技術分野
本発明は、酸化ストレス疾患の治療及び／又は予防のための医薬として有用な酸化ストレス抑制剤に関するものである。さらに詳細には、本発明は、ピラゾロン誘導体又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、酸化ストレス抑制剤に関する。さらに本発明は、酸化ストレスの測定方法に関するものである。さらに詳細には、本発明は、マーカーとして血漿中のモノ不飽和脂肪酸、ユビキノン−１０（ＣｏＱ−１０ともいう）又はコレステロールエステルヒドロペルオキシドを用いることを特徴とする酸化ストレスの測定方法に関する。
背景技術
何らかの原因で細胞内あるいは細胞周辺で生体内酸化防御機構にインバランスが生じると、生体膜が酸化されるが、最も酸化されやすいのは膜脂質中の高度不飽和脂肪酸である。高度不飽和脂肪酸の減少を補うために、細胞は脂肪酸不飽和酵素を活性化し、ステアリン酸（１８：０）のオレイン酸（１８：１）への、パルミチン酸（１６：０）のパルミトオレイン酸（１６：１）への変化が進行する。さらに酸化ストレスが亢進し、細胞が死に至ると、加水分解酵素が働き、遊離の脂肪酸が血流中に出てくることになるが、その遊離脂肪酸の組成は酸化ストレスがかかっていない場合に比べ、高度不飽和脂肪酸の割合が少なく、モノ不飽和脂肪酸（オレイン酸（１８：１）、パルミトオレイン酸（１６：１））の割合が多いことが知られている。
細胞中の酸化ストレスの亢進のみならず、血流中でも活性酸素・フリーラジカルの生成が増加すると、最初に減少する抗酸化物質はビタミンＣとユビキノール−１０である。ユビキノール−１０は選択的にユビキノン−１０に酸化されるために、これを酸化ストレスの指標とすることは有用である。ビタミンＣとユビキノール−１０が減少した後は、リポタンパク質中のコレステロールエステルの酸化が進行し、その酸化生成物であるコレステロールエステルヒドロペルオキシドの生成が顕著になる。したがって、このヒドロペルオキシドは後期酸化ストレスマーカーとして有用のみならず、この生成を抑制する抗酸化物質は実用上大きな意味を持つ。
酸化ストレスにより誘発または進行、増悪する疾患（以下、「酸化ストレス疾患」と称することもある）としては、肝障害、脳血管障害（脳梗塞、脳出血など）、糖尿病などが挙げられる。現在までの所、血漿中モノ不飽和脂肪酸が上昇する例としては、ラット肝障害モデル（四塩化炭素投与、ＬＥＣラット）、脳血管障害急性期患者、新生児などで報告がある。しかしながら、血漿中モノ不飽和脂肪酸を低下させる作用を有する薬剤に関する報告はない。
また従来から、障害部位での酸化障害は認識されているが、障害部位での酸化障害（例えば、脳梗塞では脳組織が酸化障害を受ける）を的確かつ定量的に実証したという報告はない。動物実験で標的臓器を摘出・抽出し、過酸化脂質を定量するなどの方法は知られているが、組織抽出は臨床の現場で組織（例えば、肝臓や脳など）での酸化障害を評価する場合には、現実的ではない。酸化障害を的確かつ定量的に、組織を侵襲することなく血液などを標品として測定できる方法を開発する必要が依然として存在している。
発明の開示
本発明は、副作用の少ない安全な酸化ストレス疾患の治療及び／又は予防のための医薬として有用な酸化ストレス抑制剤を提供することを解決すべき課題とした。本発明はまた、酸化ストレスを的確かつ定量的に測定するための新規な方法を提供することを解決すべき課題とした。本発明はまた、組織を侵襲することなく血液などを標品として測定できる、新規な酸化ストレスの測定方法を提供することを解決すべき課題とした。さらに、本発明は、本明細書に記載した一定の構造を有するピラゾロン誘導体が有する酸化ストレス抑制作用の有効性を評価する方法を提供することを解決すべき課題とした。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討し、ラット脳虚血−再開通モデルにおける酸化ストレスマーカー（血漿中モノ不飽和脂肪酸、即ち、オレイン酸（１８：１）及びパルミトオレイン酸（１６：１））の変化を測定した結果、その濃度の上昇が認められた。また、この酸化ストレスを薬物の投与により抑制できるかどうかを検討した結果、本明細書で定義する下記式（Ｉ）で示されるピラゾロン誘導体を投与した場合に、上述した酸化ストレスマーカーの上昇を抑制できることを見出した。さらに、モノ不飽和脂肪酸の代わりにユビキノン−１０の変化を測定した場合も、上記同様の結果が認められた。また、ヒト血漿にラジカル開始剤を添加することにより生成する酸化ストレスマーカー、即ち、コレステロールエステルヒドロペルオキシドの変化を測定した結果、その濃度の上昇が認められた。上記同様、この酸化ストレスを薬物の添加により抑制できるかを検討した結果、下記式（Ｉ）で示されるピラゾロン誘導体がコレステロールエステルヒドロペルオキシドの上昇を抑制できることを見出した。これらの結果は、式（Ｉ）で示されるピラゾロン誘導体が病態時に亢進する酸化ストレスを抑制することを実証するものであると同時に、組織（脳など）の酸化ストレス（酸化障害）を測定するためのマーカーとして、血漿中モノ不飽和脂肪酸（即ち、オレイン酸（１８：１）及びパルミトオレイン酸（１６：１））、ユビキノン−１０及びコレステロールエステルヒドロペルオキシドが有用であることを実証するものである。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
即ち、本発明によれば、下記式（Ｉ）で示されるピラゾロン誘導体又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、酸化ストレス、好ましくは血漿中のモノ不飽和脂肪酸（即ち、オレイン酸（１８：１）及び／又はパルミトオレイン酸（１６：１））、ユビキノン−１０及び／又はコレステロールエステルヒドロペルオキシド、より好ましくはユビキノン−１０及び／又はコレステロールエステルヒドロペルオキシドの抑制剤が提供される。
（式中、Ｒ１は、水素原子、アリール基、炭素数１〜５のアルキル基又は総炭素数３〜６のアルコキシカルボニルアルキル基を表わし；Ｒ２は、水素原子、アリールオキシ基、アリールメルカプト基、炭素数１〜５のアルキル基又は炭素数１〜３のヒドロキシアルキル基を表し；あるいは、Ｒ１及びＲ２は、共同して炭素数３〜５のアルキレン基を表わし；Ｒ３は、水素原子、炭素数１〜５のアルキル基、炭素数５〜７のシクロアルキル基、炭素数１〜３のヒドロキシアルキル基、ベンジル基、ナフチル基又は非置換の、又は炭素数１〜５のアルキル基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数１〜３のヒドロキシアルキル基、総炭素数２〜５のアルコキシカルボニル基、炭素数１〜３のアルキルメルカプト基、炭素数１〜４のアルキルアミノ基、総炭素数２〜８のジアルキルアミノ基、ハロゲン原子、トリフルオロメチル基、カルボキシル基、シアノ基、水酸基、ニトロ基、アミノ基及びアセトアミド基からなる群から選ばれる同一若しくは異なる１〜３個の置換基で置換されたフェニル基を表す。）
有効成分として、好ましくは、式（Ｉ）において、Ｒ１は炭素数１〜５のアルキル基であり、Ｒ２は水素原子であり、Ｒ３は、炭素数１〜５のアルキル基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数１〜３のヒドロキシアルキル基、総炭素数２〜５のアルコキシカルボニル基、炭素数１〜３のアルキルメルカプト基、炭素数１〜４のアルキルアミノ基、総炭素数２〜８のジアルキルアミノ基、ハロゲン原子、トリフルオロメチル基、カルボキシル基、シアノ基、水酸基、ニトロ基、アミノ基及びアセトアミド基からなる群から選ばれる同一若しくは異なる１〜３個の置換基で置換されたフェニル基である。
特に好ましくは、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、酸化ストレス抑制剤が提供される。
本発明の酸化ストレス抑制剤は、好ましくは、酸化ストレスにより誘発、進行又は増悪する疾患の治療及び／又は予防のための医薬として使用することができる。好ましくは、酸化ストレスにより誘発、進行又は増悪する疾患はモノ不飽和脂肪酸、ユビキノン−１０又はコレステロールエステルヒドロペルオキシドの上昇を伴なう疾患であり、より好ましくは、ユビキノン−１０又はコレステロールエステルヒドロペルオキシドの上昇を伴なう疾患である。本発明の酸化ストレス抑制剤は、血漿中モノ不飽和脂肪酸、ユビキノン−１０又はコレステロールエステルヒドロペルオキシド、好ましくは、ユビキノン−１０又はコレステロールエステルヒドロペルオキシドを抑制することにより酸化ストレスを抑制することができる。
本発明の別の側面によれば、薬学的に有効量の前記式（Ｉ）で示されるピラゾロン誘導体又はその薬学的に許容される塩を、ヒトを含む哺乳動物に投与することを含む、酸化ストレスを抑制する方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、酸化ストレス抑制剤の製造における、前記式（Ｉ）で示されるピラゾロン誘導体又はその薬学的に許容される塩の使用が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、マーカーとして血漿中のモノ不飽和脂肪酸、ユビキノン−１０又はコレステロールエステルヒドロペルオキシド、好ましくはユビキノン−１０又はコレステロールエステルヒドロペルオキシドを用いることを特徴とする酸化ストレスの測定方法が提供される。
好ましくは、モノ不飽和脂肪酸はオレイン酸（１８：１）及び／又はパルミトオレイン酸（１６：１）である。
好ましくは、モノ不飽和脂肪酸、ユビキノン−１０又はコレステロールエステルヒドロペルオキシドの測定は液体クロマトグラフィー法によって行う。
本発明の別の側面によれば、被験者の血漿中のモノ不飽和脂肪酸、ユビキノン−１０又はコレステロールエステルヒドロペルオキシド、好ましくはユビキノン−１０又はコレステロールエステルヒドロペルオキシドの含有量を測定し、その測定値より酸化ストレスにより誘発、進行又は増悪する疾患の病態を分析または評価することを特徴とする臨床検査方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、酸化ストレス抑制作用を有すると予想される薬剤を投与した被験者の血漿中のモノ不飽和脂肪酸、ユビキノン−１０又はコレステロールエステルヒドロペルオキシドの含有量を測定することを含む、当該薬剤が有する酸化ストレス抑制作用の有効性を評価する方法が提供される。
好ましくは、薬剤は、前記式（Ｉ）で示されるピラゾロン誘導体又はその薬学的に許容される塩であり、より好ましくは、式（Ｉ）において、Ｒ１が炭素数１〜５のアルキル基であり、Ｒ２が水素原子であり、Ｒ３が、炭素数１〜５のアルキル基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数１〜３のヒドロキシアルキル基、総炭素数２〜５のアルコキシカルボニル基、炭素数１〜３のアルキルメルカプト基、炭素数１〜４のアルキルアミノ基、総炭素数２〜８のジアルキルアミノ基、ハロゲン原子、トリフルオロメチル基、カルボキシル基、シアノ基、水酸基、ニトロ基、アミノ基及びアセトアミド基からなる群から選ばれる同一若しくは異なる１〜３個の置換基で置換されたフェニル基である。式（Ｉ）で示されるピラゾロン誘導体又はその薬学的に許容される塩として特に好ましくは、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン又はその薬学的に許容される塩である。
本発明のさらに別の側面によれば、酸化ストレスにより誘発、進行又は増悪する疾患を患っていると予想される患者の血漿中のモノ不飽和脂肪酸、ユビキノン−１０又はコレステロールエステルヒドロペルオキシドの含有量を測定し、その測定値より酸化ストレスにより誘発、進行又は増悪する疾患の病態を分析または評価し、その結果、酸化ストレスにより誘発、進行又は増悪する疾患を患っていると判断された患者に対し、前記式（Ｉ）で示されるピラゾロン誘導体又はその薬学的に許容される塩を投与することを特徴とする、医薬が提供される。式（Ｉ）で示されるピラゾロン誘導体又はその薬学的に許容される塩として特に好ましくは、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン又はその薬学的に許容される塩である。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
（Ｉ）本発明の医薬
本発明の医薬は、本明細書に定義した式（Ｉ）で示されるピラゾロン誘導体又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含む。
式（Ｉ）で示される化合物は、以下の式（Ｉ’）又は（Ｉ”）で示される構造をもとりうる。従って、式（Ｉ’）又は（Ｉ”）の構造をとる化合物も本発明の有効成分に含まれる。
式（Ｉ）において、Ｒ１の定義におけるアリール基としては、フェニル基並びにメチル基、ブチル基、メトキシ基、ブトキシ基、塩素原子及び水酸基等の置換基で置換されたフェニル基等が挙げられる。
