JP2013043862A - Composition for treating prostatic cancer, and screening method of active ingredient in composition for treating prostatic cancer - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼキナーゼ２（CAMKK2）又はCAMKK2遺伝子を有効成分とする前立腺癌治療組成物並びに前立腺癌治療組成物の有効成分のスクリーニング方法に関する。 The present invention relates to a prostate cancer treatment composition containing calcium / calmodulin-dependent protein kinase kinase 2 (CAMKK2) or CAMKK2 gene as an active ingredient, and a method for screening an active ingredient of the prostate cancer treatment composition.
前立腺癌（ＰＣａ）は最も多く見られる悪性腫瘍であり、米国男性の癌関連死では２番目に多い原因である（非特許文献１）。初期の進行性ＰＣａはアンドロゲン依存性であることから、進行性ＰＣａにはアンドロゲン遮断療法（ＡＤＴ）が初めに選択される。ＡＤＴの一例である、去勢及び抗アンドロゲン剤の併用により、症状の改善又は前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の減少は前立腺癌患者の９０％以上に見られる。しかしながら、ＡＤＴで最初に反応した後、最終的にＰＣａはアンドロゲン遮断への応答性を失い、去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）へ進行してしまう。 Prostate cancer (PCa) is the most common malignant tumor and is the second most common cause of cancer-related death in US men (Non-patent Document 1). Because early progressive PCa is androgen dependent, androgen block therapy (ADT) is initially selected for advanced PCa. An example of ADT, castration and a combination of antiandrogens, improves symptoms or reduces prostate specific antigen (PSA) in more than 90% of prostate cancer patients. However, after first reacting with ADT, PCa eventually loses responsiveness to androgen blockade and progresses to castration resistant prostate cancer (CRPC).
ＣＲＰＣへの進行を説明できる多分子機序が提示されており、ＰＣａ進行における重要な媒介物質としてアンドロゲン受容体（AR）が関与していると考えられている（非特許文献２、３）
特に、ＰＣａのアンドロゲン過敏状態は、副腎から分泌されるアンドロゲンの去勢レベルへ適合することに重要な役割を担っている。さらに、ＰＣａ又は骨転移領域における腫瘍内アンドロゲン合成によっても、アンドロゲン過敏性ＰＣａ細胞が生存及び増殖するに十分なアンドロゲンが供給されている（非特許文献４、５）。
A multimolecular mechanism that can explain the progression to CRPC has been presented, and androgen receptor (AR) is considered to be involved as an important mediator in PCa progression (Non-patent Documents 2 and 3).
In particular, the androgen hypersensitivity state of PCa plays an important role in meeting the castration level of androgen secreted from the adrenal gland. In addition, androgen synthesis sufficient for survival and proliferation of androgen-sensitive PCa cells is also provided by intratumoral androgen synthesis in PCa or bone metastatic regions (Non-patent Documents 4 and 5).
一方、前立腺組織内には、副腎性アンドロゲンであるデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ：Dehydroepiandrosterone）を活性型男性ホルモン（DHT）に変換するための多くの代謝酵素の存在が確認されている。ＤＨＥＡはホルモン療法によってそれほど変化を受けないが、ホルモン治療後にも前立腺癌組織内でＤＨＥＡからDHTに変換されることが、血清中より組織中にDHTが高濃度で存在している理由と考えられている。 On the other hand, the presence of many metabolic enzymes for converting adrenal androgen, dehydroepiandrosterone (DHEA) into active male hormone (DHT), has been confirmed in prostate tissue. Although DHEA is not significantly affected by hormone therapy, the fact that DHEA is converted to DHT in prostate cancer tissue after hormone treatment is considered to be the reason that DHT is present in tissues at a higher concentration than in serum. ing.
下記記載のように前立腺癌の治療等に関する報告は存在する。
特許文献１は、「前立腺由来間質細胞を使用した新規な酵素活性測定法に関するものであり、さらには、酵素阻害剤の評価方法」を開示している。
特許文献２は、「ヒトTMP-2蛋白質に対する抗体を含む製剤学的組成物を処置を要求される患者に投与することを特徴とする前立腺癌の治療方法」を開示している。
There are reports on the treatment of prostate cancer as described below.
Patent Document 1 discloses “a novel enzyme activity measurement method using prostate-derived stromal cells, and further an enzyme inhibitor evaluation method”.
Patent Document 2 discloses “a method for treating prostate cancer, which comprises administering a pharmaceutical composition containing an antibody against human TMP-2 protein to a patient who requires treatment”.
上記いずれの文献は、「CAMKK2又はCAMKK2遺伝子を有効成分とする前立腺癌治療組成物並びに前立腺癌治療の有効成分のスクリーニング方法」について開示又は示唆がない。 None of the above references disclose or suggest “a composition for treating prostate cancer containing CAMKK2 or CAMKK2 gene as an active ingredient and a method for screening an active ingredient for treating prostate cancer”.
以上により、新規な前立腺癌の治療剤、特にＣＲＰＣの治療剤の開発が望まれている。 As described above, development of a novel prostate cancer therapeutic agent, particularly a CRPC therapeutic agent is desired.
本発明は、上記した問題点を解決することを解決すべき課題とした。より詳しくは、新規な前立腺癌の治療剤、特にＣＲＰＣの治療剤を提供することを解決すべき課題とした。 This invention made it the subject which should solve solving the above-mentioned problem. More specifically, an object to be solved is to provide a novel therapeutic agent for prostate cancer, particularly a therapeutic agent for CRPC.
従来の知見では、前立腺癌において、CAMKK2の発現が上昇することにより、癌細胞が浸潤・遊走することにより癌が進行することが知られていた（参照：Cancer Res Jan 15,2011）。
しかし、本発明者らは、上記従来の知見とはまったく異なり、「前立腺癌、特に去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）において、CAMKK2遺伝子の発現が上昇することにより、癌細胞の増殖を抑制すること並びにアンドロゲン受容体の感受性を弱めることができること」を見出したことを基にして、本発明を完成した。
According to the conventional knowledge, it has been known that, in prostate cancer, cancer progresses as cancer cells invade and migrate due to increased expression of CAMKK2 (see: Cancer Res Jan 15,2011).
However, the present inventors are completely different from the above-mentioned conventional findings, “in prostate cancer, particularly castration-resistant prostate cancer (CRPC), it suppresses the growth of cancer cells by increasing the expression of CAMKK2 gene. In addition, the present invention has been completed based on the finding that the sensitivity of the androgen receptor can be reduced.
すなわち、本発明は以下の通りである。
「１．カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼキナーゼ２（CAMKK2）若しくはCAMKK2同等物、並びに／又はCAMKK2遺伝子若しくはCAMKK2遺伝子同等物を有効成分として含む前立腺癌の予防・治療剤。
２．前記前立腺癌は、去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）である前項１の前立腺癌の予防・治療剤。
３．以下の工程を含む前立腺癌の予防・治療効果を有する物質のスクリーニング方法。
（１）候補物質を前立腺癌細胞に導入する工程
（２）該細胞中のCAMKK2又はCAMKK2遺伝子の発現量を測定する工程
４．前記前立腺癌細胞は、CAMKK2又はCAMKK2遺伝子を導入していることを特徴とする前項３のスクリーニング方法。
５．前記発現量の測定は、前記候補物質を導入した前立腺癌細胞のCAMKK2又はCAMKK2遺伝子の発現量を、前記候補物質を導入していない前立腺癌細胞のCAMKK2又はCAMKK2遺伝子の発現量と比較することを特徴とする前項３又は４のスクリーニング方法。
６．前立腺癌患者から得られた前立腺組織のCAMKK2陽性領域を測定する工程を含む前立腺癌の予後検査方法。」
That is, the present invention is as follows.
“1. A prophylactic / therapeutic agent for prostate cancer comprising calcium / calmodulin-dependent protein kinase kinase 2 (CAMKK2) or CAMKK2 equivalent and / or CAMKK2 gene or CAMKK2 gene equivalent as an active ingredient.
2. 2. The preventive / therapeutic agent for prostate cancer according to 1 above, wherein the prostate cancer is castration resistant prostate cancer (CRPC).
3. A screening method for a substance having a prophylactic / therapeutic effect on prostate cancer, comprising the following steps.
(1) Step of introducing candidate substance into prostate cancer cell (2) Step of measuring the expression level of CAMKK2 or CAMKK2 gene in the cell 4. The screening method according to item 3 above, wherein the prostate cancer cell has introduced CAMKK2 or CAMKK2 gene.
5. The measurement of the expression level is to compare the expression level of CAMKK2 or CAMKK2 gene in prostate cancer cells into which the candidate substance has been introduced with the expression level of CAMKK2 or CAMKK2 gene in prostate cancer cells into which the candidate substance has not been introduced. 5. The screening method according to item 3 or 4 above.
