JP2013052202A - Dna vaccine microneedle - Google Patents
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Abstract
Description
本発明はＤＮＡワクチン経皮送達用マイクロニードルアレイに関する。 The present invention relates to a microneedle array for DNA vaccine transdermal delivery.
感染症の世界的流行の脅威が増すと共に、感染症に対する唯一の予防手段であるワクチンの開発研究が重要となってきている。ワクチン開発には感染防御に有効な抗原の同定が不可欠である。これまでに実用化された多くのワクチンは弱毒化・無毒化した病原体そのもの（生ワクチン）か、病原体を構成する蛋白質や毒素蛋白質（不活化ワクチン）を抗原として使用している。しかし、これらワクチン抗原の中にはコストやシステムの面から大量供給が困難なものがあり、また不活化ワクチンに誘導される免疫応答の種類や持続性に問題を抱えるものも存在し、これらの欠点を克服できる新型のワクチン開発が注目されてきている。 As the threat of the global epidemic of infectious diseases increases, research and development of vaccines that are the only preventive measures against infectious diseases are becoming important. Identification of effective antigens for infection protection is essential for vaccine development. Many vaccines put to practical use so far use attenuated / detoxified pathogens themselves (live vaccines) or proteins and toxin proteins (inactivated vaccines) that constitute pathogens as antigens. However, some of these vaccine antigens are difficult to supply in large quantities due to cost and system, and some have problems with the type and persistence of immune responses induced by inactivated vaccines. The development of new vaccines that can overcome the shortcomings has attracted attention.
新型ワクチンとして、抗原蛋白質をコードしたプラスミドＤＮＡをワクチン抗原として利用するＤＮＡワクチンが最近脚光を浴びている（特許文献１）。ＤＮＡワクチンは、従来のワクチンに比べて製法が簡便でコストも抑えられるため、各種感染症やがん、アレルギー疾患などに対する新たなワクチンとして研究開発が世界的に進んでいる。 As a new type of vaccine, a DNA vaccine using a plasmid DNA encoding an antigen protein as a vaccine antigen has recently been spotlighted (Patent Document 1). Since DNA vaccines are simpler and less costly than conventional vaccines, research and development are advancing worldwide as new vaccines for various infectious diseases, cancers, allergic diseases and the like.
薬物を体内に投入する方法として、従来皮下注射法、筋肉注射法や経口投与法がよく用いられてきた。しかし、経口投与法は消化器官や消化酵素による分解代謝作用により効率が悪く、注射投与法は苦痛を伴う他薬物の局所濃度の急上昇のため好ましくない。そのためワクチン投与の普及促進にはより簡便な経皮的投与手法の開発が望まれてきた。 Conventionally, a subcutaneous injection method, an intramuscular injection method, and an oral administration method have been often used as a method for introducing a drug into the body. However, the oral administration method is inefficient due to the degradation and metabolism action by the digestive organs and digestive enzymes, and the injection administration method is not preferable because the local concentration of other drugs rapidly increases with pain. Therefore, development of a simpler transdermal administration technique has been desired for promoting the spread of vaccine administration.
皮膚は、外界からの病原体進入という危機に常時さらされており、角質層という物理的バリアーと、その下層である表皮層に常在するランゲルハンス細胞を中心とした免疫バリアーを備えることで第一線の防御機構を形成している。従って、この防御機構を突破して、生きた表皮層にプラスミドＤＮＡを効率よく送達できれば、発現する抗原蛋白質を免疫系のランゲルハンス細胞が捕捉し、抗原特異的免疫応答を惹起できると考えられる。 The skin is constantly exposed to the danger of pathogen entry from the outside world, and is equipped with a physical barrier called the stratum corneum and an immune barrier centered on Langerhans cells that are resident in the underlying epidermis layer. Forms a defense mechanism. Therefore, if this defense mechanism can be overcome and plasmid DNA can be efficiently delivered to the living epidermis layer, it is thought that Langerhans cells of the immune system can capture the expressed antigen protein and elicit an antigen-specific immune response.
これらの問題を解決し、皮膚下の特定の場所に薬効成分を確実に供給する方法として、マイクロニードルが提案された（特許文献２）。マイクロニードルは非常に細いので皮膚角質層に刺入した際痛みも出血もなく且つ穿刺創は速やかに閉鎖されるので、皮膚下に薬物を確実に供給する方法として好適である。なお、基板上に複数のマイクロニードルを備えたものをマイクロニードルアレイという。さらにマイクロニードルアレイを皮膚上に固定するための粘着テープ等を備えたものをマイクロニードルパッチという。
マイクロニードルの材質として、生体内で溶解消失する物質が提案されている（特許文献３）。このようなマイクロニードルにワクチンを含有させて皮膚に刺入すると、マイクロニードルは皮膚内において溶解消失するので、皮膚の特定の場所にワクチンを確実に供給することができる。生体内で溶解消失する物質としては、ヒアルロン酸、コラーゲン、ゼラチン等の多糖類が提案（特許文献４）されている。Microneedles have been proposed as a method for solving these problems and for reliably supplying medicinal ingredients to specific places under the skin (Patent Document 2). Since the microneedle is very thin, there is no pain or bleeding when it is inserted into the skin stratum corneum, and the puncture wound is quickly closed, which is suitable as a method for reliably supplying the drug under the skin. In addition, what provided the some microneedle on the board | substrate is called microneedle array. Furthermore, the one provided with an adhesive tape or the like for fixing the microneedle array on the skin is called a microneedle patch.
