferably 0.002 U / ml or more, preferably 0.005 U / ml or more, and more preferably 0.01 U / ml or more. In any case, the upper limit is preferably 4 U / ml or less, more preferably 2 U / ml or less, and even more preferably 1 U / ml or less.
工程(I-B)はまた、NADHの存在下で実施される。NADH濃度は、低過ぎては吸光度の検出が困難であり、また高過ぎては減少量測定値の正確性が低下する等、影響が比較的大きい。存在するNADHの量は、下限は、0.01ｍＭ以上であることが好ましく、0.02ｍＭ以上であることがより好ましく、0.05ｍＭ以上であることがさらに好ましい。いずれの場合であっても上限は、4ｍＭ以下であることが好ましく、2ｍＭ以下であることがより好ましく、1ｍＭ以下であることがさらに好ましい。 Step (I-B) is also performed in the presence of NADH. If the NADH concentration is too low, it is difficult to detect the absorbance. If the NADH concentration is too high, the accuracy of the measurement of the amount of decrease decreases. The lower limit of the amount of NADH present is preferably 0.01 mM or more, more preferably 0.02 mM or more, and even more preferably 0.05 mM or more. In any case, the upper limit is preferably 4 mM or less, more preferably 2 mM or less, and further preferably 1 mM or less.
乳酸脱水素酵素を用いる系においては、340 nmの吸光度を測定することで、反応進行に伴うNADH減少量を計測し、ピルビン酸生成量が算出される。 In a system using lactate dehydrogenase, by measuring the absorbance at 340 nm, the amount of decrease in NADH accompanying the progress of the reaction is measured, and the amount of pyruvate produced is calculated.
乳酸脱水素酵素を用いる工程(I-B)は、工程(I-A)と同じ系内で同時に進行させることができる。反応温度は、使用する酵素の最適温度等を考慮して適宜決定されるが、室温〜37℃、例えば30℃で好適に行うことができる。反応時間は、被検試料に含まれるピロリン酸量等を考慮して適宜適宜決定できるが、反応は速やかに進行するものであり、20分以内、例えば約7〜13分で、試料中のほぼ全量のピロリン酸をNADHの酸化に用いることができる。必要であれば、20 mM Imidazole-HCl (pH 7.0)等の適切な緩衝液中で、これらの工程を実施することができる。同一系中の各成分の濃度は、当業者であれば適宜決定することができるが、例えば、以下の範囲とすることができる。
MgCl2： 0.5〜50 mM
PEP： 0.05〜5 mM
AMP： 0.05〜5 mM
NADH： 0.05〜1 mM
PPDK： 0.01〜1 U/ml
乳酸脱水素酵素： 0.01〜1 U/ml
乳酸脱水素酵素反応を利用する態様では、少なくとも0〜200 μMの範囲で、ピロリン酸の定量が可能である。
Step (IB) using lactate dehydrogenase can proceed simultaneously in the same system as step (IA). The reaction temperature is appropriately determined in consideration of the optimum temperature of the enzyme to be used, etc., but can be suitably carried out at room temperature to 37 ° C., for example 30 ° C. The reaction time can be appropriately determined in consideration of the amount of pyrophosphoric acid contained in the test sample, etc., but the reaction proceeds quickly, and within 20 minutes, for example, about 7 to 13 minutes, The entire amount of pyrophosphate can be used for the oxidation of NADH. If necessary, these steps can be performed in a suitable buffer such as 20 mM Imidazole-HCl (pH 7.0). The concentration of each component in the same system can be determined as appropriate by those skilled in the art, and can be, for example, in the following range.
MgCl 2: 0.5~50 mM
PEP: 0.05-5 mM
AMP: 0.05-5 mM
NADH: 0.05-1 mM
PPDK: 0.01-1 U / ml
Lactate dehydrogenase: 0.01-1 U / ml
In the embodiment using the lactate dehydrogenase reaction, pyrophosphate can be quantified in the range of at least 0 to 200 μM.
工程(I-B)は、ピルビン酸酸化酵素による反応を利用し、過酸化水素検出系により実施することもできる。
ピルビン酸酸化酵素は、下記の反応を触媒する。
Step (IB) can also be performed by a hydrogen peroxide detection system utilizing a reaction by pyruvate oxidase.
Pyruvate oxidase catalyzes the following reaction.
本発明に用いることができるピルビン酸酸化酵素としては、特に制限はなく、各種の生物由来のもの、例えばPseudomonas属由来のものを好適に用いることができる。 There is no restriction | limiting in particular as pyruvate oxidase which can be used for this invention, The thing derived from various organisms, for example, the thing derived from Pseudomonas genus, can be used conveniently .
使用するピルビン酸酸化酵素の量は、本発明のピロリン酸の定量が実施できれば特に限定されず、試料に含まれるピロリン酸の存在量、使用する装置、酵素の純度や種類に応じて適宜決定することができる。使用する酵素の量は、下限は、0.03U/ml以上であることが好ましく、0.07U/ml以上であることがより好ましく、0.15U/ml以上であることがさらに好ましい。いずれの場合であっても上限は、60U/ml以下であることが好ましく、30U/ml以下であることがより好ましく、15U/ml以下であることがさらに好ましい。 The amount of pyruvate oxidase used is not particularly limited as long as the pyrophosphate quantification of the present invention can be carried out, and is appropriately determined according to the amount of pyrophosphate contained in the sample, the apparatus used, and the purity and type of the enzyme. be able to. The lower limit of the amount of enzyme used is preferably 0.03 U / ml or more, more preferably 0.07 U / ml or more, and further preferably 0.15 U / ml or more. In any case, the upper limit is preferably 60 U / ml or less, more preferably 30 U / ml or less, and even more preferably 15 U / ml or less.
ピルビン酸酸化酵素の作用により生じる過酸化水素は、公知の方法で定量でき、例えばペルオキシダーゼ反応を用いて測定することができる。使用可能なペルオキシダーゼとしては、過酸化水素の定量に利用可能な酵素であればよく、例えば西洋わさび由来ペルオキシダーゼが挙げられる。 Hydrogen peroxide generated by the action of pyruvate oxidase can be quantified by a known method, and can be measured, for example, using a peroxidase reaction. The peroxidase that can be used may be any enzyme that can be used for the quantification of hydrogen peroxide, such as horseradish peroxidase.
使用するペルオキシダーゼの量は、本発明のピロリン酸の定量が実施できれば特に限定されず、試料に含まれるピロリン酸の存在量、使用する装置、酵素の純度や種類に応じて適宜決定することができる。使用する酵素の量は、下限は、0.03U/ml以上であることが好ましく、0.07U/ml以上であることがより好ましく、0.15U/ml以上であることがさらに好ましい。いずれの場合であっても上限は、300U/ml以下であることが好ましく、150U/ml以下であることがより好ましく、75U/ml以下であることがさらに好ましい。 The amount of peroxidase to be used is not particularly limited as long as the pyrophosphate of the present invention can be quantified, and can be appropriately determined according to the amount of pyrophosphate contained in the sample, the apparatus to be used, and the purity and type of the enzyme. . The lower limit of the amount of enzyme used is preferably 0.03 U / ml or more, more preferably 0.07 U / ml or more, and further preferably 0.15 U / ml or more. In any case, the upper limit is preferably 300 U / ml or less, more preferably 150 U / ml or less, and even more preferably 75 U / ml or less.
また、ペルオキシダーゼと反応する電子受容体は、使用するペルオキシダーゼの基質となり得る発色剤又は蛍光剤であれば使用可能である。発色剤としては、例えば4-アミノアンチピリン：フェノールなどが挙げられる。西洋わさび由来ペルオキシダーゼにより、過酸化水素と上記発色剤は以下に示すように反応し、生成物であるキノンイミン色素を505 nmの吸光で検出可能である。 The electron acceptor that reacts with peroxidase can be any color former or fluorescent agent that can serve as a substrate for the peroxidase to be used. Examples of the color former include 4-aminoantipyrine: phenol. By means of peroxidase derived from horseradish, hydrogen peroxide and the color former react as shown below, and the product quinoneimine dye can be detected by absorbance at 505 nm.
またペルオキシダーゼと反応する蛍光剤としては、10-Acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine (ADHP)などが挙げられる。洋わさび由来ペルオキシダーゼにより、過酸化水素とADHPの反応により蛍光物質であるresorufinが生成し、590 nmの蛍光（励起光530 nm）で検出可能である。4-アミノアンチピリンやADHP等の発色剤や蛍光剤は、当業者であれば、使用されるペルオキシダーゼの種類に応じて、適宜選択することができる。また検出のための波長も、当業者であれば、使用される発色剤や蛍光剤の種類に応じて、適宜選択することができる。 Examples of the fluorescent agent that reacts with peroxidase include 10-Acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine (ADHP). Resorufin, a fluorescent substance, is produced by reaction of hydrogen peroxide with ADHP by peroxidase derived from horseradish, and can be detected with fluorescence at 590 nm (excitation light at 530 nm). A color former such as 4-aminoantipyrine and ADHP and a fluorescent agent can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the type of peroxidase used. Also, the wavelength for detection can be appropriately selected by those skilled in the art according to the type of color former and fluorescent agent used.
ピルビン酸酸化酵素を用いる工程(I-B)もまた、工程(I-A)と同じ系内で同時に進行させることができる。反応温度は、使用する酵素の最適温度等を考慮して適宜決定されるが、室温〜37℃、例えば30℃で好適に行うことができる。反応時間は、被検試料に含まれるピロリン酸量等を考慮して適宜適宜決定できるが、反応は速やかに進行するものであり、20分以内、例えば約7〜13分で、試料中のほぼ全量のピロリン酸を過酸化水素の生成に用いることができる。必要であれば、20 mM Imidazole-HCl(pH 7.0)等の適切な緩衝液中で、これらの工程を実施することができる。 The step (I-B) using pyruvate oxidase can also proceed simultaneously in the same system as the step (I-A). The reaction temperature is appropriately determined in consideration of the optimum temperature of the enzyme to be used, etc., but can be suitably carried out at room temperature to 37 ° C., for example, 30 ° C. The reaction time can be appropriately determined in consideration of the amount of pyrophosphoric acid contained in the test sample, etc., but the reaction proceeds quickly, and within 20 minutes, for example, about 7 to 13 minutes, The entire amount of pyrophosphoric acid can be used for the production of hydrogen peroxide. If necessary, these steps can be performed in a suitable buffer such as 20 mM Imidazole-HCl (pH 7.0).
4-アミノアンチピリン及びフェノールを用い、すべての工程を同一系中で実施する場合、各成分の濃度は、当業者であれば適宜決定することができるが、例えば、以下の範囲とすることができる。
MgCl： 2.5〜250 mM
NH4Cl： 1〜100 mM
PEP： 0.05〜5 mM
AMP： 0.05〜5 mM
PPDK： 0.01〜1 U/ml
4-アミノアンチピリン： 0.1〜10 mM
フェノール： 0.1〜10 mM
ピルビン酸酸化酵素： 0.15〜15 U/ml
ペルオキシダーゼ： 0.15〜75 U/ml
4-アミノアンチピリン及びフェノールを用いる態様では、少なくとも0〜200 μMの範囲で、ピロリン酸の定量が可能である。
When all steps are carried out in the same system using 4-aminoantipyrine and phenol, the concentration of each component can be determined as appropriate by those skilled in the art. For example, it can be in the following range. .