6). A method for prognosing prostate cancer, comprising a step of measuring a CAMKK2-positive area of prostate tissue obtained from a prostate cancer patient. "
本発明の前立腺癌の予防・治療剤は、優れた前立腺癌細胞の増殖抑制効果を示した。
さらに、本発明の前立腺癌の予防・治療剤は、アンドロゲン受容体の感受性の高いＣＲＰＣでも前立腺癌細胞の増殖抑制効果を示す。
The preventive / therapeutic agent for prostate cancer of the present invention showed an excellent effect of suppressing the proliferation of prostate cancer cells.
Furthermore, the prostatic cancer prophylactic / therapeutic agent of the present invention exhibits an effect of suppressing the proliferation of prostate cancer cells even with CRPC having high androgen receptor sensitivity.
本発明は、下記実施例により、前立腺癌細胞でCAMKK2を発現させることにより、癌細胞増殖を抑制すること、アンドロゲン受容体の感受性を弱めることができること、並びに前立腺癌患者から得られた前立腺組織のCAMKK2陽性領域が少ないと予後不良を起こすことを新規に見出したことに基づいている。 The present invention, according to the following examples, expresses CAMKK2 in prostate cancer cells, thereby suppressing cancer cell proliferation, reducing androgen receptor sensitivity, and prostate tissue obtained from prostate cancer patients. This is based on the new discovery that poor CAMKK2-positive areas cause poor prognosis.
（前立腺癌の予防・治療剤）
本発明の前立腺癌の予防・治療剤は、有効成分としてCAMKK2若しくはCAMKK2同等物、並びに／又はCAMKK2遺伝子若しくはCAMKK2遺伝子同等物を含む。
さらに、本発明の前立腺癌の予防・治療剤は、特に従来治療が困難であった去勢抵抗性前立腺癌にも効果がある。
(Preventive and therapeutic agent for prostate cancer)
The preventive / therapeutic agent for prostate cancer of the present invention contains CAMKK2 or CAMKK2 equivalent and / or CAMKK2 gene or CAMKK2 gene equivalent as active ingredients.
Furthermore, the preventive / therapeutic agent for prostate cancer of the present invention is also effective for castration resistant prostate cancer, which has been difficult to treat with conventional methods.
（その他の癌の予防・・治療剤）
有効成分としてCAMKK2若しくはCAMKK2同等物、並びに／又はCAMKK2遺伝子若しくはCAMKK2遺伝子同等物を含む組成物は、下記の癌の予防・治療にも効果があると考えられる。
大腸癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、卵巣癌、子宮体癌、胃癌、脳腫瘍、肝癌、膵臓癌、食道癌、腎臓癌。
(Other cancer preventive and therapeutic agents)
A composition containing CAMKK2 or CAMKK2 equivalent as an active ingredient, and / or CAMKK2 gene or CAMKK2 gene equivalent is considered to be effective for the following cancer prevention and treatment.
Colorectal cancer, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, cervical cancer, ovarian cancer, endometrial cancer, stomach cancer, brain tumor, liver cancer, pancreatic cancer, esophageal cancer, kidney cancer.
CAMKK2は、市販品、又は天然由来、人工合成由来、大腸菌等タンパク質合成系由来等のいずれでも良い。加えて、天然由来の遺伝子に基づいて変異を導入して得たものであってもよい。変異を導入する手段は自体公知であり、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法又はポリメラーゼ連鎖反応等を単独で又は適宜組合せて使用できる。 CAMKK2 may be a commercially available product, a natural product, a synthetic product, or a protein synthesis system such as E. coli. In addition, it may be obtained by introducing a mutation based on a naturally derived gene. Means for introducing mutations are known per se, and for example, site-specific mutagenesis, gene homologous recombination, primer extension, polymerase chain reaction and the like can be used alone or in appropriate combination.
また、CAMKK2同等物は、以下を含む。
（１）CAMKK2機能を少なくも維持しているが、CAMKK2との構造を比較して、アミノ酸配列に１ないし数十個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入等がされているアミノ酸配列。
（２）CAMKK2機能を少なくも維持しているが、CAMKK2との構造を比較して、アミノ酸相同性が90%以上であるアミノ酸配列。
（３）CAMKK2の保護化誘導体、糖鎖修飾体、アシル化誘導体、又はアセチル化誘導体
なお、基本的な性質（CAMKK2機能）を変化させないという観点からは、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸及び芳香族アミノ酸等）の間での相互の置換は容易に想定される。
CAMKK2 equivalents also include:
(1) An amino acid sequence that maintains CAMKK2 function at least, but has a substitution, deletion, addition, or insertion of one to several tens of amino acids in the amino acid sequence by comparing the structure with CAMKK2. .
(2) An amino acid sequence that maintains at least CAMKK2 function, but has an amino acid homology of 90% or more by comparing the structure with CAMKK2.
(3) Protected derivative, sugar chain modified, acylated derivative, or acetylated derivative of CAMKK2 From the viewpoint of not changing the basic properties (CAMKK2 function), for example, homologous amino acids (polar amino acids, nonpolar) Mutual substitution between amino acids, hydrophobic amino acids, hydrophilic amino acids, positively charged amino acids, negatively charged amino acids, aromatic amino acids, etc.) is readily envisioned.
CAMKK2遺伝子同等物は、以下を含む。
（１）CAMKK2遺伝子と比較して、１ないし数十個の塩基配列が置換、欠失、付加、又は挿入等がされている塩基配列。
（２）CAMKK2遺伝子と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつCAMKK2機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
なお、「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起き、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件を意味する。
CAMKK2 gene equivalents include:
(1) A nucleotide sequence in which 1 to several tens of nucleotide sequences are substituted, deleted, added, inserted or the like compared to the CAMKK2 gene.
(2) A nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a nucleotide sequence complementary to the CAMKK2 gene and encodes a polypeptide having a CAMKK2 function.
The “stringent condition” means a condition in which only specific hybridization occurs and non-specific hybridization does not occur.
（前立腺癌の予防・治療効果を有する物質のスクリーニング方法）
本発明の前立腺癌の予防・治療効果を有する物質のスクリーニング方法では、少なくとも以下の工程を含む。
（１）候補物質を前立腺癌細胞に導入する工程
（２）該細胞中のCAMKK2又はCAMKK2遺伝子の発現量を測定する工程
なお、前立腺癌細胞には、スクリーニング工程の前、後、及び／又は途中に、CAMKK2又はCAMKK2遺伝子を前立腺癌細胞に形質導入しても良い。
加えて、CAMKK2又はCAMKK2遺伝子の発現量の測定は、好ましくは、前記候補物質を導入した前立腺癌細胞のCAMKK2又はCAMKK2遺伝子の発現量を、前記候補物質を導入していない前立腺癌細胞のCAMKK2又はCAMKK2遺伝子の発現量と比較する。
(Screening method for substances having preventive and / or therapeutic effects on prostate cancer)
The method for screening a substance having a prophylactic / therapeutic effect on prostate cancer of the present invention includes at least the following steps.
(1) Step of introducing candidate substance into prostate cancer cell (2) Step of measuring expression level of CAMKK2 or CAMKK2 gene in the cell In addition, before and after the screening step, and / or during the prostate cancer cell In addition, CAMKK2 or CAMKK2 gene may be transduced into prostate cancer cells.
In addition, the measurement of the expression level of CAMKK2 or CAMKK2 gene is preferably performed by measuring the expression level of CAMKK2 or CAMKK2 gene in prostate cancer cells into which the candidate substance has been introduced, or CAMKK2 in prostate cancer cells into which the candidate substance has not been introduced. Compare with the expression level of CAMKK2 gene.
本発明で用いる候補物質としては任意の物質を使用することができる。候補物質の種類は特に限定されず、個々の低分子合成化合物、天然物抽出物中に存在する化合物でもよく、合成ペプチドでもよい。あるいは、候補物質はまた、化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリーもしくはコンビナトリアルライブラリーでもよい。候補物質は、好ましくは低分子化合物であり、低分子化合物の化合物ライブラリーが好ましい。化合物ライブラリーの構築は当業者に公知であり、また市販の化合物ライブラリーを使用することもできる。 Any substance can be used as a candidate substance used in the present invention. The types of candidate substances are not particularly limited, and may be individual low-molecular synthetic compounds, compounds present in natural product extracts, or synthetic peptides. Alternatively, the candidate substance may also be a compound library, a phage display library or a combinatorial library. The candidate substance is preferably a low molecular compound, and a compound library of low molecular compounds is preferable. The construction of a compound library is known to those skilled in the art, and a commercially available compound library can also be used.