As a material of the microneedle, a substance that dissolves and disappears in a living body has been proposed (Patent Document 3). When such a microneedle contains a vaccine and is inserted into the skin, the microneedle dissolves and disappears in the skin, so that the vaccine can be reliably supplied to a specific place on the skin. As substances that dissolve and disappear in vivo, polysaccharides such as hyaluronic acid, collagen, and gelatin have been proposed (Patent Document 4).
ＤＮＡワクチン投与にマイクロニードル技術を利用した発明はすでにいくつか公開されている（特許文献５−１３）。特許文献５、６、１２は電極や電場を利用することを必須要件としており、装置的に煩雑であり本願発明とは基本的に異なる。特許文献７、１１はＤＮＡワクチンを薬剤として例示しているのみで、ＤＮＡワクチン投与に関する実施例は記載されていない。特許文献８は微小突起部材を用いるＤＮＡワクチン投与に関するが、超音波との併用が必須となっており、超音波の支援なしではＤＮＡワクチン投与は成功していない。特許文献９、１０は薬剤の弾道投与に関し、ＤＮＡワクチンマイクロニードルの実施例の記載はない。特許文献１３はシリコン製マイクロニードルを用いて皮膚表面を擦りむいてＤＮＡワクチンを投与する発明を開示しており、この方法で注射法とほぼ対等な効果を得ている。しかし特許文献１３においては、マイクロニードルは皮膚を擦りむくために使用されており、皮膚内で溶解消失するマイクロニードル中にＤＮＡワクチンを含有させて投与することは開示も示唆もしていない。 Several inventions using the microneedle technology for DNA vaccine administration have already been published (Patent Documents 5-13).
本発明が解決しようとする課題は、ワクチン抗原としてプラスミドＤＮＡを経皮的に投与可能な免疫製剤、すなわち「貼るＤＮＡワクチン製剤」を提供することにある。
皮膚内溶解型マイクロニードルを用いてプラスミドＤＮＡを経皮的に生体内に送達し、表皮層に存在するランゲルハンス細胞にプラスミドＤＮＡがコードする抗原蛋白質を捕捉させ認識させることにより、抗原特異的免疫反応応答を効率よく惹起することができる。プラスミドＤＮＡを角質下の皮膚組織内に確実に送達できる方法論を構築し、それによって抗原特異的な免疫応答誘導を達成するＤＮＡワクチン内臓マイクロニードルが提供できると考えられる。The problem to be solved by the present invention is to provide an immunological preparation capable of transcutaneously administering plasmid DNA as a vaccine antigen, that is, a “pasted DNA vaccine preparation”.
Antigen-specific immune response by transdermally delivering plasmid DNA into the body using a skin-dissolving microneedle and capturing and recognizing the antigenic protein encoded by the plasmid DNA in Langerhans cells present in the epidermis A response can be elicited efficiently. It is believed that a methodology capable of reliably delivering plasmid DNA into the subdermal skin tissue can be constructed, thereby providing a DNA vaccine visceral microneedle that achieves antigen-specific immune response induction.
本発明のＤＮＡワクチンマイクロニードルアレイは、マイクロニードル部分に医薬的に有効量のＤＮＡ抗原を含有させた、基板上に皮膚内で溶解消失する複数のマイクロニードルを有することを特徴とする。 The DNA vaccine microneedle array of the present invention is characterized by having a plurality of microneedles that dissolve and disappear in the skin on a substrate, containing a pharmaceutically effective amount of a DNA antigen in the microneedle portion.
本発明のＤＮＡワクチンマイクロニードルアレイに含有されるＤＮＡワクチンとしては、例えばインフルエンザＨＡ抗原や腫瘍関連抗原等のＤＮＡを用いることができる。本発明におけるニワトリ卵白アルブミン（ＯＶＡ）発現プラスミドは抗体発現の例示ＤＮＡである。
さらにこのニワトリ卵白アルブミン（ＯＶＡ）発現プラスミドは、Ｔｈ１免疫応答（細胞性免疫応答）へと偏向した免疫誘導特性を有することを特徴とする。As the DNA vaccine contained in the DNA vaccine microneedle array of the present invention, for example, DNA such as influenza HA antigen and tumor-associated antigen can be used. The chicken ovalbumin (OVA) expression plasmid in the present invention is an exemplary DNA for antibody expression.
Further, this chicken ovalbumin (OVA) expression plasmid is characterized by having an immune induction characteristic biased toward a Th1 immune response (cellular immune response).
