JP2013092436A

JP2013092436A - Method of measuring solid nmr

Info

Publication number: JP2013092436A
Application number: JP2011234407A
Authority: JP
Inventors: Takayuki Nemoto; 隆之根本; Mamiko Nasu; 麻実子那須
Original assignee: Astellas Pharma Inc
Current assignee: Astellas Pharma Inc
Priority date: 2011-10-25
Filing date: 2011-10-25
Publication date: 2013-05-16

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method of measuring solid NMR.SOLUTION: An NMR spectrum of a solid sample is measured by performing spin locking by irradiating a sample with a radio wave from a direction in which magnetism falls after causing the magnetism to fall by applying 90° pulses to the sample forH, and observing the magnetism ofH or observing the magnetism after moving the magnetism ofH to another isotope. In the present invention, a mixture including a plurality of solid molecular species is used as the sample, and signals caused by molecular species which do not desired to be observed are removed or attenuated.

Description

本発明は、固体ＮＭＲの測定方法に関する。 The present invention relates to a method for measuring solid-state NMR.

複数の化合物の混合物について、成分ごとのＮＭＲスペクトルを選択的に取得する手法が知られている。
溶液ＮＭＲについては、例えば、ＤＯＳＹ法（Diffusion Ordered Spectroscopy Method）が知られている（E. O. Stejskal, J. E. Tanner, Journal of Chemical Physics, vol. 42, No.1, p.288-292 (1965)）。ＤＯＳＹ法では、各成分が固有の自己拡散係数（分子の拡散的な運動性）を有することを利用し、成分ごとの自己拡散係数の違いを利用して成分ごとのＮＭＲスペクトルを得る。通常、混合物のＮＭＲスペクトルは、各成分のスペクトルの和として観測されるが、その混合物のＮＭＲスペクトルを分子の拡散係数を利用して逆ラプラス変換（ＩＬＴ：Inverse Laplace Transform）により分離すると、分子種ごとのＮＭＲスペクトルを得ることが可能になる。通常のＤＯＳＹ法は、自己拡散係数に対して化学シフトを２次元に展開する手法であるため、定量分析は困難であり、基本的に定性分析のみに適用される。また、ＤＯＳＹ法における測定時間の短縮を目的とした1次元のＤＯＳＹ法についても報告されているが、この手法は、分子の拡散係数の測定時間の短縮化を目的としたものであるため、複数の化合物の混合物について、各成分のスペクトルを得るためものではない（N. M. Loening, J. Keeler, G. A. Morris, Journal of Magnetic Resonance, vol. 153, p.103-112 (2001)）。 A technique for selectively acquiring an NMR spectrum for each component of a mixture of a plurality of compounds is known.
Regarding solution NMR, for example, the DOSY method (Diffusion Ordered Spectroscopy Method) is known (EO Stejskal, JE Tanner, Journal of Chemical Physics, vol. 42, No. 1, p. 288-292 (1965)). In the DOSY method, each component has a unique self-diffusion coefficient (molecular diffusive mobility), and an NMR spectrum for each component is obtained using a difference in self-diffusion coefficient for each component. Usually, the NMR spectrum of a mixture is observed as the sum of the spectra of each component. When the NMR spectrum of the mixture is separated by inverse Laplace Transform (ILT) using the diffusion coefficient of the molecule, Each NMR spectrum can be obtained. Since the normal DOSY method is a technique for developing a chemical shift two-dimensionally with respect to the self-diffusion coefficient, quantitative analysis is difficult and is basically applied only to qualitative analysis. A one-dimensional DOSY method aimed at shortening the measurement time in the DOSY method has also been reported. However, since this method aims at shortening the measurement time of the molecular diffusion coefficient, It is not intended to obtain a spectrum of each component of a mixture of the above compounds (NM Loening, J. Keeler, GA Morris, Journal of Magnetic Resonance, vol. 153, p. 103-112 (2001)).

一方、固体ＮＭＲについては、例えば、ＤＥＣＲＡ法（Direct Exponential Curve Resolution Algorithm）（非特許文献１）やＲＯＳＹ法（Relaxation Ordered Spectroscopy）（非特許文献２）が知られている。 On the other hand, as for solid-state NMR, for example, a DECRA method (Direct Exponential Curve Resolution Algorithm) (Non-Patent Document 1) and a ROSY method (Relaxation Ordered Spectroscopy) (Non-Patent Document 2) are known.

ＤＥＣＲＡ法は基本的に１次元ＮＭＲに適用される手法であり、分子種ごとの^１Ｈの縦緩和時間（ＨＴ_１）の違いを利用して、線形解析によって分子種ごとのＮＭＲスペクトルを得る。ＤＥＣＲＡ法は、定性分析だけでなく、定量分析にも適用可能であるが、データ取得に莫大な時間がかかる。 The DECRA method is basically a technique applied to one-dimensional NMR, and an NMR spectrum for each molecular species is obtained by linear analysis using a difference in ¹ H longitudinal relaxation time (HT ₁ ) for each molecular species. The DECRA method can be applied not only to qualitative analysis but also to quantitative analysis, but it takes enormous time to acquire data.

ＲＯＳＹ法は、ＤＥＣＲＡ法と同様に、分子種ごとの^１Ｈの縦緩和時間（ＨＴ_１）の違いを利用して、逆ラプラス変換によりシグナルを分離し、分子種ごとのＮＭＲスペクトルを得る手法である。この手法は、^１Ｈの縦緩和時間（ＨＴ_１）に対して化学シフトを２次元に展開する手法であるため、定量分析に適用することは難しく、基本的に定性分析に用いられる。特許文献１には、混合物の固体試料についてのＲＯＳＹ法によるＮＭＲ測定法が記載されている。特許文献１の方法では、均一な縦磁化緩和時間を有している核に縦磁化緩和を起こさせるパルスを照射する第１の工程、所定時間ｔを置いて前記均一な縦磁化緩和時間を有している核のスピン拡散を切断して高分解能ＮＭＲスペクトルを測定する第２の工程、ｔを変えて第１の工程と第２の工程を繰り返して複数の高分解能ＮＭＲスペクトルを取得する第３の工程、第３の工程により得られた複数の高分解能ＮＭＲスペクトルを縦磁化緩和時間に依存して回復するＮＭＲ信号強度の回復速度の違いに基づいて逆ラプラス変換法により縦磁化緩和時間の値ごとに分類する第４の工程を備える。 The ROSY method is similar to the DECRA method in that it uses the difference in ¹ H longitudinal relaxation time (HT ₁ ) for each molecular species to separate signals by inverse Laplace transform and obtain an NMR spectrum for each molecular species. is there. This method is a method of developing a chemical shift two-dimensionally with respect to the longitudinal relaxation time (HT ₁ ) of ¹ H, so that it is difficult to apply to quantitative analysis and is basically used for qualitative analysis. Patent Document 1 describes an NMR measurement method using a ROSY method for a solid sample of a mixture. In the method of Patent Document 1, a first step of irradiating a nucleus having a uniform longitudinal magnetization relaxation time with a pulse for causing longitudinal magnetization relaxation, and having the uniform longitudinal magnetization relaxation time after a predetermined time t. A second step of measuring the high-resolution NMR spectrum by cutting the spin diffusion of the nuclei, and a third step of acquiring a plurality of high-resolution NMR spectra by repeating the first step and the second step while changing t The value of the longitudinal magnetization relaxation time obtained by the inverse Laplace transform method based on the difference in the recovery speed of the NMR signal intensity for recovering the plurality of high resolution NMR spectra obtained by the process 3 and the third process depending on the longitudinal magnetization relaxation time. A fourth step of categorizing each.

また、非特許文献３に記載のＮＭＲ測定方法は、複数の化合物を含む固体試料について、化合物ごとの緩和時間の違いを利用して選択的にシグナルを検出する。具体的には、混合物における^１Ｈの縦緩和時間（ＨＴ_１）について、反復回復法を利用して、消去したいシグナルのシグナル強度が励起状態から基底状態に回復する際にゼロとなるタイミングで測定を行う手法が記載されている。また、非特許文献３には、混合物における^１Ｈの回転座標系の縦緩和時間（ＨＴ_１ρ）について、スピンエコーを用いることにより、ＨＴ_１ρの短い化合物のシグナル強度がゼロとなるタイミングで測定することによって、混合物中のＨＴ_１ρの長い化合物を選択的に測定する手法が記載されている。 In addition, the NMR measurement method described in Non-Patent Document 3 selectively detects a signal using a difference in relaxation time for each compound in a solid sample containing a plurality of compounds. Specifically, the longitudinal relaxation time (HT ₁ ) of ¹ H in the mixture is measured at a timing when the signal intensity of the signal to be erased becomes zero when the signal intensity to be erased recovers from the excited state to the ground state by using the iterative recovery method. The method of performing is described. In Non-Patent Document 3, the longitudinal relaxation time (HT _1ρ ) of the ¹ H rotating coordinate system in the mixture is measured at a timing when the signal intensity of a compound having a short HT _1ρ becomes zero by using spin echo. _Thus , a technique for selectively measuring a compound having a long HT _{1ρ in} a mixture is described.