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の定義における炭素数１〜５のアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基等が挙げられる。
Ｒ１の定義における総炭素数３〜６のアルコキシカルボニルアルキル基としては、メトキシカルボニルメチル基、エトキシカルボニルメチル基、プロボキシカルボニルメチル基、メトキシカルボニルエチル基、メトキシカルボニルプロピル基等が挙げられる。
Ｒ２の定義におけるアリールオキシ基としては、フエノキシ基、ｐ−メチルフエノキシ基、ｐ−メトキシフエノキシ基、ｐ−クロロフエノキシ基、ｐ−ヒドロキシフエノキシ基等が挙げられ、アリールメルカプト基としては、フェニルメルカプト基、ｐ−メチルフェニルメルカプト基、ｐ−メトキシフェニルメルカプト基、ｐ−クロロフェニルメルカプト基、ｐ−ヒドロキシフェニルメルカプト基等が挙げられる。
Ｒ２及びＲ３の定義における炭素数１〜３のヒドロキシアルキル基としては、ヒドロキシメチル基、２−ヒドロキシエチル基、３−ヒドロキシプロピル基等が挙げられる。Ｒ３の定義における炭素数５〜７のシクロアルキル基としては、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基等が挙げられる。
Ｒ３の定義において、フェニル基の置換基における炭素数１〜５のアルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、プロボキシ基、イソプロボキシ基、ブトキシ基、ペンチルオキシ基等が挙げられ、総炭素数２〜５のアルコキシカルボニル基としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロボキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基等が挙げられ、炭素数１〜３のアルキルメルカプト基としては、メチルメルカプト基、エチルメルカプト基、プロピルメルカプト基等が挙げられ、炭素数１〜４のアルキルアミノ基としては、メチルアミノ基、エチルアミノ基、プロピルアミノ基、ブチルアミノ基等が挙げられ、総炭素数２〜８のジアルキルアミノ基としては、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジプロピルアミノ基、ジブチルアミノ基等が挙げられる。
本発明で用いる式（Ｉ）の化合物の具体例としては、例えば、以下に示す化合物が挙げられる。
３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン
３−メチル−１−（２−メチルフェニル）−２−ピラゾリン−５−オン
３−メチル−１−（３−メチルフェニル）−２−ピラゾリン−５−オン
３−メチル−１−（４−メチルフェニル）−２−ピラゾリン−５−オン
３−メチル−１−（３，４−ジメチルフェニル）−２−ピラゾリン−５−オン
１−（４−エチルフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン
３−メチル−１−（４−プロピルフェニル）−２−ピラゾリン−５−オン
１−（４−ブチルフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン
１−（３−トリフルオロメチルフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン
１−（４−トリフルオロメチルフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン
１−（２−メトキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン
１−（３−メトキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン
１−（４−メトキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン
１−（３，４−ジメトキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン
１−（４−エトキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン
３−メチル−１−（４−プロボキシフェニル）−２−ピラゾリン−５−オン
１−（４−ブトキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン
１−（２−クロロフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン
１−（３−クロロフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン
１−（４−クロロフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン
１−（３，４−ジクロロフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン
１−（４−ブロモフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン
１−（４−フルオロフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン
１−（３−クロロ−４−メチルフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン
１−（３−メチルメルカプトフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン
１−（４−メチルメルカプトフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン
４−（３−メチル−５−オキソ−２−ピラゾリン−１−イル）安息香酸
１−（４−エトキシカルボニルフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン
１−（４−ニトロフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン
３−エチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン
１−フェニル−３−プロピル−２−ピラゾリン−５−オン
１，３−ジフェニル−２−ピラゾリン−５−オン
３−フェニル−１−（ｐ−トリル）−２−ピラゾリン−５−オン
１−（４−メトキシフェニル）−３−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン
１−（４−クロロフェニル）−３−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン
３，４−ジメチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン
４−イソブチル−３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン
４−（２−ヒドロキシエチル）−３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン
３−メチル−４−フェノキシ−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン
３−メチル−４−フェニルメルカプト−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン
３，３’，４，５，６，７−ヘキサヒドロ−２−フェニル−２Ｈ−インダゾール−３−オン
３−（エトキシカルボニルメチル）−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン
１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン
３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン
１，３−ジメチル−２−ピラゾリン−５−オン
１−エチル−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン
１−ブチル−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン
１−（２−ヒドロキエチル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン
１−シクロヘキシル−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン
１−ベンジル−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン
１−（α−ナフチル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン
１−メチル−３−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン
３−メチル−１−（４−メチルフェニル）−２−ピラゾリン−５−オン
１−（４−ブチルフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン
１−（４−メトキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン
１−（４−ブトキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン
１−（４−クロロフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン
１−（４−ヒドロキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン
１−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン
１−（２−ヒドロキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン
１−（３−ヒドロキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン
１−（４−ヒドロキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン
１−（３，４−ヒドロキシフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン
１−（４−ヒドロキシフェニル）−３−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン
１−（４−ヒドロキシメチルフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン
１−（４−アミノフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン
１−（４−メチルアミノフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン
１−（４−エチルアミノフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン
１−（４−ブチルアミノフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン
１−（４−ジメチルアミノフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン
１−（アセトアミドフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン
１−（４−シアノフェニル）−３−メチル−２−ピラゾリン−５−オン
本発明の医薬の有効成分としては、式（Ｉ）で表される遊離形態の化合物のほか、生理学的に許容される塩を用いてもよい。生理学的に許容される塩としては、塩酸、硫酸、臭化水素塩、リン酸等の鉱酸との塩；メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、酢酸、グリコール酸、グルクロン酸、マレイン酸、フマル酸、シュウ酸、アスコルビン酸、クエン酸、サリチル酸、ニコチン酸、酒石酸等の有機酸との塩；ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩；マグネシウム、カルシウム等のアルカリ土類金属との塩；アンモニア、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、Ｎ，Ｎ−ビス（ヒドロキシエチル）ピペラジン、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、エタノールアミン、Ｎ−メチルグルタミン、Ｌ−グルタミン等のアミンとの塩が挙げられる。また、グリシンなどのアミノ酸との塩を用いてもよい。