MgCl: 2.5-250 mM
NH 4 Cl: 1 to 100 mM
PEP: 0.05-5 mM
AMP: 0.05-5 mM
PPDK: 0.01-1 U / ml
4-Aminoantipyrine: 0.1-10 mM
Phenol: 0.1-10 mM
Pyruvate oxidase: 0.15-15 U / ml
Peroxidase: 0.15-75 U / ml
In an embodiment using 4-aminoantipyrine and phenol, pyrophosphate can be quantified in the range of at least 0 to 200 μM.
ADHPを用い、すべての工程を同一系中で実施する場合、各成分の濃度は、当業者であれば適宜決定することができるが、例えば、以下の範囲とすることができる。
MgCl2： 0.5〜50 mM
NH4Cl： 1〜100 mM
PEP： 0.05〜5 mM
AMP： 0.05〜5 mM
PPDK： 0.01〜1 U/ml
Na-PO4： 0.05〜5 mM
ADHP： 50 μM
ピルビン酸酸化酵素： 0.15〜15 U/ml
ペルオキシダーゼ： 0.15〜75 U/ml
ADHPを用いる態様では、少なくとも0〜10μMの範囲で、ピロリン酸の定量が可能である。この態様により、極微量のピロリン酸を測定可能である。
When all steps are carried out in the same system using ADHP, the concentration of each component can be determined as appropriate by those skilled in the art, and for example, it can be in the following range.
MgCl 2: 0.5~50 mM
NH 4 Cl: 1 to 100 mM
PEP: 0.05-5 mM
AMP: 0.05-5 mM
PPDK: 0.01-1 U / ml
Na-PO 4: 0.05~5 mM
ADHP: 50 μM
Pyruvate oxidase: 0.15-15 U / ml
Peroxidase: 0.15-75 U / ml
In the embodiment using ADHP, pyrophosphate can be quantified in the range of at least 0 to 10 μM. According to this embodiment, a very small amount of pyrophosphate can be measured.
工程(I-B)は、上述の2種類の酵素のほか、ピルビン酸を、2,4-dinitrophenylhydrazine等の発色試薬と反応させ、生成物の吸光度を測定する系として構築してもよい。この系は、ピルビン酸以外の2−オキソ酸でも同様に発色する場合があることに留意するとよい。工程(I-B)はまた、ピルビン酸脱炭酸酵素とアルコール脱水素酵素を用い、NADHの減少を検出する工程として構築してもよい。さらに、ピルビン酸脱炭酸酵素とアセトアルデヒド脱水素酵素を用い、NADHの生成を検出する工程として構築してもよい。これらの工程を実施するために必要な条件は、当業者であれば、適宜設計することができる。 Step (I-B) may be constructed as a system for measuring the absorbance of the product by reacting pyruvic acid with a coloring reagent such as 2,4-dinitrophenylhydrazine in addition to the two types of enzymes described above. It should be noted that this system may develop color with 2-oxo acids other than pyruvate as well. Step (I-B) may also be constructed as a step of detecting a decrease in NADH using pyruvate decarboxylase and alcohol dehydrogenase. Furthermore, it may be constructed as a step of detecting the production of NADH using pyruvate decarboxylase and acetaldehyde dehydrogenase. Those skilled in the art can appropriately design the conditions necessary for carrying out these steps.
本発明のピロリン酸の定量方法は、リン酸やATPの共存下でも実施可能である。また、ATPを生成することができるという利点を有する。ピロリン酸の定量のための従来法としては、ピロフォファターゼによってピロリン酸から無機リン酸を生成させ、無機リン酸を各種検出法で定量する手法（I-a）、ATPスルフリラーゼ又はPPDKによってピロリン酸からATPを生成させ、ATPを各種検出法で定量する手法（I-b）、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼによりピロリン酸からヒポキサンチンを生成し、ヒポキサンチンを定量する手法（I-c）が存在するが、このような特徴を具備するものではない。 The method for quantifying pyrophosphate according to the present invention can be carried out in the presence of phosphoric acid or ATP. It also has the advantage that ATP can be generated. Conventional methods for the quantification of pyrophosphate include inorganic phosphate produced from pyrophosphate using pyrophosphatase and quantification of inorganic phosphate using various detection methods (Ia). ATP from pyrophosphate using ATP sulfurylase or PPDK There are a method for quantifying hypoxanthine by producing hypoxanthine from pyrophosphate using hypoxanthine phosphoribosyltransferase (Ib), and a method for quantifying hypoxanthine (Ib). It does not comprise.
本発明の方法及び従来法について、下表にまとめた。 The method of the present invention and the conventional method are summarized in the following table.
本発明のピルビン酸の定量方法は、ATP共存下でも実施することができるので、測定対象物質と共にATPを基質としてピロリン酸を生成する酵素反応と共役（複数の酵素による、連続反応。「カップリング」と同義。特に、一方の酵素の生成物がもう一方の酵素の基質として使われる連続反応を指す。）させて、対象物質を定量する方法において、用いることができる。測定対象物質と共にATPを基質としてピロリン酸を生成する酵素は、その基質特異性の高さや、発エルゴン反応であるATP加水分解により高い反応性を有することから、測定用酵素としてきわめて有望である。測定対象物質としては、メチオニン、シトルリン、アルギニンが挙げられる。 Since the pyruvate quantification method of the present invention can be carried out even in the presence of ATP, it is coupled with an enzyme reaction that produces pyrophosphate using ATP as a substrate together with the substance to be measured (continuous reaction by multiple enzymes. “Coupling. In particular, it refers to a continuous reaction in which the product of one enzyme is used as a substrate for the other enzyme.) And can be used in a method for quantifying a target substance. Enzymes that produce pyrophosphate using ATP as a substrate together with the substance to be measured are highly promising as measurement enzymes because of their high substrate specificity and high reactivity due to ATP hydrolysis, which is an Ergon reaction. Examples of substances to be measured include methionine, citrulline, and arginine.
ピロリン酸依存的な吸光度減少を測定する本発明においては、ごく弱いながらピロリン酸非依存的な吸光度減少も起こりうる。この非依存的な吸光度減少の速度は、PPDK添加量と比例関係にある。そのため、大過剰量のPPDKを反応液中に添加してしまうと、ピロリン酸非依存的な吸光度減少が大きくなり、誤差の原因となりうる。そのため、本発明においては、併用する酵素（乳酸脱水素酵素、後述するAdoMetS等）に比較し、PPDKの活性量を抑えるとよい。このようにすれば、反応中でPPDKが律速段階となり、上記吸光度減少の影響が抑えられるからである。またPPDKは可逆反応を触媒する酵素であり、単独でピロリン酸存在下で反応させても、ピロリン酸を完全に消費しきる前に平衡に達しうる。しかしながら、本発明の、同じ系内で同時に進行させる態様では、乳酸脱水素酵素（十分量のNADH存在下ではほぼ完全に乳酸生成方向に傾く。）や、ピルビン酸酸化酵素（不可逆反応）といった、反応を実質的に不可逆的に触媒する酵素とカップリングさせることで、ピロリン酸をほぼ完全に変換することができる。また、後述するAdoMetS、ASS、及びADIも、不可逆性の強い酵素であり、基質をほぼ完全に反応させることに寄与していると考えられる。 In the present invention for measuring a decrease in absorbance dependent on pyrophosphate, a decrease in absorbance independent of pyrophosphate can also occur. This independent rate of decrease in absorbance is proportional to the amount of PPDK added. Therefore, if a large excess of PPDK is added to the reaction solution, the decrease in absorbance independent of pyrophosphate is increased, which may cause an error. Therefore, in the present invention, the amount of PPDK activity is preferably suppressed as compared with the enzymes used together (lactate dehydrogenase, AdoMetS, which will be described later). This is because PPDK becomes the rate-determining step in the reaction, and the influence of the decrease in absorbance can be suppressed. PPDK is an enzyme that catalyzes a reversible reaction, and even if it is reacted alone in the presence of pyrophosphate, it can reach an equilibrium before it is completely consumed. However, in the embodiment of the present invention that proceeds simultaneously in the same system, lactate dehydrogenase (inclined almost completely in the direction of lactic acid production in the presence of a sufficient amount of NADH), pyruvate oxidase (irreversible reaction), By coupling the reaction with an enzyme that catalyzes the reaction substantially irreversibly, the pyrophosphate can be almost completely converted. AdoMetS, ASS, and ADI, which will be described later, are also highly irreversible enzymes, and are considered to contribute to the reaction of the substrate almost completely.
なお、このような観点からは、同じ系内で実施する場合の本発明においては、PPDK量は、例えば、乳酸脱水素酵素の1/20〜1/2、好ましくは1/10〜1/2とすることができ、またAdoMetS、ASS又はADIの1/10〜1/1.5、好ましくは1/5〜1/1.5とすることができる。 From this point of view, in the present invention when carried out in the same system, the PPDK amount is, for example, 1/20 to 1/2 of lactate dehydrogenase, preferably 1/10 to 1/2. In addition, AdoMetS, ASS or ADI can be 1/10 to 1 / 1.5, preferably 1/5 to 1 / 1.5.
＜メチオニンの定量方法＞
本発明のメチオニンの定量方法は、
ピロリン酸に、AMP及びホスホエノールピルビン酸（PEP）存在下で、PPDKを作用させ、ATP、リン酸、及びピルビン酸を生成させる工程(II-A)；及び
生成されたピルビン酸を定量する工程(II-B)
を含み、得られたピルビン酸量に基づいてメチオニン量を決定するが、ピロリン酸は、工程(II-C)、すなわちメチオニンに、ATP存在下で、アデノシルメチオニン合成酵素（AdoMetS）を作用させて、アデノシルメチオニン、及びピロリン酸を生成させる工程により、生成されたものである。
<Method for quantifying methionine>
The method for quantifying methionine of the present invention comprises:
A step of causing PPDK to act on pyrophosphate in the presence of AMP and phosphoenolpyruvate (PEP) to produce ATP, phosphoric acid, and pyruvate (II-A); and a step of quantifying the produced pyruvate (II-B)
The amount of methionine is determined on the basis of the amount of pyruvic acid obtained, but pyrophosphoric acid allows adenosylmethionine synthase (AdoMetS) to act on methionine in the presence of ATP. And adenosylmethionine and pyrophosphate.
工程(II-C)は、被検試料中のメチオニンを、アデノシルメチオニン合成酵素（AdoMetS）、ATPとともにインキュベーションすることで行なうことができる。このAdoMetSが触媒する反応は、以下の反応式で表される。 Step (II-C) can be performed by incubating methionine in a test sample with adenosylmethionine synthase (AdoMetS) and ATP. The reaction catalyzed by AdoMetS is represented by the following reaction formula.
なお、本発明で「メチオニン」というときは、特に記載した場合を除き、L-メチオニンをいう。また「アデノシルメチオニン合成酵素」は、一般には、「Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素」又は「メチオニンアデノシルトランスフェラーゼ」と称されることもある。 In the present invention, “methionine” refers to L-methionine unless otherwise specified. The “adenosylmethionine synthase” may also be generally referred to as “S-adenosylmethionine synthase” or “methionine adenosyltransferase”.
