JP2013151462A

JP2013151462A - Diabetic nephropathy therapeutic agent including nitrosonifedipine derivative as active ingredient

Info

Publication number: JP2013151462A
Application number: JP2012013831A
Authority: JP
Inventors: Toshiaki Tamaoki; 俊晃玉置; Koichiro Tsuchiya; 浩一郎土屋; Keisuke Ishizawa; 啓介石澤
Original assignee: University of Tokushima NUC
Current assignee: University of Tokushima NUC
Priority date: 2012-01-26
Filing date: 2012-01-26
Publication date: 2013-08-08
Anticipated expiration: 2032-01-26
Also published as: JP5360933B2

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a diabetic nephropathy therapeutic agent.SOLUTION: A diabetic nephropathy therapeutic agent includes a nitrosonifedipine derivative represented by formula (1) as an active ingredient. In the formula: Ris a lower alkyl group; Ris a substituted or unsubstituted lower alkyl group; and X' is a nitroso group at the 2-, 3- or 4- position.

Description

本発明は、ニトロソニフェジピン誘導体を有効成分とする新規な糖尿病性腎症治療剤に関する。更に詳しくは、本発明の糖尿病性腎症治療剤は、尿中アルブミンおよび尿中タンパクの排泄量増加を抑制し、メサンギュウム領域の拡大を抑制できる。更に尿中の８-ヒドロキシデオキシグアノシン（８−ＯＨｄＧ）の増加を抑制して、糖尿病性腎症の進行抑制に有用な治療剤である。 The present invention relates to a novel therapeutic agent for diabetic nephropathy comprising a nitrosonifedipine derivative as an active ingredient. More specifically, the therapeutic agent for diabetic nephropathy of the present invention can suppress an increase in the excretion amount of urinary albumin and urinary protein, and can suppress the expansion of the mesangial region. Furthermore, it is a therapeutic agent useful for suppressing the progression of diabetic nephropathy by suppressing the increase of 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG) in urine.

我が国における糖尿病患者数は生活習慣の欧米化に伴い年々増加し、糖尿病予備軍を含めた患者数は約２０００万人に達しているとされている。糖尿病患者において、特に問題となるのが糖尿病合併症によるＱＯＬの低下である。糖尿病性腎症は我が国における透析導入原疾患の第１位であり透析導入率の約４５％を占めている。
ニフェジピン（ＮＩＦ）は世界中で広く高血圧治療薬として使用されているカルシウム拮抗薬である。ニフェジピンは生体内でそのニトロ基がニトロソ基に変換されて、Ｃａチャネル拮抗作用をほとんど示さないニトロソニフェジピン（ＮＯ−ＮＩＦ）となることが知られている（非特許文献１）。また、光照射下においても同様にニトロソニフェジピン（ＮＯ−ＮＩＦ）に変化することが知られている。この代謝物のニトロソニフェジピンの薬理作用については、細胞膜保護作用があることが報告されている（特許文献１）。また、そのメカニズムは、ＮＯ−ＮＩＦの持つラジカルの強い消去能であり、その結果、酸化ストレスの抑制効果を示すことが明らかにされている（非特許文献２〜４）。
一方、酸化ストレスの亢進が糖尿病合併症の成因であるとされており、酸化ストレス亢進が糖尿病性腎症の発症に関与していることが報告されている（非特許文献５）。ビタミンＥなどの抗酸化剤の効果が検討されているが、充分な効果は出ていない。また、特許文献２で示される抗酸化剤であるＮＯ-ＮＩＦに関しても、糖尿病性腎症に対する治療効果は、これまで全く報告がされていない。 The number of diabetic patients in Japan has been increasing year by year with the shift of lifestyle habits to Europe and the United States, and the number of patients including diabetic reserves is said to have reached about 20 million. Particularly problematic in diabetic patients is a reduction in QOL due to diabetic complications. Diabetic nephropathy is the leading primary dialysis disease in Japan and accounts for about 45% of the dialysis introduction rate.
Nifedipine (NIF) is a calcium antagonist widely used throughout the world as a treatment for hypertension. It is known that nifedipine is converted to nitroso group in vivo and becomes nitrosonifedipine (NO-NIF) which hardly shows Ca channel antagonistic action (Non-patent Document 1). Moreover, it is known that it changes to nitrosonifedipine (NO-NIF) similarly under light irradiation. As for the pharmacological action of this metabolite, nitrosonifedipine, it has been reported that it has a protective action on cell membrane (Patent Document 1). Moreover, it has been clarified that the mechanism is a strong radical scavenging ability of NO-NIF and, as a result, exhibits an effect of suppressing oxidative stress (Non-Patent Documents 2 to 4).
On the other hand, increased oxidative stress is considered to be a cause of diabetic complications, and it has been reported that increased oxidative stress is involved in the development of diabetic nephropathy (Non-patent Document 5). Although the effect of antioxidants such as vitamin E has been studied, it has not been sufficiently effective. In addition, regarding NO-NIF, which is an antioxidant shown in Patent Document 2, no therapeutic effect on diabetic nephropathy has been reported so far.

特開２００７−９１６６４号公報JP 2007-91664 A 特開２００９−７３７５９号公報JP 2009-73759 A

マグネティック・レゾナンス・イン・メディシン（Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｍｅｄ．）４２：６９１−６９４，１９９９Magnetic Resonance in Medicine (Magn. Reson. Med.) 42: 691-694, 1999 ジャーナル・ファルマコロジカル・サイエンス（Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．）１０９，１４−１９（２００９）Journal Pharmacolal Science (J. Pharmacol. Sci.) 109, 14-19 (2009) ジャーナル・メデイカル・インベスディゲイション（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｉｎｖｅｓｔ．）５８：１１８−１２６，２０１１Journal Medal Invest. 58: 118-126, 2011 ケミカル・ファーマシュウテイカル・ブレタン（Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．）５９（２）２０８−２１４（２０１１）Chemical Pharmaceuticals Bulletin (Chem. Pharm. Bull.) 59 (2) 208-214 (2011) 福岡医誌、９９（３）：４５−５５（２００８）Fukuoka Medical Journal, 99 (3): 45-55 (2008)

本発明は、新規な糖尿病性腎症の治療剤を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a novel therapeutic agent for diabetic nephropathy.

