JP2013121329A - Method for producing isoprenoid, isoprenoid and callus - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
Description
本発明は、イソプレノイドの製造方法の技術分野に属する。 The present invention belongs to the technical field of methods for producing isoprenoids.
天然ゴムは、トウダイグサ科のパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）や桑科植物のインドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ ｅｌａｓｔｉｃａ）などのゴム産生植物を栽培し、その植物体が有する乳管細胞で天然ゴムを生合成させ、該天然ゴムを植物から手作業により採取することにより得られる。 Natural rubber is produced by cultivating rubber-producing plants such as Hevea brasiliensis of the Euphorbiaceae and Indian rubber tree of the mulberry plant (Ficus elastica), biosynthesizes the natural rubber with milk duct cells of the plant body, and the natural rubber It is obtained by manually collecting rubber from plants.
現在、工業用ゴム製品に用いられている天然ゴムは、パラゴムノキを唯一の採取源としている。しかしながら、パラゴムノキは東南アジアや南米などの限られた地域でのみ生育可能な植物である。更に、パラゴムノキは、植樹からゴムの採取が可能な成木になるまでに７年程度を要し、また、天然ゴムを採取できる期間は２０〜３０年である。今後、開発途上国を中心に天然ゴムの需要の増大が見込まれているが、上述の理由によりパラゴムノキによる天然ゴムの大幅な増産は困難である。そのため、天然ゴム資源の枯渇が懸念されており、パラゴムノキの成木以外の安定的な天然ゴム（イソプレノイド）の供給源が望まれている。 At present, the natural rubber used in industrial rubber products has para rubber tree as its sole source. However, Para rubber tree is a plant that can grow only in limited areas such as Southeast Asia and South America. Furthermore, it takes about seven years for para rubber tree to become an adult tree from which rubber can be collected from planting, and the period during which natural rubber can be collected is 20 to 30 years. In the future, demand for natural rubber is expected to increase mainly in developing countries. However, for the reasons described above, it is difficult to significantly increase the production of natural rubber using para rubber tree. For this reason, there is a concern about the depletion of natural rubber resources, and a stable supply source of natural rubber (isoprenoid) other than adult rubber trees is desired.
本発明は、前記課題を解決し、パラゴムノキの成木に頼らない安定的なイソプレノイドの製造方法、該製造方法により得られるイソプレノイドを提供することを目的とする。また、イソプレノイドを製造可能な新規なカルス、該カルスの誘導方法、該カルスの培養方法を提供することを目的とする。 The object of the present invention is to solve the above-mentioned problems and to provide a stable method for producing isoprenoids that does not rely on adult rubber tree, and an isoprenoid obtained by the production method. It is another object of the present invention to provide a novel callus capable of producing an isoprenoid, a method for inducing the callus, and a method for culturing the callus.
従来から、完全な植物体でなくとも、カルスなどの未分化細胞を用いて、一部の二次代謝物を生合成できることは知られていた。天然ゴム（イソプレノイド）も二次代謝物ではあるが、乳管細胞という特殊な細胞により生合成されることが知られており、乳管細胞以外の細胞（例えば、カルス）では生合成できないものと考えられていた。本発明者らは、鋭意検討した結果、イソプレノイド産生植物の組織片から誘導したカルスにより、イソプレノイド（天然ゴム）を生合成できることを見出した。さらに、カルスに増産剤を適用することにより、カルスによるイソプレノイド産生能を向上させられることを見出し、本発明を完成させた。 Conventionally, it has been known that some secondary metabolites can be biosynthesized using undifferentiated cells such as callus even if they are not complete plants. Natural rubber (isoprenoid) is also a secondary metabolite, but is known to be biosynthesized by special cells called ductal cells, and cannot be biosynthesized by cells other than ductal cells (for example, callus). It was thought. As a result of intensive studies, the present inventors have found that isoprenoids (natural rubber) can be biosynthesized by callus derived from tissue pieces of isoprenoid-producing plants. Furthermore, it discovered that the isoprenoid production ability by callus could be improved by applying a production-increasing agent to callus, and completed this invention.
すなわち、本発明は、抗生物質、副腎皮質ホルモン、ステロイド系抗炎症剤、抗コレステロール剤、及び高血圧薬から選択される１種類以上の増産剤の存在条件下でイソプレノイド産生植物のカルスを培養する工程を含む、イソプレノイドの製造方法に関する。 That is, the present invention includes a step of culturing callus of an isoprenoid-producing plant under the presence of one or more kinds of production enhancers selected from antibiotics, corticosteroids, steroidal anti-inflammatory agents, anticholesterol agents, and hypertension agents. It is related with the manufacturing method of isoprenoid containing.
また、本発明は、Ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ １遺伝子によりコードされるペンタトリコペプチド含有タンパク質の機能の阻害、呼吸鎖関連酵素の機能の阻害、カリウムチャネル開口、及び電子伝達阻害から選択される活性を有する１種類以上の増産剤の存在条件下でイソプレノイド産生植物のカルスを培養する工程を含む、イソプレノイドの製造方法に関する。 In addition, the present invention provides one kind of activity selected from inhibition of the function of a pentatricopeptide-containing protein encoded by Lovastatin insensitive 1 gene, inhibition of the function of a respiratory chain-related enzyme, potassium channel opening, and inhibition of electron transfer The present invention relates to a method for producing isoprenoids, comprising a step of culturing callus of an isoprenoid-producing plant under the presence of the above-mentioned production enhancer.
また、本発明は、ＩＰＰ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ遺伝子発現量を減少させる活性、及びＨＭＧ−ＣｏＡ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子発現量を増加させる活性から選択される活性を有する１種類以上の増産剤の存在条件下でイソプレノイド産生植物のカルスを培養する工程を含む、イソプレノイドの製造方法に関する。 The present invention also provides an isoprenoid-producing plant under the presence of one or more kinds of production enhancers having an activity selected from the activity of decreasing the expression level of the IPP isomerase gene and the activity of increasing the expression level of the HMG-CoA Reductase gene. The present invention relates to a method for producing isoprenoids, comprising a step of culturing callus.
増産剤が、水又は水溶性媒体に溶解又は分散させたものであることが好ましい。 It is preferable that the production enhancer is dissolved or dispersed in water or a water-soluble medium.
イソプレノイド産生植物がパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、グアユール、及びロシアンタンポポから選択されるものであることが好ましい。 It is preferred that the isoprenoid-producing plant is one selected from Hevea brasiliensis, guayule, and Russian dandelion.
カルスの培養が、イソプレノイド産生植物の組織片を植物生長ホルモン、増産剤、及び炭素源を含む誘導培地中で培養することにより行われることが好ましい。 The callus is preferably cultured by culturing a tissue piece of an isoprenoid-producing plant in an induction medium containing a plant growth hormone, a production enhancer, and a carbon source.
イソプレノイド産生植物の組織片からカルスを誘導した後、カルスを培養することにより、カルスによりイソプレノイドを生合成することが好ましい。 It is preferable to biosynthesize isoprenoids with callus by inducing callus from tissue pieces of an isoprenoid-producing plant and then culturing the callus.
また、本発明は、抗生物質、副腎皮質ホルモン、ステロイド系抗炎症剤、抗コレステロール剤、及び高血圧薬から選択される１種類以上の増産剤の存在条件下で培養して得られる、イソプレノイド産生植物のカルスに関する。 The present invention also relates to an isoprenoid-producing plant obtained by culturing in the presence of one or more kinds of production-increasing agents selected from antibiotics, corticosteroids, steroidal anti-inflammatory agents, anticholesterol agents, and hypertension agents. About callus.
また、本発明は、Ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ １遺伝子によりコードされるペンタトリコペプチド含有タンパク質の機能の阻害、呼吸鎖関連酵素の機能の阻害、カリウムチャネル開口、及び電子伝達阻害から選択される活性を有する１種類以上の増産剤の存在条件下で培養して得られる、イソプレノイド産生植物のカルスに関する。 In addition, the present invention provides one kind of activity selected from inhibition of the function of a pentatricopeptide-containing protein encoded by Lovastatin insensitive 1 gene, inhibition of the function of a respiratory chain-related enzyme, potassium channel opening, and inhibition of electron transfer The present invention relates to a callus of an isoprenoid-producing plant, which is obtained by culturing under the presence of the above-mentioned production enhancer.
また、本発明は、ＩＰＰ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ遺伝子発現量を減少させる活性、及びＨＭＧ−ＣｏＡ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子発現量を増加させる活性から選択される活性を有する１種類以上の増産剤の存在条件下で培養して得られる、イソプレノイド産生植物のカルスに関する。 In addition, the present invention is obtained by culturing in the presence of one or more kinds of production increasing agents having an activity selected from the activity of decreasing the expression level of IPP isomerase gene and the activity of increasing the expression level of HMG-CoA Reductase gene. And isoprenoid-producing plant callus.
また、本発明は、上記の製造方法で製造されたイソプレノイドに関する。 Moreover, this invention relates to the isoprenoid manufactured with said manufacturing method.
本発明の方法により、イソプレノイド産生植物の成木に頼らず、安定的にイソプレノイドを製造することが可能となる。 By the method of the present invention, it is possible to stably produce isoprenoids without depending on the mature tree of the isoprenoid-producing plant.
本発明は、抗生物質、副腎皮質ホルモン、ステロイド系抗炎症剤、抗コレステロール剤、及び高血圧薬から選択される１種類以上の増産剤の存在条件下でイソプレノイド産生植物のカルスを培養する工程を含む、イソプレノイドの製造方法に関する。また、本発明は、Ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ １遺伝子によりコードされるペンタトリコペプチド含有タンパク質の機能の阻害、呼吸鎖関連酵素の機能の阻害、カリウムチャネル開口、及び電子伝達阻害、から選択される活性を有する１種類以上の増産剤の存在条件下でイソプレノイド産生植物のカルスを培養する工程を含む、イソプレノイドの製造方法に関する。また、本発明は、ＩＰＰ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ遺伝子発現量を減少させる活性、及びＨＭＧ−ＣｏＡ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子発現量を増加させる活性から選択される活性を有する１種類以上の増産剤の存在条件下でイソプレノイド産生植物のカルスを培養する工程を含む、イソプレノイドの製造方法に関する。 The present invention includes a step of culturing callus of an isoprenoid-producing plant in the presence of one or more production-increasing agents selected from antibiotics, corticosteroids, steroidal anti-inflammatory agents, anticholesterol agents, and hypertension agents. The present invention relates to a method for producing isoprenoids. In addition, the present invention has an activity selected from inhibition of the function of pentatricopeptide-containing protein encoded by Lovastatin insensitive 1 gene, inhibition of the function of respiratory chain-related enzyme, potassium channel opening, and inhibition of electron transfer 1 The present invention relates to a method for producing isoprenoids, comprising a step of culturing callus of an isoprenoid-producing plant under the presence of more than one kind of production enhancer. The present invention also provides an isoprenoid-producing plant under the presence of one or more kinds of production enhancers having an activity selected from the activity of decreasing the expression level of the IPP isomerase gene and the activity of increasing the expression level of the HMG-CoA Reductase gene. The present invention relates to a method for producing isoprenoids, comprising a step of culturing callus.
イソプレノイドは、イソプレン単位（Ｃ５Ｈ８）で構成された重合体の総称である。イソプレノイドとしては、例えばモノテルペン（Ｃ１０）、セスキテルペン（Ｃ１５）、ジテルペン（Ｃ２０）、セスタテルペン（Ｃ２５）、トリテルペン（Ｃ３０）、テトラテルペン（Ｃ４０）、天然ゴムなどの重合体が挙げられる。 Isoprenoid is a general term for polymers composed of isoprene units (C 5 H 8 ). Examples of isoprenoids include monoterpenes (C 10 ), sesquiterpenes (C 15 ), diterpenes (C 20 ), sesterterpenes (C 25 ), triterpenes (C 30 ), tetraterpenes (C 40 ), and heavy rubbers such as natural rubber. Coalescence is mentioned.