（前立腺癌の予防・治療剤の組成）
本発明の前立腺癌の予防・治療剤の組成は、有効成分として、CAMKK2若しくはCAMKK2同等物、及び／又はCAMKK2遺伝子若しくはCAMKK2遺伝子同等物、並びに／又は、上記スクリーニング方法により得られた前立腺癌の予防・治療効果を有する物質を有効成分として含む。
さらに、予防又は治療等の目的に応じて、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、腸溶剤、液剤、注射剤（液剤、懸濁剤）又は遺伝子療法に用いる形態などの各種の形態に、常法にしたがって調製することができる。本発明の前立腺癌の予防・治療剤は、通常は１種又は複数の医薬用担体を用いて医薬組成物として製造することが好ましい。
(Composition of preventive and therapeutic agent for prostate cancer)
The composition of the preventive / therapeutic agent for prostate cancer of the present invention comprises, as an active ingredient, CAMKK2 or CAMKK2 equivalent, and / or CAMKK2 gene or CAMKK2 gene equivalent, and / or prevention of prostate cancer obtained by the above screening method -A substance having a therapeutic effect is included as an active ingredient.
Furthermore, in various forms such as powders, granules, tablets, capsules, intestinal solvents, solutions, injections (solutions, suspensions) or forms used for gene therapy, depending on the purpose of prevention or treatment, etc. It can be prepared according to the method. The prostatic cancer prophylactic / therapeutic agent of the present invention is usually preferably prepared as a pharmaceutical composition using one or more pharmaceutical carriers.
本発明の前立腺癌の予防・治療剤の投与量又は摂取量については、本発明の効果が得られるものであれば特に限定されるものではなく、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状及び他の医薬の使用の有無等）、及び担当医師の判断等に応じて適宜選択される。本発明の前立腺癌の予防・治療剤は、１日１〜数回に分けて投与又は摂取することができ、数日又は数週間に１回の割合で間欠的に投与又は摂取してもよい。 The dose or intake of the prostatic cancer prophylactic / therapeutic agent of the present invention is not particularly limited as long as the effects of the present invention can be obtained, and the effectiveness of the components contained, the dosage form, the administration The route is selected as appropriate according to the route, the type of disease, the nature of the subject (weight, age, medical condition, presence / absence of use of other medicines, etc.) and the judgment of the doctor in charge. The prostatic cancer prophylactic / therapeutic agent of the present invention can be administered or ingested in 1 to several times a day, and may be intermittently administered or ingested once every several days or weeks. .
（前立腺癌の予後検査）
本発明の前立腺癌の予後検査とは、従来の検査方法とは異なり、前立腺癌患者から得られた前立腺組織のCAMKK2陽性領域を測定する。図１のＥから明らかなように、指定された領域中でのCAMKK2陽性領域割合が50％以上では、指定された領域中でのCAMKK2陽性領域割合が50％未満と比較して、ＡＤＴ後の生存率が有意に高いことを示している。
(Prognosis of prostate cancer)
Unlike the conventional test method, the prognosis test for prostate cancer of the present invention measures a CAMKK2-positive region of prostate tissue obtained from a prostate cancer patient. As is clear from E of FIG. 1, when the ratio of CAMKK2 positive area in the specified area is 50% or more, the ratio of CAMKK2 positive area in the specified area is less than 50%, after ADT. The survival rate is significantly high.
本発明の前立腺癌の予後検査では、ＡＤＴ後の患者由来の前立腺組織のCAMKK2陽性領域を測定して、基準値（例えば、50%）と比較することにより、予後不良の検査を行うことができる。 In the prognosis test of prostate cancer of the present invention, a prognosis test can be performed by measuring a CAMKK2-positive area of prostate tissue derived from a patient after ADT and comparing it with a reference value (for example, 50%). .
以下、本発明を、実施例を挙げてより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、下記実施例は金沢大学動物実験指針に基づいて行った。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated in detail, this invention is not limited to these. In addition, the following Example was performed based on the Kanazawa University animal experiment guideline.
（材料及び方法）
本実施例で使用した材料及び方法は、以下の通りである。
(Materials and methods)
The materials and methods used in this example are as follows.
（cDNAマイクロアレイ分析）
正常の前立腺組織及び前立腺癌組織間で示差発現している遺伝子を同定するために、cDNAマイクロアレイ分析により、正常前立腺組織の３検体及び前立腺癌組織の３検体間の発現遺伝子を比較した。cDNAマイクロアレイ分析は、Whole Human Genome Microarray 4x44K（Agilent Technologies）を用いて、DNA Chip Research Inc.（Kanagawa, Japan）に委託して行った。
(CDNA microarray analysis)
In order to identify genes differentially expressed between normal prostate tissue and prostate cancer tissue, cDNA microarray analysis was performed to compare the expressed genes between three samples of normal prostate tissue and three samples of prostate cancer tissue. cDNA microarray analysis was performed by DNA Chip Research Inc. (Kanagawa, Japan) using Whole Human Genome Microarray 4x44K (Agilent Technologies).
（使用した細胞）
LNCaP細胞及びVCaP細胞（American Type Culture Collection, Manassas, VA）は、1%ペニシリン／ストレプトマイシン並びに5％若しくは10%FBS（Fetal Bovine Serum）が添加されたDMEMで培養した。
CAMKK2過剰発現したLNCaP細胞を作製するために、LipofectamineTM試薬（Invitrogen）を使用して、0.5μg pCMV6-AC-GEP（OriGene Technologies, Rockville, MD, USA）又はpCMV6-AC-GEP- CAMKK2（OriGene Technologies, Rockville, MD, USA）をLNCaP細胞に形質導入した。導入８時間後において、該細胞を1200μg/ml G418（Sigma-Aldrich）を含む培地で培養して、GFP発現した又はGFP-CAMKK2過剰発現した細胞を取得した。
(Used cells)
LNCaP cells and VCaP cells (American Type Culture Collection, Manassas, VA) were cultured in DMEM supplemented with 1% penicillin / streptomycin and 5% or 10% FBS (Fetal Bovine Serum).
To produce LNCaP cells overexpressing CAMKK2, 0.5 μg pCMV6-AC-GEP (OriGene Technologies, Rockville, MD, USA) or pCMV6-AC-GEP-CAMKK2 (OriGene) using Lipofectamine ™ reagent (Invitrogen) Technologies, Rockville, MD, USA) were transduced into LNCaP cells. Eight hours after the introduction, the cells were cultured in a medium containing 1200 μg / ml G418 (Sigma-Aldrich) to obtain cells expressing GFP or overexpressing GFP-CAMKK2.
（細胞増殖アッセイ）
5×104細胞を、MDEM-5% Charcoal-stripped fetal calf serum（CCS, Thermo Scientific HyClone, UK）が添加されたプレートの各セルに添加した。そして、該細胞を各セルに吸着させ、そして24時間増殖させた。続けて、増殖した細胞は、DHT入り又はDHTなしのMDEM-5% CCS培地で処理し、さらに該培地を２日間おきに換えた。各実験において、細胞を採取し、そして該細胞数を血球計により３回測定した。測定値は、３回の再現実験の平均±標準偏差で表した。
(Cell proliferation assay)
5 × 10 4 cells were added to each cell on the plate to which MDEM-5% Charcoal-stripped fetal calf serum (CCS, Thermo Scientific HyClone, UK) was added. The cells were then adsorbed to each cell and allowed to grow for 24 hours. Subsequently, the grown cells were treated with MDEM-5% CCS medium with or without DHT, and the medium was changed every two days. In each experiment, cells were harvested and the number of cells was measured three times with a hemocytometer. The measured value was expressed as the mean ± standard deviation of three replicate experiments.
（RNA干渉分析）
特異的ステルスCAMKK2及びAR small干渉RNAs（siRNA）は、Invitrogenに受注して作製した。CAMKK2標的siRNA-01,02及びAR標的siRNA配列は、以下の通りである。
CAMKK2標的siRNA-01配列：5'-UUCGAACACCAUGUACAGAUGGUCC-3'（配列番号１）
CAMKK2標的siRNA-02配列：5'-CAAUGAAGGACU- CCAUGCCCAGGUG-3'（配列番号２）
AR標的siRNA配列：5'-CAUAGUGACACCCAGAAGCUUCAUC-3'（配列番号３）
非標的siRNA（NT siRNA）は、Invitrogenから購入した。CAMKK2ノックダウンのために、5×104cells/well LNCaP細胞を各セルに添加して、24時間培養した。該培養後、Lipofectamine RNAiMAX試薬（Invitrogen）を使用して、20 nmol/L CAMKK2 siRNA又は20 nmol/L NT siRNAを培養後細胞に形質導入した。さらに、導入済細胞を、４日間、DHT存在又は非存在下のDMEM-5%CCSで培養した。培養終了後において、該細胞をトリプシン処理し、そして血球計により細胞数を測定した。総RNAは、siRNA導入して24時間後に抽出し、総タンパク質は、siRNA導入して72時間後に抽出した。
(RNA interference analysis)
Specific stealth CAMKK2 and AR small interfering RNAs (siRNA) were produced by receiving orders from Invitrogen. The CAMKK2 target siRNA-01,02 and AR target siRNA sequences are as follows.