本発明者らは、ニトロソニフェジピン誘導体を用いた酸化ストレス軽減作用の研究を進める中で、今回、糖尿病の合併症の一つである糖尿病性腎症に着目した。本発明者らは、糖尿病性腎症に対するニトロソニフェジピン誘導体の効果を評価するため、糖尿病性腎症のモデル動物としてＫＫＡｙマウス（１２週令）を使用し、その効果を評価した。その結果、以下に示すニトロソニフェジピン誘導体の効果が見出された。
ａ）図１と２に示すように、尿中アルブミンおよび尿中タンパク質の排出量増加を抑制する。
ｂ）図３に示すように、腎糸球体直径の伸長および糸球体係蹄面積の拡大を抑制する。
ｃ）図１０に示すように、尿中の８-ヒドロキシデオキシグアノシン（８−ＯＨｄＧ）の増加を抑制する。
ｄ）図１１に示すように、腎臓における活性酸素種（ＲＯＳ）の産生を抑制する。
ｅ）図１２に示すように、腎臓におけるＴＮＦ−αのｍＲＮＡ発現上昇を抑制する。
ｆ）図５〜６に示すように、耐糖能、インスリン抵抗性、血圧に関して影響を与えない。
ｇ）図７〜９に示すように、脂肪細胞の肥大と白色脂肪細胞の組織重量の増加に対して影響を与えない。 The present inventors paid attention to diabetic nephropathy, which is one of the complications of diabetes, while researching the oxidative stress mitigating action using a nitrosonifedipine derivative. In order to evaluate the effect of the nitrosonifedipine derivative on diabetic nephropathy, the present inventors used KKAy mice (12 weeks old) as a model animal for diabetic nephropathy and evaluated the effect. As a result, the effects of the following nitrosonifedipine derivatives were found.
a) As shown in FIGS. 1 and 2, increase in urinary albumin and urinary protein excretion is suppressed.
b) As shown in FIG. 3, the expansion of the kidney glomerular diameter and the expansion of the glomerular snare area are suppressed.
c) As shown in FIG. 10, the increase of 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG) in urine is suppressed.
d) As shown in FIG. 11, the production of reactive oxygen species (ROS) in the kidney is suppressed.
e) As shown in FIG. 12, an increase in TNF-α mRNA expression in the kidney is suppressed.
f) As shown in FIGS. 5 to 6, there is no effect on glucose tolerance, insulin resistance, and blood pressure.
g) As shown in FIGS. 7 to 9, there is no effect on the enlargement of fat cells and the increase in tissue weight of white fat cells.

以上のことから、本発明のニトロソニフェジピン誘導体には、糖尿病性腎症の進展を抑制する効果が存在し、しかも、血糖降下作用や降圧作用のないことが見出された。これらのことから、本発明者らは、ニトロソニフェジピン誘導体が、副作用のない（血糖値、血圧、肥満に影響を与えない）良好な糖尿病性腎症の治療剤・予防剤になることを見出し、本発明を完成した。 From the above, it has been found that the nitrosonifedipine derivative of the present invention has an effect of suppressing the development of diabetic nephropathy, and has no hypoglycemic action or antihypertensive action. From these facts, the present inventors have found that the nitrosonifedipine derivative is a good therapeutic / preventive agent for diabetic nephropathy having no side effects (does not affect blood sugar level, blood pressure, obesity) The present invention has been completed.

即ち、本発明の要旨は以下の通りである。
（１）一般式（１）： That is, the gist of the present invention is as follows.
(1) General formula (1):

［式中、Ｒ^１は低級アルキル基、Ｒ^２は置換または非置換低級アルキル基、Ｘ’は２−、３−または４−位におけるニトロソ基を表わす。］で示されるニトロソニフェジピン誘導体を有効成分とする糖尿病性腎症治療剤。
（２）一般式（１）におけるＲ^１、Ｒ^２がそれぞれメチル基である、上記（１）に記載の糖尿病性腎症治療剤。
（３）ニトロソニフェジピン誘導体がニトロソニフェジピンである、上記（１）に記載の糖尿病性腎症治療剤。 [Wherein, R ¹ represents a lower alkyl group, R ² represents a substituted or unsubstituted lower alkyl group, and X ′ represents a nitroso group at the 2-, 3-, or 4-position. ] The therapeutic agent for diabetic nephropathy comprising a nitrosonifedipine derivative represented by the formula:
(2) The therapeutic agent for diabetic nephropathy according to (1) above, wherein R ¹ and R ² in the general formula (1) are each a methyl group.
(3) The therapeutic agent for diabetic nephropathy according to (1) above, wherein the nitrosonifedipine derivative is nitrosonifedipine.

（４）一般式（１）： (4) General formula (1):

［式中、Ｒ^１は低級アルキル基、Ｒ^２は置換または非置換低級アルキル基、Ｘ’は２−、３−または４−位におけるニトロソ基を表わす。］で示されるニトロソニフェジピン誘導体を有効成分とする、尿中タンパク質と尿中アルブミンの排出量増加抑制剤。
（５）一般式（１）におけるＲ^１、Ｒ^２がそれぞれメチル基である、上記（４）に記載の抑制剤。
（６）ニトロソニフェジピン誘導体がニトロソニフェジピンである、上記（４）に記載の抑制剤。 [Wherein, R ¹ represents a lower alkyl group, R ² represents a substituted or unsubstituted lower alkyl group, and X ′ represents a nitroso group at the 2-, 3-, or 4-position. ] The urinary protein and urinary albumin excretion increase inhibitor containing the nitrosonifedipine derivative represented by the above formula as an active ingredient.
(5) The inhibitor according to (4) above, wherein R ¹ and R ² in the general formula (1) are each a methyl group.
(6) The inhibitor according to (4) above, wherein the nitrosonifedipine derivative is nitrosonifedipine.

本発明のニトロソニフェジピン誘導体（１）は、糖尿病性腎症の進展を抑制する効果を有しており、そして、腎臓の糸球体を保護して、尿中タンパク質と尿中アルブミンの排出量増加を抑制できている。このように、本発明のニトロソニフェジピン誘導体は、効果の点で、これまでにない糖尿病性腎症の治療剤となっている。更に、本発明のニトロソニフェジピン誘導体は、ニフェジピンに由来する作用を有しておらず、その結果、本発明のニトロソニフェジピン誘導体は、体重、血圧、血糖値、インスリン抵抗性に影響を与えず、更に腎重量、白色脂肪組織重量と脂肪細胞の大きさに影響を与えることはなかった。このように本発明のニトロソニフェジピン誘導体は、安全性が高く、しかも糖尿病性腎症の進行を抑制できるものであるため、糖尿病性腎症の治療剤として非常に有用なものとなっている。 The nitrosonifedipine derivative (1) of the present invention has an effect of suppressing the development of diabetic nephropathy, and protects the glomeruli of the kidney to increase the excretion of urinary protein and urinary albumin. It can be suppressed. Thus, the nitrosonifedipine derivative of the present invention is a therapeutic agent for diabetic nephropathy that has never been seen in terms of effects. Furthermore, the nitrosonifedipine derivative of the present invention does not have an action derived from nifedipine, and as a result, the nitrosonifedipine derivative of the present invention does not affect body weight, blood pressure, blood glucose level, insulin resistance, There was no effect on kidney weight, white adipose tissue weight or adipocyte size. Thus, since the nitrosonifedipine derivative of the present invention is highly safe and can suppress the progression of diabetic nephropathy, it is very useful as a therapeutic agent for diabetic nephropathy.