本発明のイソプレノイドの製造方法は、イソプレノイド産生植物の組織片からカルスを誘導し、抗生物質、副腎皮質ホルモン、ステロイド系抗炎症剤、抗コレステロール剤、及び高血圧薬から選択される１種類以上の増産剤の存在条件下、Ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ １遺伝子によりコードされるペンタトリコペプチド含有タンパク質の機能の阻害、呼吸鎖関連酵素の機能の阻害、カリウムチャネル開口、及び電子伝達阻害から選択される活性を有する１種類以上の増産剤の存在条件下、又は、ＩＰＰ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ遺伝子発現量を減少させる活性、及びＨＭＧ−ＣｏＡ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子発現量を増加させる活性から選択される活性を有する１種類以上の増産剤の存在条件下で、カルスによりイソプレノイドを生合成する製造方法である。具体的には、イソプレノイド産生植物の組織片からカルスを誘導し、前記増産剤の存在条件下でカルスを培養することにより、イソプレノイドを生合成すればよい。 The method for producing isoprenoid of the present invention induces callus from a tissue piece of an isoprenoid-producing plant, and increases one or more kinds of production selected from antibiotics, corticosteroids, steroidal anti-inflammatory agents, anticholesterol agents, and hypertension agents. One type of activity selected from the inhibition of the function of pentatricopeptide-containing protein encoded by Lovastatin insensitive 1 gene, the inhibition of the function of respiratory chain-related enzymes, the opening of potassium channels, and the inhibition of electron transport in the presence of the agent Conditions under the presence of the above-mentioned production enhancer, or conditions under the presence of one or more kinds of production enhancers having an activity selected from the activity of decreasing the expression level of IPP isomerase gene and the activity of increasing the expression level of HMG-CoA Reductase gene And isoprene by callus The de is a manufacturing method of biosynthesis. Specifically, the isoprenoid may be biosynthesized by inducing callus from a tissue piece of an isoprenoid-producing plant and culturing the callus in the presence of the above-mentioned production enhancer.
誘導したカルスをそのまま培養してイソプレノイドを製造することとしてもよいが、より多量のイソプレノイドが得られるという理由から、誘導したカルスをまず増殖させ、増殖させたカルスによりイソプレノイドを製造することが好ましい。 The induced callus may be cultured as it is to produce isoprenoid, but for the reason that a larger amount of isoprenoid can be obtained, it is preferable that the induced callus is first grown and the isoprenoid is produced from the grown callus.
具体的には、イソプレノイド産生植物の組織片を植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地中で培養することによりカルスを誘導する誘導工程と、カルスを生育培地中で培養して増殖させる増殖工程と、増殖工程により増殖させたカルスを上記増産剤を含む生産培地で培養し、カルスによりイソプレノイドを生合成する生産工程とを含む製造方法が好ましい。なお、増殖工程及び生産工程において液体培養を行う場合には、カルスの増殖が比較的速いため、増殖工程と生産工程を明確に分けずに、１つの工程でカルスを増殖させつつ、カルスによりイソプレノイドを生合成することとしてもよい。 Specifically, an induction step of inducing callus by culturing a tissue piece of an isoprenoid-producing plant in an induction medium containing a plant growth hormone and a carbon source, and a proliferation step of culturing and growing the callus in a growth medium A production method comprising culturing callus grown in the growth step in a production medium containing the above-mentioned production enhancer and biosynthesizing isoprenoids with the callus is preferable. In addition, when liquid culture is performed in the growth process and the production process, since the growth of callus is relatively fast, the callus is grown in one process without clearly dividing the growth process and the production process. May be biosynthesized.
（誘導工程）
誘導工程では、例えば、イソプレノイド産生植物の組織片を植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地中で培養することによりカルスを誘導する。
(Guidance process)
In the induction step, for example, callus is induced by culturing a tissue piece of an isoprenoid-producing plant in an induction medium containing a plant growth hormone and a carbon source.
イソプレノイド産生植物としては、イソプレノイドを産生可能な植物であれば特に限定されず、例えば、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）等のＨｅｖｅａ属；ノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ ｏｌｅｒａｃｅｕｓ）、オニノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ ａｓｐｅｒ）、ハチジョウナ（Ｓｏｎｃｈｕｓ ｂｒａｃｈｙｏｔｕｓ）等のＳｏｎｃｈｕｓ属；セイタカアワダチソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ａｌｔｉｓｓｉｍａ）、アキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ｖｉｒｇａｕｒｅａ ｓｕｂｓｐ． ａｓｉａｔｉｃａ）、ミヤマアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ｖｉｒｇａｕｒｅａ ｓｕｂｓｐ． ｌｅｉｐｃａｒｐａ）、キリガミネアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ｖｉｒｇａｕｒｅａ ｓｕｂｓｐ． ｌｅｉｐｃａｒｐａ ｆ． ｐａｌｕｄｏｓａ）、オオアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ｖｉｒｇａｕｒｅａ ｓｕｂｓｐ． ｇｉｇａｎｔｅａ）、オオアワダチソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ ｇｉｇａｎｔｅａ Ａｉｔ． ｖａｒ． ｌｅｉｏｐｈｙｌｌａ Ｆｅｒｎａｌｄ）等のＳｏｌｉｄａｇｏ属；ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）、シロタエヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｒｇｏｐｈｙｌｌｕｓ）、ヘリアンサス・アトロルベンス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｔｒｏｒｕｂｅｎｓ）、ヒメヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｄｅｂｉｌｉｓ）、コヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｄｅｃａｐｅｔａｌｕｓ）、ジャイアントサンフラワー（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）等のＨｅｌｉａｎｔｈｕｓ属；タンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ）、エゾタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｖｅｎｕｓｔｕｍ Ｈ．Ｋｏｉｄｚ）、シナノタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｈｏｎｄｏｅｎｓｅ Ｎａｋａｉ）、カントウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｐｌａｔｙｃａｒｐｕｍ Ｄａｈｌｓｔ）、カンサイタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、セイヨウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ Ｗｅｂｅｒ）等のＴａｒａｘａｃｕｍ属；イチジク（Ｆｉｃｕｓ ｃａｒｉｃａ）、インドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ ｅｌａｓｔｉｃａ）、オオイタビ（Ｆｉｃｕｓ ｐｕｍｉｌａ Ｌ．）、イヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｅｒｅｃｔａ Ｔｈｕｍｂ．）、ホソバムクイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ａｍｐｅｌａｓ Ｂｕｒｍ．ｆ．）、コウトウイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｂｅｎｇｕｅｔｅｎｓｉｓ Ｍｅｒｒ．）、ムクイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｉｒｉｓａｎａ Ｅｌｍ．）、ガジュマル（Ｆｉｃｕｓ ｍｉｃｒｏｃａｒｐａ Ｌ．ｆ．）、オオバイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ ｓｅｐｔｉｃａ Ｂｕｒｍ．ｆ．）、ベンガルボダイジュ（Ｆｉｃｕｓ ｂｅｎｇｈａｌｅｎｓｉｓ）等のＦｉｃｕｓ属；グアユール（Ｐａｒｈｅｎｉｕｍ ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ ｓｅｒｒｉｏｌａ）、ベンガルボダイジュ等が挙げられる。なかでも、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ属に属する植物であることが好ましく、なかでも、Ｈｅｖｅａ属、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｓｏｌｉｄａｇｏ属、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、Ｆｉｃｕｓ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物であることが好ましく、パラゴムノキ、ノゲシ、セイタカアワダチソウ、ヒマワリ、タンポポ、及びイチジクからなる群より選択される少なくとも１種であることがより好ましい。 The isoprenoid-producing plant is not particularly limited as long as it is a plant capable of producing an isoprenoid. For example, a Hevea genus such as Hevea brasiliensis; of Sonchus spp;. goldenrod (Solidago altissima), goldenrod (. Solidago virgaurea subsp asiatica), Miyama goldenrod (. Solidago virgaurea subsp leipcarpa), tung moth Mine goldenrod (Solidago virgaurea subsp leipcarpa .... Paludosa), giant goldenrod (Solidago virgaurea subsp gigantea), Solidago gigantea (Solidago gigantea Ait var leiophylla Fernald) Solidago genus and the like; sunflower (Helianthus annuus), Shirota et sunflower (Helianthus argophyllus), Helianthus Atororubensu (Helianthus atrorubens) Genus Helianthus, such as Helianthus debilis, Helianthus decapetalus, Giant sunflower (Helianthus giganteus), etc .; cum), Ezo dandelion (Taraxacum venustum H. Koidz), Shinano dandelion (Taraxacum hornaici Naka um), Cant dandelion, ), Indian rubber tree (Ficus elastica), Japanese persimmon (Ficus pumila L.), Inubiwa (Ficus erecta Thumb.). ), Ficus amellas Burm.f., Fencus benuetensis Merr., Ficus irisana Elm., Ficcus microcarpa f. ), A genus Ficus such as Ficus benghalensis; Parhenium argentatum, lettuce (Lactuca seriola), Bengal voyage and the like. Among them, a plant belonging to the genus Helianthus is preferable. Among them, a plant belonging to at least one genus selected from the group consisting of the genus Hevea, Sonchus, Solidago, Helianthus, Taraxacum, Ficus. It is preferable that there is at least one selected from the group consisting of Para rubber tree, Nogeshi, Solidago radish, sunflower, dandelion, and fig.
組織片としては、特に限定されないが、葉、茎、根、芽、花弁、子葉、胚軸、葯、及び種子からなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。なかでも、葉、茎がより好ましい。 The tissue piece is not particularly limited, but is preferably at least one selected from the group consisting of leaves, stems, roots, buds, petals, cotyledons, hypocotyls, cocoons, and seeds. Of these, leaves and stems are more preferable.
誘導工程では、まず、イソプレノイド産生植物の組織片の表面を洗浄する。組織片として植物の内部にある組織を利用する場合は、例えば、磨き粉で洗浄しても良いが、界面活性剤を約０．１％含む水で洗浄してもよい。葉などを利用する場合は、軟らかいスポンジで表面を洗浄することが好ましい。 In the induction step, first, the surface of the tissue piece of the isoprenoid-producing plant is washed. When using the tissue inside the plant as the tissue piece, for example, it may be washed with a sachet, but may be washed with water containing about 0.1% of a surfactant. When using leaves or the like, the surface is preferably washed with a soft sponge.
次に、組織片を殺菌又は滅菌する。殺菌又は滅菌は、周知の殺菌剤、滅菌剤を用いて行うことができるが、エタノール、塩化ベンザルコニウム、次亜塩素酸ナトリウム水溶液が好ましい。 Next, the tissue piece is sterilized or sterilized. Sterilization or sterilization can be performed using a known disinfectant or sterilant, and ethanol, benzalkonium chloride, and an aqueous sodium hypochlorite solution are preferable.
次に、殺菌又は滅菌した組織片を植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地中で培養することにより、カルスの誘導を行う。なお、誘導培地は、液体であっても固体であってもよいが、培地上に置床して培養することで、カルス化しやすいため、固体培養が好ましい。また、誘導培地が液体培地である場合には、静置培養を行ってもよく、振とう培養を行ってもよい。 Next, callus is induced by culturing the sterilized or sterilized tissue piece in an induction medium containing a plant growth hormone and a carbon source. The induction medium may be liquid or solid, but solid culture is preferable because it is easily placed on the medium and cultured for callus. In addition, when the induction medium is a liquid medium, stationary culture or shaking culture may be performed.