本発明の医薬の有効成分としては、上記式（Ｉ）で表される化合物若しくはその生理学的に許容される塩の水和物、又は上記式（Ｉ）で表される化合物若しくはその生理学的に許容される塩の溶媒和物を用いてもよい。溶媒和物を形成する有機溶媒の種類は特に限定されないが、例えば、メタノール、エタノール、エーテル、ジオキサン、テトラヒドロフランなどを例示することができる。また、上記式（Ｉ）で表される化合物は、置換基の種類により１以上の不斉炭素を有する場合があり、光学異性体又はジアステレオ異性体などの立体異性体が存在する場合がある。本発明の医薬の有効成分としては、純粋な形態の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などを用いてもよい。
なお、本発明で用いる式（Ｉ）の化合物は公知化合物であり、例えば、特公平５−３１５２３号公報、特公平５−３５１２８号公報などに記載されている。
本発明で有効成分として用いる式（Ｉ）で示されるピラゾロン誘導体又はその薬学的に許容される塩は、血漿中のモノ不飽和脂肪酸、ユビキノン−１０又はコレステロールエステルヒドロペルオキシドを抑制することにより酸化ストレスを抑制することができ、酸化ストレス疾患の治療及び／又は予防のための医薬として使用することができる。従って、本明細書で言う酸化ストレス疾患としては、モノ不飽和脂肪酸、ユビキノン−１０又はコレステロールエステルヒドロペルオキシドの上昇を伴なう疾患が好ましい。酸化ストレス疾患の具体例としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
虚血疾患若しくはそれに基づく各種の疾患、即ち、脳梗塞、脳卒中等の脳血管障害、又はそれらに起因する脳機能低下、血管性痴呆、加齢に伴う脳血管組織病変等の諸種脳疾患、心筋梗塞、心不全等心筋虚血に基づく諸種末梢循環障害等；
その他の酸化ストレス疾患としては、アルコール性肝炎、網膜症、網膜鉄錆症、白内障、放射線治療による副作用障害、脳浮腫、抗原毒素に因るエンドトキシン・ショック、腎炎、糖尿病等が挙げられる。
本発明で用いる式（Ｉ）の化合物の投与量は一般に非経口投与で０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ・日、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ・日であり、経口投与で１〜２００ｍｇ／ｋｇ・日、好ましくは５〜２０ｍｇ／ｋｇ・日である。上記投与量は１日１〜３回で投与するのが好ましい。また、上記投与量は、年齢、病態、症状により適宜増減することが更に好ましい。
本発明の医薬としては、上記式（Ｉ）で表される化合物若しくはその生理学的に許容される塩、又はそれらの水和物若しくは溶媒和物をそのまま投与してもよいが、一般的には、有効成分である上記の物質と薬理学的及び製剤学的に許容される添加物を含む医薬組成物を調製して投与することが好ましい。
薬理学的及び製剤学的に許容しうる添加物としては、例えば、賦形剤、崩壊剤ないし崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤ないし溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、噴射剤、及び粘着剤等を用いることができる。
経口投与に適する医薬組成物には、添加物として、例えば、ブドウ糖、乳糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、又は結晶セルロース等の賦形剤；カルボキシメチルセルロース、デンプン、又はカルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤又は崩壊補助剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、又はゼラチン等の結合剤；ステアリン酸マグネシウム又はタルク等の滑沢剤；ヒドロキシプロピルメチルセルロース、白糖、ポリエチレングリコール又は酸化チタン等のコーティング剤；ワセリン、流動パラフィン、ポリエチレングリコール、ゼラチン、カオリン、グリセリン、精製水、又はハードファット等の基剤を用いることができる。
注射あるいは点滴用に適する医薬組成物には、注射用蒸留水、生理食塩水、プロピレングリコール等の水性あるいは用時溶解型注射剤を構成しうる溶解剤又は溶解補助剤；ブドウ糖、塩化ナトリウム、Ｄ−マンニトール、グリセリン等の等張化剤；無機酸、有機酸、無機塩基又は有機塩基等のｐＨ調節剤等の添加物を用いることができる。
本発明の医薬の形態は特に限定されず、当業者に利用可能な種々の形態をとることができる。経口投与に適する医薬として、例えば、固体の製剤用添加物を用いて錠剤、散剤、顆粒剤、硬ゼラチンカプセル剤、坐剤、又はトローチ剤などを調製することができ、液状の製剤用添加物を用いてシロップ剤、乳剤、軟ゼラチンカプセル剤などを調製することができる。また、非経口投与に適する医薬として、注射剤、点滴剤、吸入剤、坐剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤などを調製することができる。なお、上記の式（Ｉ）の化合物を有効成分とする脳保護剤（点滴剤）が、すでに臨床において使用されているので（一般名「エダラボン」、商品名「ラジカット」：三菱ウェルファーマ株式会社製造・販売）、本発明の医薬において上記市販製剤をそのまま用いることができる。
（ＩＩ）本発明による酸化ストレスの測定方法
本発明においては、オレイン酸（１８：１）及びパルミトオレイン酸（１６：１）などのモノ不飽和脂肪酸、ユビキノン−１０又はコレステロールエステルヒドロペルオキシド、好ましくはユビキノン−１０又はコレステロールエステルヒドロペルオキシドをマーカー（指標）として、酸化ストレスの測定を行う。なお、本明細書で言うコレステロールエステルヒドロペルオキシドとは、主として、コレステロールの脂肪酸エステルの脂肪酸部分の過酸化体を意味する。本発明においては、対象となる生体から血漿を採取し、その血漿中に存在するオレイン酸（１８：１）及びパルミトオレイン酸（１６：１）などのモノ不飽和脂肪酸、ユビキノン−１０又はコレステロールエステルヒドロペルオキシドを、公知の各種の測定手法にて測定する。
オレイン酸（１８：１）及びパルミトオレイン酸（１６：１）などのモノ不飽和脂肪酸、ユビキノン−１０又はコレステロールエステルヒドロペルオキシドの量の測定は、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）などの液体クロマトグラフィ法で行うことが好ましい。
高速液体クロマトグラフィによるモノ不飽和脂肪酸、ユビキノン−１０又はコレステロールエステルヒドロペルオキシドの量の測定は常法に従って行うことができ、カラムとしては、例えばモノ不飽和脂肪酸の測定の場合には、オクチルカラム（３μｍ、３．３ｃｍ×４．６ｍｍ ｉ．ｄ．、Ｓｕｐｅｌｃｏ）＋ｐｋｂ−１００カラム（５μｍ、２５ｃｍ×４．６ｍｍ ｉ．ｄ．、Ｓｕｐｅｌｃｏ）などを使用でき、移動相としては、例えば、アセトニトリル／メタノール／水＝１７．５／６５．０／１７．５（ｖ／ｖ／ｖ）を用いることができる。流速は例えば、１．５ｍｌ／分とし、カラム温度は４０℃に設定することができる。また、ユビキノン−１０の場合には、カラムとしてガードカラム２本（Ｔｙｐｅ Ｓｕｐｅｌｇｕａｒｄ ＬＣ−ＡＢＺ、５μｍ、５０×４．６ｍｍ ｉ．ｄ．、Ｓｕｐｅｌｃｏ）＋分析カラム（Ｔｙｐｅ Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ ＬＣ−８、５μｍ、２５０×４．６ｍｍ ｉ．ｄ．、Ｓｕｐｅｌｃｏ）＋還元カラム（Ｔｙｐｅ ＲＣ−１０−１、Ｉｒｉｃａ）などを使用でき、移動相としては、例えば、メタノール／ｔｅｒｔ−ブチルアルコール＝８５／１５（ｖ／ｖ）（５０ｍＭ過塩素酸ナトリウムを含む）を用いることができ、流速：０．８ｍｌ／分とすることができる。さらに、コレステロールエステルヒドロペルオキシドの場合には、分析カラムとして（Ｔｙｐｅ Ｂｅｃｋｍａｎ ＬＣ−８、５μｍ、２５０×４．６ｍｍ ｉ．ｄ．）などを使用でき、移動相としては、例えば、メタノール／ｔｅｒｔ−ブチルアルコール＝１９／１（ｖ／ｖ）を用いることができ、移動相の流速：１．０ｍｌ／分、化学発光剤の流速：１．５ｍｌ／分とし、化学発光法を用いた高速液体クロマトグラフィにより測定することができる。但し、これらは高速液体クロマトグラフィの一例を示すものにすぎず、当業者であれば好適な条件を適宜設定することができる。
本発明においてモノ不飽和脂肪酸を測定する場合は、好ましくは、総遊離脂肪酸に対するパルミトオレイン酸の割合（％１６：１）、並びに総遊離脂肪酸に対するオレイン酸の割合（％１８：１）を測定する。
上述した方法により得られるオレイン酸（１８：１）及びパルミトオレイン酸（１６：１）などのモノ不飽和脂肪酸、並びにユビキノン−１０及びコレステロールエステルヒドロペルオキシドの量は、生体内において生成する活性酸素又はフリーラジカルの存在量を反映するものであり、従って酸化ストレスの状態を反映するものである。従って、その測定値の大小により、酸化ストレスの大小の状態を把握することができる。また、その測定値から、酸化ストレス疾患の状態を効果的に分析または評価することが可能である。
酸化ストレス疾患としては、モノ不飽和脂肪酸、ユビキノン−１０又はコレステロールエステルヒドロペルオキシド、好ましくはユビキノン−１０又はコレステロールエステルヒドロペルオキシドの上昇を伴なう疾患が好ましく、その具体例としては、本明細書中上記した通りであるが、それらに限定されるものではない。
本発明では、マーカーとして用いるモノ不飽和脂肪酸、ユビキノン−１０及びコレステロールエステルヒドロペルオキシドは、血漿中に比較的高い割合で存在することから、通常の臨床検査において採用されるＨＰＬＣ技術等を利用して、容易に実施することができる。
さらに、本発明によれば、酸化ストレス抑制作用を有すると予想される薬剤を投与した被験者の血漿中のモノ不飽和脂肪酸、ユビキノン−１０又はコレステロールエステルヒドロペルオキシド、好ましくはユビキノン−１０又はコレステロールエステルヒドロペルオキシドの含有量を測定することを含む、当該薬剤が有する酸化ストレス抑制作用の有効性を評価する方法が提供される。好ましくは、薬剤は、前記式（Ｉ）で示されるピラゾロン誘導体又はその薬学的に許容される塩であり、より好ましくは、式（Ｉ）において、Ｒ１が炭素数１〜５のアルキル基であり、Ｒ２が水素原子であり、Ｒ３が、炭素数１〜５のアルキル基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数１〜３のヒドロキシアルキル基、総炭素数２〜５のアルコキシカルボニル基、炭素数１〜３のアルキルメルカプト基、炭素数１〜４のアルキルアミノ基、総炭素数２〜８のジアルキルアミノ基、ハロゲン原子、トリフルオロメチル基、カルボキシル基、シアノ基、水酸基、ニトロ基、アミノ基及びアセトアミド基からなる群から選ばれる同一若しくは異なる１〜３個の置換基で置換されたフェニル基である。式（Ｉ）で示されるピラゾロン誘導体又はその薬学的に許容される塩として特に好ましくは、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン又はその薬学的に許容される塩である。
さらに本発明によれば、酸化ストレスにより誘発、進行又は増悪する疾患を患っていると予想される患者の血漿中のモノ不飽和脂肪酸、ユビキノン−１０又はコレステロールエステルヒドロペルオキシド、好ましくはユビキノン−１０又はコレステロールエステルヒドロペルオキシドの含有量を測定し、その測定値より酸化ストレスにより誘発、進行又は増悪する疾患の病態を分析または評価し、その結果、酸化ストレスにより誘発、進行又は増悪する疾患を患っていると判断された患者に対し、前記式（Ｉ）で示されるピラゾロン誘導体又はその薬学的に許容される塩を投与することを特徴とする、医薬が提供される。式（Ｉ）で示されるピラゾロン誘導体又はその薬学的に許容される塩として特に好ましくは、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン又はその薬学的に許容される塩である。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
実施例
合成例：３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン（以下、エダラボンと称す）の合成
エタノール５０ｍｌ中にアセト酢酸エチル１３．０ｇ及びフェニルヒドラジン１０．８ｇを加え、３時間還流攪拌した。反応液を放冷後、析出した結晶をろ取し、エタノールより再結晶して、表題の化合物１１．３ｇを無色結晶として得た。
収率 ６７％
融点 １２７．５〜１２８．５℃
実施例１：
（方法）
１．使用動物