特開２０１０−７１８３９号公報JP 2010-71839 A

B. Antalek, W. Windig, Journal of American Chemical Society, vol. 118, p.10331-10332 (1996)B. Antalek, W. Windig, Journal of American Chemical Society, vol. 118, p.10331-10332 (1996) Y. Nishiyama, M. H. Frey, S. Mukasa, H. Utsumi. Journal of Magnetic Resonance, vol. 202, p.135-139 (2010)Y. Nishiyama, M. H. Frey, S. Mukasa, H. Utsumi. Journal of Magnetic Resonance, vol. 202, p.135-139 (2010) N. Zumbulyadis, Journal of Magnetic Resonance, 53, p.486-494 (1983)N. Zumbulyadis, Journal of Magnetic Resonance, 53, p.486-494 (1983)

分子種ごとのＮＭＲシグナルを選択的に取得するための固体ＮＭＲに関する従来の手法は、測定に莫大な時間を要したり、定量分析が困難であった。このような状況に鑑み、本発明の課題は、実用性に優れた固体ＮＭＲの測定法を提供すること、特に、混合物中の特定の分子種のシグナルを選択的に消去または減弱できる固体ＮＭＲの測定法を提供することである。 The conventional methods related to solid-state NMR for selectively acquiring NMR signals for each molecular species require a huge amount of time for measurement and are difficult to perform quantitative analysis. In view of such circumstances, an object of the present invention is to provide a solid-state NMR measurement method excellent in practicality, in particular, solid-state NMR capable of selectively eliminating or attenuating a signal of a specific molecular species in a mixture. It is to provide a measurement method.

本発明者は、固体試料のＮＭＲ測定について鋭意検討したところ、スピンロッキングを用いて^１Ｈの回転座標系の縦緩和時間（ＨＴ_１ρ）を利用することにより、固体試料のＮＭＲスペクトルを分子種選択的に得られることを見いだし、本発明を完成させるに至った。 The present inventor has intensively studied the NMR measurement of the solid sample, and by selecting the molecular species of the NMR spectrum of the solid sample by utilizing the longitudinal relaxation time (HT _1ρ ) of the ¹ H rotating coordinate system using spin locking. The present invention has been found to be obtained, and the present invention has been completed.

すなわち、一つの態様において本発明は、複数の分子種を含む固体試料に９０°パルスを印加して磁化を倒した後、磁化の倒れている方向からラジオ波を照射してスピンロッキングを行い、その後、各成分の^１Ｈの回転座標系の縦緩和時間（ＨＴ_１ρ）の違いを利用することを含む、固体ＮＭＲの測定方法である。 That is, in one embodiment, the present invention applies a 90 ° pulse to a solid sample containing a plurality of molecular species to incline magnetization, and then performs spin locking by irradiating a radio wave from the direction in which the magnetization has fallen, Then, it is a measurement method of solid-state NMR including using the difference in the longitudinal relaxation time (HT _1ρ ) of the ¹ H rotating coordinate system of each component.

本発明は以下に限定されるものではないが、以下の発明を包含する。
（１） ^１Ｈに対して９０°パルスを試料に印加して磁化を倒した後、磁化の倒れている方向からラジオ波を照射してスピンロッキングを行い、^１Ｈの磁化を直接観測、または^１Ｈの磁化を他の核種へ移動させた後に当該磁化を観測するＮＭＲスペクトルの測定方法であって、複数の固体分子種を含む混合物を試料として使用し、測定を希望しない分子種に起因するシグナルを除去または減弱する手段を含む、固体ＮＭＲスペクトルの測定方法。
（２） ^１Ｈ核の磁化を交差分極法により^１３Ｃ核へ移動させ、当該^１３Ｃ核の磁化を観測するものである、（１）に記載の方法。
（３） ^１Ｈ核の磁化を^１３Ｃ核へ移動させ、当該^１３Ｃ核の磁化を観測する手法が、ＣＰ−ＭＡＳ法によるものである、（２）に記載の方法。
（４）測定を希望しない分子種に起因するシグナルを除去または減弱する手段が、当該分子種に係る^１Ｈの回転座標系の縦緩和時間ＨＴ_１ρよりも長い時間をもってスピンロッキングを行うことにより、^１Ｈの回転座標系の縦緩和時間ＨＴ_１ρが相対的に長い分子種の磁化を観測するものである、（３）に記載の方法。
（５）測定を希望しない分子種に起因するシグナルを除去または減弱する手段が、１）^１Ｈ核に対して０より大きく１８０°未満の任意の角度のパルスを印加して磁化を倒した後、^１Ｈの磁化を直接観測、または^１Ｈの磁化を^１３Ｃ核へ移動させて当該磁化を観測する工程、２）^１Ｈに対して９０°パルスを印加して磁化を倒した後、磁化の倒れている方向からラジオ波を照射して所定時間スピンロッキングを行い、^１Ｈの磁化を直接観測、または^１Ｈの磁化を交差分極法により^１３Ｃ核へ移動させて当該磁化を観測する工程、３）１）による測定値から２）による測定値を差し引く工程、を含む、（３）に記載の方法。
（６）１）において^１Ｈ核に対して印加されるパルスが１５〜６０°または１２０〜１６５°である、（５）に記載の方法。
（７）１）において^１Ｈ核に対して印加されるパルスが９０°である、（５）に記載の方法。
（８）固体ＮＭＲスペクトルを測定するためのパルスプログラムであって、１）^１Ｈ核に対して０より大きく１８０°未満の任意の角度のパルスを印加して磁化を倒した後、^１Ｈの磁化を直接観測、または^１Ｈの磁化を^１３Ｃ核へ移動させて当該磁化を観測させること、２）^１Ｈに対して９０°パルスを印加して磁化を倒した後、磁化の倒れている方向からラジオ波を照射して所定時間スピンロッキングを行い、^１Ｈの磁化を直接観測、または^１Ｈの磁化を^１３Ｃ核へ移動させて当該磁化を観測させること、３）１）による測定値から２）による測定値を差し引く処理を演算装置に行わせること、を含むシークエンスを実行させるための上記パルスプログラム。 Although this invention is not limited to the following, the following invention is included.
(1) Applying a 90 ° pulse to ¹ H to the sample to invert the magnetization, and then irradiating a radio wave from the direction in which the magnetization is falling to perform spin locking, or directly observing the magnetization of ¹ H, or An NMR spectrum measurement method for observing the magnetization after moving the magnetization of ¹ H to another nuclide, using a mixture containing a plurality of solid molecular species as a sample, resulting from a molecular species that is not desired to be measured A method for measuring a solid-state NMR spectrum, including means for removing or attenuating a signal.
(2) 1 the magnetization of ^H nuclei moved by cross-polarization technique to ^{13 C} nuclei, is to observe the magnetization of the ^{13 C} nuclei, the method described in (1).
(3) The method according to (2), wherein the method of moving the magnetization of the ¹ H nucleus to the ¹³ C nucleus and observing the magnetization of the ¹³ C nucleus is based on the CP-MAS method.
(4) A means for removing or attenuating a signal caused by a molecular species that is not desired to be measured by performing spin locking in a time longer than the longitudinal relaxation time HT _1ρ of the ¹ H rotating coordinate system related to the molecular species, The method according to (3), wherein the magnetization of a molecular species having a relatively long longitudinal relaxation time HT _{1ρ in a} ¹ H rotating coordinate system is observed.
(5) A means for removing or attenuating a signal caused by a molecular species not desired to be measured is as follows: 1) After applying a pulse at an arbitrary angle greater than 0 and less than 180 ° to ¹ H nuclei to demagnetize the magnetization ¹⁾ directly observing the magnetization of ¹ H, or observing the magnetization by moving the ¹ H magnetization to ¹³ C nuclei, and 2) depressing the magnetization by applying a 90 ° pulse to ¹ H, and then magnetizing performs predetermined time spin locking from being direction by irradiating a radio wave collapse of ^one step direct observation of the magnetization of ^H, where or by ^first moving ^H magnetization to ^{13 C} nuclei by cross-polarization method of observing the magnetization 3) The method according to (3), including a step of subtracting the measurement value according to 2) from the measurement value according to 1).
(6) The method according to (5), wherein the pulse applied to the ¹ H nucleus in 1) is 15 to 60 ° or 120 to 165 °.
(7) The method according to (5), wherein the pulse applied to the ¹ H nucleus in 1) is 90 °.
(8) A pulse program for measuring a solid state NMR spectrum. 1) After applying a pulse at an arbitrary angle greater than 0 and less than 180 ° to ¹ H nuclei to demagnetize, ¹ H Observation of magnetization directly or observation of magnetization by moving ¹ H magnetization to ¹³ C nuclei. 2) After tilting the magnetization by applying a 90 ° pulse to ¹ H, the magnetization is tilted. It performs predetermined time spin locking by irradiating radio waves from directions ¹ directly observe the magnetization of ^H, or ¹ is moved ^H magnetized to the ^{13 C} nuclei to be observed the magnetization, 3) 1) measured by The above pulse program for executing a sequence including: causing an arithmetic unit to perform a process of subtracting a measurement value according to 2).