CAMKK2 target siRNA-01 sequence: 5'-UUCGAACACCAUGUACAGAUGGUCC-3 '(SEQ ID NO: 1)
CAMKK2 target siRNA-02 sequence: 5'-CAAUGAAGGACU- CCAUGCCCAGGUG-3 '(SEQ ID NO: 2)
AR target siRNA sequence: 5'-CAUAGUGACACCCAGAAGCUUCAUC-3 '(SEQ ID NO: 3)
Non-targeted siRNA (NT siRNA) was purchased from Invitrogen. For CAMKK2 knockdown, 5 × 10 4 cells / well LNCaP cells were added to each cell and cultured for 24 hours. After the culture, 20 nmol / L CAMKK2 siRNA or 20 nmol / L NT siRNA was transduced into the cells using Lipofectamine RNAiMAX reagent (Invitrogen). Furthermore, the introduced cells were cultured in DMEM-5% CCS in the presence or absence of DHT for 4 days. At the end of the culture, the cells were trypsinized and the number of cells was measured with a hemocytometer. Total RNA was extracted 24 hours after siRNA introduction, and total protein was extracted 72 hours after siRNA introduction.
（RT-PCR）
総RNAは、RNeasy Mini Kit(Qiagen, Hilden, Germany）を使用して、細胞培養から抽出した。cDNAは、ThermoScript RT-PCRシステム（Invitrogen）を使用して、各総RNA1μgの逆転写により得た。各cDNA試料は、ExTaq（TAKARA, Japan）により増幅した。GAPDH（GlycerAldehyde-3-Phosphate DeHydrogenase）及びAR mRNAのRT-PCR条件は、文献"Endocrine-related cancer 2009; 16: 1139-55"の記載に従って行った。CAMKK2のRT-PCRで使用したセンスプライマーの配列は、5'-CTGGACATGAACGGACGCTGCATCT-3'（配列番号４）であり、アンチセンスプライマーの配列は、5'-GCCCTTGGTTGACCAGTTCGA- ACAC-3'（配列番号５）であった。増幅したPCR産物は、1.5％アガロースゲルでの電気泳動により視覚化した。mRNA発現の定量化のために、real time PCRをLightCycler TaqMan Master (Roche Applied Science, Swizerland）の指示に従って行った。各試料中の遺伝子発現量は、標的遺伝子の量及びGAPDH遺伝子発現による標準化により測定した。
(RT-PCR)
Total RNA was extracted from cell culture using the RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany). cDNA was obtained by reverse transcription of 1 μg of each total RNA using a ThermoScript RT-PCR system (Invitrogen). Each cDNA sample was amplified by ExTaq (TAKARA, Japan). The RT-PCR conditions for GAPDH (Glycer Aldehyde-3-Phosphate DeHydrogenase) and AR mRNA were performed according to the description in the document “Endocrine-related cancer 2009; 16: 1139-55”. The sequence of the sense primer used in RT-PCR of CAMKK2 is 5′-CTGGACATGAACGGACGCTGCATCT-3 ′ (SEQ ID NO: 4), and the sequence of the antisense primer is 5′-GCCCTTGGTTGACCAGTTCGA-ACAC-3 ′ (SEQ ID NO: 5) Met. Amplified PCR products were visualized by electrophoresis on a 1.5% agarose gel. For quantification of mRNA expression, real time PCR was performed according to the instructions of LightCycler TaqMan Master (Roche Applied Science, Swizerland). The gene expression level in each sample was measured by standardization based on the amount of target gene and GAPDH gene expression.
（ルシフェラーゼアッセイ）
AR転写活性を評価するために、アンドロゲン-レスポンスエレメントを含む5.8kb PSAプロモータにより制御されるルシフェラーゼ遺伝子発現プラスミド（pGL3PSAp-5.8）を、Lipofectamine transfection試薬（Invitrogen）を使用して、24時間培養後のLNCaP細胞及びそのセルラインに形質導入した。該導入24時間後の細胞は、指定したDHT濃度を添加することにより処理した。試薬添加24時間後において、処理済細胞を回収して、さらにluciferase lysis buffer（Promega WI）で溶解した。LNCaP細胞中のCAMKK2ノックダウンのために、5×104LNCaP細胞に、RNAiMAX（Invitrogen）を使用して、12時間20nmol/L non-target (NT) siRNA又はCAMKK2 siRNA（Invitrogen）を形質導入し、次に、LNCaP細胞に12時間pGL3PSAp-5.8を形質導入した。培地を交換後に、形質導入したLNCaP細胞を24時間培養し、そして回収した。これらの実験は、少なくとも２回行った。なお、各実験はほぼ同じ結果になったことを確認している。
(Luciferase assay)
To evaluate AR transcriptional activity, a luciferase gene expression plasmid (pGL3PSAp-5.8) controlled by a 5.8kb PSA promoter containing an androgen-response element was cultured with Lipofectamine transfection reagent (Invitrogen) for 24 hours. LNCaP cells and their cell lines were transduced. Cells 24 hours after the introduction were treated by adding the designated DHT concentration. Twenty-four hours after addition of the reagent, the treated cells were collected and further lysed with luciferase lysis buffer (Promega WI). For CAMKK2 knockdown in LNCaP cells, transfect 5 × 10 4 LNCaP cells with RNAiMAX (Invitrogen) for 12 hours at 20 nmol / L non-target (NT) siRNA or CAMKK2 siRNA (Invitrogen) Next, LGLaP cells were transduced with pGL3PSAp-5.8 for 12 hours. After changing the medium, the transduced LNCaP cells were cultured for 24 hours and collected. These experiments were performed at least twice. It was confirmed that each experiment had almost the same result.
（Western blot 分析）
様々な処理後において、総タンパク質を細胞から抽出した。タンパク質の定量は、Bradfordの方法に従って行った。そして、同量のタンパク質を、10%又は12.5%ゲルに充填して電気泳動を行い、PVDF膜にブロッティングして、カゼインPBS及び0.05%Tween-20により室温で1時間ブロッキングした。該膜は、CAMKK2に対するマウスモノクローナル抗体（Sigma-Aldrich）、GAPDHに対するマウスモノクローナル抗体（Novus Bilogicals, Littleton, CO）、AMPKに対するマウスモノクローナル抗体（Abcam, Cambridge, MA）、pAMPKに対するラビットポリクローナル抗体（Abcam）及びAR（NH）に対するラビットポリクローナル抗体で培養した。抗マウス抗体又は抗ラビットモノクローナル抗体に対する西洋ワサビペルオキシダーゼ結合２次抗体を使用し、タンパク質バンドを、化学発光試薬で視覚化した。
(Western blot analysis)
Total protein was extracted from the cells after various treatments. Protein quantification was performed according to the method of Bradford. Then, the same amount of protein was filled in a 10% or 12.5% gel, subjected to electrophoresis, blotted on a PVDF membrane, and blocked with casein PBS and 0.05% Tween-20 at room temperature for 1 hour. The membrane consists of mouse monoclonal antibody against CAMKK2 (Sigma-Aldrich), mouse monoclonal antibody against GAPDH (Novus Bilogicals, Littleton, CO), mouse monoclonal antibody against AMPK (Abcam, Cambridge, MA), rabbit polyclonal antibody against pAMPK (Abcam) And cultured with a rabbit polyclonal antibody against AR (NH). Protein bands were visualized with chemiluminescent reagents using horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody to anti-mouse antibody or anti-rabbit monoclonal antibody.
（動物実験）
免疫不全マウス（SCID）は、LNCaP/GFP細胞及びLNCaP/GFP-CAMKK2細胞の移植1週間前に去勢した。該細胞は、50%マトリゲルで混合し、そして6週齢の免疫不全雄マウス及び6週齢の去勢免疫不全雄マウスの背面の皮下組織に注入するために調整した。背面の腫瘍量及び体重は継続して測定した。前立腺特異抗原（PSA）の酵素免疫測定用血清は、該マウスのサクリファイス直前に取得し、測定で使用する前まで冷凍した。免疫不全マウスの血清中のPSA濃度測定は、SRL（Special Reference Laboratories, Inc. Japan）に委託した。
(Animal experimentation)
Immunodeficient mice (SCID) were castrated one week before transplantation of LNCaP / GFP cells and LNCaP / GFP-CAMKK2 cells. The cells were mixed with 50% Matrigel and prepared for injection into the dorsal subcutaneous tissue of 6-week-old immunodeficient male mice and 6-week-old castrated immunodeficient male mice. The dorsal tumor volume and body weight were continuously measured. Serum for enzyme immunoassay of prostate-specific antigen (PSA) was obtained immediately before the mouse was sacrificed and frozen until used in the measurement. The measurement of PSA concentration in the serum of immunodeficient mice was commissioned to SRL (Special Reference Laboratories, Inc. Japan).