ランゲルハンス細胞は免疫系の司令塔として機能する抗原提示細胞であり、皮膚から生体に進入してきた病原体を捕捉して近傍のリンパ節へと移動し、抗原情報を免疫エフェクター細胞に伝達する。このランゲルハンス細胞の本来的な免疫学的機能を標的として経皮ＤＮＡワクチンを開発するには、プラスミドＤＮＡが皮膚最外層の物理的バリアーである角質層を突破する必要があり、皮膚内溶解型マイクロニードルの適用はプラスミドＤＮＡを安定に角質層下の皮膚組織へと到達することを可能とする。 Langerhans cells are antigen-presenting cells that function as a control tower of the immune system, capture pathogens that have entered the living body from the skin, move to nearby lymph nodes, and transmit antigen information to immune effector cells. In order to develop a transdermal DNA vaccine targeting the intrinsic immunological function of the Langerhans cells, it is necessary for plasmid DNA to break through the stratum corneum, which is the physical barrier of the outermost skin layer. The application of the needle allows the plasmid DNA to stably reach the skin tissue below the stratum corneum.
現在公表されているＤＮＡワクチンの多くは、プラスミドＤＮＡを皮下注射法や筋肉注射法により投与している。注射は痛みを伴うばかりでなく、注射針による感染症罹患の危険性や投与局所の腫脹や発熱といった副作用問題を孕んでいる。マイクロニードル技術を活用すれば、このような副作用を生じない、簡便で普及性に優れたＤＮＡワクチンを実用化できる。
本発明に基づき有効な経皮ＤＮＡワクチン製剤を開発・上市できれば、衛生環境的・医療技術的・経済的な問題を抱える開発途上国にワクチンが十分に行き渡っていない現状を打開し、新興・再興感染症に対する予防医療に大いに貢献できるものと確信する。
本発明の応用例は感染症予防に留まらず、がん、自己免疫疾患、アレルギー、アルツハイマー病などに対する新たな予防・治療法の開発にも期待が持たれる。In many of the DNA vaccines that are currently published, plasmid DNA is administered by subcutaneous injection or intramuscular injection. Injection is not only painful, but also has side effects such as the risk of infection by the needle and the local swelling and fever. If microneedle technology is utilized, a simple and excellent DNA vaccine that does not cause such side effects can be put into practical use.
If an effective transdermal DNA vaccine formulation can be developed and marketed based on the present invention, the current situation in which vaccines are not sufficiently distributed to developing countries with sanitary environmental, medical technology, and economic problems will be overcome. I am convinced that it can greatly contribute to preventive medicine against infectious diseases.
The application example of the present invention is not limited to the prevention of infectious diseases, but is expected to develop new preventive / therapeutic methods for cancer, autoimmune diseases, allergies, Alzheimer's disease and the like.
ＤＮＡワクチンとしてニワトリ卵白アルブミン（ＯＶＡ）発現プラスミドを含有するマイクロニードルを使用すると、これを注射法で投与する場合や蛋白質ワクチンを利用する場合に比較して、Ｔｈ２免疫応答（体液性免疫応答：主に抗体の産生）よりもむしろＴｈ１免疫応答（細胞性免疫応答：主に細胞傷害性Ｔ細胞の活性化）へと偏向した免疫誘導特性を有する特徴が認められた。
がん、ウイルス感染症などに効果を発揮するワクチンは、Ｔｈ２免疫応答のみならず、Ｔｈ１免疫応答の誘導が必要である。また、自己免疫疾患やアレルギーはＴｈ１／Ｔｈ２免疫応答バランスの破綻が病因であるので、ワクチンによってどちらかに偏ったバランスを正常に戻せれば有効な治療法となる。このようにいずれかへ偏向した免疫誘導特性を有することは、このワクチンの新しい応用に繋がる。When a microneedle containing a chicken ovalbumin (OVA) expression plasmid is used as a DNA vaccine, the Th2 immune response (humoral immune response: main) is compared with the case where it is administered by an injection method or when a protein vaccine is used. (1) rather than the production of antibodies), a characteristic having immune-inducing properties biased toward a Th1 immune response (cellular immune response: mainly activation of cytotoxic T cells) was observed.
Vaccines that are effective against cancer, viral infections, etc. need to induce not only a Th2 immune response but also a Th1 immune response. In addition, since autoimmune diseases and allergies are caused by disruption of the Th1 / Th2 immune response balance, an effective treatment method can be achieved if the biased balance is restored to normal by the vaccine. This immunity-inducing characteristic biased to either one leads to a new application of this vaccine.
次に、本発明を詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。 Next, although this invention is demonstrated in detail, this invention is not limited to an Example.