本発明によって、分子種の^１Ｈの回転座標系の縦緩和時間（ＨＴ_１ρ）の違いを利用することにより、固体試料の成分比を変えたＮＭＲスペクトルを得ることができる。特に本発明によれば、複数の化合物または結晶形の異なる同一化合物もしくは、結晶と非晶質の混合物を含む固体試料について、特定の分子種に起因するシグナルを消去または減弱することが可能である。本発明は、一次元ＮＭＲを用いることから、定性分析のみならず定量分析にも適用可能である。また、本発明は、比較的短時間でデータを取得でき、一般的な装置およびデータ処理法で実行することができる。 According to the present invention, an NMR spectrum in which the component ratio of the solid sample is changed can be obtained by using the difference in the longitudinal relaxation time (HT _1ρ ) of the ¹ H rotating coordinate system of the molecular species. In particular, according to the present invention, it is possible to eliminate or attenuate a signal caused by a specific molecular species for a plurality of compounds, the same compound having different crystal forms, or a solid sample containing a mixture of crystals and amorphous. . Since the present invention uses one-dimensional NMR, it can be applied not only to qualitative analysis but also to quantitative analysis. Further, the present invention can acquire data in a relatively short time, and can be executed with a general apparatus and data processing method.

図１は、スピンロッキングの時間を長くとることにより、ＨＴ_１ρの長い化合物のみを選択的に検出するためのパルスシークエンスである。FIG. 1 shows a pulse sequence for selectively detecting only compounds having a long HT _1ρ by _increasing the time of spin locking. 図２は、混合物中の特定成分のシグナルを選択的に消去または減弱するためのパルスシークエンスである。FIG. 2 is a pulse sequence for selectively eliminating or attenuating the signal of a specific component in the mixture. 図３は、本発明の実施例１で得られたＮＭＲチャートである。図中、○はエテンザミド、△はブロモバレリル尿素、×はアセトアミノフェンに由来するシグナルである。図３（ａ）は、スピンロッキング時間を０秒とした場合（＝通常のＣＰ−ＭＡＳ法による測定）、図３（ｂ）はスピンロッキング時間を５０ｍ秒とした場合であり、図３（ｃ）はエテンザミドの標品を通常のＣＰ−ＭＡＳ法により測定した結果である。FIG. 3 is an NMR chart obtained in Example 1 of the present invention. In the figure, ◯ is etenzamid, Δ is bromovaleryl urea, and x is a signal derived from acetaminophen. 3A shows a case where the spin locking time is 0 second (= measurement by a normal CP-MAS method), and FIG. 3B shows a case where the spin locking time is 50 msec. ) Is the result of measuring the ethenamide standard by the usual CP-MAS method. 図４は、本発明の実施例２で得られたＮＭＲチャートである。図中、○はアセチルサリチル酸に由来するシグナルである。図４（ａ）は、通常のＣＰ−ＭＡＳ法による測定、図４（ｂ）は、３０°パルスを印加した通常のＣＰ−ＭＡＳ法による測定スペクトルから、スピンロッキング時間を３．４４ｍ秒としたシグナルを差し引いた場合であり、図４（ｃ）はアセチルサリチル酸の標品を通常のＣＰ−ＭＡＳ法により測定した結果である。FIG. 4 is an NMR chart obtained in Example 2 of the present invention. In the figure, ◯ is a signal derived from acetylsalicylic acid. FIG. 4A shows a measurement by a normal CP-MAS method, and FIG. 4B shows a measurement spectrum by a normal CP-MAS method to which a 30 ° pulse is applied, and the spin locking time is 3.44 msec. FIG. 4 (c) shows the result of measuring a sample of acetylsalicylic acid by a normal CP-MAS method. 図５は、本発明の実施例３で得られたＮＭＲチャートである。図５（ａ）は、ラクトース（乳糖）１水和物とβ−サイクロデキストリンの重量比１：１混合物をＣＰ−ＭＡＳ法で測定した結果、図５（ｂ）は、同一サンプルに対し、１５°パルスを印加した通常のＣＰ−ＭＡＳ法による測定スペクトルから、スピンロッキング時間を７．８４ｍ秒としたシグナルを差し引いた場合であり、図５（ｃ）はラクトース１水和物の標品を通常のＣＰ−ＭＡＳ法により測定した結果である。FIG. 5 is an NMR chart obtained in Example 3 of the present invention. FIG. 5A shows a result of measuring a 1: 1 weight ratio mixture of lactose (lactose) monohydrate and β-cyclodextrin by the CP-MAS method. As a result, FIG. This is a case where a signal with a spin locking time of 7.84 msec is subtracted from a measurement spectrum by a normal CP-MAS method to which a pulse is applied, and FIG. 5 (c) shows a normal lactose monohydrate preparation. It is the result measured by CP-MAS method. 図６は、本発明の実施例４で得られたＮＭＲチャートである。図６（ａ）は、ラクトース１水和物とβ−サイクロデキストリンの重量比１：１混合物を通常のＣＰ−ＭＡＳ法で測定した結果、図６（ｂ）は、同一サンプルに対し、６０°パルスを印加した通常のＣＰ−ＭＡＳ法による測定スペクトルから、スピンロッキング時間を５．００ｍ秒としたシグナルを差し引いた場合であり、図６（ｃ）はβ−サイクロデキストリンの標品を通常のＣＰ−ＭＡＳ法により測定した結果である。FIG. 6 is an NMR chart obtained in Example 4 of the present invention. FIG. 6 (a) shows the result of measuring a 1: 1 weight ratio mixture of lactose monohydrate and β-cyclodextrin by the usual CP-MAS method. As a result, FIG. FIG. 6 (c) shows a case where a standard of CP-cyclodextrin is obtained by subtracting a signal having a spin locking time of 5.00 milliseconds from a measurement spectrum obtained by applying a pulse to a normal CP-MAS method. -It is the result measured by MAS method.

本発明は、複数の分子種を含む固体試料についてＮＭＲ（核磁気共鳴）を測定する方法に関する。ここに、複数の分子種とは、構造の異なる複数の化合物のみならず、同一構造の化合物について存在する複数の結晶形または非晶質を指す。一般に固体は、溶液と比較して、分子・原子運動が遅いため、固体ＮＭＲでは、ケミカルシフト異方性や双極子相互作用などが強調された広幅なスペクトルが得られる傾向にあり、分子種に選択的な測定を行うことが難しい。 The present invention relates to a method for measuring NMR (nuclear magnetic resonance) on a solid sample containing a plurality of molecular species. Here, the plurality of molecular species refers to not only a plurality of compounds having different structures but also a plurality of crystal forms or amorphous existing for compounds having the same structure. In general, solids have slower molecular and atomic motion than solutions, and solid NMR tends to provide a broad spectrum that emphasizes chemical shift anisotropy and dipole interactions. Difficult to make selective measurements.

本発明においては、複数の分子種を含む固体試料について測定を行う。本発明における固体試料とは、ＮＭＲを測定できる固体であれば特に制限はなく、広範な範囲の固体試料に本発明を適用可能である。本発明の固体試料は、複数の分子種を含んでおり、含まれる分子種の数は２以上であれば特に制限はない。本発明によれば、例えば、３以上の分子種、５以上の分子種、あるいは、１０以上の分子種を含むような固体試料に利用することも可能である。複数の分子種を含む固体試料としては、例えば、製剤、または複数の結晶形あるいは結晶と非晶質の混合物を含む原薬、などを好適に挙げることができる。また、本発明に係る固体試料は、それに含まれる分子がすでに同定されていても、未同定であっても構わない。 In the present invention, measurement is performed on a solid sample containing a plurality of molecular species. The solid sample in the present invention is not particularly limited as long as it is a solid capable of measuring NMR, and the present invention can be applied to a wide range of solid samples. The solid sample of the present invention includes a plurality of molecular species, and there is no particular limitation as long as the number of the molecular species included is 2 or more. According to the present invention, for example, it can be used for a solid sample containing 3 or more molecular species, 5 or more molecular species, or 10 or more molecular species. As the solid sample containing a plurality of molecular species, for example, a drug product or a drug substance containing a plurality of crystal forms or a mixture of crystals and amorphous can be preferably exemplified. Further, the solid sample according to the present invention may be identified or unidentified in the molecules contained therein.

