JP2013083448A - Measurement reagent of low molecular weight compound - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、抗原抗体反応を利用した低分子量化合物の測定試薬に関する。特に、本発明の測定試薬は従来の試薬と比較し、測定感度が向上した試薬である。 The present invention relates to a reagent for measuring a low molecular weight compound utilizing an antigen-antibody reaction. In particular, the measurement reagent of the present invention is a reagent with improved measurement sensitivity compared to conventional reagents.
脊椎動物には、自己を病気から守るための免疫系が備わっている。免疫系とは、体内へ侵入した病原体を認識して攻撃し、排除する生体保護システムである。ここで重要なのが、生体自身（自己）とそれ以外の異物（非自己）との識別である。この識別で主要な役割を果たしているのが、抗体である。 Vertebrates have an immune system that protects them from disease. The immune system is a biological protection system that recognizes, attacks, and eliminates pathogens that have entered the body. What is important here is the discrimination between the living body itself (self) and other foreign substances (non-self). It is the antibodies that play a major role in this identification.
抗体は主に血液中にあり、血流にのって体内を循環している。そして病原体が体内へ侵入すると、前記抗体が当該病原体中の特定物質を特異的に認識し、結合する。この時、抗体が認識する特定物質のことを抗原と呼ぶ。抗体と抗原との結合は、「鍵と鍵穴」に相当するメカニズムで行なわれる。すなわち、抗体の抗原結合部位（鍵穴）に当てはまる抗原（鍵）のみが結合できる仕組みである。そのため、抗体と抗原との結合にはそれぞれの立体構造が非常に重要といえる。 Antibodies are mainly in the blood and circulate in the body along the bloodstream. When the pathogen enters the body, the antibody specifically recognizes and binds to a specific substance in the pathogen. At this time, a specific substance recognized by the antibody is called an antigen. The binding between the antibody and the antigen is performed by a mechanism corresponding to “key and keyhole”. That is, it is a mechanism that can bind only an antigen (key) that fits in an antigen binding site (keyhole) of an antibody. Therefore, it can be said that each three-dimensional structure is very important for the binding between the antibody and the antigen.
抗体と抗原との特異的相互作用（結合）には高い親和性を有している。例えば、マウスモノクローナル抗体とその抗原との結合における解離定数（Ｋｄ）は１×１０−９から１０−１０にもなる。これは仮に、抗体と抗原の濃度がそれぞれ１Ｍとなるように混ぜた場合、９６％以上の抗原が抗体と結合するほどの高い親和性である。そのため、たとえ微量の抗原であってもそれが体内へ侵入すると、抗体によって捕捉することが可能である。 The specific interaction (binding) between the antibody and the antigen has a high affinity. For example, the dissociation constant (Kd) in the binding between a mouse monoclonal antibody and its antigen is 1 × 10 −9 to 10 −10 . This is so high that 96% or more of the antigen binds to the antibody when the antibody and the antigen are mixed at a concentration of 1M. Therefore, even if a very small amount of antigen enters the body, it can be captured by the antibody.
前述したように、抗体と抗原との結合には特異性と親和性という点で大きな特徴がある。そのため抗体は、夾雑物中にある微量の特定物質を検出するための道具として非常に有用といえる。そしてこの利点を生かして、実験用試薬、免疫診断試薬、治療用医薬品など、数多くの製品が開発されている。 As described above, the binding between an antibody and an antigen has major characteristics in terms of specificity and affinity. Therefore, the antibody can be said to be very useful as a tool for detecting a minute amount of a specific substance in a contaminant. Taking advantage of this, many products such as laboratory reagents, immunodiagnostic reagents and therapeutic drugs have been developed.