本発明には、AdoMetSとしては、各種の生物由来のものを用いることができる。AdoMetSは比較的広い範囲の微生物に分布している。例えば、大腸菌又は酵母由来のものが知られており、これらのいずれかを好適に用いることができる。大腸菌を宿主として発現させ、用いる場合には、宿主由来酵素であればより高い発現量が得られると予想されるので、大腸菌由来のものを選択してもよい。 In the present invention, AdoMetS may be derived from various organisms. AdoMetS is distributed in a relatively wide range of microorganisms. For example, those derived from Escherichia coli or yeast are known, and any of these can be suitably used. When E. coli is expressed and used as a host, it is expected that a higher expression level can be obtained if it is a host-derived enzyme.
使用するAdoMetSの量は、メチオニンの定量が実施できれば特に限定されず、試料に含まれるメチオニンの量、使用する装置、酵素の純度や種類に応じて適宜決定することができる。使用する酵素の量は、下限は、0.001U/ml以上であることが好ましく、0.005U/ml以上であることがより好ましく、0.01U/ml以上であることがさらに好ましい。またいずれの場合であっても上限は、10U/ml以下であることが好ましく、5U/ml以下であることがより好ましく、1U/ml以下であることがさらに好ましい。 The amount of AdoMetS to be used is not particularly limited as long as methionine can be quantified, and can be appropriately determined according to the amount of methionine contained in the sample, the apparatus to be used, and the purity and type of the enzyme. The lower limit of the amount of enzyme used is preferably 0.001 U / ml or more, more preferably 0.005 U / ml or more, and further preferably 0.01 U / ml or more. In any case, the upper limit is preferably 10 U / ml or less, more preferably 5 U / ml or less, and further preferably 1 U / ml or less.
前掲工程(I-A)及び前掲工程(I-B)に関する説明は、特に記載した場合を除き、それぞれ工程(II-A)及び工程(II-B)に当てはまる。 The explanations regarding the above step (I-A) and the above step (I-B) apply to the step (II-A) and the step (II-B), respectively, unless otherwise specified.
工程(II-B)は、乳酸脱水素酵素を用いる系、ピルビン酸酸化酵素を用いる系として構築することができる。また、前掲工程(I-B)と同様、ピルビン酸を、2,4-dinitrophenylhydrazine等の発色試薬と反応させ、生成物の吸光度を測定する工程、ピルビン酸脱炭酸酵素とアルコール脱水素酵素を用い、NADHの減少を検出する工程、又はピルビン酸脱炭酸酵素とアセトアルデヒド脱水素酵素を用い、NADHの生成を検出する工程として構築してもよい。 Step (II-B) can be constructed as a system using lactate dehydrogenase or a system using pyruvate oxidase. Similarly to the above step (IB), pyruvic acid is reacted with a coloring reagent such as 2,4-dinitrophenylhydrazine, and the absorbance of the product is measured. Using pyruvic acid decarboxylase and alcohol dehydrogenase, NADH It may be constructed as a step of detecting a decrease in the amount of NADH, or as a step of detecting the production of NADH using pyruvate decarboxylase and acetaldehyde dehydrogenase.
工程(II-A)、工程(II-B)及び工程（II−C）は、同じ系内で同時に進行させることができる。反応温度は、使用する酵素の最適温度等を考慮して適宜決定されるが、室温〜37℃、例えば30℃で好適に行うことができる。反応時間は、被検試料に含まれるピロリン酸量等を考慮して適宜適宜決定できるが、反応は速やかに進行するものであり、20分以内、例えば約7〜13分で、試料中のほぼ全量のメチオニンをピルビン酸に相当する量として測定することができる。必要であれば、20 mM Imidazole-HCl (pH 7.0)等の適切な緩衝液中で、これらの工程を実施することができる。 Step (II-A), step (II-B) and step (II-C) can be carried out simultaneously in the same system. The reaction temperature is appropriately determined in consideration of the optimum temperature of the enzyme to be used, etc., but can be suitably carried out at room temperature to 37 ° C., for example, 30 ° C. The reaction time can be appropriately determined in consideration of the amount of pyrophosphoric acid contained in the test sample, etc., but the reaction proceeds quickly, and within 20 minutes, for example, about 7 to 13 minutes, The total amount of methionine can be measured as the amount corresponding to pyruvic acid. If necessary, these steps can be performed in a suitable buffer such as 20 mM Imidazole-HCl (pH 7.0).
系中の各成分の濃度は、当業者であれば適宜決定することができるが、例えば、以下の範囲とすることができる。
MgCl2： 0.5〜50 mM
ATP： 0.1〜10 mM
PEP： 0.04〜4 mM
AMP： 0.04〜4 mM
NADH： 0.025〜2.5 mM
PPDK： 0.01〜1 U/ml
AdoMetS： 0.01〜1 U/ml
乳酸脱水素酵素： 0.01〜1 U/ml
乳酸脱水素酵素反応を利用する態様では、少なくとも0〜200μMの範囲で、メチオニンの定量が可能である。
The concentration of each component in the system can be determined as appropriate by those skilled in the art. For example, the concentration can be set in the following range.
MgCl 2: 0.5~50 mM
ATP: 0.1-10 mM
PEP: 0.04-4 mM
AMP: 0.04-4 mM
NADH: 0.025-2.5 mM
PPDK: 0.01-1 U / ml
AdoMetS: 0.01-1 U / ml
Lactate dehydrogenase: 0.01-1 U / ml
In the embodiment using the lactate dehydrogenase reaction, methionine can be quantified in the range of at least 0 to 200 μM.
また、本発明のこの方法は、メチオニン以外のタンパク質を構成する19種類のアミノ酸及びアンモニアが夾雑する場合であっても、メチオニンのみを選択的に定量することができる。 In addition, this method of the present invention can selectively quantify only methionine even when 19 kinds of amino acids constituting the protein other than methionine and ammonia are contaminated.
＜シトルリンの定量方法＞
本発明のシトルリンの定量方法は、
ピロリン酸に、AMP及びホスホエノールピルビン酸（PEP）存在下で、PPDKを作用させ、ATP、リン酸、及びピルビン酸を生成させる工程(III-A)；及び
生成されたピルビン酸を定量する工程(III-B)
を含み、得られたピルビン酸量に基づいてシトルリン量を決定するが、ピロリン酸は、工程(III-C)、すなわちシトルリンに、アスパラギン酸（Asp）及びATP存在下で、アルギニノスクシネート合成酵素（ASS）を作用させて、AMP、アルギノコハク酸、及びピロリン酸を生成させる工程により、生成されたものである。
<Quantitative method for citrulline>
The method for quantifying citrulline of the present invention includes:
A step of allowing PPDK to act on pyrophosphate in the presence of AMP and phosphoenolpyruvate (PEP) to produce ATP, phosphate, and pyruvate (III-A); and a step of quantifying the produced pyruvate (III-B)
The amount of citrulline is determined based on the amount of pyruvic acid obtained, but pyrophosphate is synthesized in step (III-C), ie, citrulline, in the presence of aspartic acid (Asp) and ATP, argininosuccinate. It is produced by a process of producing AMP, arginosuccinic acid, and pyrophosphoric acid by acting an enzyme (ASS).
工程(III-C)は、被検試料中のシトルリンを、ASS、ATP等とともにインキュベーションすることで行なうことができる。このASSが触媒する反応は、以下の反応式で表される。 Step (III-C) can be performed by incubating citrulline in the test sample together with ASS, ATP, and the like. The reaction catalyzed by the ASS is represented by the following reaction formula.
ASSとしては、各種の生物由来のものを用いることができる。ASSは比較的広い範囲の微生物に分布している。例えば、大腸菌又は酵母由来のものが知られており、これらのいずれかを好適に用いることができる。大腸菌を宿主として発現させ、用いる場合には、宿主由来酵素であればより高い発現量が得られると予想されるので、大腸菌由来のものを選択してもよい。 As ASS, those derived from various organisms can be used. ASS is distributed in a relatively wide range of microorganisms. For example, those derived from Escherichia coli or yeast are known, and any of these can be suitably used. When E. coli is expressed and used as a host, it is expected that a higher expression level can be obtained if it is a host-derived enzyme.
使用するASSの量は、シトルリンの定量が実施できれば特に限定されず、試料に含まれるシトルリンの量、使用する装置、酵素の純度や種類に応じて適宜決定することができる。使用する酵素の量は、下限は、0.001U/ml以上であることが好ましく、0.005U/ml以上であることがより好ましく、0.01U/ml以上であることがさらに好ましい。またいずれの場合であっても上限は、10U/ml以下であることが好ましく、5U/ml以下であることがより好ましく、1U/ml以下であることがさらに好ましい。 The amount of ASS to be used is not particularly limited as long as citrulline can be quantified, and can be appropriately determined according to the amount of citrulline contained in the sample, the apparatus to be used, and the purity and type of the enzyme. The lower limit of the amount of enzyme used is preferably 0.001 U / ml or more, more preferably 0.005 U / ml or more, and further preferably 0.01 U / ml or more. In any case, the upper limit is preferably 10 U / ml or less, more preferably 5 U / ml or less, and further preferably 1 U / ml or less.
前掲工程(I-A) 及び前掲工程(I-B)に関する説明は、特に記載した場合を除き、それぞれ工程(III-A) 及び工程(III-B)に当てはまる。 The explanation regarding the above-mentioned process (I-A) and the above-mentioned process (I-B) applies to the process (III-A) and the process (III-B), respectively, unless otherwise specified.
工程(III-B)は、乳酸脱水素酵素を用いる系、ピルビン酸酸化酵素を用いる系として構築することができる。また、前掲工程(I-B)と同様、ピルビン酸を、2,4-dinitrophenylhydrazine等の発色試薬と反応させ、生成物の吸光度を測定する工程、ピルビン酸脱炭酸酵素とアルコール脱水素酵素を用い、NADHの減少を検出する工程、又はピルビン酸脱炭酸酵素とアセトアルデヒド脱水素酵素を用い、NADHの生成を検出する工程として構築してもよい。 Step (III-B) can be constructed as a system using lactate dehydrogenase and a system using pyruvate oxidase. Similarly to the above step (IB), pyruvic acid is reacted with a coloring reagent such as 2,4-dinitrophenylhydrazine, and the absorbance of the product is measured. Using pyruvic acid decarboxylase and alcohol dehydrogenase, NADH It may be constructed as a step of detecting a decrease in the amount of NADH, or as a step of detecting the production of NADH using pyruvate decarboxylase and acetaldehyde dehydrogenase.
工程(III-A)、工程(III-B)及び工程（III−C）は、同じ系内で同時に進行させることができる。反応温度は、使用する酵素の最適温度等を考慮して適宜決定されるが、室温〜37℃、例えば30℃で好適に行うことができる。反応時間は、被検試料に含まれるピロリン酸量等を考慮して適宜適宜決定できるが、反応は速やかに進行するものであり、20分以内、例えば約7〜13分で、試料中のほぼ全量のシトルリンをピルビン酸に相当する量として測定することができる。必要であれば、20 mM Imidazole-HCl(pH 7.0)等の適切な緩衝液中で、これらの工程を実施することができる。 Step (III-A), step (III-B), and step (III-C) can proceed simultaneously in the same system. The reaction temperature is appropriately determined in consideration of the optimum temperature of the enzyme to be used, etc., but can be suitably carried out at room temperature to 37 ° C., for example, 30 ° C. The reaction time can be appropriately determined in consideration of the amount of pyrophosphoric acid contained in the test sample, etc., but the reaction proceeds quickly, and within 20 minutes, for example, about 7 to 13 minutes, The total amount of citrulline can be measured as the amount corresponding to pyruvic acid. If necessary, these steps can be performed in a suitable buffer such as 20 mM Imidazole-HCl (pH 7.0).