（CAMKK2の免疫組織化学）
通常組織を含む80コア（グリーソンスコアに適合している）から構成されているTM0016組織マイクロアッセイ（TMAs）をProvitro（Berlin, Germany）から購入し、そして95コアから構成されているPR952 TMAsはBiomax（Rockville, MD）から購入した。免疫組織化学的染色（IHC）は、Daka ChemMate ENVISION Kit/HRP（DAB）-universal kit（K5007）を使用して実行した。組織標本は、CAMKK2に対するマウスモノクローナル抗体で染色した。抗原回復は、95℃で40分間の組織切片の加熱により実行した。該切片は、10分間の3%過酸化水素による内因性ペルオキシダーゼ活性をブロッキングして、さらに、室温で60分間で希釈した一次抗体（1:200）で培養し、続いて、60分間のデキストランの重合体を結合したペルオキシダーゼ標識２次抗体で培養した。組織スライド上の標的タンパク質の染色は、DABを使用して展開し、そしてヘマトキシリンで対比染色した。患者からの十分なインフォームドコンセントを得てから、該患者の前立腺組織（骨転移した進行性前立腺癌）を、前立腺の針生検から得た。IHCの方法は、1次抗体の希釈濃度(1:400)以外は、組織マイクロアレイと同じであった。
(Immunohistochemistry of CAMKK2)
TM0016 tissue microassay (TMAs), which consists of 80 cores (conforms to Gleason score) containing normal tissue, was purchased from Provitro (Berlin, Germany) and PR952 TMAs, which consists of 95 cores, is Biomax (Rockville, MD). Immunohistochemical staining (IHC) was performed using the Daka ChemMate ENVISION Kit / HRP (DAB) -universal kit (K5007). Tissue specimens were stained with a mouse monoclonal antibody against CAMKK2. Antigen retrieval was performed by heating tissue sections at 95 ° C. for 40 minutes. The sections were blocked with endogenous peroxidase activity by 3% hydrogen peroxide for 10 minutes and further incubated with primary antibody (1: 200) diluted at room temperature for 60 minutes, followed by 60 minutes of dextran. The cells were cultured with a peroxidase-labeled secondary antibody conjugated with a polymer. Staining of target proteins on tissue slides was developed using DAB and counterstained with hematoxylin. After obtaining sufficient informed consent from the patient, the patient's prostate tissue (advanced prostate cancer with bone metastases) was obtained from a prostate needle biopsy. The IHC method was the same as the tissue microarray except for the primary antibody dilution (1: 400).
（免疫蛍光染色）
CAMKK2タンパク質の染色は、市販のキットを使用して一晩実施した。細胞は、60時間70％エタノールで染色し、PBSで三回洗浄し、そして15分間5%血清アルブミンでブロッキングした。次に、スライドはPBT（0.1％ Triton X-100 in PBS）で3回洗浄し、1時間37℃で抗CAMKK2抗体で培養し、そして細胞をPBTで3回洗浄した。さらに、洗浄した細胞を1時間37℃で5μg/ml Alexa Flour 594 anti-mouse IgG in 1% BSA/PBTでインキュベートした。該細胞をPBTで3回洗浄し、さらに核酸を検出するために、4',6-diamidino-2-phenylindole（DAPI）を含むVectashield Mounting Mediumで封入した。該スライドは、共焦点顕微鏡を使用してイメージングした。
(Immunofluorescence staining)
Staining of CAMKK2 protein was performed overnight using a commercially available kit. Cells were stained with 70% ethanol for 60 hours, washed 3 times with PBS, and blocked with 5% serum albumin for 15 minutes. The slides were then washed 3 times with PBT (0.1% Triton X-100 in PBS), incubated for 1 hour at 37 ° C. with anti-CAMKK2 antibody, and the cells were washed 3 times with PBT. Furthermore, the washed cells were incubated for 1 hour at 37 ° C. with 5 μg / ml Alexa Fluor 594 anti-mouse IgG in 1% BSA / PBT. The cells were washed three times with PBT, and further encapsulated with Vectashield Mounting Medium containing 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) in order to detect nucleic acid. The slide was imaged using a confocal microscope.
（統計的分析）
統計的有意性はPrism4.0ソフトウエアを使用して決定した。異なる比率間での有意性を評価するためにχ２検定を使用した。異なるグループ間での連続変数の分析を、一元配置分散分析と、さらにFisherの最小有意差検定で評価した。クラスカル・ワリス検定は、組織マイクロアレイのIHC染色上での統計的有意差異を決定するために、使用した。CAMKK2染色スコア、年齢、グリソン（Gleason）スコア、又は前立腺癌転移段階の相関関係を検討するため、ロジスティック回帰分析を使用した。別段の指示が無い限り、値は全て平均±ＳＥＭで表示した。有意差はp<0.05とした。
(Statistical analysis)
Statistical significance was determined using Prism 4.0 software. A χ 2 test was used to assess significance between different ratios. Analysis of continuous variables between different groups was evaluated with one-way analysis of variance and Fisher's least significant difference test. The Kruskal-Wallis test was used to determine statistically significant differences on IHC staining of tissue microarrays. Logistic regression analysis was used to examine the correlation between CAMKK2 staining score, age, Gleason score, or prostate cancer metastasis stage. Unless otherwise indicated, all values were expressed as mean ± SEM. Significant difference was p <0.05.
（前立腺癌及び正常前立腺間での示差的発現したCAMKK2の同定）
本実施例では、前立腺癌及び正常前立腺間での示差的発現しているタンパク質を同定した。詳細は、以下の通りである。
(Identification of differentially expressed CAMKK2 between prostate cancer and normal prostate)
In this example, a differentially expressed protein between prostate cancer and normal prostate was identified. Details are as follows.
約40,000遺伝子は、実施例１の記載の方法に従い、cDNAマイクロアレイ分析でスクリーニングした。すべての3つの前立腺癌の試料は、すべての3つの正常前立腺試料と比較して、スクリーニングした遺伝子中の79（0.2％）遺伝子は上方制御（≧2.5-fold）されており、そしてスクリーニングした遺伝子中の124（0.31％）遺伝子は下方制御（≧0.25−fold）されていた。さらに、3つの前立腺癌組織は、3つの正常前立腺組織と比較して、CAMKK2が比較的高度に発現し、6倍を越えて上方制御されていることを確認した。 About 40,000 genes were screened by cDNA microarray analysis according to the method described in Example 1. All three prostate cancer samples were up-regulated (≧ 2.5-fold) in 79 (0.2%) of the screened genes and screened genes compared to all three normal prostate samples Among them, 124 (0.31%) genes were down-regulated (≧ 0.25-fold). In addition, three prostate cancer tissues confirmed that CAMKK2 was relatively highly expressed and up-regulated more than 6 times compared to three normal prostate tissues.
cDNAマイクロアレイ上のCAMKK2発現パターンと臨床前立腺癌試料との相関性の有無を確認した。図１Ａ〜Ｄで示されるように、4つのステージの細胞質のCAMKK2染色強度を確認した。組織マイクロアレイを使用したCAMKK2の免疫組織化学的分析により、初期の前立腺癌組織の87.8% (115/131)、及び骨転移した前立腺癌の85.7%（6/7）は細胞質の陽性染色を示したことを確認した。一方、正常前立腺の4.1％（6/24）のみが陽性染色を示した（参照：下記表１）。グリソンスコア（8,9及び10）が高い前立腺癌組織のCAMKK2の発現レベルは、グリソンスコアが低い前立腺癌組織のCAMKK2の発現レベルと比較して、有意に低かった。 The correlation between the expression pattern of CAMKK2 on the cDNA microarray and clinical prostate cancer samples was confirmed. As shown in FIGS. 1A to D, the CAMKK2 staining intensity of the cytoplasm of the four stages was confirmed. Immunohistochemical analysis of CAMKK2 using tissue microarray showed that 87.8% (115/131) of early prostate cancer tissues and 85.7% (6/7) of prostate cancer with bone metastasis showed positive cytoplasmic staining It was confirmed. On the other hand, only 4.1% (6/24) of normal prostate showed positive staining (see: Table 1 below). The expression level of CAMKK2 in prostate cancer tissue with a high Gleason score (8, 9, and 10) was significantly lower than the expression level of CAMKK2 in prostate cancer tissue with a low Gleason score.