抗体を用いて特定物質を検出する方法についてはこれまで非常によく研究されており、数多く報告されている。しかしその中心となる部分に注目すると、数種類に分類することができる。最も代表的な方法が、サンドイッチ法と競合法である。サンドイッチ法は、抗原を二種類の抗体で挟みこむことで捕捉し、検出する手法である。この方法ではまず、一方の抗体（一次抗体）を担体に固定化しておき、この一次抗体の働きにより、抗原を担体上に固定する。次に酵素や蛍光色素などで標識したもう一方の抗体（二次抗体）を加える。この標識化二次抗体が担体上に固定された抗原を捕捉して結合する。そしてこの標識化二次抗体により発せられるシグナルを検出することで抗原を定量する（図１）。一方競合法は、一種類の抗体を用いて抗原を検出する方法である。この方法では、抗体を担体に固定化しておき、抗原を含む試料および酵素や蛍光色素などで標識した抗原（標識化抗原）を添加する。試料中の抗原量が増えると、抗体と結合する標識化抗原が減り、シグナルが弱くなる。抗原を含まない試料を添加したときにおける標識化抗原により発せられるシグナルを１００％としたときの、抗原を含む試料を添加したときにおける標識化抗原により発せられるシグナルの割合から、試料中の抗原量を算出する（図２）。 Methods for detecting specific substances using antibodies have been studied very well and many reports have been made. However, focusing on the central part, it can be classified into several types. The most representative methods are the sandwich method and the competitive method. The sandwich method is a technique for capturing and detecting an antigen by sandwiching it between two types of antibodies. In this method, first, one antibody (primary antibody) is immobilized on a carrier, and the antigen is immobilized on the carrier by the action of the primary antibody. Next, another antibody (secondary antibody) labeled with an enzyme or a fluorescent dye is added. This labeled secondary antibody captures and binds the antigen immobilized on the carrier. And antigen is quantified by detecting the signal emitted by this labeled secondary antibody (FIG. 1). On the other hand, the competition method is a method for detecting an antigen using one kind of antibody. In this method, an antibody is immobilized on a carrier, and an antigen-containing sample and an antigen (labeled antigen) labeled with an enzyme or a fluorescent dye are added. As the amount of antigen in the sample increases, the labeled antigen that binds to the antibody decreases and the signal weakens. From the ratio of the signal emitted by the labeled antigen when the sample containing the antigen is added when the signal emitted by the labeled antigen when the sample not containing the antigen is 100%, the amount of antigen in the sample Is calculated (FIG. 2).
サンドイッチ法、競合法、いずれの方法でも、抗原を定量的に検出できる。しかし、その測定原理の違いにより利点と欠点がある。サンドイッチ法では、二次抗体の量を自由に増やすことができるため、シグナルを増幅することができる。そのため、微量の抗原でも高い感度で検出できる。しかし、測定に適した二種類の抗体を用意する必要があるため、サンドイッチ法で検出できる物質は、抗体と相互作用する部位を複数有した、比較的分子量の大きいものに限られる。一方競合法では、使用する抗体が一種類で済み、実験操作がサンドイッチ法より１ステップ少ないため測定時間が短く済み、抗体と相互作用する部位が少ない低分子量化合物（非特許文献１）であっても抗原を定量的に検出できる。しかし、サンドイッチ法のようにシグナルを増幅することはできないため、同じ性能の抗体を使用した場合で比較すると、感度の点ではサンドイッチ法より劣る。 The antigen can be quantitatively detected by either the sandwich method or the competitive method. However, there are advantages and disadvantages due to the difference in measurement principle. In the sandwich method, the amount of secondary antibody can be freely increased, so that the signal can be amplified. Therefore, even a very small amount of antigen can be detected with high sensitivity. However, since it is necessary to prepare two types of antibodies suitable for measurement, substances that can be detected by the sandwich method are limited to those having a plurality of sites that interact with antibodies and having a relatively large molecular weight. On the other hand, in the competitive method, only one type of antibody is used, and the experimental procedure is one step less than the sandwich method, so the measurement time is short, and the low molecular weight compound has few sites that interact with the antibody (Non-patent Document 1). Can also detect antigen quantitatively. However, since the signal cannot be amplified as in the sandwich method, the sensitivity is inferior to that of the sandwich method when antibodies having the same performance are used.
低分子量化合物は抗体と相互作用する部位が少ないため、当該化合物を抗原抗体反応を利用して定量するには、サンドイッチ法ではなく競合法による測定が用いられる。しかしながら、競合法はサンドイッチ法と比較し、抗原である低分子量化合物を高い感度で検出することができなかった。 Since a low molecular weight compound has few sites that interact with an antibody, measurement by a competitive method rather than a sandwich method is used to quantify the compound using an antigen-antibody reaction. However, the competitive method could not detect a low molecular weight compound as an antigen with high sensitivity as compared with the sandwich method.
本発明では前記問題の解決を目指したものである。すなわち、本発明が解決しようとする課題は、競合法を用いた抗原抗体反応による低分子量化合物の測定において、従来よりも、当該化合物を検出する際の感度が向上した試薬および感度を向上させる方法を提供するものである。 The present invention aims to solve the above problems. That is, the problem to be solved by the present invention is a reagent having improved sensitivity and a method for improving sensitivity in detecting a low molecular weight compound by antigen-antibody reaction using a competitive method. Is to provide.