植物生長ホルモンとしては、例えば、オーキシン系植物ホルモン及び／又はサイトカイニン系植物ホルモンが挙げられる。 Examples of plant growth hormones include auxin plant hormones and / or cytokinin plant hormones.
オーキシン系植物ホルモンとしては、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、ナフタレン酢酸、インドール酪酸、インドール酢酸、インドールプロピオン酸、クロロフェノキシ酢酸、ナフトキシ酢酸、フェニル酢酸、２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸、パラクロロフェノキシ酢酸、２−メチル−４−クロロフェノキシ酢酸、４−フルオロフェノキシ酢酸、２−メトキシ−３，６−ジクロロ安息香酸、２−フェニル酸、ピクロラム、ピコリン酸等が挙げられる。なかでも、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、ナフタレン酢酸、インドール酪酸が好ましく、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、ナフタレン酢酸がより好ましく、ナフタレン酢酸が更に好ましい。 Auxin plant hormones include 2,4-dichlorophenoxyacetic acid, naphthalene acetic acid, indolebutyric acid, indoleacetic acid, indolepropionic acid, chlorophenoxyacetic acid, naphthoxyacetic acid, phenylacetic acid, 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid, parachloro Examples include phenoxyacetic acid, 2-methyl-4-chlorophenoxyacetic acid, 4-fluorophenoxyacetic acid, 2-methoxy-3,6-dichlorobenzoic acid, 2-phenyl acid, picloram, picolinic acid and the like. Of these, 2,4-dichlorophenoxyacetic acid, naphthalene acetic acid and indolebutyric acid are preferable, 2,4-dichlorophenoxyacetic acid and naphthalene acetic acid are more preferable, and naphthalene acetic acid is still more preferable.
サイトカイニン系植物ホルモンとしては、ベンジルアデニン、カイネチン、ゼアチン、ベンジルアミノプリン、イソペンチニルアミノプリン、チジアズロン、イソペンテニルアデニン、ゼアチンリポシド、ジヒドロゼアチン等が挙げられる。なかでも、ベンジルアデニン、カイネチン、ゼアチンが好ましく、ベンジルアデニン、カイネチンがより好ましく、ベンジルアデニンが更に好ましい。 Examples of cytokinin plant hormones include benzyladenine, kinetin, zeatin, benzylaminopurine, isopentinylaminopurine, thidiazuron, isopentenyladenine, zeatin liposide, dihydrozeatin and the like. Of these, benzyladenine, kinetin and zeatin are preferable, benzyladenine and kinetin are more preferable, and benzyladenine is more preferable.
炭素源としては、特に限定されず、スクロース、グルコース、トレハロース、フルクトース、ラクトース、ガラクトース、キシロース、アロース、タロース、グロース、アルトロース、マンノース、イドース、アラビノース、アピオース、マルトース等の糖類が挙げられる。また、エリスリトール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、ラクチトール等の糖アルコールであってもよい。なかでもスクロース、グルコースが好ましく、スクロースがより好ましい。 The carbon source is not particularly limited, and examples thereof include saccharides such as sucrose, glucose, trehalose, fructose, lactose, galactose, xylose, allose, talose, gulose, altrose, mannose, idose, arabinose, apiose and maltose. Further, sugar alcohols such as erythritol, xylitol, mannitol, sorbitol, and lactitol may be used. Of these, sucrose and glucose are preferable, and sucrose is more preferable.
誘導培地としては、Ｗｈｉｔｅの培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）、Ｈｅｌｌｅｒの培地（Ｈｅｌｌｅｒ Ｒ， Ｂｏｔ．Ｂｉｏｌ．Ｖｅｇ．Ｐａｒｉｓ １４ １−２２３（１９５３））、ＳＨ培地（ＳｃｈｅｎｋとＨｉｌｄｅｂｒａｎｄｔの培地）、ＭＳ培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅとＳｋｏｏｇの培地）（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）、ＬＳ培地（ＬｉｎｓｍａｉｅｒとＳｋｏｏｇの培地）（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）、Ｇａｍｂｏｒｇ培地、Ｂ５培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）、ＭＢ培地、ＷＰ培地（Ｗｏｏｄｙ Ｐｌａｎｔ：木本類用）等の基本培地や、該基本培地の組成に変更を加えた改変基本培地等のベースとなる培地に植物生長ホルモンを加えたものを使用すればよい。なかでも、ＭＳ培地、Ｂ５培地、ＷＰ培地に植物生長ホルモンを加えたものが好ましい。また、カルスの維持および細胞分裂の促進に適しているという理由から、オーキシン系植物ホルモン及びサイトカイニン系植物ホルモンを含むことが好ましい。 As an induction medium, White's medium (described in Plant Cell Engineering Introduction (Academic Publishing Center) p20-p36), Heller's medium (Heller R, Bot. Biol. Veg. Paris 14 1-223 (1953)), SH medium (Schenk and Hildebrandt's medium), MS medium (Murashige and Skoog's medium) (described in Plant Cell Engineering Introduction (Academic Publishing Center) p20-p36), LS Medium (Linmeier and Skoog Medium) (Introduction to Plant Cell Engineering (Academic Society) (Publishing center) p20 to p36), Gamborg medium, B5 medium (introduction to plant cell engineering (conference publication center) p20 to p36), MB medium, WP medium (Wooden Plant: for woody plants) and other basic media Or change the composition of the basic medium A medium obtained by adding a plant growth hormone to a base medium such as a modified basic medium may be used. Especially, what added plant growth hormone to MS culture medium, B5 culture medium, and WP culture medium is preferable. In addition, auxin-type plant hormones and cytokinin-type plant hormones are preferably included because they are suitable for maintaining callus and promoting cell division.
誘導培地は、ジャスモン酸、及びモノテルペン化合物からなる群より選択される少なくとも１種を含んでもよい。モノテルペン化合物としては、Ｄ−リモネン、α−ピネン、β−ピネン、ｌ−メントール、ゲラニオール、カラン、ピナン、ミルセン、オシメン、コスメン等が挙げられる。なかでも、Ｄ−リモネン、α−ピネンが好ましい。 The induction medium may contain at least one selected from the group consisting of jasmonic acid and monoterpene compounds. Examples of the monoterpene compound include D-limonene, α-pinene, β-pinene, l-menthol, geraniol, caran, pinane, myrcene, oschimen, and cosmene. Of these, D-limonene and α-pinene are preferable.
誘導培地を固体培地とする場合、固形化剤を使用して培地を固体にすればよい。固形化剤としては、特に限定されず、寒天、ゲランガム、アガロース、ゲルライト、ゼラチン、シリカゲル等が挙げられる。 When the induction medium is a solid medium, a solidifying agent may be used to make the medium solid. The solidifying agent is not particularly limited, and examples thereof include agar, gellan gum, agarose, gellite, gelatin, silica gel and the like.
好適な誘導培地の組成及び培養条件は、植物種により異なり、また培地が液体培地であるか固体培地であるかによっても異なるが、通常は以下の組成である。 The composition and culture conditions of a suitable induction medium vary depending on the plant species, and also vary depending on whether the medium is a liquid medium or a solid medium, but usually has the following composition.
誘導培地中の窒素濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上である。該窒素濃度は、好ましくは１００ｍＭ以下、より好ましくは５０ｍＭ以下である。 The nitrogen concentration in the induction medium is preferably 0 mM or more, more preferably 1 × 10 −3 mM or more. The nitrogen concentration is preferably 100 mM or less, more preferably 50 mM or less.
誘導培地中の微量無機塩類の濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上である。微量無機塩類の濃度は、好ましくは２ｍＭ以下、より好ましくは０．２３ｍＭ以下である。 The concentration of trace inorganic salts in the induction medium is preferably 0 mM or more, more preferably 1 × 10 −3 mM or more. The concentration of trace inorganic salts is preferably 2 mM or less, more preferably 0.23 mM or less.
なお、微量無機塩類とは、ホウ素、マンガン、亜鉛、銅、モリブデン、塩素、コバルト、チタン、バナジウム、アルミニウム、ケイ素等の培地に少量含有させる無機塩類を意味する。すなわち、微量無機塩類には、カルシウム、マグネシウム、カリウム等の主要無機塩類（培地に多量に含めなければ培養が成立しない無機塩類）は含まれない。上記微量無機塩類のなかでも、ホウ素、マンガン、亜鉛が好ましく、ホウ素、マンガン、亜鉛の合計濃度が上記微量無機塩類の好ましい濃度範囲内であることが好ましい。 The trace inorganic salts mean inorganic salts contained in a small amount in a medium such as boron, manganese, zinc, copper, molybdenum, chlorine, cobalt, titanium, vanadium, aluminum, and silicon. In other words, the trace inorganic salts do not include main inorganic salts such as calcium, magnesium, and potassium (inorganic salts that cannot be cultured unless contained in a large amount in the medium). Among the trace inorganic salts, boron, manganese and zinc are preferable, and the total concentration of boron, manganese and zinc is preferably within the preferable concentration range of the trace inorganic salts.
誘導培地中の炭素源の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１質量％以上である。該炭素源の濃度は、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは６質量％以下、更に好ましくは３質量％以下である。なお、本明細書において、炭素源の濃度とは、糖類の濃度を意味する。 The concentration of the carbon source in the induction medium is preferably 0.1% by mass or more, more preferably 1% by mass or more. The concentration of the carbon source is preferably 10% by mass or less, more preferably 6% by mass or less, and still more preferably 3% by mass or less. In the present specification, the concentration of the carbon source means the concentration of saccharides.
誘導培地中のカルシウムイオン濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−５ｍＭ以上、更に好ましくは０．１ｍＭ以上である。該カルシウムイオン濃度は、好ましくは１０ｍＭ以下、より好ましくは３ｍＭ以下である。 The calcium ion concentration in the induction medium is preferably 0 mM or more, more preferably 1 × 10 −5 mM or more, and further preferably 0.1 mM or more. The calcium ion concentration is preferably 10 mM or less, more preferably 3 mM or less.
誘導培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上、更に好ましくは０．２ｍｇ／ｌ以上である。該オーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは２０ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは１０ｍｇ／ｌ以下である。 The concentration of the auxin plant hormone in the induction medium is preferably 0 mg / l or more, more preferably 1 × 10 −3 mg / l or more, and still more preferably 0.2 mg / l or more. The concentration of the auxinic plant hormone is preferably 20 mg / l or less, more preferably 10 mg / l or less.
誘導培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上、更に好ましくは０．２ｍｇ／ｌ以上である。該サイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは１５ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは１０ｍｇ／ｌ以下である。 The concentration of the cytokinin plant hormone in the induction medium is preferably 0 mg / l or more, more preferably 1 × 10 −3 mg / l or more, and still more preferably 0.2 mg / l or more. The concentration of the cytokinin plant hormone is preferably 15 mg / l or less, more preferably 10 mg / l or less.
誘導培地中のジャスモン酸の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは１×１０−６質量％以上である。該ジャスモン酸の濃度は、好ましくは０．５質量％以下、より好ましくは０．３質量％以下である。 The concentration of jasmonic acid in the induction medium is preferably 0% by mass or more, more preferably 1 × 10 −6 % by mass or more. The concentration of the jasmonic acid is preferably 0.5% by mass or less, more preferably 0.3% by mass or less.
誘導培地中のモノテルペン化合物の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは１×１０−６質量％以上である。該モノテルペン化合物の濃度は、好ましくは０．５質量％以下、より好ましくは０．３質量％以下である。 The concentration of the monoterpene compound in the induction medium is preferably 0% by mass or more, more preferably 1 × 10 −6 % by mass or more. The concentration of the monoterpene compound is preferably 0.5% by mass or less, more preferably 0.3% by mass or less.