なお、同一の系内で行う場合、AMPはASSが関与する反応で生産されるので、その添加は理論的には必須ではないが、AMP非添加の場合、以下のような影響が出る可能性が考えられる。AMPを添加しない場合は、添加した場合に比べAMP濃度が低くなる（その時点でのピロリン酸濃度と同濃度となる）ため、PPDK反応の速度が低下しうる。特にこの影響は、反応終了間際に大きくなると考えられる。ピロリン酸が反応により消費し尽くされようとするとき、ピロリン酸濃度だけでなくAMP濃度も同等に低下し、二基質濃度の低下によりPPDK反応は顕著に進行しにくくなる可能性がある。これが原因となり、未反応のピロリン酸が多くなる可能性がある。このとき、未反応のピロリン酸の分だけ定量値が小さく見積もられてしまうので、定量値が不正確になる可能性がある。 In addition, when AMP is produced in the same system, AMP is produced by a reaction involving ASS, so its addition is theoretically not essential, but in the absence of AMP, the following effects may occur: Can be considered. When AMP is not added, the AMP concentration is lower than when it is added (it is the same concentration as the pyrophosphate concentration at that time), so the speed of the PPDK reaction can be reduced. In particular, this effect is considered to increase at the end of the reaction. When pyrophosphoric acid is about to be exhausted by the reaction, not only the pyrophosphoric acid concentration but also the AMP concentration is reduced equally, and the PPDK reaction may not be able to proceed remarkably due to a decrease in the bisubstrate concentration. This may cause an increase in unreacted pyrophosphate. At this time, since the quantitative value is estimated to be small by the amount of unreacted pyrophosphoric acid, the quantitative value may be inaccurate.
系中の各成分の濃度は、当業者であれば適宜決定することができるが、例えば、以下の範囲とすることができる。
MgCl2： 0.5〜50 mM
アスパラギン酸： 0.2〜20 mM
PEP： 0.02〜2 mM
ATP： 0.1〜10 mM
AMP： 0.025〜2.5 mM
NADH： 0.025〜2.5 mM
PPDK： 0.01〜1 U/ml
ASS： 0.01〜1 U/ml
乳酸脱水素酵素： U/ml
乳酸脱水素酵素反応を利用する態様では、少なくとも0〜200 μMの範囲で、シトルリンの定量が可能である。
The concentration of each component in the system can be determined as appropriate by those skilled in the art. For example, the concentration can be set in the following range.
MgCl 2: 0.5~50 mM
Aspartic acid: 0.2-20 mM
PEP: 0.02 to 2 mM
ATP: 0.1-10 mM
AMP: 0.025-2.5 mM
NADH: 0.025-2.5 mM
PPDK: 0.01-1 U / ml
ASS: 0.01-1 U / ml
Lactate dehydrogenase: U / ml
In an embodiment using a lactate dehydrogenase reaction, citrulline can be quantified in the range of at least 0 to 200 μM.
また、本発明のこの方法は、タンパク質を構成する20種類のアミノ酸及び尿素が夾雑する場合であっても、シトルリンのみを選択的に定量することができる。なお、被検試料中にアスパラギン酸が夾雑している場合でも、シトルリン選択的な定量は可能である。 Further, this method of the present invention can selectively quantify only citrulline even when 20 kinds of amino acids constituting the protein and urea are contaminated. Even when aspartic acid is contaminated in the test sample, selective determination of citrulline is possible.
＜アルギニンの定量方法＞
本発明のアルギニンの定量方法は、
ピロリン酸に、AMP及びホスホエノールピルビン酸（PEP）存在下で、PPDKを作用させ、ATP、リン酸、及びピルビン酸を生成させる工程(IV-A)；及び
生成されたピルビン酸を定量する工程(IV-B)
を含み、得られたピルビン酸量に基づいてアルギニン量を決定するが、ピロリン酸は、アルギニンに、アルギニンデイミナーゼ（ADI）を作用させて、アンモニア、及びシトルリンを生成させる工程(IV-D)：及び
生成されたシトルリンに、ASSを作用させ、AMP、アルギノコハク酸、及びピロリン酸を生成させる工程(IV-C)により、生成されたものである。
<Method for quantifying arginine>
The method for quantifying arginine of the present invention comprises:
A step of allowing PPDK to act on pyrophosphate in the presence of AMP and phosphoenolpyruvate (PEP) to produce ATP, phosphoric acid, and pyruvate (IV-A); and a step of quantifying the produced pyruvate (IV-B)
The amount of arginine is determined on the basis of the amount of pyruvic acid obtained, and pyrophosphate is produced by causing arginine to act on arginine deiminase (ADI) to produce ammonia and citrulline (IV-D) : And produced citrulline by the step (IV-C) of causing ASS to act to produce AMP, arginosuccinic acid, and pyrophosphoric acid.
工程(IV-D)は、被検試料中のアルギニンを、アルギニンデイミナーゼ（ADI）とともにインキュベーションすることで行なうことができる。このADIが触媒する反応は、以下の反応式で表される。 Step (IV-D) can be performed by incubating arginine in the test sample with arginine deiminase (ADI). The reaction catalyzed by ADI is represented by the following reaction formula.
なお、本発明で「アルギニン」というときは、特に記載した場合を除き、L-アルギニンをいう。 In the present invention, “arginine” refers to L-arginine unless otherwise specified.
本発明には、ADIとしては、各種の生物由来のものを用いることができる。例えば、Pseudomonas aeruginosa又は乳酸菌由来のものが知られており、これらのいずれかを好適に用いることができる。また、ADI遺伝子を保持しており、その遺伝子産物が生理学的にも機能していると考えられているP. aeruginosa由来のものを、調製してもちいてもよい。 In the present invention, ADIs derived from various organisms can be used. For example, those derived from Pseudomonas aeruginosa or lactic acid bacteria are known, and any of these can be suitably used. Moreover, you may prepare the thing derived from P. aeruginosa which hold | maintains an ADI gene and is considered that the gene product is functioning physiologically.
使用するADIの量は、アルギニンの定量が実施できれば特に限定されず、試料に含まれるアルギニンの量、使用する装置、酵素の純度や種類に応じて適宜決定することができる。使用する酵素の量は、下限は、0.001U/ml以上であることが好ましく、0.005U/ml以上であることがより好ましく、0.01U/ml以上であることがさらに好ましい。またいずれの場合であっても上限は、10U/ml以下であることが好ましく、5U/ml以下であることがより好ましく、1U/ml以下であることがさらに好ましい。 The amount of ADI to be used is not particularly limited as long as arginine can be quantified, and can be appropriately determined according to the amount of arginine contained in the sample, the apparatus to be used, and the purity and type of the enzyme. The lower limit of the amount of enzyme used is preferably 0.001 U / ml or more, more preferably 0.005 U / ml or more, and further preferably 0.01 U / ml or more. In any case, the upper limit is preferably 10 U / ml or less, more preferably 5 U / ml or less, and further preferably 1 U / ml or less.
前掲工程(I-A) 及び前掲工程(I-B)に関する説明は、特に記載した場合を除き、それぞれ工程(IV-A) 及び工程(IV-B)に当てはまる。また前掲工程(III-C)に関する説明は、特に記載した場合を除き、工程(IV-C) に当てはまる。 The explanation regarding the above step (I-A) and the above step (I-B) applies to the step (IV-A) and the step (IV-B), respectively, unless otherwise specified. Further, the explanation regarding the above-mentioned step (III-C) is applicable to the step (IV-C) unless otherwise specified.
工程(IV-B)は、乳酸脱水素酵素を用いる系、ピルビン酸酸化酵素を用いる系として構築することができる。また、前掲工程(I-B)と同様、ピルビン酸を、2,4-dinitrophenylhydrazine等の発色試薬と反応させ、生成物の吸光度を測定する工程、ピルビン酸脱炭酸酵素とアルコール脱水素酵素を用い、NADHの減少を検出する工程、又はピルビン酸脱炭酸酵素とアセトアルデヒド脱水素酵素を用い、NADHの生成を検出する工程として構築してもよい。 Step (IV-B) can be constructed as a system using lactate dehydrogenase or a system using pyruvate oxidase. Similarly to the above step (IB), pyruvic acid is reacted with a coloring reagent such as 2,4-dinitrophenylhydrazine, and the absorbance of the product is measured. Using pyruvic acid decarboxylase and alcohol dehydrogenase, NADH It may be constructed as a step of detecting a decrease in the amount of NADH, or as a step of detecting the production of NADH using pyruvate decarboxylase and acetaldehyde dehydrogenase.
工程(IV-A)、工程(IV-B)、工程（IV−C）及び工程（IV−D）は、同じ系内で同時に進行させることができる。反応温度は、使用する酵素の最適温度等を考慮して適宜決定されるが、室温〜37℃、例えば30℃で好適に行うことができる。反応時間は、被検試料に含まれるピロリン酸量等を考慮して適宜適宜決定できるが、反応は速やかに進行するものであり、20分以内、例えば約7〜13分で、試料中のほぼ全量のアルギニンをピルビン酸に相当する量として測定することができる。必要であれば、20 mM Imidazole-HCl(pH 7.0)等の適切な緩衝液中で、これらの工程を実施することができる。 Step (IV-A), step (IV-B), step (IV-C) and step (IV-D) can proceed simultaneously in the same system. The reaction temperature is appropriately determined in consideration of the optimum temperature of the enzyme to be used, etc., but can be suitably carried out at room temperature to 37 ° C., for example, 30 ° C. The reaction time can be appropriately determined in consideration of the amount of pyrophosphoric acid contained in the test sample, etc., but the reaction proceeds quickly, and within 20 minutes, for example, about 7 to 13 minutes, The total amount of arginine can be measured as the amount corresponding to pyruvic acid. If necessary, these steps can be performed in a suitable buffer such as 20 mM Imidazole-HCl (pH 7.0).
系中の各成分の濃度は、当業者であれば適宜決定することができるが、例えば、以下の範囲とすることができる。
MgCl2： 0.5〜50 mM
アスパラギン酸： 0.2〜20 mM
PEP： 0.02〜2 mM
ATP： 0.1〜10 mM
AMP： 0.025〜2.5 mM
NADH： 0.025〜2.5 mM
PPDK： 0.01〜1 U/ml
ASS： 0.01〜1 U/ml
ADI： 0.01〜1 U/ml
乳酸脱水素酵素： U/ml
乳酸脱水素酵素反応を利用する態様では、少なくとも0〜200 μMの範囲で、アルギニンの定量が可能である。
The concentration of each component in the system can be determined as appropriate by those skilled in the art. For example, the concentration can be set in the following range.