本発明においては、^１Ｈの回転座標系の縦緩和時間（ＨＴ_１ρ）を利用して、分子種に選択的な測定を行う。一般に、溶液ＮＭＲと比較して固体ＮＭＲでは、分子種ごと、すなわち、化合物やその固体状態（結晶多形、アモルファスなど）ごとに緩和時間が大きく異なるため、本発明では、特に各成分のＨＴ_１ρの違いを利用することにより分子種選択的な分析を行う。 In the present invention, a measurement selective to the molecular species is performed using the longitudinal relaxation time (HT _1ρ ) of the ¹ H rotating coordinate system. In general, in the solid-state NMR and compared with the solution NMR, each molecular species, i.e., compounds and their solid state (crystalline polymorphism, amorphous, etc.) relaxation times are significantly different for each, in the present invention, in particular HT _1Ro of each component Analyze molecular species selectively by using the difference.

本発明においては、試料中の^１Ｈに対して９０°パルスを印加して磁化をＸＹ平面（Ｚ軸：静磁場方向）に倒す。
本発明では、試料中の^１Ｈに対して９０°パルスを照射した後、スピンロッキング（Spin locking）を行う。すなわち、９０°パルスによってＸＹ平面に倒された磁化に対して、倒れた方向からラジオ波を照射して、位相がバラバラにならないように保持して磁化をロックする（スピンロッキング）。これにより、スピンロッキングした状態で、^１Ｈの回転座標系の縦緩和（ＨＴ_１ρ）、つまり、^１Ｈの回転座標系の縦緩和による磁化の減衰だけを生じさせることができ、回転座標系の縦緩和時間^１ＨＴ_１ρの短い信号を優先的に減衰させて消去することができる。したがって、本発明では、スピンロッキングのパルス長（スピンロッキング時間）を長く設定することにより、^１ＨＴ_１ρの短い信号を先に減衰させることができるため、比較的^１ＨＴ_１ρの長い分子種のシグナルを選択的に取得することができる。 In the present invention, a 90 ° pulse is applied to ¹ H in the sample to tilt the magnetization in the XY plane (Z axis: static magnetic field direction).
In the present invention, after irradiation with 90 ° pulses for ^{1 H} in the sample, performing a spin locking (Spin locking). That is, with respect to the magnetization that has been tilted to the XY plane by the 90 ° pulse, a radio wave is irradiated from the tilted direction, and the magnetization is locked while being held so that the phase does not fall apart (spin locking). Thus, in a state where the spin locking, ^{1 H} rotational coordinate system longitudinal relaxation of _(HT 1ρ), that is, it is possible to generate only the attenuation of the magnetization due to longitudinal relaxation of the rotating coordinate system of ^{1 H,} a rotating coordinate system A signal having a short longitudinal relaxation time ¹ HT _1ρ can be preferentially attenuated and erased. Therefore, in the present invention, by setting the pulse length of the spin locking the (spin locking time) long, ¹ HT _{for 1Ro} the short signal can be attenuated first, relatively ¹ HT _1ρ long molecular species Signal Can be acquired selectively.

本発明の一つの態様において、固体試料に含まれる複数の分子種のうち、測定したくない分子種に係るＨＴ_１ρの短い成分のシグナルが、減衰して消滅するのに十分な長さでスピンロッキングを行うことによって、^１Ｈの回転座標系の縦緩和時間ＨＴ_１ρが比較的長い分子種のシグナルを選択的に取得することができる。スピンロッキングの時間としては、例えば、通常の条件では１０〜５０ｍ秒が好ましい。 In one embodiment of the present invention, among a plurality of molecular species contained in a solid sample, a signal of a short component of HT _1ρ related to a molecular species that is not _desired to be measured has a length sufficient to attenuate and disappear. By performing locking, it is possible to selectively acquire a signal of a molecular species having a relatively long longitudinal relaxation time HT _{1ρ of} the ¹ H rotating coordinate system. For example, the spin locking time is preferably 10 to 50 milliseconds under normal conditions.

本発明の一つの態様において、スピンロッキングのパワーを下げることによって長時間のスピンロッキングに伴うラジオ波の照射が可能となる。スピンロッキングを長時間行うことは、装置（パワーアンプなど）の故障を誘発するため、スピンロッキングをかける時間に制約がある場合があり、その場合、スピンロッキングの時間を短縮しつつ所望の分子種のシグナルを取得する必要が生じる。そこで、スピンロッキングで照射するラジオ波のパワーを下げることにより、長時間のスピンロッキングに伴うラジオ波の照射ができれば、例えば５０ｍ秒を超える長時間のラジオ波の照射も可能となるため、この態様によれば、通常の条件において、スピンロッキング時間を長くしないと消去できないようなＨＴ_１ρが長い分子種に起因するシグナルを消去することができる。具体的には、スピンロッキングのラジオ波のパワーを装置固有の通常の強さ（４０〜９０ｋＨｚ）の３分の２から２分の１程度に抑えることにより装置への負荷を軽減する。この場合には、スピンロッキングの時間としては５０〜２００ｍ秒の範囲も好適に用いられる。 In one embodiment of the present invention, radio wave irradiation associated with spin locking for a long time can be performed by lowering the power of spin locking. Performing spin locking for a long time induces a failure of the device (power amplifier, etc.), and therefore there are cases where the time for applying the spin locking is limited. In this case, the desired molecular species is reduced while reducing the spin locking time. It is necessary to acquire the signal. Therefore, by reducing the power of the radio wave irradiated by spin locking, if it is possible to irradiate a radio wave accompanying a long period of spin locking, for example, it is possible to irradiate a radio wave for a long time exceeding 50 msec. _Therefore , under normal conditions, it is possible to erase a signal caused by a molecular species having a long HT _1ρ that cannot be erased unless the spin locking time is lengthened. Specifically, the load on the device is reduced by suppressing the power of the spin-locking radio wave from about two-thirds to about one-half of the normal strength (40 to 90 kHz) inherent to the device. In this case, a range of 50 to 200 milliseconds is also preferably used as the spin locking time.

本発明の一つの態様において、ＣＰ−ＭＡＳ法によりＮＭＲを測定することが好ましい。ＣＰ−ＭＡＳ法は、交差分極法（ＣＰ）、マジック角度回転法（ＭＡＳ）、ハイパワーデカップリング（ＨＤ）を組み合わせたもので、^１Ｈ核など緩和時間が比較的短い核の磁化を^１３Ｃ核などの緩和時間が比較的長い核に移動させることによって測定時間を短縮するとともに、大きな磁化を持つ^１Ｈ核などの磁化を小さな磁化を持つ^１３Ｃ核などに移しているため、^１３Ｃ核などを観測核とした場合においてシグナル強度を大きくすることができる。すなわち、^１Ｈの磁化を交差分極法によって^１３Ｃに移すことにより、^１３Ｃの高分解能の下で^１ＨのＴ_１やＴ_１ρを評価できるため好ましい。交差分極法（ＣＰ：Cross Polarization）は、^１Ｈ核と^１３Ｃ核に同時に共鳴周波数のラジオ波をHartmann-Hahn条件を満たすように照射後、９０°位相シフトしたラジオ波を照射してスピンロッキングをかけ、^１Ｈ核から^１３Ｃ核に磁化を移動させ、その後、ＦＩＤを取得する。この場合、緩和過程では^１Ｈからエネルギーが散逸する。マジック角度回転法（ＭＡＳ：Magic Angle Spinning）は、試料をマジック角で高速回転させてケミカルシフトの異方性を消去し、ピークをシャープにする手法である。（数kHz以上が必要）。また、ハイパワーデカップリング（ＨＤ：High Power Decoupling）は、^１Ｈに強いＲＦパルスを照射して^１Ｈ−^１３Ｃの双極子相互作用を除去する手法であり、例えば、ＣＷ（Continuous-Wave）デカップリングやＴＰＰＭ（Two Pulse Phase Modulation）デカップリングなどが用いられる。交差分極における接触時間やラジオ波の周波数は、^１ＨのＴ_１ρや測定条件に応じて適宜調節することができる。通常、交差分極の時間としては１〜２ｍ秒、^１Ｈのラジオ波の磁場強度が４０〜９０ｋＨｚ、^１３Ｃのラジオ波の磁場強度が４０〜９０ｋＨｚを使用する。 In one embodiment of the present invention, NMR is preferably measured by the CP-MAS method. CP-MAS method, cross-polarization technique (CP), magic angle rotation method (MAS), a combination of high-power decoupling ^{(HD), 1} H nuclei such as relaxation time is relatively short nuclear magnetization of ¹³ C of since the well as shortening the measuring time by the relaxation time of the nuclear moves a relatively long core, transferred magnetization such as ^{1 H} nuclei having a large magnetization such as ^{13 C} nucleus with a small magnetization, ^{13 C} nuclear The signal intensity can be increased when the observation nucleus is used. That is, it is preferable to transfer ¹ H magnetization to ¹³ C by the cross polarization method because T ₁ and T _1ρ of ¹ H can be evaluated under high resolution of ¹³ C. Cross Polarization (CP) is a method of spin locking by irradiating ¹ H and ¹³ C nuclei simultaneously with radio waves of resonance frequency so as to satisfy the Hartmann-Hahn condition and then irradiating them with 90 ° phase-shifted radio waves. To move the magnetization from the ¹ H nucleus to the ¹³ C nucleus, and then obtain the FID. In this case, energy is dissipated from ¹ H in the relaxation process. Magic Angle Spinning (MAS) is a technique in which a sample is rotated at a high speed at a magic angle to eliminate chemical shift anisotropy and sharpen a peak. (Several kHz or more is required). High power decoupling (HD) is a technique for removing ¹ H- ¹³ C dipole interaction by irradiating a strong RF pulse to ¹ H. For example, CW (Continuous-Wave) Decoupling and TPPM (Two Pulse Phase Modulation) decoupling are used. The contact time and the frequency of the radio wave in cross polarization can be appropriately adjusted according to T _{1ρ of} ¹ H and measurement conditions. Usually, the cross polarization time is 1 to 2 milliseconds, the magnetic field strength of ¹ H radio wave is 40 to 90 kHz, and the magnetic field strength of ¹³ C radio wave is 40 to 90 kHz.