誘導培地のｐＨは、４．０〜１０．０が好ましく、５．０〜６．５がより好ましく、５．６〜５．８が更に好ましい。培養温度は、０〜４０℃が好ましく、２３〜３０℃がより好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、照度は、０〜１０００００ｌｘが好ましく、０〜０．１ｌｘがより好ましい。 The pH of the induction medium is preferably 4.0 to 10.0, more preferably 5.0 to 6.5, and still more preferably 5.6 to 5.8. The culture temperature is preferably 0 to 40 ° C, more preferably 23 to 30 ° C. Cultivation may be performed in a dark place or in a bright place, but the illuminance is preferably 0 to 100000 lx, more preferably 0 to 0.1 lx.
なお、本明細書において、固体培地のｐＨは、固形化剤を除く全成分を添加した培地のｐＨを意味する。また、本明細書において、暗所とは、照度が０〜０．１ｌｘであることを意味し、明所とは、照度が０．１ｌｘを超えていることを意味する。 In the present specification, the pH of the solid medium means the pH of the medium to which all components except the solidifying agent are added. In the present specification, the dark place means that the illuminance is 0 to 0.1 lx, and the bright place means that the illuminance exceeds 0.1 lx.
固体培地の場合、誘導培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下である。 In the case of a solid medium, the concentration of the solidifying agent in the induction medium is preferably 0.1% by mass or more, more preferably 0.2% by mass or more. The concentration of the solidifying agent is preferably 2% by mass or less, more preferably 1.1% by mass or less.
以上のように、殺菌又は滅菌した組織片を上記誘導培地中で培養することにより、カルスの誘導を行うことが可能である。なお、イソプレノイド産生植物の組織片を上記誘導培地中で培養し、上記誘導培地で継代培養を繰り返すことにより、イソプレノイド産生植物の組織片から誘導された細胞１００質量％中のカルスの割合を２０質量％以上（好ましくは６０質量％以上、より好ましくは９０質量％以上）とすることが可能となり、カルスを効率的、安定的に誘導できる。この誘導工程により誘導されたカルスは、次の増殖工程に使用される。なお、イソプレノイド産生植物（好ましくはＨｅｖｅａ属に属する植物（特に、パラゴムノキ）、Ｓｏｎｃｈｕｓ属に属する植物（特に、ノゲシ）、Ｓｏｌｉｄａｇｏ属に属する植物（特に、セイタカアワダチソウ）、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ属に属する植物（特に、ヒマワリ）、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属に属する植物（特に、タンポポ）、Ｆｉｃｕｓ属に属する植物（特に、イチジク））の組織片から誘導されたカルスは、イソプレノイドの製造に優れている。 As described above, callus can be induced by culturing a sterilized or sterilized tissue piece in the induction medium. The tissue piece of the isoprenoid-producing plant is cultured in the induction medium, and the subculture is repeated in the induction medium, whereby the ratio of callus in 100% by mass of cells derived from the tissue piece of the isoprenoid-producing plant is 20 It becomes possible to set it as mass% or more (preferably 60 mass% or more, more preferably 90 mass% or more), and callus can be induced | guided | derived efficiently and stably. The callus induced by this induction step is used for the next growth step. In addition, isoprenoid-producing plants (preferably plants belonging to the genus Hevea (especially Para rubber tree), plants belonging to the genus Sonchus (especially Nogeshi), plants belonging to the genus Solidago (especially Solidago genus), plants belonging to the genus Helianthus (particularly, Sunflowers, calligraphy derived from tissue pieces of plants belonging to the genus Taraxacum (particularly dandelion), plants belonging to the genus Ficus (particularly figs) are excellent in the production of isoprenoids.
本発明では、誘導されたカルスの遺伝子を組み替えてもよい。組み換え遺伝子の導入方法は一般的に用いられているものを、通常知られた条件で使用すればよく、例えば、プロトプラスト法、パーティクルガン法、アグロバクテリウム法（以上「生物化学実験法４１植物細胞工学入門」１９９８年９月１日、学会出版センター、第２５５頁〜３２６頁，「植物バイオテクノロジー」２００９年５月２５日、幸書房、第１３０頁〜１３６頁）などがあるが、これらに限らない。 In the present invention, the induced callus gene may be recombined. Recombinant gene introduction methods that are generally used may be used under generally known conditions. For example, the protoplast method, the particle gun method, the Agrobacterium method (hereinafter referred to as “Biochemical Experimental Method 41 Plant Cell”). "Introduction to Engineering", September 1, 1998, Academic Publishing Center, pp. 255-326, "Plant Biotechnology", May 25, 2009, Yuki Shobo, pp. 130-136). Not exclusively.
（増殖工程）
増殖工程では、例えば、誘導工程により誘導されたカルス（上述の方法等により遺伝子が組み替えられていてもよい）を生育培地中で培養して増殖させる。なお、生育培地は、液体であっても固体であってもよい。また、生育培地が液体培地である場合には、静置培養を行ってもよく、振とう培養を行ってもよい。
(Proliferation process)
In the growth step, for example, the callus induced in the induction step (the gene may be recombined by the above-described method or the like) is cultured in a growth medium to proliferate. The growth medium may be liquid or solid. When the growth medium is a liquid medium, stationary culture or shaking culture may be performed.
生育培地としては、Ｗｈｉｔｅの培地、Ｈｅｌｌｅｒの培地、ＳＨ培地（ＳｃｈｅｎｋとＨｉｌｄｅｂｒａｎｄｔの培地）、ＭＳ培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅとＳｋｏｏｇの培地）、ＬＳ培地（ＬｉｎｓｍａｉｅｒとＳｋｏｏｇの培地）、Ｇａｍｂｏｒｇ培地、Ｂ５培地、ＭＢ培地、ＷＰ培地（Ｗｏｏｄｙ Ｐｌａｎｔ：木本類用）等の基本培地や、該基本培地の組成に変更を加えた改変基本培地等のベースとなる培地に必要に応じて植物生長ホルモンを加えたものを使用すればよい。なかでも、ＭＳ培地、Ｂ５培地、ＷＰ培地に植物生長ホルモンを加えたものが好ましい。植物生長ホルモン、炭素源としては、上記誘導培地と同様のものが好適に使用できる。なお、生育培地と誘導培地の組成が同一であってもよい。また、カルスの維持および細胞分裂の促進に適しているという理由から、オーキシン系植物ホルモン及びサイトカイニン系植物ホルモンを含むことが好ましい。 Growth media include: White medium, Heller medium, SH medium (Schench and Hildebrandt medium), MS medium (Murashige and Skoog medium), LS medium (Linsmaier and Skoog medium), Gamburg medium, B5 medium, MB A culture medium, a basic medium such as a WP medium (Wood Plant: for woody plants), or a basic medium such as a modified basic medium obtained by changing the composition of the basic medium, with plant growth hormone added as necessary Can be used. Especially, what added plant growth hormone to MS culture medium, B5 culture medium, and WP culture medium is preferable. As the plant growth hormone and carbon source, those similar to the above induction medium can be preferably used. The composition of the growth medium and the induction medium may be the same. In addition, auxin-type plant hormones and cytokinin-type plant hormones are preferably included because they are suitable for maintaining callus and promoting cell division.
生育培地は、ジャスモン酸、モノテルペン化合物、及び糖アルコールからなる群より選択される少なくとも１種を含んでもよい。なかでも、糖アルコールが好ましいが必須成分ではない。 The growth medium may contain at least one selected from the group consisting of jasmonic acid, monoterpene compounds, and sugar alcohols. Of these, sugar alcohols are preferred but not essential.
モノテルペン化合物としては、Ｄ−リモネン、α−ピネンが好ましく、Ｄ−リモネンがより好ましい。 As the monoterpene compound, D-limonene and α-pinene are preferable, and D-limonene is more preferable.
糖アルコールとしては、上述のエリスリトール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、ラクチトール等が挙げられるが、なかでも、エリスリトールが好ましい。 Examples of the sugar alcohol include erythritol, xylitol, mannitol, sorbitol, lactitol and the like, and among them, erythritol is preferable.
生育培地が固体培地の場合、上記誘導培地の場合と同様に、固形化剤を使用して培地を固体にすればよい。 When the growth medium is a solid medium, the medium may be solidified using a solidifying agent as in the case of the induction medium.
好適な生育培地の組成及び培養条件は、植物種により異なり、また培地が液体培地であるか固体培地であるかによっても異なるが、通常は以下の組成である。 The composition and culture conditions of a suitable growth medium vary depending on the plant species, and also depend on whether the medium is a liquid medium or a solid medium, but usually has the following composition.
生育培地中のジャスモン酸の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは０．００１質量％以上である。該ジャスモン酸の濃度は、好ましくは１質量％以下、より好ましくは０．３質量％以下である。 The concentration of jasmonic acid in the growth medium is preferably 0% by mass or more, more preferably 0.001% by mass or more. The concentration of the jasmonic acid is preferably 1% by mass or less, more preferably 0.3% by mass or less.
生育培地中のモノテルペン化合物の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上、更に好ましくは０．０５質量％以上、特に好ましくは０．１０質量％以上である。該モノテルペン化合物の濃度は、好ましくは１質量％以下、より好ましくは０．７５質量％以下、更に好ましくは０．５０質量％以下、特に好ましくは０．３０質量％以下である。 The concentration of the monoterpene compound in the growth medium is preferably 0% by mass or more, more preferably 0.01% by mass or more, still more preferably 0.05% by mass or more, and particularly preferably 0.10% by mass or more. The concentration of the monoterpene compound is preferably 1% by mass or less, more preferably 0.75% by mass or less, still more preferably 0.50% by mass or less, and particularly preferably 0.30% by mass or less.
生育培地中の糖アルコールの濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上、更に好ましくは０．０５質量％以上、特に好ましくは０．２０質量％以上、最も好ましくは０．４０質量％以上である。該糖アルコールの濃度は、好ましくは１質量％以下、より好ましくは０．７５質量％以下、更に好ましくは０．６０質量％以下である。 The concentration of the sugar alcohol in the growth medium is preferably 0% by mass or more, more preferably 0.01% by mass or more, still more preferably 0.05% by mass or more, particularly preferably 0.20% by mass or more, and most preferably It is 0.40 mass% or more. The concentration of the sugar alcohol is preferably 1% by mass or less, more preferably 0.75% by mass or less, and still more preferably 0.60% by mass or less.
生育培地中の窒素濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上である。該窒素濃度は、好ましくは１００ｍＭ以下、より好ましくは５５ｍＭ以下である。 The nitrogen concentration in the growth medium is preferably 0 mM or more, more preferably 1 × 10 −3 mM or more. The nitrogen concentration is preferably 100 mM or less, more preferably 55 mM or less.
生育培地中の微量無機塩類の濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上である。微量無機塩類の濃度は、好ましくは２ｍＭ以下、より好ましくは０．２３ｍＭ以下である。 The concentration of trace inorganic salts in the growth medium is preferably 0 mM or more, more preferably 1 × 10 −3 mM or more. The concentration of trace inorganic salts is preferably 2 mM or less, more preferably 0.23 mM or less.
生育培地中の炭素源の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１質量％以上である。該炭素源の濃度は、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは６質量％以下、更に好ましくは４質量％以下である。生育培地が液体培地の場合には、炭素源の濃度が２〜６質量％であることが更に好ましい。 The concentration of the carbon source in the growth medium is preferably 0.1% by mass or more, more preferably 1% by mass or more. The concentration of the carbon source is preferably 10% by mass or less, more preferably 6% by mass or less, and still more preferably 4% by mass or less. When the growth medium is a liquid medium, the concentration of the carbon source is more preferably 2 to 6% by mass.