前記課題を鑑みてなされた本発明は、以下の態様を包含する：
本発明の第一の態様は、リンカーを介してキャリアータンパク質と結合した低分子量化合物で動物を免疫して得られる抗体と、リンカーを介して標識物質と結合した低分子量化合物とを含む、前記低分子量化合物の測定試薬であって、前記キャリアータンパク質と結合した低分子量化合物におけるリンカー結合位置と、前記標識物質と結合した低分子量化合物におけるリンカー結合位置とが異なる、前記測定試薬である。
The present invention made in view of the above problems includes the following aspects:
A first aspect of the present invention comprises the low molecular weight compound comprising an antibody obtained by immunizing an animal with a low molecular weight compound bound to a carrier protein via a linker, and a low molecular weight compound bound to a labeling substance via a linker. A reagent for measuring a molecular weight compound, wherein the linker binding position in the low molecular weight compound bound to the carrier protein is different from the linker binding position in the low molecular weight compound bound to the labeling substance.
本発明の第二の態様は、前記キャリアータンパク質と結合した低分子量化合物におけるリンカー結合位置と、前記標識物質と結合した低分子量化合物におけるリンカー結合位置とが、２から５炭素原子分離れている、前記第一の態様に記載の測定試薬である。 In the second aspect of the present invention, the linker binding position in the low molecular weight compound bound to the carrier protein and the linker binding position in the low molecular weight compound bound to the labeling substance are separated from 2 to 5 carbon atoms, The measurement reagent according to the first aspect.
本発明の第三の態様は、低分子量化合物がステロイドホルモンである、前記第一または第二の態様に記載の測定試薬である。 A third aspect of the present invention is the measurement reagent according to the first or second aspect, wherein the low molecular weight compound is a steroid hormone.
本発明の第四の態様は、ステロイドホルモンがプロゲステロン（Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ）であり、前記キャリアータンパク質と結合したプロゲステロンにおけるリンカー結合位置が６位または１１位の炭素原子であり、前記標識物質と結合したプロゲステロンにおけるリンカー結合位置が３位の炭素原子である、前記第三の態様に記載の測定試薬である。 In a fourth aspect of the present invention, the steroid hormone is progesterone, the linker binding position in the progesterone bound to the carrier protein is the 6th or 11th carbon atom, and the progesterone bound to the labeling substance is It is a measuring reagent as described in said 3rd aspect whose linker bond position is a 3rd-position carbon atom.
本発明の第五の態様は、リンカーが、アミノ基、カルボキシル基またはチオール基を有する物質との反応性を有する、前記第一から第四の態様のいずれかに記載の測定試薬である。 A fifth aspect of the present invention is the measurement reagent according to any one of the first to fourth aspects, wherein the linker has reactivity with a substance having an amino group, a carboxyl group, or a thiol group.
本発明の第六の態様は、リンカーを介してキャリアータンパク質と結合した低分子量化合物で動物を免疫して得られる抗体と、前記キャリアータンパク質と結合した低分子量化合物におけるリンカー結合位置とは異なる位置でリンカーを介して標識物質と結合した低分子量化合物とを用いた、前記低分子量化合物の測定方法である。 In a sixth aspect of the present invention, an antibody obtained by immunizing an animal with a low molecular weight compound bound to a carrier protein via a linker and a position different from the linker binding position in the low molecular weight compound bound to the carrier protein This is a method for measuring a low molecular weight compound using a low molecular weight compound bound to a labeling substance via a linker.
以下、本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
本発明の測定試薬に含まれる低分子量化合物に対する抗体を調製する際、当該化合物は、その小ささのために抗体と相互作用する部位が少ない。そのため、前記化合物単独で動物に免疫しても免疫原性が低く、前記化合物に対する抗体が得られにくい。そのため、リンカーを介してウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのキャリアータンパク質と前記化合物とを結合した態様で動物を免疫する（非特許文献１）。これにより免疫原性を示すようになり、本発明の測定試薬に含まれる抗体を調製することができる。免疫に使用できる動物としては、当業者が通常用いる、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、ヤギが例示できる。 When preparing an antibody against a low molecular weight compound contained in the measurement reagent of the present invention, the compound has few sites that interact with the antibody due to its small size. Therefore, even if an animal is immunized with the compound alone, its immunogenicity is low and it is difficult to obtain an antibody against the compound. Therefore, animals are immunized in such a manner that a carrier protein such as bovine serum albumin (BSA) and the above compound are bound via a linker (Non-patent Document 1). As a result, immunogenicity is exhibited, and an antibody contained in the measurement reagent of the present invention can be prepared. Examples of animals that can be used for immunization include mice, rats, rabbits, chickens, and goats that are commonly used by those skilled in the art.