糖尿病性腎症モデルマウス（１２週令ＫＫＡｙマウス）にニトロソニフェジピンを投与し、腎障害に対する効果を尿中のタンパク質の漏出量で評価した図である。評価結果を４種の棒グラフで示す。４種の棒グラフは、それぞれ左から右へ、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（コントロール）、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ニトロソニフェジピン投与群）、ＫＫＡｙマウス（コントロール）、ＫＫＡｙマウス（ニトロソニフェジピン投与群）における尿中のタンパク質の全量を表している。It is the figure which administered the nitrosonifedipine to the diabetic nephropathy model mouse (12-week-old KKAy mouse | mouth), and evaluated the effect with respect to a renal disorder by the leakage amount of the protein in urine. The evaluation results are shown by four types of bar graphs. The four bar graphs show the protein in urine from C57BL / 6 mice (control), C57BL / 6 mice (nitrosonifedipine administration group), KKAy mice (control), and KKAy mice (nitroso-nifedipine administration group), respectively, from left to right. Represents the total amount. 糖尿病性腎症モデルマウス（１２週令ＫＫＡｙマウス）にニトロソニフェジピンを投与し、腎障害に対する効果を尿中のアルブミンの漏出量で評価した図である。評価結果を４種の棒グラフで示す。４種の棒グラフは、それぞれ左から右へ、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（コントロール）、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ニトロソニフェジピン投与群）、ＫＫＡｙマウス（コントロール）、ＫＫＡｙマウス（ニトロソニフェジピン投与群）における尿中のアルブミンの全量を表している。It is the figure which administered the nitrosonifedipine to the diabetic nephropathy model mouse (12-week-old KKAy mouse | mouth), and evaluated the effect with respect to a renal disorder by the leakage amount of the albumin in urine. The evaluation results are shown by four types of bar graphs. The four bar graphs show urinary albumin in C57BL / 6 mice (control), C57BL / 6 mice (nitrosonifedipine administration group), KKAy mice (control), and KKAy mice (nitroso-nifedipine administration group), respectively, from left to right. Represents the total amount. 糖尿病性腎症モデルマウス（１２週令ＫＫＡｙマウス）と通常のＣ５７ＢＬ／６マウスの各腎臓糸球体の組織切片の拡大写真を示した図である。ニトロソニフェジピン（ＮＯ−ＮＩＦ）の投与により、腎糸球体直径の伸長および糸球体係蹄面積の拡大が抑制されることをＰＡＳ染色で評価した。ＮＯ−ＮＩＦの投与（＋）と無投与（―）の場合の腎臓糸球体組織をＰＡＳ染色して比較すると、ＮＯ−ＮＩＦの投与により、糖尿病性腎症モデルマウスの腎糸球体直径の伸長および糸球体係蹄面積の拡大が抑制されることが示された。It is the figure which showed the enlarged photograph of the tissue slice of each kidney glomerulus of a diabetic nephropathy model mouse (12-week-old KKAy mouse) and a normal C57BL / 6 mouse. It was evaluated by PAS staining that administration of nitrosonifedipine (NO-NIF) suppressed the expansion of the glomerular diameter and the expansion of the glomerular snare area. When comparing the kidney glomerular tissues with NO-NIF administration (+) and non-administration (-) by PAS staining, the administration of NO-NIF increased the glomerular diameter of diabetic nephropathy model mice and It was shown that expansion of the glomerular snare area is suppressed. 糖尿病性腎症モデルマウスにおいて、ＮＯ−ＮＩＦの投与により、腎糸球体直径の伸長および糸球体係蹄面積の拡大が抑制されたことを定量的に表わした図である。４種の棒グラフは、それぞれ左から右へ、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（コントロール）、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ニトロソニフェジピン投与群）、ＫＫＡｙマウス（コントロール）、ＫＫＡｙマウス（ニトロソニフェジピン投与群）における腎糸球体直径の伸長（左図）および糸球体係蹄面積の拡大（右図）を表わしている。糖尿病性腎症モデルマウスは、通常のＣ５７ＢＬ／６マウスと比較して腎糸球体直径の伸長および糸球体係蹄面積の拡大が観察され、ＮＯ−ＮＩＦの投与により、それらは抑制された。It is a figure which expressed quantitatively that the expansion of the glomerular diameter and the expansion of the glomerular snare area were suppressed by administration of NO-NIF in the diabetic nephropathy model mouse. The four bar graphs show, from left to right, the kidney glomerular diameter in C57BL / 6 mice (control), C57BL / 6 mice (nitrosonifedipine administration group), KKAy mice (control), and KKAy mice (nitrosonifedipine administration group). (Left figure) and expansion of the glomerular snare area (right figure). In the diabetic nephropathy model mouse, an increase in the glomerular diameter and an expansion of the glomerular snare area were observed as compared with normal C57BL / 6 mice, and these were suppressed by administration of NO-NIF.