生育培地中のカルシウムイオン濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−５ｍＭ以上である。該カルシウムイオン濃度は、好ましくは１０ｍＭ以下、より好ましくは４ｍＭ以下、更に好ましくは０．５ｍＭ以下である。生育培地が液体培地の場合には、カルシウムイオン濃度が１×１０−５〜３ｍＭであることが更に好ましい。 The calcium ion concentration in the growth medium is preferably 0 mM or more, more preferably 1 × 10 −5 mM or more. The calcium ion concentration is preferably 10 mM or less, more preferably 4 mM or less, and still more preferably 0.5 mM or less. When the growth medium is a liquid medium, the calcium ion concentration is more preferably 1 × 10 −5 to 3 mM.
生育培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上、更に好ましくは０．５ｍｇ／ｌ以上である。該オーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは２０ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは６ｍｇ／ｌ以下、更に好ましくは２ｍｇ／ｌ以下、特に好ましくは１．２ｍｇ／ｌ以下である。生育培地が液体培地の場合には、オーキシン系植物ホルモンの濃度が１×１０−３〜１５ｍｇ／ｌであることが更に好ましい。 The concentration of the auxin plant hormone in the growth medium is preferably 0 mg / l or more, more preferably 1 × 10 −3 mg / l or more, and still more preferably 0.5 mg / l or more. The concentration of the auxin-based plant hormone is preferably 20 mg / l or less, more preferably 6 mg / l or less, still more preferably 2 mg / l or less, and particularly preferably 1.2 mg / l or less. When the growth medium is a liquid medium, the concentration of the auxin plant hormone is more preferably 1 × 10 −3 to 15 mg / l.
生育培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上、更に好ましくは１．５ｍｇ／ｌ以上である。該サイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは１５ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは３ｍｇ／ｌ以下、更に好ましくは２．５ｍｇ／ｌ以下である。生育培地が液体培地の場合には、サイトカイニン系植物ホルモンの濃度が１×１０−３〜１０ｍｇ／ｌであることが好ましい。 The concentration of the cytokinin plant hormone in the growth medium is preferably 0 mg / l or more, more preferably 1 × 10 −3 mg / l or more, and still more preferably 1.5 mg / l or more. The concentration of the cytokinin plant hormone is preferably 15 mg / l or less, more preferably 3 mg / l or less, and even more preferably 2.5 mg / l or less. When the growth medium is a liquid medium, the concentration of the cytokinin plant hormone is preferably 1 × 10 −3 to 10 mg / l.
生育培地のｐＨは、４．０〜１０．０が好ましく、５．０〜６．５がより好ましく、固体培地の場合には、５．６〜５．８が更に好ましく、液体培地の場合には５．６〜５．８が更に好ましい。培養温度は、０〜４０℃が好ましく、２３〜３６℃がより好ましい。なお、生育培地が液体培地の場合には、培養温度が２３〜３０℃であることが更に好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、照度は、０〜１０００００ｌｘが好ましい。なお、液体培養の場合には、暗所で培養を行うことが好ましい。 The pH of the growth medium is preferably 4.0 to 10.0, more preferably 5.0 to 6.5, in the case of a solid medium, more preferably 5.6 to 5.8, and in the case of a liquid medium. Is more preferably 5.6 to 5.8. The culture temperature is preferably 0 to 40 ° C, more preferably 23 to 36 ° C. In addition, when the growth medium is a liquid medium, the culture temperature is more preferably 23 to 30 ° C. The culture may be performed in a dark place or in a light place, but the illuminance is preferably 0 to 100000 lx. In the case of liquid culture, it is preferable to perform the culture in a dark place.
固体培地の場合、生育培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下である。 In the case of a solid medium, the concentration of the solidifying agent in the growth medium is preferably 0.1% by mass or more, more preferably 0.2% by mass or more. The concentration of the solidifying agent is preferably 2% by mass or less, more preferably 1.1% by mass or less.
以上のように、増殖工程では、カルスを上記生育培地中で培養することにより、カルスを増殖させることが可能である。なお、イソプレノイド産生植物のカルスを上記生育培地中で培養することにより、４週間当たりの質量基準のカルスの生長率を２倍以上（好ましくは２．５倍以上）とすることが可能となり、カルスを効率的、安定的に生育できる。４週間当たりの質量基準のカルスの生長率は、実施例に記載の方法により算出できる。この増殖工程により増殖させたカルスは、次の生産工程に使用される。なお、増殖工程では、カルスの増殖と共にイソプレノイドの生合成を行ってもよいし、イソプレノイドの生合成は行わずに、カルスの増殖のみを行ってもよい。これは、生育培地の組成や増殖工程の培養条件を適宜変更することにより制御可能である。 As described above, in the proliferation step, it is possible to grow the callus by culturing the callus in the growth medium. In addition, by culturing callus of an isoprenoid-producing plant in the above growth medium, it becomes possible to increase the growth rate of callus on a mass basis for 4 weeks by 2 times or more (preferably 2.5 times or more). Can grow efficiently and stably. The growth rate of callus based on mass per 4 weeks can be calculated by the method described in the examples. The callus grown in this growth process is used for the next production process. In the growth step, isoprenoid biosynthesis may be performed simultaneously with callus growth, or only callus growth may be performed without performing isoprenoid biosynthesis. This can be controlled by appropriately changing the composition of the growth medium and the culture conditions of the growth process.
（生産工程）
生産工程では、例えば、増殖工程により増殖させたカルスを上記増産剤を含む生産培地で培養し、カルスによりイソプレノイドを生合成する。なお、生産培地は、液体であっても固体であってもよい。また、生産培地が液体培地である場合には、静置培養を行ってもよく、振とう培養を行ってもよい。
(Production process)
In the production process, for example, the callus grown in the growth process is cultured in a production medium containing the above-mentioned production enhancer, and isoprenoid is biosynthesized by the callus. The production medium may be liquid or solid. In addition, when the production medium is a liquid medium, stationary culture may be performed or shaking culture may be performed.
生産培地としては、Ｗｈｉｔｅの培地、Ｈｅｌｌｅｒの培地、ＳＨ培地（ＳｃｈｅｎｋとＨｉｌｄｅｂｒａｎｄｔの培地）、ＭＳ培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅとＳｋｏｏｇの培地）、ＬＳ培地（ＬｉｎｓｍａｉｅｒとＳｋｏｏｇの培地）、Ｇａｍｂｏｒｇ培地、Ｂ５培地、ＭＢ培地、ＷＰ培地（Ｗｏｏｄｙ Ｐｌａｎｔ：木本類用）等の基本培地や、該基本培地の組成に変更を加えた改変基本培地等のベースとなる培地に必要に応じて植物生長ホルモンを加えたものを使用すればよい。なかでも、ＭＳ培地、Ｂ５培地、ＷＰ培地に植物生長ホルモンを加えたものが好ましい。植物生長ホルモン、炭素源としては、上記誘導培地と同様のものが好適に使用できる。なお、生産培地と、誘導培地及び／又は生育培地の組成が同一であってもよい。また、カルスの維持及び細胞分裂の促進に適しているという理由から、オーキシン系植物ホルモン及びサイトカイニン系植物ホルモンを含むことが好ましい。 Production media include: White medium, Heller medium, SH medium (Schench and Hildebrandt medium), MS medium (Murashige and Skoog medium), LS medium (Linsmaier and Skoog medium), Gamborg medium, B5 medium, MB A culture medium, a basic medium such as a WP medium (Wood Plant: for woody plants), or a basic medium such as a modified basic medium obtained by changing the composition of the basic medium, with plant growth hormone added as necessary Can be used. Especially, what added plant growth hormone to MS culture medium, B5 culture medium, and WP culture medium is preferable. As the plant growth hormone and carbon source, those similar to the above induction medium can be preferably used. The composition of the production medium and the induction medium and / or growth medium may be the same. In addition, auxin-type plant hormones and cytokinin-type plant hormones are preferably included because they are suitable for maintaining callus and promoting cell division.
生産培地は、イソプレノイドの生産を促すという理由から、ジャスモン酸、及びモノテルペン化合物からなる群より選択される少なくとも１種を含むことが好ましいが、これらは必須成分ではない。モノテルペン化合物を含む場合、Ｄ−リモネン、α−ピネンが好ましく、Ｄ−リモネンがより好ましい。 The production medium preferably contains at least one selected from the group consisting of jasmonic acid and monoterpene compounds because it promotes the production of isoprenoids, but these are not essential components. When a monoterpene compound is included, D-limonene and α-pinene are preferable, and D-limonene is more preferable.
生産培地が固体培地の場合、上記誘導培地の場合と同様に、固形化剤を使用して培地を固体にすればよい。 When the production medium is a solid medium, the medium may be made solid using a solidifying agent as in the case of the induction medium.
好適な生産培地の組成及び培養条件は、植物種により異なり、また培地が液体培地であるか固体培地であるかによっても異なるが、通常は以下の組成である。 The composition and culture conditions of a suitable production medium vary depending on the plant species and vary depending on whether the medium is a liquid medium or a solid medium, but usually has the following composition.
生産培地中の窒素濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上、更に好ましくは７．５ｍＭ以上である。該窒素濃度は、好ましくは１００ｍＭ以下、より好ましくは５０ｍＭ以下である。 The nitrogen concentration in the production medium is preferably 0 mM or more, more preferably 1 × 10 −3 mM or more, and further preferably 7.5 mM or more. The nitrogen concentration is preferably 100 mM or less, more preferably 50 mM or less.
生産培地中の微量無機塩類の濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−３ｍＭ以上である。微量無機塩類の濃度は、好ましくは２ｍＭ以下、より好ましくは０．２３ｍＭ以下である。 The concentration of trace inorganic salts in the production medium is preferably 0 mM or more, more preferably 1 × 10 −3 mM or more. The concentration of trace inorganic salts is preferably 2 mM or less, more preferably 0.23 mM or less.
生産培地中の炭素源の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１質量％以上である。該炭素源の濃度は、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは６質量％以下、更に好ましくは３質量％以下である。生産培地が液体培地の場合には、炭素源の濃度が２〜６質量％であることが更に好ましい。 The concentration of the carbon source in the production medium is preferably 0.1% by mass or more, more preferably 1% by mass or more. The concentration of the carbon source is preferably 10% by mass or less, more preferably 6% by mass or less, and still more preferably 3% by mass or less. When the production medium is a liquid medium, the concentration of the carbon source is more preferably 2 to 6% by mass.
生産培地中のカルシウムイオン濃度は、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１×１０−５ｍＭ以上、更に好ましくは０．５ｍＭ以上である。該カルシウムイオン濃度は、好ましくは１０ｍＭ以下、より好ましくは４ｍＭ以下である。生産培地が液体培地の場合には、カルシウムイオン濃度が１×１０−５〜３ｍＭであることが更に好ましい。 The calcium ion concentration in the production medium is preferably 0 mM or more, more preferably 1 × 10 −5 mM or more, and further preferably 0.5 mM or more. The calcium ion concentration is preferably 10 mM or less, more preferably 4 mM or less. When the production medium is a liquid medium, the calcium ion concentration is more preferably 1 × 10 −5 to 3 mM.
生産培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上である。該オーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは２０ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは６ｍｇ／ｌ以下である。生産培地が液体培地の場合には、オーキシン系植物ホルモンの濃度が１×１０−３〜１５ｍｇ／ｌであることが好ましい。 The concentration of the auxin plant hormone in the production medium is preferably 0 mg / l or more, more preferably 1 × 10 −3 mg / l or more. The concentration of the auxin plant hormone is preferably 20 mg / l or less, more preferably 6 mg / l or less. When the production medium is a liquid medium, the concentration of the auxin-based plant hormone is preferably 1 × 10 −3 to 15 mg / l.