７週齢のＣｒｊ：ＣＤ（ＳＤ）雄性ラット（入荷時体重：１９７．８〜２２８．８ｇ、日本チャールズ・リバー株式会社）を５０匹購入し、５日間以上の検疫馴化期間に一般状態の観察及び体重測定を行い、異常がなく順調な体重推移を示すことを確認した後、８週齢で試験に供した。すべての動物は、温度２４±２℃、湿度５５±１０％、換気回数１３回／時及び照明１２時間（午前７時〜午後７時）に設定した飼育室内で飼育した。
２．試験群の構成
体重差による脳梗塞巣形成のバラツキを防ぐため、手術日の体重を元に層別連続無作為化法で群分けし、生理食塩液投与（対照群及び偽手術（ｓｈａｍ ｏｐｅ）群）、被験物質投与（単回投与群及び反復投与群）の計４群を設定した。
３．ＭＣＡ（中大脳動脈）閉塞再開通モデルの作製
ラットを３％イソフルラン吸入にて麻酔導入後、仰臥位に固定し、２％イソフルラン吸入にて麻酔を維持した。フリームービングの状態で持続注入を行うためにカテーテルを大腿静脈内に留置した。
頸部正中皮膚切開を行い、右側総頸動脈、外頸動脈及び内頸動脈を露出し、総頸動脈及び外頸動脈を縫合糸（５号）で結紮した。予めシリコンコーティング（キサントプレンＬ、バイエル薬品）をし１９ｍｍの長さに切断した４号のナイロン糸（栓子）を、外頸動脈と内頸動脈の分岐部より挿入し、ＭＣＡを閉塞した。ＭＣＡ閉塞２時間後に栓子を抜き、ＭＣＡの血流を再開通させた。ＭＣＡ閉塞３０分後に神経症状（前肢の屈曲）を観察し、前肢の屈曲が確認できない動物は試験から除外した。偽手術群については、本法に準拠して右側総頸動脈及び外頸動脈の結紮まで実施した。手術中の体温調節を行うために体温計用プローブ（ＰＨＹＳＩＴＥＭＰ ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ Ｉｎｃ．ＢＡＴ−１２）を直腸内に挿入しておき、手術前後の体温を記録した。体温低下が見られた場合、白熱灯を用いて体温を３７℃付近に維持した。
４．薬物の投与
ＭＣＡ閉塞再開通直後３ｍｇ／ｋｇの３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンを１．０ｍＬ／ｂｏｄｙ／ｈの容量で３０分間の持続注入（１回目投与）を行い、６時間後同容量で再度３０分間の持続注入（２回目投与）を行った。手術翌日より、午前１０時及び午後１６時にインフュージョンポンプ（ＫＤ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ，１０連ｉｎｆｕｓｉｏｎｐｕｍｐ ２３０）を用いて３ｍｇ／ｋｇの３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンを１．０ｍＬ／ｂｏｄｙ／ｈの容量で１日２回３０分間の持続注入を連続１３日間行った。投与液の濃度は最新の体重をもとに算出した。なお、単回投与群は、手術日の１回目のみ３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンを投与し、２回目以降は同容量の生理食塩液を投与した。対照群及び偽手術群には生理食塩液を同容量で投与した。
５．採血
ＭＣＡ閉塞前、閉塞再開通後、１，２，３，５，７および１０日目の１回目の投与開始前及び１４日目の午前１０時よりヘパリン処理した１ｍＬシリンジを用いて鎖骨下静脈から血液を約０．３ｍＬ採取し、３０００ｒｐｍ、１０分間遠心して血漿を分離した。血漿は４本のマイクロチューブに２５μＬずつ分注し、液体窒素で凍結させた後、送付時まで約−８０℃にて凍結保存した。
６．遊離脂肪酸の分離定量
１２．５μＭのマルガリン酸（１３：０、内部標準）を含む２００μｌのメタノールを、５０μｌの血漿に加えよく混和した後、遠心分離した（１２，０００ｒｐｍ、３分）。上清５０μｌの溶媒を窒素気流下で除去後、２ｍｇ／ｍｌのモノダンシルカダベリンのジメチルホルムアミド溶液５０μｌと１μｌのシアノリン酸ジエチルを加え、２０分間暗所で反応させて、遊離脂肪酸を蛍光誘導化した。
高速液体クロマトグラフィに反応液５μｌを注入し、総脂肪酸量と脂肪酸組成を調べた。高速液体クロマトグラフィの条件は以下のとおりである。
カラム：オクチルカラム（３μｍ、３．３ｃｍ×４．６ｍｍ ｉ．ｄ．、Ｓｕｐｅｌｃｏ）＋ｐｋｂ−１００カラム（５μｍ、２５ｃｍ×４．６ｍｍ ｉ．ｄ．、Ｓｕｐｅｌｃｏ）
移動相：アセトニトリル／メタノール／水＝１７．５／６５．０／１７．５（ｖ／ｖ／ｖ）
流速：１．５ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
蛍光検出器励起波長：３２０ｎｍ
蛍光検出器蛍光波長：５２０ｎｍ
（結果・考察）
結果を図１及び図２に示す。
図１は、血漿中のパルミトオレイン酸（１６：１）の割合の経時的変化を示すグラフである。総遊離脂肪酸に対するパルミトオレイン酸（１６：１）の割合を％１６：１と定義する。図１において、第０日目における％１６：１の値を基準として、変化の百分率（％）をグラフの縦軸に示し、日数をグラフの横軸に示す。
図２は、血漿中のオレイン酸（１８：１）の割合の経時的変化を示すグラフである。総遊離脂肪酸に対するオレイン酸の割合を％１８：１と定義する。第０日目における％１８：１の値を基準として、変化の百分率（％）をグラフの縦軸に示し、日数をグラフの横軸に示す。
偽手術群のラットでは、パルミトオレイン酸（１６：１）及びオレイン酸（１８：１）の割合に大きな変動は見られなかった。しかし、対照群のラットでは、ＭＣＡ閉塞−再開通後１〜５日後までパルミトオレイン酸（１６：１）及びオレイン酸（１８：１）の割合が有意に上昇し、この間の酸化ストレス亢進が示唆された。一方、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンを投与した群では、パルミトオレイン酸（１６：１）及びオレイン酸（１８：１）の割合は、偽手術群と同じにようにほとんど変化せず、対照群と比較して有意に抑制された。
上記の結果は、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンが脳虚血−再開通後に増加するラジカルを有効に消去し、脂質過酸化反応を抑制することにより脳を保護することを示唆する。
実施例２：ユビキノン−１０（ＣｏＱ−１０）の分離定量
（方法）
使用動物、試験群の構成、ＭＣＡ閉塞再開通モデルの作製、薬物の投与、及び採血は実施例１と同様に行った。ユビキノン−１０（ＣｏＱ−１０）の分離定量は以下の通り行った。
２５０μｌのｃｏｌｄメタノールと５００μｌのｃｏｌｄヘキサンを、５０μｌの血漿に加えよく混和した後、遠心分離した（１０，０００ｇ、３分間、４℃）。５μｌのヘキサン層（０．５μｌの血漿に相当）を速やかに高速液体クロマトグラフィに注入し、ユビキノン−１０（ＣｏＱ−１０）量を調べた．高速液体クロマトグラフィの条件は以下の通りである。
カラム：ガードカラム２本（Ｔｙｐｅ Ｓｕｐｅｌｇｕａｒｄ ＬＣ−ＡＢＺ、５μｍ、５０×４．６ｍｍ ｉ．ｄ．、Ｓｕｐｅｌｃｏ）＋分析カラム（Ｔｙｐｅ Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ ＬＣ−８、５μｍ、２５０×４．６ｍｍ ｉ．ｄ．、Ｓｕｐｅｌｃｏ）＋還元カラム（Ｔｙｐｅ ＲＣ−１０−１、Ｉｒｉｃａ）
移動層：メタノール／ｔｅｒｔ−ブチルアルコール＝８５／１５（ｖ／ｖ）（５０ｍＭ過塩素酸ナトリウムを含む）
流速：０．８ｍｌ／分
検出：電気化学検出器作用電圧：＋６００ｍＶ
（結果）
結果を図３に示す。
図３は、血漿中のユビキノン−１０の割合の経時的変化を示すグラフである。図３において、第０日目におけるユビキノン−１０の値を基準として、変化の百分率（％）をグラフの縦軸に示し、日数をグラフの横軸に示す。
偽手術群のラットでは、ユビキノン−１０の割合に大きな変動は見られなかった。しかし、対照群のラットでは、ＭＣＡ閉塞−再開通後ユビキノン−１０の割合が上昇し、この間の酸化ストレス亢進が示唆された。一方、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンを投与した群では、ユビキノン−１０の割合は、偽手術群と同じにようにほとんど変化しなかった。なお、偽手術群の２例及び反復投与群１例を除く全例において５日目のユビキノン−１０の測定ではユビキノン−１０が検出されなかったことから、図３においては５日目のデータは削除した。
実施例３：コレステロールエステルヒドロペルオキシド（ＣＥ−ＯＯＨ）の測定（方法）
健康な４０才代男性から提供された血液から、実施例１に述べた方法に準じて、血漿を分離した。この血漿２ｍｌにラジカル開始剤である２，２’−アゾビス（２，４−ジメチル−バレロニトリル）（ＡＭＶＮ）（和光純薬社より購入）をＡＭＶＮ濃度が１０ｍＭとなるように加えた。エダラボン投与群にはエダラボン濃度が５０μＭとなるように、さらにエダラボンを加えた。
反応混液を３７℃に保ち、４、５及び６時間後に反応混液中に含まれるコレステロールエステルヒドロペルオキシド量をイソルミノール化学発光法を用いた高速液体クロマトグラフィーにより測定した。測定条件は以下の通り。
化学発光剤の調製
１７７．２ｍｇのイソルミノール（シグマ社より購入）と５ｍｇのマイクロパーオキシダーゼ（シグマ社より購入）を５００ｍｌのメタノールと５００ｍｌのホウ酸塩緩衝液（ｐＨ１０）の混合液中に溶解し、化学発光剤を調製した。
流速
移動相（メタノール／ｔ−ブタノール＝１９／１（ｖ／ｖ））：１．０ｍｌ／分化学発光剤：１．５ｍｌ／分
カラム
分析カラム：Ｔｙｐｅ Ｂｅｃｋｍａｎ ＬＣ−８，５μｍ，２５０×４．６ｍｍ ｉ．ｄ．
（結果）
結果を図４に示す。
図４は、反応混液中に含まれるコレステロールエステルヒドロペルオキシド濃度の経時的変化を示すグラフである。図４において、コレステロールエステルヒドロペルオキシド濃度をグラフの縦軸に示し、経過時間をグラフの横軸に示す。５時間経過後以降において、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン（薬剤）を添加した群では、コレステロールエステルヒドロペルオキシド濃度の増加が抑制された。
産業上の利用の可能性
本発明の医薬は、各種の酸化ストレス疾患（例えば、虚血疾患若しくはそれに基づく各種の疾患、即ち、脳梗塞、脳卒中等の脳血管障害、又はそれらに起因する脳機能低下、血管性痴呆、加齢に伴う脳血管組織病変等の諸種脳疾患、心筋梗塞、心不全等心筋虚血に基づく諸種末梢循環障害等、並びに肝障害、糖尿病等の予防・治療剤として有用である。
さらに本発明により、酸化ストレスを的確かつ定量的に測定するための新規な方法が提供される。本発明の方法は、組織を侵襲することなく血液などを標品として測定できる。さらに、本発明によれば、血漿中のモノ不飽和脂肪酸、ユビキノン−１０又はコレステロールエステルヒドロペルオキシドの含有量をマーカーとすることにより、本明細書に記載した一定の構造を有するピラゾロン誘導体が有する酸化ストレス抑制作用の有効性を評価する方法が提供される。本発明の方法によれば、当該ピラゾロン誘導体の薬剤としての有効性を的確かつ簡単に評価することができる。
本出願が主張する優先権の基礎となる出願である特願２００１−２７５４６６及び特願２００１−２７５４６７の明細書に記載の内容は全て、本明細書の開示の一部として本明細書中に引用により取り込むものとする。
【図面の簡単な説明】
図１は、血漿中のパルミトオレイン酸（１６：１）の割合の経時的変化を示すグラフである。
図２は、血漿中のオレイン酸（１８：１）の割合の経時的変化を示すグラフである。
図３は、血漿中のユビキノン−１０の割合の経時的変化を示すグラフである。
図４は、血漿中のコレステロールエステルヒドロペルオキシドの割合の経時的変化を示すグラフである。Technical field
TECHNICAL FIELD The present invention relates to an oxidative stress inhibitor useful as a medicament for treating and / or preventing oxidative stress disease. More specifically, the present invention relates to an oxidative stress inhibitor comprising a pyrazolone derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. Further, the present invention relates to a method for measuring oxidative stress. More specifically, the present invention relates to a method for measuring oxidative stress, which comprises using a monounsaturated fatty acid, ubiquinone-10 (also referred to as CoQ-10) or cholesterol ester hydroperoxide in plasma as a marker.