ＡＤＴで治療した進行性前立腺癌の日本人患者でのCAMKK2発現と予後｛PSA無進行生存（PFS）率｝間の相関性を確認した。患者全員は、骨転位を伴う進行性前立腺癌と診断され、さらに該診断後にＡＤＴで治療した。図１Ｅに示すとおり、CAMKK2発現の強度に関わらず、CAMKK2発現陽性細胞比が50％未満である患者は、CAMKK2発現陽性細胞比が50％以上である患者と比較して、有意にPFSは低かった（それぞれ、平均PFS６ヶ月と１９ヶ月の比較、p=0.30031）。 The correlation between CAMKK2 expression and prognosis {PSA progression free survival (PFS) rate} in Japanese patients with advanced prostate cancer treated with ADT was confirmed. All patients were diagnosed with advanced prostate cancer with bone dislocation and further treated with ADT after the diagnosis. As shown in FIG. 1E, regardless of the intensity of CAMKK2 expression, patients with a CAMKK2 expression-positive cell ratio of less than 50% have a significantly lower PFS than patients with a CAMKK2 expression-positive cell ratio of 50% or more. (Average PFS 6 months and 19 months, p = 0.30031, respectively).
（CAMKK2発現を誘導するアンドロゲン）
通常ＡＤＴ施行前は、前立腺癌はアンドロゲン依存性であることから、ジヒドロテストステロン（DHT）がLNCaP細胞内のCAMKK2を誘導する可能性の有無を確認した。詳細は、以下の通りである。
(Androgen that induces CAMKK2 expression)
Usually, before ADT, since prostate cancer is androgen-dependent, it was confirmed whether dihydrotestosterone (DHT) could induce CAMKK2 in LNCaP cells. Details are as follows.
DHTは濃度依存的にCAMKK2mRNAを誘導した（図２Ａ）。さらに、DHTは６時間以内にCAMKK2mRNA発現を誘導した。該誘導は、DHTがアンドロゲン受容体（AR）を介してCAMKK2発現を直接誘導していると考えられる。ウエスタンブロット分析は、「DHTが濃度依存的に72kDa CAMKK2タンパク質発現を誘導していること」を明らかにした。すなわち、ＡＤＴはCAMKK2タンパク質発現を減弱させることを確認した。 DHT induced CAMKK2 mRNA in a concentration-dependent manner (FIG. 2A). Furthermore, DHT induced CAMKK2 mRNA expression within 6 hours. The induction is considered that DHT directly induces CAMKK2 expression via the androgen receptor (AR). Western blot analysis revealed that “DHT induces 72kDa CAMKK2 protein expression in a concentration-dependent manner”. That is, it was confirmed that ADT attenuates CAMKK2 protein expression.
（LNCaP細胞内CAMKK2の過剰発現が細胞増殖を抑制するかの確認）
LNCaP細胞内CAMKK2の過剰発現が細胞増殖を抑制するかを確認した。詳細は、以下の通りである。
(Confirmation of overexpression of CAMKK2 in LNCaP cells suppresses cell growth)
It was confirmed whether overexpression of CAMKK2 in LNCaP cells suppressed cell proliferation. Details are as follows.
前立腺癌細胞におけるCAMKK2の機能を確認するために、CAMKK2を安定的に過剰発現するLNCaP細胞（LNCaP／ＧＦＰ‐CAMKK2）を調製した。LNCaP／ＧＦＰ‐CAMKK2細胞の細胞質中で９９ｋＤａのＧＦＰ融合CAMKK2タンパク質が優先的に発現していることを確認した（参照：図２Ｂ及び２Ｃ）。
DHT濃度の変化によって、LNCaP／ＧＦＰ細胞及びLNCaP／ＧＦＰ‐CAMKK2細胞の両方でARmRNA発現が変わることはなかった。コントロールでは、10nmol/L DHTは、LNCaP／ＧＦＰ細胞のARタンパク質濃度を増加させた。しかし、LNCaP／ＧＦＰ‐CAMKK2細胞では、DHTによりARタンパク質濃度が増加することはほとんどなかった（図２Ｄ）。DHT存在下でARタンパク質が安定化することは既知であることから、DHT存在下でのCAMKK2過剰発現がARタンパク質の安定性を抑制していると考えられる。
In order to confirm the function of CAMKK2 in prostate cancer cells, LNCaP cells (LNCaP / GFP-CAMKK2) stably overexpressing CAMKK2 were prepared. It was confirmed that the 99 kDa GFP-fused CAMKK2 protein was preferentially expressed in the cytoplasm of LNCaP / GFP-CAMKK2 cells (see: FIGS. 2B and 2C).
Changes in DHT concentration did not change AR mRNA expression in both LNCaP / GFP and LNCaP / GFP-CAMKK2 cells. In control, 10 nmol / L DHT increased the AR protein concentration of LNCaP / GFP cells. However, in LNCaP / GFP-CAMKK2 cells, AR protein concentration was hardly increased by DHT (FIG. 2D). Since it is known that the AR protein is stabilized in the presence of DHT, it is considered that overexpression of CAMKK2 in the presence of DHT suppresses the stability of the AR protein.
さらに、ルシフェラーゼリポーター・アッセイを行い、LNCaP細胞内のAR活性に対するCAMKK2過剰発現の影響を確認した。4.1kbpの強い上流アンドロゲン応答配列（ＡＲＥ３）並びに弱いＡＲＥ１及びＡＲＥ２を含む5.8kbpのPSAプロモーターにより制御されるルシフェラーゼレポーター（pGL3PSAp-5.8）をLNCaP／ＧＦＰ及びLNCaP／ＧＦＰ‐CAMKK2細胞に形質導入した。LNCaP／ＧＦＰ‐CAMKK2細胞内中のDHTにより誘導したＰＳＡプロモーター活性は、LNCaP／ＧＦＰ細胞内での活性と比較して、２〜４倍低いものであった（図３Ａ）。さらに、DHT非存在下でのＰＳＡプロモーター活性の基礎レベルもまた、LNCaP／ＧＦＰ細胞と比較して、LNCaP／ＧＦＰ‐CAMKK2細胞内では２．７倍低かった。 Furthermore, a luciferase reporter assay was performed to confirm the effect of CAMKK2 overexpression on AR activity in LNCaP cells. LNCaP / GFP and LNCaP / GFP-CAMKK2 cells were transduced with a luciferase reporter (pGL3PSAp-5.8) controlled by a 5.8 kbp PSA promoter containing a 4.1 kbp strong upstream androgen response element (ARE3) and weak ARE1 and ARE2. The PSA promoter activity induced by DHT in LNCaP / GFP-CAMKK2 cells was 2 to 4 times lower than that in LNCaP / GFP cells (FIG. 3A). Furthermore, the basal level of PSA promoter activity in the absence of DHT was also 2.7 times lower in LNCaP / GFP-CAMKK2 cells compared to LNCaP / GFP cells.
DHTの有無にかかわらず、CAMKK2過剰発現はＰＳＡプロモーター活性を下方制御することから、LNCaP細胞増殖に及ぼすCAMKK2過剰発現の影響も確認した。DHT非存在下でのLNCaP／ＧＦＰ‐CAMKK2細胞の増殖率は、LNCaP／ＧＦＰ細胞と比較して、低かった（Ｐ＜０．０５）（図３Ｂ）。
さらに、LNCaP／ＧＦＰ‐CAMKK2細胞の増殖は、1nmol/L DHTで最も多く促進され、一方、LNCaP／ＧＦＰ細胞の増殖は、0.1 nmol/L DHTで最も多く促進された（P＜0.001）（図３Ｂ）。この結果から、CAMKK2過剰発現は、LNCaP細胞のアンドロゲン感受性を減少させることを確認した。
Regardless of the presence or absence of DHT, CAMKK2 overexpression down-regulated PSA promoter activity, thus confirming the effect of CAMKK2 overexpression on LNCaP cell proliferation. The proliferation rate of LNCaP / GFP-CAMKK2 cells in the absence of DHT was low compared to LNCaP / GFP cells (P <0.05) (FIG. 3B).
Furthermore, proliferation of LNCaP / GFP-CAMKK2 cells was most promoted by 1 nmol / L DHT, while proliferation of LNCaP / GFP cells was most promoted by 0.1 nmol / L DHT (P <0.001) (FIG. 3B). From this result, it was confirmed that CAMKK2 overexpression decreases the androgen sensitivity of LNCaP cells.