生産培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは０ｍｇ／ｌ以上、より好ましくは１×１０−３ｍｇ／ｌ以上、更に好ましくは０．１ｍｇ／ｌ以上である。該サイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは１５ｍｇ／ｌ以下、より好ましくは３ｍｇ／ｌ以下である。生産培地が液体培地の場合には、サイトカイニン系植物ホルモンの濃度が１×１０−３〜１０ｍｇ／ｌであることが好ましい。 The concentration of the cytokinin plant hormone in the production medium is preferably 0 mg / l or more, more preferably 1 × 10 −3 mg / l or more, and still more preferably 0.1 mg / l or more. The concentration of the cytokinin plant hormone is preferably 15 mg / l or less, more preferably 3 mg / l or less. When the production medium is a liquid medium, the concentration of the cytokinin plant hormone is preferably 1 × 10 −3 to 10 mg / l.
生産培地中のジャスモン酸の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは０．００１質量％以上である。該ジャスモン酸の濃度は、好ましくは１質量％以下、より好ましくは０．３質量％以下である。 The concentration of jasmonic acid in the production medium is preferably 0% by mass or more, more preferably 0.001% by mass or more. The concentration of the jasmonic acid is preferably 1% by mass or less, more preferably 0.3% by mass or less.
生産培地中のモノテルペン化合物の濃度は、好ましくは０質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上、更に好ましくは０．０５質量％以上である。該モノテルペン化合物の濃度は、好ましくは１質量％以下、より好ましくは０．３質量％以下である。 The concentration of the monoterpene compound in the production medium is preferably 0% by mass or more, more preferably 0.01% by mass or more, and still more preferably 0.05% by mass or more. The concentration of the monoterpene compound is preferably 1% by mass or less, more preferably 0.3% by mass or less.
生産培地のｐＨは、４．０〜１０．０が好ましく、５．０〜６．５がより好ましく、固体培地の場合には５．６〜５．８が更に好ましく、液体培地の場合には５．６〜５．８が更に好ましい。培養温度は、０〜４０℃が好ましく、２３〜３６℃がより好ましい。なお、生産培地が液体培地の場合には、培養温度が２３〜３０℃であることが更に好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、照度は、０〜１０００００ｌｘが好ましく、０〜０．１ｌｘがより好ましい。なお、液体培養の場合には、暗所で培養を行うことが好ましい。 The pH of the production medium is preferably 4.0 to 10.0, more preferably 5.0 to 6.5, more preferably 5.6 to 5.8 in the case of a solid medium, and in the case of a liquid medium. 5.6 to 5.8 is more preferable. The culture temperature is preferably 0 to 40 ° C, more preferably 23 to 36 ° C. In addition, when the production medium is a liquid medium, the culture temperature is more preferably 23 to 30 ° C. Cultivation may be performed in a dark place or in a bright place, but the illuminance is preferably 0 to 100000 lx, more preferably 0 to 0.1 lx. In the case of liquid culture, it is preferable to perform the culture in a dark place.
固体培地の場合、生産培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下である。 In the case of a solid medium, the concentration of the solidifying agent in the production medium is preferably 0.1% by mass or more, more preferably 0.2% by mass or more. The concentration of the solidifying agent is preferably 2% by mass or less, more preferably 1.1% by mass or less.
（増産剤）
増産剤は、抗生物質、副腎皮質ホルモン、ステロイド系抗炎症剤、抗コレステロール剤、及び高血圧薬から選択される。
(Product increaser)
The production increasing agent is selected from antibiotics, corticosteroids, steroidal anti-inflammatory agents, anticholesterol agents, and hypertensive agents.
或いは、増産剤は、Ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ １遺伝子によりコードされるペンタトリコペプチド含有タンパク質の機能の阻害、呼吸鎖関連酵素の機能の阻害、カリウムチャネル開口、及び電子伝達阻害、から選択される活性を有する。イソプレノイドはメバロン酸経路と非メバロン酸経路の２種の経路により合成されることが一般に良く知られている。これらの経路は、ミトコンドリアにある呼吸鎖複合体の調節により制御を受けるので、前記増産剤を使用することにより、イソプレノイド産生能を向上させることができる。 Alternatively, the production-increasing agent has an activity selected from inhibition of the function of a pentatricopeptide-containing protein encoded by the Lovastatin insensitive 1 gene, inhibition of the function of a respiratory chain-related enzyme, potassium channel opening, and inhibition of electron transfer. It is generally well known that isoprenoids are synthesized by two pathways, the mevalonate pathway and the non-mevalonate pathway. Since these pathways are controlled by regulation of the respiratory chain complex in mitochondria, the ability to produce isoprenoids can be improved by using the above-mentioned production enhancer.
或いは、増産剤は、ＩＰＰ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ遺伝子発現量を減少させる活性、及びＨＭＧ−ＣｏＡ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子（以下ＨＭＧＲと略）発現量を増加させる活性、から選択される活性を有する。ＨＭＧ−ＣｏＡ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子産物はメバロン酸経路における主要酵素を制御するので、前記増産剤を使用することにより、イソプレノイド産生能を向上させることができる。 Alternatively, the production-increasing agent has an activity selected from the activity of decreasing the expression level of the IPP isomerase gene and the activity of increasing the expression level of the HMG-CoA Reductase gene (hereinafter abbreviated as HMGR). Since the HMG-CoA Reductase gene product controls the main enzyme in the mevalonate pathway, the ability to produce isoprenoids can be improved by using the above-mentioned production enhancer.
抗生物質とは、微生物が産生し、ほかの微生物の増殖を抑制する物質のことをいう。抗生物質の具体例としては、アンチマイシン、アンホテリシン、ツニカマイシン、ニスタマイシン、フォスミドマイシンが挙げられる。この中でも、呼吸鎖複合体阻害剤であるという理由でアンチマイシンが好ましい。アンチマイシンとしては、アンチマイシンＡが好ましい。アンチマイシンＡのタイプはＡ１であってもよく、Ａ３であってもよい。 Antibiotics refer to substances produced by microorganisms that inhibit the growth of other microorganisms. Specific examples of antibiotics include antimycin, amphotericin, tunicamycin, nistamycin, and fosmidomycin. Among these, antimycin is preferable because it is a respiratory chain complex inhibitor. Antimycin A is preferred as the antimycin. The type of antimycin A may be A1 or A3.
副腎皮質ホルモン、或いは／及びステロイド系抗炎症剤は、メバロン酸経路におけるＨＭＧＲ−ＣｏＡ還元酵素のはたらきを阻害するという理由で増産剤として使用される。副腎皮質ホルモン、或いは／及びステロイド系抗炎症剤としては、ハイドロコルチゾン、グルココルチコイド、フルドロコチゾン、プロドニゾロン、デキサメタゾン等が挙げられる。 Corticosteroids and / or steroidal anti-inflammatory agents are used as production enhancers because they inhibit the function of HMGR-CoA reductase in the mevalonate pathway. Examples of corticosteroids and / or steroidal anti-inflammatory agents include hydrocortisone, glucocorticoid, fludrocotisone, prodnisolone, dexamethasone and the like.
抗コレステロール剤としてはスタチン系薬剤、例えば、ロバスタチン、メバスタチン、アトルバスタチン、シンバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチンが挙げられる。 Anticholesterol agents include statin drugs such as lovastatin, mevastatin, atorvastatin, simvastatin, pitavastatin, pravastatin, fluvastatin.
高血圧薬としては、ロテニン等が挙げられる。 Examples of hypertensive drugs include rotenin.
抗真菌剤としてロダニン−３−酢酸、呼吸鎖複合体ＩおよびＩＩＩ阻害剤としてアラキドン酸、呼吸鎖ＩＶ阻害剤としてシアン酸塩、起炎物質としてカプサイシン、呼吸阻害剤としてアジ化合物（アジ化ナトリウム等）、呼吸鎖複合体Ｉ阻害剤としてアミタール、電子伝達阻害剤として硫化ナトリウム、呼吸鎖複合体ＩＩＩ阻害剤としてｎ−ヘプチルヒドロキシキノリン−Ｎ−オキシド、電子伝達阻害剤として２，３−ジメルカプトプロパノールを使用することもできる。これらは、単独で用いても、２つ以上を併用しても構わない。 Rhodanine-3-acetic acid as an antifungal agent, arachidonic acid as a respiratory chain complex I and III inhibitor, cyanate as a respiratory chain IV inhibitor, capsaicin as a flame retardant, azide compound as a respiratory inhibitor (sodium azide, etc. ), Amital as respiratory chain complex I inhibitor, sodium sulfide as electron transport inhibitor, n-heptylhydroxyquinoline-N-oxide as respiratory chain complex III inhibitor, 2,3-dimercaptopropanol as electron transport inhibitor Can also be used. These may be used alone or in combination of two or more.
増産剤は、水又は水溶性媒体に溶解又は分散させてから使用されることが好ましい。水又は水溶性媒体に溶解又は分散させることにより、増産剤を細胞に対して効果的に作用させることができる。具体的には、増産剤は、少量の水溶性媒体に溶かし、さらに水で希釈してから使用されることが好ましい。増産剤を溶解又は分散させるための水溶性媒体としては、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコール等のアルコール類、アセトン、エチルメチルケトン等のケトン類、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。 The production enhancer is preferably used after being dissolved or dispersed in water or a water-soluble medium. By dissolving or dispersing in water or a water-soluble medium, the production enhancer can effectively act on the cells. Specifically, it is preferable that the production enhancer is used after being dissolved in a small amount of a water-soluble medium and further diluted with water. Examples of the water-soluble medium for dissolving or dispersing the production enhancer include alcohols such as ethanol, methanol and isopropyl alcohol, ketones such as acetone and ethyl methyl ketone, and dimethyl sulfoxide.
水溶性媒体／（水溶性媒体＋水）の希釈率は、１／１００〜１／１０００であることが好ましく、１／２００〜１／８００であることがより好ましく、１／３５０〜１／６５０であることがさらに好ましい。これより水の量が多いと、必要な増産剤の濃度が得られない傾向がある。他方、これより水の量が少ないと、水溶性媒体が、イソプレノイドを製造する細胞に対し悪影響を及ぼす可能性がある。 The dilution ratio of water-soluble medium / (water-soluble medium + water) is preferably 1/100 to 1/1000, more preferably 1/200 to 1/800, and 1/350 to 1/650. More preferably. If the amount of water is larger than this, the necessary concentration of the production increasing agent tends not to be obtained. On the other hand, if the amount of water is less than this, the water-soluble medium may adversely affect the cells that produce the isoprenoid.
上記の生産工程において、生産培地に増産剤を添加することにより、カルスによるイソプレノイドの産生効率を向上させることができる。増産剤の存在条件は、イソプレノイドの製造効率を向上させられる条件であれば特に限定されない。生産培地中の増産剤の濃度は、０．１〜２０μｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、０．５〜１５μｍｏｌ／Ｌであることがより好ましく、１〜１０μｍｏｌ／Ｌであることがさらに好ましく、１．５〜４．５μｍｏｌ／Ｌであることがさらにより好ましい。これらの濃度にすることで、イソプレノイド合成効率を向上できると共に、不必要に高濃度としてコストを増大させてしまうことを防ぐことができる。 In the production process described above, the production efficiency of isoprenoids by callus can be improved by adding a production increasing agent to the production medium. The presence condition of the production enhancer is not particularly limited as long as the production efficiency of isoprenoid is improved. The concentration of the production enhancer in the production medium is preferably 0.1 to 20 μmol / L, more preferably 0.5 to 15 μmol / L, still more preferably 1 to 10 μmol / L. More preferably, it is 5-4.5 μmol / L. By setting these concentrations, it is possible to improve the efficiency of isoprenoid synthesis and to prevent the cost from being increased to an unnecessarily high concentration.