Background art
When an imbalance occurs in the in vivo oxidation defense mechanism in or around a cell for some reason, the biological membrane is oxidized, but the most oxidizable is the highly unsaturated fatty acid in the membrane lipid. To compensate for the loss of polyunsaturated fatty acids, the cells activate fatty acid unsaturated enzymes to convert stearic acid (18: 0) to oleic acid (18: 1) and palmitic acid (16: 0) to palmitoolein. Conversion to the acid (16: 1) proceeds. When oxidative stress further increases and the cells die, hydrolytic enzymes work to release free fatty acids into the bloodstream, but the composition of the free fatty acids is lower than when oxidative stress is not applied. It is known that the proportion of polyunsaturated fatty acids is low and the proportion of monounsaturated fatty acids (oleic acid (18: 1), palmito oleic acid (16: 1)) is large.
When the production of active oxygen and free radicals increases not only in oxidative stress in cells but also in the bloodstream, antioxidants that decrease first are vitamin C and ubiquinol-10. Since ubiquinol-10 is selectively oxidized to ubiquinone-10, it is useful to use this as an indicator of oxidative stress. After the reduction of vitamin C and ubiquinol-10, the oxidation of cholesterol ester in lipoprotein proceeds, and the production of oxidized product, cholesterol ester hydroperoxide, becomes remarkable. Therefore, this hydroperoxide is not only useful as a late oxidative stress marker, but also an antioxidant that suppresses its production has great practical significance.
Diseases induced, progressed, or exacerbated by oxidative stress (hereinafter sometimes referred to as “oxidative stress disease”) include hepatic disorder, cerebrovascular disorder (cerebral infarction, cerebral hemorrhage, etc.), diabetes, and the like. To date, examples of elevated monounsaturated fatty acids in plasma have been reported in rat liver injury models (carbon tetrachloride administration, LEC rats), acute cerebrovascular disease patients, newborns, and the like. However, there is no report on a drug having an action of lowering plasma monounsaturated fatty acids.
In addition, although oxidative damage at an injured site has been conventionally recognized, there has been no report that oxidative damage at an injured site (for example, brain tissue undergoes oxidative damage in cerebral infarction) has been accurately and quantitatively demonstrated. Although methods such as extracting and extracting target organs from animal experiments and quantifying lipid peroxide are known, tissue extraction evaluates oxidative damage in tissues (eg, liver and brain) at clinical sites. If not, it is not realistic. There is still a need to develop a method that can accurately and quantitatively measure an oxidative disorder without invading tissues, such as a blood sample.
Disclosure of the invention
An object of the present invention is to provide an oxidative stress inhibitor that is useful as a medicament for safe treatment and / or prevention of oxidative stress diseases with few side effects. Another object of the present invention is to provide a novel method for accurately and quantitatively measuring oxidative stress. Another object of the present invention is to provide a novel method for measuring oxidative stress that can measure blood or the like as a sample without invading tissues. Furthermore, an object of the present invention is to provide a method for evaluating the effectiveness of the pyrazolone derivative having a certain structure described in the present specification for inhibiting oxidative stress.
Means for Solving the Problems The present inventors diligently studied to solve the above-mentioned problems, and studied oxidative stress markers (plasma monounsaturated fatty acids, ie, oleic acid (18: 1) and palmitoolein) in a rat cerebral ischemia-reperfusion model. As a result of measuring the change of the acid (16: 1), an increase in the concentration was observed. Further, as a result of examining whether or not this oxidative stress can be suppressed by administration of a drug, it was found that when the pyrazolone derivative represented by the following formula (I) defined herein is administered, the above-mentioned increase in the oxidative stress marker is suppressed. I found what I can do. Furthermore, when the change of ubiquinone-10 was measured instead of the monounsaturated fatty acid, the same result as above was observed. In addition, as a result of measuring a change in an oxidative stress marker generated by adding a radical initiator to human plasma, ie, cholesterol ester hydroperoxide, an increase in the concentration was observed. As described above, as a result of examining whether or not this oxidative stress can be suppressed by adding a drug, it was found that a pyrazolone derivative represented by the following formula (I) can suppress an increase in cholesterol ester hydroperoxide. These results demonstrate that the pyrazolone derivative represented by the formula (I) suppresses oxidative stress that increases during a disease state, and at the same time, measures the oxidative stress (oxidative disorder) of a tissue (such as the brain). Are useful as markers of plasma monounsaturated fatty acids (ie, oleic acid (18: 1) and palmitooleic acid (16: 1)), ubiquinone-10 and cholesterol ester hydroperoxide. is there. The present invention has been completed based on these findings.
That is, according to the present invention, oxidative stress, preferably a monounsaturated fatty acid in plasma (that is, oleic acid) containing a pyrazolone derivative represented by the following formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient: (18: 1) and / or palmitooleic acid (16: 1)), an inhibitor of ubiquinone-10 and / or cholesterol ester hydroperoxide, more preferably ubiquinone-10 and / or cholesterol ester hydroperoxide. .
As an active ingredient, preferably, in the formula (I), R 1 Is an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms; 2 Is a hydrogen atom, and R 3 Is an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms, a hydroxyalkyl group having 1 to 3 carbon atoms, an alkoxycarbonyl group having 2 to 5 carbon atoms, and an alkylmercapto group having 1 to 3 carbon atoms. From the group consisting of alkylamino groups having 1 to 4 carbon atoms, dialkylamino groups having 2 to 8 carbon atoms, halogen atoms, trifluoromethyl groups, carboxyl groups, cyano groups, hydroxyl groups, nitro groups, amino groups and acetamido groups It is a selected phenyl group substituted with the same or different 1 to 3 substituents.
Particularly preferably, there is provided an oxidative stress inhibitor comprising 3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
The oxidative stress inhibitor of the present invention can be preferably used as a medicament for treating and / or preventing a disease induced, progressed or exacerbated by oxidative stress. Preferably, the disease induced, progressed or exacerbated by oxidative stress is a disease associated with an increase in monounsaturated fatty acids, ubiquinone-10 or cholesterol ester hydroperoxide, more preferably ubiquinone-10 or cholesterol ester hydroperoxide. It is a disease with elevation. The oxidative stress inhibitor of the present invention can suppress oxidative stress by suppressing monounsaturated fatty acids, ubiquinone-10 or cholesterol ester hydroperoxide in plasma, preferably ubiquinone-10 or cholesterol ester hydroperoxide.
According to another aspect of the present invention, the method comprises administering a pharmaceutically effective amount of the pyrazolone derivative represented by the above formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof to a mammal including a human. A method is provided for reducing stress.
According to still another aspect of the present invention, there is provided use of the pyrazolone derivative represented by the formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof in the production of an oxidative stress inhibitor.
According to yet another aspect of the present invention, the use of a monounsaturated fatty acid, ubiquinone-10 or cholesterol ester hydroperoxide in plasma as a marker, preferably ubiquinone-10 or cholesterol ester hydroperoxide, is used to reduce oxidative stress. A measuring method is provided.
Preferably, the monounsaturated fatty acid is oleic acid (18: 1) and / or palmitooleic acid (16: 1).
Preferably, the measurement of monounsaturated fatty acids, ubiquinone-10 or cholesterol ester hydroperoxide is performed by liquid chromatography.
According to another aspect of the present invention, the content of monounsaturated fatty acid, ubiquinone-10 or cholesterol ester hydroperoxide, preferably ubiquinone-10 or cholesterol ester hydroperoxide, in the plasma of the subject is measured, and There is provided a clinical test method characterized by analyzing or evaluating the condition of a disease induced, progressed or exacerbated by oxidative stress.
According to still another aspect of the present invention, it is possible to measure the content of monounsaturated fatty acid, ubiquinone-10 or cholesterol ester hydroperoxide in the plasma of a subject administered with a drug expected to have an oxidative stress suppressing action. And a method for evaluating the effectiveness of the drug in suppressing oxidative stress.
Preferably, the drug is a pyrazolone derivative represented by the formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and more preferably, in the formula (I), R 1 Is an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms; 2 Is a hydrogen atom, and R 3 Is an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms, a hydroxyalkyl group having 1 to 3 carbon atoms, an alkoxycarbonyl group having 2 to 5 carbon atoms, and an alkylmercapto group having 1 to 3 carbon atoms From the group consisting of alkylamino groups having 1 to 4 carbon atoms, dialkylamino groups having 2 to 8 carbon atoms, halogen atoms, trifluoromethyl groups, carboxyl groups, cyano groups, hydroxyl groups, nitro groups, amino groups and acetamido groups It is a selected phenyl group substituted with the same or different 1 to 3 substituents. Particularly preferred as the pyrazolone derivative represented by the formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof is 3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
According to yet another aspect of the invention, the content of monounsaturated fatty acids, ubiquinone-10 or cholesterol ester hydroperoxide in the plasma of a patient suspected of suffering from a disease induced, advanced or exacerbated by oxidative stress Is measured, and the pathology of the disease induced, progressed or exacerbated by oxidative stress is analyzed or evaluated from the measured value, and as a result, for patients determined to be suffering from the disease induced, advanced or exacerbated by oxidative stress, And administering a pyrazolone derivative represented by the formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof. Particularly preferred as the pyrazolone derivative represented by the formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof is 3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail.