異種移植モデルでの腫瘍形成に対するCAMKK2過剰発現の効果を評価するため、LNCaP／ＧＦＰ及びLNCaP／ＧＦＰ‐CAMKK2細胞を無処置の雄ｓｃｉｄマウスの側腹部背側に皮下注射した。LNCaP／ＧＦＰ‐CAMKK2細胞の増殖率は、１１５日目にLNCaP／ＧＦＰ細胞の２５％まで有意に減少した（P=0.017）（図３Ｃ）。
担癌scidマウスをサクリファイスし、血清を回収し、該血清中PSA値を測定した。増殖度に伴って、LNCaP／ＧＦＰ‐CAMKK2保有マウスの平均血清中PSA値は、LNCaP／ＧＦＰ保有マウスの４．２倍減少していた（P<0.01）（図３Ｄ）。
さらに、去勢scidマウスにおいてLNCaP／ＧＦＰ‐CAMKK2細胞の腫瘍化を評価した。１３０日目の去勢マウスにおいて、LNCaP／ＧＦＰ‐CAMKK2細胞の増殖率がLNCaP／ＧＦＰ細胞の１５％まで減少した（Ｐ＜０．０５）（図３Ｅ）。サクリファイスしたLNCaP／ＧＦＰ‐CAMKK2保有マウスの血清中ＰＳＡ値も、LNCaP／ＧＦＰ保有マウスの８．８倍減少していた（Ｐ＜０．０５）（図３Ｆ）。
これらの結果は、アンドロゲンの有無及びインビトロ／インビボに関わらず、LNCaP細胞内CAMKK2過剰発現は癌細胞増殖を阻害することを確認した。
To evaluate the effect of CAMKK2 overexpression on tumor formation in a xenograft model, LNCaP / GFP and LNCaP / GFP-CAMKK2 cells were injected subcutaneously into the dorsal flank of untreated male scid mice. The proliferation rate of LNCaP / GFP-CAMKK2 cells was significantly reduced to 25% of LNCaP / GFP cells on day 115 (P = 0.017) (FIG. 3C).
The tumor-bearing scid mice were sacrificed, the serum was collected, and the PSA value in the serum was measured. With the degree of proliferation, the mean serum PSA value of LNCaP / GFP-CAMKK2-bearing mice decreased 4.2-fold as compared to LNCaP / GFP-bearing mice (P <0.01) (FIG. 3D).
Furthermore, tumorigenesis of LNCaP / GFP-CAMKK2 cells was evaluated in castrated scid mice. In castrated mice on day 130, the proliferation rate of LNCaP / GFP-CAMKK2 cells decreased to 15% of LNCaP / GFP cells (P <0.05) (FIG. 3E). The serum PSA value of the sacrificed LNCaP / GFP-CAMKK2-bearing mice was also reduced by 8.8 times that of the LNCaP / GFP-bearing mice (P <0.05) (FIG. 3F).
These results confirmed that LNCaP intracellular CAMKK2 overexpression inhibits cancer cell proliferation regardless of the presence of androgen and in vitro / in vivo.
（AR活性を誘導するCAMKK2のノックダウン）
ＣＭＶプロモーター等の強力な人工プロモーターを使用して特定のタンパク質を細胞中で過剰発現させると、細胞増殖及びAR活性が抑制される可能性があることが知られている。よって、低分子干渉mRNAを使用し、CAMKK2のノックダウンが起こるかどうかを確認した。詳細は、以下の通りである。
(CAMKK2 knockdown that induces AR activity)
It is known that when a specific protein is overexpressed in cells using a strong artificial promoter such as the CMV promoter, cell proliferation and AR activity may be suppressed. Therefore, using small interfering mRNA, it was confirmed whether CAMKK2 knockdown occurred. Details are as follows.
CAMKK2をノックダウンするため、初めに２種の異なるsiRNA（siCAMKK2‐01及び02）を使用した。siCAMKK2‐01及び02を使用してCAMKK2をノックダウンしたところ、CAMKK2mRNA発現及びCAMKK2タンパク質発現が抑制された（図４Ａ）。
ルシフェラーゼリポーター・アッセイによりLNCaP細胞内のＰＳＡプロモーター活性に与えるCAMKK2ノックダウンの効果を評価した。CAMKK2のノックダウン度に伴って、ＰＳＡプロモーター活性はCAMKK2タンパク質発現度と逆相関していた（図４Ｂ）。特に、20nmol/LsiCAMKK2‐01によるCAMKK2をノックダウンは、コントロールである非標的simRNA（siNT）と比較して、0.1nmol/L DHTで誘導したＰＳＡプロモーター活性が３．６倍促進された。したがって、CAMKK2のノックダウンについてさらに研究するため、siCAMKK2‐01を選択した。siCAMKK2によるCAMKK2をノックダウンすると、濃度依存的かつsiNTと比較して、０．１ｎＭのDHTで誘導したＰＳＡプロモーター活性が１．９〜４．１倍促進され、さらにＰＳＡプロモーター活性の基礎レベルが１．９倍〜３．０倍促進された。CAMKK2をノックダウンすると、それぞれの濃度のDHTでＰＳＡプロモーター活性誘導が促進された（図４Ｃ）。CAMKK2のノックダウンによるＰＳＡプロモーター活性の誘導度に伴って、CAMKK2のノックダウンによりLNCaP細胞増殖が促進された（図４Ｄ）。
Two different siRNAs (siCAMKK2-01 and 02) were first used to knock down CAMKK2. When CAMKK2 was knocked down using siCAMKK2-01 and 02, CAMKK2 mRNA expression and CAMKK2 protein expression were suppressed (FIG. 4A).
The effect of CAMKK2 knockdown on PSA promoter activity in LNCaP cells was evaluated by luciferase reporter assay. With the degree of CAMKK2 knockdown, the PSA promoter activity was inversely correlated with the degree of CAMKK2 protein expression (FIG. 4B). In particular, knocking down CAMKK2 by 20 nmol / LsiCAMKK2-01 promoted the PSA promoter activity induced by 0.1 nmol / L DHT by 3.6 times compared to non-target simRNA (siNT) as a control. Therefore, siCAMKK2-01 was selected to further study CAMKK2 knockdown. When CAMKK2 is knocked down by siCAMKK2, the PSA promoter activity induced by 0.1 nM DHT is promoted by 1.9 to 4.1 times as compared with siNT, and the basal level of PSA promoter activity is 1 Accelerated 9 times to 3.0 times. When CAMKK2 was knocked down, induction of PSA promoter activity was promoted at each concentration of DHT (FIG. 4C). Along with the degree of induction of PSA promoter activity by CAMKK2 knockdown, LNCaP cell proliferation was promoted by CAMKK2 knockdown (FIG. 4D).
特に、0.1nmol/L DHT添加による増殖促進がCAMKK2ノックダウンによりさらに促進されたことから、アンドロゲン過敏症はCAMKK2発現の下方制御により増強すると考えられる。この増殖結果は、さらにCAMKK2の半特異的アンタゴニストであるSTO-609により確認した。STO-609は、0.1nmol/L DHTの存在下において、用量依存的にLNCaP細胞増殖を促進した（図なし）。しかしながら、STO-609は、DHT非存在下において、有意に細胞増殖を促進しなかった。 In particular, growth promotion by addition of 0.1 nmol / L DHT was further promoted by CAMKK2 knockdown, and androgen hypersensitivity is thought to be enhanced by down-regulation of CAMKK2 expression. This proliferation result was further confirmed by STO-609, a semi-specific antagonist of CAMKK2. STO-609 promoted LNCaP cell proliferation in a dose-dependent manner in the presence of 0.1 nmol / L DHT (not shown). However, STO-609 did not significantly promote cell proliferation in the absence of DHT.
次に、CAMKK2発現ノックダウンが様々なアンドロゲン誘導性MMTVプロモーター活性に影響を与えるか確認した。
1.0nmol/L DHTで誘導したＭＭＴＶプロモーター活性並びにＰＳＡプロモーター活性はCAMKK2ノックダウンにより促進されたことを確認した（図なし）。LNCaP細胞で観察された現象が他の細胞にも当てはまるかを確認するため、アンドロゲン感受性前立腺癌ＶＣａＰ細胞を使用し、同様の実験を行った。LNCaP細胞内と同様に、ＶＣａＰ細胞内のDHT誘導ＰＳＡ及びＭＭＴＶプロモーター活性はCAMKK2ノックダウンにより促進された。この促進現象がアンドロゲン感受性細胞で観察されたものと共通の事象であると考えられる。
CAMKK2過剰発現が、DHT存在下でARタンパク質レベルを減少させたことから、siCAMKK2によるCAMKK2ノックダウンのAR発現レベルを確認した。DHT処理の24時間後に増加したAR発現レベルは、さらに、CAMKK2ノックダウンにより増加した。しかし、AR発現レベルは、DHT非存在下でのCAMKK2のノックダウンでは、変化がなかった（図５Ａ）。
DHT存在下でのCAMKK2ノックダウンにより増加したAR過剰発現がAR活性に影響を与えるかどうかを確認した。そこで、CAMKK2ノックダウンで誘導されたＰＳＡプロモーター活性に与えるAR発現のノックダウンの効果を確認した。図５Ｂに示すとおり、AR発現のノックダウンは、DHT存在下でのsiCAMKK2誘導ARプロモーター活性の抑制を引き起こしたが、DHT非存在下でのＰＳＡプロモーター活性のsiCAMKK2誘導基礎レベルは、ARsimRNAに関係なく変化しなかった。
CAMKK2ノックダウンで誘導した基礎ＰＳＡプロモーター活性とAR活性との関連性をさらに確認するため、弱いＡＲＥを２つしか含まない６３３ｂｐの欠損ＰＳＡプロモーターで制御される別のリポーターベクター（ｐＧＬ３ＰＳＡｐ‐０．６３）を使用した。ｐＧＬ３ＰＳＡｐ‐０．６３を形質導入したLNCaP細胞では、強いＡＲＥ３を含むｐＧＬ３ＰＳＡｐ‐５．８と比較して、DHTによりＰＳＡプロモーター活性を弱く誘導した（２倍）。基礎ＰＳＡプロモーター活性のみならずDHT誘導ＰＳＡプロモーター活性は、ｐＧＬ３ＰＳＡｐ‐５．８と比較して、CAMKK2ノックダウンでは促進されなかった（図５Ｃ）。
これらの結果は、CAMKK2ノックダウンによるARプロモーター活性増強はAR安定性のみならず他の転写因子が介在していると考えられる。
Next, it was confirmed whether CAMKK2 expression knockdown affects various androgen-inducible MMTV promoter activities.