糖尿病性腎症モデルマウスと通常のＣ５７ＢＬ／６マウスの体重と血圧に対するＮＯ−ＮＩＦの投与の影響を表わした図である。上記図４と同じ４つの投与群に分け、ＮＯ−ＮＩＦ投与の有無による、体重の変化（左図）と血圧の変化（右図）を評価した。ＮＯ−ＮＩＦは、体重と血圧に対して何ら影響を示さなかった。なお、血圧はｔａｉｌｃｕｆｆ法にて測定した。It is a figure showing the influence of administration of NO-NIF on the body weight and blood pressure of diabetic nephropathy model mice and normal C57BL / 6 mice. It was divided into the same four administration groups as in FIG. 4 above, and changes in body weight (left figure) and blood pressure (right figure) with and without NO-NIF administration were evaluated. NO-NIF had no effect on body weight and blood pressure. The blood pressure was measured by the tail cuff method. 糖尿病性腎症モデルマウスと通常のＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、糖負荷試験後の血糖値とインスリン抵抗性に対するＮＯ−ＮＩＦ投与の影響を表わした図である。上記図４と同じ４つの投与群に分け、ＮＯ−ＮＩＦ投与の有無による、糖負荷試験後の血糖値の変化（左図）とインスリン抵抗性の変化（右図）を評価した。ＮＯ−ＮＩＦは、血糖値とインスリン抵抗性に対して何ら影響を示さなかった。It is a figure showing the influence of NO-NIF administration with respect to the blood glucose level after a glucose tolerance test, and insulin resistance in a diabetic nephropathy model mouse and a normal C57BL / 6 mouse. Divided into the same four administration groups as in FIG. 4 above, the change in blood glucose level (left figure) and the change in insulin resistance (right figure) after the glucose tolerance test depending on whether or not NO-NIF was administered were evaluated. NO-NIF had no effect on blood glucose levels and insulin resistance. 糖尿病性腎症モデルマウスと通常のＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、腎重量と白色脂肪組織（ＷＡＴ）重量に対するＮＯ−ＮＩＦ投与の影響を表わした図である。上記図４と同じ４つの投与群に分け、ＮＯ−ＮＩＦ投与の有（＋）無（−）による影響を上記図４の記載方法に準じて棒グラフで表わしている。腎重量の変化（左図）とＷＡＴ重量の変化（右図）を評価したが、ＮＯ−ＮＩＦは、腎重量とＷＡＴ重量に対して何ら影響を示さなかった。It is a figure showing the influence of NO-NIF administration with respect to a kidney weight and a white adipose tissue (WAT) weight in a diabetic nephropathy model mouse and a normal C57BL / 6 mouse. It is divided into the same four administration groups as in FIG. 4 above, and the effect of the presence (+) or absence (−) of NO-NIF administration is represented by a bar graph according to the description method of FIG. Changes in kidney weight (left figure) and changes in WAT weight (right figure) were evaluated, but NO-NIF showed no effect on kidney weight and WAT weight. 糖尿病性腎症モデルマウスと通常のＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、ＮＯ−ＮＩＦ投与の有（＋）無（−）による影響を比較した脂肪細胞組織の組織切片の拡大写真である。上記図４と同じ４つの投与群に分け、採取した脂肪細胞組織の切片をＨＥ染色法で染色した。この組織切片の拡大写真を比較評価すれば、ＮＯ−ＮＩＦは、脂肪細胞の大きさに影響を与えないことが示された。It is an enlarged photograph of the tissue section of the adipocyte tissue which compared the influence by presence (+) absence (-) of NO-NIF administration in a diabetic nephropathy model mouse and normal C57BL / 6 mouse. Divided into the same four administration groups as in FIG. 4 above, the sections of the collected adipocyte tissue were stained by HE staining. A comparative evaluation of enlarged photographs of the tissue sections showed that NO-NIF did not affect the size of adipocytes. 上記図８の拡大写真から、各脂肪細胞の大きさ（面積）を測定して、４つの群におけるＮＯ−ＮＩＦ投与の影響を比較した図である。いずれのモデルマウスにおいても、ＮＯ−ＮＩＦは脂肪細胞の肥大に関して影響を与えないことが示された。It is the figure which measured the magnitude | size (area) of each fat cell from the enlarged photograph of the said FIG. 8, and compared the influence of NO-NIF administration in four groups. In any model mouse, NO-NIF was shown to have no effect on adipocyte hypertrophy. 糖尿病性腎症モデルマウスと通常のＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、全身性酸化ストレスマーカーの尿中８−ＯＨｄＧ排出量に対するＮＯ−ＮＩＦ投与の影響を表わした図である。上記図４と同じ４つの投与群に分け、ＮＯ−ＮＩＦ投与の有無による影響を上記図４の記載方法に準じて棒グラフで表わしている。糖尿病性腎症モデルマウスの尿中８−ＯＨｄＧ排出量の増加は、ＮＯ−ＮＩＦの投与により抑制されることが示された。It is a figure showing the influence of NO-NIF administration with respect to the amount of urinary 8-OHdG excretion of a systemic oxidative stress marker in diabetic nephropathy model mice and normal C57BL / 6 mice. It is divided into the same four administration groups as in FIG. 4 above, and the effect of the presence or absence of NO-NIF administration is represented by a bar graph according to the method described in FIG. It was shown that the increase in urinary 8-OHdG excretion in diabetic nephropathy model mice was suppressed by administration of NO-NIF. 糖尿病性腎症モデルマウスと通常のＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、腎臓における活性酸素種（ＲＯＳ）に対するＮＯ−ＮＩＦ投与の影響を表わした腎臓組織切片の拡大写真である。上記図４と同じ４つの投与群に分け、採取した腎臓組織の切片をジヒドロキシエチジウム（ｄｉｈｙｄｒｏｅｔｈｉｄｉｕｍ）染色法で染色した。この組織切片の拡大写真を比較評価すると、ＮＯ−ＮＩＦの投与により糖尿病性腎症モデルマウスのＲＯＳの産生増加が抑制されることが示された。It is an enlarged photograph of a kidney tissue section showing the influence of NO-NIF administration on reactive oxygen species (ROS) in the kidney in diabetic nephropathy model mice and normal C57BL / 6 mice. Divided into the same four administration groups as in FIG. 4 above, the collected kidney tissue sections were stained by the dihydroxyethidium staining method. A comparative evaluation of the magnified photographs of the tissue sections showed that administration of NO-NIF suppressed the increase in ROS production in diabetic nephropathy model mice. 糖尿病性腎症モデルマウスと通常のＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、腎臓におけるＴＮＦ−αに対するＮＯ−ＮＩＦ投与の影響を表わした図である。上記図４と同じ４つの投与群に分け、採取した腎臓組織におけるＴＮＦ−αのｍＲＮＡ発現量をＲｅａｌ−ＴｉｍｅＰＣＲ法により測定した。この測定結果を上記図４の記載方法に準じて棒グラフで表わした。これにより、糖尿病性腎症モデルマウスにおいて、ＮＯ−ＮＩＦは腎臓におけるＴＮＦ−αｍＲＮＡ発現の増加を抑制することが示された。It is a figure showing the influence of NO-NIF administration with respect to TNF- (alpha) in a kidney in a diabetic nephropathy model mouse and normal C57BL / 6 mouse. The TNF-α mRNA expression level in the collected kidney tissues was measured by the Real-Time PCR method. The measurement results were represented by a bar graph according to the description method of FIG. Thereby, it was shown that NO-NIF suppresses the increase in TNF-α mRNA expression in the kidney in diabetic nephropathy model mice.

−本発明の第一の態様−
本発明の第一の態様は、ニトロソニフェジピン誘導体を有効成分とする糖尿病性腎症の治療剤に関するものである。
本発明の「ニトロソニフェジピン誘導体」とは、一般式（１）： -First embodiment of the present invention-
The first aspect of the present invention relates to a therapeutic agent for diabetic nephropathy comprising a nitrosonifedipine derivative as an active ingredient.
The “nitrosonifedipine derivative” of the present invention is a compound represented by the general formula (1):

［式中、Ｒ^１は低級アルキル基、Ｒ^２は置換または非置換低級アルキル基、Ｘ’は２−、３−または４−位におけるニトロソ基を意味する。］
で示されるピリジン化合物を表わすものである。 [Wherein, R ¹ represents a lower alkyl group, R ² represents a substituted or unsubstituted lower alkyl group, and X ′ represents a nitroso group at the 2-, 3-, or 4-position. ]
Represents a pyridine compound represented by the formula:

上記一般式（１）において、Ｒ^１基の低級アルキル基としては炭素数１〜４個の直鎖または分枝鎖アルキル基が挙げられ、好ましくはメチル基またはイソプロピル基である。
Ｒ^２基の置換または非置換低級アルキル基における低級アルキル基としては炭素数１〜４個の直鎖または分枝鎖アルキル基が挙げられ、好ましくはメチル基、エチル基、イソプロピル基またはイソブチル基である。またその置換基としては、炭素数１〜３個の直鎖アルコキシ基（例えばメトキシ基）、フリル基、または低級アルキル基および／またはフェニル低級アルキル基によりモノまたはジ置換されたアミノ基（例えば、Ｎ−メチル−Ｎ−フェニルメチルアミノ）等が挙げられる。 In the above general formula (1), examples of the lower alkyl group of R ¹ group include a linear or branched alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, preferably a methyl group or an isopropyl group.
Examples of the lower alkyl group in the substituted or unsubstituted lower alkyl group of R ² include a linear or branched alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, preferably a methyl group, an ethyl group, an isopropyl group or an isobutyl group. is there. As the substituent, a straight-chain alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms (for example, methoxy group), a furyl group, or an amino group mono- or di-substituted with a lower alkyl group and / or a phenyl lower alkyl group (for example, N-methyl-N-phenylmethylamino) and the like.