(I) Pharmaceutical of the present invention
The medicament of the present invention contains a pyrazolone derivative represented by the formula (I) defined herein or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
The compound represented by the formula (I) may also have the structure represented by the following formula (I ′) or (I ″). Therefore, the compound having the structure represented by the formula (I ′) or (I ″) is also provided by the present invention. Contained in the active ingredient.
In the formula (I), R 1 Examples of the aryl group in the definition include a phenyl group and a phenyl group substituted with a substituent such as a methyl group, a butyl group, a methoxy group, a butoxy group, a chlorine atom or a hydroxyl group.
R 1 , R 2 And R 3 Examples of the alkyl group having 1 to 5 carbon atoms in the definition include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group, a butyl group, an isobutyl group, a sec-butyl group, a tert-butyl group, and a pentyl group.
R 1 Examples of the alkoxycarbonylalkyl group having 3 to 6 carbon atoms in the definition include a methoxycarbonylmethyl group, an ethoxycarbonylmethyl group, a propoxycarbonylmethyl group, a methoxycarbonylethyl group, and a methoxycarbonylpropyl group.
R 2 Examples of the aryloxy group in the definition include a phenoxy group, a p-methylphenoxy group, a p-methoxyphenoxy group, a p-chlorophenoxy group, a p-hydroxyphenoxy group, and the like.As the arylmercapto group, Examples include a phenylmercapto group, a p-methylphenylmercapto group, a p-methoxyphenylmercapto group, a p-chlorophenylmercapto group, and a p-hydroxyphenylmercapto group.
R 2 And R 3 Examples of the hydroxyalkyl group having 1 to 3 carbon atoms in the definition include a hydroxymethyl group, a 2-hydroxyethyl group, and a 3-hydroxypropyl group. R 3 Examples of the cycloalkyl group having 5 to 7 carbon atoms in the definition include a cyclopentyl group, a cyclohexyl group, a cycloheptyl group, and the like.
R 3 In the definition, the alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms in the substituent of the phenyl group includes a methoxy group, an ethoxy group, a propoxy group, an isopropoxy group, a butoxy group, a pentyloxy group, and the like. Examples of the alkoxycarbonyl group include a methoxycarbonyl group, an ethoxycarbonyl group, a propoxycarbonyl group, and a butoxycarbonyl group.Examples of the alkylmercapto group having 1 to 3 carbon atoms include a methylmercapto group, an ethylmercapto group, and a propylmercapto group. And the like. Examples of the alkylamino group having 1 to 4 carbon atoms include a methylamino group, an ethylamino group, a propylamino group, and a butylamino group. As the dialkylamino group having 2 to 8 carbon atoms, , Dimethylamino group, diethylamino group, dipropylamino group, dibu Arylamino group, and the like.
Specific examples of the compound of the formula (I) used in the present invention include the following compounds.
3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one
3-methyl-1- (2-methylphenyl) -2-pyrazolin-5-one
3-methyl-1- (3-methylphenyl) -2-pyrazolin-5-one
3-methyl-1- (4-methylphenyl) -2-pyrazolin-5-one
3-methyl-1- (3,4-dimethylphenyl) -2-pyrazolin-5-one
1- (4-ethylphenyl) -3-methyl-2-pyrazolin-5-one
3-methyl-1- (4-propylphenyl) -2-pyrazolin-5-one
1- (4-butylphenyl) -3-methyl-2-pyrazolin-5-one
1- (3-trifluoromethylphenyl) -3-methyl-2-pyrazolin-5-one
1- (4-trifluoromethylphenyl) -3-methyl-2-pyrazolin-5-one
1- (2-methoxyphenyl) -3-methyl-2-pyrazolin-5-one
1- (3-methoxyphenyl) -3-methyl-2-pyrazolin-5-one
1- (4-methoxyphenyl) -3-methyl-2-pyrazolin-5-one
1- (3,4-dimethoxyphenyl) -3-methyl-2-pyrazolin-5-one
1- (4-ethoxyphenyl) -3-methyl-2-pyrazolin-5-one
3-methyl-1- (4-propoxyphenyl) -2-pyrazolin-5-one
1- (4-butoxyphenyl) -3-methyl-2-pyrazolin-5-one
1- (2-chlorophenyl) -3-methyl-2-pyrazolin-5-one
1- (3-chlorophenyl) -3-methyl-2-pyrazolin-5-one
1- (4-chlorophenyl) -3-methyl-2-pyrazolin-5-one
1- (3,4-dichlorophenyl) -3-methyl-2-pyrazolin-5-one
1- (4-bromophenyl) -3-methyl-2-pyrazolin-5-one
1- (4-fluorophenyl) -3-methyl-2-pyrazolin-5-one
1- (3-chloro-4-methylphenyl) -3-methyl-2-pyrazolin-5-one
1- (3-methylmercaptophenyl) -3-methyl-2-pyrazolin-5-one
1- (4-methylmercaptophenyl) -3-methyl-2-pyrazolin-5-one
4- (3-methyl-5-oxo-2-pyrazolin-1-yl) benzoic acid
1- (4-ethoxycarbonylphenyl) -3-methyl-2-pyrazolin-5-one
1- (4-nitrophenyl) -3-methyl-2-pyrazolin-5-one
3-ethyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one
1-phenyl-3-propyl-2-pyrazolin-5-one
1,3-diphenyl-2-pyrazolin-5-one
3-phenyl-1- (p-tolyl) -2-pyrazolin-5-one
1- (4-methoxyphenyl) -3-phenyl-2-pyrazolin-5-one
1- (4-chlorophenyl) -3-phenyl-2-pyrazolin-5-one
3,4-dimethyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one
4-isobutyl-3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one
4- (2-hydroxyethyl) -3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one
3-methyl-4-phenoxy-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one
3-methyl-4-phenylmercapto-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one
3,3 ', 4,5,6,7-hexahydro-2-phenyl-2H-indazol-3-one
3- (ethoxycarbonylmethyl) -1-phenyl-2-pyrazolin-5-one
1-phenyl-2-pyrazolin-5-one
3-methyl-2-pyrazolin-5-one
1,3-dimethyl-2-pyrazolin-5-one
1-ethyl-3-methyl-2-pyrazolin-5-one
1-butyl-3-methyl-2-pyrazolin-5-one
1- (2-hydroxyethyl) -3-methyl-2-pyrazolin-5-one
1-cyclohexyl-3-methyl-2-pyrazolin-5-one
1-benzyl-3-methyl-2-pyrazolin-5-one
1- (α-naphthyl) -3-methyl-2-pyrazolin-5-one
1-methyl-3-phenyl-2-pyrazolin-5-one
3-methyl-1- (4-methylphenyl) -2-pyrazolin-5-one
1- (4-butylphenyl) -3-methyl-2-pyrazolin-5-one
1- (4-methoxyphenyl) -3-methyl-2-pyrazolin-5-one
1- (4-butoxyphenyl) -3-methyl-2-pyrazolin-5-one
1- (4-chlorophenyl) -3-methyl-2-pyrazolin-5-one
1- (4-hydroxyphenyl) -3-methyl-2-pyrazolin-5-one
1- (3,4-dihydroxyphenyl) -3-methyl-2-pyrazolin-5-one
1- (2-hydroxyphenyl) -3-methyl-2-pyrazolin-5-one
1- (3-hydroxyphenyl) -3-methyl-2-pyrazolin-5-one
1- (4-hydroxyphenyl) -3-methyl-2-pyrazolin-5-one
1- (3,4-hydroxyphenyl) -3-methyl-2-pyrazolin-5-one
1- (4-hydroxyphenyl) -3-phenyl-2-pyrazolin-5-one
1- (4-hydroxymethylphenyl) -3-methyl-2-pyrazolin-5-one
1- (4-aminophenyl) -3-methyl-2-pyrazolin-5-one
1- (4-methylaminophenyl) -3-methyl-2-pyrazolin-5-one
1- (4-ethylaminophenyl) -3-methyl-2-pyrazolin-5-one
1- (4-butylaminophenyl) -3-methyl-2-pyrazolin-5-one
1- (4-dimethylaminophenyl) -3-methyl-2-pyrazolin-5-one
1- (acetamidophenyl) -3-methyl-2-pyrazolin-5-one
1- (4-cyanophenyl) -3-methyl-2-pyrazolin-5-one
As the active ingredient of the medicament of the present invention, a physiologically acceptable salt may be used in addition to the free form compound represented by the formula (I). Physiologically acceptable salts include salts with mineral acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, hydrobromide and phosphoric acid; methanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, benzenesulfonic acid, acetic acid, glycolic acid, glucuronic acid Salts with organic acids such as maleic acid, fumaric acid, oxalic acid, ascorbic acid, citric acid, salicylic acid, nicotinic acid, tartaric acid; salts with alkali metals such as sodium and potassium; alkaline earth metals such as magnesium and calcium Such as ammonia, tris (hydroxymethyl) aminomethane, N, N-bis (hydroxyethyl) piperazine, 2-amino-2-methyl-1-propanol, ethanolamine, N-methylglutamine, L-glutamine, etc. And salts with amines. Further, a salt with an amino acid such as glycine may be used.
As an active ingredient of the medicament of the present invention, a hydrate of the compound represented by the above formula (I) or a physiologically acceptable salt thereof, or a compound represented by the above formula (I) or a physiologically acceptable salt thereof Solvates of acceptable salts may be used. The type of the organic solvent that forms the solvate is not particularly limited, and examples thereof include methanol, ethanol, ether, dioxane, and tetrahydrofuran. Further, the compound represented by the above formula (I) may have one or more asymmetric carbons depending on the kind of the substituent, and may have a stereoisomer such as an optical isomer or a diastereoisomer. . As the active ingredient of the medicament of the present invention, pure forms of stereoisomers, arbitrary mixtures of stereoisomers, racemates and the like may be used.
The compound of the formula (I) used in the present invention is a known compound and is described in, for example, Japanese Patent Publication No. 5-31523 and Japanese Patent Publication No. 5-35128.
The pyrazolone derivative represented by the formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof used as an active ingredient in the present invention can suppress oxidative stress by suppressing monounsaturated fatty acid, ubiquinone-10 or cholesterol ester hydroperoxide in plasma. And can be used as a medicament for treating and / or preventing oxidative stress disease. Therefore, as the oxidative stress disease referred to in the present specification, a disease accompanied by an increase in monounsaturated fatty acid, ubiquinone-10 or cholesterol ester hydroperoxide is preferable. Specific examples of the oxidative stress disease include, but are not limited to, the following.