MgCl 2: 0.5~50 mM
Aspartic acid: 0.2-20 mM
PEP: 0.02 to 2 mM
ATP: 0.1-10 mM
AMP: 0.025-2.5 mM
NADH: 0.025-2.5 mM
PPDK: 0.01-1 U / ml
ASS: 0.01-1 U / ml
ADI: 0.01-1 U / ml
Lactate dehydrogenase: U / ml
In the embodiment using the lactate dehydrogenase reaction, arginine can be quantified in the range of at least 0 to 200 μM.
また、本発明のこの方法は、アルギニン以外のタンパク質を構成する19種類のアミノ酸、尿素及びアンモニアが夾雑する場合であっても、アルギニンをのみを選択的に定量することができる。なお、被検試料中にアスパラギン酸が夾雑している場合でも、シトルリン選択的な定量は可能である。 In addition, this method of the present invention can selectively quantify only arginine even when the 19 amino acids constituting urea other than arginine, urea and ammonia are contaminated. Even when aspartic acid is contaminated in the test sample, selective determination of citrulline is possible.
＜本発明の用途等＞
メチオニンはホモシスチン尿症患者において高濃度蓄積することが知られており、臨床においてはマス・スクリーニングのための重要なバイオマーカーとなる。また、シトルリンは体内に存在するアミノ酸の一種であり、血流促進や免疫活性化などに寄与している。その効能から、サプリメントなどの食品や医薬品で広く用いられている。また尿素回路中の代謝物の一つでもあり、シトルリン尿症をはじめとして、人体の尿素回路代謝異常を検出するバイオマーカーとしても重要視されている。そして、アルギニンはタンパク質構成アミノ酸の一種であり、食品や医薬品に含まれる重要な構成成分の一つである。また尿素回路中の代謝物の一つでもあり、アルギナーゼ欠損症をはじめとして、人体の尿素回路代謝異常を検出するバイオマーカーとしても重要視されている。本発明は、このような目的で対象物質を定量するために、用いることができる。
<Uses of the present invention>
Methionine is known to accumulate at high concentrations in patients with homocystinuria and is an important biomarker for mass screening in the clinic. Citrulline is a kind of amino acid present in the body and contributes to blood flow promotion and immune activation. Because of its efficacy, it is widely used in foods and medicines such as supplements. It is also one of the metabolites in the urea cycle, and is regarded as important as a biomarker for detecting abnormalities in the urea cycle in the human body, including citrullineuria. Arginine is a kind of protein-constituting amino acid and is one of important constituents contained in foods and pharmaceuticals. It is also one of the metabolites in the urea cycle, and is regarded as important as a biomarker for detecting abnormalities in the urea cycle in the human body, including arginase deficiency. The present invention can be used for quantifying a target substance for such purposes.
本発明のピロリン酸の定量方法、メチオニンの定量方法、シトルリンの定量方法、及びアルギニンの定量方法は、各種の生体由来の夾雑物質の共存下でも、適切に対象物質を定量することができる。したがって、本発明の各方法は、生体由来試料、例えば、血液、血清、血漿、尿、汗に対して適用することができる。本発明は特に、血液由来の試料に対して実施するのに適している。なお、本発明を、ピロリン酸の定量方法を例に説明することがあるが、その説明は、特に記載した場合を除き、メチオニンの定量方法、シトルリンの定量方法、及びアルギニンの定量方法にも当てはまる。 The pyrophosphoric acid quantification method, methionine quantification method, citrulline quantification method, and arginine quantification method of the present invention can appropriately quantify the target substance even in the presence of various biologically derived contaminants. Therefore, each method of the present invention can be applied to biological samples such as blood, serum, plasma, urine and sweat. The present invention is particularly suitable for implementation on blood-derived samples. Note that the present invention may be described using a pyrophosphate quantification method as an example, but the description also applies to a methionine quantification method, a citrulline quantification method, and an arginine quantification method, unless otherwise specified. .
本発明の方法は、比較的少量の対象物質の特定又は定量のために用いることができる。本発明の方法は、容量数十〜数百μlの系として実施することができる。本発明の方法を血液試料を対象に実施しようとする場合は、血液試料は、血漿や血清、乾燥ろ紙血液であることができる。乾燥ろ紙血液を用いる方法は、例えば、新生児の踵から採取した血液を専用の採血ろ紙に十分量染み込ませたものとすることができ、新生児のマス・スクリーニングにおいて、特に有用である。乾燥ろ紙血液を対象とする具体的な条件は、当業者であれば、既存のマス・スクリーニングのための方法のための条件を参考に、適宜設計できる。 The method of the present invention can be used for identification or quantification of a relatively small amount of a target substance. The method of the present invention can be implemented as a system having a capacity of several tens to several hundreds μl. When the method of the present invention is to be performed on a blood sample, the blood sample can be plasma, serum, or dry filter paper blood. The method using dry filter paper blood is particularly useful in mass screening of newborns, for example, a blood sample collected from a newborn's sputum can be sufficiently soaked in a dedicated blood collection filter paper. The specific conditions for the dry filter paper blood can be appropriately designed by those skilled in the art with reference to the conditions for the existing mass screening method.
本発明はまた、ピロリン酸の定量方法、メチオニンの定量方法、シトルリンの定量方法、及びアルギニンの定量方法のためのキット、又はコマーシャル・パッケージ（commercial package）を提供する。本発明のキット又はパッケージは、上述したような濃度範囲の各成分を、単独で又はいずれかの二以上の混合物として包含する各ユニットと、好ましくはキットの用途や使用方法が記載されたもの（箱、包装、ラベル、使用説明書等）を含む。 The present invention also provides a kit or a commercial package for a pyrophosphate quantification method, a methionine quantification method, a citrulline quantification method, and an arginine quantification method. The kit or package of the present invention describes each unit containing each component in the concentration range as described above alone or as a mixture of two or more, and preferably describes the use and usage method of the kit ( Box, packaging, label, instruction manual, etc.).
本発明により、少なくとも、メチオニン、シトルリン及びアルギニンの、簡易で迅速な定量方法が提供される。複数種類のアミノ酸の濃度の多変量解析は、病気の有無や健康状態の検査・診断のために注目されている。本発明の定量方法は、このような解析のためにも用いることができる。 The present invention provides a simple and rapid method for quantitative determination of at least methionine, citrulline and arginine. Multivariate analysis of the concentration of multiple types of amino acids is attracting attention for the examination and diagnosis of the presence or absence of diseases and health. The quantification method of the present invention can also be used for such analysis.
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが本発明はこれに限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.
1. 各酵素の調製例
1-1. PPDK発現プラスミドの構築
Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii NBRC12426株由来PPDK（PfPPDK）及びThermoproteus tenax NBRC100435株由来PPDK（TtPPDK）の発現用プラスミドを構築した。各菌体からゲノムDNAを調製した。
1. Preparation example of each enzyme
1-1. Construction of PPDK expression plasmid
Plasmids for expression of Propionibacterium freudenreichii subsp. Shermanii NBRC12426 strain-derived PPDK (PfPPDK) and Thermoproteus tenax NBRC100435 strain-derived PPDK (TtPPDK) were constructed. Genomic DNA was prepared from each cell.
PfPPDKについて、上記ゲノムDNAを鋳型とし、データベース上のPPDK遺伝子配列（配列番号1）を元に設計したプライマー（配列番号2、3）を用いてPCRを行い、遺伝子を増幅した。増幅産物をpET-28aに挿入し、PfPPDK発現用プラスミドとした。TtPPDKについて、上記ゲノムDNAを鋳型とし、データベース上のPPDK遺伝子配列（配列番号4）を元に設計したプライマー（配列番号5、6）を用いてPCRを行い、遺伝子を増幅した。増幅産物をpET-28aに挿入し、TtPPDK発現用プラスミドとした。 For PfPPDK, PCR was performed using the genomic DNA as a template and primers (SEQ ID NOs: 2 and 3) designed based on the PPDK gene sequence (SEQ ID NO: 1) on the database to amplify the gene. The amplified product was inserted into pET-28a to obtain a PfPPDK expression plasmid. For TtPPDK, PCR was performed using the genomic DNA as a template and primers (SEQ ID NOs: 5 and 6) designed based on the PPDK gene sequence (SEQ ID NO: 4) on the database to amplify the gene. The amplified product was inserted into pET-28a to obtain a TtPPDK expression plasmid.
各発現プラスミドをシークエンシングし、塩基配列を確認した。データベース上の遺伝子と比較して非同義置換が起きている箇所についてはQuikGeneキットによって修正し、データベース上と同じ配列の翻訳産物が得られるようにした。 Each expression plasmid was sequenced and the nucleotide sequence was confirmed. The part where non-synonymous substitution occurred compared with the gene on the database was corrected by the QuikGene kit so that the translation product of the same sequence as the database was obtained.
1-2. AdoMetS発現プラスミドの構築
Escherichia coli W3110株菌体からゲノムDNAを調製した。これを鋳型として、データベース上のAdoMetS遺伝子配列（配列番号7）を元に設計したプライマー（配列番号8、9）を用いてPCRを行い、AdoMetS遺伝子を増幅した。増幅産物をpET-28aに挿入し、AdoMetS発現用プラスミドとした。
1-2. Construction of AdoMetS expression plasmid
Genomic DNA was prepared from Escherichia coli W3110 strain. Using this as a template, PCR was performed using primers (SEQ ID NOs: 8 and 9) designed based on the AdoMetS gene sequence (SEQ ID NO: 7) on the database to amplify the AdoMetS gene. The amplified product was inserted into pET-28a to obtain an AdoMetS expression plasmid.
1-3. ASS発現プラスミドの構築
上記のE. coli W3110株ゲノムDNAを鋳型として、データベース上のASS遺伝子配列（配列番号10）を元に設計したプライマー（配列番号11、12）を用いてPCRを行い、ASS遺伝子を増幅した。増幅産物をpET-28aに挿入し、ASS発現用プラスミドとした。
1-3. Construction of ASS expression plasmid PCR using primers (SEQ ID NOs: 11 and 12) designed based on the ASS gene sequence (SEQ ID NO: 10) on the database using the above E. coli W3110 genomic DNA as a template The ASS gene was amplified. The amplified product was inserted into pET-28a to obtain an ASS expression plasmid.
1-4. ADI発現プラスミドの構築
Pseudomonas aeruginosa PAO1株菌体からゲノムDNAを調製した。これを鋳型として、データベース上のADI遺伝子配列（配列番号13）を元に設計したプライマー（配列番号14、15）を用いてPCRを行い、AdoMetS遺伝子を増幅した。増幅産物をpET-28aに挿入し、AdoMetS発現用プラスミドとした。
1-4. Construction of ADI expression plasmid
Genomic DNA was prepared from Pseudomonas aeruginosa PAO1 strain. Using this as a template, PCR was performed using primers (SEQ ID NOs: 14 and 15) designed based on the ADI gene sequence (SEQ ID NO: 13) on the database to amplify the AdoMetS gene. The amplified product was inserted into pET-28a to obtain an AdoMetS expression plasmid.