（ニワトリ卵白アルブミン（ＯＶＡ）発現プラスミド生成法）
ＯＶＡ発現プラスミドは、以前に構築した図１に示されているｐＨＭＣＭＶ５／ＯＶＡを使用した。この手順の詳細は次の文献に記載されている。
１）水口裕之、マークＡ．ケイ（Ｈｉｒｏｙｕｋｉ Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ ａｎｄ Ｍａｒｋ Ａ．Ｋａｙ），改良された生体外連結法による組換えアデノウイルスベクターの効率的な構築（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ ｂｙ ａｎ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ），ヒト遺伝子治療（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ），米国、マリー・アン・ライバート社（Ｍａｒｙ Ａｎｎ Ｌｉｅｂｅｒｔ，Ｉｎｃ），１９９８年，９巻，１７号，２５７７−２５８３頁
２）水口裕之、マークＡ．ケイ（Ｈｉｒｏｙｕｋｉ Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ ａｎｄ Ｍａｒｋ Ａ．Ｋａｙ），Ｅ１およびＥ１／Ｅ４を欠損した組換えアデノウイルスベクターを構築するための簡便法（Ａ Ｓｉｍｐｌｅ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ Ｅ１−ａｎｄ Ｅ１／Ｅ４−Ｄｅｌｅｔｅｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ），ヒト遺伝子治療（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ），米国、マリー・アン・ライバート社（Ｍａｒｙ Ａｎｎ Ｌｉｅｂｅｒｔ，Ｉｎｃ），１９９９年，１０巻，１２号，２０１３−２０１７頁
３）岡田直貴、斎藤友美、舛永安繁、塚田有希子、中川晋作、水口裕之、森宏平、岡田裕香、藤田卓也、早川堯夫、眞弓忠範、山本昌（Ｎａｏｋｉ Ｏｋａｄａ，Ｔｏｍｏｍｉ Ｓａｉｔｏ，Ｙａｓｕｓｈｉｇｅ Ｍａｓｕｎａｇａ，Ｙｕｋｉｋｏ Ｔｓｕｋａｄａ，Ｓｈｉｎｓａｋｕ Ｎａｋａｇａｗａ，Ｈｉｒｏｙｕｋｉ Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ，Ｋｏｈｅｉ Ｍｏｒｉ，Ｙｕｋａ Ｏｋａｄａ，Ｔａｋｕｙａ Ｆｕｊｉｔａ，Ｔａｋａｏ Ｈａｙａｋａｗａ，Ｔａｄａｎｏｒｉ Ｍａｙｕｍｉ，ａｎｄ Ａｋｉｒａ Ｙａｍａｍｏｔｏ），アルギニン−グリシン−アスパラギン酸配列を含むファイバー変異型アデノウイルスベクターを用いた効率的な抗原遺伝子形質導入は、ネズミ樹状細胞の抗腫瘍ワクチン効果と機能成熟を増強できる（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ Ｆｉｂｅｒ−Ｍｕｔａｎｔ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｃａｎ Ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅ Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｕｒｉｎｅ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ），癌研究（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），米国、米国癌学会（Ａｍｅｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），２００１年，６１巻，２１号，７９１３−７９１９頁(Chicken egg albumin (OVA) expression plasmid production method)
As the OVA expression plasmid, pHMCMV5 / OVA shown in FIG. 1 constructed previously was used. Details of this procedure are described in the following document.
1) Hiroyuki Mizuguchi, Mark A. Kay (Hiroyuki Mizuguchi and Mark A. Kay), Efficient Construction of a Recombinant Adenovirus Induced Veterinary Veterinary Veterinary Veterinary Therapy (Effects) (Human Gene Therapy), Mary Ann Libert, Inc., 1998, Vol. 9, No. 17, pp. 2577-2583 2) Mizuguchi Hiroyuki, Mark A. et al. Kay (Hiroyuki Mizuguchi and Mark A. Kay), a simple method for constructing recombinant adenoviral vectors lacking E1 and E1 / E4 Human Gene Therapy, Mary Ann Libert, Inc., 1999, Vol. 10, No. 12, 2013-2017 3) Okada Naoki, Saito Tomomi, Tominaga Yasushi, Yukiko Tsukada, Yusaku Nakagawa, Hiroyuki Mizuguchi, Kohei Mori, Yuka Okada, Takuya Fujita, Ikuo Hayakawa, Tadanori Yumi, Masaru Yamamoto (Naoki Okada, Tomomi Saito, Yasu shige Masunaga, Yukiko Tsukada, Shinsaku Nakagawa, Hiroyuki Mizuguchi, Kohei Mori, Yuka Okada, Takuya Fujita, Takao Hayakawa, Tadanori Mayumi, and Akira Yamamoto), arginine - glycine - using fiber variant adenovirus vector containing aspartic acid sequence Efficient antigen gene transduction can enhance the anti-tumor vaccine efficacy and functional maturation of murine dendritic cells (Efficient Antigen Gene Transduction Arg-Gly-Asp Fiber-Mutant Adenovirus Vectors Can Potentate Immune Vaccine Efficiency and Measurement of Murine Dendritic Cells, Cancer Research, USA, American Association for Cancer Research, 2001, 61-79, 79-79.
ｐＨＭＣＭＶ５／ＯＶＡはＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５α（東洋紡績株式会社）にトランスフォーメーションして増幅した後、ＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｇｉｇａ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ株式会社）を用いて精製した。 pHMCMV5 / OVA is E. coli. After being transformed into E. coli strain DH5α (Toyobo Co., Ltd.) and amplified, it was purified using QIAGEN Plasmid Giga Kit (QIAGEN Corporation).