Ischemic diseases or various diseases based thereon, that is, various cerebral diseases such as cerebral infarction, cerebral vascular disorders such as cerebral apoplexy, cerebral dysfunction resulting from them, vascular dementia, cerebral vascular tissue lesions associated with aging, myocardium Various peripheral circulatory disorders based on myocardial ischemia such as infarction and heart failure;
Other oxidative stress diseases include alcoholic hepatitis, retinopathy, retinal iron rust, cataract, side effects due to radiation therapy, cerebral edema, endotoxin shock caused by antigen toxin, nephritis, diabetes and the like.
The dose of the compound of the formula (I) used in the present invention is generally 0.01 to 100 mg / kg-day, preferably 0.1 to 10 mg / kg-day for parenteral administration, and 1 to 200 mg / kg-day for oral administration. kg / day, preferably 5 to 20 mg / kg / day. The above dose is preferably administered 1 to 3 times a day. Further, it is more preferable that the above-mentioned dose is appropriately increased or decreased depending on age, disease state and symptoms.
As the medicament of the present invention, the compound represented by the above formula (I) or a physiologically acceptable salt thereof, or a hydrate or solvate thereof may be administered as it is. It is preferable to prepare and administer a pharmaceutical composition containing the above-mentioned substances as active ingredients and pharmacologically and pharmaceutically acceptable additives.
Pharmacologically and pharmaceutically acceptable additives include, for example, excipients, disintegrants or disintegration aids, binders, lubricants, coating agents, pigments, diluents, bases, solubilizers and the like. Dissolution aids, tonicity agents, pH adjusters, stabilizers, propellants, adhesives and the like can be used.
Pharmaceutical compositions suitable for oral administration include, as additives, excipients such as glucose, lactose, D-mannitol, starch, or crystalline cellulose; disintegrants or disintegrants such as carboxymethyl cellulose, starch, or calcium carboxymethyl cellulose. Adjuvants; binders such as hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, polyvinylpyrrolidone or gelatin; lubricants such as magnesium stearate or talc; coating agents such as hydroxypropylmethylcellulose, sucrose, polyethylene glycol or titanium oxide; Bases such as liquid paraffin, polyethylene glycol, gelatin, kaolin, glycerin, purified water, and hard fat can be used.
Pharmaceutical compositions suitable for injection or infusion include solubilizing agents or solubilizing agents which can constitute aqueous or ready-to-use injections such as distilled water for injection, physiological saline, and propylene glycol; glucose, sodium chloride, D Additives such as isotonic agents such as mannitol and glycerin; pH regulators such as inorganic acids, organic acids, inorganic bases and organic bases can be used.
The form of the medicament of the present invention is not particularly limited, and can take various forms available to those skilled in the art. As a drug suitable for oral administration, for example, tablets, powders, granules, hard gelatin capsules, suppositories, or troches can be prepared using solid pharmaceutical additives, and liquid pharmaceutical additives can be prepared. Can be used to prepare syrups, emulsions, soft gelatin capsules and the like. In addition, injections, drops, inhalants, suppositories, transdermal absorbents, transmucosal absorbents, and the like can be prepared as pharmaceuticals suitable for parenteral administration. Since a cerebral protective agent (instillation) containing the compound of the above formula (I) as an active ingredient has already been used in clinical practice (generic name: edaravone, trade name: Radicut: manufactured by Mitsubishi Pharma Corporation)・ Sales), the above-mentioned commercial preparations can be used as they are in the medicament of the present invention.
(II) Method for measuring oxidative stress according to the present invention
In the present invention, monounsaturated fatty acids such as oleic acid (18: 1) and palmitooleic acid (16: 1), ubiquinone-10 or cholesterol ester hydroperoxide, preferably ubiquinone-10 or cholesterol ester hydroperoxide are used as markers. As an (index), oxidative stress is measured. In addition, the cholesterol ester hydroperoxide referred to in this specification mainly means a peroxide of a fatty acid portion of a fatty acid ester of cholesterol. In the present invention, plasma is collected from a target organism, and monounsaturated fatty acids such as oleic acid (18: 1) and palmitooleic acid (16: 1), ubiquinone-10 or cholesterol are present in the plasma. Ester hydroperoxide is measured by various known measurement techniques.
Determination of the amount of monounsaturated fatty acids such as oleic acid (18: 1) and palmitooleic acid (16: 1), ubiquinone-10 or cholesterol ester hydroperoxide is determined by liquid chromatography such as high performance liquid chromatography (HPLC). It is preferred to do so.
The measurement of the amount of monounsaturated fatty acid, ubiquinone-10 or cholesterol ester hydroperoxide by high performance liquid chromatography can be carried out according to a conventional method. As a column, for example, in the case of measurement of monounsaturated fatty acid, an octyl column (3 μm , 3.3 cm × 4.6 mm id, Supelco) + pkb-100 column (5 μm, 25 cm × 4.6 mm id, Supelco), and the like. As the mobile phase, for example, acetonitrile / methanol / Water = 17.5 / 65.0 / 17.5 (v / v / v) can be used. The flow rate is, for example, 1.5 ml / min, and the column temperature can be set at 40 ° C. In the case of ubiquinone-10, two guard columns (Type Superguard LC-ABZ, 5 μm, 50 × 4.6 mm id, Superco) + analysis column (Type Supercosil LC-8, 5 μm, 250 μm) were used as columns. × 4.6 mm id, Supelco) + reduction column (Type RC-10-1, Irica) or the like can be used. As the mobile phase, for example, methanol / tert-butyl alcohol = 85/15 (v / v) ) (Containing 50 mM sodium perchlorate) can be used, and the flow rate can be 0.8 ml / min. Further, in the case of cholesterol ester hydroperoxide, (Type Beckman LC-8, 5 μm, 250 × 4.6 mm id) or the like can be used as an analytical column, and as a mobile phase, for example, methanol / tert-butyl Alcohol = 19/1 (v / v) can be used, and the flow rate of the mobile phase: 1.0 ml / min, the flow rate of the chemiluminescent agent: 1.5 ml / min, and high performance liquid chromatography using a chemiluminescence method. Can be measured. However, these are merely examples of high performance liquid chromatography, and those skilled in the art can appropriately set suitable conditions.
When monounsaturated fatty acids are measured in the present invention, preferably, the ratio of palmito oleic acid to total free fatty acids (% 16: 1) and the ratio of oleic acid to total free fatty acids (% 18: 1) are measured. I do.
The amounts of monounsaturated fatty acids, such as oleic acid (18: 1) and palmitooleic acid (16: 1), and ubiquinone-10 and cholesterol ester hydroperoxide obtained by the method described above are determined by the amount of active oxygen produced in the body. Or it reflects the abundance of free radicals, and thus reflects the state of oxidative stress. Therefore, the magnitude of the oxidative stress can be grasped from the magnitude of the measured value. In addition, it is possible to effectively analyze or evaluate the state of the oxidative stress disease from the measured values.
As the oxidative stress disease, a disease accompanied by an increase in monounsaturated fatty acid, ubiquinone-10 or cholesterol ester hydroperoxide, preferably ubiquinone-10 or cholesterol ester hydroperoxide is preferable, and specific examples thereof are described herein. As described above, but is not limited thereto.
In the present invention, since monounsaturated fatty acids, ubiquinone-10 and cholesterol ester hydroperoxide used as markers are present in a relatively high ratio in plasma, it is possible to utilize a HPLC technique or the like employed in ordinary clinical tests. , Can be easily implemented.
Furthermore, according to the present invention, monounsaturated fatty acids, ubiquinone-10 or cholesterol ester hydroperoxide, preferably ubiquinone-10 or cholesterol ester hydroperoxide, in the plasma of a subject to whom a drug expected to have an oxidative stress inhibitory action is administered There is provided a method for evaluating the effectiveness of an oxidative stress-suppressing action of the drug, which comprises measuring a peroxide content. Preferably, the drug is a pyrazolone derivative represented by the formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and more preferably, in the formula (I), R 1 Is an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms; 2 Is a hydrogen atom, and R 3 Is an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms, a hydroxyalkyl group having 1 to 3 carbon atoms, an alkoxycarbonyl group having 2 to 5 carbon atoms, and an alkylmercapto group having 1 to 3 carbon atoms From the group consisting of alkylamino groups having 1 to 4 carbon atoms, dialkylamino groups having 2 to 8 carbon atoms, halogen atoms, trifluoromethyl groups, carboxyl groups, cyano groups, hydroxyl groups, nitro groups, amino groups and acetamido groups It is a selected phenyl group substituted with the same or different 1 to 3 substituents. Particularly preferred as the pyrazolone derivative represented by the formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof is 3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
Further according to the present invention, monounsaturated fatty acids, ubiquinone-10 or cholesterol ester hydroperoxide, preferably ubiquinone-10 or in the plasma of a patient suspected of suffering from a disease induced, advanced or exacerbated by oxidative stress. Measure the content of cholesterol ester hydroperoxide, analyze or evaluate the condition of the disease induced, progressed or worsened by oxidative stress from the measured value, and as a result, suffer from the disease induced, progressed or worsened by oxidative stress A medicament characterized by administering the pyrazolone derivative represented by the above formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof to a patient judged to be the above. Particularly preferred as the pyrazolone derivative represented by the formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof is 3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
The present invention will be described more specifically with reference to the following examples, but the present invention is not limited to the examples.
Example
Synthesis Example: Synthesis of 3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one (hereinafter referred to as edaravone)
13.0 g of ethyl acetoacetate and 10.8 g of phenylhydrazine were added to 50 ml of ethanol, and the mixture was stirred under reflux for 3 hours. After allowing the reaction solution to cool, the precipitated crystals were collected by filtration and recrystallized from ethanol to give 11.3 g of the title compound as colorless crystals.
Yield 67%
127.5-128.5 ° C
Example 1
(Method)
1. Animal used
Fifty seven-week-old Crj: CD (SD) male rats (weight at arrival: 197.8-228.8 g, Charles River Japan Co., Ltd.) were purchased, and the general condition was observed during a quarantine acclimatization period of 5 days or more. After measuring the body weight and confirming that there was no abnormal change in the body weight, the body was subjected to a test at the age of 8 weeks. All animals were housed in a breeding room set at a temperature of 24 ± 2 ° C., 55 ± 10% humidity, 13 ventilations / hour, and 12 hours of illumination (7:00 am to 7:00 pm).
2. Composition of test group
In order to prevent variability in cerebral infarction lesion formation due to weight differences, groups were divided by stratified continuous randomization based on body weight on the day of surgery, saline administration (control group and sham operation group), and test A total of four groups of substance administration (single administration group and repeated administration group) were set.