1-5. 各酵素の発現、精製
各発現用プラスミドで大腸菌BL21 (DE3)株を形質転換し、大量発現株として用いた。
各発現株を37℃の振盪培養でOD600が0.6〜0.8に達するまで培養し、IPTGを終濃度0.5 mMになるように添加することで発現誘導をかけた。発現誘導後、PPDK及びADI発現株は30℃、AdoMetS及びASS発現株は37℃で4時間振盪培養を行い、集菌した。菌体を超音波破砕し、可溶性画分に目的酵素が得られた。
1-5. Expression and purification of each enzyme Escherichia coli BL21 (DE3) strain was transformed with each expression plasmid and used as a large expression strain.
Each expression strain was cultured by shaking culture at 37 ° C. until the OD 600 reached 0.6 to 0.8, and expression was induced by adding IPTG to a final concentration of 0.5 mM. After expression induction, PPDK and ADI expression strains were subjected to shaking culture at 30 ° C., and AdoMetS and ASS expression strains were cultured at 37 ° C. for 4 hours, and collected. The cells were sonicated and the target enzyme was obtained in the soluble fraction.
各発現株破砕液上清をGEヘルスケア社製Ni Sepharoseカラムにロードし、20 mM Tris-HCl, 50 mM imidazole溶液で洗浄後、20 mM Tris-HCl, 500 mM imidazole溶液で溶出させることによって目的酵素を精製・回収した。上記の酵素液は必要に応じて、透析や限外濾過によりimidazoleの除去及びバッファーの交換を行ってから使用した。 The supernatant of each expression strain was loaded onto a GE Healthcare Ni Sepharose column, washed with 20 mM Tris-HCl, 50 mM imidazole solution, and then eluted with 20 mM Tris-HCl, 500 mM imidazole solution. The enzyme was purified and recovered. The above enzyme solution was used after removing imidazole and exchanging the buffer by dialysis or ultrafiltration if necessary.
各酵素精製液は、glycerolを終濃度20%となるように混合して-80℃で凍結保存したとき、安定に長期保存が可能であった。 Each enzyme purified solution could be stably stored for a long time when glycerol was mixed at a final concentration of 20% and stored frozen at -80 ° C.
2. ピロリン酸定量例
2-1. ピロリン酸定量の反応条件例1
ピロリン酸を含む検体と、下記の組成のピロリン酸定量用反応液を混合した。混合液を30℃に置いて反応を進行させ、340 nmの吸光度の減少量を測定した。混合液の液量は1 ml又は200μlになるようにし、前者の場合は光路長1 cmのキュベットと吸光光度計で、後者の場合はマイクロプレート（光路長不定）とマイクロプレートリーダーで吸光度測定を行った。なお図面においては、光路長1 cmのキュベットで測定した際の吸光度をAbs、マイクロプレートで測定した際の吸光度をAUと表記した。
ピロリン酸定量用反応液：20 mM Imidazole-HCl (pH 7.0), 5 mM MgCl2, 0.5 mM PEP, 0.5 mM AMP, 0.25 mM NADH, 0.1 U/ml PPDK, 0.5 U/ml 乳酸脱水素酵素（ウサギ筋肉由来、オリエンタル酵母株式会社製）（濃度は検体との混合後の終濃度）
2. Example of pyrophosphate determination
2-1. Example 1 of reaction conditions for pyrophosphate determination
A sample containing pyrophosphate and a reaction solution for quantifying pyrophosphate having the following composition were mixed. The reaction was allowed to proceed by placing the mixture at 30 ° C., and the amount of decrease in absorbance at 340 nm was measured. Adjust the volume of the mixture to 1 ml or 200 μl. In the former case, measure the absorbance with a cuvette and absorptiometer with an optical path length of 1 cm. In the latter case, measure the absorbance with a microplate (undefined path length) and a microplate reader. went. In the drawing, the absorbance when measured with a cuvette having an optical path length of 1 cm was expressed as Abs, and the absorbance when measured with a microplate was expressed as AU.
Reaction solution for pyrophosphate determination: 20 mM Imidazole-HCl (pH 7.0), 5 mM MgCl 2 , 0.5 mM PEP, 0.5 mM AMP, 0.25 mM NADH, 0.1 U / ml PPDK, 0.5 U / ml Lactate dehydrogenase (rabbit Muscle origin, manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd.) (The concentration is the final concentration after mixing with the sample)
2-2. ピロリン酸定量の反応条件例2
ピロリン酸を含む検体と、下記の組成のピロリン酸定量用反応液を混合した。混合液200μlを30℃に置いて反応を進行させ、505 nmの吸光度の増加量をマイクロプレートリーダーで測定した。
ピロリン酸定量用反応液：20 mM Imidazole-HCl (pH 7.0), 5 mM MgCl2, 10 mM NH4Cl, 0.5 mM PEP, 0.5 mM AMP, 0.1 U/ml PPDK, 0.5 mM Na-PO4, 1 mM 4-アミノアンチピリン, 1 mM フェノール, 1.5 U/ml ピルビン酸酸化酵素（PYRUVATE OXIDASE from Microorganism (Diagnostic Reagent Grade) TOYOBO ENZYMES）, 7.5 U/ml ペルオキシダーゼ（濃度は検体との混合後の終濃度）
2-2. Reaction condition example 2 for pyrophosphate determination
A sample containing pyrophosphate and a reaction solution for quantifying pyrophosphate having the following composition were mixed. The reaction was allowed to proceed by placing 200 μl of the mixed solution at 30 ° C., and the increase in absorbance at 505 nm was measured with a microplate reader.
Reaction solution for pyrophosphate determination: 20 mM Imidazole-HCl (pH 7.0), 5 mM MgCl 2 , 10 mM NH 4 Cl, 0.5 mM PEP, 0.5 mM AMP, 0.1 U / ml PPDK, 0.5 mM Na-PO 4 , 1 mM 4-aminoantipyrine, 1 mM phenol, 1.5 U / ml pyruvate oxidase (PYRUVATE OXIDASE from Microorganism (Diagnostic Reagent Grade) TOYOBO ENZYMES), 7.5 U / ml peroxidase (concentration is the final concentration after mixing with the sample)
2-3. ピロリン酸定量の反応条件例3
ピロリン酸を含む検体と、下記の組成のピロリン酸定量用反応液を混合した。混合液200μlを30℃に置いて反応を進行させ、590 nmの蛍光（励起光530 nm）の増加量をマイクロプレートリーダーで測定した。
ピロリン酸定量用反応液：20 mM Imidazole-HCl (pH 7.0), 5 mM MgCl2, 10 mM NH4Cl, 0.5 mM PEP, 0.5 mM AMP, 0.1 U/ml PPDK, 0.5 mM Na-PO4,50μM ADHP , 1.5 U/ml ピルビン酸酸化酵素, 7.5 U/ml ペルオキシダーゼ（濃度は検体との混合後の終濃度）
2-3. Reaction condition example 3 for pyrophosphate determination
A sample containing pyrophosphate and a reaction solution for quantifying pyrophosphate having the following composition were mixed. The reaction was allowed to proceed by placing 200 μl of the mixed solution at 30 ° C., and the amount of increase in fluorescence at 590 nm (excitation light 530 nm) was measured with a microplate reader.
Reaction solution for pyrophosphate determination: 20 mM Imidazole-HCl (pH 7.0), 5 mM MgCl 2 , 10 mM NH 4 Cl, 0.5 mM PEP, 0.5 mM AMP, 0.1 U / ml PPDK, 0.5 mM Na-PO 4 , 50 μM ADHP, 1.5 U / ml pyruvate oxidase, 7.5 U / ml peroxidase (concentration is final concentration after mixing with specimen)
2-4. ピロリン酸定量の検量線作成例
各種濃度のピロリン酸標準溶液を検体として用い、検量線が作成可能か検証した。
反応条件を実施例2-1に記載のようにし、光路長1 cmのキュベットと吸光光度計で測定を行った。反応は混合後10分後には終了しており、PfPPDKを用いた系では図1(A)、TtPPDKを用いた系では図1(B)のような検量線が得られた。検量線の直線性は高く、本手法により少なくとも0〜200μMの範囲においてピロリン酸の定量が可能であることが示された。また検量線の傾きは、PfPPDKを用いたとき6.0 mM-1・cm-1、TtPPDKを用いたとき6.4 mM-1・cm-1であり、これはNADHのモル吸光係数（6.2 mM-1・cm-1）と同等な値であることから、検体中のピロリン酸のほぼ全量がNADH酸化に用いられたことが示された。
2-4. Example of preparing a calibration curve for pyrophosphate determination Using a standard solution of pyrophosphate of various concentrations as a sample, it was verified whether a calibration curve could be created.
The reaction conditions were as described in Example 2-1, and measurement was performed with a cuvette having an optical path length of 1 cm and an absorptiometer. The reaction was completed 10 minutes after mixing, and a calibration curve as shown in FIG. 1 (A) was obtained for the system using PfPPDK and FIG. 1 (B) was obtained for the system using TtPPDK. The linearity of the calibration curve was high, and it was shown that pyrophosphate can be quantified in the range of at least 0 to 200 μM by this method. The slope of the calibration curve was 6.0 mM -1 · cm -1 when using PfPPDK and 6.4 mM -1 · cm -1 when using TtPPDK, which is the molar extinction coefficient of NADH (6.2 mM -1 · 1 ). Since it was a value equivalent to cm −1 ), it was shown that almost the entire amount of pyrophosphate in the specimen was used for NADH oxidation.
反応条件を実施例2-1に記載のようにし、PfPPDKを用い、マイクロプレートとマイクロプレートリーダーで測定を行った場合の結果は図2のようになった。吸光度計を用いた場合と同様に直線性の高い検量線が得られ、本系によるピロリン酸定量がマイクロプレートリーダーでも使用可能であることが示された。 The reaction conditions were as described in Example 2-1, and when PfPPDK was used and measurement was performed with a microplate and a microplate reader, the results were as shown in FIG. A calibration curve with high linearity was obtained as in the case of using an absorptiometer, and it was shown that pyrophosphate quantification using this system can also be used with a microplate reader.
実施例2-2のような反応条件でPfPPDKを用いて測定を行った結果、図3のような検量線が得られた。実施例2-1と同様に直線性の高い検量線が得られ、本系が4-アミノアンチピリンを用いた発色系でも使用可能であることが示された。
実施例2-3のような反応条件でPfPPDKを用いて測定を行った結果、図4のような検量線が得られた。0〜10μMの範囲のピロリン酸濃度で高い直線性が得られ、ADHPなどの蛍光色素を用いることで、低濃度のピロリン酸でも高感度に定量可能であることが示された。
As a result of measurement using PfPPDK under the reaction conditions as in Example 2-2, a calibration curve as shown in FIG. 3 was obtained. A calibration curve with high linearity was obtained in the same manner as in Example 2-1, indicating that this system can also be used in a coloring system using 4-aminoantipyrine.
As a result of measurement using PfPPDK under the reaction conditions as in Example 2-3, a calibration curve as shown in FIG. 4 was obtained. High linearity was obtained at pyrophosphoric acid concentrations in the range of 0 to 10 μM, and it was shown that by using fluorescent dyes such as ADHP, even low concentrations of pyrophosphoric acid can be quantified with high sensitivity.