（皮膚内溶解型マイクロニードルの作製方法）
図１に本実施例のマイクロニードルの断面図を示す。本実施例で用いたマイクロニードルの材質とマイクロニードルに含めた薬物をまとめて表１に示す。マイクロニードルの材質は、マイクロニードルを構成する３成分の質量比で示す。抗原の濃度は、マイクロニードル質量に対する質量％で示す。(Method for producing skin-soluble microneedle)
FIG. 1 shows a cross-sectional view of the microneedle of the present embodiment. Table 1 summarizes the materials of the microneedles used in this example and the drugs included in the microneedles. The material of the microneedle is indicated by the mass ratio of the three components constituting the microneedle. The concentration of the antigen is indicated by mass% with respect to the mass of the microneedle.
本実施例で用いられているヒアルロン酸は（株）紀文フードケミファ製でその分子量は８０万（商品名：ＦＣＨ−８０ＬＥ）、デキストランは日本バルク薬品（株）製（商品名：デキストラン７０）、ポリビニルピロリドンはＢＡＳＦジャパン製（商品名：コリドン１２ＰＦ）である。また、本発明において分子量とは重量平均分子量であり、ゲルパーミェーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）により測定された量をいう。 Hyaluronic acid used in this example is manufactured by Kibun Food Chemifa Co., Ltd., and its molecular weight is 800,000 (trade name: FCH-80LE). Dextran is manufactured by Nippon Bulk Chemicals Co., Ltd. (trade name: Dextran 70). Polyvinylpyrrolidone is manufactured by BASF Japan (trade name: Kollidon 12PF). Moreover, in this invention, molecular weight is a weight average molecular weight and means the quantity measured by gel permeation chromatography (GPC).
マイクロニードルは、根元直径０．２ｍｍ、先端直径０．０４ｍｍ、長さ０．８ｍｍの円錐台状であり、０．８ｍｍ間隔に格子状に配列されており、１ｃｍ２の円形パッチ型アレイでありマイクロニードルは１４４個形成されている。
各素材組成の混合物を水に溶解させて１０％固形分水溶液とした。この水溶液にＯＶＡ発現プラスミドを添加し、室温下マイクロニードル形成用凹部に充填し水分を蒸発して乾燥した後剥離してマイクロニードルアレイを製造した。
また、別の製造法として、マイクロニードルパッチを成形し、その針先をＤＮＡを溶解したヒアルロン酸水溶液に浸漬した後乾燥させて針先にＤＮＡを含有するマイクロニードルを製造することもできる（溶着法）。The microneedles have a truncated cone shape with a root diameter of 0.2 mm, a tip diameter of 0.04 mm, and a length of 0.8 mm, and are arranged in a grid at intervals of 0.8 mm, and are 1 cm 2 circular patch type arrays. 144 microneedles are formed.
A mixture of each material composition was dissolved in water to obtain a 10% solid content aqueous solution. An OVA expression plasmid was added to this aqueous solution, filled in a recess for forming a microneedle at room temperature, dried by evaporating water, and then peeled off to produce a microneedle array.
As another manufacturing method, a microneedle patch can be formed, and the needle tip can be immersed in a hyaluronic acid aqueous solution in which DNA is dissolved and then dried to produce a microneedle containing DNA at the needle tip (welding). Law).
針部に３μｇのｐＨＭＣＭＶ５／ＯＶＡを装填した針長８００μｍのマイクロニードル（ＭＨ８００−ｐＨＭＣＭＶ５／ＯＶＡ）、ならびに針部に１０μｇのＯＶＡ蛋白質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ株式会社）を装填した針長８００μｍのマイクロニードル（ＭＨ８００−ＯＶＡ）を上に述べた方法に従って作製した。なお、ｐＨＭＣＭＶ５／ＯＶＡおよびＯＶＡ蛋白質の含量は、それぞれＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ株式会社）およびＥＬＩＳＡ法にて定量した。 A microneedle (MH800-pHMCMV5 / OVA) having a needle length of 3 μg loaded with 3 μg of pHMCMV5 / OVA, and a microneedle having a needle length of 800 μm (MH800-pHMCMV5 / OVA) loaded with 10 μg of OVA protein (Sigma-Aldrich). MH800-OVA) was made according to the method described above. The contents of pHMCMV5 / OVA and OVA protein were quantified by PicoGreen assay kit (Molecular Probes) and ELISA method, respectively.
（ワクチン接種方法）
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの除毛した背部皮膚にＭＨ８００−ｐＨＭＣＭＶ５／ＯＶＡあるいはＭＨ８００−ＯＶＡを６時間貼付した。この免疫操作を２週間隔で３回繰り返し、経日的に血清を回収した。また対照群のマウスには、同様のスケジュールで３μｇのｐＨＭＣＭＶ５／ＯＶＡを大腿外側に筋肉内注射した。なお、ＭＨ８００−ｐＨＭＣＭＶ５／ＯＶＡとＭＨ８００−ＯＶＡとではマイクロニードル当たりの薬物量が異なるが、両薬物は作用機構が異なるため、免疫操作の有効性を薬物投与量基準で判断することは困難である。(Vaccination method)
MH800-pHMCMV5 / OVA or MH800-OVA was affixed to the dorsal skin of C57BL / 6 mice for 6 hours. This immunization operation was repeated 3 times at 2-week intervals, and serum was collected over time. The control group of mice was injected intramuscularly with 3 μg of pHMCMV5 / OVA on the outer thigh on the same schedule. In addition, although the drug amount per microneedle is different between MH800-pHMCMV5 / OVA and MH800-OVA, since both drugs have different mechanisms of action, it is difficult to judge the effectiveness of immunization on the basis of drug dosage. .