一般式（１）のピリジン化合物の好ましい具体例は、ニトロソ−ニフェジピン（一般式（１）中、Ｒ^１：−ＣＨ_３、Ｒ^２：−ＣＨ_３、Ｘ’：２−ＮＯ・）、ニトロソ−ニソルジピン（一般式（１）中、Ｒ^１：−ＣＨ_３、Ｒ^２：−ＣＨ_２（ＣＨ_３）_２、Ｘ’：２−ＮＯ・）ニトロソ−ニモジピン（一般式（１）中、Ｒ^１：−ＣＨ（ＣＨ_３）_２、Ｒ^３：−（ＣＨ_２）_２ＯＣＨ_３、Ｘ’：３−ＮＯ・）、ニトロソ−ニカルジピン（一般式（１）中、Ｒ^１：−ＣＨ_３、Ｒ^２：−（ＣＨ）_２Ｎ（ＣＨ_３）（ＣＨ_２Ｃ_６Ｈ_５）、Ｘ’：３−ＮＯ・およびニトロソ−ニトレンジピン（一般式（１）中、Ｒ^１：−ＣＨ_３、Ｒ^３：−ＣＨ_２ＣＨ_３、Ｘ’：３−ＮＯ・）である。 Preferred specific examples of the pyridine compound of the general formula (1) include nitroso-nifedipine (in the general formula (1), R ¹ : —CH ₃ , R ² : —CH ₃ , X ′: 2-NO ·), nitroso- Nisoldipine (in general formula (1), R ¹ : —CH ₃ , R ² : —CH ₂ (CH ₃ ) ₂ , X ′: 2-NO ·) nitroso-nimodipine (in general formula (1), R ¹ : _{_{^{_{-CH (CH 3) 2, R}}}} 3 :-( CH 2) 2 OCH 3, X ': 3-NO ·), nitroso - Chu nicardipine (formula ^{_{(1), R 1: -CH}} 3, R 2: _{_{- (CH) 2 N (CH}} 3) (CH 2 C 6 H 5), X ': 3-NO · and nitroso - in nitrendipine (formula ^{_{(1), R 1: -CH}} 3, R 3: -CH ₂ CH ₃ , X ′: 3-NO ·).

本発明のニトロソニフェジピン誘導体（１）は、対応するニトロ置換フェニル−１，４−ジヒドロピリジン化合物を紫外線照射処理することにより容易に製造される〔ヤネッツら、バイオオルガニック・メディシナル・ケミストリィ（ＹａｎｅｚＣ．，ｅｔａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．）２００４，１２（９）：２４５９−６８を参照〕。
本発明のニトロソニフェジピン誘導体の内、より好ましいものとしては、Ｒ^１とＲ^２がそれぞれメチル基のものであり、更に好ましくは、Ｘ’が２位のニトロソ基である、ニトロソニフェジピン（ＮＯ−ＮＩＦ）を挙げることができる。 The nitrosonifedipine derivative (1) of the present invention is easily produced by subjecting the corresponding nitro-substituted phenyl-1,4-dihydropyridine compound to ultraviolet irradiation treatment [Yanetz et al., Bioorganic Medicinal Chemistry (Yanez C. , Et al., Bioorg. Med. Chem.) 2004, 12 (9): 2459-68].
Among the nitrosonifedipine derivatives of the present invention, more preferred are those in which R ¹ and R ² are each a methyl group, and more preferably, nitrosonifedipine (NO-NIF) wherein X ′ is a 2-position nitroso group. ).

本発明の「糖尿病性腎症治療剤」とは、糖尿病性腎症の進行を抑制し、腎症の悪化を抑制して、腎不全になることを阻止するための治療剤のことを言う。糖尿病性腎症とは、糖尿病が進行して起こる糖尿病の合併症の一つであり、腎臓の糸球体が細小血管障害のため硬化して数を減じて行く病気であり、最終的には腎不全となり、人工透析に至る主要原因となっている。本発明の糖尿病性腎症の治療剤は、図１〜４に示されるように病態の進行を抑制し、軽減することによって腎不全やそれに伴う人工透析への移行を阻止するための治療剤として有効であり、しかも、図５〜９に示される副作用の少ない治療剤である。
本発明の糖尿病性腎症治療剤は、１，４−ジヒドロピリジン系カルシウム拮抗薬と同様に経口製剤、非経口製剤（注射剤、経皮製剤等）として用いることができ、それら製剤は、その有効成分のニトロソニフェジピン誘導体（１）を通常の医薬製剤と同様に処方することにより製造される。
そのような製剤の具体例としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などの経口剤、静注、筋注などの注射剤、点滴静注剤等が挙げられ、それら製剤は通常用いられる医薬用担体を用いて調製される。
上記医薬用担体としては、医薬分野において常用され、かつ本発明のニトロソニフェジピン誘導体（１）と反応しない物質が用いられる。錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤の製造に用いられる医薬用担体の具体例としては、乳糖、トウモロコシデンプン、白糖、マンニトール、硫酸カルシウム、結晶セルロースのような賦形剤、カルメロースナトリウム、変性デンプン、カルメロースカルシウムのような崩壊剤、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンのような結合剤、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、硬化油のような滑沢剤が挙げられる。錠剤は、通常のコーティング剤を用い、周知の方法でコーティングしてもよい。 The “diabetic nephropathy therapeutic agent” of the present invention refers to a therapeutic agent for inhibiting the progression of diabetic nephropathy, inhibiting the worsening of nephropathy, and preventing renal failure. Diabetic nephropathy is one of the complications of diabetes that occurs as diabetes progresses. It is a disease in which the glomeruli of the kidney harden due to microangiopathy and the number decreases. It is a major cause of failure and artificial dialysis. The therapeutic agent for diabetic nephropathy of the present invention is used as a therapeutic agent for inhibiting renal failure and the accompanying transition to artificial dialysis by suppressing and reducing the progression of the disease state as shown in FIGS. It is a therapeutic agent that is effective and has few side effects as shown in FIGS.
The therapeutic agent for diabetic nephropathy of the present invention can be used as an oral preparation and a parenteral preparation (injection, transdermal preparation, etc.) in the same manner as the 1,4-dihydropyridine calcium antagonist. It is manufactured by formulating the component nitrosonifedipine derivative (1) in the same manner as a normal pharmaceutical preparation.
Specific examples of such preparations include oral preparations such as tablets, capsules, granules, powders, syrups, injections such as intravenous injections and intramuscular injections, intravenous infusions, etc. Prepared using the pharmaceutical carrier used.
As the pharmaceutical carrier, a substance that is commonly used in the pharmaceutical field and does not react with the nitrosonifedipine derivative (1) of the present invention is used. Specific examples of pharmaceutical carriers used in the manufacture of tablets, capsules, granules, powders include lactose, corn starch, sucrose, mannitol, calcium sulfate, excipients such as crystalline cellulose, carmellose sodium, modified starch , Disintegrants such as carmellose calcium, binders such as methylcellulose, gelatin, gum arabic, ethylcellulose, hydroxypropylcellulose, polyvinylpyrrolidone, light anhydrous silicic acid, magnesium stearate, talc, lubricants such as hardened oil Is mentioned. The tablet may be coated by a well-known method using a normal coating agent.