3. Development of MCA (middle cerebral artery) occlusion reopening model
Rats were anesthetized with 3% isoflurane inhalation, fixed in a supine position, and maintained under 2% isoflurane inhalation. The catheter was placed in the femoral vein for continuous infusion in a free-moving state.
A midline cervical skin incision was made to expose the right common carotid artery, external carotid artery, and internal carotid artery, and the common carotid artery and external carotid artery were ligated with sutures (No. 5). No. 4 nylon thread (obturator), which had been coated with silicon (Xanthoprene L, Bayer Chemical) in advance and cut to a length of 19 mm, was inserted from the bifurcation of the external carotid artery and the internal carotid artery, and the MCA was closed. Two hours after MCA occlusion, the obturator was removed and the blood flow of MCA was resumed. Nerve symptoms (flexion of the forelimbs) were observed 30 minutes after MCA occlusion, and animals in which flexion of the forelimbs were not confirmed were excluded from the test. In the sham operation group, the procedure was performed up to ligation of the right common carotid artery and the external carotid artery according to the present method. A thermometer probe (PHYSITEMP INSTRUMENTS Inc. BAT-12) was inserted into the rectum to control body temperature during the operation, and the body temperature before and after the operation was recorded. When a decrease in body temperature was observed, the body temperature was maintained at around 37 ° C. using an incandescent lamp.
4. Drug administration
Immediately after the reopening of MCA occlusion, a continuous infusion of 3 mg / kg of 3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one at a volume of 1.0 mL / body / h for 30 minutes (first administration) was carried out for 6 hours. Thereafter, continuous infusion (second administration) was performed again for 30 minutes in the same volume. From the day after the surgery, 3 mg / kg of 3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one was added at 10:00 am and 16:00 pm using an infusion pump (KD SCIENTIFIC, 10 consecutive infusion pump 230) at 1.0 mL / kg. A continuous infusion of 30 minutes twice daily at a volume of body / h was performed for 13 consecutive days. The concentration of the administration solution was calculated based on the latest body weight. In the single dose group, 3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one was administered only on the first day of the operation, and the same volume of physiological saline was administered on the second and subsequent occasions. The control group and the sham operation group were administered with the same volume of physiological saline.
5. Blood collection
From the subclavian vein using a 1 mL syringe treated with heparin before MCA occlusion, after reocclusion, before the first administration on days 1, 2, 3, 5, 7, and 10 and at 10 am on day 14 About 0.3 mL of blood was collected, and centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes to separate plasma. Plasma was dispensed in 25 μL aliquots into four microtubes, frozen with liquid nitrogen, and stored frozen at about −80 ° C. until sending.
6. Separation and quantification of free fatty acids
200 μl of methanol containing 12.5 μM of margaric acid (13: 0, internal standard) was added to 50 μl of plasma, mixed well, and centrifuged (12,000 rpm, 3 minutes). After removing 50 μl of the solvent under a nitrogen stream, 50 μl of a 2 mg / ml solution of monodansyl cadaverine in dimethylformamide and 1 μl of diethyl cyanophosphate were added, and the mixture was allowed to react in the dark for 20 minutes to induce fluorescence of free fatty acids. .
5 μl of the reaction solution was injected into the high performance liquid chromatography, and the total fatty acid content and fatty acid composition were examined. The conditions of the high performance liquid chromatography are as follows.
Column: Octyl column (3 μm, 3.3 cm × 4.6 mm id, Supelco) + pkb-100 column (5 μm, 25 cm × 4.6 mm id, Supelco)
Mobile phase: acetonitrile / methanol / water = 17.5 / 65.0 / 17.5 (v / v / v)
Flow rate: 1.5 ml / min
Column temperature: 40 ° C
Excitation wavelength of fluorescence detector: 320 nm
Fluorescence detector fluorescence wavelength: 520 nm
(Results and discussion)
The results are shown in FIGS.
FIG. 1 is a graph showing the change over time in the ratio of palmitooleic acid (16: 1) in plasma. The ratio of palmito oleic acid (16: 1) to total free fatty acids is defined as% 16: 1. In FIG. 1, the percentage (%) of the change is shown on the vertical axis of the graph, and the number of days is shown on the horizontal axis of the graph, based on the value of% 16: 1 on the 0th day.
FIG. 2 is a graph showing the change over time in the ratio of oleic acid (18: 1) in plasma. The ratio of oleic acid to total free fatty acids is defined as% 18: 1. The percentage of change (%) is shown on the vertical axis of the graph, and the number of days is shown on the horizontal axis of the graph, based on the value of% 18: 1 on day 0.
In the sham-operated group rats, there was no significant change in the proportions of palmitooleic acid (16: 1) and oleic acid (18: 1). However, in the rats of the control group, the ratios of palmitooleic acid (16: 1) and oleic acid (18: 1) were significantly increased from 1 to 5 days after MCA occlusion-reopening, and oxidative stress during this period was not increased. It was suggested. On the other hand, in the group to which 3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one was administered, the ratios of palmitooleic acid (16: 1) and oleic acid (18: 1) were the same as those in the sham operation group. As shown in the figure, there was almost no change, and it was significantly suppressed as compared with the control group.
The above results indicate that 3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one effectively scavenges radicals that increase after cerebral ischemia-reopening and protects the brain by inhibiting lipid peroxidation. Suggest that.
Example 2: Separation and quantification of ubiquinone-10 (CoQ-10)
(Method)
The animals used, the composition of the test group, the preparation of the MCA occlusion reopening model, the administration of the drug, and the blood collection were performed in the same manner as in Example 1. Separation and quantification of ubiquinone-10 (CoQ-10) was performed as follows.
250 μl of cold methanol and 500 μl of cold hexane were added to 50 μl of plasma, mixed well, and then centrifuged (10,000 g, 3 minutes, 4 ° C.). 5 μl of the hexane layer (corresponding to 0.5 μl of plasma) was immediately injected into the high performance liquid chromatography, and the amount of ubiquinone-10 (CoQ-10) was determined. The conditions for high performance liquid chromatography are as follows.
Column: 2 guard columns (Type Superguard LC-ABZ, 5 μm, 50 × 4.6 mm id, Supelco) + analysis column (Type Supercosil LC-8, 5 μm, 250 × 4.6 mm id, Supelco) ) + Reduction column (Type RC-10-1, Irica)
Moving layer: methanol / tert-butyl alcohol = 85/15 (v / v) (including 50 mM sodium perchlorate)
Flow rate: 0.8 ml / min
Detection: Electrochemical detector working voltage: +600 mV
(result)
The results are shown in FIG.
FIG. 3 is a graph showing the change over time in the ratio of ubiquinone-10 in plasma. In FIG. 3, the percentage of change (%) is shown on the vertical axis of the graph, and the number of days is shown on the horizontal axis of the graph, based on the value of ubiquinone-10 on day 0.
In the sham-operated rats, there was no significant change in the ratio of ubiquinone-10. However, in the rats of the control group, the ratio of ubiquinone-10 increased after MCA occlusion-reopening, suggesting an increase in oxidative stress during this period. On the other hand, in the group to which 3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one was administered, the ratio of ubiquinone-10 hardly changed as in the sham operation group. In all cases except the sham-operated group and the repeated administration group, ubiquinone-10 was not detected in the measurement of ubiquinone-10 on the fifth day. Deleted.
Example 3 Measurement of Cholesterol Ester Hydroperoxide (CE-OOH) (Method)
Plasma was isolated from blood donated by healthy males in their forties according to the method described in Example 1. To 2 ml of the plasma, 2,2'-azobis (2,4-dimethyl-valeronitrile) (AMVN) (purchased from Wako Pure Chemical Industries) as a radical initiator was added so that the AMVN concentration became 10 mM. To the edaravone-administered group, edaravone was further added so that the edaravone concentration became 50 μM.
The reaction mixture was kept at 37 ° C., and after 4, 5 and 6 hours, the amount of cholesterol ester hydroperoxide contained in the reaction mixture was measured by high performance liquid chromatography using isoluminol chemiluminescence method. The measurement conditions are as follows.
Preparation of chemiluminescent agent
177.2 mg of isoluminol (purchased from Sigma) and 5 mg of microperoxidase (purchased from Sigma) are dissolved in a mixture of 500 ml of methanol and 500 ml of a borate buffer (pH 10) to give a chemiluminescent agent. Was prepared.
Flow velocity
Mobile phase (methanol / t-butanol = 19/1 (v / v)): 1.0 ml / min Chemiluminescent agent: 1.5 ml / min
column
Analytical column: Type Beckman LC-8, 5 μm, 250 × 4.6 mm i. d.
(result)
FIG. 4 shows the results.
FIG. 4 is a graph showing the time-dependent change in the concentration of cholesterol ester hydroperoxide contained in the reaction mixture. In FIG. 4, the cholesterol ester hydroperoxide concentration is shown on the vertical axis of the graph, and the elapsed time is shown on the horizontal axis of the graph. After 5 hours, in the group to which 3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one (drug) was added, an increase in the cholesterol ester hydroperoxide concentration was suppressed.
Industrial potential
The medicament of the present invention can be used for various oxidative stress diseases (for example, ischemic diseases or various diseases based thereon, ie, cerebrovascular disorders such as cerebral infarction and stroke, or cerebral dysfunction, vascular dementia, It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for various cerebral diseases such as cerebrovascular lesions with age, myocardial infarction, various peripheral circulatory disorders based on myocardial ischemia such as heart failure, liver disorders, diabetes and the like.
Further, the present invention provides a novel method for accurately and quantitatively measuring oxidative stress. The method of the present invention can measure blood or the like as a sample without invading tissue. Furthermore, according to the present invention, by using the content of monounsaturated fatty acid, ubiquinone-10 or cholesterol ester hydroperoxide in plasma as a marker, the oxidation of the pyrazolone derivative having a certain structure described in the present specification can be carried out. A method for evaluating the effectiveness of a stress suppressing action is provided. According to the method of the present invention, the effectiveness of the pyrazolone derivative as a drug can be accurately and simply evaluated.
All the contents described in the specifications of Japanese Patent Application Nos. 2001-275466 and 2001-275467, which are the applications on which the priority claimed by the present application is based, are incorporated herein as a part of the disclosure of the present specification. It shall be taken in by.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing the change over time in the ratio of palmitooleic acid (16: 1) in plasma.
FIG. 2 is a graph showing the change over time in the ratio of oleic acid (18: 1) in plasma.
FIG. 3 is a graph showing the change over time in the ratio of ubiquinone-10 in plasma.
FIG. 4 is a graph showing the change over time in the ratio of cholesterol ester hydroperoxide in plasma.