以上のように、増殖工程により増殖させたカルスを生産培地で培養することにより、カルスによりイソプレノイドを生合成できる。カルスにより生合成されたイソプレノイドは、細胞内に蓄積又は細胞外に放出（分泌）される。特に、生産培地（特に液体培地）の培地組成が上記好適な範囲内の場合には、カルスの細胞内にイソプレノイドが蓄積され、更に蓄積されたイソプレノイドが好適に細胞外に放出され、より好適にイソプレノイドを製造することができる。これにより、イソプレノイドの抽出が容易となるだけでなく、連続培養の可能性が広がる。 As described above, isoprenoids can be biosynthesized by callus by culturing callus grown in the growth step in a production medium. The isoprenoid biosynthesized by callus accumulates inside the cell or is released (secreted) outside the cell. In particular, when the medium composition of the production medium (particularly the liquid medium) is within the above-mentioned preferred range, isoprenoids are accumulated in the callus cells, and the accumulated isoprenoids are preferably released to the outside of the cells. Isoprenoids can be produced. This not only facilitates the extraction of isoprenoids, but also expands the possibility of continuous culture.
細胞内にイソプレノイドが蓄積している場合には、例えば、公知の方法により細胞を破砕し、破砕物からイソプレノイドを公知の方法により抽出することによりイソプレノイドが得られる。また、イソプレノイドが細胞外に放出されている場合は、例えば、培地からイソプレノイドをトルエン・ヘキサン混合溶媒により抽出することによりイソプレノイドが得られる。 When isoprenoid is accumulated in the cells, for example, the cells are disrupted by a known method, and the isoprenoid is obtained by extracting the isoprenoid from the disrupted material by a known method. When isoprenoid is released outside the cell, for example, the isoprenoid is obtained by extracting the isoprenoid from the medium with a mixed solvent of toluene and hexane.
イソプレノイド産生植物の組織片から誘導されたカルス（好ましくは増殖工程により増殖させたカルス）を上記生産培地中で培養することにより、カルスの細胞内に蓄積されているイソプレノイドの量（イソプレノイド細胞内蓄積量）を、カルス乾燥質量に対し、０．０１質量％以上とすることが可能となり、イソプレノイドを好適に製造できる。ここで、イソプレノイド細胞内蓄積量は、カルスを凍結乾燥させ、該カルスから精製回収したイソプレノイドのカルス乾燥質量に対する割合（質量％）を意味し、実施例に記載の方法により算出できる。 The amount of isoprenoid accumulated in the cells of callus (isoprenoid intracellular accumulation) by culturing callus derived from a tissue piece of an isoprenoid-producing plant (preferably a callus grown by a growth process) in the above production medium. Amount) can be 0.01% by mass or more based on the dry mass of callus, and isoprenoids can be preferably produced. Here, the amount of isoprenoid intracellular accumulation refers to the ratio (mass%) of the isoprenoid purified and recovered from the callus to the dry mass of callus, and can be calculated by the method described in the examples.
本発明の製造方法により得られるイソプレノイドは、イソプレン単位（Ｃ５Ｈ８）が直鎖状に（共）重合した構造を有するゴム（天然ゴム）である。 The isoprenoid obtained by the production method of the present invention is a rubber (natural rubber) having a structure in which isoprene units (C 5 H 8 ) are linearly (co) polymerized.
イソプレノイドの重量平均分子量（Ｍｗ）は、好ましくは１０００以上、より好ましくは１００００以上、更に好ましくは１０００００以上、特に好ましくは１００００００以上である。１０００未満では、ゴムとして利用しにくい傾向がある。また、上記重量平均分子量の上限は、特に限定されない。なお、本明細書において、重量平均分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフ（ＧＰＣ）（東ソー（株）製ＧＰＣ−８０００シリーズ等、検出器：示差屈折計、ＵＶ）による測定値をもとに標準ポリイソプレン又は標準ポリスチレン換算により求めることができる。具体的には、実施例に記載の方法により測定できる。 The weight average molecular weight (Mw) of the isoprenoid is preferably 1000 or more, more preferably 10,000 or more, still more preferably 100,000 or more, and particularly preferably 1,000,000 or more. If it is less than 1000, it tends to be difficult to use as rubber. Moreover, the upper limit of the said weight average molecular weight is not specifically limited. In the present specification, the weight average molecular weight is determined based on a measurement value by a gel permeation chromatograph (GPC) (GPC-8000 series manufactured by Tosoh Corporation, detector: differential refractometer, UV). It can be determined by isoprene or standard polystyrene conversion. Specifically, it can be measured by the method described in the examples.
イソプレノイドに含まれるイソプレンユニット中の１，４−シス構造の含有量は、好ましくは１０モル％以上、より好ましくは３０モル％以上、更に好ましくは６０モル％以上、特に好ましくは９０モル％以上である。１，４−シス構造の含有量の上限は特に限定されない。１，４−シス構造の含有量は、ＮＭＲにより測定できる。 The content of the 1,4-cis structure in the isoprene unit contained in the isoprenoid is preferably 10 mol% or more, more preferably 30 mol% or more, still more preferably 60 mol% or more, particularly preferably 90 mol% or more. is there. The upper limit of the content of the 1,4-cis structure is not particularly limited. The content of the 1,4-cis structure can be measured by NMR.
以下に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
（１）実施例で使用した化合物等について、まとめて説明する。
２，４−Ｄ：２，４−ジクロロフェノキシ酢酸
ＫＩ：カイネチン
リモネン：Ｄ−リモネン
固形化剤：寒天、アガロース、ゼラチン
パラゴムノキ：東京大学大学院農学生命科学研究科附属 科学の森教育研究センター 樹芸研究所より入手
(1) The compounds used in the examples will be described together.
2,4-D: 2,4-dichlorophenoxyacetic acid KI: kinetin limonene: D-limonene solidifying agent: agar, agarose, gelatin para rubber tree: University of Tokyo Graduate School of Agriculture and Life Science Obtain from
（２）誘導工程
パラゴムノキから茎を採取した。次に、採取した茎の表面を流水で洗浄し、さらに７０％エタノールで洗浄した後、約５〜１０％に希釈した次亜塩素酸ナトリウム溶液で滅菌し、再度流水で洗浄した。
(2) Induction process Stems were collected from Para rubber tree. Next, the surface of the collected stem was washed with running water, further washed with 70% ethanol, sterilized with a sodium hypochlorite solution diluted to about 5 to 10%, and washed again with running water.
次に、滅菌した茎の組織を誘導培地（固体培地）に差込み、培養を行った（誘導工程）。誘導培地は、ＭＳ培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）を基に、炭素源として糖類を３質量％含み、更にオーキシン系植物ホルモン及びサイトカイニン系植物ホルモンを添加し、固形化剤の濃度を１．１質量％とした。また、オートクレーブ（１２１℃、２０分）前に、培地のｐＨを５．７〜５．８に調整した。 Next, the sterilized stem tissue was inserted into an induction medium (solid medium) and cultured (induction process). The induction medium is based on MS medium (described in Plant Cell Engineering Introduction (Academic Publishing Center) p20-p36), containing 3% by mass of saccharides as a carbon source, and further adding auxin-type plant hormone and cytokinin-type plant hormone, The concentration of the solidifying agent was 1.1% by mass. Further, the pH of the medium was adjusted to 5.7 to 5.8 before autoclaving (121 ° C., 20 minutes).
オーキシン系植物ホルモンとして、２，４−Ｄと、サイトカイニン系植物ホルモンとしてカイネチンを組み合わせて、暗所（０〜０．１ｌｘ）で約１ヶ月培養し、パラゴムノキの組織片からカルス（未分化細胞）を誘導した。誘導培地の組成を表１に示す。 2.4-D as an auxin-type plant hormone and kinetin as a cytokinin-type plant hormone are combined and cultured in the dark (0 to 0.1 lx) for about 1 month, and callus (undifferentiated cells) from a tissue piece of Para rubber tree Induced. The composition of the induction medium is shown in Table 1.
上記誘導培地で継代培養を繰り返した後（合計培養日数：９０日）、目視によりカルスの誘導を確認し、誘導されたカルスの直径が３ｍｍ以上のものをカルスの誘導有りと判断した。試験を１８回実施し、その平均を総合して評価結果とした。その結果、表１に示した誘導培地では、イソプレノイド産生植物の組織片から誘導された細胞１００質量％中のカルスの割合（誘導効率）が９０質量％以上であり、ほぼカルスのみが誘導された。 After repeated subculture in the induction medium (total number of culture days: 90 days), the induction of callus was confirmed by visual observation, and a callus having an induced callus diameter of 3 mm or more was judged to have callus induction. The test was carried out 18 times, and the average of the tests was taken as the evaluation result. As a result, in the induction medium shown in Table 1, the ratio of callus (induction efficiency) in 100% by mass of cells derived from the tissue pieces of the isoprenoid-producing plant was 90% by mass or more, and almost only callus was induced. .
（３）増殖工程
表１の誘導培地により誘導されたカルスを、約１ヶ月ごとに生育培地（固体培地）で継代培養してカルスを増殖させた。
(3) Proliferation process The callus induced by the induction medium in Table 1 was subcultured in a growth medium (solid medium) about every month to propagate the callus.
生育培地は、ＭＳ培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）を基に、炭素源として糖類を２〜６質量％含み、更にオーキシン系植物ホルモン及びサイトカイニン系植物ホルモンを添加し、固形化剤の濃度を０．２〜１．１質量％とした。また、オートクレーブ（１２１℃、２０分）前に、培地のｐＨを５．７〜５．８に調整した。 The growth medium is based on MS medium (described in Plant Cell Engineering Introduction (Academic Publishing Center) p20-p36), contains 2-6% by mass of saccharides as a carbon source, and further contains auxin-type plant hormones and cytokinin-type plant hormones The concentration of the solidifying agent was 0.2 to 1.1% by mass. Further, the pH of the medium was adjusted to 5.7 to 5.8 before autoclaving (121 ° C., 20 minutes).
オーキシン系植物ホルモンとして２，４−Ｄと、サイトカイニン系植物ホルモンとしてカイネチンとを組み合わせて、暗所（０〜０．１ｌｘ）で培養し、カルスの生育を促した。生育培地の組成を表２に示す。 A combination of 2,4-D as an auxin-type plant hormone and kinetin as a cytokinin-type plant hormone was cultured in the dark (0 to 0.1 lx) to promote the growth of callus. The composition of the growth medium is shown in Table 2.
この増殖工程において、カルスの生長率を算出した。カルスの生長率は、培養初期のカルス仕込み量（質量）と継代時（本例では、培養２８日間（４週間）終了時）に測定したカルス質量の比率（継代時に測定したカルス質量／培養初期のカルス仕込み量）から算出した。その結果、培養２８日間でのカルスの生長率は４．２であった。 In this growth process, the growth rate of callus was calculated. The growth rate of callus is the ratio of callus charge (mass) at the initial stage of culture and the mass of callus measured at the time of passage (in this example, at the end of 28 days of culture (4 weeks)). It was calculated from the amount of callus charged at the initial stage of culture). As a result, the growth rate of callus after 28 days of culture was 4.2.
（４）増産剤の調製
抗真菌性抗生物質であり、Ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ １遺伝子によりコードされるペンタトリコペプチド含有タンパク質の機能の阻害作用のあるアンチマイシンＡ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．製、有効成分９０％以上）１０ｍｇをエタノール１８．２ｃｃに溶解し１ｍｍｏｌ／Ｌとした。更に、これを水で１００倍〜１０００倍に適宜希釈し、全培地容量に対して、１μｍｏｌ／Ｌ(実施例１及び実施例４)、２μｍｏｌ／Ｌ(実施例２及び実施例５)、１０μｍｏｌ／Ｌ(実施例３及び実施例６)、となる様に添加した。
(4) Preparation of a production enhancer Antimycin A (manufactured by Santa Cruz Biotechnology Inc., active ingredient 90%, which is an antifungal antibiotic and has an inhibitory function on the function of pentatricopeptide-containing protein encoded by Lovastatin insensitive 1 gene) Above) 10 mg was dissolved in 18.2 cc of ethanol to make 1 mmol / L. Further, this was appropriately diluted 100 to 1000 times with water, and 1 μmol / L (Examples 1 and 4), 2 μmol / L (Examples 2 and 5), 10 μmol with respect to the total medium volume. / L (Example 3 and Example 6).