シロップ剤製造に用いられる担体の具体例としては、白糖、ブドウ糖、果糖のような甘味剤、アラビアゴム、トラガント、カルメロースナトリウム、メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、結晶セルロース、ビーガムのような懸濁化剤、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリソルベート８０のような分散剤が挙げられる。
注射剤は、通常、ニトロソニフェジピン誘導体（１）を注射用蒸留水に溶解して調製するが、必要に応じて溶解補助剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、等張化剤、無痛化剤、保存剤等を添加することができる。更に、該化合物を注射用蒸留水又は植物油に懸濁した懸濁性注射剤の形であってもよく、必要に応じて基剤、懸濁化剤、粘調剤等を添加することができる。 Specific examples of carriers used for syrup preparation include sweeteners such as sucrose, glucose and fructose, arabic gum, tragacanth, carmellose sodium, methylcellulose, sodium alginate, crystalline cellulose, suspending agents such as beef gum, Dispersing agents such as sorbitan fatty acid ester, sodium lauryl sulfate, polysorbate 80 are listed.
Injections are usually prepared by dissolving the nitrosonifedipine derivative (1) in distilled water for injection, but if necessary, solubilizing agents, buffers, pH adjusters, isotonic agents, soothing agents, storage An agent or the like can be added. Furthermore, it may be in the form of a suspension injection in which the compound is suspended in water for injection or vegetable oil, and a base, a suspending agent, a thickening agent and the like can be added as necessary.

本発明の有効成分のニトロソニフェジピン誘導体の投与量は投与方法、患者の症状・年齢等によっても異なるが、対応する１，４−ジヒドロピリジン系カルシウム拮抗薬と同程度の用量でよく、また血圧や心機能に対する作用がないことからより高用量で投与することもでき、通常大人で１日当たり数ｍｇ〜百数十ｍｇ、好ましくは２０ｍｇから６０ｍｇ程度で１日１回または数回に分けて投与することができる。 The dose of the nitrosonifedipine derivative, which is the active ingredient of the present invention, varies depending on the administration method, patient's symptom, age, etc., but it may be the same dose as the corresponding 1,4-dihydropyridine calcium antagonist, as well as blood pressure and heart rate. Since there is no effect on the function, it can be administered at a higher dose, and usually for adults, several mg to hundreds of mg per day, preferably about 20 mg to 60 mg, once a day or divided into several times a day Can do.

−本発明の第二の態様−
本発明の第二の態様は、ニトロソニフェジピン誘導体を有効成分とする尿中タンパク質と尿中アルブミンの排出量の増加抑制剤に関するものである。
本発明の「尿中タンパク質と尿中アルブミンの排出量の増加抑制剤」とは、尿中タンパク質と尿中アルブミンの排出量の増加を共に抑制する薬剤と言うことである。即ち、腎臓障害に基づき腎臓の糸球体が損傷を受けると、血中のタンパク質とアルブミンが尿中に排出されることになる。糸球体の損傷の程度が大きければ、尿中に排出されるタンパク質とアルブミンの量が増大する。本発明のニトロソニフェジピン誘導体は、腎臓障害の進行を抑制し、あるいは腎臓障害を治癒して、糸球体の損傷拡大を抑制または阻止する薬物である。その結果、図１と２に示されるように尿中タンパク質と尿中アルブミンの排出量の増加が抑制されることになる。
本発明のニトロソニフェジピン誘導体の作用機序としては、図１１に示されるように腎臓における活性酸素種（ＲＯＳ）の産生を抑制し、酸化ストレスを抑制できるためと考えられる。その結果、腎臓組織におけるＴＮＦ−αの産生が図１２に示すように抑制されている。このことは、酸化ストレスのマーカーである尿中８−ＯＨｄＧの排出量が顕著に抑制されていることからも明らかとなっている。 -Second aspect of the present invention-
The second aspect of the present invention relates to an increase inhibitor of urinary protein and urinary albumin excretion comprising a nitrosonifedipine derivative as an active ingredient.
The “inhibitor of increase in urinary protein and urinary albumin excretion” according to the present invention is an agent that suppresses both increase in urinary protein and urinary albumin excretion. That is, when kidney glomeruli is damaged due to kidney damage, protein and albumin in blood are excreted in urine. The greater the degree of glomerular damage, the greater the amount of protein and albumin excreted in the urine. The nitrosonifedipine derivative of the present invention is a drug that suppresses or inhibits the expansion of glomerular damage by suppressing the progression of kidney damage or curing the kidney damage. As a result, as shown in FIGS. 1 and 2, an increase in the amount of urinary protein and urinary albumin excreted is suppressed.
The mechanism of action of the nitrosonifedipine derivative of the present invention is considered to be because it is possible to suppress the production of reactive oxygen species (ROS) in the kidney and suppress oxidative stress as shown in FIG. As a result, the production of TNF-α in the kidney tissue is suppressed as shown in FIG. This is also clear from the fact that the amount of urinary 8-OHdG, which is a marker of oxidative stress, is significantly suppressed.

なお、第２態様において、前述の第一態様と共通する用語は、それぞれ同じ意味を表す。また、製剤および投与法等についても、第一態様に準じて適用されるものである。 In the second embodiment, terms common to the first embodiment described above have the same meaning. Further, the formulation and administration method are also applied according to the first embodiment.

以下、実施例および試験例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれによってなんら限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on examples and test examples, but the present invention is not limited thereto.