本発明の測定試薬に含まれる、リンカーを介して標識物質と結合した低分子量化合物（以下、標識化抗原とする）を作製する際は、当該抗原が前述の方法で調製した低分子量化合物に対する抗体に認識されうる構造であることが必要となる。すなわち、前記抗原のエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）がきちんと露出していることが必要だといえる。エピトープが埋もれ、外部から接触しづらい形で標識化抗原を作製すると、当該抗原に対する抗体がエピトープを認識できず競合法による測定が行なえない。そのため、通常標識化抗原を作製する際は、免疫に使用した抗原の立体構造を変えない、すなわち、前記キャリアータンパク質と結合した低分子量化合物におけるリンカー結合位置と同じ位置でリンカーを介して標識物質と低分子量化合物とを結合した標識化抗原を用いる。しかしながら、本発明の測定試薬に含まれる標識化抗原は、リンカーを介して標識物質と低分子量化合物とを結合させる際、当該リンカー位置を、抗体調製時に使用した、リンカーを介してキャリアータンパク質と結合した低分子量化合物におけるリンカー結合位置と異なる位置とすることを特徴とし、これにより低分子量化合物の測定感度を向上させている。リンカー結合位置を変えることで感度が向上する理由としては、低分子量化合物におけるエピトープが露出する構造に変化が生じることで、抗体と標識化抗原との親和性が落ち、結果として、抗体と非標識化抗原（試料中に含まれる抗原）との親和性が相対的に上昇したためと推測される。 When preparing a low molecular weight compound (hereinafter referred to as labeled antigen) contained in the measurement reagent of the present invention bound to a labeling substance via a linker, the antigen is an antibody against the low molecular weight compound prepared by the above-described method. It is necessary to have a structure that can be recognized. That is, it can be said that the epitope of the antigen is necessary to be exposed properly. If a labeled antigen is prepared in such a manner that the epitope is buried and difficult to contact from the outside, the antibody against the antigen cannot recognize the epitope and measurement by the competition method cannot be performed. Therefore, when preparing a labeled antigen in general, the steric structure of the antigen used for immunization is not changed, i.e., the labeling substance is linked via a linker at the same position as the linker binding position in the low molecular weight compound bound to the carrier protein. A labeled antigen bound to a low molecular weight compound is used. However, when the labeled antigen contained in the measurement reagent of the present invention binds a labeling substance and a low molecular weight compound via a linker, the linker position is bound to a carrier protein via the linker used during antibody preparation. The position of the low molecular weight compound is different from the linker binding position, thereby improving the measurement sensitivity of the low molecular weight compound. The reason why the sensitivity is improved by changing the linker binding position is that the affinity between the antibody and the labeled antigen decreases due to the change in the structure where the epitope in the low molecular weight compound is exposed, resulting in the antibody being unlabeled. This is presumably because the affinity with the conjugated antigen (antigen contained in the sample) was relatively increased.
本発明の測定試薬に含まれる、標識化抗原を作製する際用いる標識物質は、抗原抗体反応を利用した測定試薬において当業者が通常用いる標識物質の中から適宜選択し使用することができる。具体的には、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などの酵素、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＦＩＴＣ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、などの蛍光色素がある。 The labeling substance used in preparing the labeled antigen contained in the measurement reagent of the present invention can be appropriately selected and used from among the labeling substances commonly used by those skilled in the art in the measurement reagent using antigen-antibody reaction. Specific examples include enzymes such as alkaline phosphatase (ALP) and horseradish peroxidase (HRP), and fluorescent dyes such as Cy3, Cy5, FITC, and Rhodamine.
本発明の測定試薬は、従来の競合法による低分子量化合物の測定試薬と比較し、測定感度が向上した試薬であるが、本発明の測定試薬が適用できる低分子量化合物の種類は非常に幅広く、少なくともリンカーと結合可能な部位を２箇所以上有した低分子化合物であればよい。低分子量化合物の具体例としては、トリヨードサイロニン（Ｔ３）、チロキシン（Ｔ４）、３，５−ジヨード−Ｌ−チロニン（Ｔ２）などの甲状腺ホルモンや、エストロン（Ｅ１）、エストラジオール（Ｅ２）、エストリオール（Ｅ３）、プロゲステロン（ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ）、コルチゾール（ｃｏｒｔｉｓｏｌ）などのステロイド骨格を有したステロイドホルモンがあげられる。この中でも、ステロイドホルモンは、リンカーと結合可能な部位が多いことから、本発明の測定試薬の測定対象として好ましい。 The measurement reagent of the present invention is a reagent with improved measurement sensitivity compared to the conventional low molecular weight compound measurement reagent by the competitive method, but the types of low molecular weight compounds to which the measurement reagent of the present invention can be applied are very wide, Any low molecular compound having at least two sites capable of binding to a linker may be used. Specific examples of the low molecular weight compounds include thyroid hormones such as triiodothyronine (T3), thyroxine (T4), 3,5-diiodo-L-thyronine (T2), estrone (E1), estradiol (E2), Examples include steroid hormones having a steroid skeleton such as estriol (E3), progesterone, and cortisol. Among these, steroid hormones are preferable as a measurement target of the measurement reagent of the present invention because there are many sites capable of binding to a linker.