（５）生産工程
増殖させたカルスを生産培地（固体培地）で培養して、イソプレノイドの生産を行った。
(5) Production process The grown callus was cultured in a production medium (solid medium) to produce isoprenoids.
生産培地は、ＭＳ培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）を基に、炭素源として糖類を２〜６質量％含み、更にオーキシン系植物ホルモン及びサイトカイニン系植物ホルモンを添加し、固形化剤の濃度を０．２〜１．１質量％とした。また、オートクレーブ（１２１℃、２０分）前に、培地のｐＨを５．７〜５．８に調整した。 The production medium is based on MS medium (described in Plant Cell Engineering Introduction (Academic Publishing Center) p20-p36), contains 2-6% by mass of saccharides as a carbon source, and additionally contains auxin-type plant hormones and cytokinin-type plant hormones The concentration of the solidifying agent was 0.2 to 1.1% by mass. Further, the pH of the medium was adjusted to 5.7 to 5.8 before autoclaving (121 ° C., 20 minutes).
オーキシン系植物ホルモンとして、２，４−Ｄと、サイトカイニン系植物ホルモンとしてカイネチンとを組み合わせて、暗所（０〜０．１ｌｘ）で培養し、イソプレノイドの生産を促した。カルスの培養は３０日間行った。増産剤として、上記（４）で調製した増産剤を生産培地に添加した。生産培地の組成を表３に示す。 A combination of 2,4-D as an auxin-type plant hormone and kinetin as a cytokinin-type plant hormone was cultured in the dark (0 to 0.1 lx) to promote production of isoprenoids. The callus was cultured for 30 days. As a production enhancer, the production enhancer prepared in (4) above was added to the production medium. The composition of the production medium is shown in Table 3.
（６）ＩＰＰ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ遺伝子、及びＨＭＧ−ＣｏＡ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子に対する増産剤の効果
ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）により、比較例１、及び実施例１の培地で生育させたカルスにおける、ＩＰＰ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ遺伝子発現量、及びＨＭＧ−ＣｏＡ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子発現量に対する増産剤の効果を測定した。
(6) Effect of a production-increasing agent on IPP isomerase gene and HMG-CoA reductase gene IPP isomerase gene in callus grown in the culture medium of comparative example 1 and example 1 by RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) The effect of the production-increasing agent on the expression level and the expression level of the HMG-CoA Reductase gene was measured.
カルスからＲＮＡを抽出し、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅにより逆転写反応を行った。得られたｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＩＰＰ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ遺伝子発現量の測定のためのＰＣＲは、以下のプライマーセット：ＨｂＩＰＩ−Ｆ１：ＡＣＣＡＧＡＣＴＣＴＣＧＴＣＣＴＣＧＣＴ、及びＨｂＩＰＩ−Ｒ１：ＧＣＴＡＣＡＧＧＴＧＡＴＧＣＣＡＣＡＡＴを使用し、９４℃で１分の後、９４℃で１５秒、６３℃で１５秒、及び７２℃で１分を１サイクルとして３０サイクル繰り返し、４℃で保温する条件により行った。ＨＭＧ−ＣｏＡ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子発現量の測定のためのＰＣＲは、以下のプライマーセット：ＨｂＨＭＧＲ−Ｆ１：ＣＣＡＣＴＣＣＧＡＡＡＧＣＧＴＣＧＧＡＣ、及びＨｂＨＭＧＲ−Ｒ１：ＣＣＡＴＴＧＣＡＴＣＧＣＣＡＧＴＧＣＴＧを使用し、９４℃で２分の後、９８℃で１５秒、及び６８℃で１分を１サイクルとして３０サイクル繰り返し、４℃で保温する条件により行った。 RNA was extracted from the callus and reverse transcription reaction was performed with RiverTra Ace. PCR was performed using the obtained cDNA as a template. PCR for the measurement of the expression level of the IPP isomerase gene was carried out using the following primer sets: HbIPI-F1: ACCAGACTCTCGTCCTCGCT and HbIPI-R1: GCTACAGGTGATGGCCACAAT. After 94 ° C for 1 minute, 94 ° C for 15 seconds, 63 ° C For 15 seconds at 72 ° C. and 1 minute at 72 ° C. for 30 cycles. PCR for the measurement of the expression level of HMG-CoA Reductase gene was carried out using the following primer sets: HbHMGR-F1: CCACTCCGAAAGCGTCGGAC, and HbHMGR-R1: CCATTGCATCATGCCCAGTCTGTG for 2 seconds at 94 ° C. and 15 seconds at 98 ° C. And it was performed under the condition of keeping 30 minutes by repeating 1 cycle at 68 ° C. for 1 cycle.
ＲＴ−ＰＣＲ産物の電気泳動結果を図１に示す。この結果から、アンチマイシンＡが、ＩＰＰ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ遺伝子発現量を減少させ、またＨＭＧ−ＣｏＡ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子発現量を増加させることがわかる。 The electrophoresis result of the RT-PCR product is shown in FIG. From this result, it can be seen that antimycin A decreases the expression level of the IPP isomerase gene and increases the expression level of the HMG-CoA Reducease gene.
（７）イソプレノイドの精製回収
培養後のカルス約７０ｇを生産培地より回収し、液体窒素で凍結させた後、凍結乾燥させて、カルス中の水分を除去した。次いで、水分を除去したカルスを乳鉢で粉砕した後、ソックスレー抽出装置を用いて有機溶媒によりイソプレノイドの抽出を行った。まず、９９％メタノールで抽出を行い、不要な代謝物を除去した。その後９９％トルエンでさらに抽出することで、イソプレノイドを精製回収した。
(7) Purification and recovery of isoprenoids About 70 g of callus after culture was collected from the production medium, frozen in liquid nitrogen, and then freeze-dried to remove moisture in the callus. Next, after the callus from which moisture had been removed was pulverized in a mortar, the isoprenoid was extracted with an organic solvent using a Soxhlet extraction apparatus. First, extraction was performed with 99% methanol to remove unnecessary metabolites. Thereafter, the isoprenoid was purified and recovered by further extraction with 99% toluene.
生産工程により製造されたイソプレノイドの量（カルスの細胞内に蓄積されているイソプレノイドの量（イソプレノイド細胞内蓄積量））を算出した。イソプレノイド細胞内蓄積量は、凍結乾燥させたのちのカルス乾燥質量に対し、該カルスから精製回収したイソプレノイドの割合（質量％）により算出した。実施例１〜３におけるイソプレノイド細胞内蓄積量を、比較例１での細胞内蓄積量を１００とした指数に換算した。その結果を表４に示す。また、実施例４〜６におけるイソプレノイド細胞内蓄積量を、比較例２での細胞内蓄積量を１００とした指数に換算した。その結果を表５に示す。 The amount of isoprenoid produced by the production process (the amount of isoprenoid accumulated in callus cells (the amount of isoprenoid intracellular accumulation)) was calculated. The amount of isoprenoid intracellular accumulation was calculated by the ratio (mass%) of isoprenoid purified and recovered from the callus with respect to the dry mass of callus after lyophilization. The amount of isoprenoid intracellular accumulation in Examples 1 to 3 was converted to an index with the amount of intracellular accumulation in Comparative Example 1 as 100. The results are shown in Table 4. Moreover, the isoprenoid intracellular accumulation amount in Examples 4 to 6 was converted into an index with the intracellular accumulation amount in Comparative Example 2 as 100. The results are shown in Table 5.
重量平均分子量（Ｍｗ）は、下記１．〜７．の条件で、ゲルパーミエーションクロマトグラフ（ＧＰＣ）法により測定した。
１．装置：東ソー社製ＨＬＣ−８０２０
２．分離カラム：東ソー社製ＧＭＨ−ＸＬ
３．測定温度：４０℃
４．キャリア：テトラヒドロフラン
５．流量：０．６ｍＬ／分
６．検出器：示差屈折、ＵＶ
７．分子量標準：標準ポリスチレン
結果を表４及び表５に示す。
The weight average molecular weight (Mw) is as follows. ~ 7. The gel permeation chromatograph (GPC) method was used.
1. Apparatus: HLC-8020 manufactured by Tosoh Corporation
2. Separation column: GMH-XL manufactured by Tosoh Corporation
3. Measurement temperature: 40 ° C
4). Carrier: tetrahydrofuran5. Flow rate: 0.6 mL / min Detector: differential refraction, UV
7). Molecular weight standards: Standard polystyrene results are shown in Tables 4 and 5.
表４及び表５の結果より、パラゴムノキのカルスの培養系に増産剤を添加することにより、製造効率を大幅に向上させられることを確認できた。本発明の方法で製造されたイソプレノイドの重量平均分子量は、１，０００，０００以上であり、上記増産剤を用いることにより分子量を増大できることが確認できた。 From the results of Tables 4 and 5, it was confirmed that the production efficiency can be greatly improved by adding a production-increasing agent to the culture system of Para rubber tree calli. The weight average molecular weight of the isoprenoid produced by the method of the present invention is 1,000,000 or more, and it was confirmed that the molecular weight can be increased by using the above-mentioned production enhancer.
Claims (11)
１種類以上の増産剤の存在条件下でイソプレノイド産生植物のカルスを培養する工程を含む、イソプレノイドの製造方法。 Production of isoprenoids comprising the step of culturing callus of an isoprenoid-producing plant in the presence of one or more kinds of production-increasing agents selected from antibiotics, corticosteroids, steroidal anti-inflammatory agents, anticholesterol agents, and hypertension agents Method.
１種類以上の増産剤の存在条件下でイソプレノイド産生植物のカルスを培養する工程を含む、イソプレノイドの製造方法。 Existence of one or more kinds of production enhancers having an activity selected from inhibition of the function of pentatricopeptide-containing protein encoded by Lovastatin insensitive 1 gene, inhibition of the function of respiratory chain-related enzyme, potassium channel opening, and inhibition of electron transfer A method for producing an isoprenoid, comprising a step of culturing callus of an isoprenoid-producing plant under conditions.
１種類以上の増産剤の存在条件下でイソプレノイド産生植物のカルスを培養する工程を含む、イソプレノイドの製造方法。 A step of culturing callus of an isoprenoid-producing plant in the presence of one or more kinds of production enhancers having an activity selected from the activity of decreasing the expression level of IPP isomerase gene and the activity of increasing the expression level of HMG-CoA Reductase gene A method for producing isoprenoids, comprising:
１種類以上の増産剤の存在条件下で培養して得られる、イソプレノイド産生植物のカルス。 Callus of an isoprenoid-producing plant obtained by culturing in the presence of one or more kinds of production-increasing agents selected from antibiotics, corticosteroids, steroidal anti-inflammatory agents, anticholesterol agents, and hypertension agents.
１種類以上の増産剤の存在条件下で培養して得られる、イソプレノイド産生植物のカルス。 Existence of one or more kinds of production enhancers having an activity selected from inhibition of the function of pentatricopeptide-containing protein encoded by Lovastatin insensitive 1 gene, inhibition of the function of respiratory chain-related enzyme, potassium channel opening, and inhibition of electron transfer Callus of an isoprenoid-producing plant obtained by culturing under conditions.
１種類以上の増産剤の存在条件下で培養して得られる、イソプレノイド産生植物のカルス。 An isoprenoid-producing plant obtained by culturing in the presence of one or more kinds of production-increasing agents having an activity selected from the activity of decreasing the expression level of IPP isomerase gene and the activity of increasing the expression level of HMG-CoA Reductase gene Callus.
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