（血清中ＯＶＡ特異的抗体価の測定方法）
血清中のＯＶＡ特異的抗体価はＥＬＩＳＡ法により測定した。５０ｍＭ ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．６）に溶解したＯＶＡを０．５μｇ／５０μｌ／ｗｅｌｌで９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに分注し、４℃で一晩インキュベーションすることでＯＶＡの固相化を行った。ブロッキング処理は、４％ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社）溶液を２００μｌ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃で２時間インキュベーションすることにより行った。血清検体を０．４％ブロックエース／ＴＢＳ−Ｔ（Ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて連続２倍希釈し、ブロッキング液を除去したプレートに各希釈血清検体を５０μｌ／ｗｅｌｌ添加した。室温で２時間インキュベーションし、各ウェルをＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ株式会社）、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ１抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ株式会社）、あるいはＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ２ｃ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ株式会社）を５０μｌ／ｗｅｌｌで添加した。なお、各ＨＲＰ標識抗体は０．４％ブロックエース／ＴＢＳ−Ｔでメーカー推奨濃度に希釈して使用した。(Method for measuring serum OVA-specific antibody titer)
The serum OVA-specific antibody titer was measured by ELISA. OVA dissolved in 50 mM bicarbonate buffer (pH 9.6) was dispensed into a 96-well ELISA plate at 0.5 μg / 50 μl / well and incubated overnight at 4 ° C. to immobilize OVA. The blocking treatment was performed by adding 200 μl / well of 4% Block Ace (DS Pharma Biomedical) solution and incubating at 37 ° C. for 2 hours. Serum specimens were serially diluted 2-fold using 0.4% Block Ace / TBS-T (Tris-buffered saline containing 0.05% Tween 20), and each diluted serum specimen was added to the plate from which the blocking solution was removed at 50 μl / well. . After incubating at room temperature for 2 hours and washing each well 3 times with TBS-T, Horseradish peroxidase (HRP) -labeled goat anti-mouse IgG antibody (Southern Biotech), HRP-labeled goat anti-mouse IgG1 antibody (Southern Biotech, Inc.) ) Or HRP-labeled goat anti-mouse IgG2c antibody (Southern Biotech Co., Ltd.) was added at 50 μl / well. Each HRP-labeled antibody was diluted with 0.4% Block Ace / TBS-T to the concentration recommended by the manufacturer.
プレートを室温で２時間インキュベーションし、各ウェルをＴＢＳ−Ｔで３回洗浄後、ＨＲＰ基質溶液（ＴＭＢ，ｕｌｔｒａ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ；Ｍｏｓｓ株式会社）を１００μｌ／ｗｅＩｌ添加した。適当な発色が認められるまでプレートを室温でインキュベーションした後、反応停止液として２Ｎ Ｈ２ＳＯ４を５０μｌ／ｗｅｌｌ添加し、主波長４５０ｎｍ、副波長６５５ｎｍにて吸光度を測定した。各血清検体のＯＶＡ特異的抗体価は、無免疫マウスの同倍希釈血清検体よりも吸光度が０．１以上高い値を示す最大希釈倍率（２−ｘ）について、その逆数（２Ｘ）の２を底とする対数（ｌｏｇ２２ｘ＝Ｘ）を算出し、その値をＲｅｃｉｐｒｏｃａｌ ｌｏｇ２ ｔｉｔｅｒとして表わした。The plate was incubated at room temperature for 2 hours, and each well was washed 3 times with TBS-T, and then HRP substrate solution (TMB, ultra sensitive; Moss Inc.) was added at 100 μl / weIl. After incubating the plate at room temperature until appropriate color development was observed, 50 μl / well of 2N H 2 SO 4 was added as a reaction stop solution, and the absorbance was measured at a main wavelength of 450 nm and a sub wavelength of 655 nm. The OVA-specific antibody titer of each serum sample is 2 of its reciprocal (2 X ) with respect to the maximum dilution factor (2- x ) showing an absorbance 0.1 or more higher than that of the same-diluted serum sample of non-immunized mice. Logarithm (log 2 2 x = X) was calculated, and the value was expressed as Reciprocal log 2 titer.
本実験において測定した血清中ＯＶＡ特異的抗体価の推移を図２にまとめた。
ＭＨ８００−ｐＨＭＣＭＶ５／ＯＶＡを用いて経皮ワクチンしたマウスにおいては、１回のワクチン接種で血清中にＯＶＡ特異的ＩｇＧ抗体の産生が検出され、そのレベルは従来のＤＮＡワクチン（ｐＨＭＣＭＶ５／ＯＶＡの筋肉内注射）を受けたマウスと同等であった。しかしながら、これらＤＮＡワクチンを施した両群のＯＶＡ特異的ＩｇＧ抗体価は、ＯＶＡ蛋白質を経皮ワクチンした群（ＭＨ８００−ＯＶＡ群）の抗体価と比較すると明らかに低値であった。またＭＨ８００−ＯＶＡ群では複数回のワクチン接種によってＯＶＡ特異的ＩｇＧ抗体価の明らかな上昇（ブースト効果）が認められたのに対して、ＤＮＡワクチンの二群では２回目ワクチン接種以降の抗体価は初回ワクチン接種後と比較して大きな変化はなかった。したがって、プラスミドＤＮＡの投与経路の差異に拘わらず、ＤＮＡワクチンは蛋白質抗原を用いたワクチン手法と比較して抗体産生（体液性免疫応答）が誘導されにくいのではないかと推察された。Changes in serum OVA-specific antibody titers measured in this experiment are summarized in FIG.