本発明の別の態様において、複数の分子種を含む固体試料を測定する場合、ある分子種のシグナルが消滅する点（いわゆるnull点：τ_null）を利用して分子種選択的な測定を行うことができる。すなわち、この態様では、第１段階として、まず（１）^１Ｈに対して０より大きく１８０°未満の任意の角度のパルスを印加し、通常のＣＰ−ＭＡＳ法によりシグナルを取り込み、引き続き、第２段階として、（２）試料中の^１Ｈに対し９０°パルスをかけた後、スピンロッキングを行う。スピンロッキングを行っている間には、^１Ｈの回転座標系の縦緩和（ＨＴ_１ρ）、つまり、^１Ｈの回転座標系の縦緩和ＨＴ_１ρによる磁化の減衰だけを生じさせることができる。さらに、（１）から（２）を差し引くことにより、ある分子種のシグナルが消滅するタイミング（τ_null）が発生する。この手法によれば、複数の分子種を含む固体試料について、測定したくない分子種に起因するシグナルを消去することができ、その結果、分子種選択的な測定が可能になる。ここで、第一段階のパルス角としては、０より大きく１８０°未満の任意の角度を用いることができる。１０〜１７０°の任意の角度が好ましい。混合物中の任意の分子種のシグナルを容易に消去可能という観点から、例えば、１０〜８０°または１００〜１７０°パルスが好ましく、１０〜７０°または１１０〜１７０°パルスがより好ましく、１５〜６０°または１２０〜１６５°がさらに好ましい。一方、第一段階のパルス角として、９０°付近のものを用いた場合、この方法により選択的に消去できる混合物中の分子種は、^１Ｈの回転座標系の縦緩和（ＨＴ_１ρ）の非常に長いものに限定されるが、シグナルの強度を上げることができる点で好適である。 In another embodiment of the present invention, when measuring a solid sample containing a plurality of molecular species, molecular species-selective measurement is performed using a point at which a signal of a certain molecular species disappears (so-called null point: τ _null ). be able to. That is, in this aspect, as a first stage, first, (1) a pulse of an arbitrary angle greater than 0 and less than 180 ° is applied to ¹ H, a signal is captured by a normal CP-MAS method, As two steps, (2) a 90 ° pulse is applied to ¹ H in the sample, and then spin locking is performed. While spin locking is being performed, only ¹ H longitudinal coordinate system relaxation (HT _1ρ ), that is, magnetization attenuation due to ¹ H rotational coordinate system longitudinal relaxation HT _1ρ can occur. Further, by subtracting (2) from (1), a timing (τ _null ) at which the signal of a certain molecular species disappears occurs. According to this method, it is possible to eliminate a signal caused by a molecular species that is not desired to be measured for a solid sample including a plurality of molecular species, and as a result, it is possible to perform molecular species selective measurement. Here, as the first-stage pulse angle, any angle greater than 0 and less than 180 ° can be used. An arbitrary angle of 10 to 170 ° is preferred. From the viewpoint that signals of any molecular species in the mixture can be easily erased, for example, 10 to 80 ° or 100 to 170 ° pulse is preferable, 10 to 70 ° or 110 to 170 ° pulse is more preferable, and 15 to 60 is preferable. More preferably, the angle is 120 ° to 165 °. On the other hand, when a pulse angle around 90 ° is used as the first-stage pulse angle, the molecular species in the mixture that can be selectively erased by this method is an extremely _low longitudinal relaxation (HT _1ρ ) in the ¹ H rotational coordinate system. However, it is preferable in that the signal intensity can be increased.

スピンロッキングの時間は、複数の分子種に関するそれぞれの^１Ｈの回転座標系の縦緩和（ＨＴ_１ρ）をスピンロッキングの時間を種々変えながら測定を行うことにより、最適な値を求める。 The spin locking time is determined by measuring the longitudinal relaxation (HT _1ρ ) of each ¹ H rotation coordinate system for a plurality of molecular species while varying the spin locking time.

さらに、本発明の一つの態様において、繰り返し時間（tau）を短くすることによって、^１Ｈ核の縦緩和時間（ＨＴ_１）の長いシグナルを除去することができるため、その結果、固体試料に含まれる複数の分子種のうち、ある分子種に起因するシグナルを選択的に取得することができる。例えば、ＨＴ_１が６０秒程度のＨＴ_１の長い化合物の場合、繰り返し時間を５秒以下に設定することによって、この化合物のシグナルを消去することが可能となる。 Furthermore, in one embodiment of the present invention, by shortening the repetition time (tau), a signal with a long longitudinal relaxation time (HT ₁ ) of ¹ H nucleus can be removed. Among the plurality of molecular species, a signal attributable to a certain molecular species can be selectively acquired. For example, if HT ₁ is a long compound for about 60 seconds with HT _1, by setting the repetition time to 5 seconds or less, it is possible to erase the signals for this compound.

本発明は、ＣＰ−ＭＡＳ法に代えて、^１Ｈ核の磁化を^１３Ｃ核、^１５Ｎ核、^２９Ｓｉ核または^３１Ｐに移動させること、すなわち、観測核として^１３Ｃ核のみならず、^１５Ｎ核、^２９Ｓｉ核、または^３１Ｐを用いる手法に適用可能である。 The present invention, instead of the CP-MAS ^method, the magnetization of the ¹ H nucleus ¹³ C ^{nuclear, 15} N ^nuclei, to move to the 29 Si nuclei or ³¹ P, i.e., ¹³ not C nuclear only as an observing ^{nucleus, 15} The present invention can be applied to a method using N nuclei, ²⁹ Si nuclei, or ³¹ P.

また、１つの態様において、本発明は、固体ＮＭＲスペクトルを測定するためのパルスプログラムである。すなわち、本発明のプログラムは、１）^１Ｈ核に対して０より大きく１８０°未満の任意の角度のパルスを印加して磁化を倒した後、^１Ｈの磁化を直接観測、または^１Ｈの磁化を^１３Ｃ核へ移動させて当該磁化を観測させること、２）^１Ｈに対して９０°パルスを印加して磁化を倒した後、磁化の倒れている方向からラジオ波を照射して所定時間スピンロッキングを行い、^１Ｈの磁化を直接観測、または^１Ｈの磁化を^１３Ｃ核へ移動させて当該磁化を観測させること、３）１）による測定値から２）による測定値を差し引く処理を演算装置に行わせること、を含むシークエンスを実行させる。 In one embodiment, the present invention is a pulse program for measuring a solid-state NMR spectrum. In other words, the program of the present invention is as follows: 1) Apply a pulse of any angle greater than 0 and less than 180 ° to ¹ H nuclei to demagnetize, then directly observe ¹ H magnetization, or ¹ H be observed is moved the magnetization magnetizing to ^{13 C} nuclei, 2) 1 after defeating the magnetization by applying a 90 ° pulse with respect to ^H, by irradiating a radio wave from a direction lying magnetization predetermined Perform time spin locking and observe ¹ H magnetization directly, or move ¹ H magnetization to ¹³ C nuclei and observe the magnetization. 3) Subtract the measurement value from 2) from the measurement value from 1). Causing the processing unit to execute the sequence.