2-5. リン酸又はATP共存下におけるピロリン酸定量
本定量系がリン酸又はATP共存下でも使用可能かどうかを検証するため、下記の三種類のうちいずれかを検体として用い、ピロリン酸の検量線が作成可能かを検証した。
・各種濃度のピロリン酸標準溶液
・各種濃度のピロリン酸標準溶液と0.3 mMリン酸標準溶液（濃度は反応液との混合後終濃度）
・各種濃度のピロリン酸標準溶液と0.3 mM ATP標準溶液（濃度は反応液との混合後終濃度）
2-5. Determination of pyrophosphate in the presence of phosphoric acid or ATP In order to verify whether this quantification system can be used in the presence of phosphoric acid or ATP, one of the following three types was used as a sample. It was verified whether a calibration curve could be created.
・ Pyrophosphate standard solution with various concentrations ・ Pyrophosphate standard solution with various concentrations and 0.3 mM phosphoric acid standard solution (concentration is final concentration after mixing with reaction solution)
・ Pyrophosphate standard solution and 0.3 mM ATP standard solution (concentration is final concentration after mixing with reaction solution)
反応条件は実施例2-1のようにし、PPDKにはPfPPDKを用いた。上記三種類のサンプルでそれぞれ測定を行った結果、図5のような検量線が得られた。各ピロリン酸濃度における吸光度や、3条件での検量線の傾きについて、リン酸又はATPの共存による顕著な差は見られなかった。よって、本ピロリン酸定量系が、リン酸又はATPの共存下でも影響を受けず、定量が可能であることが示された。 The reaction conditions were as in Example 2-1, and PfPPDK was used as the PPDK. As a result of measuring each of the above three types of samples, a calibration curve as shown in FIG. 5 was obtained. There was no significant difference in the absorbance at each pyrophosphate concentration or the slope of the calibration curve under the three conditions due to the coexistence of phosphoric acid or ATP. Therefore, it was shown that this pyrophosphate quantification system is not affected even in the presence of phosphoric acid or ATP, and quantification is possible.
2-6. 生体試料におけるピロリン酸添加回収実験例
本定量系が実際に生体試料共存下でも使用可能かどうかを検証するため、下記2種類のうちいずれかを検体として用い、ピロリン酸の検量線が作成可能かを検証した。
・各種濃度のピロリン酸標準溶液
・各種濃度のピロリン酸標準溶液と50%ヒト血漿（濃度は反応液との混合後終濃度）
2-6. Pyrophosphate addition recovery experiment in biological samples In order to verify whether this quantification system can actually be used even in the presence of biological samples, one of the following two types was used as a sample, and a pyrophosphoric acid calibration curve It was verified whether can be created.
・ Pyrophosphate standard solutions of various concentrations ・ Pyrophosphate standard solutions of various concentrations and 50% human plasma (the concentration is the final concentration after mixing with the reaction solution)
反応条件は実施例2-1のようにし、PPDKにはPfPPDKを用いた。上記二種類のサンプルでそれぞれ測定を行った結果、図6のような検量線が得られた。各ピロリン酸濃度における吸光度や、2条件での検量線の傾きについて、ヒト血漿の共存による顕著な差は見られなかった。よって、本ピロリン酸定量系が、ヒト血漿共存下でも影響を受けず、生体試料においても定量が可能であることが示された。 The reaction conditions were as in Example 2-1, and PfPPDK was used as the PPDK. As a result of measuring each of the two types of samples, a calibration curve as shown in FIG. 6 was obtained. There was no significant difference in the absorbance at each pyrophosphate concentration or the slope of the calibration curve under the two conditions due to the coexistence of human plasma. Therefore, it was shown that this pyrophosphate quantification system is not affected even in the presence of human plasma and can be quantified in biological samples.
3. メチオニン定量例
3-1. メチオニン定量の反応条件例
メチオニンを含む検体と、下記の組成のメチオニン定量用反応液を混合した。混合液200μlを30℃に置いて反応を進行させ、340 nmの吸光度の減少量をマイクロプレートリーダーで測定した。
メチオニン定量用反応液：20 mM Imidazole-HCl (pH 7.0), 5 mM MgCl2, 1 mM ATP, 0.5 mM PEP, 0.4 mM AMP, 0.25 mM NADH, 0.1 U/ml PfPPDK, 0.5 U/ml 乳酸脱水素酵素, 0.2 U/ml AdoMetS（濃度は検体との混合後の終濃度）
3. Example of methionine determination
3-1. Example of Reaction Conditions for Quantification of Methionine A sample containing methionine was mixed with a reaction solution for methionine determination having the following composition. The reaction was allowed to proceed by placing 200 μl of the mixed solution at 30 ° C., and the decrease in absorbance at 340 nm was measured with a microplate reader.
Reaction solution for methionine determination: 20 mM Imidazole-HCl (pH 7.0), 5 mM MgCl 2 , 1 mM ATP, 0.5 mM PEP, 0.4 mM AMP, 0.25 mM NADH, 0.1 U / ml PfPPDK, 0.5 U / ml lactate dehydrogenation Enzyme, 0.2 U / ml AdoMetS (concentration is final concentration after mixing with sample)
3-2. メチオニン定量の検量線作成例
検体として、反応液との混合後終濃度が0〜100 μMとなるような標準メチオニン溶液又は標準ピロリン酸溶液を用いた。各サンプルのメチオニン又はピロリン酸終濃度と吸光度差をプロットしたものを図7に示す。メチオニン添加サンプルでもピロリン酸添加サンプルと同様に直線性の高い検量線が得られ、本反応液でメチオニン定量が可能であることが示された。またメチオニン検量線とピロリン酸検量線の傾きはほぼ一致しており、反応液中のメチオニンのほぼ全てがピロリン酸に変換され反応に用いられたことが示された。
3-2. Example of preparing a calibration curve for quantification of methionine As a sample, a standard methionine solution or a standard pyrophosphate solution having a final concentration of 0 to 100 μM after mixing with the reaction solution was used. FIG. 7 shows a plot of the methionine or pyrophosphate final concentration and the absorbance difference of each sample. Similarly to the pyrophosphate-added sample, a calibration curve with high linearity was obtained for the methionine-added sample, and it was shown that methionine quantification was possible with this reaction solution. The slopes of the methionine calibration curve and the pyrophosphoric acid calibration curve almost coincided, indicating that almost all of the methionine in the reaction solution was converted to pyrophosphoric acid and used for the reaction.
3-3. 各種アミノ酸及びアンモニアとの反応性
検体として、反応液との混合後終濃度が200 μMとなるような各種アミノ酸及びNH4Clを用いた。なおアミノ酸としては、メチオニン以外の19種のタンパク質構成アミノ酸を用いた。
3-3. Various amino acids and NH 4 Cl having a final concentration of 200 μM after mixing with the reaction solution were used as reactive samples with various amino acids and ammonia . As amino acids, 19 kinds of protein constituting amino acids other than methionine were used.
測定の結果、いずれのサンプルでも、検体依存的な有意な吸光度変化は見られなかった。これより、本定量系がメチオニン以外のタンパク質構成アミノ酸やアンモニアと反応性を有さず、選択性の高いメチオニン定量が可能であることが示された。 As a result of the measurement, no significant sample-dependent change in absorbance was observed in any sample. From this, it was shown that this quantification system has no reactivity with protein-constituting amino acids other than methionine and ammonia, and methionine quantification with high selectivity is possible.
4. シトルリン定量例
4-1. シトルリン定量の反応条件例
20 mM Imidazole-HCl (pH 7.0), 5 mM MgCl2, 2 mM アスパラギン酸, 2 mM PEP, 1 mM ATP, 0.25 mM AMP, 0.25 mM NADH, 0.1 U/ml PfPPDK, 0.5 U/ml 乳酸脱水素酵素, 0.2 U/ml ASS, 0-200μMシトルリンを終濃度で含むような反応液を調製した。混合液200μlを30℃に置いて反応を進行させ、340 nmの吸光度の減少量をマイクロプレートリーダーで測定した。
4. Citrulline determination example
4-1. Example of reaction conditions for citrulline determination
20 mM Imidazole-HCl (pH 7.0), 5 mM MgCl 2 , 2 mM aspartic acid, 2 mM PEP, 1 mM ATP, 0.25 mM AMP, 0.25 mM NADH, 0.1 U / ml PfPPDK, 0.5 U / ml lactate dehydrogenase , 0.2 U / ml ASS, 0-200 μM citrulline in a final concentration was prepared. The reaction was allowed to proceed by placing 200 μl of the mixed solution at 30 ° C., and the decrease in absorbance at 340 nm was measured with a microplate reader.
4-2. シトルリン定量の検量線作成例
検体として、反応液との混合後終濃度が0〜200 μMとなるような標準シトルリン溶液又は標準ピロリン酸溶液を用いた。各サンプルのシトルリン又はピロリン酸終濃度と吸光度差をプロットしたものを図8に示す。シトルリン添加サンプルでもピロリン酸添加サンプルと同様に直線性の高い検量線が得られ、本反応液でシトルリン定量が可能であることが示された。またシトルリン検量線とピロリン酸検量線の傾きはほぼ一致しており、反応液中のシトルリンのほぼ全てがピロリン酸に変換され反応に用いられたことが示された。
4-2. Example of preparing a calibration curve for citrulline determination As a sample, a standard citrulline solution or a standard pyrophosphate solution having a final concentration of 0 to 200 μM after mixing with the reaction solution was used. FIG. 8 shows a plot of the citrulline or pyrophosphate final concentration and the absorbance difference of each sample. Similar to the pyrophosphate-added sample, a highly linear calibration curve was obtained for the citrulline-added sample, and it was shown that citrulline quantification was possible with this reaction solution. In addition, the slopes of the citrulline calibration curve and the pyrophosphoric acid calibration curve almost coincided, indicating that almost all citrulline in the reaction solution was converted to pyrophosphoric acid and used for the reaction.
4-3. 各種アミノ酸及び尿素との反応性
検体として、反応液との混合後終濃度が200μMとなるような各種アミノ酸及び尿素を用いた。なおアミノ酸としては、アスパラギン酸以外の19種のタンパク質構成アミノ酸を用いた。
4-3. Various amino acids and urea having a final concentration of 200 μM after mixing with the reaction solution were used as reactive samples with various amino acids and urea. As amino acids, 19 protein-constituting amino acids other than aspartic acid were used.
測定の結果、いずれのサンプルでも、検体依存的な有意な吸光度変化は見られなかった。これより、本定量系がシトルリン以外のタンパク質構成アミノ酸や尿素と反応性を有さず、選択性の高いシトルリン定量が可能であることが示された。 As a result of the measurement, no significant sample-dependent change in absorbance was observed in any sample. From this, it was shown that this quantification system has no reactivity with protein-constituting amino acids other than citrulline and urea, and it is possible to quantify citrulline with high selectivity.