In mice transdermally vaccinated with MH800-pHMCMV5 / OVA, the production of OVA-specific IgG antibodies in serum was detected with a single vaccination, the level of which was compared to that of a conventional DNA vaccine (pHMCMV5 / OVA intramuscular Injection). However, the OVA-specific IgG antibody titers of both groups subjected to these DNA vaccines were clearly lower than the antibody titers of the group (MH800-OVA group) transdermally vaccinated with OVA protein. In the MH800-OVA group, an obvious increase (boost effect) of the OVA-specific IgG antibody titer was observed by multiple vaccinations, whereas in the two groups of DNA vaccines, the antibody titers after the second vaccination were There was no significant change compared to after the first vaccination. Therefore, it was presumed that DNA vaccines are less likely to induce antibody production (humoral immune response) than vaccine methods using protein antigens, regardless of the administration route of plasmid DNA.
そこで、ＤＮＡワクチンと蛋白質ワクチンの免疫誘導特性を比較する足掛かりとして、血清中ＯＶＡ特異的ＩｇＧ抗体のサブクラス解析を行った。ＭＨ８００−ｐＨＭＣＭＶ５／ＯＶＡ群ならびにｐＨＭＣＭＶ５／ＯＶＡ筋肉内注射群においては、Ｔｈ１型サブクラスとされるＩｇＧ２ｃの抗体価上昇は認められたものの、Ｔｈ２型サブクラスであるＩｇＧ１の抗体価については検出限界以下であった。一方、ＭＨ８００−ＯＶＡ群においてはＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃともに抗体価の上昇が認められ、それらのレベルはＴｈ２型であるＩｇＧ１が優位な傾向にあった。したがって、ＤＮＡワクチンは蛋白質ワクチンと比較するとＴｈ２免疫応答（体液性免疫応答）よりもむしろＴｈ１免疫応答（細胞性免疫応答）へと偏向した免疫誘導特性を有する可能性が示唆された。 Therefore, as a starting point for comparing the immunity induction characteristics of DNA vaccine and protein vaccine, subclass analysis of serum OVA-specific IgG antibody was performed. In the MH800-pHMCMV5 / OVA group and the pHMCMV5 / OVA intramuscular injection group, although an antibody titer of IgG2c, which is a Th1-type subclass, was observed, the antibody titer of IgG1, a Th2-type subclass, was below the detection limit. It was. On the other hand, in the MH800-OVA group, an increase in antibody titer was observed for both IgG1 and IgG2c, and the level of those IgG1 that was Th2 type tended to be dominant. Therefore, it was suggested that the DNA vaccine may have immune-inducing properties that are biased toward a Th1 immune response (cellular immune response) rather than a Th2 immune response (humoral immune response) as compared to a protein vaccine.
以上を総合すると、マイクロニードルを応用したＤＮＡ経皮ワクチンは、免疫誘導機序ならびに免疫応答特性に関する詳細な解析が必要とされるものの、従来の注射によるＤＮＡワクチンと同等の抗原特異的免疫応答を誘導できることが実証された。またＤＮＡ経皮ワクチンが細胞性免疫応答を優位に活性化できる可能性が示されたことは、ウイルス感染症や癌などのように予防や治療に細胞性免疫の働きが必要となる疾患への本アプローチの応用も期待される。 In summary, DNA transcutaneous vaccines using microneedles require antigenic immune responses equivalent to conventional DNA vaccines, although detailed analysis of immune induction mechanisms and immune response characteristics is required. It was demonstrated that it can be induced. In addition, the possibility that DNA transcutaneous vaccines can activate cellular immune responses preferentially has been shown to prevent diseases such as viral infections and cancers that require cellular immunity for prevention and treatment. Applications of this approach are also expected.
図２中のｐＨＭＣＭＶ５／ＯＶＡ：プラスミドの名称は次の通りである。
ｋｂｐ：キロベースペア。塩基数を表す単位で１ｋｂｐは１０００塩基対のこと。
ＯＶＡ：ニワトリ卵白アルブミンのｃＤＮＡ配列。
Ｏｒｉ：プラスミドの複製起点となる配列。
ＭＣＳ：マルチクローニングサイトの配列。様々な制限酵素に認識される配列が存在する部位であり、適当な制限酵素で切断することによって外来のＤＮＡ配列をプラスミドに挿入する。
Ｋａｎ「：カナマイシン耐性遺伝子（アミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ）の配列。
ＣＭＶ：サイトメガロウイルスプロモーターの配列。真核生物において下流の遺伝子のｍＲＮＡ合成（転写）を開始させる。
ＢＧＨＰ（Ａ）：ウシ成長ホルモン由来ポリＡ付加シグナルの配列。遺伝子から転写されたｍＲＮＡの３’末端側にポリＡ配列を付加する。
残りの記号は全て制限酵素の名称であり、それぞれの制限酵素で切断される配列の存在を示しています。（数字）が付いているものはプラスミド内に複数（数字）の切断箇所があることを表します。PHMCMV5 / OVA: plasmid names in FIG. 2 are as follows.
kbp: kilobase pair. A unit representing the number of bases, 1 kbp is 1000 base pairs.