低分子量化合物とキャリアータンパクまたは標識物質と結合させる際に用いる、リンカーは特に限定はなく、Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミド（ＮＨＳ）などアミノ基との反応性を有するリンカーや、カルボジイミド化合物などカルボキシル基との反応性を有するリンカー、マレイミド化合物やハロアセチル化合物、ピリジルアセチル化合物などチオール基との反応性を有するリンカーが例示できる。 The linker used for binding the low molecular weight compound to the carrier protein or the labeling substance is not particularly limited. A linker having reactivity with an amino group such as N-hydroxysuccinimide (NHS), a carboxyl group such as a carbodiimide compound, and the like. And linkers having reactivity with thiol groups, such as maleimide compounds, haloacetyl compounds, and pyridylacetyl compounds.
抗体を調製する際に用いる、リンカーを介してキャリアータンパク質と結合した低分子量化合物におけるリンカー結合位置と、標識化抗原におけるリンカー結合位置とは、抗体と標識化抗原との相互作用を完全に損なわない範囲で互いに異なる位置とすればよい。具体的には、キャリアータンパク質と結合した低分子量化合物におけるリンカー結合位置と、標識化抗原におけるリンカー結合位置とが、２から５炭素原子分離れていると好ましいが、測定対象の低分子量化合物の構造によっては、それ以上離れていてもよい。なお、測定対象の低分子量化合物が、ステロイドホルモンの一つであるプロゲステロン（Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ）の場合における、本発明の測定試薬の一例として、プロゲステロンの６位または１１位の炭素原子にリンカーを結合し、当該リンカーを介してキャリアータンパク質と結合した、プロゲステロン−キャリアータンパク質複合体で動物を免疫して得られる抗体と、プロゲステロンの３位の炭素原子にリンカーを結合し、当該リンカーを介して標識物質と結合した、標識化抗原とを含む測定試薬があげられる。 The linker binding position in the low molecular weight compound bound to the carrier protein via the linker and the linker binding position in the labeled antigen used when preparing the antibody do not completely impair the interaction between the antibody and the labeled antigen. The positions may be different from each other in the range. Specifically, the linker binding position in the low molecular weight compound bound to the carrier protein and the linker binding position in the labeled antigen are preferably separated from 2 to 5 carbon atoms, but the structure of the low molecular weight compound to be measured Some may be further away. In the case where the low molecular weight compound to be measured is progesterone which is one of steroid hormones, as an example of the measurement reagent of the present invention, a linker is bonded to the 6th or 11th carbon atom of progesterone, An antibody obtained by immunizing an animal with a progesterone-carrier protein complex bound to a carrier protein via the linker, and a linker bound to the 3rd carbon atom of progesterone, and bound to a labeling substance via the linker And a measurement reagent containing a labeled antigen.
本発明は、リンカーを介してキャリアータンパク質と結合した低分子量化合物で動物を免疫して得られる抗体と、リンカーを介して標識物質と結合した低分子量化合物とを用いた、競合法による抗原抗体反応を利用した低分子量化合物の測定試薬および測定方法において、従来、前記キャリアータンパク質と結合した低分子量化合物におけるリンカー結合位置と、前記標識物質と結合した低分子量化合物におけるリンカー結合位置とを一致させるところ、互いに異なる結合位置とすることに特徴があり、これにより従来の競合法による抗原抗体反応を利用した試薬および方法と比較し、測定感度を向上させることができる。 The present invention relates to an antigen-antibody reaction by a competitive method using an antibody obtained by immunizing an animal with a low molecular weight compound bound to a carrier protein via a linker and a low molecular weight compound bound to a labeling substance via a linker. In the conventional low molecular weight compound measurement reagent and measurement method using the method, the linker binding position in the low molecular weight compound bound to the carrier protein is matched with the linker binding position in the low molecular weight compound bound to the labeling substance. It is characterized in that the binding positions are different from each other, and as a result, the measurement sensitivity can be improved as compared with the reagent and method using the antigen-antibody reaction by the conventional competition method.
以下、ウサギ抗プロゲステロン（Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ）抗体を用いたプロゲステロン測定試薬を例として、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail using a progesterone measurement reagent using a rabbit anti-progesterone antibody as an example, but the present invention is not limited to these examples.