It was confirmed that MMTV promoter activity and PSA promoter activity induced by 1.0 nmol / L DHT were promoted by CAMKK2 knockdown (not shown). In order to confirm whether the phenomenon observed in LNCaP cells was applicable to other cells, androgen-sensitive prostate cancer VCaP cells were used and the same experiment was performed. As in LNCaP cells, DHT-induced PSA and MMTV promoter activities in VCaP cells were promoted by CAMKK2 knockdown. This enhanced phenomenon is thought to be a common event observed with androgen-sensitive cells.
Since CAMKK2 overexpression decreased the AR protein level in the presence of DHT, the AR expression level of CAMKK2 knockdown by siCAMKK2 was confirmed. The AR expression level increased 24 hours after DHT treatment was further increased by CAMKK2 knockdown. However, AR expression levels did not change with CAMKK2 knockdown in the absence of DHT (FIG. 5A).
It was confirmed whether AR overexpression increased by CAMKK2 knockdown in the presence of DHT affects AR activity. Therefore, the effect of knockdown of AR expression on PSA promoter activity induced by CAMKK2 knockdown was confirmed. As shown in FIG. 5B, knockdown of AR expression caused suppression of siCAMKK2-induced AR promoter activity in the presence of DHT, but the siCAMKK2-induced basal level of PSA promoter activity in the absence of DHT was independent of ARsimRNA. It did not change.
To further confirm the association between basal PSA promoter activity induced by CAMKK2 knockdown and AR activity, another reporter vector (pGL3PSAp-0.63 controlled by a 633 bp defective PSA promoter containing only two weak AREs) )It was used. In LNCaP cells transduced with pGL3PSAp-0.63, PHT promoter activity was weakly induced by DHT (2-fold) compared to pGL3PSAp-5.8 containing strong ARE3. DHT-induced PSA promoter activity as well as basal PSA promoter activity was not promoted by CAMKK2 knockdown compared to pGL3PSAp-5.8 (FIG. 5C).
These results suggest that augmentation of AR promoter activity by CAMKK2 knockdown is mediated not only by AR stability but also by other transcription factors.
（ＡＭＰＫ経路とCAMKK2機能の効果）
ＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼ（ＡＭＰＫ）はエネルギー恒常性の中心的役割を担うCAMKK2の下流成分である。また、腫瘍抑制因子で知られているセリン-スレオニンレバーキナーゼB1（LKB1）は、AMPKを活性化し、そしてAMPK活性化を介して細胞成長を抑制させることが知られている。本実施例では、CAMKK2発現レベルは、DHT存在又は非存在下で、AMPKの活性化に影響を与えるかを確認した（参照：図６）。
(Effects of AMPK pathway and CAMKK2 function)
AMP-activated protein kinase (AMPK) is a downstream component of CAMKK2 that plays a central role in energy homeostasis. In addition, it is known that serine-threonine lever kinase B1 (LKB1), which is known as a tumor suppressor, activates AMPK and suppresses cell growth through AMPK activation. In this example, it was confirmed whether the CAMKK2 expression level affects the activation of AMPK in the presence or absence of DHT (see FIG. 6).
CAMKK2の過剰発現は、DHT存在下でAMPKのリン酸化を誘導したが、DHT非存在下ではAMPKのリン酸化を誘導しなかった。また、DHT誘導AMPKリン酸化は、CAMKK2ノックダウンにより阻害された。
これらの結果により、アンドロゲン存在下でのCAMKK2過剰発現によるLNCaP細胞増殖の抑制は、AMPK活性化を介して行われると考えられる。
Overexpression of CAMKK2 induced AMPK phosphorylation in the presence of DHT, but not AMPK phosphorylation in the absence of DHT. DHT-induced AMPK phosphorylation was inhibited by CAMKK2 knockdown.
Based on these results, suppression of LNCaP cell proliferation by CAMKK2 overexpression in the presence of androgen is considered to be performed through AMPK activation.
（総論）
本実施例では、以下のことを確認した。
CAMKK2過剰発現は、前立腺癌細胞の増殖を抑制し、アンドロゲン感受性を弱める。すなわち、CAMKK2若しくはCAMKK2同等物、並びに／又はCAMKK2遺伝子若しくはCAMKK2遺伝子同等物は、前立腺癌、特にアンドロゲン感受性が高い去勢抵抗性前立腺癌の予防、治療剤の有効成分となる。
前立腺癌細胞中のCAMKK2発現を向上させることができる物質は、前立腺癌、特に去勢抵抗性前立腺癌の予防、治療剤の有効成分となる。すなわち、前立腺癌細胞中のCAMKK2発現を向上させることを指標とすることにより、前立腺癌、特に去勢抵抗性前立腺癌の予防、治療効果を有する物質をスクリーニングすることができる。
指定された領域中でのCAMKK2陽性領域割合が50％以上では、指定された領域中でのCAMKK2陽性領域割合が50％未満と比較して、ＡＤＴ後の生存率が高いことを確認した。すなわち、患者由来の前立腺組織のCAMKK2陽性領域割合を測定して、基準値（例えば、50%）と比較することにより、予後不良の検査を行うことができる。
CAMKK2は、細胞のエネルギー代謝に重要なAMPKの上流に位置する遺伝子である。よって、CAMKK2の発現を亢進させることができれば、前立腺癌以外の癌でも治療・予防が可能と考えられる。
(General)
In this example, the following was confirmed.
CAMKK2 overexpression suppresses prostate cancer cell growth and attenuates androgen sensitivity. That is, CAMKK2 or CAMKK2 equivalent, and / or CAMKK2 gene or CAMKK2 gene equivalent is an active ingredient of a prophylactic or therapeutic agent for prostate cancer, particularly castration-resistant prostate cancer with high androgen sensitivity.
A substance capable of improving the expression of CAMKK2 in prostate cancer cells is an active ingredient of a prophylactic or therapeutic agent for prostate cancer, particularly castration resistant prostate cancer. That is, by using as an index the improvement of CAMKK2 expression in prostate cancer cells, a substance having a prophylactic and therapeutic effect on prostate cancer, particularly castration resistant prostate cancer can be screened.
When the CAMKK2-positive area ratio in the designated area was 50% or more, it was confirmed that the survival rate after ADT was high as compared with the CAMKK2-positive area ratio in the designated area being less than 50%. That is, the prognosis test can be performed by measuring the ratio of the CAMKK2-positive area of the prostate tissue derived from the patient and comparing it with a reference value (for example, 50%).
CAMKK2 is a gene located upstream of AMPK that is important for cellular energy metabolism. Therefore, if the expression of CAMKK2 can be enhanced, it is considered possible to treat / prevent cancer other than prostate cancer.
本発明によれば、新規な前立腺癌、特に去勢抵抗性前立腺癌の予防、治療剤を提供することができる。 According to the present invention, it is possible to provide a novel preventive or therapeutic agent for prostate cancer, particularly castration resistant prostate cancer.
Claims (6)
（１）候補物質を前立腺癌細胞に導入する工程
（２）該細胞中のCAMKK2又はCAMKK2遺伝子の発現量を測定する工程 A screening method for a substance having a prophylactic / therapeutic effect on prostate cancer, comprising the following steps.
(1) Introducing a candidate substance into prostate cancer cells (2) Measuring the expression level of CAMKK2 or CAMKK2 gene in the cells
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