一般に、固体ＮＭＲを測定する装置（ハードウェア）には、静磁場を発生させる超伝導磁石、電磁波パルスの照射とシグナルの測定を行うプローブコイル、計算機（コンピューター）などから構成される。本発明で用いるＮＭＲ装置は、上記の他にも、試料に磁場勾配をかけるためのグラジエント装置、パルスを発生させるトランスミッター、アンプ、レシーバーなどを備えていてもよい。本発明のパルスプログラムは、固体ＮＭＲ測定装置に上記のシークエンスを実行させることができ、計算機を介して、パルスの照射、磁化の観測、観測データの処理を行う。 In general, an apparatus (hardware) for measuring solid-state NMR includes a superconducting magnet that generates a static magnetic field, a probe coil that irradiates an electromagnetic pulse and measures a signal, and a computer (computer). In addition to the above, the NMR apparatus used in the present invention may include a gradient apparatus for applying a magnetic field gradient to the sample, a transmitter for generating pulses, an amplifier, a receiver, and the like. The pulse program of the present invention can cause the solid-state NMR measurement apparatus to execute the above-described sequence, and performs pulse irradiation, magnetization observation, and observation data processing via a computer.

以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、本明細書において特に記載しない限り、数値範囲はその端点を含み、各成分の量は重量基準で記載される。 The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to the following examples. Unless otherwise specified in the present specification, numerical ranges include their end points, and the amount of each component is described on a weight basis.

１．試料
測定試料として、市販の固形製剤である「サリドン（登録商標）エース」（第一三共ヘルスケア社製、鎮痛・解熱薬）を用いた。１錠あたり、エテンザミド（ethenzamide）２５０ｍｇ、アセトアミノフェン（acetaminophen）１１０ｍｇ、ブロモバレリル尿素（bromovalerylurea）１００ｍｇ、無水カフェイン２５ｍｇを含有し、添加物として、クロスＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）Ｎａ、トウモロコシデンプン、ヒドロキシプロピルセルロース、タルク、ステアリン酸Ｍｇなどを含有する。 1. Sample As a measurement sample, “Salidon (registered trademark) ace” (manufactured by Daiichi Sankyo Healthcare Co., Ltd., analgesic / antipyretic), which is a commercially available solid preparation, was used. Each tablet contains 250 mg of ethenzamide, 110 mg of acetaminophen, 100 mg of bromovalerylurea and 25 mg of anhydrous caffeine. As additives, cross CMC (carboxymethylcellulose) Na, corn starch, hydroxypropyl Contains cellulose, talc, Mg stearate, and the like.

１錠をメノウ乳鉢で磨り潰し粉末化した後、得られた粉末を固体ＮＭＲ用φ４ｍｍのサンプルローターに詰めた。
２．ＮＭＲ測定条件
上記試料を用い、ＣＰ−ＭＡＳ法により固体ＮＭＲで３種類の主成分のうち、ＨＴ_１ρのもっとも長いエテンザミドのみを選択的に検出する条件で測定を行った。測定条件の詳細は以下のとおりである。
・装置：AVANCE 400WB（ブルカーバイオスピン製）
・測定温度：室温
・測定時間：５分２１秒
・パルスシークエンス：図１に記載
・試料回転速度：14 kHz
・繰り返し時間：20 秒
・積算回数：16回
・スピンロッキング時間：50 m秒
３．測定結果
図３に、通常のＣＰ−ＭＡＳ法によるサリドンエースのＮＭＲスペクトルと、３種類の主成分のうち、^１Ｈ核の回転座標系の縦緩和時間ＨＴ_１ρのもっとも長いエテンザミドのＮＭＲスペクトルを選択的に測定した結果を示す。 One tablet was ground and powdered in an agate mortar, and the obtained powder was packed into a sample rotor of φ4 mm for solid NMR.
2. NMR measurement conditions Using the above sample, measurement was performed under the condition of selectively detecting only _{ethenamide having} the longest HT _1ρ among the three main components by solid-state NMR by the CP-MAS method. The details of the measurement conditions are as follows.
・ Device: AVANCE 400WB (Bruker Biospin)
・ Measurement temperature: room temperature ・ Measurement time: 5 minutes 21 seconds ・ Pulse sequence: described in FIG. 1 ・ Sample rotation speed: 14 kHz
・ Repetition time: 20 seconds ・ Number of integrations: 16 times ・ Spin locking time: 50 msec. Measurement results Figure 3 shows the NMR spectrum of salidone ace obtained by the normal CP-MAS method and the NMR spectrum of _{ethenamide having} the longest longitudinal relaxation time HT _1ρ of the rotational coordinate system of ¹ H nucleus among the three main components. The result of the measurement was shown.

図３（ａ）では、試料中のエテンザミド、アセトアミノフェン、ブロモバレリル尿素、賦形剤に起因するピークを確認することができた。また、スピンロッキングを行い、緩和時間が短いものを長時間緩和により除去することによって、３種類の主成分のうち、ＨＴ_１ρのもっとも長いエテンザミドのみを検出することができた（図３（ｂ）参照）。 In FIG. 3 (a), peaks due to etenzamide, acetaminophen, bromovaleryl urea, and excipient in the sample could be confirmed. Further, by performing spin locking and removing those having a short relaxation time by long-time relaxation, it was possible to detect only _{ethenamide having} the longest HT _1ρ among the three main components (FIG. 3B). reference).

１．試料
測定試料として、市販の固形製剤である「バファリン（登録商標）Ａ」（ライオン社製、鎮痛・解熱薬）を用いた。１錠あたり、アセチルサリチル酸（acetylsalicylic acid）３３０ｍｇ、合成ヒドロタルサイトを含有し、添加物としてトウモロコシデンプン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、酸化チタン、マクロゴール、青色１号などを含有する。 1. Sample As a measurement sample, “Vafarin (registered trademark) A” (manufactured by Lion, analgesic / antipyretic), which is a commercially available solid preparation, was used. Each tablet contains 330 mg of acetylsalicylic acid and synthetic hydrotalcite, and contains corn starch, hydroxypropylmethylcellulose, titanium oxide, macrogol, blue No. 1 and the like as additives.

１錠をメノウ乳鉢で磨り潰し粉末化した後、得られた粉末を固体ＮＭＲ用φ４ｍｍのサンプルローターに詰めた。
２．ＮＭＲ測定条件
上記試料を用い、ＣＰ−ＭＡＳ法により固体ＮＭＲで３種類の主成分のうち、ＨＴ_１ρの違いを利用し、賦形剤成分を選択的に消去するための条件を用いて測定を行った。測定条件の詳細は以下のとおりである。
・装置：AVANCE 400WB（ブルカーバイオスピン製）
・測定温度：室温
・測定時間：３６時間５９分３８秒
・パルスシークエンス：図２に記載
・試料回転速度：15 kHz
・繰り返し時間：60 秒
・積算回数：1108回
・30°パルス
・スピンロッキング時間：3.44 m秒
３．測定結果
図４に、通常のＣＰ−ＭＡＳ法によるバファリンＡのＮＭＲスペクトルと、賦形剤成分を選択的に消去し、主成分であるアセチルサリチル酸を選択的に測定した結果を示す。 One tablet was ground and powdered in an agate mortar, and the obtained powder was packed into a sample rotor of φ4 mm for solid NMR.
2. NMR measurement conditions Using the above sample, CP-MAS method is used for solid NMR to measure using the difference in HT _1ρ and using the conditions for selectively eliminating excipient components. went. The details of the measurement conditions are as follows.
・ Device: AVANCE 400WB (Bruker Biospin)
・ Measurement temperature: Room temperature ・ Measurement time: 36 hours 59 minutes 38 seconds ・ Pulse sequence: described in FIG. 2 ・ Sample rotation speed: 15 kHz
・ Repetition time: 60 seconds ・ Number of integrations: 1108 times ・ 30 ° pulse ・ Spin locking time: 3.44 msec Measurement Results FIG. 4 shows the NMR spectrum of bufferin A by the normal CP-MAS method and the results of selectively measuring the main component acetylsalicylic acid by selectively eliminating excipient components.