OVA: cDNA sequence of chicken ovalbumin.
Ori: Sequence that serves as a replication origin of a plasmid.
MCS: Sequence of multiple cloning site. This is a site where sequences recognized by various restriction enzymes are present, and a foreign DNA sequence is inserted into a plasmid by cutting with an appropriate restriction enzyme.
Kan " : Sequence of kanamycin resistance gene (aminoglycoside 3'-phosphotransferase).
CMV: Sequence of cytomegalovirus promoter. Initiates mRNA synthesis (transcription) of downstream genes in eukaryotes.
BGHP (A): Sequence of bovine growth hormone-derived poly A addition signal. A poly A sequence is added to the 3 ′ end of the mRNA transcribed from the gene.
The remaining symbols are all restriction enzyme names and indicate the presence of sequences cleaved by the respective restriction enzymes. The ones with (numbers) indicate that there are multiple (numbers) cuts in the plasmid.
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018217897A1 (en) * | 2017-05-23 | 2018-11-29 | David Weiner | Compositions and method for inducing an immune response |
| US10603477B2 (en) | 2014-03-28 | 2020-03-31 | Allergan, Inc. | Dissolvable microneedles for skin treatment |
| CN112716885A (en) * | 2021-01-13 | 2021-04-30 | 上海行渝生物科技有限公司 | Nucleic acid micro needle and preparation method and application thereof |
| US11065428B2 (en) | 2017-02-17 | 2021-07-20 | Allergan, Inc. | Microneedle array with active ingredient |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005526016A (en) * | 2002-01-25 | 2005-09-02 | グラクソ グループ リミテッド | DNA dosage form |
| JP2008505685A (en) * | 2004-07-06 | 2008-02-28 | トランスファーマ メディカル リミテッド | Transdermal immunization delivery system |
| WO2009014382A2 (en) * | 2007-07-23 | 2009-01-29 | Postech Academy-Industry Foundation | Cxcl11 adjuvant compositions and uses thereof |
| WO2009079712A1 (en) * | 2007-12-24 | 2009-07-02 | The University Of Queensland | Coating method |
| WO2010074239A1 (en) * | 2008-12-26 | 2010-07-01 | 久光製薬株式会社 | Microneedle device |
| WO2010140401A1 (en) * | 2009-06-03 | 2010-12-09 | 株式会社バイオセレンタック | Microneedle array using porous substrate and process for producing same |
| JP2011224308A (en) * | 2010-04-21 | 2011-11-10 | Kosumedei Seiyaku Kk | Microneedle welding method |
-
2011
- 2011-09-01 JP JP2011205253A patent/JP2013052202A/en active Pending
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005526016A (en) * | 2002-01-25 | 2005-09-02 | グラクソ グループ リミテッド | DNA dosage form |
| JP2008505685A (en) * | 2004-07-06 | 2008-02-28 | トランスファーマ メディカル リミテッド | Transdermal immunization delivery system |
| WO2009014382A2 (en) * | 2007-07-23 | 2009-01-29 | Postech Academy-Industry Foundation | Cxcl11 adjuvant compositions and uses thereof |
| WO2009079712A1 (en) * | 2007-12-24 | 2009-07-02 | The University Of Queensland | Coating method |
| US20110059150A1 (en) * | 2007-12-24 | 2011-03-10 | The University Of Queensland | Coating method |
| WO2010074239A1 (en) * | 2008-12-26 | 2010-07-01 | 久光製薬株式会社 | Microneedle device |
| WO2010140401A1 (en) * | 2009-06-03 | 2010-12-09 | 株式会社バイオセレンタック | Microneedle array using porous substrate and process for producing same |
| JP2011224308A (en) * | 2010-04-21 | 2011-11-10 | Kosumedei Seiyaku Kk | Microneedle welding method |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10603477B2 (en) | 2014-03-28 | 2020-03-31 | Allergan, Inc. | Dissolvable microneedles for skin treatment |
| US10987503B2 (en) | 2014-03-28 | 2021-04-27 | Allergan, Inc. | Dissolvable microneedles for skin treatment |
| US11065428B2 (en) | 2017-02-17 | 2021-07-20 | Allergan, Inc. | Microneedle array with active ingredient |
| WO2018217897A1 (en) * | 2017-05-23 | 2018-11-29 | David Weiner | Compositions and method for inducing an immune response |
| CN112716885A (en) * | 2021-01-13 | 2021-04-30 | 上海行渝生物科技有限公司 | Nucleic acid micro needle and preparation method and application thereof |
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