（実施例１）ニトロソニフェジピン（ＮＯ−ＮＩＦ）の合成
ニフェジピン（和光純薬製）をメタノールに溶解し、２５ｍＭニフェジピンメタノール溶液（５００ｍＬ）を調製する。この溶液にハロゲン光（ＫｏｄａｋＥｋｔａｇｒａｐｈｉｃＩＩＩＥＰｌｕｓｐｒｏｊｅｃｔｏｒ）を７時間照射する。それによって黄色のニフェジピン溶液は徐々に緑色に変色する。光照射後、メタノールをエバポレーターで減圧下除去し、析出する結晶を冷メタノールで洗浄する。得られる結晶をメタノールで再結晶して、２−ニトロソ−ニフェジピン（ＮＯ−ＮＩＦ）を得る。その生成物をＮＭＲスペクトル、元素分析により同定する。ＨＰＬＣにより測定した純度は＞９９．９％であった。 Example 1 Synthesis of Nitrosonifedipine (NO-NIF) Nifedipine (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) is dissolved in methanol to prepare a 25 mM nifedipine methanol solution (500 mL). This solution is irradiated with halogen light (Kodak Ektagraphic III E Plus projector) for 7 hours. Thereby, the yellow nifedipine solution gradually turns green. After light irradiation, the methanol is removed under reduced pressure by an evaporator, and the precipitated crystals are washed with cold methanol. The resulting crystals are recrystallized from methanol to give 2-nitroso-nifedipine (NO-NIF). The product is identified by NMR spectrum, elemental analysis. The purity measured by HPLC was> 99.9%.

（実施例２）糖尿病性腎症のモデルマウスに対するＮＯ−ＮＩＦの作用
（１）実験材料：
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雄性）、ＫＫＡｙマウス（雄性）を日本ＣＬＥＡから購入した。
使用する抗体は市販のものを使用。
（２）試験方法：
ａ）投与方法：
糖尿病性腎症のモデルマウスとして１２週令の雄性ＫＫＡｙマウスを用いた。また、比較対象として１２週令の雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスを使用した。
上記マウスをそれぞれ２群に分け、その一方にＮＯ−ＮＩＦの投与を行なった。まず、ＮＯ−ＮＩＦを１％ＣＭＣ−生理食塩液に懸濁し、３０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの投与量で４週間連日腹腔内投与を行った。同時に、ＮＯ−ＮＩＦを含有しない溶液をコントロール群に同様に投与した。 (Example 2) Effect of NO-NIF on model mice of diabetic nephropathy (1) Experimental materials:
C57BL / 6 mice (male) and KKAy mice (male) were purchased from Japan CLEA.
Use commercially available antibodies.
(2) Test method:
a) Method of administration:
A 12-week-old male KKAy mouse was used as a model mouse for diabetic nephropathy. In addition, 12-week-old male C57BL / 6 mice were used for comparison.
The mice were divided into two groups, and NO-NIF was administered to one of them. First, NO-NIF was suspended in 1% CMC-physiological saline and intraperitoneally administered daily for 4 weeks at a dose of 30 mg / kg / day. At the same time, a solution containing no NO-NIF was similarly administered to the control group.

ｂ）効果の測定：
１）尿中蛋白の排出量の測定：
尿中タンパク排泄量は公知のＢｒａｄｆｏｒｄ法を用いて測定した。
２）尿中アルブミン量の測定：
尿中アルブミン排泄量は公知のＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。
３）メサンギウム領域の拡大測定：
メサンギウム領域の拡大は腎糸球体をＰＡＳ染色することによって評価した。
４）尿中８−ＯＨｄＧの測定：
尿中の８−ＯＨｄＧ排泄量は、上記マウスから排出された２４時間分の尿サンプルを使用し、ＥＬＩＺＡ法（酵素結合の免疫吸着アッセイ・キット）により、手順書（伏見製薬）に従い測定した。
５）腎臓での活性酸素種（ＲＯＳ）の測定：
活性酸素種の測定は、ＤＨＥ染色法を用いて実施した（ＭｏｌＥｎｄｃｒｉｎｏｌ２４：１３３８−１３４８，２０１０)。採取された腎臓組織をＯＣＴ化合物中で凍結させ、切断して、ガラス・スライドに設置する。切片を暗室内でＰＢＳ（１０ｍｍｏｌ／ｌ）中、ジヒドロエチジュウムで処理し、保湿容器中で室温下３０分静置する。切片にカバーグラスを掛けて、腎臓組織を蛍光顕微鏡を用いて観察、評価した。
６）腎臓でのＴＮＦ−αのｍＲＮＡの測定：
遺伝子発現はＲｅａｌ−ＴｉｍｅＰＣＲにより確認した。まず、腎臓組織から、ＲＮＡを採取し、先行文献（ＭｏｌＥｎｄｃｒｉｎｏｌ２４：１３３８−１３４８，２０１０）に基いてｃＤＮＡが合成された。定量的リアルタイムＰＣＲを行い、プライマーとしてロシュ社のＴＮＦ−αプライマーセットを使用した。 b) Measurement of effect:
1) Measurement of urinary protein excretion:
Urinary protein excretion was measured using a known Bradford method.
2) Measurement of urinary albumin content:
Urinary albumin excretion was measured using a known ELISA method.
3) Enlarged measurement of the mesangial region:
The expansion of the mesangial region was evaluated by PAS staining of the glomeruli.
4) Measurement of urinary 8-OHdG:
The amount of 8-OHdG excreted in urine was measured according to the procedure manual (Fushimi Pharmaceutical Co., Ltd.) by the ELIZA method (enzyme-linked immunosorbent assay kit) using urine samples for 24 hours excreted from the mice.
5) Measurement of reactive oxygen species (ROS) in the kidney:
The measurement of reactive oxygen species was carried out using the DHE staining method (Mol Endcrinol 24: 1338-1348, 2010). Harvested kidney tissue is frozen in OCT compound, cut and placed on a glass slide. The section is treated with dihydroethium in PBS (10 mmol / l) in a dark room and left in a moisturizing container at room temperature for 30 minutes. The section was covered with a cover glass, and the kidney tissue was observed and evaluated using a fluorescence microscope.
6) Measurement of TNF-α mRNA in kidney:
Gene expression was confirmed by Real-Time PCR. First, RNA was collected from kidney tissue, and cDNA was synthesized based on the previous document (Mol Endcrinol 24: 1338-1348, 2010). Quantitative real-time PCR was performed and a Roche TNF-α primer set was used as a primer.

７）耐糖能、インスリン抵抗性の測定：
随時血糖値およびグルコース負荷試験における血糖値は、自己検査用グルコース測定器を用いて測定した。
８）血圧の測定：
マウスの尾静脈の血圧をテイル・カッフ（Ｔａｉｌｃｕｆｆ）法により測定した。
９）脂肪細胞の肥大の測定：
脂肪細胞の肥大はＨＥ染色にて測定・評価した。 7) Measurement of glucose tolerance and insulin resistance:
The blood glucose level at any time and the glucose level in the glucose tolerance test were measured using a self-testing glucose meter.
8) Measurement of blood pressure:
The blood pressure of the tail vein of the mouse was measured by the Tail cuff method.
9) Measurement of fat cell hypertrophy:
Adipocyte hypertrophy was measured and evaluated by HE staining.