実施例１ ウサギポリクローナル抗体およびウサギモノクローナル抗体の取得
（１）抗プロゲステロンウサギ抗体を取得するため、プロゲステロン（Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ）の３位、６位または１１位の炭素原子にそれぞれリンカー（３位の炭素原子に結合させるリンカー：２−ＮＨＳ−２−ｏｘｏ−１−ｏｘｙｅｔｈａｎｅ，６位または１１位の炭素原子に結合させるリンカー：４−ＮＨＳ−１，４−ｄｉｏｘｏ−１−ｏｘｙｂｕｔａｎｅ）を結合した誘導体（Ｐｒｏｇｅ−３、Ｐｒｏｇｅ−６、Ｐｒｏｇｅ−１１）を作製し（図３）、当該誘導体をキャリアータンパク質であるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と結合させた。
（２）（１）で作製したプロゲステロン誘導体−ＢＳＡ結合体を抗原として、ウサギを免疫し、抗プロゲステロンウサギポリクローナル抗体を取得した。ここで取得した抗体のうち、プロゲステロンの１１位の炭素原子にリンカーを結合した誘導体とＢＳＡとの複合体を抗原として取得した抗体をα−Ｐｒｏｇ１１とし、プロゲステロンの６位の炭素原子にリンカーを結合した誘導体とＢＳＡとの複合体を抗原として取得した抗体をα−Ｐｒｏｇ６とする。
（３）（２）の免疫を行なったウサギから抗体産生細胞を単離し、前記細胞から特許文献１に記載の方法で抗体遺伝子をクローニングすることでモノクローナル抗体を取得した。なお本実施例で取得したモノクローナル抗体は、プロゲステロンの１１位の炭素原子にリンカーを結合した誘導体とＢＳＡとの複合体を抗原として免疫を行なったウサギから得られたものである。
Example 1 Obtaining Rabbit Polyclonal Antibody and Rabbit Monoclonal Antibody (1) In order to obtain an anti-progesterone rabbit antibody, a linker (on the 3rd carbon atom) was added to the 3rd, 6th or 11th carbon atom of progesterone. Linker: 2-NHS-2-oxo-1-oxyethane, Linker to 6-position or 11-position carbon atom: 4-NHS-1,4-dioxo-1-oxybutane) derivative (Proge- 3, Prog-6, Prog-11) (FIG. 3), and the derivative was bound to bovine serum albumin (BSA) which is a carrier protein.
(2) Rabbits were immunized using the progesterone derivative-BSA conjugate prepared in (1) as an antigen, and anti-progesterone rabbit polyclonal antibodies were obtained. Of the antibodies obtained here, α-Prog11 is an antibody obtained using a complex of BSA and a derivative obtained by binding a linker to the 11th carbon atom of progesterone, and the linker is bound to the 6th carbon atom of progesterone. An antibody obtained by using a complex of the derivative and BSA as an antigen is referred to as α-Prog6.
(3) Antibody-producing cells were isolated from the rabbits immunized in (2), and monoclonal antibodies were obtained from the cells by cloning antibody genes by the method described in Patent Document 1. The monoclonal antibody obtained in this example was obtained from a rabbit immunized with a complex of BSA and a derivative in which a linker was bonded to the 11th carbon atom of progesterone and BSA.
実施例２ 標識化抗原（ＣＪ）の作製およびウサギモノクローナル抗体との反応性評価
（１）実施例１（１）で作製したプロゲステロン誘導体（Ｐｒｏｇｅ−３、Ｐｒｏｇｅ−６、Ｐｒｏｇｅ−１１）に、それぞれアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を結合させ、標識化抗原（ＣＪ）を作製した。
（２）（１）で作製したＣＪと、実施例１（３）で作製した抗プロゲステロンウサギモノクローナル抗体との反応性を以下の方法で確認した。なお、下記に示す操作は、東ソー社製全自動エンザイムイムノアッセイ装置ＡＩＡ−６００ＩＩを用いて３７℃にて全自動で行なった。
（２−１）一定の濃度に調整した各ＣＪを、それぞれ、抗ウサギＩｇＧ抗体を固定化した磁性粒子と混合した。
（２−２）（２−１）の混合物に実施例１（３）で作製したウサギモノクローナル抗体を添加し、１０分間反応した。
（２−３）反応後、Ｂ／Ｆ分離を行ない、磁性粒子と結合した各ＣＪから発せられるシグナルを検出した。ここで得られるシグナルが大きいほどウサギモノクローナル抗体と結合しているＣＪ量が多いことを意味しており、反応性の高さを示す。
Example 2 Production of Labeled Antigen (CJ) and Reactivity Evaluation with Rabbit Monoclonal Antibody (1) Progesterone derivatives (Proge-3, Proge-6, and Proge-11) produced in Example 1 (1) Alkaline phosphatase (ALP) was bound to produce labeled antigen (CJ).