5. アルギニン定量例
5-1. アルギニン定量の反応条件例
20 mM Imidazole-HCl (pH 7.0), 5 mM MgCl2, 2 mM アスパラギン酸, 2 mM PEP, 1 mM ATP, 0.25 mM AMP, 0.25 mM NADH, 0.1 U/ml PfPPDK, 0.5 U/ml 乳酸脱水素酵素, 0.2 U/ml ASS, 0.2 U/ml ADI, 0-200μMアルギニンを終濃度で含むような反応液を調製した。混合液200μlを30℃に置いて反応を進行させ、340 nmの吸光度の減少量をマイクロプレートリーダーで測定した。
5. Arginine determination example
5-1. Example of reaction conditions for arginine determination
20 mM Imidazole-HCl (pH 7.0), 5 mM MgCl 2 , 2 mM aspartic acid, 2 mM PEP, 1 mM ATP, 0.25 mM AMP, 0.25 mM NADH, 0.1 U / ml PfPPDK, 0.5 U / ml lactate dehydrogenase , 0.2 U / ml ASS, 0.2 U / ml ADI, and 0-200 μM arginine at final concentrations were prepared. The reaction was allowed to proceed by placing 200 μl of the mixed solution at 30 ° C., and the decrease in absorbance at 340 nm was measured with a microplate reader.
5-2. アルギニン定量の検量線作成例
検体として、反応液との混合後終濃度が0〜200μMとなるような標準アルギニン溶液又は標準シトルリン溶液を用いた。各サンプルのアルギニン又はピロリン酸終濃度と吸光度差をプロットしたものを図9に示す。アルギニン添加サンプルでもシトルリン添加サンプルと同様に直線性の高い検量線が得られ、本反応液でアルギニン定量が可能であることが示された。またアルギニン検量線とシトルリン検量線の傾きの差は10%程度にとどまり、反応液中のアルギニンのほぼ全てがシトルリンに変換され反応に用いられたことが示された。
5-2. Example of preparing calibration curve for quantification of arginine A standard arginine solution or a standard citrulline solution having a final concentration of 0 to 200 μM after mixing with the reaction solution was used as a sample. FIG. 9 shows a plot of the arginine or pyrophosphate final concentration and the absorbance difference of each sample. Similarly to the citrulline-added sample, the arginine-added sample gave a calibration curve with high linearity, indicating that arginine can be quantified using this reaction solution. The difference in slope between the arginine calibration curve and the citrulline calibration curve was only about 10%, indicating that almost all of the arginine in the reaction solution was converted to citrulline and used for the reaction.
5-3. 各種アミノ酸、尿素及びアンモニアとの反応性
検体として、反応液との混合後終濃度が200μMとなるような各種アミノ酸、アンモニア、及び尿素を用いた。なおアミノ酸としては、アルギニンとアスパラギン酸以外の18種のタンパク質構成アミノ酸を用いた。
5-3. Various amino acids, ammonia, and urea having a final concentration of 200 μM after mixing with the reaction solution were used as reactive samples with various amino acids, urea, and ammonia . As amino acids, 18 kinds of protein constituting amino acids other than arginine and aspartic acid were used.
測定の結果、いずれのサンプルでも、検体依存的な有意な吸光度変化は見られなかった。これより、本定量系がアルギニンやシトルリン以外のタンパク質構成アミノ酸や尿素と反応性を有さず、選択性の高いアルギニン定量が可能であることが示された。 As a result of the measurement, no significant sample-dependent change in absorbance was observed in any sample. From this, it was shown that this quantification system has no reactivity with protein-constituting amino acids other than arginine and citrulline and urea, and arginine quantification with high selectivity is possible.
メチオニンやシトルリン、アルギニンは生体内の主要なアミノ酸の一種であり、食品や医薬品に含まれる重要な構成成分の一つである。メチオニンは必須アミノ酸の一つであり、血液中コレステロールやヒスタミンの軽減、活性酸素除去といった効果が知られている一方で、大量投与は脂肪肝の原因にもなる。シトルリンは血流促進や免疫活性化などに寄与することが知られ、その効能から、サプリメントなどの食品や医薬品で広く用いられている。アルギニンは成長期に接種が必要な準必須アミノ酸であり、免疫力向上や疲労回復のため食品や医薬品に用いられている。このためこれらのアミノ酸の定量は、食品分析、医薬品・サプリメントの品質管理、過剰症・欠乏症時の血液検査及び酵素センサーとして利用が考えられる。 Methionine, citrulline, and arginine are one of the main amino acids in the living body, and are one of the important components contained in foods and pharmaceuticals. Methionine is one of the essential amino acids, and its effects such as reducing blood cholesterol and histamine and removing active oxygen are known. On the other hand, large doses can cause fatty liver. Citrulline is known to contribute to blood flow promotion and immune activation, and is widely used in foods and pharmaceuticals such as supplements because of its efficacy. Arginine is a semi-essential amino acid that needs to be inoculated during the growth period, and is used in foods and pharmaceuticals to improve immunity and relieve fatigue. For this reason, the quantification of these amino acids can be used for food analysis, quality control of pharmaceuticals and supplements, blood tests in excess / deficiency, and enzyme sensors.
またメチオニンはホモシスチン尿症患者において高濃度蓄積することが知られており、臨床においてはマス・スクリーニングのための重要なバイオマーカーとなる。シトルリンとアルギニンは尿素回路中の代謝物の一つであり、シトルリン尿症やアルギナーゼ欠損症をはじめとする尿素回路代謝異常のバイオマーカーとなる。このためこれらのアミノ酸の定量は、上記疾病検出の簡便なマス・スクリーニングとしての利用も期待される。 Methionine is known to accumulate at high concentrations in patients with homocystinuria and is an important biomarker for mass screening in the clinic. Citrulline and arginine are one of the metabolites in the urea cycle and serve as biomarkers for urea cycle metabolism abnormalities such as citrulline urine disease and arginase deficiency. Therefore, the quantification of these amino acids is expected to be used as a simple mass screening for the detection of the above-mentioned diseases.
配列番号1：PfPPDK遺伝子配列
配列番号2：プライマー配列
配列番号3：プライマー配列
配列番号4：TtPPDK遺伝子配列
配列番号5：プライマー配列
配列番号6：プライマー配列
配列番号7：AdoMetS遺伝子配列
配列番号8：プライマー配列
配列番号9：プライマー配列
配列番号10：ASS遺伝子配列
配列番号11：プライマー配列
配列番号12：プライマー配列
配列番号13：ADI遺伝子配列
配列番号14：プライマー配列
配列番号15：プライマー配列
SEQ ID NO: 1: PfPPDK gene sequence SEQ ID NO: 2: primer sequence SEQ ID NO: 3: primer sequence SEQ ID NO: 4: TtPPDK gene sequence SEQ ID NO: 5: primer sequence SEQ ID NO: 7: primer sequence SEQ ID NO: 7: AdoMetS gene sequence SEQ ID NO: 8: primer Sequence number 9: Primer sequence number 10: ASS gene sequence number 11: Primer sequence number 12: Primer sequence number 13: ADI gene sequence number 14: Primer sequence number 15: Primer sequence
Claims (11)
生成されたピルビン酸を定量する工程
を含み、得られたピルビン酸量に基づいてピロリン酸量を決定する、ピロリン酸を定量する方法。 Pyrophosphate pyruvate dikinase (PPDK) is allowed to act on pyrophosphate in the presence of adenosine monophosphate (AMP) and phosphoenolpyruvate (PEP) to convert adenosine triphosphate (ATP) phosphate and pyruvate. A method for quantifying pyrophosphate, the method comprising determining the amount of pyrophosphate based on the amount of pyruvic acid obtained, and comprising determining the amount of pyruvic acid generated.
ピルビン酸に、（i）乳酸脱水素酵素、（ii）ピルビン酸酸化酵素、（iii）ピルビン酸脱炭酸酵素及びアルコール脱水素酵素、又は（iv）ピルビン酸脱炭酸酵素及びアルデヒド脱水素酵素を作用させる工程を経るものである、請求項1に記載の方法。 The process of quantifying pyruvic acid is
(I) lactate dehydrogenase, (ii) pyruvate oxidase, (iii) pyruvate decarboxylase and alcohol dehydrogenase, or (iv) pyruvate decarboxylase and aldehyde dehydrogenase on pyruvate 2. The method according to claim 1, wherein the method undergoes a step of causing the reaction to occur.
対象物質に、対象物質の変換と共にATPを基質としてピロリン酸を生成しうる酵素を作用させて、ピロリン酸を生成させる工程；
生成されたピロリン酸に、AMP及びホスホエノールピルビン酸（PEP）存在下で、PPDKを作用させ、ATP、リン酸、及びピルビン酸を生成させる工程；及び
生成されたピルビン酸を定量する工程
を含み、得られたピルビン酸量に基づいて対象物質量を決定する、対象物質を定量する方法。 A method for quantifying a target substance:
A step of generating pyrophosphate by causing an enzyme capable of generating pyrophosphate using ATP as a substrate along with the conversion of the target substance to the target substance;
A step of allowing PPDK to act on the produced pyrophosphate in the presence of AMP and phosphoenolpyruvate (PEP) to produce ATP, phosphate, and pyruvate; and a step of quantifying the produced pyruvate A method for quantifying a target substance, wherein the target substance amount is determined based on the obtained amount of pyruvic acid.
生成されたピロリン酸に、AMP及びホスホエノールピルビン酸（PEP）存在下で、PPDKを作用させ、ATP、リン酸、及びピルビン酸を生成させる工程；及び
生成されたピルビン酸を定量する工程
を含み、得られたピルビン酸量に基づいてメチオニン量を決定する、メチオニンを定量する方法。 A step of causing adenosylmethionine synthase (AdoMetS) to act on methionine in the presence of ATP to produce adenosylmethionine and pyrophosphate;
A step of allowing PPDK to act on the produced pyrophosphate in the presence of AMP and phosphoenolpyruvate (PEP) to produce ATP, phosphate, and pyruvate; and a step of quantifying the produced pyruvate A method for quantifying methionine, wherein the amount of methionine is determined based on the amount of pyruvic acid obtained.
生成されたピロリン酸に、AMP及びPEP存在下で、PPDKを作用させ、ATP、リン酸、及びピルビン酸を生成させる工程；及び
生成されたピルビン酸を定量する工程
を含み、得られたピルビン酸量に基づいてシトルリン量を決定する、シトルリンを定量する方法。 Causing citrulline to act on argininosuccinate synthase (ASS) in the presence of aspartic acid and ATP to produce AMP, arginosuccinic acid, and pyrophosphoric acid;
A step of allowing PPDK to act on the produced pyrophosphate in the presence of AMP and PEP to produce ATP, phosphoric acid and pyruvic acid; and a step of quantifying the produced pyruvic acid, A method for quantifying citrulline, wherein the amount of citrulline is determined based on the amount.
生成されたシトルリンに、ASSを作用させ、AMP、アルギノコハク酸、及びピロリン酸を生成させる工程；
生成されたピロリン酸に、AMP及びPEP存在下で、PPDKを作用させ、ATP、リン酸、及びピルビン酸を生成させる工程；及び
生成されたピルビン酸を定量する工程
を含み、得られたピルビン酸量に基づいてアルギニン量を決定する、アルギニンを定量する方法。 A process of causing arginine to act on arginine deiminase (ADI) to produce ammonia and citrulline:
A step of causing ASS to act on the produced citrulline to produce AMP, arginosuccinic acid, and pyrophosphoric acid;
A step of allowing PPDK to act on the produced pyrophosphate in the presence of AMP and PEP to produce ATP, phosphoric acid and pyruvic acid; and a step of quantifying the produced pyruvic acid, A method for quantifying arginine, wherein the amount of arginine is determined based on the amount.
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