（３）測定結果：
１）尿中蛋白と尿中アルブミン量について：
図１と図２に示されるように糖尿病性腎症のモデルマウス（ＫＫＡｙマウス）では、コントロール群では尿中タンパク排泄量および尿中アルブミン排泄量が増加する。しかし、NO-NIF投与群ではＫＫＡｙマウスにおける尿中タンパク排泄量および尿中アルブミン排泄量は増加しなかった。
２）腎糸球体直径の伸長および糸球体係蹄面積の拡大について：
図３と図４に示されるようにＫＫＡｙマウスでは、コントロール群では腎糸球体直径の伸長および糸球体係蹄面積の拡大が観察されるが、ＮＯ−ＮＩＦ投与群では抑制されていた。
３）尿中８−ＯＨｄＧについて：
図１０に示されるように尿中の８−ＯＨｄＧ排泄量は、ＮＯ−ＮＩＦ投与群では抑制され、増加することはなかった。
４）腎臓での活性酸素種（ＲＯＳ）とＴＮＦ−αのｍＲＮＡについて：
図１１と図１２に示されるように腎臓におけるＲＯＳ産生とＴＮＦ−αのｍＲＮＡ発現は、ＮＯ−ＮＩＦ投与群では抑制され、増加することはなかった。 (3) Measurement results:
1) Urinary protein and urinary albumin content:
As shown in FIGS. 1 and 2, in the diabetic nephropathy model mouse (KKAy mouse), the urinary protein excretion and the urinary albumin excretion increase in the control group. However, urinary protein excretion and urinary albumin excretion in KKAy mice did not increase in the NO-NIF administration group.
2) About expansion of the glomerular diameter and expansion of the glomerular snare area:
As shown in FIGS. 3 and 4, in the KKAy mice, an increase in the glomerular diameter and an increase in the glomerular snare area were observed in the control group, but were suppressed in the NO-NIF administration group.
3) About urinary 8-OHdG:
As shown in FIG. 10, the amount of 8-OHdG excreted in urine was suppressed in the NO-NIF administration group and never increased.
4) Reactive oxygen species (ROS) and TNF-α mRNA in the kidney:
As shown in FIGS. 11 and 12, ROS production and TNF-α mRNA expression in the kidney were suppressed and never increased in the NO-NIF administration group.

５）耐糖能、インスリン抵抗性について：
図６に示されるようにＫＫＡｙマウスにおいて、コントロール群とＮＯ−ＮＩＦ投与群との間で、耐糖能、インスリン抵抗性に関する差はなく、ＮＯ−ＮＩＦが影響を与えないことが分った。
６）血圧について：
上記の耐糖能等と同様に、図５に示されるようにＮＯ−ＮＩＦは血圧に対して何の影響も示さなかった。
９）脂肪細胞の肥大等の測定：
図７に示されるようにＫＫＡｙマウスにおいて、コントロール群とＮＯ−ＮＩＦ投与群が共に腎重量および白色脂肪細胞組織（ＷＡＴ）重量の増加を生じ、投与の有無で差が見られなかった。即ち、ＮＯ−ＮＩＦは、腎重量とＷＡＴ重量の増加に対して影響を示さなかった。
図８と図９に示されるようにＫＫＡｙマウスにおいて、コントロール群とＮＯ−ＮＩＦ投与群が共に脂肪細胞の肥大を生じ、投与の有無で差が見られなかった。即ち、ＮＯ−ＮＩＦFは、脂肪細胞の大きさ（肥大）に対して影響を示さなかった。 5) About glucose tolerance and insulin resistance:
As shown in FIG. 6, in the KKAy mice, there was no difference in glucose tolerance and insulin resistance between the control group and the NO-NIF administration group, and it was found that NO-NIF had no effect.
6) About blood pressure:
Similar to the above glucose tolerance and the like, NO-NIF showed no effect on blood pressure as shown in FIG.
9) Measurement of fat cell hypertrophy, etc .:
As shown in FIG. 7, in the KKAy mice, the control group and the NO-NIF administration group both increased the kidney weight and the white adipocyte tissue (WAT) weight, and there was no difference in the presence or absence of administration. That is, NO-NIF had no effect on increases in kidney weight and WAT weight.
As shown in FIG. 8 and FIG. 9, in the KKAy mice, both the control group and the NO-NIF administration group caused fat cell hypertrophy, and no difference was observed depending on the presence or absence of administration. That is, NO-NIFF showed no effect on the size (hypertrophy) of adipocytes.

以上のことから、ＮＯ−ＮＩＦは糖尿病性腎症の進展に対して抑制効果を示すが、随伴する副作用として血糖降下作用や降圧作用を示さず、安全な薬剤であることが示された。 From the above, although NO-NIF has an inhibitory effect on the development of diabetic nephropathy, it has been shown that it is a safe drug without showing a hypoglycemic action or an antihypertensive action as an accompanying side effect.

本発明の糖尿病性腎症の治療剤は、血糖値や血圧、肥満などに対して影響を示さず、主作用として糖尿病性腎症の進展を阻止できる薬剤である。このように本発明のニトロソニフェジピン誘導体は、随伴する副作用のない糖尿病性腎症の治療剤であることから、ニトロソニフェジピン誘導体を母核化合物とする、これまでになかった新規な糖尿病性腎症治療剤を提供することができるようになった。
即ち、本発明のニトロソニフェジピン誘導体は、糖尿病治療において血糖コントロール困難な症例に対しても腎障害抑制効果を示し、糖尿病性腎症による透析導入を防ぐ新たな治療薬であることが示された。 The therapeutic agent for diabetic nephropathy of the present invention is a drug that does not affect blood glucose level, blood pressure, obesity and the like and can prevent the development of diabetic nephropathy as a main action. Thus, since the nitrosonifedipine derivative of the present invention is a therapeutic agent for diabetic nephropathy without accompanying side effects, a novel novel diabetic nephropathy treatment using nitrosonifedipine derivative as a mother nucleus compound has never been achieved. An agent can be provided.
That is, it was shown that the nitrosonifedipine derivative of the present invention is a new therapeutic agent that shows an effect of suppressing renal damage even in cases where it is difficult to control blood glucose in the treatment of diabetes and prevents dialysis induction due to diabetic nephropathy.

Claims

General formula (1):
[Wherein, R ¹ represents a lower alkyl group, R ² represents a substituted or unsubstituted lower alkyl group, and X ′ represents a nitroso group at the 2-, 3-, or 4-position. ] The therapeutic agent for diabetic nephropathy comprising a nitrosonifedipine derivative represented by the formula:

The therapeutic agent for arteriosclerosis according to claim 1, wherein R ¹ and R ² in the general formula (1) are each a methyl group.

The therapeutic agent for arteriosclerosis according to claim 1, wherein the nitrosonifedipine derivative is nitrosonifedipine.

General formula (1):
[Wherein, R ¹ represents a lower alkyl group, R ² represents a substituted or unsubstituted lower alkyl group, and X ′ represents a nitroso group at the 2-, 3-, or 4-position. ] The urinary protein and urinary albumin excretion increase inhibitor containing the nitrosonifedipine derivative represented by the above formula as an active ingredient.

The inhibitor according to claim 4, wherein R ¹ and R ² in the general formula (1) are each a methyl group.

The inhibitor according to claim 4, wherein the nitrosonifedipine derivative is nitrosonifedipine.