図４（ａ）では、試料中のアセチルサリチル酸、賦形剤に起因するピークを確認することができた。また、（１）３０°パルスを印加した通常のＣＰ−ＭＡＳによりシグナルを取り込み、引き続き、第２段階として、（２）試料中の^１Ｈに対し９０°パルスをかけた後、３．４４ｍ秒のスピンロッキングを行ってシグナルを取り込み、さらに、（１）から（２）を差し引くことにより、アセチルサリチル酸のみを検出することができた（図４（ｂ）参照）。 In FIG. 4 (a), peaks due to acetylsalicylic acid and excipient in the sample could be confirmed. Further, (1) a signal is taken in by a normal CP-MAS to which a 30 ° pulse is applied, and subsequently, as a second stage, (2) a 90 ° pulse is applied to ¹ H in the sample, and then 3.44 ms. The signal was captured by performing spin-locking of the above, and by subtracting (2) from (1), only acetylsalicylic acid could be detected (see FIG. 4 (b)).

１．試料
測定試料として、ラクトース（乳糖）１水和物とβ-サイクロデキストリンを重量比１：１になるように測り取り、メノウ乳鉢で粉砕・混合した後、得られた粉末を固体ＮＭＲ用φ４ｍｍのサンプルローターに詰めた。 1. Sample As a measurement sample, lactose (lactose) monohydrate and β-cyclodextrin were weighed to a weight ratio of 1: 1, pulverized and mixed in an agate mortar, and the obtained powder was used for solid NMR φ4 mm Packed in sample rotor.

２．ＮＭＲ測定条件
上記試料を用い、ＣＰ−ＭＡＳ法により固体ＮＭＲで２種類の化合物のうち、ＨＴ_１ρの違いを利用し、それぞれの成分を選択的に消去するための条件で測定を行った。測定条件の詳細は以下のとおりである。
・装置：AVANCE 400WB（ブルカーバイオスピン製）
・測定温度：室温
・測定時間：６時間９分５２秒
・パルスシークエンス：図２に記載
・試料回転速度：14 kHz
・繰り返し時間：84 秒
・積算回数：132回
・第一段階のパルス角：15°
・スピンロッキング時間：7.84 m秒
３．測定結果
図５に、通常のＣＰ−ＭＡＳ法によるラクトース１水和物とβ-サイクロデキストリンの重量比１：１混合物のＮＭＲスペクトルと、β-サイクロデキストリンを選択的に消去し、ラクトース１水和物を選択的に測定した結果を示す。 2. NMR measurement conditions Using the above sample, measurement was performed under the conditions for selectively erasing each component using the difference in HT _1ρ among the two kinds of compounds in solid NMR by the CP-MAS method. The details of the measurement conditions are as follows.
・ Device: AVANCE 400WB (Bruker Biospin)
・ Measurement temperature: Room temperature ・ Measurement time: 6 hours 9 minutes 52 seconds ・ Pulse sequence: described in FIG. 2 ・ Sample rotation speed: 14 kHz
・ Repetition time: 84 seconds ・ Number of integrations: 132 times ・ First stage pulse angle: 15 °
・ Spin locking time: 7.84 msec. Results of measurement FIG. 5 shows the NMR spectrum of a 1: 1 mixture of lactose monohydrate and β-cyclodextrin by the normal CP-MAS method, and β-cyclodextrin is selectively erased, and lactose monohydration. The result of selectively measuring an object is shown.

図５（ａ）では、試料中のラクトース１水和物及びβ-サイクロデキストリンに起因するシグナルを確認することができた。また、（１）１５°パルスを印加した通常のＣＰ−ＭＡＳによりシグナルを取り込み、引き続き、第２段階として、（２）試料中の^１Ｈに対し９０°パルスをかけた後、７．８４ｍ秒のスピンロッキングを行ってシグナルを取り込み、さらに、（１）から（２）を差し引くことにより、ラクトース１水和物のみを検出することができた（図５（ｂ）参照）。 In FIG. 5 (a), signals attributable to lactose monohydrate and β-cyclodextrin in the sample could be confirmed. Further, (1) a signal is captured by a normal CP-MAS to which a 15 ° pulse is applied, and subsequently, as a second stage, (2) a 90 ° pulse is applied to ¹ H in the sample, and then 7.84 ms. The signal was captured by performing the spin-locking of (1) and (2) was subtracted from (1), whereby only lactose monohydrate could be detected (see FIG. 5 (b)).

１．試料
測定試料として、ラクトース１水和物とβ-サイクロデキストリンを重量比１：１になるように測り取り、メノウ乳鉢で粉砕・混合した後、得られた粉末を固体ＮＭＲ用φ４ｍｍのサンプルローターに詰めた。 1. Sample As a measurement sample, lactose monohydrate and β-cyclodextrin were weighed at a weight ratio of 1: 1, pulverized and mixed in an agate mortar, and the resulting powder was placed in a φ4 mm sample rotor for solid NMR. Stuffed.

２．ＮＭＲ測定条件
上記試料を用い、ＣＰ−ＭＡＳ法により固体ＮＭＲで２種類の化合物のうち、ＨＴ_１ρの違いを利用し、それぞれの成分を選択的に消去するための条件で測定を行った。測定条件の詳細は以下のとおりである。
・装置：AVANCE 400WB（ブルカーバイオスピン製）
・測定温度：室温
・測定時間：５時間４２分４０秒
・パルスシークエンス：図２に記載
・試料回転速度：14 kHz
・繰り返し時間：16 秒
・積算回数：640回
・第一段階のパルス角：60°
・スピンロッキング時間：5.00 m秒
３．測定結果
図６に、通常のＣＰ−ＭＡＳ法によるラクトース１水和物とβ-サイクロデキストリンの重量比１：１混合物のＮＭＲスペクトルと、ラクトース１水和物を選択的に消去し、β-サイクロデキストリンを選択的に測定した結果を示す。 2. NMR measurement conditions Using the above sample, measurement was performed under the conditions for selectively erasing each component using the difference in HT _1ρ among the two kinds of compounds in solid NMR by the CP-MAS method. The details of the measurement conditions are as follows.
・ Device: AVANCE 400WB (Bruker Biospin)
・ Measurement temperature: Room temperature ・ Measurement time: 5 hours 42 minutes 40 seconds ・ Pulse sequence: described in FIG. 2 ・ Sample rotation speed: 14 kHz
・ Repetition time: 16 seconds ・ Number of integration: 640 times ・ First stage pulse angle: 60 °
-Spin locking time: 5.00 msec. Measurement Results FIG. 6 shows the NMR spectrum of a 1: 1 mixture of lactose monohydrate and β-cyclodextrin by the normal CP-MAS method, and lactose monohydrate was selectively erased, and β-cyclo The result of selectively measuring dextrin is shown.

図６（ａ）では、試料中のラクトース１水和物及びβ-サイクロデキストリンに起因するシグナルを確認することができた。また、（１）６０°パルスを印加した通常のＣＰ−ＭＡＳによりシグナルを取り込み、引き続き、第２段階として、（２）試料中の^１Ｈに対し９０°パルスをかけた後、５．００ｍ秒のスピンロッキングを行ってシグナルを取り込み、さらに、（１）から（２）を差し引くことにより、β−サイクロデキストリンのみを検出することができた（図６（ｂ）参照）。 In FIG. 6 (a), signals attributable to lactose monohydrate and β-cyclodextrin in the sample could be confirmed. Further, (1) a signal is taken in by a normal CP-MAS to which a 60 ° pulse is applied, and subsequently, as a second stage, (2) a 90 ° pulse is applied to ¹ H in the sample, and then 5.00 ms. The signal was captured by performing spin-locking of the above, and by subtracting (2) from (1), only β-cyclodextrin could be detected (see FIG. 6 (b)).

１．試料
結晶化度の測定には、ニフェジピン結晶（和光純薬）、及び、非晶質ニフェジピン−ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）固体分散体を用いた。 1. Sample For the measurement of crystallinity, nifedipine crystals (Wako Pure Chemical Industries) and amorphous nifedipine-polyvinylpyrrolidone (PVP) solid dispersion were used.

検量線作成用サンプルとして、一定量のアセトアミノフェン（内部標準物質）にニフェジピン結晶を加えたものを乳鉢にて混合粉砕し、ニフェジピンの結晶成分の重量比が内部標準物質に対し、１０％、５０％、１００％、１５０％及び２００％となるように調製したものを準備した。 As a sample for preparing a calibration curve, a certain amount of acetaminophen (internal standard substance) added with nifedipine crystals was mixed and ground in a mortar, and the weight ratio of the crystal components of nifedipine was 10% with respect to the internal standard substance. What was prepared so that it might become 50%, 100%, 150%, and 200% was prepared.