(2) The reactivity of the CJ prepared in (1) with the anti-progesterone rabbit monoclonal antibody prepared in Example 1 (3) was confirmed by the following method. In addition, operation shown below was performed fully automatically at 37 degreeC using the Tosoh company fully automatic enzyme immunoassay apparatus AIA-600II.
(2-1) Each CJ adjusted to a constant concentration was mixed with magnetic particles on which an anti-rabbit IgG antibody was immobilized.
(2-2) The rabbit monoclonal antibody prepared in Example 1 (3) was added to the mixture of (2-1) and reacted for 10 minutes.
(2-3) After the reaction, B / F separation was performed, and signals emitted from each CJ bound to the magnetic particles were detected. The larger the signal obtained here, the greater the amount of CJ bound to the rabbit monoclonal antibody, and the higher the reactivity.
結果を図４に示す。免疫に使用したプロゲステロン誘導体（Ｐｒｏｇｅ−１１）を用いて作製したＣＪ（１１位ＣＪ）との反応性が最も高いことが確認できた。一方、立体構造上１１位とは反対の場所にある、６位の炭素原子にリンカーを結合した誘導体（Ｐｒｏｇｅ−６）を用いて作製したＣＪ（６位ＣＪ）とは、全く反応しないことが確認できた。これは、６位の炭素原子にリンカーを結合させたことで、抗体結合部位が潰れてしまったことが原因と考えられる。なお、１１位から比較的近い、３位の炭素原子にリンカーを結合した誘導体（Ｐｒｏｇｅ−３）を用いて作製したＣＪ（３位ＣＪ）とは、弱いながらも反応性を有していることが確認できた。 The results are shown in FIG. It was confirmed that the reactivity with CJ (11th position CJ) prepared using the progesterone derivative (Proge-11) used for immunization was the highest. On the other hand, it does not react at all with CJ (6-position CJ) produced using a derivative (Proge-6) in which a linker is bonded to the carbon atom at the 6-position, which is opposite to the 11-position in terms of the three-dimensional structure. It could be confirmed. This is thought to be because the antibody binding site was crushed by binding a linker to the carbon atom at the 6-position. In addition, CJ (3-position CJ) produced using a derivative (Proge-3) having a linker bonded to the 3-position carbon atom, which is relatively close to the 11-position, is weak but reactive. Was confirmed.
実施例３ ＣＪリンカー結合位置の違いによる測定感度への影響（ウサギモノクローナル抗体を使用した場合）
これまでに作製した材料を用い、標識化抗原（ＣＪ）を作製する際のリンカー結合位置の違いがプロゲステロンの検出感度にどのような影響を与えるのかを調べた。なお、下記に示す操作は、東ソー社製全自動エンザイムイムノアッセイ装置ＡＩＡ−６００ＩＩを用いて３７℃にて全自動で行なった。
（１）一定の濃度に調整した各ＣＪを、それぞれ、抗ウサギＩｇＧ抗体を固定化した磁性粒子と混合した。
（２）プロゲステロン濃度既知のキャリブレータ（ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ）溶液を用意し、（１）の混合物にそれぞれ一定量添加した。
（３）実施例１（３）で作製したウサギモノクローナル抗体を添加し、１０分間反応した。
（４）反応後、Ｂ／Ｆ分離を行ない、磁性粒子と結合した各ＣＪから発せられる蛍光シグナルを検出した。
（５）一定濃度のプロゲステロンを含む各キャリブレータ（Ｃａｌ２からＣａｌ６）のシグナル（Ｂ）を、プロゲステロンを全く含まないキャリブレータ（Ｃａｌ１）を加えた時のシグナル（Ｂ０）を１００％としたときの相対的な値（Ｂ／Ｂ０［％］）として算出し、プロゲステロン濃度を横軸（対数）、Ｂ／Ｂ０（％）を縦軸にとり、各キャリブレータ使用時の測定結果をプロットして検量線を作成した。
（６）Ｂ／Ｂ０＝５０％となる時のプロゲステロン濃度（Ｃ５０）を指標としてその検出感度を評価した。
Example 3 Influence on measurement sensitivity due to difference in CJ linker binding position (when rabbit monoclonal antibody is used)
Using the materials prepared so far, it was investigated how the difference in linker binding position when producing labeled antigen (CJ) affects the detection sensitivity of progesterone. In addition, operation shown below was performed fully automatically at 37 degreeC using the Tosoh company fully automatic enzyme immunoassay apparatus AIA-600II.