また別途、ニフェジピン結晶の割合が５０％となるように、ニフェジピン結晶と非晶質ニフェジピン−ポリビニルピロリドン固体分散体を混合したものに、一定量のアセトアミノフェン（内部標準物質）を加えたものを乳鉢にて混合・粉砕し、ニフェジピン結晶と非晶質ニフェジピンを５０：５０の割合で含有する試料を調製した。 Separately, a mixture of a nifedipine crystal and an amorphous nifedipine-polyvinylpyrrolidone solid dispersion with a certain amount of acetaminophen (internal standard substance) added so that the ratio of nifedipine crystals is 50%. A sample containing nifedipine crystals and amorphous nifedipine in a ratio of 50:50 was prepared by mixing and grinding in a mortar.

得られた粉末を固体ＮＭＲ用φ４ｍｍのサンプルローターに詰めた。
２．ＮＭＲ測定条件
上記試料を用い、ＣＰ−ＭＡＳ法により固体ＮＭＲで３種類の主成分のうち、ＨＴ１ρの違いを利用し、非晶質成分を選択的に消去するための条件を用いて測定を行った。測定条件の詳細は以下のとおりである。
・装置：AVANCE 400WB（ブルカーバイオスピン製）
・測定温度：室温
・測定時間：５時間１分１２秒
・パルスシークエンス：図１に記載
・試料回転速度：14 kHz
・繰り返し時間：50 秒
・積算回数：360回
・スピンロッキング時間：150 m秒
・スピンロッキングパワー：34.7 kHz
３．測定結果
結晶化度測定用の検量線は、検量線作成用サンプル中のアセトアミノフェン(内部標準物質)とニフェジピン結晶の質量比に対して、アセトアミノフェン由来のシグナルとニフェジピン由来のシグナルの強度比をプロットして作成した。具体的には，アセトアミノフェンとニフェジピン結晶の質量比(ニフェジピン結晶／アセトアミノフェン：0.1、0.5、1.0、1.5、2.0)に対して、アセトアミノフェン由来の23.2ppmのシグナルに対するニフェジピン由来の35.2ppmのシグナルの強度比をプロットした。その相関係数は、R²=0.9974と非常に良好な相関を示した。 The obtained powder was packed in a φ4 mm sample rotor for solid-state NMR.
2. NMR measurement conditions Using the above sample, CP-MAS method is used for solid-state NMR, using the difference in HT1ρ among the three main components, and using the conditions for selectively erasing amorphous components. It was. The details of the measurement conditions are as follows.
・ Device: AVANCE 400WB (Bruker Biospin)
・ Measurement temperature: Room temperature ・ Measurement time: 5 hours 1 minute 12 seconds ・ Pulse sequence: described in FIG. 1 ・ Sample rotation speed: 14 kHz
・ Repetition time: 50 seconds ・ Number of integration: 360 times ・ Spin locking time: 150 msec ・ Spin locking power: 34.7 kHz
3. Measurement results The calibration curve for measuring the crystallinity is the intensity of the signals derived from acetaminophen and nifedipine relative to the mass ratio of acetaminophen (internal standard substance) and nifedipine crystals in the sample for preparing the calibration curve. Created by plotting the ratio. Specifically, for the mass ratio of acetaminophen and nifedipine crystals (nifedipine crystals / acetaminophen: 0.1, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0), 35.2% of nifedipine derived from 23.2 ppm signal derived from acetaminophen. The intensity ratio of ppm signal was plotted. The correlation coefficient showed a very good correlation with R ² = 0.9974.

この検量線を用いて、ニフェジピン結晶と非晶質ニフェジピンを５０：５０の割合で含有する２種類の試料（試料ａ：１７．６％のＰＶＰを含む、試料ｂ：３０％のＰＶＰを含む）について、ニフェジピン結晶の比率を測定したところ、それぞれ、４７．４％及び４５．８％と求められた。すなわち、結晶状態の異なる化合物を複数種類含有する試料について、特定の結晶状態を有する化合物の割合を本発明によって定量することができた。 Using this calibration curve, two types of samples containing nifedipine crystals and amorphous nifedipine in a ratio of 50:50 (sample a: containing 17.6% PVP, sample b: containing 30% PVP) When the ratio of nifedipine crystals was measured, it was determined to be 47.4% and 45.8%, respectively. That is, according to the present invention, the ratio of the compound having a specific crystal state could be quantified according to the present invention for a sample containing a plurality of types of compounds having different crystal states.

以上、詳述したように、本発明によって、分子種の^１Ｈの回転座標系の縦緩和時間（ＨＴ_１ρ）の違いを利用することにより、固体試料の成分比を変えたＮＭＲスペクトルを得ることができる。特に本発明によれば、複数の化合物または結晶形の異なる同一化合物もしくは、結晶と非晶質の混合物を含む固体試料について、特定の分子種に起因するシグナルを消去または減弱することが可能である。本発明は、一次元ＮＭＲを用いることから、定性分析のみならず定量分析にも適用可能である。また、本発明は、比較的短時間でデータを取得でき、一般的な装置およびデータ処理法で実行することができる。 As described above in detail, according to the present invention, by using the difference in the longitudinal relaxation time (HT _1ρ ) of the ¹ H rotating coordinate system of the molecular species, an NMR spectrum in which the component ratio of the solid sample is changed can be obtained. Can do. In particular, according to the present invention, it is possible to eliminate or attenuate a signal caused by a specific molecular species for a plurality of compounds, the same compound having different crystal forms, or a solid sample containing a mixture of crystals and amorphous. . Since the present invention uses one-dimensional NMR, it can be applied not only to qualitative analysis but also to quantitative analysis. Further, the present invention can acquire data in a relatively short time, and can be executed with a general apparatus and data processing method.

Claims

After defeating magnetization by applying a 90 ° pulse to the sample with respect to ^{1 H,} perform spin locking by irradiating radio waves from the direction lying in the magnetization, direct observation of the magnetization of ^{1 H,} or ^{1 H} of An NMR spectrum measurement method that observes the magnetization after moving the magnetization to another nuclide, using a mixture containing multiple solid molecular species as a sample, and removing signals caused by molecular species that you do not want to measure Or a method for measuring a solid-state NMR spectrum, including means for attenuating.

¹ the magnetization of ^H nuclei moved by cross-polarization technique to ^{13 C} nuclei, is to observe the magnetization of the ^{13 C} nuclei, the method according to claim 1.

^The method according to claim 2, wherein the method of moving the magnetization of ¹ H nuclei to ¹³ C nuclei and observing the magnetization of the ¹³ C nuclei is based on a CP-MAS method.

Measurement means for removing or attenuating the signal caused by molecular species that do not wish to, with a time longer than the longitudinal relaxation time HT _1Ro the rotating coordinate system of the ^{1 H} according to the species by performing spin locking, ^{1 H} of The method according to claim 3, wherein the magnetization of a molecular species having a relatively long longitudinal relaxation time HT _1ρ of the rotating coordinate system is observed.

Measurement means for removing or attenuating the signal caused by molecular species that do not wish to, 1) after defeating the magnetization by applying a pulse of the 1 ^H any angle greater than 0 less than 180 ° with respect to the nucleus, ¹ H A step of directly observing the magnetization of 1H, or observing the magnetization by moving the magnetization of ¹ H to ¹³ C nuclei, 2) applying a 90 ° pulse to ¹ H, and then demagnetizing the magnetization; by irradiating radio waves from the direction are performed for a predetermined time spin locking, process is moved to the ^{13 C} nuclei to observe the magnetization by direct observation of the magnetization of the ^{1 H,} or the magnetization of the ^{1 H} cross polarization method, 3) 4. The method of claim 3, comprising subtracting the measurement value according to 2) from the measurement value according to 1).

The method according to claim 5, wherein the pulse applied to ¹ H nuclei in 1) is 15-60 ° or 120-165 °.

The method according to claim 5, wherein the pulse applied to ¹ H nuclei in 1) is 90 °.

A pulse program for measuring a solid-state NMR spectrum. 1) After applying a pulse of any angle greater than 0 and less than 180 ° to ¹ H nucleus to demagnetize, ¹ H magnetization directly Observation or moving the magnetization of ¹ H to ¹³ C nuclei and observing the magnetization 2) Applying a 90 ° pulse to ¹ H to invert the magnetization, and then radio from the direction in which the magnetization is falling performs predetermined time spin locking by irradiation with waves, ^{1 H} directly observe the magnetization of, or ¹ by ^H cross-polarization method magnetization of ¹³ is moved in the ^C nucleus be observed the magnetization, 3) 1) measurement by The above pulse program for executing a sequence including causing the arithmetic device to perform a process of subtracting the measurement value according to 2) from the value.