(1) Each CJ adjusted to a constant concentration was mixed with magnetic particles on which an anti-rabbit IgG antibody was immobilized.
(2) A calibrator solution having a known progesterone concentration was prepared, and a predetermined amount was added to the mixture of (1).
(3) The rabbit monoclonal antibody prepared in Example 1 (3) was added and reacted for 10 minutes.
(4) After the reaction, B / F separation was performed, and a fluorescence signal emitted from each CJ bound to the magnetic particles was detected.
(5) Relative when the signal (B) of each calibrator (Cal2 to Cal6) containing a certain concentration of progesterone is 100% of the signal (B0) when a calibrator (Cal1) containing no progesterone is added A calibration curve was created by plotting the measurement results when using each calibrator, taking the progesterone concentration on the horizontal axis (logarithm) and B / B0 (%) on the vertical axis. .
(6) The detection sensitivity was evaluated using the progesterone concentration (C50) when B / B0 = 50% as an index.
実験の結果、１１位ＣＪを使用した時のＣ５０が７．０ｎｇ／ｍＬであったのに対し、３位ＣＪを使用した時のＣ５０が１．７ｎｇ／ｍＬとなり、ＣＪの変更によって検出感度が約４倍向上することがわかった（図５）。なお、６位ＣＪを使用した時はシグナルが得られなかったため、検量線を作成することができなかった。 As a result of the experiment, C50 was 7.0 ng / mL when using the 11th position CJ, whereas C50 when using the 3rd position CJ was 1.7 ng / mL. It was found that the improvement was about 4 times (FIG. 5). In addition, since a signal was not obtained when 6th-position CJ was used, a calibration curve could not be created.
実施例４ ＣＪリンカー部位の違いによる測定感度への影響（ウサギポリクローナル抗体を使用した場合）
ウサギモノクローナル抗体の代わりに、実施例１（２）で作製したα−Ｐｒｏｇ１１およびα−Ｐｒｏｇ６を用いた他は、実施例３と同様の実験を行ない、ＣＪのリンカー部位の違いによるＰｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅの検出感度への影響を調べた。
Example 4 Influence on measurement sensitivity due to difference in CJ linker site (when rabbit polyclonal antibody is used)
The same experiment as in Example 3 was performed except that α-Prog11 and α-Prog6 prepared in Example 1 (2) were used instead of the rabbit monoclonal antibody, and the detection sensitivity of Progesterone due to the difference in the linker site of CJ The effect on
α−Ｐｒｏｇ１１を用いた場合、１１位ＣＪを使用した時のＣ５０が４７ｎｇ／ｍＬであったのに対し、３位ＣＪを使用した時のＣ５０は２６ｎｇ／ｍＬとなり、ＣＪの変更により検出感度を向上させられることがわかった（図６）。なお、６位ＣＪを使用した場合は、シグナルが得られなかったため、検量線を作成することができなかった。 When α-Prog11 was used, C50 when using 11-position CJ was 47 ng / mL, whereas C50 when using 3-position CJ was 26 ng / mL. It was found that it can be improved (FIG. 6). When 6-position CJ was used, no calibration signal could be created because no signal was obtained.
またα−Ｐｒｏｇ６を用いた場合、６位ＣＪを使用した時のＣ５０が２１ｎｇ／ｍＬであったのに対し、３位ＣＪを使用した時のＣ５０は１０ｎｇ／ｍＬとなり、ＣＪの変更により検出感度を向上させられることがわかった（図７）。なお、１１位ＣＪを使用した場合は、シグナルが得られなかったため、検量線を作成することができなかった。 In addition, when α-Prog6 was used, C50 when using 6-position CJ was 21 ng / mL, whereas C50 when using 3-position CJ was 10 ng / mL. (Fig. 7). In addition, when 11th-position CJ was used, since a signal was not obtained, a calibration curve could not be created.
実施例３および４の結果より、標識化抗原（ＣＪ）を作成する際のプロゲステロンのリンカー結合位置と、抗原を作成する際のプロゲステロンのリンカー結合位置とを、異なる位置（具体的には３から５炭素原子分離れた位置）とすることで、プロゲステロンの検出感度が向上することがわかる。 From the results of Examples 3 and 4, the linker binding position of progesterone when preparing the labeled antigen (CJ) is different from the linker binding position of progesterone when preparing the antigen (specifically, from 3 It can be seen that the detection sensitivity of progesterone is improved by setting the position 5 carbon atoms apart.
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